JP2001507369A

JP2001507369A - 光活性薬剤としてのモノヒドロベンゾポルフィリン誘導体のエチレングリコールエステル

Info

Publication number: JP2001507369A
Application number: JP54758598A
Authority: JP
Inventors: スターンバーグ，イーサン; ドルフィン，デイビッド; ジー．レビー，ジュリア; エム．リッチャー，アンナ; ダブリュー．シー．ハント，デイビッド; ジェイン，アショック; エム．ウォーターフィールド，エリザベス
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2001-06-05
Anticipated expiration: 2018-05-06
Also published as: ES2171022T3; CN1113882C; IL132066A; AU741070B2; CN1254339A; EP0983273B8; EP1177795A3; EP1177795A2; HK1042439B; HUP0003604A3; NO995436D0; US5929105A; DE69803376D1; JP3378889B2; CA2284879A1; WO1998050387A1; CA2284879C; US6153639A; EP1177795B1; KR20010012331A

Abstract

(57)【要約】光力学的治療に有用な新規の化合物は、式（1）または（２）、（３）または（４）、ならびにそれらの金属化および/または標識化および/または結合体化形態であり、ここで各Ｒ¹は、独立して、アルキル（１〜6C）であり；各ｎは、独立して、０〜６の整数であり；そしてＲ²はビニルまたはその誘導体形態である。

Description

【発明の詳細な説明】光活性薬剤としてのモノヒドロベンゾポルフィリン誘導体のエチレングリコールエステル技術分野本発明は光力学的治療（PDT）に有用な化合物、および関連する適用に関する。詳細には、モノヒドロベンゾポルフィリンのエチレングリコールエステルに関する。背景技術光力学的治療（PDT）は、一般的に光（典型的には可視範囲であるが、近紫外でもある）を吸収し得る化合物の投与、続いて、被験体において毒性または抑制効果が所望される部位の照射を包含する。PDTは、最初は肺瘍の処置においてヘマトポルフィリンおよび関連化合物を用いて開発された。なぜならば、これらの化合物は急速に分裂する細胞を含む部位を「標的化（home）」すると思われるからである。次いで、腫瘍は、ヘマトポルフィリンによって吸収される光を用いて照射され、そして周囲組織の破壊が生じ得た。PDTはこれまでに、粥状硬化斑、再狭窄、血流中での感染、慢性関節リウマチ、乾癬の処置、および眼の状態の処置に有用であることが示されており、必ずしも腫瘍に制限されない。米国特許第5,171,749号、および関連出願（米国特許第5,283,255号；同第5,39 9,583号；同第4,883,790号；同第4,920,143号；および同第5,095,030号；これらのすべては本明細書中で参考として援用される）において発行している特許は、モノヒドロベンゾポルフィリンすなわち「BPD」と命名されたPDTにおいて有用な、光活性化合物のクラスを記載し、そして特許請求する。このクラスは一置換または二置換のアルキンのプロトポルフィリン-IXとのDiels-Alder反応によって得られ、そして得られた化合物はさらに異性化され、還元され、そして/または誘導体化されて広いクラスのBPDが得られ得る。これらの特許に開示されるように、このグループの特に有用なサブクラスは、Ｃ環およびＤ環上の2-カルボキシルエチル側鎖のエステル基の加水分解または部分的加水分解から得られる。Diels-Al der反応の間のこれらの基の保護としてのエステル化は、2-カルボアルコキシ（c arbalkoxy）エチル基を含む初期生成物を生じる。これらのエステルの容易な加水分解が容易く行われ得、ジカルボアルコキシアルキンから得られるDiels-Alde r生成物に関する任意のカルボアルコキシ基が、実際には完全に加水分解されずに残ることが見出された。このことにより、図1に示すような4つの種類の化合物、BPD-MA、BPD-MB、BPD-DAおよびBPD-DBが生成する；この図は米国特許第5,171, 749号から得た。この描写において、Ｒ¹およびＲ²はカルボアルコキシ基、典型的にはカルボメトキシまたはカルボエトキシであり、そしてＲはアルキル（1〜6 Ｃ）である。 BPD-MAは、特にPDTに有用な特性を有すると見出されており、そして現在は臨床開発中である。しかし、さらに特定の形態の光活性薬剤に対する必要性が残存し、この薬剤により、上記のように、PDTが適用される種々の適応に対する光活性化合物のレパートリーが広がる。本発明は、Ｃ環およびＤ環にカルボキシアルキル置換基のエチレングリコールエステルを含む化合物を提供する。これらの化合物はPDTが使用される特定の例において、利点である薬物動態特性を有する。発明の開示本発明の化合物は、光力学的治療および光活性化合物を使用する関連方法論における適用を見出す化合物のレパートリーに対する、新規の有用な追加である。これらの分子中のエチレングリコールエステルの存在は、これらの分子にこのような光活性化合物が使用される条件の範囲の拡大および処置の細かな調整を可能にする特性を提供する。従って、１つの局面において、本発明は以下の式の化合物に関し、そしてこれらの金属化（metallated）および/または標識化および/または結合体化形態に関し、ここでＲ¹はアルキル（１〜６Ｃ）、好ましくはメチルであり、ｎは０〜６の整数、好ましくは２であり、そしてＲ²はビニルまたはその誘導体、好ましくはビニルである。本発明はまた、以下の式の化合物、およびこれらの金属化および/または標識化および/または結合体化形態にも関し、ここでＲ¹、ｎ、およびＲ²は上記のように定義される。これらのアナログは、式１および２の化合物がプロトポルフィリンIXに由来する様式と同様の様式で、それぞれ、プロトポルフィリンIIIおよびプロトポルフィリンXIII由来である。本発明はまた、式１〜４の種々の形態の異性体を包含し、これは本明細書中で参考として援用される、米国特許4,883,790号に記載されるように、非転移Diels-A lder縮合生成物（すなわち、1,4-ジエン）から得られる。他の局面において、本発明は式１、２、３もしくは４またはそれらの1,4-ジエン異性体の化合物あるいはそれらの混合物を使用する診断方法および処置方法に関する。図面の簡単な説明図１は、先行技術の化合物、PBD-MA、PBD-MB、PBD-DAおよびPBD-DBを示す。図２は、L1210細胞によるB-EA6の取り込みの反応速度論を示す。図３は、L1210細胞によるB-EA6の放出の反応速度論を示す。図４は、インビボでのB-EA6の薬物動態の図示である。図５は、正常脾細胞およびL1210細胞によるB-EA6の取り込みの反応速度論の比較を示す。図６は、BPD-MAおよびBPD-MBで処理したマウスと比較した場合の、マウスでの B-EA6を使用するPDTの時間経過を示す。図７は、マウスにおける微小血管系に対するB-EA6の効果を示す。図８は、BPD-MAおよびB-EA6の血漿でのスペクトルの比較を示す。図9Aおよび9Bは、L1210細胞および樹状細胞での、BPD-MAと比較した場合のA-E A6を使用する光力学的処置の細胞傷害性効果を示す。図10は、A-EA6およびBPD-MAのMHC Iレセプターの表面発現の減少における相対効果を示す。図11は、HL60細胞におけるストレスおよびマイトジェン経路キナーゼに対する、A-EA6およびBPD-MAを使用する光力学的治療の効果を示す。図12は、HL60細胞におけるカスパーゼ活性化に対するA-EA6およびBPD-MAを使用するPDTの相対効果を示す。図13は、HL60細胞におけるDNA断片化に対するA-EA6およびBPD-MAを使用するPD Tの相対効果を示す。発明の実施の形態本発明の化合物は上に参照したBPDの特許に開示されるものに関連するが、本発明の化合物はＣ環およびＤ環上の置換基においてエチレングリコールのエステルを含むという点で異なる。これらの化合物は、カルボアルコキシアルキルまたはカルボアルコキシル置換基の単純な加水分解、ならびにベンゾポルフィリンのＣ環およびＤ環の得られるカルボキシル基の再エステル化によって調製され得るか、あるいはエステル転移反応によって直接的に得られ得る。化合物１および２は、上で参照された米国特許に記載される種類の個々の種であり、プロトポルフィリンIXとのDiels-Alder反応を包含するプロセスを介して得られるということが留意される。化合物３および４は、完全に類似の様式で調製されるが、Diels-Alder反応の基質としてプロトポルフィリンIIIまたはプロトポルフィリンXIIIを使用する。プロトポルフィリンIXはＡ環およびＢ環に関して対照的ではないので、Diels-Alder付加がＡ環で生じるか、またはＢ環で生じるかに依存して、２つの可能な生成物が得られる。一方でプロトポルフィリンIII およびプロトポルフィリンXIIIはこれらの環に関して対照的であり、それゆえ付加の部位に関わらず、各々の場合において１つの生成物のみが生じる。本発明の化合物において、Ｒ²は好ましくはビニルであるが、また、その誘導体でもあり得る。Ａ環またはＢ環におけるビニル基は、付加または酸化によって他の実施態様のＲ²に容易に誘導体化される。付加または酸化生成物は、付加される置換基が脱離基として機能性である場合、さらに置換され得る。例えば、-B rは、-OH、-OR''、-NH₂、-NHR''または-NR₂''などによって置換され得る（ここで、Ｒ''は炭化水素基である）。例えば、付加される置換基の１つは、水素および他のハロ、ヒドロキシ、低級アルコキシ、アミノまたはアミド、スルフヒドリルまたはオルガノスルフィドあるいはさらなる水素であり得る。本発明の化合物はＲ²として種々の基を含み、これにはさらなるポルフィリンまたはポルフィリン関連環系を提供する置換基を含む。従って、Ｒ²は、ビニル、-CHOR'、-CHO、-COOR'、-CH(OR')CH₃、-CH(OR')CH₂O R'、-CH(SR')CH₃、-CH(NR')₂CH₃、-CH(CN)CH₃、-CH(COOR')CH₃、-CH(OOCR')CH₃ 、-CH(NR'COR')CH₃、-CH(CONR'₂)CH₃、-CH(ハロ)CH₃または-CH(ハロ)CH₂(ハロ) であり得、ここでＲ’はＨまたはヘテロ原子置換基で任意に置換された炭化水素基（１〜６Ｃ）であり、あるいはここで、Ｒ²はビニル基の直接的または間接的誘導体化より生じる12Ｃより小さい有機基であるか、またはここで、Ｒ²は１〜３のテトラピロール型核を含む基である。本明細書中において使用される場合、用語「アルキル」は飽和直鎖炭化水素または飽和分枝鎖炭化水素をいい、十分な数の炭素原子を含む場合、環式であり得るか、または環式部分を含み得る。典型的な例は、メチル、エチル、t-ブチル、シクロヘキシルなどである。「炭化水素基」とは、炭素および水素のみを含有する１価の置換基をいい、これは直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和、芳香族または非芳香族あるいは両方、ならびに環式または非環式であり得る。従って、1〜10Ｃの炭化水素基は、シクロペンチルエチル、2-ペンテニル、3-ブチニル、2,4-ジメチルヘキシルなどを含み得る。本発明のいくつかの実施態様において、炭化水素基はヘテロ原子含有置換基で置換され得る。このような置換基は、-OR、-NR₂、-SR、-COOR、-CONR₂、-OOCR、 -NRCOR、-SOR、-SO₂R、-SO₃R、ハロ、-CNなどを含み、ここでＲはＨまたはアルキル（１〜６Ｃ）である。環式アミンは、ピリジル、ピリミジル、チアゾリル、キノリルなどを含む。従って、これらは単環系または縮合環系を含み得、そしてさらなるヘテロ原子を含み得る。本発明の化合物は少なくとも１つのキラル中心を含み、それゆえ種々の立体異性形態で存在し得ることが留意される。所望ならば、このような立体異性体（エナンチオマーを含む）は、当該分野で標準的な技術を使用して分離され得る；しかし、ラセミ混合物または１つより多くのジアステレオマーを含む混合物もまた、使用され得る。それゆえ、式１〜４に示される化合物は、場合に応じて、個々の光学異性体、エナンチオマーまたはジアステレオマー、ならびにこれらの個々のキラル異性体の混合物の代表である。所望される場合、本発明の化合物は、テトラピロール型核を適切なイオン（例えば、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、スズイオンなど）で処理して金属錯体を得ることによって金属化形態で調製され得る。金属イオンはまた、放射性標識であり得る。一般に、金属イオンは当該分野において標準的な条件下で適切な塩を用いて挿入され得る。例えば、亜鉛イオンは、1:1の塩化メチレン：メタノール中で、化合物を酢酸亜鉛で処理することにより導入され得る。化合物はまた、標識を含み得、これには放射性同位元素、発色団および蛍光標識が含まれる。一般に、放射性同位元素標識は、化合物がインビボへと続けられる場合、または特定の部分を標識するのに使用される場合に有用である。放射性同位元素である有用なカチオン性部分は、テクネチウム、ガリウムおよびインジウムを含む。さらに、分子自体の中のヘテロ原子の放射性同位元素（例えば、¹³ ¹ Ｉまたは³²Ｐ）あるいは¹⁴Ｃの含有物が、分子を標識するために使用され得る。上記のBPDに関連する特許にさらに記載されるように、所望されるならば、本発明の化合物は、この分子を特定の組織または器官に対して指向する標的化剤に結合され得る。このような標的化剤は、抗体、レセプター、レセプター−リガンドなどを含む。標的化剤の化合物に対する結合は、標準的技術を使用して行われる。「結合化形態」によって、上記のような、標的化剤に結合された式１〜４の化合物が意味される。式１〜４の化合物の好ましい実施態様は、両方のｎ＝２である化合物、または両方のＲ¹がエチルまたはメチル、好ましくはメチルである化合物、およびＲ²がビニルである化合物を含む。特に好ましいのは以下の式の化合物である。 A-EA6およびB-EA6は両方とも調製されている。両方とも有効な光増感剤であり；A-EA6はより処方しやすいようである。本発明の化合物の種々の形態は、当該分野において一般に公知の光力学的治療技術において使用され得る。上の背景の部に記載されるように、光力学的治療は、多くのプロトコールを使用し、ならびに種々の適応のために行われ得る。さらにこの型の化合物はいくつかの例における光が存在しない場合において薬理学的活性を示す。標準的な薬学的組成物（好ましくはリポソーム組成物を含む）は、このような適応で所望されるように使用される。以下の実施例は例示を意図するが、本発明の制限を意図しない。実施例は本発明の種類の２つのメンバー（A-EA6およびB-EA6)の驚くべき薬物動態特性を例示および実証するが、式１〜４で記載される残りの化合物がこれらの特性において同様の変動を有することが予期される。それゆえ、本発明に含まれる化合物の小さなクラスは、本治療が指向される種々の状態の処置に有用な光力学的薬剤のレパートリーに有益な追加を提供する。実施例１２つの形態のEA6の調製Ａ．B-EA6を調製するために、出発物質はジメチルエステルとしてBPD-DB、すなわち、図１に示されるようなBPD-DBであり、ここでＲ¹およびＲ²は両方ともCO OMeであり、Ｒ''はビニルである。 50mLのエチレングリコールおよび100mLのジクロロメタン中のBPD-DB 2.0g（2. 7mM）に1.0mLの硫酸を添加した。反応物を室温で18時間撹拌した。次いで反応物を、100mLの５％水性酢酸アンモニウムと100mLのジクロロメタンとの撹拌混合物に添加した。有機層を単離し、次いで50mLの水で２回洗浄した。溶媒をロータリーエバポレーションで除去した。次いで、暗緑色の残渣を75gのアルミナ（５％の水で不活化）でクロマトグラフにかけ、そしてジクロロメタン中の0.5％〜5.0 ％のメタノール勾配で溶出した。次いで、生成物を含有する画分から溶媒をロータリーエバポレーションによって除去した。残渣を減圧下で一晩乾燥し、2.02g （89％）の分析上純粋な緑色固体の表題化合物を得た。Ｂ．段落Ａに記載された様式と同様の様式ではあるが、BPD-DBの代わりにBPD- DAを使用して、異性体形態であるA-EA6を調製した。実施例２ L1210 細胞によるB-EA6およびBPD-MAの取り込みおよび放出の比較 BPD-MAまたはB-EA6を３μg/mlで、10％ウシ胎仔血清の存在下で10^-/mLのL1210 細胞（マウス白血病細胞株）とインキュベートした。光増感剤の細胞内含量を、種々の時点での細胞溶解物の蛍光によって測定した。B-EA6については最高濃度は145.9ng/10⁶細胞に達し、そしてBPD-MAについては149.5ng/10⁶細胞に達した。取り込みの時間経過を、両方の場合において60分（この時までに取り込みが最大に達した）での細胞含量のパーセントとして、図２に示す。示されるように、B- EA6のほうがより迅速に取り込まれ、ほんの５分後にはその最高濃度の80％に達し、そしてその最大取り込みは15分以内に達した。 L1210細胞からのこれらの薬剤の放出の反応速度論は、細胞に１時間の間３μ ｇ/mlで予め負荷を与え、次いで、細胞を薬剤の存在しない10％ウシ胎仔血清を含有する培地に配置することによって、測定した。残存する細胞内薬剤含量を、細胞を溶解し、そして蛍光を測定することによって、種々の時点で測定した。図３に示されるように（再び、開始時の細胞内含量のパーセントとして示されるように）、BPD-MAおよびB-EA6は異なる放出の反応速度論を示した。B-EA6の初期放出はさらにより迅速であったが、BPD-MAの場合では放出はより完全であった。インビトロにおけるB-EA6の薬物動態がBPD-MAの薬物動態より迅速であることは予想外であった。BPD-MAと比較した場合、B-EA6のより高い保持はその増加したサイズに起因され得るが、より速い細胞膜を介する移動は予想外であった。実施例３インビボでの薬物動態の比較 BPD-MAまたはB-EA6のいずれかを静脈内注射でDBA/2マウス（１つの時点当たり３匹のマウスを用いる）に４mg/kgの用量で投与した。血漿、皮膚、肝臓および腎臓の薬物含量を組織抽出物中の蛍光によって測定した。図４は、注射後15分での関連組織における濃度の割合としてプロットした結果を示す。図４に見られるように、BPD-MAまたはB-EA6のいずれも、血漿、肝臓または腎臓に蓄積しなかった；しかし、BPD-MAは最初の３時間以内に皮膚に蓄積した：B-EA6は蓄積しない。 BPD-MAと比較した場合、B-EA6のより迅速な蓄積は、ここで全ての組織からのより迅速なクリアランスによってインビボで確認されるように、利点となる。光での処置は光増感剤の注射後すぐに行われ得、そしてその迅速なクリアランスに起因して長期の皮膚または眼の光過敏症は示されない。従って、処置された被験体は、明るい光を避けたり暗色の眼鏡をかけたりのような特別な予防策を行わなくても正常な生活を再開し得る。次いで、種々の組織におけるB-EA6およびBPD-MAの半減期を、時間枠15分〜３時間で算出し、そして結果を図１に示した： ^*時間内に示された^** ３時間目までの間に皮膚において増加したBPD-MA濃度 †ＮＤ＝測定せずこの時間枠におけるBPD-MAの半減期は、皮膚においては算出し得なかった。なぜならば、その濃度が３時間の間は増加したからである。表１に示されるように、一般的に、ほとんどの組織においてB-EA6はBPD-MAより非常に短い半減期を有する。BPD-MAと比較した場合、正常な皮膚におけるB-EA6の蓄積の欠如は予想外であり、そしてBPD-MAのクリアランスより迅速なクリアランスを示す。上記のように、皮膚の光過敏症は光増感剤を利用する光力学的治療の唯一認識された副作用であるので、このことは利点である。また、薬物動態をインビボマウス腫瘍モデルを用いて測定した。M1横紋筋肉腫を有する10DBA/2マウスの群を、0.75〜1.5mg/kgの種々の用量でのBPD-MAのリポソーム処方物で静脈内注射した。注射後種々の時点で、腫瘍を690nmのレーザー光を用いて50または150J/cm²で照射した。結果は、表２に示されるように各群での注射後７日目に腫瘍を有さないマウスの割合の点から測定した。 ^*肺瘍モデル＝DBA/2マウスにおけるMI腫瘍−各PDT条件を10匹の動物で試験した。^** 薬剤はリポソーム処方し、そして静脈内注射した。^*** 690nmレーザー光表２に示すように、注射後の時間が15〜180分の範囲である場合、BPD-MA処置したマウスはかなりの生存率を示す。一方で、B-EA6処置したマウスは30分または180分では反応を示さない；しかし、ほんの15分後に照射を供給した場合は、有意な反応を得た。これらのデータは、B-EA6を使用するPDTが、光での初期の処置に有効であることを示す。注射後の遅い時期での効果の欠如は、上記の理由のために有利である B-EA6の迅速なクリアランスを再び示す。実施例４血清存在下および非存在下でのLD₅₀の測定 B-EA6またはBPD-MAのいずれかをｌ時間L1210細胞と共に一定の濃度でインキュベートし、そして９J/cm²の広域スペクトル光に曝した。この測定を、血清の非存在下で、および10％血清の存在下で行った。結果を表３に示す。示されるように、BPD-MAおよびB-EA6は同程度のLD₅₀値を血清非存在下で有する；しかし、血清存在下では、B-EA6はかなりより良好な有効性の保持を示す。ほとんどの例において、血清の存在は、PDTにおいて使用される薬剤（例えば、BPD-MA）の光活性を非常に減少する。驚くべきことに、B-EA6は血漿成分に対してよりも、細胞膜に対してより親和性を示し、従って細胞環境において血清の存在により非常にわずかに影響される。従って、インビボにおいて、その活性は PBD-MAおよびこのファミリーの他の化合物の活性よりも高くあり得る。実施例５ B-EA6 のインビトロでの効果インビトロでL1210細胞に細胞傷害効果を及ぼすB-EA6の能力を、細胞を種々の濃度のB-EA6とともに１時間の間、血清非存在下においてインキュベートすることによりさらに試験した。過剰の薬剤を除去した後、細胞を９J/cm²の広域スペクトル光（380〜750nm）に曝し、そして細胞生存率をMTTアッセイにより測定した（Mosmann,T.ら、J Immunol Meth（1983）65:55-63）。死細胞の割合を、光に曝しただけの細胞の生存率を参照して算出した。約７ng/mlの濃度では、80％の細胞が死滅した；15ng/mlでは、ほとんど100％の細胞が生存しなかった。上記のように、B-EA6に対するLD₅₀は約4.7ng/mlである。インビトロでのBPD-MAと比較した場合のB-EA6のいくらか低い効果は、実施例４に示すような血清存在下でのインビボでのBPD-MAと比較した場合のB-EA6のかなりより高い活性を、さらにより予想外のものとする。実施例６腫瘍細胞についてのB-EA6の選択性 L1210細胞のB-EA6を蓄積する能力は、脾細胞の同様の能力に匹敵した。３μg/ mlのB-EA6を各細胞型と共にインキュベートし、そしてB-EA6の細胞含量を細胞溶解物中の蛍光によって測定した。図５に、２つの細胞型についてのng/10⁶細胞での取り込みの比較を示す。示されるように、L1210細胞は、約20分後にこの値に達する約140ng/10⁶細胞を取り込み得た。一方で、脾細胞は１時間のインキュベーション後に20ng/10⁶細胞より少なく蓄積した。その脇腹の皮下で増殖したM1（横紋筋肉腫）腫瘍を保有するDBA/2マウスを、B -EA6が腫瘍に対して選択性を示すことを示すモデルとして使用した。マウスに0. 75mg/kgのB-EA6をリポソーム処方物で静脈内に投与した。15分後、5mmの直径の腫瘍を含む１cmの領域を、アルゴン励起色素レーザーからの50J/cm²の690nmの波長の70mWの光に曝した。照射は効果的に腫瘍を排除し、周辺の正常皮膚には影響を与えなかった。従って、B-EA6は腫瘍特異性を示す。実施例７ B-EA6 による免疫調節 Balb/Cマウス（１群当たり５〜８匹のマウス）を、接触性過敏症（CHS）アッセイとも呼ばれる遅発性皮膚光過敏症アッセイを用いて試験した。感作薬剤であるジニトロフルオロベンゼン（DNFB）をマウスの脇腹に塗り、そして５日後、片耳にDNFBをチャレンジし、一方、他方はコントロールとして作用する。腫脹は免疫応答の指標である。マウスに１mg/kgのリポソームB-EA6を静脈内注射し、そして全身にわたって15J/cm²の光を照射するか、または周辺光に曝すかのいずれかを行った。耳腫脹の阻害によって示されるこの処置の免疫応答を予防する能力を、測定した。結果は、15J/cm²での全身の光照射または周辺光での照射後のいずれかと組み合わせたB-EA6の投与が、非処置マウスと比較した場合に試験耳における腫脹を減少することを示した。両方の場合において、腫脹は、処置をしないマウスで示された腫脹の約60％のみであった。免疫調節を測定するさらなるアッセイでは、マウス腹膜マクロファージを単離、精製および組換えインターフェロン−γ（100U/ml）によって活性化した。活性化した細胞を１時間、37℃で一定の濃度のB-EA6と共にインキュベートし、次いで５J/cm²で690nmのLED光に曝した。MHC I、MHC II、CD54、CD80およびCD86の発現レベルを24時間後にFITC結合型抗体およびセルソーターを用いて測定した。 0.5ng/mlのB-EA6についての結果を、2.5ng/mlでBPD-MAを使用した同様の実験と比較して表４に示す。表中の結果は、光のみで処置した細胞と比較した発現の割合として示されている。示されるように、BPD-MAおよびB-EA6は両方ともMHC IIの発現を減少し得るが、残りの表面マーカーは減少しなかった。従って、B-EA6は有利な薬物動態を有するが、BPD-MAおよびこのグループの他の化合物の免疫調節活性を保持する。実施例８関節炎モデルにおけるB-EA6の効果 MRL-Iprマウスは自然に関節炎を発症する；これはフロインドアジュバントの皮内注射によって増強された。種々の数のMRL-Iprマウスを、アジュバントの注射後０、10および20日目にPDTを用いて処置した。0.5mg/kgのリポソームB-EA6からなるPDTを静脈内に注射し、続けてマウス腹部を赤色（560〜900nm）光に80J/c m²でB-EA6注射後１時間目に照射した。マウスを観察し、そして症状を５日毎に3 0日間スコアした。結果を、BPD-MAおよびBPD-MBで同様に処置したマウスと比較して図６に示す。図６に示されるように、臨床症状の発生率（すなわち、これらの徴候を示すマウスの割合）によって測定されたものであろうと、または両くるぶし間（bimaleolar）の足首の幅のmmでの変化によって測定されたものであろうと、B-EA6（黒丸として示す）はアジュバント注射の続発症の予防に効果的であった。再び、B-EA6の免疫調節活性の保持を示す。実施例９微小血管系に対するB-EA6の効果マウス精巣挙筋モデルを使用した。B-EA6を静脈内に2mg/kgで注射し、そして外科的に露出した小動脈および小静脈を、B-EA6の注射後５分および15分で始めて５分あたり25J/cm²の強度の光で照射した。血管を赤血球柱（column）直径としてコントロールのパーセントとして測定した。結果を図７に示す。５分で照射を開始した場合、一過性の血管閉鎖が得られ得、一方、15分後に照射を開始した場合、永続性の閉鎖が得られた。 B-EA6の、血管系を狭窄する、または閉鎖する増強された能力は、本実施例に示されるように、より迅速な薬物動態と組み合わせて、B-EA6を、眼での血管新生疾患の処置において特に有利にする。実施例10 B-EA6 の吸収スペクトル BPD-MAおよびB-EA6は、蛍光（380〜750nm）に対する４時間の照射の前および後で、血漿において類似の吸収スペクトルを有する。これらのスペクトルの比較を図８に示す。B-EA6のスペクトルの、BPD-MAのスペクトルに対する類似性は、有利である。なぜならば、PDTで有用な治療剤としてのPBD-MAの使用は、よく発達しているからである。これらのスペクトルの類似性は、BPD-MAでの処置においてうまくいくのと同じ光源がB-EA6について使用され得ることを示す。実施例11 A-EA6 のインビトロ細胞傷害性実施例５に記載の様式と同様の様式において、インビトロでの２つの異なる細胞株に対するA-EA6の細胞傷害性を試験し、そしてBPD-MAと比較した。L1210細胞または樹状細胞株D2SC/1のいずれかを、１時間、37℃で、A-EA6またはBPD-MAのいずれかと共にインキュベートした。過剰の薬剤を除去した後、細胞を690nmの光に対して、樹状細胞については５J/cm²の光、およびL1210細胞については９⁰J /cm²の光で曝した。細胞生存率を18〜24時間後に、実施例５に記載されるMTT比色アッセイを使用して測定した。死細胞のパーセントは光のみに曝した細胞を参考することにより算出した。図９Ａに示されるように、A-EA6はL1210細胞に関して血清の非存在下ではBPD-MAに対して同等の細胞傷害性を示すが、血清の存在下ではBPD-MAより顕著に毒性であった。白丸はA-EA6＋血清を表す；黒丸はBPD-MA ＋血清を表す；白四角は血清非存在でのA-EA6を表す；および黒四角は血清非存在でのBPD-MAを表す。図９Ｂに示されるように、樹状細胞においては（ここでBPD-MAは6ng/mlのLD₅₀ を有し、A-EA6は2.7ng/mlのLD₅₀を有する）、５％ウシ胎仔血清存在下でA-EA6は BPD-MAよりも低い濃度で毒性であった。図9Bにおいて、黒丸はBPD-MAを示し、そして白四角はA-EA6を示す。類似の測定ではあるが、細胞傷害性以外にMHC Iレセプターの測定において、A -EA6はより低い濃度でこれらのレセプターの発現を減少させるのに有効であった。この測定において、樹状細胞を１時間、そのLD₅₀よりも低い薬剤濃度でインキュベートした；BPD-MAについては2.5ng/mlおよび5ng/ml、ならびにA-EA6については１ng/mlおよび2.5ng/ml。細胞を5J/cm²の690nmの光で処置し、次いで適切な抗体で処置後３時間標識し、そしてフローサイトメトリーで評価した。結果を、光で処理したコントロール細胞についての平均チャネル蛍光強度のパーセントとして測定した。これらの結果を図10に示す；BPD-MAは、2.5ng/mlおよび5ng/mlで、それぞれ18％および29％の減少を生じ；A-EA6はlng/mlおよび2.5ng/mlの両方の濃度で約25％のチャネル蛍光を低下した。実施例12 細胞内シグナリングに対するA-EA6の効果実施例11に記載した研究の条件を、標的としてHL-60細胞を使用して反復し、そしてA-EA6およびBPA-MAの、細胞傷害性、マイトジェン経路キナーゼp70 S6Kならびにストレス経路キナーゼc-junおよびHSP27に対する効果を比較した。結果を図11に示す。致死量以下の濃度で、A-EA6はストレス経路キナーゼのより強い活性化およびマイトジェン経路キナーゼのより強い阻害を示した。 HL-60細胞におけるカスパーゼ活性化に対する効果もまた測定した。A-EA6は、 BPD-MAが示すよりも強いカスパーゼの活性化を示した。この効果はアポトーシスに関連する場合に所望される。不必要な細胞を除去するためにアポトーシスを使用することは、周辺の正常細胞および組織に対する影響を最少にする。A-EA6のB PD-MAとの比較を図12に示す。図13は、HL-60細胞においてDNA断片化パーセントを測定した場合での同様の比較を示す。再び、A-EA6はBPD-MAよりも低い濃度で有効であった。実施例13 A-EA6 を使用するインビボ光力学的治療実施例３に記載されるプロトコールと同様のプロトコールで、A-EA6またはBPD -MAのいずれかを、M1腫瘍を保有するマウスに１mg/kgの用量で静脈内に注射した。これを、次いで、薬剤の投与後種々の時点で50J/cm²の690nmレーザー光での全身照射を行った。７日目に肺瘍を有さない動物の数を測定し、そして結果を表５に示す。これらの結果は、このアッセイにおいてA-EA6が少なくともBPD-MAと同様に有効であることを示す。実施例14 免疫調節活性コントロールおよび試験マウスの脇腹に抗原DMFBを塗り、そしてその耳に５日後に同じ化合物を塗ることによってチャレンジした。試験動物を、BPD-MAまたは A-EA6を使用して、光増感剤を静脈内に注射し、次いで動物を赤色LED光に15J/cm² で曝すことによって全身PDTで処置した。耳腫脹の抑制パーセントをコントロールと比較して算出した。結果を表６に示し、そしてこれはA-EA6がこのアッセイにおいてBPD-MAが有するよりも強い免疫調節効果を有することを示す。

【手続補正書】【提出日】平成１２年６月１３日（２０００．６．１３）【補正内容】 6.1 請求の範囲を別紙のとおり補正します。 6.2 明細書を以下の通り補正します。（１）明細書９頁３行に「１０^-／ｍＬ」とあるのを、「１０⁷／ｍＬ」に補正します。（２）明細書１６頁１０行〜１１行に「９⁰Ｊ／ｃｍ²」とあるのを、「９Ｊ／ｃｍ²」に補正します。請求の範囲１．以下の式の化合物、およびこれらの金属化および/または標識化および/または結合体化形態：ここで各々のＲ¹は独立してアルキル（１〜6C）であり；各ｎは独立して0〜6の整数であり；そしてＲ²はビニルまたはその誘導体形態である。２．請求項１に記載の化合物であって、Ｒ²がビニル、−CHOR'、−CHO、−COOR' 、−CH（OR'）CH₃、−CH(OR')CH₂OR’、−CH(SR')CH₃、-CH(NR')₂CH₃、−CH(CN) CH₃、−CH(COOR')CH₃、−CH(OOCR')CH₃、−CH(NR'COR')CH₃、−CH(CONR'₂)CH ₃ 、−CH(ハロ)CH₃または−CH(ハロ)CH₂(ハロ)であり、ここでR'がＨ、または必要に応じてヘテロ原子置換基で置換された炭化水素基（１〜６Ｃ）であるか、あるいはＲ²がビニル置換基の直接または間接誘導体化から得られる12Ｃより小さい有機基であるか、あるいは、Ｒ²が１〜３のテトラピロール型核を含む基である、化合物。３．金属化形態であり、および/または結合体形態であり、および/または標識されている、請求項１または２に記載の化合物。４．金属イオンを含まない、請求項１または２に記載の化合物。５．Ｒ²がビニルであり、および/または各Ｒ¹がメチルであり、および/または両方のｎが２である、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。６．Ｒ²がビニルであり、そして両方のＲ¹がメチルである、請求項５に記載の化合物。７．以下の式を有する請求項６に記載の化合物、ならびにこれらの金属化および /または標識化および/または結合体化形態：８．金属化形態であり、および/または結合体化形態であり、および/または標識されている、請求項７に記載の化合物。９．金属イオンを含まない、請求項７に記載の化合物。１０．少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせられている、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物を含む薬学的組成物。１１．光力学的治療または診断を必要とする被験体に対し、該治療または診断を行うための薬学的組成物であって、該組成物が光活性薬剤として請求項１〜９のいずれかに記載の化合物を含む、組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スターンバーグ，イーサンカナダ国ブイ６アール１ピー８ブリティッシュコロンビア，バンクーバー, ウエスト４ティーエイチアベニュー 3837 (72)発明者ドルフィン，デイビッドカナダ国ブイ６アール２アール２ブリティッシュコロンビア，バンクーバー，ウエスト 12ティーエイチアベニュー 4464 (72)発明者レビー，ジュリアジー. カナダ国ブイ６ジェイ４ゼット３ブリティッシュコロンビア，バンクーバー，ペニーファーシングレーン 1490 ナンバー601 (72)発明者リッチャー，アンナエム. カナダ国ブイ６ティー１エックス４ブリティッシュコロンビア，バンクーバー，トロントロード 5775 ピーエイチ１ (72)発明者ハント，デイビッドダブリュー．シー. カナダ国ブイ４ビー４ダブリュー３ブリティッシュコロンビア，ホワイトロック，ハブグッドストリート 886 (72)発明者ジェイン，アショックカナダ国ブイ５ティー３エル５ブリティッシュコロンビア，バンクーバー, ブランズウィックストリート 2150 ナンバー209 (72)発明者ウォーターフィールド，エリザベスエム. カナダ国ブイ６エル３エイ４ブリティッシュコロンビア，バンクーバー，ボレンハイムストリート 4610

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の式の化合物、およびこれらの金属化および/または標識化および/または結合体化形態：ここで各々のＲ¹は独立してアルキル（1〜6C）であり；各ｎは独立して0〜6の整数であり；そしてＲ²はビニルまたはその誘導体形態である。２．請求項１に記載の化合物であって、Ｒ²がビニル、−CHOR'、−CHO、−COOR' 、−CH（OR'）CH₃、−CH(OR')CH₂OR’、−CH(SR')CH₃、-CH(NR')₂CH₃、−CH(CN) CH₃、−CH(COOR')CH₃、−CH(OOCR')CH₃、−CH(NR'COR')CH₃、−CH(CONR'₂)CH ₃ 、−CH(ハロ)CH₃または−CH(ハロ)CH₂(ハロ)であり、ここでR'がＨ、または必要に応じてヘテロ原子置換基で置換された炭化水素基（１〜６Ｃ）であるか、あるいはＲ²がビニル置換基の直接または間接誘導体化から得られる12Ｃより小さい有機基であるか、あるいは、Ｒ²が１〜３のテトラピロール型核を含む基である、化合物。３．金属化形態であり、および/または結合体形態であり、および/または標識されている、請求項１または２に記載の化合物。４．金属イオンを含まない、請求項１または２に記載の化合物。５．Ｒ²がビニルであり、および/または各Ｒ¹がメチルであり、および/または両方のｎが２である、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。６．Ｒ²がビニルであり、そして両方のＲ¹がメチルである、請求項５に記載の化合物。７．以下の式を有する請求項６に記載の化合物、ならびにこれらの金属化および /または標識化および/または結合体化形態：８．金属化形態であり、および/または結合体化形態であり、および/または標識されている、請求項７に記載の化合物。９．金属イオンを含まない、請求項７に記載の化合物。１０．少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせられている、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物を含む薬学的組成物。１１．光力学的治療または診断を行うために改良された方法であって、該方法が光活性化合物を該治療または診断を必要とする被験体に投与する工程を含み、該改良が光活性薬剤として請求項１〜９のいずれかに記載の化合物の使用を含む、方法。