KR20060073172A - 생체 고분자/유전자 복합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에어로졸 전달 방식으로 유전자를 전달하기 위한 생체 고분자/유전자 복합체에 관한 것이다.

본 발명에 의한 생체고분자/유전자 복합체는 1 차 아미노산의 일부가 당으로 치환된 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하고, 상기 폴리에틸렌이민의 함량이 상기 소정의 유전자의 함량의 2 내지 4 배이다.

본 발명에 의한 에어로졸 전달용 폐암 치료제는 30~40 몰%의 1 차 아미노산이 포도당으로 치환된 폴리에틸렌이민(PEI) 및 PTEN를 코딩 하는 유전자를 포함하는 생체고분자/유전자 복합체를 포함하고, 상기 생체 고분자/유전자 복합체에서 상기 폴리에틸렌이민의 함량이 상기 유전자의 함량의 2 내지 4 배이다.

에어로졸, 유전자, 복합체

Description

생체 고분자/유전자 복합체{BIOPOLYMER AND GENE COMPLEX}

도 1 은 다양한 농도의 당 치환율(몰%)에 대한 MTT 생체 내 세포 독성 시험 결과를 보여준다.

도 2 는 생체 고분자/유전자 복합체에 대한 마우스 특이적 탐식 세포 및 단핵세포에 대한 면역 조직화학 염색 분석 결과를 보여준다.

도 3 은 생체 고분자/유전자 복합체를 통해 PTEN을 세포 조직에 전달한 후, 세포 조직의 Akt 단백질을 웨스턴 블랏 분석한 결과이다.

도 4 는 Akt 신호 전달 경로에 관여하는 성분의 조절 결과를 보여준다.

도 5 는 p-GSK, Akt, p-4EBP1및 mTOR의 키나아제 활성 분석의 결과를 보여준다.

도6은 Akt의 인산화에 대한 면역조직화학분석 결과를 보여준다.

도7은 TUNEL 분석 결과를 보여준다.

본 발명은 생체고분자/유전자 복합체, 구체적으로는 유전자를 에어로졸 방식으로 전달하기 위한 생체 고분자/유전자 복합체에 관한 것이다.

인간 종양의 약 30%에서 ras 유전자의 돌연변이가 발견 되고 있다. 이 유전자 그룹에는 K-ras, N-ras, 및 H-ras 등 3가지의 유전자가 존재하는데, K-ras 돌연변이는 폐의 악성선종에서 가장 자주 발견된다. 이러한 돌연변이를 가지고 있는 마우스는 가장 흔한 비소세포 폐암의 조직병변이 나타나고 짧은 잠복기와 높은 침투율을 보인다.

포스파티딜이노시톨(3,4,5)-트리포스페이트의 3번째 이노시톨 링의 인산화를 특이적으로 촉매 하는 10번째 염색체 상의 포스타테이즈 및 텐신 동족체 결실(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10; 이하 'PTEN'라 한다)은 Akt 신호전달 경로를 억제하여 세포 성장과 생존을 조절함으로써 항암 유전자로서의 역할을 하는 것이 알려져 있다.

Akt는 Ras유전자의 성장요소를 활성화시키거나 PTEN을 불활성화시킴으로써 암세포에서 활성화된다는 사실이 알려져 있다.

최근의 보고에서는 비소세포폐암의 약 90%가 PI3K/Akt 경로의 지속적인 활성화와 관련되어 있고, 이러한 Akt의 활성화는 세포의 생존과 화학요법이나 γ조사에 대한 저항성을 증가시킨다는 사실이 발표되었다.

더구나 K-ras 돌연변이는 Akt 의 활성화에 의해 폐의 악성선종의 활동성을 증가시킬 수 있다.

이러한 사실들로부터, 폐암 치료를 위해Akt 신호전달을 조절하는 방법이 요청되고 있다.

한편, 폐암 치료를 위해 흡입을 통해 유전자를 전달하는 방법이 알려져 있 다.

재조합 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector)가 기도 상피에의 높은 친화성, 폐 세포로의 효율적인 전달성으로 인해 효과적인 유전자 전달 전달체로서 사용되고 있다.

그러나, 재조합 아데노바이러스와 같은 재조합 바이러스 벡터는 그 독성, 반복 투여에 의한 면역 반응, 대량 생산의 어려움이 어렵다는 사실 때문에 실제적인 적용에는 그 한계가 있어 왔다.

비-바이러스 벡터(non-viral vector)는 바이러스 벡터에 비해 사용하기가 쉽고 면역 반응을 덜 야기한다는 이점을 가지고 있다. 또한, 이들은 높은 분자량의 DNA 분자들도 전달할 수 있는 능력을 포함한다.

최근, 몇 가지 연구들은 폴리리신 (polylysine), 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine (PEI)), 프로타민(protamine), 및 히스톤(histone)과 같은 양이온을 가진 폴리펩타이드(polypeptide)와 DNA의 결합이 in vivo와 in vitro 상 모두에서 유용한 유전자 전달 방법이 될 수 있다고 개시하고 있다.

이러한 폴리펩타이드들 중에서, PEI는 에어로졸(aerosol) 방식에 안정한 장점 때문에 유전자 전달을 위한 전달체로서 주목 받고 있다. 그러나 PEI의 사용은 다 양이온(poly-cation)의 특징적인 축적에 의한 강한 독성에 유의해야 한다.

많은 연구자들은 분무(nebulization)에 의하여 폐와 폐 림프절에 직접적인, 다양한 치료제의 전달에 대한 가능성을 연구해오면서 PEI를 유전자 치료 전달제로 사용을 시도하고 있으나, PEI는 축적되어 잠재적 독성을 유발하는 것이 보고 되고 있다.

따라서, 유전자 전달체로서의 폴리펩타이드를 사용하기 위해서 세포면에 대한 부착, 엔도사이토시스(endocytosis), 엔도조말 리소조말 네트워킹(endosomal lysosomal network)으로부터의 분리, 세포핵 내로의 이동, 벡터-언패킹 (vector-unpacking) 등이 필수적으로 요구된다.

따라서, 이러한 요건을 만족하는 효율적이고 안정성을 가진 에어로졸 유전자 전달체의 개발이 요청되고 있다.

본 발명은 생체고분자/유전자 복합체를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 생체고분자/유전자 복합체를 이용하여 원하는 유전자를 전달하고자 하는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 효과적인 에어로졸 전달을 달성할 수 있고, 독성을 감소시킨, 생체고분자/유전자 복합체를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 생체고분자/유전자 복합체를 이용하여 암 억제 유전자를 에어로졸 전달 방식으로 전달하는 방법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 기술적 과제의 해결을 위한, 본 발명의 한 특징에 따른 생체 고분자/유전자 복합체는 1 차 아미노산의 일부가 당으로 치환된 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하고, 상기 소정의 유전자의 함량의 2 내지 4 배의 폴리에틸렌이민의 함량을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 에어로졸 전달용 폐암 치료제는 30~40 몰%의 1 차 아미노산이 포도당으로 치환된 폴리에틸렌이민(PEI) 및 PTEN를 코딩 하는 유전자를 포함하는 생체고분자/유전자 복합체를 포함하고, 상기 소정의 유전자의 함량의 2 내지 4 배의 폴리에틸렌이민의 함량을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 소정의 유전자를 에어로졸 전달 방식으로 전달하기 위한 생체 고분자/유전자 복합체의 제조 방법은 생체 고분자에 1 차 아미노산의 일부 이상이 당으로 치환된 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하도록 하고, 상기 폴리에틸렌이민의 함량을 상기 소정의 유전자의 함량의 2 내지 4 배가 되도록 하여, 상기 생체 고분자와 상기 유전자를 결합시키는 것을 포함한다.

목표 유전자의 전달 방법 중 하나인 에어로졸 전달 방법은 유전자를 광범위한 표면에 적용할 수 있고 다른 경로의 투여방법에서의 발생할 수 있는 잠재적 위험성을 피할 수 있다는 점에서, 목표 유전자의 전달을 위한 효율적이고 비침투적인 방법으로 알려져 있다.

본 발명은 특정 유전자를 효과적으로 에어로졸 전달 방법에 적용하기 위한 생체고분자/유전자 복합체를 제공한다. 특히, 본 발명의 실시예에 따른 생체 고분자/유전자 복합체는 폐암 치료의 효과적임이 확인되었다.

본 발명의 실시예에 따른 생체고분자/유전자 복합체에서 생체 고분자로서 당질화 생체고분자 및 유전자로서 PTEN을 코딩 하는 유전자를 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 실시예에 따른 생체고분자/유전자 복합체의 한 구현예로서 당질화 폴리에틸렌이민(이하 'GPEI' 이라 한다)에 PTEN을 코딩 하는 유전자가 결합된 GPEI/PTEN 복합체를 예시할 수 있다.

일반적으로, PEI의 세포독성은 주로 구성 1차 아미노산으로부터 유발된다고 여겨지는데, 이들은 전체 아미노산의 약 30%를 차지한다.

GPEI는 PEI의 독성을 극복하기 위하여, PEI를 구성하는1차 아미노산의 특정 부위를 포도당 부분(moiety)으로 치환하여 PEI의 친수성을 증가시켜 PEI의 잠재적 독성을 감소시킨 PEI 유도체이다.

본 발명의 실시예에 따른 GPEI에서 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 것이면, 당질화 정도에 특별한 제한이 없으나, 바람직하게는 당 치환 율이 30~40 몰 % 이며, 가장 바람직하게는 당 치환 율이 약 36 몰 %이다.

또한, 본 발명의 실시예에서 생체 고분자 및 유전자의 결합 비율은 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 것이면, 특별한 제한이 없으나, GPEI/유전자 복합체는 바람직하게는 GPEI와 유전자가 2~4: 1의 비율로 결합된 것을 포함한다.

폐암 치료를 위한 본 발명의 한 구현예는 GPEI 에 폐암을 억제하는 유전자를 결합하여 GPEI/폐암 억제 유전자의 복합체를 제조하여 에어로졸 전달 방식으로 전달하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 폐암 억제 유전자로서 PTEN를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 GPEI는 함께 결합되는 유전자의 전달 활성을 강화시킬 수 있다.

GPEI의 이러한 강화는 더욱 효과적인 폴리플렉스 언패키징(polyplex unpackaging), 변경된 트리패킹(trafficking)과 폐 세포 대식세포의 공격으로부터 피난등에 기인하는 것으로 여겨진다. 게다가, 대체된 포도당 분자는 폐 종양 세포로 GPEI/PTEN 복합체가 선택적으로 흡수되도록 촉진하는 역할을 하는 것으로 여겨진다. PET는 포도당의 유사체인 18F-FDG (fluorine 18 fluorodeoxyglucose) 분포의 이미지로 구성되어 있으며 이 물질은 정상 조직보다는 대부분의 종양에서 다량으로 축적된다.

한편, Akt는 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase)로 세포 생존과 증식을 일으키는 신호 경로에 중요한 매개체로 작용한다. Akt은 완전한 활성을 위하여 Thr308과 Ser473의 인산화를 요구한다. 하기 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 한 실시예인GEI/PTEN의 에어로졸 전달 결과로 보아 Thr308 인산화는 Akt 의 발현 수준을 크게 억제하나, Ser473 인산화는 Akt의 발현 수준에 영향을 주지 않는 것으로 여겨진다.

Akt의 업스트림 키나아제(upstream kinase)인 PDK1은 Thr308을 인산화한다고 알려져 있다. 그러나, Ser473 인산화를 담당하는 키나아제의 정체는 아직 정확하게 알려져 있지는 않다. 몇몇의 실험 결과로부터 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트 결합(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate binding)이 PDK1의 막 위치(membrane localization)와 키나아제 활성에 중요함을 추측해볼 수 있다.

한편, Akt 다운스트림 타겟의 단백질 수준, 즉 4EBP1및 p70S6K가 PTEN 전달에 의해 영향 받는다. 이러한 결과로 보아 Thr308 인산화의 억제가 Akt 다운 스트림 타겟을 조절할 수 있음을 시사한다. 최근의 보고에 의하면 PDK1은 세포질-핵간 순환 단백질이고 핵내 이동은 PI3K 경로에 의해 조절된다. PDK1의 핵내 위치화 는 PTEN-결핍 세포에서 증가되는데, 이러한 사실은 PTEN 유전자 전달이 Akt 신호 경로의 기능에 절대적으로 영향을 미칠 수 있음을 지지한다.

PDK1은 Akt의 인산화를 통하여 항-세포자살(antiapoptosis)에 기여함이 알려져 있다. Akt 활성의 억제가 광범위한 포유동물 세포에서 세포자살(apoptosis)를 유도함이 보고 되고 있다.

또한, Akt은 항-세포자살 신호와 증식의 활성화뿐만 아니라 세포 침윤과 혈관생성의 촉진을 통하여 종양의 진행에 공헌함이 알려져 있다.

이러한 사실들로부터, 본 발명의 실시예에 따른 생체고분자/유전자 복합체의 에어로졸 전달을 통한 PTEN의 전달이 PDK1를 억압하여 Akt 키나아제 활성을 억제하고, 결국 궁극적으로 종양 활성을 억제할 수 있는 효과를 달성할 수 있음을 기대할 수 있다.

한편, PI3K와 같은 PTEN의 다운스트림 작용기(downstream effectors)는 세포자살, 침습, 이동과 성장을 포함한 다양한 세포과정을 야기하는 많은 다운스트림 경로를 조절함이 알려져 있다.

마우스의 폐에서 PTEN 관련 단백질의 증가는 많은 기능적인 결과를 야기한다. 구체적으로, 암세포에서 PTEN의 과발현은 PI3K의 억제를 통한 세포 주기의 정지와 세포 사멸을 야기한다.

또한, PI3K의 억제가 방광암의 침투능을 높은 수준으로 감소시킨다는 사실이 알려져 있다.

PTEN의 또 다른 잠재적인 다운스트림 타겟은 번역 조절에 관련된 그룹인 4E-BP's이다. 이 단백질들은 이들이 결합하는 eIF4E에 대한 친화도를 감소시키는 mTOR의 인산화를 통해 성장과 세포 스트레스와 관련된 신호전달 경로의 작용기(effectors)로서 활성을 갖는다.

최근, mTOR는 세포 조절 인자인 S6K1과 4E-BP1/eIF4E를 통한 세포 주기 증가를 조절하며 이는 증가된 PTEN이 K-ras 무표지(null) 마우스 폐암 모델에서 세포 증가를 변화시키는 것과 관련한 또 다른 기전을 제시할 수 있음이 알려져 있다.

이러한 사실들로부터, 본 발명의 실시예에 따른 생체고분자/유전자 복합체의 에어로졸 전달을 통한 PTEN의 전달이 mTOR를 포함한 Akt 경로뿐만 아니라 mTOR에 의존적인 eIF4E-BP1에도 영향을 주어, 폐암 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 효과를 달성할 수 있음을 기대할 수 있다.

아래에서는 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본 발명의 실시예에서 사용되는 항-eIF4E는 BD Biosciences 사 (San Jose, CA)에서 구입하였고, 항-PDK1는 Upstate Biotechnology 사(Waltham, MA)에서 구입하였다. 항-PTEN, 항-포스포-mTOR, and 항-4E-BP1는 Cell Signaling Technology 사(Beverly, MA)에서 구입하였다. 웨스턴 블랏 분석과 면역조직화학에 사용된 다른 항체는 Santa Cruz Biotechnology 사(Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다.

하기 실시예에서, 웨스턴 블랏 분석의 정량화는 Multi Gauge ver 2.02 program (FUJI FILM)을 사용하여 수행하였다. 웨스턴 블랏의 결과를 기반으로 산출한 액틴(actin)으로 표준화한 인산화-Akt/전체 Akt 비율은 Student's t-test를 사용하여 비교하였다.

실시예 1: GPEI 및 GPEI/DNA 복합체 제조

GPEI는 시아노보로하이드리드(cyanoborohydride)를 사용하여 PEI (M.W. 25K)와 셀로바이오스(cellobiose)와의 반응으로 제조하였다.

GPEI 내에서 최적의 글루코오스 치환 값을 구하기 위하여 다양한 농도의 당 치환율(몰%) 에 대한 A549 세포에서 MTT세포 독성 분석을 이용하여 세포 생존율을 조사하였다. 이에 따라, 최적의 글루코오스 치환 값을 치환된 GPEI를 수득하였다.

도 1 은 다양한 농도의 당 치환율(몰%)에 대한 MTT 생체 내(in vivo) 세포 독성 시험 결과를 보여준다.

도 1 로부터, PEI의 거의 모든 아미노산 그룹이 환원 성 아민화 반응에 의하여 2차 아미노산 그룹으로 변형된 GPEI가 낮은 세포독성을 나타냄을 보여주며, 그 중 36 몰 % GPEI가 가장 낮은 독성을 나타내므로, 본 실시예의 에어로졸 유전자 전달에는 36 몰 % GPEI를 사용하였다.

증류수에 1 ㎎의 DNA를 용해시키고, 약하게 교반하면서, GPEI 전달체를 조금씩 점적하여, DNA와 GPEI 전달체를 1: 2.67의 결합 비율로 혼합하고, 최종 부피가 50 ㎖가 되게 증류수로 보충하였다.

그 후, 혼합물을 실온에서 30분 동안 반응시켜, GPEI/DNA 복합체를 제조하였다. DNA 로서, 본 발명의 실시예 1에서 사용되는 pcDNA3.1-GFP는 Invitrogen 사 (Carlsbad, CA)에서 구입하였고, pcDNA3.0-PTEN은 Dr. Whang (UNC at Chapel Hill)으로부터 기증 받았다.

그 후, GPEI/DNA 복합체의 에어로졸 전달 효율을 확인하기 위하여 GPEI/GFP 플라스미드 DNA에 노출된 폐 조직에서 면역조직화학염색을 실시하였다.

도 2 는 본 발명의 생체 고분자/유전자 복합체가 마우스 특이적인 탐식 세포 및 단핵세포에 대한 면역 조직화학 염색 분석 결과를 보여준다.

도 2의 a 및 b에서, 폐에 전달된 본 발명의 생체 고분자/유전자 복합체는 GPEI/pcDNA3.1-GFP이고, 도 2 의 c 및 d 에서 전달된 본 발명의 생체 고분자/유전자 복합체는 GPEI/pcDNA 3.1이다. 도 2 의 a및 c에서, 표지는 폐세포의 탐식세포와 단핵세포에 의해 탐식된 일부 GFP를 가리키며, 도 2의 b 에서 표지는 폐세포내로 전달된 대부분의 GFP를 가리킨다.

도 2 에서와 같이, 면역조직화학염색에서 관찰한 결과, 일부 소량은 대식세포나 단핵구에 의해 탐식되었으나, 대부분의 GPEI/GFP DNA 복합체는 폐 세포 내로 충분히 전달되었다.

이러한 도 2 로부터, 본 발명의 실시예에 따른 생체고분자/유전자 복합체의 에어로졸 전달 방법이 효율적으로 작용하였음을 알 수 있다.

실시예2: 에어로졸 전달 방식을 통한 GPEI/DNA 복합체의 생체 내 전달

15주령 수컷 K-ras 무표지 마우스를 Human Cancer Consortium-NCI 사(Frederick, MD)에서 구입하여, 온도는 23 ± 2℃, 상대습도는 50 ± 20%, 광조량 12 시간으로 설정하여 사육하였다. 마우스를 nose-only exposure chamber(Dusturbo, Seoul, Korea) (이하, 'NOEC'라 한다), 에 넣고, 상기 실시예 1 의 복합체를 에어로졸 방식으로 마우스에 약 30 분동안 투여하였다. 에어로졸은 네브라이저(nebulizer) (#20304964, Dusturbo)를 사용하여 발생시켰다. 본 실시예에서는 실시예 1 의 방법에 따라 1 ㎎의 pcDNA3.0-PTEN 플라스미드 DNA를 포함하는 복합체를 사용하였다. 에어로졸에 마우스를 노출한 뒤 이틀 후, 마우스의 폐 시료를 채취하였다.

실시예 3: 웨스턴 블랏 분석

GPEI/PTEN 복합체에 노출된 K-ras 무표지 마우스에서 Akt-관련 신호전달 경로의 구성요소인 PDK1, Akt1, PTEN, mTOR, 4E-BP1, 그리고p70S6K와 같은 단백질 발현의 변화를 조사하기 위하여 웨스턴 블랏으로 분석하였다.

실시예 2 에서 수득한 폐 시료를 용해 버퍼(Promega 사, Madison, WI)를 이용하여 균질화하고, 채취된 단백질은 Bradford kit (Bio-Rad사, Hercules, CA)을 이용하여 정량 하였다. 동량의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하여 니트로셀룰로오스 멤브레인(Amersham Pharmacia 사, Cambridge, UK)으로 이동시켰다. 그 후, 멤브레인을 1시간 동안 블랏킹(blocking)시킨 후 실온에서 2시간 동안 특정 항체와 반응시켰다. 세척 후, 멤브레인을 HRP가 표지 되어 있는 이차항체와 반응시켜 Westzol enhanced chemiluminescence detection kit (Intron사, Sungnam, Korea)를 이용하여 반응시켰다. 발광된 밴드는 LAS-3000 (FUJIFILM사, Tokyo, Japan)을 이용하여 확인하였다.

도 3 은 본 발명의 생체 고분자/유전자 복합체를 통해 PTEN을 전달한 후 Akt 단백질을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 보여준다.

도 3a 는 PTEN 이 전달된 폐 세포에서 웨스턴 블랏으로 PTEN, PDK1, Akt1, Thr308 인산화 Akt, Ser473 인산화 Akt, 및 Ser2448 인산화-mTOR의 단백질 발현 수준 분석 결과를 보여준다. 도 3a로부터 PTEN 단백질의 발현 수준이 PTEN을 전달한 마우스에서 증가하였음을 알 수 있다. 도 3a 에서, C 는 콘트롤, V 는 벡터 콘트롤, PTEN 은 PTEN 이 전달된 폐를 나타낸다.

도 3a에서와 같이, 폐 세포에서 PTEN의 발현은 PTEN이 전달되지 않은 K-ras와 벡터 콘트롤에 비해 매우 높게 증가하였다. 반면에 도 3a에서와 같이, PTEN 유전자 전달은 PDK1, Akt1, Thr308 phospho-Akt, 그리고 Ser2448 phospho-mTOR 단백질의 발현을 감소시켰으나 Ser473 phospho-Akt는 어떤 변화도 보이지 않았다.

Akt 인산화의 변화를 알아보기 위하여, Akt와 phospho-Akt 단백질의 비율을 계산하였다.

도 3b 는 전체 Akt 에 대해, 인산화된 PTEN에서의 Akt 의 발현도를 보여준다. 도 3b에서 Akt 와 도 3c 에서 인산화된 Thr308 단백질의 발현 수준은 PTEN을 전달한 폐에서 유의성 있게 감소함을 알 수 있다. 그러나, 도 3d 에서 인산화된 Ser473의 단백질 발현 수준은 변하지 않음을 알 수 있다.

도3b및 도3c에서와 같이, 전체 Akt와 Thr308 phospho-Akt 발현 수준은 PTEN이 전달된 폐에서 vector control group에 비해 유의성 있게 감소하였다. 도 3d에서와 같이, 그러나 Ser473 phospho-Akt의 경우에는 벡터 콘트롤과 PTEN이 전달된 그룹 사이에서 유의적인 변화가 관찰되지 않았다.

결국, PDK1, Akt와 Thr308 인산화 Akt의 발현 감소가 PTEN이 전달된 폐에서 관찰되는 바, 이로부터 PTEN이 Akt를 직접적으로 조절하는 것을 알 수 있다.

도 4 는 Akt 신호 전달 경로에 관여하는 성분의 조절 결과를 보여준다.

도 4 로부터, 본 발명의 실시예에 따른 생체고분자/유전자 복합체에 의해 PTEN이 에어로졸 전달 방식으로 전달된 마우스의 폐에서 4E-BP1, p70S6K, 및 cyclin D1 의 발현 수준이 감소함을 알 수 있다. 도 4 에서, C 는 콘트롤, V 는 벡터 콘트롤이고, PTEN은 PTEN 이 전달된 폐를 의미한다.

도 4 에서와 같이, 에어로졸 PTEN 유전자 전달은 콘트롤에 비해 p70S6K과 cyclin D1 단백질의 발현 수준을 상당히 감소시켰고, 4EBP1은 control에 약간 감소시켰다.

이로부터 본 발명의 실시예에 따른 에어로졸 전달 시스템이 PTEN 단백질 발현 수준의 증가를 야기하고, 이러한 증가가 Akt 신호전달과 관련된 단백질의 활성 감소와 관련이 있다는 사실을 제시한다.

실시예 4: 면역침전 및 키나아제 분석

Akt 또는 mTOR의 인산화 감소는 흔히 키나아제(kinase) 활성의 감소와 관련되어 있다. 이러한 사실이 증가된 PTEN에 대한 반응으로 인한 경우인지를 확인하기 위하여, 마우스 폐조직에서 mTOR와 Akt를 면역침전시켜 각각의 기질인 PHAS I과 GSK를 사용하여 kinase 활성을 조사하였다.

실시예 2 에서 수득된 폐 시료에 대해 Seize^ㄾ primary mammalian immunoprecipitation kit (PIERCE, Rockford, IL)을 사용하여 mTOR의 면역침전을 실시하였다. mTOR 키나아제 분석은 300 μM의 ATP와 1 ㎍의 PHAS I (Calbiochem, San Diego, CA)을 사용하여 30분 동안 30℃에서 실시하였다. 5 배 샘플 버퍼를 추가하여 끓임으로써 반응을 정지시켰다. 시료는 15% SDS/PAGE로 분석하였다.

Akt의 키나아제 활성은 제조사의 지시에 따라 Akt 키나아제 분석 키트 (Cell Signaling Technology)로 분석하였다.

도 5 는 p-GSK, Akt, p-4EBP1및 mTOR의 키나아제 활성 분석의 결과를 보여준다.

도 5 로부터, PTEN 이 전달된 마우스의 폐에서 단백질의 키나아제 활성이 콘트롤에 비해 감소함을 알 수 있다. 도 5 에서, C 는 콘트롤, V 는 벡터 콘트롤이고, PTEN은 PTEN 이 전달된 폐를 의미한다.

그 결과, 도 5 에서와 같이, Akt의 활성은 PTEN가 전달된 마우스의 폐에서는 극명하게 감소하였으나 mTOR의 활성은 약간만 감소하였음을 알 수 있다.

실시예 5: 면역조직화학분석

폐에서의 Akt와 phospho-Akt (Thr and Ser)의 발현 수준을 확인하기 위하여 면역조직화학분석을 실시하였다.

실시예 2 에서 수득된 폐 시료를 즉시 얼음으로 냉각시킨 4% 포스페이트 버퍼 포름알데히드로 관류 고정시킨 후, 실온에서 후 고정시켰다. 그 후, 폐 시료를 실온에서 30% 수크로오스에 넣어 밤 동안 탈수시킨 후, Tissue-Tek OCT (Sakura 사, Torrance, CA)로 엠베딩(embedding)하였다. Microtome (Leica 사, Nussloch, Germany)을 이용하여 5 마이크로미터로 폐 시료 조직을 절단 한 후 양전하로 차지된 슬라이드(Fisher 사, Pittsburgh, PA)에 올렸다. 폐 시료의 동결 절편에서 내재성 과산화효소의 활성을 제거하기 위하여 0.3% 과산화수소(AppliChem 사, Darmstadt, Germany)로 30분 동안 반응시켰다.

에어로졸 방식의 유전자 전달의 효율을 측정하기 위한 면역형광염색을 위해 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 블라킹(blocking)하여 비특이적인 결합 부위를 차단하였다.

4℃에서 rat 항-마우스 대식세포/단핵구 항체 (MOMA, SeroTec, Raleigh, NC)를 조직 섹션에 밤 동안 반응시켰다. 다음날 조직 섹션을 세척하여 암실에서 항-rat IgG 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine) 이소티오시아네이트 복합 항체(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)와 1시간 동안 실온에서 반응시켰다.

세척 후 fluoromount (BDH, Dorset, UK)를 이용하여 커버슬립(coverslips)을 마운트하여 형광현미경(Carl Zeiss, Thornwood, NY) 하에서 관찰하였다. Akt와 p-Akt의 면역조직화학염색을 위하여, 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 블로킹하여 비특이적인 결합 부위를 차단하였다. 4℃에서 1차 항체를 조직 섹션과 밤새도록 반응시켰다.

다음날 조직 섹션을 세척하여 이차 HRP-복합 항체와 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 세척후 DAB 용액 [0.05% 3,3'-디아미노벤지딘 테트라히드로 클로라이드(Biosesang, Sungnam, Korea)과 0.03% 과산화수소]에서 5-10분 동안 반응시켰다. 핵을 표지 하기 위하여 조직 섹션을DAKOHematoxylin, Mayer's (DAKO, Carpinteria, CA)로 반대염색한 후 크실렌으로 세척하였다. Permount (Fisher)를 이용하여 커버슬립을 마운트하여 광학현미경(Carl Zeiss, Thornwood, NY) 하에서 관찰하였다.

도 6 은 Akt 의 인산화에 대한 면역 조직 화학 분석의 결과를 보여준다.

도 6 에서, 반응에 의한 표지는 갈색으로 나타나며, Akt 와 Thr308 phospho-Akt 는 PTEN 이 전달된 마우스의 폐(B 및 D)에 비해, 벡터 콘트롤 마우스이 폐(A 및 C)에서 높게 발현되었다. 그러나, Ser473 이 인산화된 Akt 의 경우에는 두 그룹의 차이가 나타나지 않았다(E 및 F).

실시예 6: 세포자살의 분석

Akt 경로의 저해로 인한 잠재적인 영향 중 하나는 세포자살(apoptosis)의 유도이다. 본 발명의 실시예 1에 따른 에어로졸 전달 복합체를 통해 전달된 PTEN이 세포자살을 유도하는지를 확인하기 위하여, 벡터 콘트롤과 PTEN 유전자를 전달한 폐 세포를 고정하고, TUNEL assay를 실시하였다.

실시예 2 에서 수득된 폐 시료 조직을 슬라이드 상에 위치시키고, 고정액 (4% PBS중 파라포름알데히드, pH 7.4)으로 고정한 후 PBS로 세척하였다. 그후, 폐 시료 조직을 얼음 위에서 2분간 0.1% 트리톤 X-100 (0.1% PBS 중 소듐 시트레이트)으로 투과화(permeabilization)시켰다. 그 후, 슬라이드를 PBS로 세척하여, 끊어진 DNA 말단을 제조사의 지시에 따라 in situ cell death detection kit (Roche, Basel, Switzerland)을 이용하여 terminal deoxy-U nick end labeling (TUNEL) 방법으로 표지 하였다. 마지막으로 조직 섹션을 메틸 그린(Trevigen, Gaithersburg, MD)으로 대조 염색하였다.

도 7 은 TUNEL 분석 결과를 보여준다.

도 7 에서와 같이, 세포 자실 신호(암갈색)가 벡터 콘트롤(A)에 비해 에어로졸 전달 방식에 의해 PTEN 이 전달된 폐(B)에서 확연하게 관찰되었다.

이로 부터, 에어로졸 전달 복합체에 의해 전달된 GPEI/PTEN에 의한 in vivo 상에서의 세포 자살이 유도되는 기능은 이러한 유전자 전달 방식이 세포 기능을 변화시킬 수 있다는 사실을 제시하였다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 특허청구범위와 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연하다.

본 발명은 고분자에 당을 적절하게 결합시킴으로써 세포로의 전달 효율성과 안정성을 증가시킨 유전자의 에어로졸 전달방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 생체고분자/유전자 복합체의 에어로졸 전달을 통한 PTEN의 전달이 PDK1를 억압하여 Akt 키나아제 활성을 억제하고, 결국 궁극적으로 종양 활성을 억제할 수 있는 효과를 달성할 수 있다.

본 발명의 생체고분자/유전자 복합체의 에어로졸 전달을 통한 PTEN의 전달이 mTOR를 포함한 Akt 경로뿐만 아니라 mTOR에 의존적인 eIF4E-BP1에도 영향을 주어, 폐암 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 효과를 달성할 수 있다.

Claims (12)

1. 소정의 유전자를 에어로졸 전달 방식으로 전달하기 위한 생체 고분자/유전자 복합체에 있어서,

   상기 생체 고분자가

   1 차 아미노산의 일부 이상이 당으로 치환된 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하고,

   상기 폴리에틸렌이민의 함량이 상기 소정의 유전자의 함량의 2 내지 4 배인

   생체 고분자/유전자 복합체.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 폴리에틸렌이민(PEI)에 포함되는 1 차 아미노산의 30 ~ 40 몰 %가 당으로 치환된 생체 고분자/유전자 복합체.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 1 차 아미노산이 포도당 또는 포도당 유사체로 치환되는 생체 고분자/유전자 복합체.
4. 제 3 항에 있어서,

   상기 1 차 아미노산이 18F-FDG으로 치환되는 생체고분자/유전자 복합체.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 유전자가 PTEN을 코딩하는 유전자를 포함하는 생체고분자/유전자 복합체.
6. 30~40 몰%의 1 차 아미노산이 포도당으로 치환된 폴리에틸렌이민(PEI) 및

   PTEN를 코딩 하는 유전자를 포함하는 생체고분자/유전자 복합체를 포함하고,

   상기 생체 고분자/유전자 복합체에서 상기 폴리에틸렌이민의 함량이 상기 유전자의 함량의 2 내지 4 배인 유전자 에어로졸 전달용 폐암 치료제.
7. 소정의 유전자를 에어로졸 전달 방식으로 전달하기 위한 생체 고분자/유전자 복합체의 제조 방법에 있어서,

   상기 생체 고분자에 1 차 아미노산의 일부 이상이 당으로 치환된 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하도록 하고,

   상기 폴리에틸렌이민의 함량을 상기 소정의 유전자의 함량의 2 내지 4 배가 되도록 하여,

   상기 생체 고분자와 상기 유전자를 결합시키는 것을 포함하는 생체 고분자/유전자 복합체 제조 방법.
8. 제 7 항에 있어서,

   상기 폴리에틸렌이민(PEI)에 포함되는 1 차 아미노산의 30 ~ 40 몰 %가 당으로 치환되도록 하는 생체 고분자/유전자 복합체 제조 방법.
9. 제 7 항에 있어서,

   상기 1 차 아미노산이 포도당 또는 포도당 유사체로 치환되도록 하는 생체 고분자/유전자 복합체 제조 방법.
10. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,

    상기 1 차 아미노산이 포도당 또는 포도당 유사체로 치환되도록 하는 생체 고분자/유전자 복합체 제조 방법.
11. 제 10 항에 있어서,

    상기 1 차 아미노산이 18F-FDG으로 치환되도록 하는 생체고분자/유전자 복합체 제조 방법.
12. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,

    상기 유전자가 PTEN을 코딩 하는 유전자를 포함하도록 하는 생체고분자/유전자 복합체 제조 방법.

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