CZ77997A3

CZ77997A3 - Extrakorporální způsob selektivní redukce aktivované populace leukocytů, tělesná tekutina tímto způsobem zpracovaná a použití fotoaktivní sloučeniny

Info

Publication number: CZ77997A3
Application number: CZ97779A
Authority: CZ
Inventors: Simon Leong; Chan Agnes How-Ching; Hunt David William Carey; Martin Renke; Julia Levy; Janice North
Original assignee: Qlt Phototherapeutics Inc.; University Of British Columbia
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1995-09-22
Publication date: 1998-02-18
Also published as: FI971116A0; EP0782455B1; ES2220937T3; TW407055B; WO1996009068A1; FI971116L; US7479503B2; JPH10508577A; PL319370A1; EP0782455A1; NO971355L; RU2166331C2; BR9509205A; DE69532961T2; FI971116A7; DE69532961D1; US6100290A; NO971355D0; ATE265211T1; AU3515395A

Description

Extrakorporální způsob selektivní redukce aktivované populace leukocytů,tělesná tekutina tímto způsobem zpracovaná a použití fotoaktivní sloučeniny

Oblast vynálezu

Vynález se týká fotodynamických metod pro selektivní depleci buněk krve nebo kostní dřeně, které jsou důležité pro progresi jistých chorob. Přesněji, zahrnuje extrakorporální způsob selektivní redukce populace aktivovaných leukocytů v krvi nebo kostní dřeni subjektů s chorobami imunitní dysfunkce,jako jsou pacienti s autoimunitními chorobami nebo pacienti infikovaní HIV. Výnález se rovněž týká tělesné tekutiny nebo její frakce tímto způsobem zpracované, jakož i použití fotoaktivní sloučeniny pro výrobu kompozice pro výše uvedený způsob. Chráněné postupy a prostředky jsou určeny pro léčbu specifických autoimunitních phorob jako je roztroušená sklerosa a revmatoidní artritida ^užitím fotodynamické terapie.

p^

Dosava .-dní stav techniky ušení imunity způsobené virem lidské imunodeficience bylo studov^¹·¹⁰' ^a-'-^e Přirozený průběh progrese choroby je stále nejistý ní ^cm®ně bylo ukázáno, že HIV - infikovaní lidé mají cirkulující _c ^;ytotoxické T - lymfocyty, které způsobují lýsu neinfikovaných 5^{D4+ buněk}· Zarling et al., J.Immunol., 144:2992 (1990) Je také všeoL°^Pcně známo, že infekce HIV snižuje hladiny CD4+ buněk, zatímco zvyšuje hladiny CD8+, DR+, a IL-2R+ leukocytů. IL-2R+ je považován zJ aktivační markér, a DR+ je HLA markér. Tyto mohou být přítomny na buňkí^{ach s}P°lu ^s adičními markéry jako je CD4+ a CD8+.

Jedním přístupem jak narušit progresi této infekce, a z ní vycházející imunosuprese, v /užívá s strategie k alteraci složení krve s ohledem fia různé komponenty imunitního systému. V jednom pokusu o dosažení tohoto objasnil U.S.Patent č. subjektu majícího AIDS a poté extrakorporální

4,960,408 proces systémové léčby - týkající se komplex psoraleny léčby T-lymíocytů ultrafialovým

Tato léčba jasně zvyšuj ačkoliv ne jednotným zp zářením majícím vlnovou délku absorbovanou sloučeninou psoralenu. Ozářené T - buňky jsou pak vráceny do subjektu.

hladiny CC3+, CD4+, a CD8+ buněk, isobem.

Fotodynamická terapie obecně vyžaduje podání fotoaktivniho agens, dopravení agens go buněk nebo tkání, které mají být něk nebo tkání světlem absorbovaným destruovány a ozáření bu fotoaktivním agens. Teor agens, při rozpadu ze zé předpokládané singletov} proximální buňky nebo tkáně.

eticky, excitované fotoaktivni kladního stavu, generuje substance, kyslík, které jsou toxické pro

Fotodynamická terapie u lidí a zvířat. Bylo po| byla nejprve použita k léčbě t^- umoru jpsáno množstiví tříd fotoaktivr_i:£_c^ agens, které zahrnuje psoraleny, které jsou aktivováý·^ _uvsvětlem, různé hematoporčyrinové deriváty, které jsý^ aktivovány viditelným svítlem, a jiné aromatic¹^ systémy, jako jsou ftalocyaniny a modifikované porf'ý_riny, jaRo jsou chloriny. Navíc, U.S. Pa :ent č. 5,09^,₀₃₀, udělený 10. března 1992, který je zdk uvede^ _{odka2 ve svéin} celku, objasňuje a nárokuje růz|?_{4 cytot}oxi ká činidla specifická pro určité vlnové délky zelené porfyriny.

které jsou jto sloučeniri deriváty, které j _{sou mod}L_fikované Di genericky popsány jako ami jsou porfyrinové lels Alderovou reakcí pro posun vlnové délky absorpce efektivně k vyšší vlnové délce. Toto vede k některým výhodným vlastnostem ve srovnání s například, hematoporfyrinovými deriváty, jsou-li tyto sloučeniny využity ve fotodynamické terapii všeobecně. Jak je popsáno v tomto patentu, tato cytotoxická agens, obecně nazývaná BPD, absorbují viditelné světlo ve vlnových délkách, které minimalizují interferenci okolních tkání při prováděném ozařování.

Navíc k léčbě tumorů a malignit byla fotodynamická terapie navrhována pro rozrušení aterosklerotických plátů, a pro odstranění patogeních agens z krevních doplňků. Obecně bylo považováno, že fotoaktivní agens může být selektivně navázáno na nebo zadrženo v nežádoucích buňkách nebo tkáni, ve srovnání s normálními buňkami nebo tkáněmi a selektivita protokolu byla založena částečně na této vlastnosti fotoaktivního agens a částečně na zaměření místa, ve kterém je aplikováno viditelné nebo UV světlo.

Nyní byla objevena možnost selektivně zmenšit hladiny aktivované populace leukocytů, které jsou asociovány s HIV infekcí nebo jinými imunitními dysfunkcemi, která užívá fotoaktivní agens, zejména sloučeniny zelených porfyrinů, které jsou popsány výše. Tato deplece může být dosažena bez vedlejších efektů na normálně funkční B buňky, CD4+ buňky, CD8+ buňky nebo populaci NK buněk. Jak leukocyty po separaci od červených krvinek, tak plná krev může být ošetřena metodou podle vynálezu.

Nyní bylo objeveno, že dvě specifické autoimunitní choroby, roztroušená sklerosa a revmatoidní artritida, jsou » «· · ♦ ♦ h porfyrinů ynamických potvrzeně odpovídající lna fotodynairji ohledem na užití zelenýc agens, ale užitím fotod obecně.

ickou terapii, nejen s jako fotoaktivního terapeutických agens

Podstata vynálezu

Vynález tedy řeší éxtrakorporální způsob selektivní redukce aktivované populace leul získaný od subjektu, kte zahrnuj ící:

a) ošetření zmíněné tekutiny, nebd její frakce obsahující aktivované leukocyty, efektivním množstvím fotoaktivní sloučeniny, a I

b) ozáření zmíněné ošetřené tekutiny nebo její frakce světlem obsahujícím alespoň jedno vlnovou déjlku absorbovanou zmíněnou fotoaktivní sloučeninou.

ocytů v leukocyty obsahující tekutině, rý potřebuje takovouto redukci,

Zmíněnou fotoaktivní slo s výhodou sloučenina ze hematoporfyrinu.

Zmíněnou Gp sloučeninou BPD-DB íčeninou je sloučenina na basi porfyrinů, leného porfyrinů (Gp) nebo derivát :e sloučenina BPD-MA, BPD-DA, BPD-MB nebo

ch₂ch₂co₂r chJh₂co₂r bpd-ha » ·

COOH a hematoporfyrinovým derivátem je porfimer sodný.

» ♦ ♦ ♦ •Ta ahující tělesné tekutiny vede iny v rozsahu asi 0,05 až 5 e transplantátu nebo subjekt

Zmíněné ošetření 1 ke koncentraci fotoakt pg/ml. Zmíněným subjekt mající autoimunitní cho sukocyty obs ivní sloučen =m je příj emc robu.

= tělesná te ctivovaných inou je krelv

Dalším vynálezem j které došlo k depleci a uvedeným. Tělesnou teku obsahuje zvýšené hladiný CD8⁺ buněk hladiny IL-2R⁺ buněk. Tělesná tekut: obsahuje s výhodou redukované hladip s roztroušenou sklerosou nebo revma kutina, nebo její frakce, u eukocytů způsobem výše nebo její frakce, která a DR⁺ buněk, ale normální na, nebo její frakce, y leukocytů asociovaných oidní artritidou.

Dalším vynálezem je pou kompozice pro způsob s<£ leukocytů, v leukocyty potřebuje takovouto reď

a) ošetření zmíněné tekut aktivované leukocyty, e sloučeniny, a

b) ozáření zmíněné ošetře obsahujícím alespoň jedr fotoaktivní sloučeninou ití fotoakt lektivní red Obsahující te i|kci, kterýž iny, nebo j fektivním mno

Lvní sloučeniny pro výrobu ukce aktivované populace kutině subjektu, který o způsob zahrnuje:

sjí frakce obsahující žstvím fotoaktivní né tekutiny u vlnovou dé nebo její frakce světlem lku absorbovanou zmíněnou

Zmíněnou fotoaktivní sic zejména sloučenina žele hematoporfyrinu, přičemž MA, BPD-DA, BPD-MB nebo hematoporfyrinovým uceninou je n|ého porfyri touto Gp s

BPD-DB výše je por derivátem sloučenina na basi porfyrinu, iitu (Gp) nebo derivát oučeninou je sloučenina BPDuvedených vzorců a imer sodný.

Vynález poskytuje metodu aktivovaných leukocytů u pro selekti subjektů v ní snížení populace Okazujících zvýšené ♦ * · hladiny markérů aktivace leukocytů. Metoda podle vynálezu zahrnuje ošetření tělesných tekutin, jako je kostní dřeň, krev, nebo jejich vhodné frakce, specifickou třídou sloučenin užívaných v fotodynamické terapii, po kterém následuje ozáření krve nebo frakce světlem majícím alespoň jednu vlnovou délku absorbovanou fotoaktivní sloučeninou. Nárokuje se postup extrakorporální, ovšem ošetření může být provedeno rovněž in vivo, nebo částečně in vivo a částečně ex vivo.

Vynález lze rovněž využít pro léčbu roztroušené sklerosy a revmatoidní artritidy. Metody využívají technik obecně užívaných ve fotodynamické terapii; fotoaktivní sloučenina je podána a distribuována systémově; subjekt je pak ozářen světlem absorbovaném fotoaktivní sloučeninou.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázky 1A a 1B ukazují efekt Gp a ozáření na různé subpopulace leukocytů, CD4 + buněk, CD8+ buněk, dvou HIV infikovaných majících rů DR+ buněk placientů.

2né markéry včetně B buněk, IL-2R+ buněk v krvi od

IJativní koncentrace subpopulací rmálních dárců a od dvou HIV

Obrázek 2 ukazuje re'. leukocytů v krvi od no: infikovaných pacientů.

Obrázek 3A a 3B ukazu leukocytů od normálníhc pořadí, před a po ošetř

Obrázek 3C ukazuje hl po ošetření BPD a ozáře infikovaného subjektu.

Obrázek 4 ukazuje ine.' ošetřením BPD a ozáření je relativní dárce a HIV ení BPD a o koncentrace subpopulací dárce v příslušném žáření.

adiny IL-2R-ní, obé u n buněk, specificky před a órmálního a HIV ktivaci bun$ m.

asociovaných s HIV

Obrázek 5 ukazuje ger.erické stru ctury různých zelených porfyrinů užívaných ve;

vynálezu.

Obrázek 6 ukazuje st porfyrinů, specificky řuktury preferovaných zelených BPD-ΜΑ, BPD-MB, BPD-DA a BPD-DB.

Obrázek 7 je graf kon PDT-ošetřených a neošet: alergické encephalomye trastuj ící řených myší itidy (EAE)

Závažnosti choroby u po indukci experimentální

Obrázek 8 je graf ukazující efek na indukci EAE u myší.

: transdermální PDT

Obrázek 9 je graf ukazující BPD-MA na incidenci kolagenem

Obrázek 10 ukazuje výsledky v různou dobu na modelu.

efekt PDT užitím liposomální indukované artritidy u myší.

podobného ošetření provedeného

Způsoby provedení vynálezu

Metody podle vynálezu také zahrnují ošetření tělesných tekutin , jako je kostní dřeň, krev, nebo jejich vhodná frakce, obsahujících abnormálně zvýšené hladiny endogenních, nebo infikovaných endogenních buněk fotoaktivní sloučeninou jako je sloučenina zeleného porfyrinu, po které následuje ozáření tělesných tekutin nebo frakce světlem absorbovaným fotoaktivní sloučeninou. Metoda podle vynálezu může být provedena v množství protokolů. Dva nejdůležitější elementy jsou ujištění (1) že fotoaktivní sloučenina je asociována s buňkami, jejichž populace má být zmenšena a (2) že fotoaktivní sloučenina asociovaná s těmito buňkami je ozářena vhodnou vlnovou délkou. Jak je zde použito, tělesné tekutiny označují tělesné tekutiny, které obsahují zvýšené hladiny aktivovaných leukocytů nebo jiných buněk, jako jsou HIV infikované buňky, které mají být depletovány. Takové tělesné tekutiny typicky zahrnují kostní dřeň, krev a jejich frakce.

Zatímco kostní dřeň může být použita jako substrát pro metodu podle vynálezu, je častěji vhodnější užití krve pacienta. Tak, v jednom protokolu, je odebrána plná krev od subjektu a ošetřena vhodnou koncentrací fotoaktivní sloučeniny po časovou periodu dostatečnou k tomu, aby emny s ροζ ena světlem s^neru nebo vrácena pac dovolila asociaci slouč Plná krev může být ozář v extrakorporálním kont ošetřená a ozářená krev

Krev odebraná od pac frakce, typicky na frak' obohacenou plasmatickou je obvykle ošetřena fot návratem plasmy a červelných krvinek adovánými cílovými buňkami s vhodnou vlnovou délkou aparátu, a pak může být ientovi.

íenta muže ci červených frakci oaktivní sl t aké

Let k ne, separace □odě během ívní sloučeríi ací na červen těla pacienta. Samozřej provedena v jakémkoliv ošetření, takže fotoakt do plné krve před separ obohacenou frakci, a pac bude obvyk leukocyty obohacenou frakci být separována na krvinek a leukocyty ocyty obsahující plasma, cjučeninou a ozářena před (je-li to žádoucí) do na frakce může být e(xtrakorporálního na může také být přidána é krvinky a leukocyty le potřeba ozařovat pouze

Lvní sloučeni

Alternativně, fotoakt být podána systémově pa injekčně, ale také jiným podání nebo podání pros fotoaktivní sloučenina vstup do krevního řečišt zdroj na tělo pacienta, zařízení může být zavede řečišti, nebo může být expozici světla. Krev n být ozařovány in vivo cientovi ve i způsoby úřednictvím podávána po ě může být

Například, no do vhodně ýyužito exter: ebo jiné těle ina, nebo její směs, může vhodné formulaci, typicky padání jako je orální sliznic. Jakmile byla lobu dostatečnou pro aplikován vhodný ozařoval catetrizační f ib roop t i c k c pozice v krevním ní transdermální sné tekutiny tak mohou

Vhodné subjekty pro tito léčbu podle vynálezu zahrnují HIV infikované pacienty, u kterých bylo ukázáno, že mají zvýšené hladiny aktivovaných leukocytů, jako jsou DR+ a IL-2R+ buňky, ve své krvi. Tyto hladiny mohou být selektivně sníženy metodou podle vynálezu. Jiní pacienti, u kterých jsou očekávány zvýšené hladiny těchto buněk zahrnují pacienty vykazující nechtěnou imunoaktivaci obecně, jako jsou subjekty s reakcí štěpu proti hostiteli nebo rejekce orgánových transplantátů jako výsledek, například, orgánové transplantace nebo transplantace kostní dřeně. Pro transplantaci mohou být ošetřeny jak tekutiny z dárcovského orgánu nebo tekutiny od pacienta - příjemce. Jinými potenciálními subjekty jsou ti, kteří vykazují autoimunitní podmínky jako je revmatoidní artritida, lupus erytematodes, muskulární dystrofie nebo myastenia gravis.

Typicky je fotoaktivní agens podáno takovým způsobem, aby vedlo ke konečné koncentraci v tekutinách nebo frakcích tkutin, které mají být ošetřeny, asi 0.05 - 5 ^g/ml, výhodně okolo 0.1 - 1 ^g/ml a nejlépe okolo 0.5 μg/ml. Ošetřená tekutina nebo frakce tekutin je pak ozářena světlem z jakéhokoliv zdroje, jako je laserová dioda, světlo emitující dioda, optickým vláknem vedoucím laserové světlo, a podobně.

Typické vlnové délky jsou v rozsahu od asi 600 - 790 nm, výhodně okolo 630 - 710 nm a , nejlépe, okolo 790 - 780 nm. Typické intensity jsou takové, aby bylo 1-50 J/cm², výhodněji okolo 5-25 J/cm², a nejlépe okolo 8-15 J/cm². Pro tyto intensity je preferována vlnová délka okolo 785 - 695 nm.

Ozařování je obvykle prováděno okolo 2 - 180 minut, lépe okolo 15 - 120 minut, v závislosti na charakteru a koncentraci fotoaktivní tekutiny, citlivosti bu vlnové délce světla, a vivo). Vhodná optimalis odborníkům známé.

agens, mp lék pacienta netodě ozařc ace a ozařov

V jednom provedení po symptomů a všeobecnou 1 revmatoidní artritidy u verifikují, že fotodynatn Všeobecně uznávané modeL ukazují úspěšné odpověd(í ilustracích dovolují na lidské subjekty, které napodobeny doloženými tnodely.

akytuje vyné ečbu stavů postižených ická léčba ové systémy Parametry plánování ú nají být léč ožství ošetřované na léčbu, intensitě a vání (in vivo nebo ex ací parametry jsou dobře lez protokoly pro zlepšení oztroušené sklerosy a subjektů. Příklady níže těchto stavů je úspěšná, pro každý z těchto stavů popsané v těhto sjpěšných protokolů pro eny pro stavy, které jsou

V dalších detailech, užitečná ve vynálezu, z preferovaně organickou cytotoxický efekt, jsou elektromagnetickému zář vlnovou délku v ultrafř se, že aktivace ozářeníi kyslíku v molekule a vy Excitovaný, singletový : ale dostatečně dlouhou : cílových buněk a tak zp’ leukocytárních buněk.

Eotoaktivní ahrnuj í j akc sloučeninu, li aktivová sní, preferc alovém nebo n excituje j sváří tak st cyslík exist ia to, aby a asoboval sel agens, která jsou ukoliv sloučeninu, které vykazuj í ny vystavením vaně záření maj ícím viditelném rozsahu. Soudí eden nebo více atomů av singletového kyslíku, uje pouze krátkou dobu, takoval buněčnou stěnu ektivní nekrosu cílových,

Například, psoraleny jsou aktivovány UV světlem, a různé deriváty hematoporfyrinů jsou aktivovány ozářením viditelným světlem. Jiná fotoaktivní agens zahrnují ftalocyaniny a modifikované porfyriny jako jsou chloriny. Zejména preferovaná fotoaktivní agens, nicméně, zahrnují sloučeniny zelených porfyrinů (Gp sloučeniny), zejména struktury ukázané na Obrázku 5, a ještě lépe struktury ukázané na Obrázku 6.

Gp sloučeniny vynálezu jsou vybrány ze skupiny porfyrinových derivátů získané Diels - Alderovými reakcemi derivátů acetylenu s protoporfyriny za podmínek, které vedou k reakci pouze jednoho ze dvou dostupných konjugátů, nearomatických dienových struktur přítomných v kruhovém systému protoporfyrinu-IX (kruh A a B). Vzorce ukázané na Obrázku 5 representují typické Gp sloučeniny podle vynálezu. Tyto sloučeniny jsou ukázány na Obrázku 5 s dusíky vnitřního kruhu obsazenými dusíkem. Nicméně je pochopeno, že metalátové formy, kde kation nahrazuje jeden nebo oba tyto vodíky, mohou být také využity. Je také chápáno, že tyto sloučeniny mohou být značeny buď nahrazením jednoho nebo více atomů ve struktuře jeho radioaktivní formou, nebo připojením radioisotopu jako jako je radioaktivní kov nebo, například, radioizotop jodu.

Pro zjednodušení je všeobecně používána zkratka termínu hydromonobenzoporfyrinových derivátů --BPD--k označení Gp sloučenin vzorců 3 a 4 Obrázku 5. Navíc, dimerní formy Gp sloučenin mohou být poskytnuty, tak amplifikujíc schopnost Gp sloučeniny absorbovat světlo na molární bázi. Dimerní a multimerní formy Gp/porfyrinu kombinací mohou být také využity, tak poskytujíc adiční absorpční vlnové délky.

Modifikované porfyrin mohou být konjugovány π y označené a specifický cílem, jako jsou receptor specifické sti imunoglqb entraci v p nebo imunospecifické čá; jejich ještě vyšší konc nebo substanci. Tato konjugace také žádoucích dávek, jelikož materiálen do jiných tkání, jejichž destrukce cíle a které je potřeba se vyhnout ?de jako Gp sloučeniny ligand reaktivní s ligandy, imunoglobuliny ulinů, které dovolí džadované cílové tkáni dovoluje další snížení není plýtváno distribucí je vzdálena od žádoucího

Je-li Gp sloučenina o viditelného absorpčního cytotoxicitě v okolních také zahrnuje kratší vlil· absorpční maximum v roz zářena in s ítu rozsahu, velde tkáních. Za|t ové délky, sáhu 670 užitím světla fotoaktivace k ímo absorpční spektrum je zde zejmena využitelné nm.

780

Obecně, umístění absorpce vlnové ze dvou π vyt v, iélky je dosaženo vazeb v jenom, ale ne ve ářejí typický porfyrinový pyrrolů obsahuj í vinyl je konjugována na - Alderova reakce systémů s acetylenovými zovaným cyklohexadienům kondenzovaným dále na A ích 1 a 2 Obrázku 5. kruh vede ke poskytuje sloučeniny sloučeniny poskytují vpzba D iels konj ugovaný :h účinným nasycením jedné dvou, pyrrolových kruz^i, které systém. V protoporfyrinu - IX dva z substituci, takže exocyklická π jednu nebo dvě π - vazby v kruhu, vyžaduje jeden z těchto deriváty dienofilů vedoucí ke kondefr označených zde jako hyc.robenzo - nebo B kruh, jak je ukáiáno ve vzoré Přeskupení π - systému v hexadienovy sloučeninám vzorců 3 a 4, a redukce vzorců 5 a 6 Obrázku 5.

Všechny tyto žádoucí bathochromní posun v absorpčním maximu

Specifické přípravky Gp sloučenin zejmena užitečné ve vynálezu jsou popsány detailně ve výše zmíněném odkazu na U.S. patent 5,095,030, který je zde uveden jako odkaz.

Pro sloučeniny ukazane na Obrazcích 5 a 6, obecně jsou R o , , , . , a R každý , nezávisle, mírné elektron odebírající substituenty, a jsou, nejběžněji, karbalkoxy, nebo alkyl nebo aryl sulfonyl, nebo jakékoliv jiné aktivující substituenty, které nejsou dostatečně odebírající elektrony k tomu, aby vedly k reakci s jak A, tak B kruhem spíše než k reakci s pouze jedním, tak jako kyano nebo -CONR⁵CO-, kde R⁵je aryl nebo alkyl. Jedním z R¹ a R² může být popřípadě H, zatímco druhý je elektron odebírající substituent dostatečné síly k usnadnění Diels - Alderovy reakce.

Jak je zde použito, karboxy je, jak je běžně definováno,

-COOH, karbalkoxy je -COOR kde R je alkyl, karboxyalkyl označuje substituent -R'-COOR kde R' a R jsou alkylen a alkyl. Alkyl označuje nasycený přímý nebo rozvětvený řetězec hydrokarbylového radikálu 1-6 uhlíkových atomů jako je methyl, n-hexyl, 2-methylpentyl, terč.butyl, n-propyl, atd.. Alkylen představuje totéž co alkyl s tou výjimkou, že skupina je dvojvazná. Aryl nebo alkyl sulfonyl skupiny mají vzorec SO²R, kde R je alkyl, jak je definován výše, nebo je aryl, kde aryl je fenyl, popřípadě substituovaný 1-3 substituenty nezávisle vybranými z halogenů (fluoru, chrómu, bromu nebo jodu), nižších alkylů (1-4C) a nižších alkoxy (1-4C). Navíc jeden nebo oba R¹ a R² mohou samy být aryl, t.j., fenyl, popřípadě substituovaný, jak je definováno výše.

Jak je ukázáno na Obrázku 5, adukt utvořený reakcí

R^-C^C-R² s protoporfyrín IX kruhov/m systémem (kde R³ je v chráněné formě 2-karboxyethylu, jako je 2-karboxymethoxyethyl karboxyethoxyethyl; a R⁴ je nebo 2 vzorců l a 2. Sloučenini vzorce 1 v a vzorce 2 vzniká z adice k B kruhu produktech vzorců 1 a 2 R⁴ znamená

CH=CH₂) jsou sloučeniny zniká z adice k A kruhu,

V těchto vzniklých CH=CH . Nicméně tato vinylová skupina je snadno derivátizovatelná v jiných provedeních R⁴ adicí k, kruhu kruhu B vzorce 1 nebo kruhu A nebo oxidační produkty mohou být dá li adované substituenty

Například, -Br může být 1-6C, jako výše), -NH provedení, nicméně, jed vodík, a jiný je vybrán (fluor, chlor, brom neb amino nebo amido, a sul skupiny, nebo může být by neměla hodnotitelně sloučeniny₍ například, nebo oxidac|í, substituentu vinylového vzorce 2. Tyto adiční le substituovány, jsoufunkčně odštěpitelné skupiny.

OH, -OR (kde R jeQlkyl atd. V preferovaném substituováln -NHR, -NR.

=n z adováných substituentů je ze skupiny sestávající se z halogenů □ jod), hydřoxy, nižších alkoxy, jiné organosulfidové . Adice k vinyl skupině změnit absořpční spektrum výsledné produkt Markovnikovy adice vody fhydryl nebe samotný vodí poskytuje strukturní analogy substituentů k těmto substituentům systémů bematoporfyrjnových kruhů v příslušném kruhu. Tak sloučenina podle vynálezu zahrnuje různé skupiny stituenty, Ifteré poskytují adiční inu podobné jako R⁴, zahrnující sut porfyrinové nebo porfyr dále popsáno.

R³ v protoporfyrinuNicméně, charakter R³konjugovanou na kruhovo pro postup Diels - Aido ]X kruhové systémy, jak bude je 2-karbo: (ačkoliv obsá u π - vazbu rovy reakce xyethyl (-CH₂CH₂COOH). .huje π - vazbu , není běžně relevantní nebo pro účinost a spektrum absorpce výsledného produktu. R³ může tak být, například, nižší alkyl (1-4C), 1-karboxyalkyl (2-6C), nebo jejich ester nebo amid. R³ substituent může také být substituován halogenem jak je definováno výše, nebo jiným nereaktivním substituentem. Nicméně, zejmena vhodné výchozí látky pro Gp sloučeniny vynálezu jsou přirozeně se vyskytující porfyriny, výhodně ty, kde R³ je -CH₂CH₂COOH nebo -CH₂CH₂COOR, kde R je alkyl (1-6C).

Ve BPD sloučeninách podl^vynálezu bylo shledáno výhodou, že hydrolyzuje nebo částečně hydrolyzuje esterifikovanou karboxy skupinu v -CH₂CH₂COOR. Hydrolýza probíhá v mnohem rychlejším stupni než hydrolýza esterové skupiny R¹ a R², je-li přítomna, a solubilita a biodistribuční charakteristika výsledné sloučeniny jsou typicky více žádoucí než ty, které se vyskytují u nehydrolyzované formy. Hydrolýza vede k mono-nebo di-kyselinovým produktům (nebo jejich solím).

Hydromonobenzoporfyriny vzniklé přímo z Diels - Alderovy reakce popsané ve výše citovaném odkazu mohou být také izomerizovány na sloučeniny mající vzorce 3 a 4 Obrázku 5.

Znázornění vzorců 3 a 4 Obrázku 5 neukazuje relativní polohu exocyklické methyl skupiny (kruh A vzorce 3 a kruh B vzorce 4) s ohledem na R² substituent. Oba izomery jsou dostupné.

Navíc, Diels Alderovy produkty mohou být selektivně redukovány, například, ošetřením vodíkem za přítomnosti paladia na uhlí tak, aby vznikly nasycené kruhové analogy, ukázané na vzorcích 5 a 6 Obrázku 5, které odpovídají příslušným Diels-Aldero' redukované produkty j so a jsou obecně méně využ sloučeniny vzorců 1-4.

zým produktů i obecně mén itelné v met

Popis daný výše s ohla 1 a 2 konvertováním zbýfz. ohledem na variabilitu vzorců 3, 4, 5 a 6.

m kruhů A a B. Tyto š preferovaným provedením odě podle vynálezu než vatizaci sloučenin vzorců nyl substituentu (R⁴) a s žitelné jako sloučeniny dem na deri ^rajícího vi jsou vyu

Sloučeniny vzorců 3 a hydrolyzované a částeční R³, jsou nejvíce prefer: které obsahují -COOH sk. volné kyseliny, nebo ve anorganickou bází.

(BPD), a i hydrolyzov vány. Slouč pinu, mohou formě solí ze sloučen entrum a pr áty a metody konfigurace jako izolát i enantiomer •merů může t si enantiome opticky akt diastereome

Bude zmíněno, že mnohp alespoň jedno chirální optické izomery. Konjug sloučeniny, mající obě jsou sloučeniny získány stereoizomeru nebo směs Separace směsi diastere^i běžnými prostředky. Smě užitím technik reakce s a separováním vzniklých zejmena ty, které mají ané karbalkoxy skupiny v eniny podle vynálezu, být připraveny buď jako s organickou nebo in Obrázku 5 obsahuje oto existují jako podle vynálezu zahrnují chirálních uhlíků, ač y jednotlivého ů a/nebo diastereomerů. ýt provedena jakýmikoliv rů mohou být separovány ivními preparáty o

ru.

Dále by mělo být zrnin neseparované směsi A a majících vzorce l a 2, šno, že proč B kruhové ač nebo 3 a 4, ukty íce, nebo reakce mohou být t.j. směsi sloučenin 5 a 6. Jak

Π

Obrázek 6 ukazuje zejména preferované sloučeniny vynálezu, které nebyly dříve v oboru popsány. Tyto sloučeniny jsou souhrnně označeny benzoporfyrinové deriváty (BPD) jak jsou vytvářeny Gp sloučeninami majícími vzorec 3 nebo 4. Tyto jsou hydrolyzovanými nebo částečně hydrolyzovanými formami přeskupených produktů vzorců 3 a 4, kde jeden nebo oba jsou chráněné karboxylové skupiny hydrolyzovaneho R^J. Esterové skupiny v R¹ a R² hydrolyzují relativně pomalu, takže konverse na formy ukázané na Obrázku 6 je snadno dosaženo.

Pro účely tohoto popisu, R³ je -CH₂CH₂COOR³'. Jak ukazuje Obrázek 6, v preferované sloučenině vzorce BPD-DA je každý R³'h, R¹ a R² jsou karbalkoxy, a derivatizace je v kruhu A. Preferovaná BPD-DB sloučenina je korespondující sloučenina, kde derivatizace je v kruhu B. BPD-MA representuje částečně hydrolyzovanou formu BPD-DA a BPD-MB částečně hydrolyzovanou formu BPD-DB. Tak, v těchto dalších sloučeninách ^sou R a R² preferovaně karbalkoxy, jeden R³ je preferovaně H a druhý R³ je preferovaně alkyl (1-6C). Sloučeniny vzorců BPD-MA a BPD-MB mohou být homogenní, kde pouze C kruh karbalkoxyethyl nebo D kruh karbalkoxyethyl je hydrolyzován, nebo může zahrnovat C a D kruh - substituent hydrolyzátů. Navíc, směsi kterýchkoliv dvou nebo více BPD-MA, -MB, -DA a -DB mohou být využity v metodě podle vynálezu.

Určitá jiná provedení, kde R⁴ je jiný než vinyl, nebo kde R³je ne přirozený substituent, jsou také zahrnuta v popisu Gp sloučenin využitelných ve vynálezu.

Obecně, každý R¹ a R² jé sestávající se z karbalkox (6-10C) sulfonyl, aryl (6(6-10C) nebo alkyl (1-6C), nezávisle vybrán ze skupiny y (2-6C), a 10C), kyano každý R^J je nezávisle alkyl nebo sůl, amid, ester nebe R⁴ je -CHCH₂, -CH₂OR⁴'

-CH(OR⁴')CH2OR⁴', -CH(SR⁴' -CH(COOR⁴')CH3, -CH(COOCR⁴-CH(halogen)CH₂(halogen), popřípadě substituovaný hýd kde R⁴ je organická skup i nepřímo derivatizace vinylu kde R⁴ je skupina obsahuj typu vzorce -L-P jak je zde (1-6C), jeho acyltr -CHO, -COOR )ch₃, -CH(NŘ ')CH₃, -CH(h kde R⁴ je H rofilním s na <12C vz , nebo ící 1-3 jáč definován.

Zejména jsou preferovány a jejich směsi. Také jsou stejné a jsou karbalkoxy, preferované jsou ty, kde R -CH(halogen)CH₃, nebo skupí tetrapyrrolového typu vzor kyl (1-6C), sulfonyl, aryl a -CONR⁵CO- kde R⁵ je aryl karboxyalkyl (2-6C), ýdrazon a

-CH(OR⁴')CH₃, ⁴'₂)ch₃, -ch(cn)ch₃, alogen)CH₃, nebo nebo alkyl (1-6C), úbstituentem, nebo niklá z přímo nebo ro tetrapyrrolového sloučeniny preferovány zejměna kark ⁴ je -CHCH₂na obsahuj e -L-P (def vzorců 3 a 4 Obrázku 5 ty, kde R¹ a R² jsou oethoxy. Také

-ch(oh)ch₃,

1-3 jádra

1C1 inované níže).

já i

Jak je zde použito, representují čtyřkruhový s ra tetrapyrrolového typu ystem skeletu:

Me

CO₂H

C 0₂H který j_ezkrácen

nebo sůl, ester, amid nebo jeho acylhydrazon, který je vysoce konjugovaný. Toto zahrnuje porfyrinový systém, který je vlastně dihydroforma porfyrinu; a redukovaný chlorinový systém, který je tetrahydroformou kompletně konjugovaného systému. Je-li porfyrin specifikován, je indikován kompletně konjugovaný systém. Gp sloučenina efektivně ukazuje dihydro formu porfyrinového systému.

V jednom provedení substituent R⁴ zahrnuje alespoň jedno jádro tetrapyrrolového typu. Výsledné sloučeniny vynálezu jsou dimery nebo oligomery, ve kterých je alespoň jedním kruhovým systémem tetrapyrrolového typu Gp sloučenina. Vazba mezi Gp skupinou přes umístění R⁴ k adičnímu kruhovému systému tetrapyrrolového typu může být prostřednictvím etherové, aminové, nebo vinylové vazby. Další deriváty porfyrinových kruhových systémů, které mají dvě dostupné substituentní pozice {jak v A, tak v B kruhu) korespondující k R⁴ mohou být také vytvářeny jak je dále popsáno níže.

Jak bylo zmíněno výše, sloučeniny mající vzorce Obrázku 5 zahrnují ty, ve kterých je R⁴ tvořen adicí počáteční Gp inám. Tak, ' vořen snadn y mohou být tuenty mohoi ^agens mohou čímu s kruhi sloučeniny k vinyl skup substituent, který je oba přidané substituen halogeny, a tyto subst Alternativně, adiční r adován k uhlíku soused

-CH2CH3 :⁴ může být jakýkoliv u adiční reakcí. Proto, například -OH nebo být dále substituovány, být ve formě HX, kde H je m za poskytnutí vzorce

Vinyl skupina může by -CH2OH, -CHO nebo COOH

Tak, obecně, R⁴ repr které je vinylová skupi štěpící nebo adiční re reakcí odštěpítelných s R⁴ substituenty zahrnuj ejsentuje jak< na -CH=CH2 í alkcí, a dále kupin s adic i: - CH(NH₂) t také oxid< a jejich so vána za získání R⁴ jako í a esterů.

koliv substituenty, na nadno konvertována substituenty vzniklé nimi skupinami. Typické CH₃, -CH(imidazo1)CH₃,

-ch-nhí

C Η, no₂

CH-NHCO ch₃

— CH-NHCO—/(

CH

-CH(OH)CH₃, -CHBrCH₃, -CH(OCH₃)CH₃, -CH(pyridinium bromid)CH , -CH(SH)CH , a jeho disulfid, -CHOHCH OH, -CHO, -COOH a -COOCH₃.

Je-li R⁴ -L-P, pak substituent vzorce -L-P representuje substituent, kde -L- je vybrán ze skupiny sestávající se z:

-CH-O-CH-, -CHNHCH-,

-CH=CH-CH-, ch₃ ch₃ ch₃ ch₃ ch₃ (a) (b) (c)

-CH-CH=CH-, =CH-CO-CH-, a, . -CH-CO-CH= ch.

CH,

CH, (d) (e) (f) ; a.

a P je vybrán ze skupiny sestávající se z Gp, kde Gp má jeden ze vzorců 1-6 ukázaných na Obrázku 5, ale postrádá R⁴a je konjugován k L přes polohu ukázanou na Obrázku 5 jako obsazenou R⁴, a porfyrin vzorce

kde R³ a R⁴ jsou jako vazba je pak konjugováni je definová: k L. Je ch výše, a neobsazená ápáno, že zkratka

Q—©

I I ©—© representuje porfyrin vzorce:

kde každý R je nazávi (Je třeba chápat, že kruhový systém ke které' resonanční systém odpov

3le H nebo n jestliže -Linu je dvojná ídaj ící ižší alkyl (1-4C).

má vzorec (e) nebo (f), vazba připojena bude mít

v kruhu, ke kterému je dvojná vazba připojena jak je uvedeno.)

Příprava dimerů a oligomerů

Sloučeniny dimerů a oligomerů podle vynálezu mohou být připraveny použitím reakcí analogických k těm, které se užívají pro dimerizaci a oligomerizaci porfyrinů per se. Gp sloučeniny nebo zelené porfyriny/porfyrinové vazby mohou vyrobeny přímo, nebo mohou být pórfyriny konjugovány nejprve, a potom následovány Diels Alderovou reakcí jednoho nebo obou terminálních porfyrinů pro konversi korespondující Gp sloučeniny.

Pro léčbu subjektů, zejměna lidských subjektů, které vykazují symptomatologii roztroušené sklerosy jsou fotoaktivní sloučeniny, jako jsou sloučeniny zelených porfyrinů nebo jejich směsy, podány systémově, typicky injekčně. Injekce může být intramuskulární, intravenosní, subkutánní, intraperitonealní nebo jakýmkoliv jiným známým způsobem injekce. Jiné prostředky systémového podání mohou být také použity, například, transmukosální podání je provedeno použitím excipientů jako jsou žlučové soli nebo soli kyseliny fusidové. Transdermální nebo orální způsob podání s vhodnými formulacemi je také dosažitelný. Nicméně injekce, zejmena ve formě liposomální kompozice, je preferována.

Množství fotoaktivní sloučeniny, které má být podáno, závisý na kondici pacienta, rozhodnutí lékaře, stavu kondice, způsobu podání a, samozřejmě, na charakteru typický typ drfyrinu, ze;

£ ahu 0,01 ti. Pro rep Ha, je typic^; na kilogram obyklé a né jjklady doložé e a mohou by fotoaktivního agens. Pro derivovaných od hematop jsou vhodné dávky v roz kilogram tělesné hmotnos porfyrinů, jako je BPD- 5 mg, lépe 0_r05 - lmg rozsahy dávek jsou pouze definice limitů. Dvě př sloučeniny jsou netoxicty tolerovány.

Využité formulace se pro injekční budou typic roztok, pufry a jiné exc lipokomplexy jsou prefei terapeutických agens vše Remington's Pharmaceutic Publishing Company, East

Podání fotoaktivního ε jakmile je diagnosa rozt v odpovědi na časnou syn.] je subjekt diagnostikové tato diagnosa. Buď jednc před léčbou světlem může opakované podání, prová minutách od sebe tak, afc chovat se společně jako j ediné podání.

gens může bý roušené skl$ tptomatologi n pomocí CT tlivé podán být použitý qějí se tato y se umožni v čase nula fotoaktivních agens měna sodných porfimerů, mg, lépe 0,1 -5 mg, na ipesentanty zelených ý rozsah dávky od 0,005 tělesné hmotnosti. Tyto jsou míněny jako né fotoaktivní t subjekty dobře podle způsobu podání -obsahovat fyziologický osomy nebo jiné é formulace pro podání být nalezeny v poslední vydání, Mack udou lišit ké přípravký ipienty. Lip ovány. Vhodit obecně mohou al Sciences on, PA.

t zahájeno ihned, rosy potvrzena. Typicky, jako je třes končetin, scanu a je potvrzena nebo opakované podání . Pokud je použito obecně v přibližně 30 o opakovaným podáním Nicméně je preferováno

Fotoaktivnímu agens je pak umožněna distribuce v subjektu. Distribucí je míněno, že uplyne dostatečná doba, takže fotoaktivní agens není dále lokalizováno v místě podání. Protože obvykle bude použito transdermální ozáření, je preferováno vyčkat do té doby, dokud fotoaktivní agens není nejvíce odstraněno z kůže, ale podat léčbu světlem před tím, než byly systémové hladiny fotoaktivní sloučeniny odstraněny.

Jak bylo vysvětleno výše, zatímco se původně soudilo, že fotoaktivnímu agens by mělo být dovoleno odstranění z normálních tkání a akumulování v nežádoucích buňkách před ozářením, bylo zjištěno, jak je popsáno v U.S. přihlášce číslo 07/979,546, zde uvedené jako odkaz, že jsou dostatečné kratší intervaly pro umožnění distribuce dostatečné k účinné fotodynamické terapii. Tak, v předkládané aplikaci, čas vyžadovaný pro distribuci fotoaktivního agens v subjektu se očekává okolo 4-7 hodin. Obecně, fotoaktivní agens zvyšuje koncentraci v kůži během 30 minut až 2 1/2 hodiny a dosahuje maxima v asi 3 hodinách.podstatné množství se odstraní ze systému 7 hodin po podání. Tak je ideální čas pro ozáření světlem v rozsahu 4-7 hodin po podání léčiva.

Poté, co proběhla distribuce je subjekt ozářen světlem, které zahrnuje vlnové délky, které jsou absorbovány fotoaktivním agens. Pacient může být vystaven transdermálnímu ozáření. Absorpční spektrum fotoaktivního agens nám podá informaci o tom, které vlnové délky využít. Požadovaná intensita závisj^ na rozsahu vlnové délky, ale typické intensity jsou 1 - 500 J/cm², lépe 5 - 250 J/cm², a nejlépe okolo 10 - 50 J/cm². Ozáření trvá asi 2 - 180 minut, lépe 15 - 120 minut v z fotoaktivního agens v k ávislosti na řevním řečiš charakteru a koncentraci •i a citlivosti na léčbu.

Obecně, subjekty, které vykazují příznaky roztroušené sklerosy nebo jiné imun jednou nebo vícekrát fo z podání fotoaktivního agens, a ozáření subjek fotodynamické terapie ná terapii, je-li to potřejo sklerosa, je takové mon CAT scanů.

itní dysfunk odynamickou □e, mohou být ošetřeny léčbou, která se skládá agens, distribuce fotoaktivního

u. Subjekt celkový st

a. Je-li st je monitorován na účinek av a znovu vystaven této avem roztroušená

Ítorování nej častěji provedeno užitím

Jako alternativa k poskytnutí transdermální! ošetřena extrakorporálnp frakce, t.j. plasma, mu|ž fotoaktivní agens podán|o v tekutinách, které maj použité fotoaktivní typické koncentrace oko ág/ml, a nejlépe okolo požadován žádný čas pro Tekutina je pak ozářena laserová dioda, světlo vedoucím laserové světilo výše, závisí na absorpčn intensitách světla, jak pokračuje po časovou pe ání fotoakt ho ozáření Bud' celá e být ošetř ivního agens systémové a může být krev pacienta krev, nebo její vhodná ena. V tomto případě je tak, že vejde k finální koncentraci i být ošetřeny, která je vhodná pro MA, například, jsou gg/ml, lépe okolo 0.1 - 1

0.5 ág/ml. Za těchto okolností není

s. Pro BPD o 0.05 - 5 distribuci fotoaktivního agens.

světlem z jakéhokoliv zdroje jako je emitující di a pod. Vir ím spektru je popsáno oda, optickým vláknem ová délka, stejně jako fotoaktivního agens a výše. Obecně, ozáření riodu stejneu s tou pro transdermální ozářeni.

Jak je dáno výše, je potřeba ošetřit pouze relevantní frakci krve. Frakcionace může být provedena v jakémkoliv stadiu procesu. Tak, fotoaktivní agens může být přidáno do plné krve, krev je pak frakcionována a relevantní část krve je ozářena. Alternativně může být krev nejprve frakcionována, pak může být přidána fotoaktivní sloučenina a pak může být frakce ošetřena světlem. Jak frakce, tak plná krev může být navrácena pacientovi. Obecně, vhodná frakce bude obsahovat bílé krvinky. V typické proceduře bude proto potřeba ošetřit pouze plasmu a pak ji navrátit.

Tak bude typický protokol pro léčbu subjektů s roztroušenou sklerosou zahrnovat následující kroky: asi 35 mg BPD-MA formulované jako liposomální preparát je injikováno i.v. subjektu vykazujícím symptomy roztroušené sklerosy. Subjekt je pak ozářen jednou nebo dvakrát: časná léčba je provedena asi 0.5 až 2.5 hodiny a pozdní léčba je provedena asi 5-7 hodin po injekci. Subjekt je ozářen červeným světlem vlnové délky 690 nm + 10 nm po 30 minut. Pro časnou léčbu je intensita okolo 10 - 50 J/cm², lépe okolo 15 - 25 J/cm², nejlépe okolo 20 J/cm². Pro pozdní léčbu je intensita okolo 150 - 250 J/cm², lépe okolo 200 J/cm².

Pacient je pak monitorován na výsledky fotodynamické terapie.

Pro léčbu revmatoidní artritidy jsou podobné parametry signifikantní. Model v Příkladu 2 níže předpovídá chování revmatoidní artritidy u lidí. Při tomto onemocnění může být použita jak systémová, tak lokální léčba. Systémová léčba je obecně účinná v ovlivnění choroby jako celku, zatímco lokální ošetření kloubů je určeno symptomům.

e typicky p intravenc ív j iný zná edky systéme ho a transd může být f iženého klo závisí na ko vém stavu, fotoaktivní a porfimer aorfyriny, j a je popsáno užité formul ijekci budou roztok, pufry í budou pref jiné lipoko ihto terapeu Pharmaceutic Company,

Pro systémovou léčbu může být intramuskulární subcutánní, nebo jakýkol být použity jiné prostř orálního, transmukosální výše. Pro lokální podání injikováno přímo do pos|t fotoaktivní sloučeniny rozhodnutí lékaře, celkb agens. Pro typické typy hematoporfyrinu, zejmen representativní zelené rozsah dávky stejný jak roztroušené sklerosy. způsobu podání -- pro i obsahovat fyziologický využita jako cesta podálí zahrnující liposomy nebp formulace pro podání tě nalezeny v Remington's vydání, Mack Publishing

Po

Eaa oužita injekce. Injekce sní, intraperitoneální, mý způsob inj ekce. Mohou vého podání včetně ermálního jak je popsáno otoaktivní sloučenina ubu. Množství podané ndici pacienta, charakteru fotoaktivního ch agens odvozených od sodný, a pro ako je BPD-MA, je vhodný výše pro léčbu ace se budou lišit podle typické přípravky a a je-li injekce erovány formulace mplexy. Vhodné tických agens mohou být al Sciences, poslední ton, PA.

Podání fotoaktivního jakmile je diagnosa re Stejně jako výše, buď j před jednotlivou léčbou systémové podání, je pr agens. Pro lokální inje fotoaktivního agens v agens muže atoidní art ďdnotlivé pofl světlem můž ^ferováno jeď ci může být átkých čase vn k:?

oýt zahájeno ihned, ritidy potvrzena u subjektu, ání nebo opakované podání 2 být použito. Obecně , pro notlivé podání fotoaktivního žádoucí opakované podání ch za sebou.

Při systémovém podání je pak fotoaktivnímu agens umožněna distribuce v subjektu. Distribucí je míněno, že uplyne dostatečná doba, takže fotoaktivní agens není dále lokalizováno v místě podání. Jak bylo vysvětleno výše, zatímco dříve se soudilo, že fotoaktivnímu agens by mělo být dovoleno odstranění z normálních tkání a akumulování v nežádoucích buňkách před ozářením, bylo zjištěno, jak je popsáno v U.S. přihlášce číslo 07/979,546, zde uvedené jako odkaz, že jsou dostatečné kratší intervaly pro umožnění distribuce dostatečné k účinné fotodynamické terapii. Je-li použito transdermálního ozáření, je časová perioda stejná jako je popsána výše pro léčbu roztroušené sklerosy. Je-li využito přímého ozáření kloubu, například, světelným vláknem s připojeným laserem zavedeným do kloubu per se, je pouze nezbytná dostatečná koncentrace v kloubu. Ta je obecně po asi 30 minutách, ačkoliv stejně tak mohou být užity jiné časy. Je-li užito lokálního podání fotoaktivního agens, může být, pochopitelně, ozáření světlem provedeno téměř okamžitě.

Jak je popsáno výše pro léčbu roztroušené sklerosy může být také využito extrakorporální ošetření krve. Podmínky popsané výše jsou zde aplikovatelné stejně.

Ve vhodnou dobu, po proběhnutí distribuce, je subjekt ozářen světlem, které obsahuje vlnové délky, které jsou absorbovány fotoaktivním agens. Absorpční spektrum fotoaktivního agens bude informativní pro to, jaké vlnové délky použít. Pro transdermální iradiaci se využije intensita a časová perioda popsaná výše. Pro lokalizovanou iradiaci kloubu může být ozáření bud' transdermální v případě malých kloubů nebo může být provedeno invasivně užitím světelných vláken v případě větších kloubů. Intensity a časy jsou podobné jako pro transdermální ozáření.

Pro extrakorporální éčbu jsou výše pro roztroušenou sklerosu.

parametry stejné jako je popsáno

Tak bude typický pro revmatoidní artritidou mg BPD-ΜΑ formulované injikováno přímo do kl revmatoidní artritidy 690 nm + 10 nm světlem Pacient je pak monitor

Následující příklady omezení vynálezu.

okol pro lé zahrnovat ako liposom (jiubu subjekt Subjekt je při 25 J/cm cjván na výsl jsou zamýšl čbu subjektu s sledující kroky: asi 3 ilní preparát je vykazujícího symptomy pak okamžitě ozářen ^! po 15 minut.

edky fotodynamické terapie, eny jako ilustrace, ale ne

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 Odpověd různých leuko Byla odebrána krev od Byla použita plná krev BPD-ΜΑ a pak ozářena sv cytú na BPD dvou pacie a ozáření.

ritů s prokázanou infekcí HIV.

od každého pacienta, s různými hladinami ětlem při 1 emitovaného z LED po čtyřminutovou

q.8 J/cm² užitím 690 nm světla časovou periodu. Populace různěn subpopulací T-bu iněk byly hodnoceny průtokovou cytometrií ve srovnání s neošetřenou kontrolou. Procenta přítomných buněk byla hodnocena jako procenta kontroly a pak zakresleny do grafu jako funkce BPD-ΜΑ koncentrace.

Získané výsledky jsou ukázáno, většina buněčn včetně B-buněk a CD4+ b DR+ buněk. IL-2R+ buňky výsledcích pacienta zak byl závislý na použité ukázány na ých populací íněk. Mírný vykazovaly eslených na dávce BPD-MA

Obrázcích IA a 1B. Jak je zůstává relativně intaktní, pokles byl prokázán u CD8+ a dramatický pokles ve Obrázku IA, a tento pokles

Jak je ukázáno na Obrázku 1A, ačkoliv IL-2R+ buňky byly dramaticky sníženy, signifikantní snížení CD8+ buněk a DR+ buněk bylo také pozorováno. Efekt na DR+ buňky byl dramatičtěji ukázán pro druhého pacienta na Obrázku IB.

Podobné studie byly provedeny s konstantní koncentrací BPD-MA (0,5 ^g/ml), použitím subjektů jednoho normálního jedince a dvou HIV pacientů. Obrázek 2 ukazuje subpopulace leukoytů v neošetřené krvi získané od těchto dárců. Jak je ukázáno na Obrázku 2,

B-buňky a přirození zabiječi - buňky se vyskytovaly zhruba ve stejných hladinách u normálního a HIV subjektů. Nicméně, ARC pacienti pravidelně vykazují snížené hladiny CD4 + a zvýšené hladiny CD8+, DR+ a IL-2R+.

Obrázky 3A, 3B a 3C ukazují efekty léčby podle vynálezu. Jak je ukázáno na Obrázku 3A, ošetření leukocytových subpopulací v normální krvi má malý efekt na jakoukoliv ukázanou populaci. Obrázek 3B ukazuje, že ,byla-li HlV-injikovaná krev podrobena této léčbě, zde bylo mírné snížení CD8+, mírné snížení DR+, a signifikantní snížení IL-2R+ buněk. Obrázek 3C ukazuje tyto výsledky specificky pro IL-2R+ buňky, jak pro normální subjekt, tak pro dva HIV - infikované subjekty. Opět byl pozorován dramatický pokles.

Tak po léčbě 0.5 Mg/ml BPD po čtyři minuty za přítomnosti 10.8 J/cm² světla o 690 nm zůstávala buněčná populace všech buněčných typů u normálního subjektu, a všech buněčných typů kromě IL-2R+ u HIV subjektu, relativně konstantní. DR+ a CD8+ buňky mírně poklesly. BPD/světlo ošetření se jeví, že má malý nebo žádný efekt na většinu podtříd leukocytů. Nicméně, zvýšené hladiny IL-2R+ buněk byly změněny na normální.

Příklad 2

Plná lidská krev od E různými koncentracemi E protokolu podobném jakc testován efekt inaktivac jsou ukázány na Obrázku produkovaly dramatickou okolo 0.5 Mg/ml nebo ni vyšší koncentrace BPD p:

Příklad 3

IV pacienta PD a různým;, byl ten, kt: e asociova 4. Jak je inaktivaci žších. Nižší ro kompletní byla také podrobena ošetření intensitami světla v erý je dán v Příkladu 1. Byl ných s HIV. Získané výsledky ukázáno, intensity 13 J/cm² viru při BPD koncentracích intensity ozáření požadovaly inaktivaci viru.

Schopnost inaktivovat CEM buněk byla také tesit zředěn do tkáňového kul|t koncentracích bud' 0,25 inkubováno po jednu hodji nm a při intensitě 10,8 buňkám, a buňky byly zk šestidenní kultivaci. V volný HIV ována. Ve ivačního mi izg/ml nebo C nu a vystali J/cm². Médi sušeny, užit ýsledky byly (LAV-l kmen) v tkáňové kultuře 2koušce byl LAV-l kmen edia a BPD byl přidán v 5 pg/ml. Medium bylo eny tři minuty ozáření při 690 um bylo pak přidáno k CEM ím standartní p24 zkoušky, po počítány v pg/ml.

Získané výsledky jsou ředěné LAV, které posky BPD, BPD koncentrace buď podstatného snížení urče shrnuty v ovály vysok ' Q_f25 Mg/ml né hladiny

Tabulce 1 níže. Jak je ukázáno, é hladiny p24, ošetření nebo 0,5 pg/ml byl schopný p24.

TABULKA 1
LAV-1	Ošetření bez léčiva	Ošetření 0,25 gg BPD	Ošetření 0,5 μ<3 BPD
Ředěni	bez světla	3 min.	3 min.
10²	>616	23.2	14.2
3 x 10“²	>616	18.2	14.5
5 x 10‘²	>616	15.1	11.4
7 x 10'²	>616	8.9	7.6
9 x 10'²	>616	7.6	5.4
10'³	>616	4.5	7.0
3 X 10³	>616	5.1	3.2
5 x 1O³	>616	4.5	3.9
7 x 10'³	>616	3.9	2.0
9 x 10³	>616	5.4	2.3
1O⁴	>616	2.0	4.2
3 x 10'⁴	>616	3.6	2.0
5 x 1O~⁴	>616	2.9	2.3
7 x 1O'⁴	>616	3.2	—
9 x 10’⁴	2.6	2.6	-__

Příklad 4

Léčba experimentální alergické enoephalomyelitidy

Experimentální alergie jako validní model mode Springer Seminars Immun navozena injekcí myelin zprostředkována MBP - sp myelinové pochvy centrá oblast, a způsobují pro<jf (Bernard, C.C.A. et al vynález rozvinul zlepšen splenocyty nebo lymfocyt monoklonální odpověď na IL-2 a pak transfektováifi kultivovaných buněk způ synchronním způsobem.

ká encephal omyelitida je obecně uznávána pro MS. Viz, například Steinman, L.

) 14:79 - 93. U myší je roteinu (MBP) a je ecifickými Γ buňkami, které atakují ního nervového systému, infiltrují alýzu zadních končetin (1975) 114: 1537. Předkládaný í tohoto mohelu, kde MBP-ošetřené gpatol (1992 basického p resivni par J Immunol y z PL myší MBP, jsou k y do naivní šobuje choro kmenu který poskytuje iltivovány in vitro s MBP a ch příjemců. Transfer těchto ou u 100% příjemců téměř

V prvotní studii byly 100 ng/ml BPD verteporf resuspendovány v 200 μΐ /zg/ml BPD v liposomálním byla injikována i.v. naí transdermální ozáření uř světlo úzkého spektra ( buňky určen

:.nu po 60 mi media obsah přípravku vním PL příij itím boxu o >90 nm + 10 e k transfekci preinkubovány s nut ve tmě, promyty a ujícího 5% FCS. Padesát μΐ 40 oylo přidáno k buňkám a směs jemcům. Zvířata dostala bsahujícího diody emitující nm) po 20 min (15 J/cm²).

Obrázek 7 ukazuje, že BPD se nevyvinula EAE, se tato vyvinula.

u zvířat zatímco u ko in] jikovaných buňkami ošetřenými ntroly, která obdržela buňky

V další sadě experimentů bylo myším, kterým byly injikovány výše popsané kultivované lymfocyty, bylo podáno 1 mg/kg BPD v liposomální formulaci okamžitě po injekci lymfocytů. Ošetřené myši byly umístěny ve tmě po 60 minut před expozicí světlem jak je popsáno výše. Protokol fotodynamické terapie (t.j. injekce BPD-MA následovaná po 60 minutách expozicí světlu) byl použit, v rozdělených experimentálních skupinách, v různou dobu po injekci kultivovaných lymfocytů. Výsledky na Obrázku 8 ukazují, že podání PDT léčby během 24 hodin oddaluje nástup EAE ze dne 21 na den 41. Nicméně, oddálení léčby na 48 hodin vedlo k tomu, že léčba byla neefektivní.

V dalším experimentu byl PDT podán zvířatům 24 hodin před injekcí lymfoidních buněk. Tento protokol byl také protektivní s ohledem na EAE.

Příklad 5

Léčba kolagen - indukované artritidy

Kolagen - indukovaná artritida je známá jako experimentální model pro studium revmatoidní artritidy.

CIA je indukována u DBA/1 myší subkutánní injekcí hovězího kolagenu typu II. V presentovaném modelu byly podány dvě injekce kolagenu, první v den 0 a druhá v den 21 (Trentham , D.E. et al.,

J Exp Med (1977) 146:857, Courtenay, J.S. et al. Nátuře (1980)

283 :665.

V jednom PDT režimu bylo myším injikováno 1 mg/kg liposomálního BPD i.v. v den 5 a 12, byly udržovány ve tmě po 60 minut po injekci a pak vystaveny obsahoval diody emitují po 20 minut (15 J/cm²). obdržely PDT léčbu vyká kontroly.

nímu ozáření v boxu, který :trum světla (690 nm + 10 nm) : Obrázek 9, myši , které atně nižší incidenci CIA než transdermá] cí úzké spěl·

Jak ukazuje zovaly podst

Ve druhém režimu byla 28; jak ukazuje Obrázek oddálen u ošetřených my výše popsar 10 byl nást si.

á PDT léčba podána v den up choroby signifikantně

Claims

1. Extrakorporální způsob selektivní redukce aktivbvanďpbpulace leukocytů v leukocyty obsahující tekutině, získaný od subjektu, který potřebuje — takovouto redukci, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) ošetření zmíněné tekutiny, nebo její frakce obsahující aktivované leukocyty, efektivním množstvím fotoaktivní sloučeniny, a

b) ozáření zmíněné ošetřené tekutiny nebo její frakce světlem obsahujícím alespoň jednu vlnovou délku absorbovanou zmíněnou fotoaktivní sloučeninou.

2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že zmíněnou fotoaktivní sloučeninou je sloučenina na basi porfyrinů.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se’tím, že zmíněnou sloučeninou je sloučenina zeleného porfyrinů (Gp) nebo derivát hematoporfyrinu.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že zmíněnou Gp sloučeninou je sloučenina BPD-MA, BPD-DA, BPD-MB nebo BPD-DB

BPD-DA

ROOC

CHR¹

CH,

CH₂ i

COOH

HOOC —

COOH α hematoporfyrinovým derivátem je porfimer sodný.

5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že zmíněné ošetření leukocyty obsahující tělesné tekutiny vede ke koncentraci fotoaktivní sloučeniny v rozsahu asi 0,05 až 5 μς/ιτιΙ.

6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že zmíněným subjektem je příjemce transplantátu nebo subjekt mající autoimunitní chorobu.

7. Tělesná tekutina, nebo její frakce, u které došlo k depleci aktivovaných leukocytů způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.

8. Tělesná tekutina, nebo její frakce, podle nároku 7, vyznačující se tím, že tělesnou tekutinou je krev, nebo její frakce, která obsahuje zvýšené hladiny CD8⁺ buněk a DR⁺ buněk, ale normální hladiny IL-2R⁺ buněk.

9. Tělesná tekutina, nebo její frakce, podle nároku 7, vyznačující se tím, že obsahuje redukované hladiny leukocytů asociovaných s roztroušenou sklerosou nebo revmatoidní artritidou.

10. Použití fotoaktivní sloučeniny pro výrobu kompozice pro způsob selektivní redukce aktivované populace leukocytů, v leukocyty obsahující tekutině subjektu, který potřebuje takovouto redukci, kterýžto způsob zahrnuje:

11. Použití fotoaktivní sloučeniny podle nároku 10, vyznačující se tím, že zmíněnou fotoaktivní sloučeninou je sloučenina na basi porfyrinu.

12. Použití fotoaktivní sloučeniny podle nároku 10, vyznačující se tím, že zmíněnou sloučeninou je sloučenina zeleného porfyrinu (Gp) nebo derivát hematoporfyrinu.

13. Použití fotoaktivní sloučeniny podle nároku 12, vyznačující setím, že zmíněnou Gp sloučeninou je sloučenina BPD-MA, BPD-DA, BPD-MB nebo BPD-DB výše uvedených vzorců a hematoporfyrinovým derivátem je porfimer sodný.