DE3587579T2

DE3587579T2 - Pharmazeutische Zubereitung enthaltend eine Tetrahydropyrrolverbindung als aktiven Bestandteil und Verfahren zur Herstellung dieser Tetrapyrrolverbindung.

Info

Publication number: DE3587579T2
Application number: DE85108987T
Authority: DE
Inventors: Jerry C Bommer; Bruce F Burnham
Original assignee: Nippon Petrochemicals Co Ltd
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1984-07-18
Filing date: 1985-07-18
Publication date: 1994-02-17
Anticipated expiration: 2005-07-19
Also published as: US4675338A; DK167768B1; EP0168832A3; SG103194G; JPS6183186A; JPH0688902B2; NO169290B; EP0168832B1; DK326785D0; DK326785A; NO169290C; CA1262862C; AU579387B2; HK135994A; CA1262862A; ATE94547T1; JPH0689000B2; NO852871L; JPS61129163A; EP0168832A2

Description

Diese Erfindung betrifft neue therapeutische Zusammensetzungen, die bei der Photodiagnose und Phototherapie verwendbar sind, insbesondere bei der Detektion und Behandlung von Tumoren und cancerösen Geweben im menschlichen oder tierischen Körper.
Es ist bekannt, Tumoren und canceröse Gewebe im menschlichen Körper mit intensivem Licht nach Verabreichung eines Hämatoporphyrin- Derivats im Wellenlängenbereich von 626 bis 636 Nanometern zu bestrahlen, um Krebszellen zu reduzieren und gelegentlich zu zerstören (siehe PCT Offenlegungsschrift WO 83/00811). Bekannt ist auch, daß Porphyrine, insbesondere das Natriumsalz von Protoporphyrinen, die normalen Zellfunktionen erhalten oder fördern können und zur Verhinderung von Genese, Wachstum, Metastasen und Rezidiven von malignen Tumoren verwendbar sind. Die japanische Offenlegungsschrift Nr. 125 737/76 beschreibt die Verwendung von Porphyrinen als tumorinhibierende Mittel, wobei als Beispiel Etioporphyrin, Mesoporphyrin, Protoporphyrin, Deuteroporphyrin, Hämatoporphyrin, Koproporphyrin und Uroporphyrin angeführt werden.
In Tetrahedron Letters Nr. 23, Seiten 2017 bis 2020 (1978) wird ein Aminomonocarbonsäureaddukt des Pigments Bonellin beschrieben, das durch Extraktion von im wesentlichen der Zellwand des See-Echuroiden B. viridis erhalten wird. Es wird angenommen, daß die Struktur dieser Addukte ein Amid ist, das durch eine der freien Carboxygruppen von Bonellin und die Aminomonocarbonsäure gebildet wird. Die Hydrolyse des Addukts ergab eine Mischung aus Valin, Isoleucin, Leucin und Alloisoleucin. Keine Verwendung für diese Aminosäureaddukte wird in dieser Referenz beschrieben.
Daß die Tetrapyrrole eine intensive Photoempfindlichkeit bei Tieren verursachen, ist bekannt und in zahlreichen Artikeln in der Literatur dokumentiert, z. B. J. Intr. Sci. Vitaminol, 27, 521-527 (1981); Agric. Biol. Chem., 46(9), 2183-2193 (1982); Chem. Abst. 98, 276 (1983) und 88, 69764m (1928).
In "Chemische Berichte", Band 90 (1957), Seiten 470-481, werden Mesoporphyrine mit zwei Dimethylglutamatester-Substituenten offenbart. Darüber hinaus werden in WO 84/01382 ein dimerer (Bis-1[3-(1- hydroxyethyl)deuteroporphyrin-8-yl-ethylether und Aggregate von Hämatoporphyrinen offenbart.
Die therapeutischen Mittel, die im Zentrum dieser Erfindung stehen, sind cyclische und acyclische Tetrapyrrole, die durch verschiedene Verfahren von natürlich vorkommenden Tetrapyrrolen abgeleitet sind. Die cyclischen Tetrapyrrole haben als ihr gemeinsames Muttertetrapyrrol Uroporphyrinogen und besitzen die folgende Ringstruktur:
worin die Positionen im Molekül mit 1 bis 20 numeriert sind und die Ringe durch die Buchstaben A, B, C und D bezeichnet sind, und schließen auch Perhydro-, z. B. Dihydro- und Tetrahydro-Derivate dieser Ringstruktur ein, z. B. Verbindungen, worin ein oder mehrere Doppelbindungen fehlen. Im Ringsystem liegen vier Pyrrolringe vor, die an den α-Positionen der jeweiligen Pyrrolringe durch eine Methingruppe, d. h. -CH=, verbunden sind. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden aus Einfachheitsgründen in der Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen als Tetrapyrrol-Derivate bezeichnet, und es soll darunter verstanden werden, daß der Begriff "Tetrapyrrol" Verbindungen der zuvor bezeichneten charakteristischen Ringstruktur bezeichnet, ebenso wie die entsprechenden Perhydro-Derivate und die entsprechenden nichtcyclischen Pyrrole, d. h. die linearen Tetrapyrrole, die allgemein als Gallenpigmente bekannt sind.
Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Tetrapyrrole sind alle durch verschiedene Mittel und verschiedene Änderungsverfahren von natürlichen Tetrapyrrolen abgeleitet. Die natürlich vorkommenden Tetrapyrrole haben als ihrem gemeinsamen Vorgänger Uroporphyrinogen III, ein Hexahydroporphyrin, das an den Brückenpositionen reduziert ist. Beispielsweise sind synthetische oder biosynthetische Derivate oder Produkte von Protoporphyrinen IX oder Protoporphyrinogen IX im Stand der Technik wohlbekannt (siehe z. B. Porphyrins and Metalloporhyrins, K. Smith; Elsevier; The Porphyrins (Bände 1-7) D. Dolphin, Academic Press; und Biosynthetic Pathways, Vol. III, Kapitel von B. Burnham, Herausgeber D.M. Greenberg, Academic Press).
Die nichtcyclischen Tetrapyrrole sind gemeinhin als Gallenpigmente bekannt und schließen beispielsweise Bilirubin und Biliverdin ein. Diese Tetrapyrrole stammen ebenfalls vom Protoporphyrin ab, z. B. als metabolische Produkte in Tieren.
Ein weiteres Charakteristikum der vorliegenden neuen therapeutischen Zusammensetzung ist das Vorliegen von mindestens einer Amidbindung in einem Substituenten an einem der numerierten Positionen der Ringstruktur. Diese liegen in den vorliegenden neuen Verbindungen zusammen mit anderen Substituenten, wie im folgenden definiert, vor.
Die vorliegende Erfindung betrachtet somit therapeutische Zusammensetzungen, die aus Aminosäure- oder Peptid-Derivaten von Verbindungen bestehen, welche Chromophore von Porphyrinen, chlorinen oder Bakteriochlorinen enthalten, ebenso wie verwandte Porphyrin- Verbindungen. Die Peptidbindung kommt zwischen einer Carboxygruppe der chromophortragenden Verbindung und der Aminogruppe der speziellen Aminosäure zustande. Die vorliegenden neuen Verbindungen umfassen unter anderem Tetrapyrrol-Derivate, die eine freie Carboxygruppe enthalten. Diese Derivate schließen die Haupttetrapyrrolklassen ein: carboxy-enthaltende Porphyrine, Chlorine und Bacteriochlorine, die den Fachleuten wohlbekannt sind.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Aminosäuren zur Bildung der oben erwähnten Peptidbindung sind Aminodicarbonsäuren, worin die Aminogruppe natürlich an einem Kohlenstoffatom der Dicarbonsäure positioniert ist. Die spezifische Position der Aminogruppe an der Kohlenstoffkette ist nicht kritisch, und das einzige Erfordernis ist, daß die Aminogruppe zur Bildung der geforderten Peptidbindung mit der Carboxylgruppe des ausgewählten Porphyrins zur Verfügung steht. Somit sind eine Reihe von Aminodicarbonsäuren in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendbar, einschließlich α-Aminobernsteinsäure (Asparaginsäure), α-Aminoglutarsäure (Glutaminsäure), β-Aminoglutarsäure, β-Aminosebacinsäure, 2,6- Piperidindicarbonsäure, 2,5-Pyrroldicarbonsäure, 2-Carboxypyrrol-5- essigsäure, 2-Carboxypiperidin-6-propionsäure, α-Aminoadipinsäure, α-Aminoazelainsäure und ähnliche Säuren. Diese Aminosäuren können mit angularen Alkylgruppen wie Methyl- und Ethylgruppen substituiert sein, ebenso wie mit anderen Gruppen, die die Fähigkeit der Aminogruppe zur Bildung der Peptidbindung nicht negativ beeinflussen, z. B. Alkoxygruppen oder Acyloxygruppen, und können auch weitere Aminogruppen einschließen. Die bevorzugten Aminosäuren sind die natürlich vorkommenden α-Aminosäuren, Glutaminsäure und Asparaginsäure, welche einfach zur Verfügung stehen und bis dato zu den besten Ergebnissen führten.
Beispielsverbindungen der Tetrapyrrolklassen werden in Tabelle I erläutert, worin die numerierten Positionen der Tetrapyrrolringstruktur zur Bezeichnung der Position des angegebenen Substituenten verwendet werden. Das Fehlen von Doppelbindungen im Ringsystem wird unter "Dihydro" mit dem jeweiligen Zahlensatz (Ringposition) bezeichnet, was das Fehlen einer Doppelbindung zwischen den bezeichneten Positionen anzeigt. Tabelle I Ringposition Porphyrin Dihydro Koproporhyrin III Deuteroporphyrin IX Hämatoporphyrin IX Protoporphyrin IX Photoprotoporphyrin IX Mesoporphyrin IX Pyropheophorbid a Transmesochlorin IX Pheophorbid a Tabelle I (Fortsetzung) Ringposition Porphyrin Dihydro Chlorin e&sub4; Mesochlorin e&sub4; Isochlorin e&sub4; Mesoisochlorin e&sub4; Mesochlorin e&sub6; Bacteriopheophorbid a Pyrobacteriopheophorbid a Bacteriochlorin e&sub6; Tabelle I (Fortsetzung) Ringposition Porphyrin Dihydro Bacteriochlorin e&sub4; Bacterioisochlorin e&sub4; Anmerkungen: Me: -CH&sub3; (Methylgruppe) Pr: -CH&sub2;CH&sub2;COOH (Propionsäuregruppe) V: -CH=CH&sub2; (Vinylgruppe) Et: -CH&sub2;CH&sub3; (Ethylgruppe) Ac: -CH&sub2;COOH (Essigsäuregruppe) ACL: CH&sub3;-CO- (Acetylgruppe)
Die vorliegende neue therapeutische Zusammensetzung umfaßt Mono- oder Polyamide einer Aminodicarbonsäure und eines Tetrapyrrols, das mindestens eine Carboxylgruppe enthält, der Struktur:
worin Z der Aminodicarbonsäurerest minus die Aminogruppe ist und X der Tetrapyrrolrest minus die Carboxygruppe ist und "n" eine Ganzzahl von 1 bis 4 ist, einschließlich deren Salze, unter der Voraussetzung, daß die Verbindung nicht Mesoporphyrin-bis-L- glutaminsäure ist.
Die besonders bevorzugten Verbindungen sind fluoreszierende Mono- oder Polyamide einer α-Aminodicarbonsäure und einer Tetrapyrrol- Verbindung der Formel:
oder der entsprechenden Di- oder Tetrahydrotetrpyrrole, worin R&sub1; Methyl oder R&sub2; H, Vinyl, Ethyl Acetyl, -Ethyl, R&sub3; Methyl R&sub4; H, Vinyl, Ethyl, R&sub8; Methyl oder ist und
R&sub9; H, COOH, CH&sub2;COOH oder Methyl ist; vorausgesetzt, daß wenn R&sub1;, R&sub2;&sub1; R&sub3;, R&sub4;, R&sub7; und R&sub8; zwei
Substituenten darstellen oder zweiwertig und an das selbe Kohlenstoffatom gebunden sind, der jeweilige Pyrrolring, an den sie gebunden sind, ein Dihydropyrrol ist;
R Niederalkyl oder Benzyl ist;
R&sub6; und R&sub9; zusammengenommen
sind,
unter der Voraussetzung, daß mindestens ein Rest von R&sub1; bis R&sub9; eine freie Carboxylgruppe einschließt; und deren Salze.
Die besonders bevorzugten therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bestehen aus Amiden, die von Tetrapyrrolen der Formel:
oder den entsprechenden Di- oder Tetrahydrotetrapyrrolen und deren Salzen abgeleitet sind, worin R&sub1; bis R&sub9; wie zuvor definiert sind.
Besonders bevorzugte therapeutische Mittel dieser Erfindung schließen die folgenden Verbindungen ein:

Chlorinderivate:

Mono- und Diaspartyltransmesochlorin IX
Mono- und Diglutamyltransmesochlorin IX
Mono-, Di- und Triaspartylchlorin e&sub6;
Mono-, Di- und Triaspartylmesochlorin e&sub6;
Mono-, Di- und Triglutamylchlorin e&sub6;
Mono-, Di- und Triglutamylmesochlorin e&sub6;
Mono- und Diaspartylchlorin e&sub4;
Mono- und Diaspartylmesochlorin e&sub4;
Mono- und Diaspartylisochlorin e&sub4;
Mono- und Diaspartylmesoisochlorin e&sub4;
Mono- und Diglutamylchlorin e&sub4;
Mono- und Diglutamylmesochlorin e&sub4;
Mono- und Diglutamylisochlorin e&sub4;
Mono- und Diglutamylmesoisochlorin e&sub4;
Monoaspartylpyropheophorbid a
Monoglutamylpyropheophorbid a
Monoaspartylpheophorbid a
Monoglutamylpheophorbid a
Mono- und Diaspartylphotoprotoporphyrin IX
Mono- und Diglutamylphotoprotoporphyrin IX
Mono- und Di-L-α-aminoadipyl-trans-mesochlorin IX

Porphyrinderivate:

Mono- und Diaspartylmesoporphyrin IX
Mono- und Diglutamylmesoporphyrin IX
Mono- und Diaspartylprotoporphyrin IX
Mono- und Diglutamylprotoporphyrin IX
Mono- und Diaspartyldeuteroporphyrin IX
Mono- und Diglutamyldeuteroporphyrin IX
Mono-, Di-, Tri- und Tetraaspartylkoproporphyrin III (Isomerenmischung)
Mono-, Di-, Tri- und Tetraglutamylkoproporphyrin III
Mono- und Diaspartylhämatoporphyrin IX
Mono- und Diglutamylhämatoporphyrin IX

Bacteriochlorinderivate:

Mono- und Diaspartylbacteriochlorin e&sub4;
Mono- und Diglutamylbacteriochlorin e&sub4;
Mono- und Diaspartylbacterioisochlorin e&sub4;
Mono- und Diglutamylbacterioisochlorin e&sub4;
Mono-, Di- und Triaspartylbacteriochlorin e&sub6;
Mono-, Di- und Triglutamylbacteriochlorin e&sub6;
Monoaspartylpyrobacteriopheophorbid a
Monoglutamylpyrobacteriopheophorbid a
Monoaspartylbacteriopheophorbid a
Monoglutamylbacteriopheophorbid a
Bevorzugte therapeutische Mittel dieser Erfindung sind
Verbindungen, worin das Porphyrinaminosäureaddukt ausgewählt ist aus
den Gruppen Monoaspartyltransmesochlorin IX,
Diaspartyltransmesochlorin IX, Monoglutamyltransmesochlorin IX,
Diglutamyltransmesochlorin IX, Monoaspartylchlorin e&sub6;,
Triaspartylchlorin e&sub6;, Monoglutamylchlorin e&sub6;,
Diglutamylprotoporphyrin IX, Monoaspartylmesochlorin e&sub6;,
Monoglutamylprotoporphyrin IX, Monoaspartylmesoporphyrin IX,
Diaspartylmesoporphyrin IX, Diaspartylprotoporphyrin IX,
Monoaspartylbacteriochlorin e&sub4;, Diaspartyldeuteroporphyrin IX,
Monoaspartyldeuteroporphyrin IX, Monoglutamylbacterioisochlorin e&sub4;,
Diglutamyldeuteroporphyrin IX, Mono- oder
Diaspartylphotoprotoporphyrin IX, Mono- oder
Diglutamylphotoprotoporphyrin IX, Mono-, Di-, Tri- oder
Tetraglutamylkoproporhyrin III, Mono- oder Diaspartylhämatoporphyrin
IX, Mono- oder Diglutamylhämatoporphyrin IX,
Mono- oder Diglutamylchlorin e&sub4;, Mono- oder Diglutamylmesochlorin e&sub4;,
Mono- oder Diaspartylchlorin e&sub4; und Monoglutamyldeuteroporphyrin IX.
Die obigen Verbindungen bilden Salze, sowohl mit Säuren wie Basen. Die Säuresalze sind besonders zur Reinigung und/oder Trennung der Amidendprodukte verwendbar, ebenso wie die mit Basen gebildeten Salze. Die Basensalze sind jedoch besonders bevorzugt für diagnostische und therapeutische Verwendungen, wie hierin beschrieben.
Die Säuresalze werden mit einer Reihe von Säuren gebildet, wie Mineralsäuren, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure und Schwefelsäure, organischen Säuren wie Toluolsulfonsäure und Benzolsulfonsäure.
Die basischen Salze schließen beispielsweise Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Ammonium-, Triethylammonium-, Trimethylammonium-, Morpholin- und Piperidinsalze und ähnliche solche Salze ein.
Die Säuren- und Basensalze werden einfach dadurch gebildet, daß das ausgewählte Aminosäuretetrapyrrolamid in einer wäßrigen Lösung der Säure oder Base gelöst wird und die Lösung zur Trockne eingedampft wird. Die Verwendung eines wassermischbaren Lösungsmittels für das Amid kann die Auflösung des Amids unterstützen.
Die Amidendprodukte können ebenfalls zu Metallkomplexen, beispielsweise durch Reaktion mit Metallsalzen, umgewandelt werden. Die Magnesiumkomplexe können zum selben Zweck wie das Adduktprodukt verwendbar sein. Andere Metallkomplexe, ebenso wie der Magnesiumkomplex, einschließlich beispielsweise Komplexe mit Eisen und Zink, sind nützlich, um einer Kontamination während der Verarbeitung des Adduktprodukts durch Metalle wie Nickel, Kobalt und Kupfer vorzubeugen, welche schwierig entfernbar sind. Zink und Magnesium sind vom Addukt-Endprodukt leicht entfernbar, nachdem die Verarbeitung beendet ist.
Da viele Aminodicarbonsäuren sowohl in der D- wie in der L-Form existieren und ebenso in Mischungen dieser Formen, wie in der D-, L- Form eingesetzt werden, wird die Auswahl der Aminosäure-Ausgangsprodukte natürlich zu Produkten führen, bei denen das jeweilige Isomer oder die jeweilige Isomerenmischung vorliegt. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung aller solcher Isomere, doch die L-Form ist besonders bevorzugt.
Die vorgenannten Verbindungen werden nach den gewöhnlichen Peptidsyntheserouten hergestellt, welche allgemein eine beliebige Amidbildungsreaktion zwischen der ausgewählten Aminosäure und dem speziellen Tetrapyrrol einschließen. So kann ein beliebiges amidbildendes Derivat der Tetrapyrrolcarbonsäure zur Herstellung der vorliegenden neuen Peptide eingesetzt werden, z. B. Niederalkylester, Anhydride und gemischte Anhydride.
Die bevorzugten Herstellungsverfahren verwenden gemischte Anhydride der Carbonsäure oder Carbodiimide. Man bringt die Reaktanten in einem dafür geeigneten Lösungsmittel einfach in Kontakt und läßt sie reagieren. Temperaturen bis zur Rückflußtemperatur können verwendet werden, wobei die höheren Temperatur lediglich die Reaktionszeit verringern. Übermaßig hohe Temperaturen werden jedoch im allgemeinen nicht bevorzugt, um unerwünschte Sekundärreaktionen zu vermeiden.
Die Verfahren zur Bildung der erfindungsgemäßen Peptide sind auf diesem Gebiet wohlbekannt und werden im Detail in den Begleitbeispielen angegeben.
Wenn das ausgewählte Tetrapyrrol mehr als eine Carboxylgruppe enthält, dann können Produktmischungen gebildet werden, einschließlich isomerer Monopeptidprodukte und Di- und sogar Tri- oder höhere Peptidprodukte, in Abhängigkeit von der Zahl der Carboxylgruppen und in Abhängigkeit von der gewählten Stöchiometrie. Somit werden, wenn äquimolare Mischungen von Aminosäure und Tetrapyrrol umgesetzt werden, nicht nur Monopeptide, sondern auch Dipeptide erhalten, obwohl das Monopeptid dominieren würde. Bei höheren Molverhältnissen wird die Natur der Produkte in ähnlicher Weise variieren. Es ist allgemein möglich, die Monopeptide und höheren Peptide unter Verwendung bekannter Chromatographietechniken aufzutrennen. Jedoch sind solche Trennungen nicht notwendig, da die gemischten Peptide gewöhnlich in ihrer Endverwendung den getrennten Produkten vergleichbar sind. Somit können Mischungen vom Mono-, Di- und Tripeptid des selben Tetrapyrrols verwendet werden.
Gewöhnlich wird nichtumgesetztes Tetrapyrrol von den Peptidprodukten der Erfindung während der Reinigung abgetrennt, beispielsweise durch chromatographische Techniken.

Photodiagonose und Phototherapie

Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind zur Photodiagnose und Phototherapie von Tumoren, Krebs und malignen Geweben (im folgenden als "Tumor" bezeichnet) verwendbar.
Wenn ein Mensch oder ein Tier, die einen Tumor haben, mit Dosen einer Verbindung der vorliegenden Erfindung behandelt wird und wenn geeignete Lichtstrahlen oder elektromagnetische Wellen appliziert werden, emittiert die Verbindung Licht, d. h. Fluoreszenz. Dadurch kann die Existenz, Position und Größe des Tumoren detektiert werden, d. h. Photodiagnose.
Wenn der Tumor mit Licht einer geeigneten Wellenlänge und Intensität bestrahlt wird, wird die Verbindung aktiviert, so daß sie einen zellabtötenden Effekt auf den Tumor ausübt. Dies wird "Phototherapie" genannt.
Verbindungen, die zur Photodiagnose und Phototherapie gedacht sind, sollten idealerweise die folgenden Eigenschaften haben:
(a) nichttoxisch in normaler therapeutischer Dosierung, wenn und solange sie nicht durch Licht aktiviert werden;
(b) sie sollten selektiv photoaktiv sein;
(c) wenn Lichtstrahlen oder elektromagnetische Wellen appliziert werden, sollten sie eine charakteristische und detektierbare Fluoreszenz emittieren;
(d) wenn sie mit Lichtstrahlen bestrahlt werden oder elektromagnetische Wellen appliziert werden, werden sie in einem Ausmaß aktiviert, daß sie einen zellabtötenden Effekt auf Tumoren ausüben; und
(e) sie sollten nach der Behandlung leicht metabolisiert oder ausgeschieden werden.
Nach den Testergebnissen bis dato haben die Verbindungen der vorliegenden neuen therapeutischen Zusammensetzungen die vorhergehenden Eigenschaften und sind auch durch eine vernünftige Löslichkeit in Wasser bei physiologischem pH gekennzeichnet.
Die zuvor erwähnten Verbindungen zeigen eine größere Fluoreszenz in Tumoren als die entsprechenden Grundtetrapyrrole, und selbst Peptide, die mit Aminomonocarbonsäuren, d. h. Alanin- und &epsi;- Aminocapronsäure gebildet wurden. Ihre Verwendung stellt den besten Kontrast bei Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe um den Tumor herum zur Verfügung. Die vorliegenden Verbindungen adsorbieren Aktivierungsenergie für die Phototherapie im vorteilhaften Bereich von 600 bis 800 Nanometern, wobei die bevorzugten Verbindungen im Bereich von 620 bis 760 Nanometer absorbieren, d. h. Licht von längerer Wellenlänge, das das Eindringen von Energie in den Tumor zu phototherapeutischen Zwecken einfacher zuläßt.
Nach vorliegenden Erfahrungen können sich die vorliegenden Verbindungen über den Tumor gleichmäßiger verteilen als die Grundtetrapyrrole, was die Verwendung beträchtlich niedrigerer Dosierungen gestattet (bis etwa 1/10 der erforderlichen Normaldosierung des Grundtetrapyrrols), was die Photosensibilisierung im Wirt verringert, wenn nicht gar ausschaltet. Sie besitzen auch eine konsistentere Fluoreszenz, wohingegen einige der entsprechenden Tetrapyrrole eine ungleichmäßige Fluoreszenz zeigen oder die Fluoreszenz von Tag zu Tag im Wirt variiert.
Eine besonders vorteilhafte Eigenschaft der vorliegenden Verbindungen beruht in der Leichtigkeit, mit der sie vom Wirt ausgeschieden werden. Im allgemeinen finden sich innerhalb von 48 bis 72 Stunden nach intravenöser oder intraperitonealer Verabreichung geringe oder nicht detektierbare Mengen im normalen Muskelgewebe. Die vorliegenden Verbindungen, die mit ihrem intakten Chromophoren ausgeschieden werden, werden aus dem Stuhlgang des Wirts innerhalb von 48 bis 72 Stunden nach Injektion wiedergewonnen. Unter gleichen Umständen verbleiben wesentliche Mengen der entsprechenden Tetrapyrrole im Vergleich zu nur geringen Mengen an Peptiden, die mit den Aminomonocarbonsäuren gebildet wurden, im Wirt, d. h. bis zu 20%. Diese Eigenschaft ist äußert wichtig dadurch, daß sie zur Minimierung der Photosensibilisierung des Wirts beiträgt.
Die vorliegende Zusammensetzung kann zur Diagnose und therapeutischen Behandlung eines breiten Bereichs von Tumoren verwendet werden. Beispiele von Tumoren sind Magenkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterkrebs, Speiseröhrenkrebs, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Rachenkrebs, Sarkome, Leberkrebs, Harnblasenkrebs, Oberkieferkrebs, Gallenkrebs, Zungenkrebs, Hirntumor, Hautkrebs, maligner Kropf, Prostatakrebs, Ohrspeicheldrüsenkrebs, Hodgkins Krankheit, multiples Myelom, Nierenkrebs, Leukämie und malignes Lymphocytom.
Zur Diagnose ist das einzige Erfordernis, daß der Tumor in der Lage ist, selektiv zu fluoreszieren, wenn er geeignetem Licht ausgesetzt wird. Zur Behandlung muß der Tumor für die Aktivierungsenergie durchdringbar sein. Zur Diagnose wird ein Licht von kürzerer Wellenlänge verwendet, während für therapeutische Zwecke Licht einer längeren Wellenlänge verwendet wird, um eine einfache Durchdringung des Tumorgewebes zu gestatten. So kann zur Diagnose Licht von 360 bis 760 Nanometern verwendet werden und zur Behandlung Licht von 620 bis 760 Nanometern, in Abhängigkeit der individuellen Charakteristika des Tetrapyrrols. Die Absorptionscharakteristika der vorliegenden neuen Verbindungen sind im wesentlichen dieselben wie die des Tetrapyrrols, von dem sie abgeleitet sind.
Notwendig ist, daß die Lichtstrahlen so intensiv sind, daß sie bewirken, daß die Verbindungen Fluoreszenz zur Diagnose emittieren und einen zellabtötenden Effekt für die Therapie ausüben.
Die Quelle für die Bestrahlung zur Photodiagnose und Phototherapie ist nicht beschränkt, jedoch ist der Laserstrahl bevorzugt, da intensive Lichtstrahlen in einem gewünschten Wellenlängenbereich selektiv appliziert werden können. Beispielsweise wird bei der Photodiagnose die Verbindung der Erfindung an einen menschlichen oder tierischen Körper verabreicht, und nach einer gewissen Zeit werden Lichtstrahlen auf den zu untersuchenden Teil gerichtet. Wenn ein Endoskop für den betroffenen Teil verwendet werden kann, wie für Lungen, Speiseröhre, Magen, Gebärmutter, Harnblase oder Rektum, wird unter Verwendung des Endoskops bestrahlt, und der Tumorteil emittiert selektiv die Fluoreszenz. Dieser Teil wird visuell beobachtet oder durch ein eingestelltes Fasersichtgerät, durch das Auge oder auf einem CRT-Bildschrim beobachtet.
Bei der Phototherapie wird nach der Verabreichung der Dosierung die Bestrahlung durch Laserstrahlen aus der Spitze von Quarzfasern durchgeführt. Neben der Bestrahlung der Oberfläche des Tumors kann der innere Teil des Tumors durch Einführen der Quarzfaserspitze in den Tumor bestrahlt werden. Die Bestrahlung kann mit dem Auge beobachtet oder auf einem CRT-Bildschirm abgebildet werden.
Zur Photodiagnose ist ein Licht mit Wellenlängen zwischen 360 und 760 Nanometern geeignet zur Aktivierung der vorliegenden Tetrapyrrolverbindungen. Natürlich hat jede Verbindung eine spezielle optimale Aktivierungswellenlänge. Eine Ultraviolett-Lampe mit langer Wellenlänge ist zur Photodiagnose besonders geeignet. Ähnliche Verfahren zur Sichtbarmachung des behandelten Tumors können verwendet werden, wie sie bereits für die Phototherapie beschrieben wurden.
Die Dosierungen von Verbindungen, die die vorliegende neue Zusammensetzung enthalten, werden in Abhängigkeit vom gewünschten Effekt, ob für Diagnose oder für Therapie, variieren. Zur Diagnose werden geringe Dosen wie etwa von 1 mg/kg wirksam sein und bis zu 20 mg/kg können verwendet werden. Zur Behandlung wird die Dosis gewöhnlich etwa 0,5 mg/kg erreichen. Natürlich kann die Dosis sowohl für Diagnose wie für Therapie im Hinblick auf die vorgenannten vorteilhaften Eigenschaften der vorliegenden Verbindungen, beispielsweise der Leichtigkeit ihrer Ausscheidung durch den Wirt, für einen variiert werden.
Die vorliegenden Verbindungen sind anscheinend bei den Dosierungsspiegeln, die für Diagnose oder Behandlung eingesetzt werden, nicht toxisch. Keine Mortalität von Testtieren aufgrund der vorliegenden Verbindungen wurde in Untersuchungen, die Dosierungsspiegel bis zu 20 mg/kg einsetzten, festgestellt.
Sowohl zur Diagnose wie zur Therapie können die vorliegenden Verbindungen auf oralem, intravenösem oder intramuskulärem Weg verabreicht werden. Sie können können als lyophilisierte sterile, pyrogenfreie Verbindungen, vorzugsweise in Form von basischen Salzen, z. B. Natriumsalzen, formuliert werden. Die bevorzugten Dosierungsformen werden als injizierbare Lösungen (isotonisch) zur Verfügung gestellt.
Die zur Behandlung von Tumoren, die Verbindungen dieser Erfindung enthalten, verwendete Bestrahlungsquelle ist ein gefilterter Hochintensitäts-, kontinuierlicher oder Farbstoffpump- oder ein anderer Laser und Lichtquellensystem, das in der Lage ist, die folgenden Leistungsgrenzen zu erfüllen: Leistungsintensität 20 bis 500 mW/cm² bei Wellenlängen zwischen 620 und 760 Nanometern und einem Gesamtoutput von mindestens 500 mW oder mehr. Verschiedene gegenwärtig im Handel erhältliche Laser erfüllen diese Kriterien.
Die Tetrapyrrole können durch verschiedene Syntheseverfahren hergestellt werden, die in der Literatur gefunden werden können, z. B.

Pheophorbide:

Willstätter, R., Stoll, A.; Investigations on Chlorophyll, (Transl. Schertz, FM.M., Merz, A.R.) Seite 249. Science Printing Press, Lancaster, Pennsylvania, 1928.
Pennington, F.C., Strain, H.H., Svec, W.A., Katz, J.J.; J. Amer. Chem. Soc., 86, 1418 (1964).
Chlorin e&sub6;:
Willstätter, R., Stoll, A.; Investigations on Chlorophyll, (Trans. Schertz, F.M., Merz, A.R.) Seite 176. Science Printing Press, Lancaster, Pennsylvania, 1928.
Willstätter, R., Isler, M.; Ann. Chem., 390, 269 (1912).
Fischer, H., Bäumler, R.; Ann. Chem., 474, 65 (1929).
Fischer, H., Siebel, H.,; Anh. Chem., 499, 84 (1932).
Conant, J.B., Mayer, W.W.; J. Amer. Chem. Soc., 52, 3013 (1930).
Chlorin C&sub4;:
Fischer, H., Heckmaier, J., Plotz, E.; Justus Liebigs Ann. Chem., 500 215 (1933)
Chlorin e&sub6;, e&sub4;&sub1; Isochlorin e&sub4;, Mesochlorin e&sub6;, Bacteriopheophorbid, Bacteriochlorin e&sub6;:
Fischer and Orth, "Die Chemie der Pyrrole" Akademische Verlagsgesellschaft, Leipzig, 1940, Vol. II, Teil 2.

Allgemeine Referenz für Porphyrine

"Porphyrins and Metalloporphyrins", Herausgeber Kevin M. Smith, Elsevier 1975, New York.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können an den Wirt in einer Reihe von Formen verabreicht werden, die an den gewählten Verabreichungsweg angepaßt sind, d. h. auf oralem, intravenösem, intramuskulärem oder subkutanem Weg.
Die aktive Verbindung kann oral, beispielsweise mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem angepaßten eßbaren Träger verabreicht werden, oder sie kann in hart- oder weichschalige Gelatinekapseln eingeschlossen werden, oder sie kann zu Tabletten gepreßt werden, oder sie kann direkt der Nahrung einer Diät zugesetzt werden. Zur oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung in Träger incorporiert werden und in Form von verdaubaren Tabletten, Kautabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Oblaten und dergleichen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Präparate sollten mindestens 0,1% aktive Verbindung enthalten. Der Prozentsatz der Zusammensetzungen und Präparate kann natürlich variieren und kann vorteilhaft zwischen etwa 2 bis etwa 60 Gew.% der Einheit liegen. Die Menge an aktiver Verbindung in solchen therapeutisch verwendbaren Zusammensetzungen ist so, daß eine geeignete Dosierung erhalten wird. Bevorzugte Zusammensetzungen oder Präparate gemäß der vorliegenden Erfindung werden so hergestellt, daß eine orale Dosierungseinheitenform zwischen 50 und 300 mg aktive Verbindung enthält.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dergleichen können auch folgendes enthalten: Ein Bindemittel wie Tragacanth, Akaziengummi, Maisstärke oder Gelatine; Corrigentia, wie Dicalciumphosphat; Desintegrierungsmittel, wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Algininsäure und dergleichen; Gleitmittel, wie Magnesiumstearat; und ein Süßungsmittel, wie Sucrose, Lactose oder Saccharin, kann zugesetzt werden oder ein Aromastoff wie Pfefferminz, Wintergrün oder Kirscharoma. Wenn die Dosierungsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu den obigen Stoffen einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Stoffe können als Überzüge oder zur anderweitigen Modifikation der physikalischen Form der Dosierungseinheit vorliegen. Beispielsweise können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beidem überzogen sein. Ein Sirup oder Elixier kann die aktive Verbindung, Sucrose als Süßungsmittel, Methyl- und Propylparabene als Koservierungsstoffe, einen Farbstoff und Aromastoffe wie Kirsch- oder Orangenaroma enthalten. Natürlich sollte jedes Material, das zur Herstellung einer Dosierungseinheit verwendet wird, pharmazeutisch rein und im wesentlichen in den eingesetzten Mengen nicht toxisch sein. Darüber hinaus kann die aktive Verbindung in Retardpräparate und Formulierungen eingebracht werden.
Die aktive Verbindung kann auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Lösungen der aktiven Verbindung als freie Base oder pharmakologisch zulässiges Salz können in Wasser, geeignet gemischt mit einem Tensid wie Hydroxypropylcellulose, hergestellt werden. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen und deren Mischungen und in Ölen hergestellt werden. Unter normalen Speicher- und Verwendungsbedingungen enthalten diese Präparate einen Konservierungsstoff, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die zur Injektionsverwendung geeigneten pharmazeutischen Formen schließen sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur sofortigen Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein. In allen Fällen muß die Form steril und flüssig in einem solchen Ausmaß sein, daß sie leicht gespritzt werden kann. Sie muß unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Schimmelpilzen, konserviert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen), geeignete Mischungen davon und pflanzliche Öle enthält. Die geeignete Fluidität kann beispielsweise durch Verwendung eines Überzugs wie Lecithin, durch das Einhalten der erforderlichen Partikelgröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden erhalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und Antipilzmittel bewirkt werden, beispielsweise Parabene, Chlorobutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen wird es vorteilhaft sein, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid, einzuschließen. Die verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Mitteln, die die Absorption verzögern, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine, in den Zusammensetzungen erreicht werden.
Sterile injizierbare Lösungen werden durch Einbringen der aktiven Verbindung in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel zusammen mit verschiedenen anderen Bestandteilen, wie oben aufgezahlt, je nach Bedarf, hergestellt, gefolgt von Sterilfiltration. Im allgemeinen werden Dispersionen hergestellt durch Einbringen der verschiedenen sterilisierten aktiven Bestandteile in ein steriles Vehikel, das das Grunddispersionsmedium und die erforderlichen anderen Inhaltsstoffe aus denen, die oben aufgezählt wurden, enthält. Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung von steril injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknung und die Gefriertrocknungstechnik, die ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffs plus beliebiger zusätzlich gewünschter Bestandteile aus deren zuvor steril gefilterten Lösungen ergeben.
Die vorliegenden neuen Verbindungen können auch direkt an Tumoren, ob intern oder extern, beim Wirt in topischen Zusammensetzungen appliziert werden. Beispielhafte Zusammensetzungen schließen Lösungen der neuen Verbindungen in Lösungsmitteln, insbesondere wäßrigen Lösungsmitteln, besonders bevorzugt Wasser, ein. Alternativ können zur topischen Applikation insbesondere bei Hauttumoren die vorliegenden neuen Verbindungen in den gewöhnlichen Creme- oder Salbenformulierungen, die gewöhnlich für diesen Zweck verwendet werden, dispergiert werden oder können in Form von Sprühlösungen oder Suspensionen zur Verfügung gestellt werden, welche ein Treibmittel, das gewöhnlich bei Aerosolpräparaten eingesetzt wird, einschließen kann.
Wie hierin verwendet, schließt "pharmazeutisch zulässiger Träger" beliebige und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle und fungicide Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen ein. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf diesem Gebiet wohlbekannt. Ausgenommen insoweit, daß ein beliebiges herkömmliches Medium oder Mittel mit dem aktiven Inhaltsstoff inkompatibel ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen erwogen. Ergänzende aktive Inhaltsstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen mit hineingenommen werden.
Es ist besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in Dosierungseinheitenform aufgrund der Leichtigkeit der Verabreichung und Gleichmäßigkeit der Dosierung zu formulieren. Die Dosierungseinheitenform, wie hierin verwendet, bedeutet physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosierungen für die zu behandelnden Säugetiere geeignet sind; jede Einheit enthält eine bestimmte Menge aktives Material, berechnet zur Bewirkung des gewünschten therapeutischen Effekts in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger. Die Spezifikation für die neuen Dosierungseinheitenformen der Erfindung werden diktiert von und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen Charakteristika des aktiven Stoffes und des besonderen zu erzielenden therapeutischen Effekts und (b) den Begrenzungen, die der Kunst des Compoundierens eines solchen aktiven Materials zur Behandlung von Tumoren bei lebenden Patienten inhärent sind.

Beispiel 1

Di-(D,L)aspartyltransmesochlorin IX (Carbodiimid-Methode)

140 mg Transmesochlorin und 200 mg (D,L)- Asparaginsäuredimethylesterhydrochlorid wurden in 30ml Dimethylformamid gelöst. 300 mg N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid wurden zugegeben. Die Reaktion wurde 1 h stehen gelassen, dann wurden weitere 300 mg Carbodiimid zugegeben. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt und dann wurde die Reaktionsmischung über Nacht stehen gelassen. Die Reaktion kann durch Dünnschichtchromatographie auf Silica verfolgt werden, wobei als Lösungsmittel Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure 8,5/1,5/0,13 V/V/V verwendet wird.
Das disubstituierte Chlorin hat den höchsten Rf Wert, das unsubstituierte Chlorin hat den niedrigsten Wert und die monosubstituierten Isomere liegen dazwischen und werden nicht aufgelöst.
Nach Stehenlassen über Nacht schien die Reaktionsmischung mindestens 50% disubstituiertes Chlorin zu enthalten. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der verbleibende Feststoff in 50 ml 3N HCl gelöst.
Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 48 h zur Hydrolyse der Estergruppen stehen gelassen, dann wurde die Chlorinmischung bei pH 2,5 bis 3 ausgefällt und gesammelt und mit Wasser in der Zentrifuge gewaschen.
Die Chlorinmischung wurde durch Auflösung in 0,05M NH&sub4;OH und Aufbringen auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 2,5 cm · 30 cm gereinigt. Das Eluierungsverfahren ist ein linearer Gradient von 40 bis 70% Methanol in 0,01M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen).
Die führende grüne Bande (Di-D,L-aspartyltransmesochlorin IX) wurde gesammelt und zur Entfernung des Methylalkohols flash-verdampft, die Lösung wurde dann bei pH 2,5-3 ausgefällt und gesammelt und dreimal in der Zentrifuge mit verdünnter Essigsäure gewaschen. Das Produkt wurde im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute war 67 mg Di- (D,L)aspartyltransmesochlorin IX.

Beispiel 2

Di- und Mono-(L)glutamyltransmesochlorin IX (gemischte Anhydridmethode)

50 mg (0,000087 Mol) Transmesochlorin IX wurden in 100 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. 210 ul (0,002 Mol) Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 195 ul (0,00179 Mol) Ethylchloroformiat zugegeben. Nach 10minütigem Rühren wurden 50 ml (0,01 Mol) 0,2 M KOH, enthaltend 250 mg (0,00169 Mol) (L)- Glutaminsäure unter Rühren zur THF-Lösung zugetropft. Diese Mischung wurde 60 min bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung wurde durch Silica-DC nach Produkten überprüft. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach dem Prüfen auf Produkt wurde die Lösung auf pH 7,5 bis 8,0 eingestellt und auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 80% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer bei pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Der Säulendurchfluß wurde mit einem Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurden je nach den individuellen Komponenten vereinigt. Die Eluierungsreihenfolge war Di- (L)glutamyltransmesochlorin IX, Mono-(L)glutamyltransmesochlorin IX und unsubstituiertes Transmesochlorin IX.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Das Präzipitat wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet.

Beispiel 3

Di- und Mono-(D,L)aspartylphotoprotoporphyrin IX (gemischte Anhydridmethode)

313,4 mg Photoprotoporphyrin IX (Isomerenmischung) wurden in 100 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. 210 ul Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 210 ul Ethylchloroformiat zugegeben. Nach 10 min Rühren wurden 50 ml einer 0,2 M KOH, enthaltend 450 mg (D,L)-Asparaginsäure, zur THF-Lösung zugegeben. Diese Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung durch Silica-DC überprüft. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (5,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Prüfung auf Produkt wurde der pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt und die Lösung auf eine Reversphasen(C-18 Silica)- Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40/80% MeOH in 0,01 M KPO&sub4; Puffer bei pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und der Gläscheninhalt wurde nach individuellen Bestandteilen vereinigt.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 3,0 bis 3,5 ausgefällt. Das Präzipitat wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an Mono-(D,L)aspartylphotoprotoporphyrin IX betrug 54 mg. Die Ausbeute von Di-(D,L)aspartylphotoprotoporphyrin IX betrug 227,8 mg.

Beispiel 4

Di- und Mono-(L)aspartylprotoporphyrin IX (gemischte Anhydridmethode)

100 mg Protoporhyrin IX wurden in 100 ml p-Dioxan gelöst. 210 ul Triethylamin wurden zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 50 ul 0,2 M KOH, enthaltend 500 mg (L) Asparaginsäure zur Dioxanlösung zugegeben. Diese Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung wurde durch Silica-DC nach Produkten untersucht. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Überprüfen auf Produkt wurde der pH der Lösung auf pH 7,5 bis 8,0 eingestellt und die Lösung auf eine Reversphasen(C-18 Silica)- Säule 2,5 · 30 cm gegeben und die Reaktionsmischung unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 70% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und der Gehalt der Gläschen wurde nach den individuellen Komponenten vereinigt.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde dann unter Vakuum getrocknet. Die Ausbeute von Mono-(L)aspartylprotoporphyrin IX betrug 12,3 mg und die von Di-(L)aspartylprotoporphyrin IX betrug 54 mg.

Beispiel 5

Di- und Mono-(L)aspartylmesoporphyrin IX (gemischte Anhydridmethode)

200 mg Mesoporphyrin IX wurden in 100 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. 210 ul Triethylamin wurden zur THF-Lösung zugegeben. Nach 10 min Rühren wurden 210 ul Ethylchloroformiat zugegeben und 10 min gerührt. 50 ml 0,2 M KOH, enthaltend 500 mg (L)-Asparaginsäure, wurden zur THF-Lösung zugegeben und 1 h bei Raumtemperatur rühren gelassen.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung wurde nach Produkten durch Silica-DC unter Verwendung von Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) zur Entwicklung des Chromatogramms untersucht.
Nach Prüfung auf Produkt wurde der pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt und die Mischung auf eine Reversphasen(C-18 Silica)- Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 80% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurde gemäß den individuellen Bestandteilen vereinigt.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 3,0 bis 3,5 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in H&sub2;O gewaschen. Das Produkt wurde im Vakuum getrocknet, was eine Ausbeute von 41,5 mg Mono-(L)aspartylmesoporphyrin und 175,1 mg Di- (L)aspartylmesoporphyrin ergab.

Beispiel 6

Di- und Mono-(L)aspartyldeuteroporphyrin IX (gemischte Anhydridmethode)

100 mg Deuteroporphyrin IX wurden in 50 ml p-Dioxan gelöst. 210 ul Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 210 ul Isobutylchloroformiat zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 50 ml 0,2 M KOH, enthaltend 500 mg L-Asparaginsäure, zur Dioxanlösung zugegeben. Diese Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung wurde durch Silica-DC untersucht. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Prüfung auf Produkt wurde der pH der Mischung eingestellt auf 7,5 bis 8 und die Mischung auf eine Reversphasen(C-18 Silica)- Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 70% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurden je nach den individuellen Komponenten vereinigt.
Das MeOH wurde abgezogen und das Material wurde bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde dann im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute von Mono-(L)aspartyldeuteroporphyrin IX betrug 10 mg.

Beispiel 7

(L)-Aspartylpyropheophorbid a (gemischte Anhydridmethode)

80 mg Pyropheophorbid a wurden in 100 ml Tetrahydrofuran (THF) aufgelöst. 210 ul Triethylamin wurden zur THF-Lösung zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 210 ul Ethylchloroformiat zugegeben und 10 min gerührt. 50 ml 0,2 M KOH, enthaltend 500 mg (L)-Asparaginsäure wurden zur THF-Lösung zugegeben und 1 h bei Raumtemperatur rühren gelassen.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen, und die Reaktionsmischung wurde durch Silica-DC untersucht. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Überprüfen auf Produkt wurde der pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt und die Mischung auf eine Reversphasen(C-18 Silica)- Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 80% Methanol in 0,01 M KOH Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurden je nach den individuellen Komponenten vereinigt.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 3,0 bis 3,5 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet, was eine Ausbeute von 62 mg (L)-Aspartylpyropheophorbid a ergab.

Beispiel 8

Tetra-, Tri- und Di-(D,L)aspartylkoproporphyrin III (gemischtes Anhydridverfahren)

150 mg Koproporphyrin III wurden in 100 ml Tetrahydrofuran (TMF) aufgelöst. 210 ul Triethylamin wurden zugegeben und das Rühren bei 20ºC 10 min fortgesetzt. 210 ul Ethylchloroformiat wurde als nächstes zugegeben und 10 min gerührt.
50 ml 0,2 M KOH, enthaltend 250 mg (D,L)-Asparaginsäure, wurden zur THF-Lösung zugegeben. Diese Mischung wurde dann 1 h gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung wurde durch Silica-DC unter Verwendung des folgenden Lösungsmittelsystems überprüft: Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/4,0/0,2)
Der pH dieser Mischung wurde dann auf 7,5 bis 8,0 eingestellt und die Mischung auf einer Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 2,5 · 30 cm chromatographiert. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung von 5 bis 50% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurden nach den individuellen Komponenten vereinigt. Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 3,0 bis 3,5 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Die Produkte wurden unter Vakuum getrocknet und die Ausbeuten waren wie folgt: Tetra-(D,L)aspartylkoproporphyrin III 94 mg, Tri-(D,L)aspartylkoproporphyrin III 77,2 mg, Di- (D,L)aspartylkoproporphyrin III 28,4 mg.

Beispiel 9

Di- und Mono-(D,L)aspartyldeuteroporphyrin IX (gemischtes Anhydridverfahren)

175 mg (0,00195 Mol) Deuteroporphyrin IX wurden in 200 ml Tetrahydrofuran (THF) aufgelöst. 210 ul (0,002 Mol) Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 210 ul (0,0019 Mol) Ethylchloroformiat zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 50 ml (0,01 Mol) 0,2 M KOH, enthaltend 200 mg (0,003 Mol) (D,L)- Asparaginsäure, unter Rühren zur THF-Lösung zugetropft. Diese Mischung wurde 60 min bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen, und die Reaktionsmischung durch Silica-DC nach Produkt untersucht. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Prüfung auf Produkt wurde die Lösung auf pH 7,5 bis 8,0 eingestellt und auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 65% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurden nach den individuellen Komponenten vereinigt. Die Reihenfolge der Eluierung war Di- (D,L)aspartyldeuteroporphyrin IX, Mono-(D,L)aspartyldeuteroporphyrin IX und unsubstituiertes Deuteroporphyrin IX.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet.

Beispiel 10

Di- und Mono-(D,L)aspartylhämatoporphyrin IX (gemischtes Anhydridverfahren)

400 mg (0,0059 Mol) Hämatoporphyrin IX wurden in 50 ml Tetrahydrofuran (THF) aufgelöst. 360 ul (0,0034 Mol) Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 340 ul (0,0031 Mol) Ethylchloroformiat zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 10 ml (0,01 Mol) 1M KOH, enthaltend 600 mg (0,0045 Mol) (D,L)-Asparaginsäure, zur THF-Lösung zugegeben. Diese Mischung wurde 90 min bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung durch Silica-DC nach Produkt untersucht. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Prüfung auf Produkt wurde die Lösung auf pH 7,5 bis 8,0 eingestellt und auf einer Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 20 bis 70% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurden nach den individuellen Komponenten vereinigt. Die Reihenfolge der Eluierung war Di- (D,L)aspartylhämatoporphyrin IX, Mono-(D,L)aspartylhämatoporphyrin IX und unsubstituiertes Hämatoporphyrin IX.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde im Vakuum getrocknet.

Beispiel 11

Di- und Mono-(D,L)aspartylprotoporphyrin IX (gemischtes Anhydridverfahren)

300 mg (0,00053 Mol) Protoporphyrin IX wurden in 100 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. 210 ul (0,002 Mol)Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 210 ul (0,0019 Mol) Ethylchloroformiat zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 50 ml (0,01 Mol) 0,2 M KOH, enthaltend 450 mg (0,0033 Mol) (D,L)- Asparaginsäure, unter Rühren zur THF-Lösung zugetropft. Diese Mischung wurde 60 min bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen, und die Reaktionsmischung wurde durch Silica-DC auf Produkt überprüft. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Überprüfen auf Produkt wurde die Lösung auf pH 7,5 bis 8,0 eingestellt und auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 65% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen je nach den individuellen Komponenten vereinigt. Die Reihenfolge der Eluierung war Di- (D,L)aspartylprotoporphyrin IX, Mono-(D,L)aspartylprotoporphyrin IX und unsubstituiertes Protoporphyrin IX.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde im Vakuum getrocknet.

Beispiel 12

Mono-(D,L)aspartylpyropheophorbid a (gemischte Anhydridmethode)

100 mg (0,000187 Mol) Pyropheophorbid a wurden in 100 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. 210 ul (0,002 Mol)Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 210 ul (0,0019 Mol) Ethylchloroformiat zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 50 ml (0,01 Mol) 0,2 M KOH, enthaltend 200 mg (0,0015 Mol) (D,L)- Asparaginsäure zur THF-Lösung zugegeben. Diese Mischung wurde 60 min bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung wurde durch Silica-DC nach Produkt überprüft. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Überprüfen auf Produkt wurde die Lösung auf pH 7,5 bis 8,0 eingestellt und auf einer Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 80% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurden nach je den individuellen Komponenten vereinigt. Die Reihenfolge der Eluierung war Mono- (D,L)aspartylpyropheophorbid a und dann unsubstituiertes Pyropheophorbid.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde im Vakuum getrocknet.

Beispiel 13

Di- und Mono-L-(L-aminoadipyltransmesochlorin IX (gemischte Anhydridmethode)

500 mg (0,000087 Mol) Transmesochlorin IX wurden in 100 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. 210 ul (0,002 Mol) Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 210 ul (0,0019 Mol) Ethylchloroformiat zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 50 ml (0,01 Mol) 0,2 M KOH, enthaltend 250 mg (0,00155 Mol) L-Cx- Aminoadipinsäure, unter Rühren zur THF-Lösung zugetropft. Diese Mischung wurde 60 min bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung durch Silica-DC nach Produkt überprüft. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Prüfen auf Produkt wurde die Lösung auf pH 7,5 bis 8,0 eingestellt und auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 80% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer PH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen je nach den individuellen Komponenten vereinigt. Die Reihenfolge der Eluierung war Di-L-αaminoadipyltransmesochlorin IX und unsubstituiertes Transmesochlorin IX.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde im Vakuum getrocknet.

Beispiel 14

Di- und Mono-(D)aspartylmesoporphyrin IX (gemischtes Anhydridverfahren)

200 mg (0,00035 Mol) Mesoporphyrin IX wurden in 100 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. 210 ul (0,002 Mol) Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 210 ul (0,0019 Mol) Ethylchloroformiat zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 50 ml (0,01 Mol) 0,2 M KOH, enthaltend 500 mg (0,0038 Mol) (D)- Asparaginsäure, unter Rühren zur THF-Lösung zugetropft. Diese Mischung wurde 60 min bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abdestilliert und die Reaktionsmischung durch Silica-DC auf Produkt geprüft. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Prüfen auf Produkt wurde die Lösung auf pH 7,5 bis 8,0 eingestellt und auf eine Reversphasen(C-18 Silica) -Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 48% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurden je nach den individuellen Komponenten vereinigt. Die Reihenfolge der Eluierung war (D)-Aspartylmesoporphyrin IX, Mono-(D)aspartylmesoporphyrin IX und unsubstituiertes Mesoporphyrin IX.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde im Vakuum getrocknet.

Beispiel 15

Di- und Mono-(L)glutamylmesoporphyrin IX (gemischtes Anhydridverfahren)

400 mg (0,007 Mol) Mesoporphyrin IX wurden in 50 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. 360 ul (0,0035 Mol) Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 340 ul (0,0031 Mol) Ethylchloroformiat zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 10 ml (0,01 Mol) 1 M KOH, enthaltend 543 mg (0,00369 Mol) (L)-Glutaminsäure zur THF-Lösung zugegeben. Diese Mischung wurde 60 min bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung durch Silica-DC auf Produkt geprüft. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Prüfen auf Produkt wurde die Lösung auf pH 7,5 bis 8,0 eingestellt und auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten aus 25 bis 60%igem Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer PH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurden je nach den individuellen Komponenten vereinigt. Die Reihenfolge der Eluierung war Di- (L)glutamylmesoporphyrin IX, Mono-(L)glutamylmesoporphyrin IX und unsubstituiertes Mesoporphyrin IX.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet.

Beispiel 16

Di- und Mono-(D)aspartyltransmesochlorin IX (gemischtes Anhydridverfahren in 1,4 Dioxan)

50 mg (0,000087 Mol) Transmesochlorin IX wurden in 50 ml 1,4 Dioxan gelöst. 210 ul (0,002 Mol) Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 210 ul (0,0019 Mol) Ethylchloroformiat zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 50 ml (0,01 Mol) 0,2 M KOH, enthaltend 500 mg (0,0038 Mol) (D)-Asparaginsäure unter Rühren zur THF-Lösung zugetropft. Diese Mischung wurde 60 min bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung durch Silica-DC auf Produkt überprüft. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Prüfung auf Produkt wurde die Lösung auf pH 7,5 bis 8,0 eingestellt und auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 2,5 · 30 cm aufgebracht. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 80% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurden je nach den individuellen Komponenten vereinigt. Die Reihenfolge der Eluierung war Di- (D)aspartyltransmesochlorin IX, Mono-(D)aspartyltransmesochlorin IX und unsubstituiertes Transmesochlorin IX.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet.

Beispiel 17

Di- und Mono-(L)-aspartyltransmesochlorin IX (gemischtes Anhydridverfahren in Tetrahydrofuran)

135 mg (0,00023 Mol) Transmesochlorin IX wurden in 100 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. 210 ul (0,002 Mol) Triethylamin wurden unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurden 210 ul (0,0019 Mol) Ethylchloroformiat zugegeben. Nach 10min Rühren wurden 50 ml (0,015 Mol) 0,3 M KOH, enthaltend 750 mg (0,0056 Mol) (L)- Asparaginsäure, unter Rühren zur THF-Lösung zugetropft. Diese Mischung wurde 60 min bei Raumtemperatur gerührt.
Das organische Lösungsmittel wurde abgezogen und die Reaktionsmischung durch Silica-DC auf Produkt untersucht. Benzol/Methanol/88%ige Ameisensäure (8,5/1,5/0,13) wurde zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet.
Nach Prüfung auf Produkt wurde die Lösung auf pH 7,5 bis 8,0 eingestellt und auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 2,5 · 30 cm aufgegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 80% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 (1 l Gesamtvolumen) aufgetrennt.
Das Säuleneluat wurde durch einen Fraktionensammler gesammelt und die Inhalte der Gläschen wurden je nach den individuellen Komponenten vereinigt. Die Reihenfolge der Eluierung war Di- (L)aspartyltransmesochlorin IX, Mono-(L)aspartyltransmesochlorin IX und unsubstituiertes Transmesochlorin IX.
Das Methanol wurde abgezogen und das Material bei pH 2,5 bis 3,0 ausgefällt. Der Niederschlag wurde 3mal mit verdünnter Essigsäure in Wasser gewaschen. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet.

Beispiel 18

(D,L)-Aspartylpheophorbid a (Carbodiimidverfahren)

55 mg Pheophorbid a wurden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. 50 mg (D,L)-Asparaginsäuredimethylesterdihydrochlorid wurden zugegeben und dann wurden 100 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Reaktion wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 1 h stehen gelassen, dann wurden weitere 50 mg Carbodiimid zugegeben. Nach Stehen während einer weiteren Stunde wurden weitere 50 mg Carbodiimid zugegeben und die Reaktion im Dunkeln 12 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und das Produkt in 50 ml 1% KOH in Methanol mit 0,5 ml H&sub2;O gelöst und im Dunkeln bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Verlauf der Hydrolyse wird durch Dünnschichtchromatographie verfolgt (C-18 Platten mit Lösungsmittel 75/25 MeOH/0,01 M KPO&sub4;Puffer, pH 6,85).
Wenn die Hydrolyse der Estergruppen im wesentlichen vollständig ist, wird die Reaktion durch Zugabe einiger Tropfen Eisessig abgebrochen. Das Methanol wird im Vakuum entfernt und das Produkt in 20 ml 0,1 M NH&sub4;OH gelöst. Diese Lösung wird auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule (1,5 · 30 cm) aufgebracht. Das Eluierungsverfahren war ein linearer Gradient von 50 bis 80% Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer, pH 6,85 (500 ml Gesamtvolumen).
Die führende grüngraue Bande enthielt das (D,L)- Aspartylpheophorbid a, welches gesammelt, flashverdampft zur Entfernung von Methylalkohol und bei pH 3 ausgefällt wurde. Der Niederschlag wurde gesammelt und 3mal in der Zentrifuge mit verdünnter Essigsäure gewaschen. Die Ausbeute an trockenem Produkt betrug 27 mg.

Beispiel 19

L-Monoaspartylchlorin e&sub6; (Carbodiimidverfahren)

150 mg Chlorin e&sub6; und 250 mg L-Asparaginsäure-di-tertbutylesterhydrochlorid wurden in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Es wurden insgesamt 3-100 mg Zugaben von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in einstündigen Abständen vorgenommen. Nach 4 h wurde die Reaktionsmischung mit 300 ml Ether verdünnt, 2mal mit 200 ml Wasser gewaschen und dann mit 40 ml 1 M KOH extrahiert. Die KOH-Lösung ließ man über Nacht hydrolysieren, dann erwärmte man 10 min auf 70ºC.
Der pH der Lösung wurde auf 7 eingestellt, dann wurde verbliebener Ether durch Flashverdampfung entfernt. Die Lösung wurde dann auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 1,5 · 30 cm aufgebracht. Das Produkt wurde durch schrittweise Eluierung mit Methanol/0,01 M, pH 6,85, KPO&sub4; Puffer gereinigt. Es wurde mit 5% Methanol eluiert, bis unerwünschte polare Pigmente entfernt waren. Monoaspartylchlorin e&sub6; wurde mit 6 bis 8% Methanol eluiert und unumgesetztes Chlorin e&sub6; wurde mit 25% Methanol entfernt.
Das Produkt wurde bei pH 3 nach kurzer Flashverdampfung zur Entfernung von Methanol ausgefällt, dann in der Zentrifuge 3mal mit verdünnter Essigsäure gewaschen.
Das Produkt wurde im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute von L- Monoaspartylchlorin e&sub6; betrug 50 mg.

Beispiel 20

L-Glutamylchlorin e&sub4; (Carbodiimidverfahren)

110 mg Chlorin e&sub4; und 220 mg L-Glutaminsäuredimethylesterhydrochlorid wurden in 15 ml Dimethylformamid gelöst. 85 mg N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid wurden dann zugegeben und die Lösung 1 h bei Raumtemperatur gerührt. 42 weitere mg Carbodiimid wurden dann zugegeben, dann wurden 50 mg Carbodiimid in einstündigen Abständen weitere 2mal zugegeben. Diese Reaktionsmischung wurde dann 12 h stehen gelassen, eine weitere Zugabe von 50 mg Carbodiimid wurde gemacht und die Reaktion 3 h stehen gelassen. Der Reaktionsfortschritt wurde durch Reversphasen-Dünnschichtchromatographie 80% Methanol, 20% KPO&sub4; Puffer (0,01 M, pH 6,85) mitverfolgt. Eine weitere Zugabe von 50 mg Carbodiimid zeigte nach Stehenlassen keine weitere Produktbildung.
200 ml Ether wurden zur Reaktionsmischung zugegeben und die Etherlösung wurde 4mal mit Wasser, etwa 100 ml pro Wäsche, gewaschen. Der Ether wurde dann durch Flashverdampfung entfernt und das Produkt wurde in ungefähr 25 ml 3 N HCl gelöst. Nach 48 h bei Raumtemperatur wurde die Lösung auf pH 3 mit NH&sub4;OH eingestellt und der Niederschlag gesammelt und in der Zentrifuge gewaschen. Das Produkt wurde in 20% Methanol/Wasser mit ein wenig NH&sub4;OH gelöst und auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule 1,5 · 30 cm aufgebracht. Die Eluierung wurde mit 20% MeOH, KPO&sub4; Puffer (0,01M PH 6,85) fortgesetzt. Dies entfernte das Produkt (L-Glutamylchlorin e&sub4;). Die Methanolkonzentration wurde zur Entfernung des unumgesetzten Chlorin e&sub4; erhöht.
Die Lösung wurde flashverdampft, bis das Methanol im wesentlichen entfernt war, dann wurden die Produkte durch Zugabe von HCl auf pH 3 ausgefällt, gesammelt und in der Zentrifuge mit verdünnter Essigsäure gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die Ausbeute von Mono-L- glutamylchlorin e&sub4; betrug 21 mg. Die Ausbeute des wiedergewonnenen Chlorins e&sub4; betrug 59 mg.

Beispiel 21

L-Monoglutamylchlorin e&sub6; (Carbodiimidverfahren)

130 mg Chlorin e&sub6; und 260 mg L-Glutaminsäuredimethylesterhydrochlorid wurden in 18 ml Dimethylformamid gelöst. 100 mg N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung 1 h gerührt. 50 mg Carbodiimid wurden weiterhin zugegeben. Nach einer Stunde schien nach Reversphasen-DC die Reaktionsmischung 75% bis 80% monosubstituiertes Produkt (C-18 Platten mit 70% MeOH, 30% 0,01 M KPO&sub4;, pH 6,85) zu enthalten. 200 ml Diethylether wurden zugegeben, 2mal mit 100 ml H&sub2;O gewaschen, dann mit 30 ml 1 M KOH extrahiert.
Man ließ das Produkt dann im Dunkeln in der KOH-Lösung 12 h hydrolysieren, dann wurde es auf 70ºC 10 min erhitzt, um die Hydrolyse der Estergruppen zu vervollständigen. Das Produkt wurde dann durch Reversphasen-Säulenchromatographie (C-18 Reversphasen Silica 1,5 · 30 cm) abgetrennt, wobei schrittweise Gradienteneluierung mit Methanol in 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 verwendet wurde. 5% Methanol entfernte polare Verunreinigungen. Das Monoglutamylchlorin e&sub6; wurde mit 6 bis 8 % Methanol eluiert. Chlorin e&sub6; wurde von der Säule mit 25% Methanol eluiert. Das Methanol wurde durch Flashverdampfung entfernt und das L- Monoaspartylchlorin e&sub6; wurde bei pH 3 ausgefällt, gesammelt und 3mal in der Zentrifuge mit verdünnter Essigsäure gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Ausbeute 40 mg.

Beispiel 22

Mono- und Di-(L)aspartylchlorin e&sub6; (Carbodiimidverfahren)

400 mg Chlorin e&sub6; und 1 g L-Asparaginsäuredibenzylester-p-tosylat wurden in 75 ml Dimethylformamid gelöst. Die Temperatur der Lösung wurde bei 65 bis 70ºC unter Rühren gehalten und 100 mg N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. (Insgesamt 3 Zugaben wurden in zweistündigen Abständen vorgenommen). Die Lösung ließ man bei dieser Temperatur insgesamt 20 h rühren, dann wurde sie durch DC (Reversphasen) (C-18 Silica)-Platte überprüft, mit 70% Methanol, 30% 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85. Das DC zeigte mehr als 50% Monosubstitution und etwas Disubstitution.
150 ml Ether wurden zugegeben und mit 100 ml Wasser und mehreren Tropfen Eisessig gerührt. Die Etherphase wurde abgetrennt und die wäßrige Phase einige Male mit 100 ml Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden vereinigt und mit Wasser (100 ml) 4mal gewaschen, um Dimethylformamid zu entfernen.
Die Aspartylchlorin-e&sub6;-ester wurden dann in 100 ml 1 M KOH extrahiert (4 Extraktionen mit jeweils 25 ml). Die KOH-Lösung wurde bei Raumtemperatur 24 h zur Hydrolyse stehen gelassen. Die Komponenten wurden durch Neutralisieren der Lösung auf pH 7 und Aufbringen auf eine Reversphasen(C-18 Silica)-Säule (1,5 cm · 30 cm) getrennt. Die Eluierung wurde unter Verwendung eines 1 l Gradienten von 30% Methanol bis 80% Methanol mit 0,1 M KPO&sub4; Puffer PH 6,85 durchgeführt. Die Fraktionen wurden gesammelt und durch DC charakterisiert. Die Reihenfolge der Eluierung war Di-(L)-diaspartylchlorin e&sub6;, L- Monoaspartylchlorin e&sub6; und Chlorin e&sub6;. Methanol wurde durch Flashverdampfung entfernt und die individuellen Komponenten bei pH 3 unter Verwendung von HCl ausgefällt.
Die Produkte wurden durch Zentrifugation gesammelt, mehrere Male mit sehr verdünnter Essigsäure gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 23,8 mg.
Die physikalischen Charakteristika von repräsentativen Verbindungen (relative Polarität) werden durch ein Standardchromatographiesystem gemessen.
DC-Platte Baker Si-C18 20 um Partikelgröße 200 mm Überzugsdicke Lösungsmittelsystem : 75% Methanol/25% 0,01 M KPO&sub4; Puffer pH 6,85 Verbindung Derivat Mesoporphyrin Mesoporhyrin Transmesochlorin Hämatoporphyrin Chlorin Deuteroporphyrin mono (D, L)aspartyl mono (L) glutamyl
DC-Platte Baker Si-C18 20 um Partikelgröße 200 mm Überzugsdicke Lösungsmittelsystem : 75% Methanol/25% 0,01 M KPO&sub4; Puffer PH 6,85 Verbindung Derivat Protoporphyrin Photoprotoporphyrin (Isomerenmischung) Pyropheophorbid Mesoporphyrin Protoporphyrin Koproporphyrin mono (L) aspartyl di (L) glutamyl tetra (D,L) aspartyl
Die Absorptionsspektra von sichtbarem Licht in Pyridin für alle Aminodicarbonsäurederivate sind identisch zum Mutterporphyrin, - chlorin oder -bakteriochlorin. Vergleichende spektroskopische Absorptionsdaten Lösungsmittel in allen Fällen ist p-Dioxan Verbindungen Absorptionsmaxima (nm) im Bereich des sichtbaren Lichts mM Extinktionskoeffizient Soret-Bande Photoprotoporphyrin (Isomerenmischung) Pheophorbid Pyropheophorbid L-Aspartylpyropheophorbid Transmesochlorin Di-(L)aspartylmesochlorin Mono-(D)aspartylmesochlorin Hämatoporphyrin-Derivat Chlorin Mono-(L)aspartylchlorin Bacteriopheophorbid
Die Herstellungen von pharmakologischen Dosierungen zur Verabreichung des aktiven Inhaltsstoffs, d. h. der Aminosäure-Porphyrinaddukte, die in den vorhergehenden Beispielen 1 bis 22 hergestellt wurden, ist wie folgt:

Beispiel 23

Eine Tablettenbasis wurde hergestellt durch Vermischen der folgenden Bestandteile in den gezeigten Gewichtsteilen:
Gramm
Sucrose, USP 80,3
Tapiocastärke 13,2
Magnesiumstearat 4,4
In diese Basis wurden hinreichend Aminosäureporphyrin-Addukte eingemischt, um Tabletten mit jeweils 100 mg aktivem Bestandteil zur Verfügung zu stellen.

Beispiel 24

Eine Mischung, die die folgenden Bestandteile enthielt, wurde hergestellt:
Gramm
Calciumphosphat 17,6
Dicalciumphosphat 18,8
Magnesiumtrisilicat, USP 5,2
Lactose, USP 5,2
Kartoffelstärke 5,2
Magnesiumstearat A 0,8
Magnesiumstearat B 0,32
Porphyrinaminosäure-Addukte 20
Diese Mischung wurde verteilt und zu Kapseln mit jeweils 25 mg aktivem Bestandteil geformt.

Beispiel 25

Zu einem im Handel erhältlichen Zuckersirup mit Himbeeraroma wird ein Äquivalent von 40 mg des Aminosäureporphyrin-Addukts pro ml zugegeben und diese Mischung in einem mechanischen Gerät zu diesem Zweck homogenisiert. Die Mischung ist besonders geeignet zur oralen Verabreichung und enthält 200 mg aktiven Bestandteil.

Beispiel 26

Eine sterile Lösung der folgenden Zusammensetzung wird hergestellt: 200 mg des Natriumsalzes des Aminosäureporphyrin-Addukts werden in einer 0,9%igen NaCl-Lösung gelöst, so daß die Endkonzentration 20 mg/ml beträgt.
Diese Lösung ist geeignet für Iv. und Im.-Verabreichung.

Beispiel 27

Das Natriumsalz des Aminosäureporphyrin-Addukts wird in einer 0,9%igen NaCl-Lösung gelöst, so daß die Endkonzentration 5 mg/ml beträgt. Diese wird in einen Aerosolzerstäuber mit einem Kohlenwasserstofftreibmittel gegeben. Dieses Präparat ist geeignet zur topischen Applikation.

Beispiel 28

Herstellung eines Metallsalzes

Das Natriumsalz des Porphyrinaminosäure-Addukts wird hergestellt durch Auflösen dieses Addukts in Wasser, das eine äquimolare Menge Natriumhydroxid enthält, und Gefriertrocknen der resultierenden Mischung.
Auf diese Weise werden andere Metallsalze hergestellt, einschließlich der Kalium-, Calcium- und Lithiumsalze.

Herstellung eines Säuresalzes

Die in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Aminosäureporphyrin-Addukte werden zu Säuresalzen, z. B. Hydrochloriden, umgewandelt, indem man sie in einer wäßrigen Lösung, enthaltend eine äquivalente Menge Säure, z. B. Salzsäure, löst und die Lösung zur Trockne eindampft, wodurch das feste Salz erhalten wird. Alternativ können alkoholische Lösungen von Chlorwasserstoffgas, gelöst in Ethanol, anstelle der wäßrigen Säurelösung verwendet werden und das Säuresalz durch Verdampfung des Lösungsmittels oder Kristallisation aus dem Alkohol, z. B. durch Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels, erhalten werden.
Die folgenden Protokolle beschreiben das Verfahren zur Verwendung dieser neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von Rattentumoren.

Beispiel 29

Die photodynamischen Therapieexperimente wurden unter Verwendung der Verbindung Mono-(L)aspartylchlorid e&sub6; ausgeführt. Zwei transplantierbare Tumorlinien in Buffalo-Ratten wurden verwendet, Morris Hepatoma 7777 und Morris Hepatoma 5123 tc. Die Tumoren wurden subkutan auf das Äußere des Schenkels transplantiert. Während der Behandlung hatten die Tumoren eine Größe im Bereich von 1 bis 2,5 cm Durchmesser.
Das allgemeine Behandlungsregime ist wie folgt. Die Ratten werden mit einer Lösung des Chlorins injiziert, die wie folgt hergestellt wurde: 20 mg des Natriumsalzes des Chlorins wurden in 1 ml 0,9% NaCl gelöst. Die Chlorinlösung wurde dann intravenös durch die äußere Jugularvene injiziert, während die Ratte mit Ether anästhesiert war. Das Volumen der injizierten Lösung wurde bezogen auf das Gewicht des Tieres und die Dosierung auf einer Gewicht zu Gewicht-Basis für das jeweilige Experiment berechnet. Eine bestimmte Zeit ließ man dann verstreichen, bevor die Lichtbehandlung untersucht wurde.
Die Lichtbehandlung der Ratten erfolgte ohne Anästhesie. Die Ratten wurden gehemmt, das Haar auf der Behandlungsfläche entfernt und mit Laserlicht aus einem Cooper Aurora-gepumpten abstimmbaren Argonfarbstofflaser behandelt.
Der Laser war mit einem optischen Lichtleiterphasersystem ausgestattet, das an ein Mikrolinsensystem gekoppelt war, entwickelt von Dr. Daniel Doiron, D.R.D. Consulting, Santa Barbara, California.
Die Linse weitet den Laserstrahl auf und stellt eine kreisförmige Lichtverteilung mit homogener Lichtintensität über die Fläche des einfallenden Lichtstrahls zur Verfügung. Die Wellenlänge des Lichtes wurde unter Verwendung eines Hartridge Reversionsspektroskops eingestellt. Die Lichtintensität wurde unter Verwendung eines Yellow Springs Instrument, Model 65 A, Radiometers bestimmt.
Die Mikrolinse wurde in einem solchen Abstand von der Haut des Tieres angebracht, daß ein Bestrahlungs-Durchmesser von 1,5 cm erzielt wurde, und der Lichtfluß wurde durch Kontrolle der Laserleistung variiert.
Nach der Bestrahlung wurde das Tier in seinen Käfig zurückgebracht und 24 h später intravenös in die externe Jugularvene mit 14 mg Evans Blue-Farbstoff, gelöst in 250 ul 0,9%iger NaCl-Lösung, behandelt. Zwei Stunden nach der Injektion wurde die Ratte getötet und der Tumor aufgeschnitten. Das Ausmaß der Tumornekrose wurde durch das Fehlen der Farbstoffaufnahme, M.C. Berenbaum, Br. J. Cancer 45 : 571 (1982), beurteilt und die Tiefe des nekrotischen Querschnitts des Tumors in mm wurde aufgezeichnet.
Tabelle II faßt die Effekte dieser Medikamente auf Tumoren zusammen und schließt die Bereiche der Wellenlängen, Dosierungen, Intensitäten und Zeitintervalle für die Behandlung ein. Dies war für einen Versuch nötig, die optimalen Bedingungen für die Phototherapie unter Verwendung dieses neuen Medikaments zu ermitteln. Die beschriebenen Bedingungen führen zu meßbarem und signifikantem Schaden an den Tumoren.
In allen Fällen, ausgenommen wo angegeben, trat Gewebeschaden selektiv beim Tumorgewebe auf, wie festgestellt durch das Evans-Blueverfahren, selbst obwohl in beinahe allen Fällen normale Haut den Tumor überlagerte und die Behandlungsfläche mit signifikanten Flächen von normalem Muskelgewebe überlappte.
Die photodynamischen Therapiedaten werden in tabellarischer Form dargestellt. Spalte Nr. 2 ist die verabreichte Gesamtlichtdosis in Joule/cm². Spalte Nr. 3 ist die verabreichte Dosis von Mono- (L)aspartylchlorin e&sub6;, in mg Medikament pro kg Körpergewicht der Ratte. Spalte Nr. 4 ist die verstrichene Zeit zwischen der Verabreichung des Medikaments und der Behandlung mit Laserlicht. Spalte Nr. 5 ist die Wellenlänge des Behandlungslichts in Nanometern. Spalte Nr. 6 ist die Intensität des Behandlungslichts in mW/cm². In Spalte Nr. 7 ist x die mittlere Tiefe der Nekrose des Tumorgewebes in mm, d. h., der Abstand von der nekrotischen Spitze des Tumors direkt an der Haut bis zum nekrotischen Rand des Tumors, der von der Haut am weitesten entfernt war.
S.D. ist die Standardabweichung von x.
(N) ist die Anzahl an Tumoren oder Beinen, die am Experiment teilnahmen.
Spalte Nr. 8 ist der Bereich der Tiefe der Nekrose in mm innerhalb der Gruppe. Tabelle II Tumor Joule Medikamentendosis Zeit in h zw. Licht u. Med. Wellenlänge Intensität Bereich nichtspezifischer Schaden Tabelle II Tumor Joule Medikamentendosis Zeit in h zw. Licht u. Med. Wellenlänge Intensität Bereich kein Effekt *kein Effekt
Kontroll-Ratten: kein Tumor
Auswertung nach 24 h: 5 zeigten erhöhte Farbstoffaufnahme in der Haut am Behandlungspunkt.
Auswertung nach 24 h: 6 zeigten erhöhte Farbstoffaufnahme in der Haut am Behandlungspunkt.
Auswertung nach 14 Tagen: keine zeigte Anzeichen von Haut- oder Tumornekrose, und das Haar war wieder normal gewachsen.
Auswertung nach 14 Tagen: ein Bein eines Tieres zeigte gewisse Anzeichen von Muskelnekrose. Die Haut schien normal und das Haar wuchs auf allen Tieren wieder normal.

Beispiel 30

PDT-Experimente mit Mäusen und Mono-L-Aspartylchlorin e&sub6; PDT mit dem Tetranatriumsalz von Mono-L-Aspartylchlorin e&sub6; wurde bei einem weiteren Tier/Tumormodellsystem ausgewertet.
Der Tumor, SMT-F, wurde subkutan in die Schulter/Rippengegend (nur einseitig) von DBA/2 Ha ROS D+ Ha Mäusen transplantiert. Die Behandlung begann, als die Tumoren ein Ausmaß von etwa 1,5 bis 2 cm Länge · 1 cm Breite und 0,7 bis 1 cm Tiefe erreicht hatten (ungefähr 7 bis 8 Tage nach der Transplantation). Das Medikament wurde durch intraperitoneale Injektion in einer Konzentration von 4 mg/ml verabreicht. Spezielle Parameter und Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle aufgeführt. Die Auswertung wurde 24 h nach der Lichtbehandlung unter Verwendung des Farbstoffs für lebendes Gewebe Evans Blue in einem Verfahren ähnlich zu dem, das zur Bewertung der Tumornekrose bei den Buffalo-Ratten verwendet wurde, ausgeführt, wobei der einzige Unterschied die intraperitoneale Injektion des Farbstoffs in einer Dosis von 5 mg pro Maus war. Die Überschriften jeder Spalte sind dieselben wie beim Rattensystem. Joule Medikamentendosis Zeit in h zw. Licht u. Med. Wellenlänge Intensität
Kein Anzeichen von Nekrose von normalem Gewebe (Muskel oder Haut) wurde beobachtet.
Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn die Verbindungen in den Beispielen 1 bis 22 an ähnlich vorbehandelte Mäuse verabreicht werden.

Beispiel 31

PDT Experimente mit Ratten und Mono-L-glutamylchlorin e&sub6; Buffalo Ratten mit Morris Hepatoma 7777, das subkutan an die Außenseite jedes Hinterbeins transplantiert worden war, wurden der photodynamischen Therapie (PDT) unterworfen, wobei Mono-L- glutamylchlorin-e&sub6;-tetranatriumsalz als Medikament verwendet wurde.
Das Experimentalverfahren war dasselbe wie beim Test des Mono-L- aspartylchlorins e&sub6;. Spezielle Parameter und Ergebnisse werden in der unten stehenden Tabelle aufgelistet.
Kein sichtbarer Schaden - festgestellt nach dem Evans-Blue-Verfahren - an der darüberliegenden Haut oder normalem Muskelgewebe, das den Tumor umgab, wurde beobachtet, obwohl die Fläche der Lichtbehandlung mit 1,5 cm Durchmesser das normale Gewebe in verschiedenen Fällen überlappte.
Spalte Nr. 1 ist die verabreichte Gesamtlichtdosis in Joule/cm². Spalte Nr. 2 ist die verabreichte Chlorindosis in mg Arzneimittel/kg Rattenkörpergewicht. Spalte Nr. 3 ist die Zeit zwischen Verabreichung des Medikaments und Behandlung mit Laserlicht. Spalte Nr. 4 ist die Wellenlänge des Behandlungslichts in Nanometern. Spalte Nr. 5 ist die Intensität des Behandlungslichts in mW/cm². In Spalte Nr. 6 ist X die mittlere Nekrosetiefe des Tumorgewebes in mm, d. h. der Abstand von der nekrotischen Oberseite des Tumors, die der Haut am nächsten war, zum nekrotischen Rand des Tumors, der von der Haut am weitesten entfernt war. S.D. ist die Standardabweichung von X, (n) ist die Anzahl an Tumoren oder Beinen, die am Experiment teilnahmen. D ist der mittlere Durchmesser der Tumornekrose und das nachfolgende S.D. die Standardabweichung für D. Joule Medikamentendosis Zeit in h zw. Licht u. Med. Wellenlänge Intensität
Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn die Verbindungen 1 bis 22 der vorhergehenden Beispiele an ähnlich vorbehandelte Ratten verabreicht werden.

Beispiel 32

PDT Experimente mit Mäusen und Mono-L-aspartylchlorin e&sub6;

Der SMT-F-Tumor im DBA/2 Ha ROS D+ Ha Maussystem wurde zur Auswertung des photodynamischen Effekts von Mono-L-glutamylchlorin e&sub6;tetranatriumsalz verwendet.
Das Protokoll ist dasselbe wie beim Experiment, bei dem Mono-L- aspartylchlorin e&sub6; verwendet wurde und die Spaltenüberschriften sind dieselben, wie diejenigen, die in diesem System und dem Rattensystem verwendet wurden. Joule Medikamentendosis Zeit in h zw. Licht u. Med. Wellenlänge Intensität * Eine neunte Maus sprach nicht an und wurde in die obige statistische Analyse nicht eingeschlossen. Dies geschah aufgrund der Möglichkeit, daß das Medikament in den Darm anstatt in das Peritoneum injiziert wurde.

Beispiel 33

Menschliche Zellen (HeLa, Stamm D98/AH2) wurden in 25 cm² Plastikkulturflaschen 24 h inkubiert, um Anlagern zu ermöglichen. Dann wurden sie gewaschen, 10 min lang in Ham's F-12 Medium mit Porphyrinen inkubiert, wiederum in Ham's F-12 Medium ohne Porphyrine 5 min gewaschen, dann verschiedene Zeiten lang bestrahlt und bei 37ºC in vollständigem Medium 24 h kultiviert. Dann wurden unter Verwendung eines Phasenkonstrastmikroskops Zellzählungen des Anteils der überlebenden Zellen vorgenommen. Die breitbandige verwendete Bestrahlungslichtquelle wurde so eingestellt, daß sie eine Lichteinfallsintensität von 5 · 10&sup5; erg/cm²/s hatte. Ein Positioniergerät erlaubte die Bestrahlung von jeweils 5 Flächen einer Flasche während verschiedener Zeiten; eine Fläche wurde nicht bestrahlt und diente als Dunkelkontrolle. Dies gab eine Überlebenskurve von 4 Lichtdosen aus einer Einzelflasche; daher ist die Technik für die schnelle und ökonomische Überprüfung großer Zahlen von potentiellen photosensibilisierenden Mitteln geeignet. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in Tabelle III gezeigt. Tabelle III Prozent überlebende Zellen 24 h nach der Bestrahlung Sensibilisator Bestrahlungszeit in Minuten Mesoporphyrin IX Mono-L-asparaginsäure Mesoporphyrin IX Di-L-asparaginsäure Mesochlorin IX Mono-L glutaminsäure Chlorin e&sub6; Mono-L-asparaginsäure Tabelle III Prozent überlebende Zellen 24 h nach der Bestrahlung Sensibilisator Bestrahlungszeit in Minuten Di-aspartylmesoporphyrin IX Aspartyl-pyropheophorbid a Aspartyl-pyropheophorbid a (die selbe Lösung wie oben, aufbewahrt im Kühlschrank) 2/10 ml einer 4·10&supmin;&sup4; M Lösung (oder Suspension) des Sensibilisators wurden mit 1,8 ml Ham's Medium für die Experimente gemischt - so wurden die Zellen mit 4·10&supmin;&sup5; M Sensibilisator behandelt. Die Zellen wurden 10 min in Gegenwart des Sensibilisators inkubiert, dann 5 min in Ham's Lösung ohne Sensibilisator gewaschen und dann in Ham's Lösung während der angegebenen Zeit bestrahlt.

Beispiel 34

Untersuchung der Porphyrinfluoreszenz als Funktion der molekularen Struktur

Zwei transplantierbare Tumorlinien in Buffaloratten wurden verwendet, Morris Hepatoma 7777 und Moris Hepatoma 5123tc. Die Tumoren wurden intramuskulär auf die Rückseite des Schenkels der Ratten transplantiert. Nach 10 bis 14 Tagen, als die Tumoren die geeignete Größe erreicht hatten, wurden 2 mg (0,5 ml) einer Lösung des Aminosäure- Porphyrin-Addukts intraperitoneal den Ratten injiziert. Die Lösung des Aminosäureporphyrin-Addukts wurde wie folgt hergestellt: 4 mg des Aminosäureporphyrins wurden in 0,1 M NaOH gelöst und auf physiologischen pH mit 1 M HCl eingestellt.
Die Ratten wurden 24 h nach Injektion getötet. Der Tumor wurde in situ seziert. Die Porphyrinfluoreszenz wurde unter einer UV-Lichtquelle mit konstanter Intensität bestimmt.
Tabellen IV, V, VI und VII listen die getesteten Porphyrinderivate auf. Die Verbindungen sind alphabetisch gruppiert.
Nach dem Namen des Porphyrins folgt eine Nummer, die die Gesamtzahl der geprüften Tumoren bezeichnet. Die nächste Zahlenspalte (A) ist eine Zahl, die wie folgt berechnet wird: Die Porphyrinfluoreszenz im Tumor wurde visuell durch eine Person unter einer UV-Lichtquelle mit konstanter Intensität nach der Skala 0, +1/2, 1, 2, 3, 4 eingeordnet. Diese Zahl wurde dann mit dem Prozentsatz der Tumoren, die diese Fluoreszenz aufwiesen, multipliziert, z. B. (+1/2) (80%) + (+1) (10%) = 50. Meistens stellen die A-Werte in der Tabelle Durchschnittswerte dar, die in verschiedenen Reihen von separaten Experimenten, die zu verschiedenen Zeiten ausgeführt wurden, erhalten wurden.
Der "C-Wert" für jeden Tumor ist der "A-Wert" für den Tumor, dividiert durch den durchschnittlichen Durchmesser des Tumors in cm.
Eine Zeitstudie von 12 bis 72 Stunden wurde ebenso bei einigen der Tumoren ausgeführt. Das Verfahren ist dasselbe wie oben, mit der Ausnahme, daß 1 mg des Aminosäure-Addukts verwendet wurde. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle IV aufgeführt. Tabelle IV Screening-Experimente* Porphyrin-Derivat Dosis Zeit Zahl Tumoren mittl. Durchm. Fluoreszenz Chlorin-e&sub6;-mono-L-glutamyl Kontrolle Zeitstudie * Tumor - Morris Hepatoma 7777 Tabelle V Tumorlinie: Morris Hepatoma 7777 Sammeltabelle für eine 2 mg Dosis Überprüfung nach 24 h Porphyrin Derivat Tumoren Mesoporhpyrin Protoporhyrin Photoprotoporphyrin Mono-(D,L)aspartyl Di-(D,L)aspartyl Mono-(L)glutamyl Tabelle V (Fortsetzung) Tumorlinie: Morris Hepatoma 7777 Sammeltabelle für eine 2 mg Dosis Überprüfung nach 24 h Porphyrin Derivat Tumoren Koproporphyrin Mesochlorin Pheophorbid Pyropheophorbid Mono-(D,L)aspartyl Di-(D,L)aspartyl Tri-(D,L)aspartyl Tetra-(D,L)aspartyl Tabelle V (Fortsetzung) Tumorlinie: Morris Hepatoma 7777 Sammeltabelle für eine 2 mg Dosis Überprüfung nach 24 h Porphyrin Derivat Tumoren Chlorin e&sub6; Mono-(L)aspartyl Mono-(L)glutamyl Tabelle VI Tumorlinie: Morris Hepatoma 7777 Porphyrin Derivat Zahl Tumoren mittl. Tumordurchmesser Fluoreszenz Mesoporphyrin Mesochlorin Deuterochlorin Chlorin Di-(D,L)aspartyl Monoo(D,L)aspartyl-monomethylester Mono-(L)glutamyl Tabelle VI (Fortsetzung) Tumorlinie: Morris Hepatoma 7777 Porphyrin Derivat Zahl Tumoren mittl. Tumordurchmesser Fluoreszenz Methylpyroporphyrin Pheophorbid Pyropheophorbid Photoprotoporphyrin Mesoprophyrin (D,L)-Aspartyl Di(D,L)aspartyl 10 mg Hämin 1 h zuvor Tabelle VII Tumorlinie: Morris Hepatoma 5123TC Porphyrin Derivat Zahl Tumoren mittl. Durchmesser in Tumoren Fluoreszenz Mesoprophyrin Mesochlorin Protoporhyrin Pyropheophorbid Chlorin Di-(D,L)aspartyl Mono-(D,L)aspartylmonoisoamylester Mono-(L)glutamyl

Claims

1. Verbindung der Struktur

worin Z der Aminodicarbonsäurerest minus die Aminogruppe ist und X der Tetrapyrrolrest minus die Carboxygruppe ist und "n" eine Ganzzahl von 1 bis inklusive 4 ist, und deren Salze, unter der Voraussetzung, daß diese Verbindung nicht Mesophorphyrin-bis-L-glutaminsäure ist.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure eine α-Aminodicarbonsäure ist.

3. Verbindung gemaß Anspruch 1, worin das Tetrapyrrol die Formel

hat, oder die entsprechenden Di- oder Tetrahydrotetrapyrrole, worin R&sub1; Methyl oder R&sub2; H, Vinyl, Ethyl, Acetyl

R&sub9; H, COOH, CH&sub2;COOH oder Methyl ist;

vorausgesetzt, daß wenn R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub7; und R&sub8; zwei Substituenten darstellen oder zweiwertig und an dasselbe Kohlenstoffatom gebunden sind, der jeweilige Pyrrolring, an welchen es gebunden ist, ein Dihydropyrrol ist;

R Niederalkyl oder Benzyl ist;

R&sub6; und R&sub9; zusammengenommen

sind, unter der Voraussetzung, daß mindestens eine Gruppe von R&sub1; bis R&sub9; eine freie Carboxylgruppe einschließt; und deren Salze.

4. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin das Tetrapyrrol die Formel:

hat, oder die entsprechenden Di- oder Tetrahydrotetrapyrrole, worin R&sub1; bis R&sub9; die in Anspruch 3 definierten Bedeutungen haben.

5. Verbindung gemäß Anspruch 4, worin das Tetrapyrrol ein Porphyrin, ein Chlorin oder ein Bacteriochlorin ist.

6. Verbindung gemäß Anspruch 4, worin die Aminosäure eine α- Aminodicarbonsäure, Asparaginsäure oder Glutaminsäure ist.

7. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin das Porphyrin-Aminosäure- Addukt ausgewählt ist aus der Gruppe von Monoaspartyltransmesochlorin IX, Diaspartyltransmesochlorin IX, Monoglutamyltransmesochlorin IX, Diglutamyltransmesochlorin IX, Monoaspartylchlorin e&sub6;, Triaspartylchlorin e&sub6;, Monoglutamylchlorin e&sub6;, Diglutamylprotoporphyrin IX, Monoaspartylmesochlorin e&sub6;, Monoglutamylprotoporphyrin IX, Monoaspartylmesoporphyrin IX, Diaspartylmesoporphyrin IX, Diaspartylprotoporphyrin IX, Monoaspartylbacteriochlorin e&sub4;, Diaspartyldeuteroporphyrin IX, Monoaspartyldeuteroporphyrin IX, Monoglutamylbacteriochlorin e&sub4;, Diglutamyldeuteroporphyrin IX, Mono- oder Diaspartylphotoprotoporphyrin IX, Mono- oder Diglutamylphotoprotoporphyrin IX, Mono-, Di-, Tri- oder Tetraglutamylkoproporphyrin III, Mono- oder Diaspartylhämatoporphyrin IX, Mono- oder Diglutamylhämatoporphyrin IX, Mono- oder Diglutamylchlorin e&sub4;, Mono- oder Diglutamylmesochlorin e&sub4;, Mono- oder Diaspartylchlorin e&sub4; und Monoglutamyldeuteroporphyrin IX.

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Umsetzung einer Aminodicarbonsäure mit einem Tetrapyrrol, das mindestens eine Carboxygruppe enthält, in einem geeigneten Lösungsmittel und wahlweise Umwandeln des Produkts in eines seiner Salze.

9. Therapeutische Zusammensetzung zur Detektion und/oder Behandlung von Säugetiertumoren, umfassend eine Verbindung eines der Ansprüche 1 bis 7 und einen pharmazeutisch zulässigen Träger dafür.

10. Verwendung einer Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Detektion und/oder Behandlung von Säugetiertumoren.