CZ392399A3

CZ392399A3 - Etylénglykol estery monohydrobenzénporfyrínových derivátů jako fotoaktivní činidla

Info

Publication number: CZ392399A3
Application number: CZ19993923A
Authority: CZ
Inventors: Ethan Sternberg; David Dolphin; Anna M. Richter; Julia G. Levy; David W. C. Hunt; Jain Ashok; Elizabeth M. Waterfield
Original assignee: Qlt Phototherapeutics, Inc.; The University Of British Columbia
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2000-02-16
Also published as: HUP0003604A2; PT983273E; AU7420798A; NO995436D0; HU221754B1; US5929105A; ATE211473T1; EP0983273B1; AU741070B2; NO314264B1; EP1177795A2; CZ294715B6; EP0983273B8; CN1254339A; KR20010012331A; HUP0003604A3; NO995436L; US6153639A; CA2284879C; HK1042439B

Description

Oblast techniky

Vynález se týká sloučenin, užitečných ve fotodynamické terapii (PDT) a souvisících aplikacích. Zvláště se týká etylénglykolových esterů monohydrobenzenpofyrinů.

Dosavadní stav techniky

Fotodynamická terapie (PDT) zahrnuje všeobecně podávání sloučenin, které jsou způsobilé absorbovat světlo, typicky ve viditelné oblasti, ale také v blízké ultrafialové oblasti, jako následek ozáření míst subjektu, pro která se žádá toxický nebo inhibiční účinek. PDT byla zpočátku vyvinuta za použití hematoporfyrinu a týkala se sloučenin pro léčení tumorů, jak se to zjistilo, když tyto sloučeniny „zdomácněly na místech, která obsahovala rychle se dělící buňky. Tumor by mohl být tedy ozařován světlem, absorbovaným hematoporfyrinem a výsledkem by byla zničená okolní tkáň. PDT se od té doby ukázala být užitečná pro léčení aterosklerotických skvrn, restenózy, infekcí krevního oběhu, reumatoidní artritidy, psoriázy a při léčení za očních stavů, neomezujících se bezpodmínečně na tumory.

US patent 5 171 749 a patenty, vydané na související přihlášky, US patenty čísla 5 283 255, 5 399 583, 4 883 790, 4 920 143 a 5 095 030, na všechny se zde odkazuje, popisují a nárokují třídu fotoaktivních sloučenin, užitečných v PDT, jmenují monohydroxybenzoporfyriny nebo „BPDs. Tato třída sloučenin se získává Diels- Alderovou reakcí mono- nebo di- subtituovaného alkinu s protoporfyrinem-IX a výsledné sloučeniny se mohou dále izomerizovat, redukovat a/nebo z nich vytvořit deriváty, • · • · · • · · · · · aby se získala velká třída BPDs. V těchto patentech se objevuje zvlášť užitečná podtřída z této skupiny, rezultující z hydrolýzy nebo částečné hydrolýzy esterových skupin 2- karboxyetylových postranních řetězců na kruzích C a D. Esterifikace jako ochrana těchto skupin během DielsAlderovy reakce rezultuje v počáteční produkty, které obsahují 2- karbalkoxyetylové skupiny. Bylo zjištěno že je možno snadno provést hydrolýzu těchto esterů, přičemž všechny karbalkoxy skupiny spojené s Diels- Alderovoyým produktem, získaným z dikarbalkoxy-alkinu, zůstanou prakticky zcela nehydrolyzované. Z toho vyplývají čtyři druhy sloučenin, BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA a BPD-DB jak je zobrazeno na obr. 1; tento obrázek byl převzat z US patentu č. 5 171 749. V tomto vyobrazení jsou R¹ a R² karbalkoxy skupiny, typicky karbometoxy- nebo karboetoxy- skupina a R je alkyl ( 1 až 6 C ).

Bylo zjištěno, že BPD-MA má zvlášť užitečné vlastnosti pro PDT a je v současné době v klinickém zkoušení. Jakkoli, zůstává však požadavek na další specifické formy fotoaktivních činidel, které rozšíří repertoár fotoaktivních sloučenin pro různé indikace na něž se PDT aplikuje, jak je shora poznamenáno. Tento vynález poskytuje sloučeniny, v nichž kruhy C a D obsahují estery etylén- glykolu karboxy- alkylových substituentů. Tyto sloučeniny mají farmakokinetické vlastnosti, které jsou výhodné v určitých případech, kde se používá PDT.

Podstata vynálezu

Sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné jako nové příspěvky k repertoáru fotoaktivních sloučenin, které nalézají použití ve fotodynamické terapii a týkají se metodologií, které využívají fotoaktivních činidel. Přítomnost esterů etylénglykolu v těchto molekulách jim dává vlastnosti, které dovolují rozšířit rozsah podmínek, za kterých se takové fotoaktivní sloučeniny používají a jemně modifikují postup léčení.

• · · 9 • · · 9

999 999 • · 9 9 9 9

Tedy, v jednom aspektu je vynález zaměřen na sloučeniny vzorce

R¹OOC,

FťOOC

/

COOR¹

Η. I COOR¹

h,CR.

ΟόΟΟΗ,ΟΗ,ΟΗ ^ΟΟΟΗ,ΟΗ,ΟΗ fcoOCH^OH ne6<

a jejich kov obsahující a/nebo značené a/nebo konjugované formy, kde R¹ je alkyl ( 1 až 6 C), výhodně metyl, n je celé číslo 0 až 6, výhodně 2 a R² je vinyl nebo jeho derivát,výhodně vinyl sloučeniny vzorce

Vynález je tedy zaměřen na rOoc

R¹OOC

(chj, (oy.

cÓoCHjCHjOH COOCHjCHjOH ηβ/ο

COOR¹

Η I COOR¹

Wn

COOCHjCHjOH COOCHjCHjOH a jejich kov obsahující a/nebo značené a/nebo konjugované formy, kde n a R² jsou definovány jak shora popsáno. Tato analoga jsou odvozena od protoporfyrinu III a popřípadě • · · • · · · · · • · · protoporfyrinu XIII způsobem podobným tomu, kterým jsou odvozeny sloučeniny vzorců 1 a 2 od protoporfyrinu IX. Vynález zahrnuje také izomery od různých forem vzorců 1 až 4, které rezultují z produktů kondenzace Diels- Alderovy reakce s nezměněným uspořádáním (tj . 1,4- dien), jak je popsáno v US patentu 4 883 790 včleněného zde do odkazů.

V jiném aspektu se vynález týká způsobů diagnózy a léčení za použití sloučenin vzorce 1, 2, 3 nebo 4 nebo jejich 1,4dienových izomerů nebo jejich směsí.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 představuje sloučeniny známé ze stavu techniky, BPDMA, BPD-MB, BPD-DA a BPD-DB.

Obr. 2 znázorňuje kinetiku absorpce B-EA6 buňkami L 1210.

Obr. 3 znázorňuje kinetiku uvolňování B-EA6 buňkami L 1210.

Obr. 4 ukazuje grafické zobrazení farmakokinetiky B-ΕΑβ in vivo.

Obr. 5 ukazuje srovnání kinetiky absorpce B-EA6 normálními splenocyty a buňkami L 1210.

Obr. 6 ukazuje časový průběh PDT za použití B-EA6 v myši ve srovnání s myší, na kterou se působilo BPD-ΜΑ a BPD-MB.

Obr. 7 ukazuje účinek B-EA6 na mikrovaskulaturu myši.

Obr. 8 ukazuje srovnání spekter v plazmě BPD-ΜΑ a B-EA6.

Obr. 9A a 9B ukazuje cytotoxický účinek fotodynamického působení při použití A-EA6 ve srovnání s BPD-ΜΑ v buňkách L 1210 a v dendritických buňkách.

• · · ♦ · · · · · ··· ·· · · ···· • · · · · · · · ·

5· ····· · · · · ··· ··· • · · · · · 4 ·· · ··· ··· ·· ··

Obr. 10 ukazuje porovnání účinků PDT při použití A-EA6 a BPD-MA, vyjádřené zmenšujícím se povrchem MHO I receptorů.

Obr. 11 ukazuje účinek fotodynamické terapie při použití A-EA6 a BPD-MA na tlak a kinetiku cesty nepřímého dělení buněk HL 60.

Obr. 12 ukazuje porovnání účinků PDT při použití A-EA6 a BPD-MA na aktivaci kaspázy v buňkách HL 60.

Obr. 13 ukazuje porovnání účinků PDT při použití A-EA6 a BPD-MA na fragmentaci v buňkách HL 60.

Příklady provedení vynálezu

Sloučeniny podle vynálezu se týkají těch, jež jsou popsány ve shora citovaných patentech BPD, ale liší se v tom, že obsahují estery etylénglykolu v substituentech na kruzích C a D. Tyto sloučeniny se mohou připravit jednoduchou hydrolýzou karbálkoxyalkylových nebo karbalkoxylových substituentů a reesterifikací vzniklých karboxylových skupin v řetězcích C a D benzoporfyrinů nebo se může získat přímo transesterifikací.

Budiž poznamenáno, že sloučeniny 1 a 2 jsou představitelé sloučenin, popsaných ve shora uvedených US patentech, získaných způsobem, který zahrnuje Diels- Alderovu reakci s protoporfyrinem IX. Sloučeniny 3 a 4 byly připraveny zcela analogickým způsobem při užití protoporfyrinu III nebo protoporfyrinu XIII jako substrátů pro Diels-Alderovu reakci. Protože protoporfyrin IX je vzhledem k A a B kruhům nesymetrický, vznikají dva možné produkty, závislé na tom, zda se Diels- Alderova adice objevuje v kruhu A nebo B.

Z druhé strany jsou protoporfyriny III a XIII vzhledem k těmto kruhům symetrické a proto vzniká v každém případě pouze jeden produkt bez ohledu na polohu adice.

• · ·

Ve sloučeninách podle vynálezu je R² výhodně vinyl, ale může to být také jeho derivát. Vinylová skupina v kruhu A nebo B se snadno derivatizuje na jiné formace R² adicí nebo oxidací. Adiční nebo oxidační produkty mohou být dále substituovány, jestliže adované substituenty jsou funkční jako odstupující skupiny, např. -Br může být substituován OH, -OR , -NH₂, -NHR nebo -NR₂ atd., kde R je uhlovodíkový radikál. Například jedním z adovaných substituentů může být vodík a jiným může být halogen, hydroxyl, nižší alkoxylová skupina, amino- skupina nebo amid, sulfhydryl nebo organosulfid nebo další vodík. Sloučeniny podle vynálezu zahrnují různé skupiny jako R²včetně substituentů, které poskytují další porfyrin nebo porfyrinu příbuzný kruh.

Tedy, R² může být vinyl, -CHOŘ', -CHO, COOR', -CH(OR')CH3, -CH(OR')CH₂OR', -CH(SR')CH₃, -CH(NR' )₂CH₃, -CH(CN)CH₃, CH(COOR')CH₃, -CH(OOCR')CH₃, -CH(NR'COR')CH₃,

CH (CONR'₂) CH₃, -CH (halo) CH₃, nebo CH (halo) CH₂ (halo) , kde R' je H nebo uhlovodíkový radikál (1 až 6 C) případně substituovaný heteroatomovým substituentem, nebo kde R² je organická skupina o nižším počtu C než 12, vznikající přímou nebo nepřímou vytvořením derivatizací vinylové skupiny, nebo kde R² je skupina, obsahující 1 až 3 jádra typu tetrapyrolu.

Zde užívaným termínem „alkyl se míní nasycený rovný nebo rozvětvený uhlovodíkový řetězec, který může, má-li dostatečný počet atomů uhlíku, být cyklický nebo obsahovat cyklickou část. Typické příklady jsou metyl, etyl, t-butyl, cyklohexyl a pod.

„Uhlovodíkový radikál znamená monovalentní substituent, obsahující jen uhlík a vodík, které mohou tvořit rovný nebo rozvětvený řetězec, nasycený nebo nenasycený, aromatický nebo nearomatický nebo obojí a cyklický nebo necyklický.

• · *··· · · « · · ·

7· ·····« » · · ··· · ·· • · · · · · · ·· · ··· ··· ·· ··

Tedy uhlovodíkový radikál o 1 až 10 C může zahrnovat cyklopentyletyl, 2-pentenyl, 3-butynyl, 2,4-dimetylhexyl a pod.

V některých provedeních vynálezu může být uhlovodíkový radikál substituován substituentem, obsahujícím heteroatom. Takové substituenty zahrnují -OR, -NR2, -SR, -COOR, -CONR2, -OOCR, NRCOR, -SOR, -SO2R, halo, -CN a pod. kde R je H nebo alkyl (1 až 6 C). Cyklické aminy zahrnují pyridyl, pyrimidyl, thiazoyl, chinolyl, a tak dále. Tedy mohou zahrnovat jednoduché kruhy, systémy kondenzovaných kruhů a mohou obsahovat přídavné heteroatomy.

Budiž poznamenáno, že sloučeniny podle vynálezu obsahují alespoň jedno chirální centrum a tedy může existovat v různých stereoizomerických formách. Pokud je to požadováno, takové stereoizomery včetně enantiomerů mohou být separovány za použití standardních dosavadních technik, avšak může být použito racemických směsí nebo směsí, obsahujících více než jeden diastereomer. Sloučeniny, vyjádřené vzorci, označenými 1 až 4, jsou proto reprezentanty individuálních optických izomerů, enantiomerů nebo diastereomerů, což mohou v tomto případě být podle okolností také směsi těchto individuálních chirálních izomerů.

Pokud je to požadováno, mohou se sloučeniny podle vynálezu připravit v kov obsahujících formách zpracováním jádra tetrapyrolového typu s vhodným iontem jako hořečnatým iontem, zinečnatým iontem, cínatým iontem a pod., aby se získal kovový komplex. Kovový ion může také být radiačně značený. Všeobecně se kovový ion vřadí užitím vhodných solí za podmínek, standardních v dosavadní praxi. Například, zinečnatý ion se může zavést zpracováním sloučeniny octanem zinečnatým, obsaženým ve směsi metylénchloridu s metanolem v poměru 1:1.

• · • · ·*· · · · · · · * · • · « · · · · · · · • »····« · · · · · · · · ·

8· · · · · · · • « · ··· ··· · · ··

Sloučeniny tedy mohou obsahovat značkovací látku, včetně radioizotopů, chromofory a fluorescenční značkovací látky. Značení radioizotopy je všeobecně užitečné, když sloučeniny mají být sledovány in vivo nebo má být ke značení použito specifických prostředků. Užitečnými kationtovými prostředky jsou radioizotopy zahrnující technecium, galium a indium. Kromě toho se ke značení molekuly může použít radioizotopů heteroatomů, jako ¹³¹I nebo ³²P v samotné molekule nebo lze použít ¹⁴C.

Jak bylo popsáno ve výše uvedených BPD patentech, sloučeniny podle vynálezu mohou být spojeny, pokud je to žádoucí, s terčovým činidlem, který nasměruje molekulu do specifické tkáně nebo orgánu. Taková terčová činidla zahrnují protilátky, receptory, receptorové ligandy a podobně. Vazba terčového činidla ke sloučenině je prováděna za použití standardních technik. „Konjugovanou formou je míněna sloučenina vzorců 1 až 4, spojená do terčového činidla, jak je popsáno shora.

Výhodná provedení sloučenin vzorců 1 až 4, zahrnují ty, kde obě n jsou rovna 2, nebo ty, kde obě R jsou etyly nebo metyly, výhodně metyly, a ty kde R² je vinyl. Zvláště výhodné jsou sloučeniny vzorce

B-EA6 • ·

Obě sloučeniny, A-EA6 a B-EA6 byly připraveny. Obě jsou efektivní fotosenzitiva, A-EA6 se jeví jako snáze připravitelné.

vlastností vynálezu

V technikách fotodynamické terapie, všeobecně známých v dosavadním stavu techniky, mohou být užity různé formy sloučenin podle vynálezu. Jak vysvětleno v popisu dosavadního stavu techniky, může být fotodynamická terapie prováděna v mnoha případech a pro rozmanité indikace. Kromě toho, v některých případech, projevují sloučeniny tohoto typu farmakologické aktivity v nepřítomnosti světla. Standardní farmaceutické kompozice včetně výhodných liposomálních kompozic, jsou žádoucí pro užívání v takových aplikacích.

Dále uvedené příklady mají vynález ilustrovat, ale nikoli omezovat. Ačkoli příklady ilustrují a demonstrují překvapující vlastnosti dvou členů z látek podle vynálezu, A-EA6 a B-EA6, je očekáváno, že zbývající sloučeniny mající vzorec 1 až 4, budou mít podobné varianty těchto Proto, malá třída sloučenin, obsažená v tomto nabízí hodnotné přírůstky do repertoáru fotodynamických činidel, užitečných v léčení při různých podmínkách, při kterých byla tato terapie nařízena.

Příklad 1

Příprava dvou forem EA6

A. K přípravě B-EA6 je výchozím materiálem BPD-DB jako dimetylester - tj. BPD-DB, jak je vidět na obr. 1, kde R¹ a R² jsou v obou případech COOMe a R'' je vinyl.

Ke 2,0 g (2,7 mM) BPD-DB v 50 ml etylénglykolu a 100 ml dichlormetanu byl přidán 1 ml kyseliny sírové. Reakční směs byla míchána po dobu 18 hod. při pokojové teplotě. Pak byla reakční směs přidána k míchané směsi 100 ml 5% vodného roztoku octanu amonného a 100 ml dichlormetanu. Organická

vrstva byla izolována a pak dvakrát promyta 50 ml vody. Rozpouštědlo bylo odstraněno odpařením za rotace. Tmavě zelený zbytek byl pak chromatografován na 75 g oxidu hlinitého (desaktivovaného 5 % vody) a eluován s gradientem 0,5% až 5,0% metanolu v dichlormetanu. Z frakcí, obsahujících produkt bylo potom odstraněno rozpouštědlo odpařením za rotace. Zbytek byl sušen ve vakuu přes noc a získalo se 2,02 g (89 %) analyticky čisté zelené tuhé sloučeniny uvedené v nadpisu.

B. Podobným způsobem, jak je uvedeno v odstavci A, ale nahrazením BPD-DA za BPD-DB byla připravena izomerická forma, A-EA6.

Příklad 2

Srovnání absorpce a uvolňování B-EA6 a BDP-MA buňkami L 1210

BPD-MA nebo B-EA6 byly inkubovány v koncentraci 3 gg/ml v přítomnosti 10% fetálního bovinního séra s 10⁷ /ml buněk L 1210 myších leukemických buněk. Obsah fotosenzitivních látek v mezibuněčném prostoru byl měřen fluorescencí buněčných lyzátů v různých dobách. Dosažené maximum koncentrace bylo 145,9 ng/10⁶ buněk pro B-EA6 a 149,5 ng/10⁶ buněk pro BPD-MA. Časový průběh absorpce je vidět na obr. 2 jako procentický podíl obsahu buněk za 60 min., ve kteréžto době dosáhla absorpce v obou případech maxima. Jak je vidět, u B-EA6 probíhala absorpce rychleji a dosáhla 80 % své maximální koncentrace již po 5 min. a dosáhla svého maxima absorpce v 15 min.

Kinetika uvolňování těchto léčiv z buněk L1210 byla měřena předběžným zatížením buněk při 3 pg/ml po dobu 1 hod. a pak umístěním buněk do média bez léčiv, obsahujícího 10 % fetálního bovinního séra. Zbývající mezibunečný obsah léčiv byl měřen v různých časových bodech lýzou buněk a měřením • · fluorescence. Jak je zřejmé z obr. 3, (zase jako procento z počátečního mezibuněčného obsahu), BPD-MA a B-EA6 projevují rozdílnou kinetiku uvolňování. Počáteční uvolňování B-EA6 bylo mnohem rychlejší, ale uvolňování bylo úplnější v případě BPD-MA.

• · · • · · • · · · • · · · · · · • · ·

Bylo neočekávané, že farmakokinetika B-EA6 byla in vitro rychlejší než farmakokinetika BPD-MA. Zatímco větší retence B-EA6 by mohla být připisována jejímu vzrůstajícímu rozměru ve srovnání s BPD-MA, byl rychlejší transfer membránou buňky neočekávaný.

Příklad 3

Srovnání farmakokinetik in vivo

Intravenózní injekcí byly podávány buď BPD-MA nebo B-EA6 do DBA/2 myši v dávce 4 mg/kg při aplikaci 3 myším za časový bod. Obsah léčiva v plasmě, kůži, játrech a ledvině byl určen v extraktech tkáně fluorescencí. Obr 4 ukazuje výsledky, zanesené do diagramu jako procentický podíl koncentrace v příslušné tkáni 15 min. po injekci. Jak je vidět na obr. 4, ani BPD-MA ani B-EA6 se neakumuluje v plasmě, játrech nebo ledvinách, jakkoli BPD-MA se během prvních 3 hod. akumuluje v kůži, B-EA6 ne.

Rychlejší akumulace B-EA6 ve srovnání s BPD-MA, jak se zde potvrzuje in vivo, tvoří výhodu, spočívající v rychlejším odstranění ze všech tkání. Léčení světlem se může provádět brzy po injekci fotosenzitivní látky a díky rychlému odstranění se neočekává prodloužení fotosenzitivity kůže nebo oka. Tudíž léčené subjekty mohou pokračovat v normálním životě bez speciálních předběžných opatření, jako vyloučení ostře zářivého světla a nošení tmavých brýlí.

Poloviční doba života B-EA6 a BPD-MA v různých tkáních byla pak vypočítávána v časovém úseku 15 min. až 3 hod. a výsledky jsou uvedeny v tabulce 1:

Tabulka 1: Poloviční doby života B-EA6 a BPD-MA
Tkáň	T^x/₂ * (15 min. až 3 hod.)
B-EA6	BPD-MA
j átra	0,6	2,4
slezina	0,8	10, 9
ledvina	0,8	5, 6
kůže	1,9	0**
sval	11,1	ND⁺
plazma	0,6	2,0

uvedeno v hod.

koncentrace BPD-MA v kůži vzrůstá postupně do 3 hod.

⁺ ND = nebylo stanoveno

Poloviční doba života BPD-MA v kůži nemohla být v tomto časovém úseku vypočtena, protože koncentrace BPD-MA během tříhodinové doby vzrůstala. Jak ukazuje tabulka 1, všeobecně má B-EA6 ve většině tkání mnohem kratší poloviční dobu života než BPD-MA. Nedostatek akumulace nebyl ve srovnání s BPD-MA u B-EA6 v normální kůži očekáván a dochází k jeho rychlejšímu odstraňování než je tomu u BPDMA. Jak bylo shora uvedeno, je to výhodné, když fotosenzitivita kůže je jediný vedlejší účinek fotodynamické terapie, využívající fotosenzitivních látek.

Farmakokinetika byla také stanovena in vivo, při užití modelu tumoru myši. Skupinám 10 DBA/2 myším obsahujícím Ml rhabdomyosarkomové tumory byly intravenózně injektovány

BPD-MA s liposomálním složením při různém dávkování 0,75 • · • · 0 0 · • 0 · 0

0 0 0

000 000

0

00 až 1,5 mg/kg. Tumory byly ozařovány laserovým světlem vlnové délky 690 nm při 50 nebo 150 J/cm² při různých dobách po injekci. Výsledky jsou uvedeny na obr. 2, byly stanoveny jako procentní podíly myší v každé skupině, které byly 7 dní po injekci bez tumorů.

	Tabulka	2: Biologická	zkouška
	Podmínky PTD		Procenta	bez
			. tumorů za	7 dní
Dávka léčiva ** Doba po	IV Dávka světla***
(mg/kg)	(min.)	(J/cm²)	BPD-MA B	-EA6
0,75	15	50	(4/5)	50 %
	30	50	70 %	0 %
1,0	15	50	100 %	90 %
	30	50	90 %	0 %
1,5	180	150	70 %	0 %

tumorový model = MI tumor v DBA/2 myši - každá PDT podmínka byla testována na 10 zvířatech léčiva měly liposomální složení a byly injektovány intravenózně

690 nm laserové světlo

Jak je ukázáno v tabulce 2, pomocí BPD-MA léčená myš projevovala značný přírůstek, když se doba po injekci pohybovala od 15 do 180 min. Na druhé straně pomocí B-EA6 léčená myš neprojevovala odezvu po 30 min. nebo 180 min., jakkoli byly získány signifikantní odezvy, když byla dodávána energie ozařováním teprve po 15 min.

Tato data demonstrují, že PDT při užití B-EA6 bude účinné při včasném léčení světlem. Nedostatek účinku po delší

9 4

994

9 9 9 9

9 9 99 999

9 9 • 999 99 99 době po injekci zase ukazuje rychlé odstraňování B-EA6, které je výhodné ze shora uvedených důvodů.

Příklad 4

Stanovení LD₅₀ se sérem a bez něho

Buď B-EA6 bylo inkubováno po dobu 1 hod. s buňkami L1210 v rozsahu koncentrací a exponováno 9 J/cm² širokým spektrem světla. Toto stanovení bylo provedeno v nepřítomnosti séra a v přítomnosti 10 % séra. Výsledky

ukazuje tabulka 3.
Tabulka 3: Hodnoty LD₅₀
	Bez séra	10 %	séra
BPD-MA	3,7 ng/ml	54,0	ng/ml
B-EA6	4,7 ng/ml	19, 7	ng/ml

Jak je vidět, mají BPD-MA a B-EA6 bez přítomnosti séra srovnatelné hodnoty LD50, v přítomnosti séra vykazuje však B-EA6 podstatně lepší výdrž účinnosti.

Přítomnost séra ve většině případů velmi snižuje fotoaktivitu činidel, používaných v PDT, jako třeba BPD-MA. Překvapivě jeví B-EA6 více afinity k buněčným membránám než ke složkám plasmy a je tedy velmi nepatrně ovlivněn přítomností séra v okolí buněk. Tedy jeho aktivita in vivo by měla být větší než aktivita BPD-MA a ostatních sloučenin této skupiny.

Příklad 5

Účinnost B-EA6 in vitro

Způsobilost B-EA6 využít cytotoxický účinek na buňkách

L1210 in vitro byla dále testována inkubací buněk s B-EA6 • ·

Φ · φφφ φ φ · β · v různých koncentracích po dobu 1 hod. v nepřítomnosti séra. Po odstranění přebytku léčiva byly buňky exponovány 9 J/cm² světlem (380 až 750 nm) a přeživší buňky byly stanoveny zkouškou MTT ( Mosmann, T. et al. J Immunol Meth (1983) 65:55 až 63). Procentní podíl usmrcených buněk byl vypočítán ve vztahu k přeživším buňkám, exponovaným jen světlem. Při koncentraci přibližně 7 ng/ml bylo usmrceno 80 % buněk, při 15 ng/ml nedokázalo přežít skoro 100 % buněk. Jak stanoveno shora, je LD₅₀ pro B-EA6 přibližně 4,7 ng/ml. Poněkud nižší účinek B-EA6 ve srovnání s BPD-MA in vitro vytváří rovněž neočekávanější srovnatelně vyšší aktivitu B-EA6 ve srovnání s BPD-MA in vivo v přítomnosti séra, jak ukázáno v příkladu 4.

Příklad 6

Selektivita B-EA6 pro buňky tumoru

Způsobilost buněk L1210 akumulovat B-EA6 byla srovnávána se způsobilostí splenocytů v obdobném případě. B-EA6 při 3gg bylo inkubováno s každým typem buňky a obsah B-EA6 v buňkách byl stanoven v lyzátech z buněk fluorescencí. Obr. 5 ukazuje srovnání absorpce pro dva typy buněk v ng/10⁶ buněk. Jak ukázáno, buňky L1210 byly způsobilé dosáhnout hodnoty absorpce přibližně 140 ng/10⁶ buněk po 20 min. Splenocyty, na druhé straně, akumulují méně než 20 ng/10⁶ buněk po jedné hodině inkubace.

DBA/2 myš, mající tumor Ml (rhabdomyosarkom), rostoucí podkožně v jejím boku, byl použit jako model na ukázku toho, že B-EA6 vykazuje selektivitu pro tumory. Myši bylo podáváno 0,75 mg/kg B-EA6 v liposomálním složení intravenózně. Po 15 min., 1 cm² plochy, která zahrnuje tumor o 5 mm průměru byla exponována 50 J/cm² světlem o 70 mW vlnové délky 690 nm z argonového barevného laseru. Expozice eliminuje efektivně tumor, ale nezasáhne okolní normální kůži. Tedy, B-EA6 vykazuje specifičnost pro tumor.

• · l * ·· · • 9 · · ft · • ft · 9 9 9 ·· · ·· t ft

Příklad 7

Modulace imunity pomocí B-EA6

Balb/C myši (5 až 8 myší na skupinu) bylo testováno za použití zkoušky zpožděné citlivosti kůže, nazývaná také zkouška kontaktní hypersenzitivity (CHS). Myš byla natřena na boku sensibilačním činidlem dinitrofluorbenzenem (DNFB) a o 5 dní později bylo jedno ucho podrobeno imunologickému testu pomocí DNFB, zatímco druhé slouží jako kontrola. Indikátorem imunitní odezvy je otok. Myším byly intravenózně injektovány liposomální B-EA6 v množství 1 mg/kg a buď ozařovány 15 J/cm² světlem na celém těle nebo exponovány okolním světlem. Byla demonstrována způsobilost tohoto působení zabránit imunitní odezvě, jak ukázáno na inhibici otoku ucha. Výsledky ukazují, že podávání B-EA6 kombinované s ozařováním buď 15 J/cm² světla na celém těle, nebo okolním světlem, snižují otékání při ušním testu ve srovnání s neléčenou myší. Otékání bylo v obou případech přibližně jen 60 % onoho, které bylo pozorováno na myši bez léčení.

V další zkoušce na stanovení imunomodulace byly myší peritoneální makrofágy izolovány, čištěny a aktivovány rekombinovaným γ-interferonem (100 U/ml). Aktivované buňky byly inkubovány po dobu 1 hod. při 37 °C s

B-EA6 v rozmezí koncentrací a pak exponovány LED světlem o vlnové délce 690 nm při 5 J/cm². Úroveň exprese MHC I, MHC II, CD54, CD80 a CD86 byly stanoveny o 24 hod. později za použití FITC konjugovaných protilátek a třídiče buněk. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4 pro B-EA6 při 0,5 ng/ml ve srovnání s podobnými experimenty s užitím BPD-MA při 2,5 ng/ml.

·· · » · *· 44

4 4 44 44 ···· • · 4 · 4 4 4 4 ·«

4 ···< · · 4 4 ··· ··· • · · · 4 4 4 ·· · 44 4 44 4 44 44

Tabulka 4:

Účinek nízké dávky PDT s B-EA6 na úroveň exprese antigenů povrchu buňky u myšího peritoneálního makrofágu

Sloučenina	MHC Třída I	MHC Třída II	CD54 (ICAM-1)	CD80 (B7-1)	CD86 (B7-2)
BPD-MA	99,1	79, 3	105,4	93,5%	99,2%
(2,5 ng/ml)	+ 4,3%	+ 10,1%	+ 3,0%
BPD-B-EA6	100,4%	71,8%	106,9%	102,3%	92,2%

(0,5 ng/ml)

Výsledky v tabulce jsou vyjádřeny jako procenta exprese ve srovnání s buňkami, na něž se působilo pouze světlem. Jak je vidět, BPD-MA a B-EA6 byly obě způsobilé snížit expresi MHC II, ale ne zbývající povrchové znaky. Tedy i když má BEA6 výhodnou farmakokinetiku, zachoval si imunomodulační aktivitu BPD-MA a ostatních sloučenin této skupiny.

Příklad 8

Účinek B-EA6 na modelovou artritidu

Samovolně rozvinutá artritida myši MRL-Ipr byla zesílena intradermální injekcí Freundova adjuvans. Na různé počty myší MRL-Ipr bylo působeno PDT ve dnech 0, 10, a 20 po injekci adjuvans. PDT, o složení 0,5 mg/kg liposomálního BEA6 bylo injektováno intravenózně s následnou expozicí ventrální části myši červeným (560 až 900 nm) světlem při 80 J/cm² 1 hod. po injekci B-EA6. Myš byla pozorována a symptomy byly připočítávány každých 5 dní po dobu 30 dní. Výsledky, jsou uvedeny na obr. 6 ve srovnání s myší podobně léčenou BPD-MA a PBD-MB. Jak ukazuje obr. 6, bylo-li měřeno při výskytu klinických symptomů (tj. procentový podíl myší vykazující tyto symptomy) nebo při změně v šířce bimaleolárního kotníku v milimetrech, B-EA6 (znázorněno jako plné kružnice) bylo účinné v zabránění následků adjuvační injekce.

• · · ♦ fc · · · · • fcfc ··> fcfc · · · · • fcfcfc · fc fcfcfc· • · ···· fcfc fcfc fcfcfc fcfcfc • fc * fcfc fcfc • fc fc fcfcfc fcfcfc fcfc fcfc

Opět byla prokázána retence imunomodulační aktivity B-EA6.

Příklad 9

Účinek B-ΕΑβ na mikrovaskulaturu

Bylo užito modelu myšího svalu kremasteru. Bylo podáváno BEA6 intravenózně v dávce 2 mg/kg a započato 5 a 15 min. po injekci s ozařováním chirurgicky exponovaných cév a žil světlem při intenzitě 25 J/cm² po dobu 5 min., a to 5 a 15 min. po injekci B-EA6. Cévám byl měřen průměr krevního sloupce jako procentický podíl kontrol.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 7. Zatím co přechodné uzavření cévy se mohlo získat, když ozařování bylo započato za 5 min., permanentní uzavření bylo získáno, když bylo ozařování započato po 15 min.

Zvýšená kapacita B-EA6 k zúžení nebo k okluzi (uzavření) vaskulatury, jak bylo demonstrováno v tomto příkladu, v kombinaci s rychlejší farmakokinetikou činí B-EA6 zvláště výhodným v léčení neovaskulárních chorob oka.

Příklad 10

Absorpční spektrum B-EA6

BPD-MA a B-EA6 mají podobná absorpční spektra v plasmě před a po 4 hodinové expozici fluorescenčního (380 až 750 nm) světla. Porovnání těchto spekter ukazuje obr. 8. Podobnost spektra B-EA6 spektru BPD-MA je výhodné, protože užití BPDMA jako terapeutického činidla, užitečného v PDT, je dobře prozkoumáno. Podobnost jejich spekter ukazuje, že mohou být používány tytéž světelné zdroje pro B-ΕΑβ, jako jsou úspěšně používány v léčení s BPD-MA.

Příklad 11

Cytotoxicita A-EA6 in vitro ··· « r · · · · • · · · · β · · · · · 9··· · · · · · · • · ···· · · · · ··· ··· • · · · · · · e ♦ · ··· ··· · · · ·

Způsobem, podobným jak je uveden v příkladu 5, byla testována cytotoxicita A-EA6 in vitro na dvou různých liniích buněk a porovnávána s BPD-MA. Buď buňky L1210 nebo linie dendritických buněk D2SC/1 byly inkubovány po dobu jedné hodiny při 37 °C buď s látkou A-EA6 nebo s BPD-MA.

Po odstranění přebytku léčiva byly buňky exponovány světlem o vlnové délce 690 nm při 5 J/cm² pro dendritické buňky a při 9 J/cm² pro buňky L1210. Přežívání buněk, bylo stanoveno o 18 až 24 hod. později s použitím kolorimetrické zkoušky MTT, popsané v příkladu 5. Procento usmrcených buněk bylo počítáno ve vztahu k buňkám, exponovaným pouze světlem. Jak ukazuje obr. 9A, projevuje A-EA6 srovnatelnou cytotoxicitu s BPD-MA ve vztahu k buňkám L1210 v nepřítomnosti séra, ale v přítomnosti séra bylo výrazně toxičtější než BPD-MA. Prázdné kroužky představují A-EA6 plus sérum, plné kroužky představují BPD-MA plus sérum; prázdné čtverce představují A-EA6 v nepřítomnosti séra a plné čtverce představují BPD-MA v nepřítomnosti séra.

Jak je vidět na obr. 9B, v dendritických buňkách, kde BPDMA mělo LD₅o 6 ng/ml a A-EA6 mělo LD₅₀ 2, 7 ng/ml, bylo A-EA6 toxické při nižších koncentracích než BPD-MA v přítomnosti 5 % fetálního telecího séra. Na obr. 9B představují plné kroužky BPD-MA a prázdné čtverce představují A-EA6.

V podobném stanovení, ale s měřením MHC I receptorů bylo A-EA6 účinné spíše ve snížení exprese těchto receptorů při nižších koncentracích, než ve snížení cytotoxicity. V tomto stanovení byly dendritické buňky inkubovány po dobu 1 hod. při koncentraci léčiva nižší než její LD50; 2,5 ng/ml a 5 ng/ml u BPD-MA a 1 ng/ml a 2,5 ng/ml u A-AE6. Na buňky bylo působeno světlem o vlnové délce 690 nm při 5 J/cm² a potom označeny vhodnou protilátkou 3 hodiny po působení a pak stanoveny průtočnou cytometrií. Výsledky byly měřeny jako procenta z intenzity fluorescence prostředního kanálu « · • · « · ·· · · · · • · · · · · • 9 · ··· · 9 · • · · · «·· · · · · · · · světlem ošetřených kontrolních buněk. Tyto výsledky ukazuje obr. 10; BPD-MA vykazovalo 18% a 20% redukci, při 2,5 ng/ml a 5 ng/ml; A-EA6 snížilo kanálovou fluorescenci o přibližně 25 % u obou koncentrací 1 ng/ml a 12,54 ng/ml.

Příklad 12

Účinek A-EA6 na vnitrobuněčnou signalizaci

Podmínky studie, uvedené vpředu v příkladu 11 byly opakovány s použitím buněk HL-60 jako terče a porovnávány účinky A-EA6 a BPD-MA na cytotoxicitu, na mitogenické dráhy kinasy p70 S6K, a na stresové dráhy kinasy c-jun a HSP27. Výsledky ukazuje obr. 11. Při subletálních koncentracích jevilo A-EA6 silnější aktivaci stresové dráhy kinasy a silnější inhibici mitogenické dráhy kinasy.

Účinek na aktivaci kaspáz v buňkách HL-60 byl také měřen. A-EA6 ukázal silnější aktivaci kaspáz než BPD-MA. Tento účinek je žádoucí je-li spojen s apoptozí. Užití apoptozy k odstranění nežádoucích buněk působí nejmenším účinkem na okolní normální buňky a tkáně. Porovnání A-EA6 s BPD-MA ukazuje obr. 12.

Obr. 13 ukazuje podobné porovnání, když byla procentní fragmentace DNA měřena v buňkách HL-60. Opět bylo A-EA6 při nižších koncentracích účinnější než BPD-MA.

Příklad 13

Fotodynamická terapie s užitím A-EA6 in vivo

V protokolu, podobném vpředu uvedenému v příkladu 3 bylo intravenózně injektováno buď A-EA6 nebo BPD-MA myši mající Ml tumor v dávce 1 mg/kg. Potom následovalo ozáření celého těla 50 J/cm² laserovým světlem vlnové délky 690 nm po různých dobách po podání drogy. Po 7 dnech byl zjištěn počet zvířat bez tumoru a výsledky ukazuje obr. 5.

« *

Tabulka 5
Fotosensibilátor	Ozařovací doba (po i.v.)	Zvířat bez tumoru po 7 dnech
BPDA-MA	15 min.	10/10
	30 min.	9/10
A-EA6	15 min.	2/2
	30 min.	6/6

Tyto výsledky ukazují, že A-EA6 je v této zkoušce aspoň tak účinné jako BPD-MA.

Příklad 14

Aktivita modulace imunity

Boky kontrolní a testovací myši byly natřeny antigenem DMFB a jejich uši byly o 5 dní později podrobeny imunologickému testu potřením toutéž sloučeninou. Testem na zvířatech bylo působení PDT na celé tělo při použití látky BPD-MA nebo AEA6 intravenózní injekcí fotosensibilátoru a poté expozicí zvířat červeným LED světlem při 15 J/cm². Procentické potlačení otoků uší bylo počítáno ve srovnání s kontrolami. Výsledky jsou vidět v tabulce 6 a ukazují, že A-EA6 mělo v této zkoušce silnější imunomodulární účinek než BPD-MA.

Tabulka 6
Fotosensibilátor	Dávka (mg/kg)	Procento potlačení
BPD-MA	1,0	49 %
A-EA6	1,0	68 %
A-EA6	0,3	59 %

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina vzorce

COOR¹

H | COOR¹

HjC<W)_n

COOCHjCHoOH COOCbkCHjOH , ⁿ I

ÓOOCHaCHjOH COOCHjCHjOH ¹ 2 (CH^ (CHj)_wcÓoCHaCHjOH COOCHjCHaOH

COOR¹

K I .COOR¹ (CH^n

ČOOCHjCHaOH ΟΟΟΟΗ^ΟΗ a její kov obsahující a/nebo značené a/nebo konjugované formy, kde každé R¹ je nezávisle alkyl (1 až 6 C) ; každé n je nezávisle celé číslo 0 až 6 a R² je vinyl nebo jeho derivátová forma.
2. Sloučenina podle nároku 1, kde R² je vinyl, CHOŘ', -CHO, -COOR', -CH (OR') CH₃,-CH (OR ) CH₂OR',-CH (SR') CH₃₍

-CH(NR')₂CH₃, -CH(CN)CH₃, -CH(COOR')CH₃,-CH(OOCR')CH₃,

-CH(NR'COR')CH₃, -CH(CONR'₂)CH₃, CH(halo)CH₃, nebo • · « · • · * · • * * ·

4» · · · * · · • ·

-CH(halo)CH2 (halo) , kde R'je Η, nebo uhlovodíkový radikál (1 až 6 C) podle volby substituovaný heteroatomovým substituentem nebo

R² je organická skupina mající méně než 12 C, rezultující z přímé nebo nepřímé derivatizace vinylového substituentu, nebo

R² je skupina, obsahující 1 až 3 jádra tetrapyrolového typu.
3. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2,která je ve formě obsahující kov a/nebo v konjugované formě a/nebo je značena.
4. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2, která neobsahuje kovový ion.
5. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 4, kde R² je vinyl a/nebo, že každé R je jsou 2.
6. Sloučenina podle nároku R¹ jsou metyly.
7. Sloučenina podle nároku metyl a/nebo že obojí n

5, kde R² je vinyl a obojí

6, která má vzorec

B-EA6 • · · · · « • · «4 • · · • * · a její kov obsahující forma a/nebo značená forma a/nebo konjugovaná forma.
8. Sloučenina podle nároku 7, která je ve formě obsahující kov a/nebo, že je v konjugované formě a/nebo, že je značena.
9. Sloučenina podle nároku 7, která neobsahuje kovový ion.
10. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 9, ve směsi alespoň jednoho farmaceuticky přijatelného excipientu.
11. Zlepšený způsob provádění fotodynamické terapie nebo diagnózy, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání fotoaktivní sloučeniny subjektu potřebujícího tuto terapii nebo diagnózu, v němž zlepšení zahrnuje použití sloučeniny podle některého z nároků 1 až 9 jako fotoaktivního činidla.