NO169290B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av et terapeutisk aktivt tetrapyrrol-amino-dicarboxylsyreaddukt - Google Patents

Abstract

Nye terapeutisk aktive forbindelser for påvisning og/. eller behandling av tumorer i pattedyr omfattende et fluor-escent mono- eller polyamid av en aminodicarboxylsyre og et tetrapyrrol inneholdende minst en carboxygruppe, og av strukturen. hvori Z er aminodicarboxylsyreresten minus aminogruppen og X er tetrapyrrolresten minus carboxygruppen og n er et helt tall fra 1 til 4. Fremstilling av forbindelsene er beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt tetrapyrrol-amino-dicarboxylsyreaddukt, anvendelig til fotodiagnostisering og fotobehandling av tumorer.

Det er kjent å bestråle tumorer og cancerøst vev i

det humane legeme med intensivt lys etter administrering av et hematoporfyrinderivat i bølgelengdeområdet på 626 til 636 nanometer for å redusere, og enkelte ganger ødelegge, de cancerøse celler (se PCT-publikasjon WO 83/00811) . Det er også kjent at porfyriner, spesielt natriumsaltet av protoporfyriner kan opprettholde eller aktivere de normale celle-funksjoner og er anvendbare for å forhindre genesis, vekst, metastaser og tilbakefall av ondartede tumorer. Japansk publisert patentsøknad 125737/76 beskriver anvendelse av porfyriner som tumorinhiberende midler, og som eksempler angis etioporfyrin, mesoporfyrin, protoporfyrin, deuteroporfyrin, hematoporfyrin, coprofyrin og uroporfyrin.

I Tetrahedron Letters nr. 23, s. 2017-2020 (1978) er det beskrevet et aminomonocarboxylsyreaddukt av pigmentet bonellin erholdt ved ekstraksjon av i første rekke kropps-veggen av det marine echuroid B. viridis. Strukturen av disse addukter er antatt å være et amid dannet gjennom hvilke som helst av de frie carboxylgrupper av bonellin og aminomonocarboxylsyren. Hydrolyse av adduktet gir en blanding av valin, isoleucin, leucin og alloisoleucin.

Ingen anvendelse for disse aminosyreaddukter er beskrevet i denne publikasjon.

At tetrapyrroler fremkaller intens fotosensibilitet i dyr, er vel kjent og er blitt dokumentert i et utall artik-ler innen litteraturen, f.eks. J. Intr. Sei. Vitaminol, 27, 521-527 (1981); Agric. Biol. Chem., 46 (9), 2183-2193

(1982); Chem. Abst. 9J3, 276 (1983) og 88_, 69764m (1928).

De terapeutisk aktive forbindelser som tas i betraktning ved analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er sykliske tetrapyrroler avledet ved forskjellige prosedyrer fra naturlig forekommende tetrapyrroler. De sykliske tetrapyrroler har som deres felles modertetrapyrrol uroporfyrinogen og utviser følgende ringstruktur:

hvori stillingene i molekylet er nummerert 1-20, og ringene identifisert med bokstavene A, B, C og D, og som også innbefatter perhydro-, f.eks. dihydro- og tetrahydroderivater av angitte ringstruktur, f.eks. forbindelser hvori en eller flere dobbeltbindinger er fraværende. I ringsystemet foreligger fire pyrrolringer forbundet gjennom alfastillingene av de respektive pyrrolringer med en methingruppe, dvs. -CH=. Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er betegnet som derivater av tetrapyrroler av praktiske grunner i foreliggende beskrivelse, og det skal forstås at uttrykket "tetrapyrrol" vil betegne forbindelser med den ovenfor angitte karakteristiske ringstruktur så vel som de tilsvarende per-hydroderivater.

Tetrapyrrolene fremstilt ifølge oppfinnelsen er alle avledet ved forskjellige alternative prosedyrer fra natur-lige tetrapyrroler. De naturlig forekommende tetrapyrroler har som deres felles stamforbindelse uroporfyrinogen III, et hexahydroporfyrin redusert ved brostillingene. Eksempelvis er syntetiske eller biosyntetiske derivater eller produkter av protoporfyriner IX eller protoporfyrinogen IX vel kjent innen faget (se f.eks. Porphyrins and Metalloporphyrins, K. Smith Elsivier; The Porphyrins (vol. 1-7) D. Dolphin, Academic Press; og Biosynthetic Pathways, vol. III, kapittel av B. Burnham, red. D.M. Greenberg, Academic Press.

Et ytterligere karakteristisk trekk ved de nye forbindelser er nærvær av minst en amidbinding i en substituent ved en hvilken som helst av de nummererte stillinger av ringstrukturen. Disse er til stede i foreliggende nye forbindelser sammen med andre substituenter som definert i det etterfølgende.

Ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således en analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk

aktivt tetrapyrrol-amino-dicarboxylsyreaddukt, anvendelig til fotodiagnostisering og fotobehandling av tumorer, med formel:

eller de tilsvarende di- eller tetrahydrotetrapyrroler hvori R9 er H, COOH, CH2COOH, CH2COR eller methyl; forutsatt at når Rlr R2, R3, R4, R7 og R8 betegner to substituenter eller er divalente og bundet til samme carbonatom, er den respektive pyrrolring til hvilken de er bundet et dihydropyrrol; R er aspartyl, glutamyl, aminoadipyl eller estere derav; hvor esteren er en methylester eller isoamylester og hvor minst en av R2, R4, R6, R7 eller R9 inneholder gruppen R R6 og R9 er sammen

forutsatt at minst en av Rx-R9 innbefatter en dicarboxyl-gruppe og salter derav kjennetegnet ved at tetrapyrrolet med den ovenfor angitte formel, hvor R=OH omsettes med én eller flere amino-dicarboxylsyrer i et egnet løsningsmiddel under amiddannende betingelser, og eventuelt at der erholdte produkter omdannes til et salt.

Foreliggende oppfinnelse angår således fremstilling av nye forbindelser omfattende aminosyrederivater av forbindelser som inneholder kromofor av porfyriner eller kloriner, så vel som beslektede porfyrinforbindelser. Peptidbindingem innbefatter en carboxygruppe av den kromoforbærende forbindelse og den spesifiserte aminosyre. Forbindelsene omfatter bl.a. derivater av tetrapyrrolene som inneholder en fri carboxygruppe. Disse derivater innbefatter hovedklasser av tetrapyrroler: carboxyholdige porfyriner og kloriner, hvilke er velkjent for fagmannen.

Aminosyren anvendt ved analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for å danne den ovenfor angitte peptidbinding, er aminodicarboxylsyrer hvori aminogruppen selvsagt er lokalisert på et carbonatom av dicarboxylsyren. Den spesifikke stilling av aminogruppen i carbonatomkjeden er ikke kritisk, det eneste krav er at aminogruppen er tilgjengelig for å danne den krevede peptidbinding med carboxylgruppen av det valgte porfyrin. Således er et utall av amindicarboxylsyrer anvendbare i forbindelsene ifølge oppfinnelsen, innbefattende a-aminoravsyre (asparaginsyre), a-aminoglutarsyre (glutaminsyre), B-aminoglutarsyre, (3-aminosebasinsyre, 2,6-piperidin-carboxylsyre, 2,5-pyrroldicarboxylsyre 2-carboxypyrrol-5-eddiksyre, 2-carboxypiperidin-6-propionsyre, a-aminoadipinsyre, a-aminoazelainsyre og lignende syrer. Disse aminosyrer kan substitueres med vinklede alkylgrupper, slik som methyl-og ethylgrupper, så vel som andre grupper som ikke ugunstig påvirker aminogruppens evne til å danne peptidbinding, f.eks. alkoxygrupper eller acyloxygrupper og kan også innbefatte ytterligere aminogrupper. De foretrukne aminosyrer er de naturlig forekommende a-aminosyrer, glutaminsyre og asparaginsyre, som er lett tilgjengelig og som hittil har gitt de beste resultater.

Eksempler på forbindelser av tetrapyrrolklassene er illustrert i tabell I hvori de nummererte stillinger av tetrapyrrolringstrukturen er anvendt for å angi stillingen av den angitte substituent. Fravær av dobbeltbindinger i ringsystemet er angitt under "dihydro" med hvert sett av tall (ringstilling) som indikerer fravær av en dobbeltbin-ding mellom de angitte stillinger.

Særlig foretrukne terapeutisk aktive forbindelser innbefatter følgende: Mono- og diaspartyltransmesoklorin IX Mono- og diglutamyltransmesoklorin IX Mono-, di- og triaspartylklorin e^ Mono-, di- og triaspartylmesoklorin e^ Mono-, di- og triglutamylklorin e fi Mono-, di- og triglutamylmesoklorin e^ Mono- og diaspartylklorin e^

Mono- og diaspartylmesoklorin e^

Mono- og diaspartylisoklorin e^

Mono- og diaspartylmesoklorin e^

Mono- og diglutamylklorin e^

Mono- og diglutamylmesoklorin e^

Mono- og diglutamylisoklorin e.

Mono- og diglutamylmesoisoklorin e^ Monoaspartylpyrofeoforbid a Monoglutamylpyrofeoforbid a Monoaspartylfeoforbid a Monoglutamylfeoforbid a

Mono- og diaspartylfotoprotoporfyrin IX Mono- og diglutamylfotoprotoporfyrin IX Mono- og di-L-alfa-aminoadipyltransmesoklorin IX Porfyrinderivater

Mono- og diaspartylmesoporfyrin IX Mono- og diglutamylmesoporfyrin IX Mono- og diaspartylprotoporfyrin IX Mono- og diglutamylprotoporfyrin IX

Mono- og diaspartyldeuteroporfyrin IX

Mono- og diglutamyldeuteroporfyrin IX

Mono-, di-, tri- og tetraaspartylcoproporfyrin III (isomer blanding)

Mono-, di-, tri- og tetraglutamylcoporfyrin III

Mono- og diaspartylhematoporfyrin IX

Mono- og diglutamylhematoporfyrin IX

Bakterioklorinderivater

Mono- og diaspartylbakterioklorin e^

Mono- og diglutamylbakterioklorin e^

Mono- og diaspartylbakterioisoklorin e4

Mono- og diglutamylbakterioisoklorin e^

Mono-, di- og triaspartylbakterioklorin e^

Mono-, di- og triglutamylbakterioklorin e^

Monoaspartylpyrobakteriofeoforbid a

Monoglutamylpyrobakteriofeoforbid a

Monoaspartylbakteriofeoforbid a

Monoglutamylbakteriofeoforbid a.

De ovenfor angitte forbindelser danner salter med enten syrer eller baser. Syresaltene er særlig anvendbare for rensing og/eller separering av amidsluttproduktene som også saltene dannet med baser. Basesaltene er imidlertid særlig foretrukne for diagnostisk og terapeutisk bruk som senere beskrevet.

Syresaltene dannes med et utall syrer slik som de uorganiske syrer, så som saltsyre, hydrobromsyre, salpeter-syre og svovelsyre, og organiske syrer, slik som toluen-sulfonsyre og benzensulfonsyre.

Basesaltene innbefatter f.eks. natrium, kalium, calsium, magnesium, ammonium, triethylammonium, trimethyl-ammonium, morfolin og piperidinsalter og liknende salter.

Syre- og basesaltene dannes ved oppløsning av det

valgte aminosyretetrapyrrolamid i en vandig løsning av syren eller basen og fordampning av løsningen til tørrhet. Anvendelse av et vannblandbart løsningsmiddel for amidet kan med-hjelpe til oppløsning av amidet.

Amidsluttproduktene kan også omdannes til metallkomplekser, f.eks. ved omsetning med metallsalter. Magnesium-kompleksene kan være anvendbare for samme formål som addukt-produktet. Andre metallkomplekser, så vel som magnesiumkom-plekset innbefattende f.eks. jern og zink, er anvendbare for å utelukke forurensning under bearbeidelse av adduktproduk-tet av metaller, slik som nikkel, kobolt og kopper, som er vanskelige å fjerne. Zink og magnesium fjernes lett fra sluttadduktproduktet etter at fremstillingen er fullført.

Da mange av aminodicarboxylsyrene foreligger både i D- og L-former og også anvendes i blandinger av disse former så vel som D,L-formen, vil valg av aminoutgangssyren selvsagt resultere i produkter hvori den respektive isomer eller blanding av isomerer foreligger. Foreliggende oppfinnelse tar i betraktning anvendelse av alle slike isomerer, men L-formen er særlig foretrukket.

De ovenfor angitte forbindelser fremstilles ved de vanlige anvendte peptidsynteser som generelt innbefatter enhver amiddannende reaksjon mellom den valgte aminosyre og det spesifikke tetrapyrrol. Således kan ethvert amiddannende derivat av tetrapyrrolcarboxylsyren anvendes ved fremstilling av foreliggende nye peptider, f.eks. laverealkylestere, anhydrider og blandede anhydrider.

De foretrukne preparative metoder gjør bruk av blandede anhydrider av carboxylsyren eller carbodiimider. Reaktantene bringes bare i kontakt i et egnet løsningsmiddel og tillates å reagere. Temperaturer opp til tilbakeløps-temperaturen kan anvendes, idet høyere temperaturer reduserer reaksjonstiden. Høye temperaturer er vanlivis ikke foretrukne for å unngå uønskede bireaksjoner.

Prosedyrene for dannelse av foreliggende peptider er

i vel kjent innen faget og beskrives i detalj i de medfølgende eksempler.

Når det valgte tetrapyrrol inneholder mer enn en carboxylgruppe, kan blandinger av produkter dannes irmbefat-tende isomere monopeptidprodukter og di- og t.o.m. tri-eller høyere peptidprodukter, avhengig av antall carboxylgrupper og avhengig av den valgte støkiometri. Når således ekvimolare blandinger av aminosyre og tetrapyrrol omsettes, erholdes ikke bare monopeptider, men også dipeptider, selv om monopeptidet vil være dominerende. Med høyere molarfor-hold vil arten av produktene variere på liknende måte. Det er generelt mulig å separere monopeptidene og de høyere peptider under anvendelse av kjente kromatografiske teknikker. Slike separasjoner er imidlertid ikke nødvendig, da de blandede peptider vanligvis er sammenliknbare med de separerte produkter for deres endelige bruk. Således kan blandinger av mono-, di- og tripeptider av det samme tetrapyrrol anvendes .

Vanligvis separeres uomsatt tetrapyrrol fra peptid-produktene ifølge oppfinnelsen under rensingen, slik som f.eks. ved kromatografiske teknikker.

Fotodiagnose og fototerapi

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er anvendbare for fotodiagnose og fototerapi av tumor, cancer og ondartet vev (heretter angitt som "tumor").

Når et menneske eller dyr med tumor behandles med doser av en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen, og deretter egnede lysstråler eller elektromagnetiske bølger påføres, vil forbindelsen sende ut lys, dvs. bevirke fluorescens. Derved kan eksistens, posisjon og størrelse av tumoren påvises, dvs. det kan foretas en fotodiagnose.

Når tumoren bestråles med lys av riktig bølgelengde og intensitet, aktiveres forbindelsen til å utvise en celledrepende effekt mot tumoren. Dette kalles "fototerapi".

Forbindelser beregnet for fotodiagnose og fototerapi skal ideelt sett utvise følgende egenskaper: (a) være ikke-toksiske ved normale terapeutiske doser med mindre og inntil de aktiveres med lys; (b) skal være selektivt fotoaktive; (c) når lysstråler eller elektromagnetiske bølger påføres, skal de utsende karakteristisk og påvisbar fluorescens; (d) når de bestråles med lysstråler eller når elektromagnetiske bølger påføres, skal de aktiveres til en grad hvor de utviser en celledrepende effekt mot tumoren; og (e) være lett mataboliserbare eller utskilles etter behandling.

Ifølge den hittil foretatte testing har forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, de ovenfor angitte egenskaper og er også karakterisert ved en rimelig løselighet i vann ved fysiologisk pH.

De ovenfor angitte forbindelser utviser større fluorescens i tumorer enn de tilsvarende basiske tetrapyrroler, og til og med peptider dannet med aminomonocarboxylsyrene, f.eks. alanin og epsilonaminocapronsyre. Anvendelse av disse gir den beste kontrast i tumorer sammenliknet med normalt vev rundt tumoren. Foreliggende forbindelser absorberer aktiverende energi for fototerapi i det hensiktsmessige området på 60 0 til 800 nanometer, hvor de foretrukne forbindelser absorberer i området 620-760 nanometer, dvs. lys av lengre bølgelengde som lettere muliggjør penetrering av energi inn i tumoren for fototerapeutiske formål.

Ut fra foreliggende erfaring fordeles de nye forbindelser mer jevnt gjennom tumoren enn tetrapyrrol, hvilket muliggjør anvendelse av tydelig lavere dose (1/10 av den krevede normale dose av tetrapyrrolen), hvilket reduserer om ikke fullt ut eliminerer, fotosensibilisering i verten. De utviser også en mer ensartet fluorescens, mens enkelte av de tilsvarende tetrapyrroler viser uensartet fluorescens eller fluorescens som varierer fra dag til dag i verten.

En særlig fordelaktig egenskap ved de nye forbindelser ligger i den letthet med hvilken de utskilles av verten. Innen 48 til 72 timer etter intravenøs eller intraperitoneal administrering er det generelt lite eller ingen påvisbare mengder i normalt muskelvev. De nye forbindelser som utskilles med deres kromofor intakt, gjenvinnes fra feces av verten i løpet av 48-72 timer etter injeksjonen. Under ekvivalente omstendigheter vil betydelige mengder av de tilsvarende tetrapyrroler være tilbake sammenliknet med at bare mindre mengder av peptider dannet med aminosyrene er tilbake i verten, f.eks. opptil 20%. Denne egenskap er meget viktig ved at den bidrar til en minimering av fotosensibiliseringen av verten. Foreliggende forbindelser kan anvendes for diagnose og terapeutisk behandling av et bredt område av tumorer. Eksempler på tumorer er magecancer, enterisk cancer, lungecancer, brystcancer, uterincancer, øsofagial-cancer, ovariecancer, pankreatincancer, faryngealcancer, sarcomas, hepatisk cancer, cancer i urinblæren, cancer i overkjeven, cancer i galletrakten, cancer på tungen, cere-braltumor, hudcancer, ondartet struma, prostatisk cancer, cancer i parotidkjertelen, Hodgkin's sykdom, multippel myeloma, renalcancer, leukemi og ondartet lymfocytoma.

For diagnose er det eneste krav at tumoren er i stand til selektivt å fluorescere når den utsettes for riktig lys. For behandling må tumoren være penetrerbar av aktiverings-energien. For diagnose anvendes lys av kortere bølgelengde, mens for terapeutiske formål anvendes lys av lengre bølge-lengde for å muliggjøre en penetrering av tumorvevet. For diagnose kan således lys på fra 360 til 760 nanometer anvendes, og for behandling fra 620 til 760, avhengig av de individuelle karakteristika av tetrapyrrolet. Absorpsjons-karakteristikaene for foreliggende nye forbindelser er hovedsakelig de samme som for tetrapyrrolet, fra hvilket de er avledet.

Det er nødvendig at lysstrålene er så intense at de forårsaker at forbindelsene utstråler fluorescens for diagnose og utviser en celledrepende effekt for terapi.

Bestrålingskilden for fotodiagnosen og fototerapien er ikke begrenset, men laserstrålen foretrekkes på grunn av at intense lysstråler i et ønsket bølgelengdeområde selektivt kan påføres. Ved f.eks. fotodiagnose administreres forbindelsen ifølge oppfinnelsen til et menneske eller dyr, og etter et bestemt tidsrom påføres lysstråler til den del som skal undersøkes. Når et endoskop kan anvendes for den påvirkede del, slik som lunger, svelg, mage, livmor, urin-blære eller rektum, bestråles denne under anvendelse av endoskopet, og tumordelen utstråler selektivt fluorescens. Denne del observeres visuelt, eller observeres gjennom et tilpasset fiberskop med øye eller på en CRT-skjerm. Etter administrering av dosen ved fototerapi utføres bestrålingen ved hjelp av laserstråler fra spissen av kvartsfibere. Ved siden av bestråling av tumoroverflaten kan den indre del av tumoren bestråles ved å innføre spissen av kvartsfibere inn i tumor. Bestrålingen kan observeres visuelt eller gjen-speiles på en CRT-skjerm.

For fotodiagnose er lys med bølgelengder mellom 360 og 760 nanometer egnet for å aktivere foreliggende tetra-pyrrolforbindelser. Hver forbindelse har selvsagt en spesi-fikk optimal bølgelengde for aktivering. En ultrafiolett lampe med lang bølgelengde er særlig egnet for fotodiagnose. Liknende metoder for å betrakte den behandlede tumor kan anvendes som allerede beskrevet for fototerapi.

Dosen av forbindelsene vil variere, avhengig av den ønskede effekt, dvs. hvorvidt de skal anvendes for diagnose eller behandling. For diagnose vil doser så lave som 1 mg/ kg være effektive, og doser opptil 20 mg/kg kan anvendes.

For behandling vil dosen vanligvis være tilnærmet 0,5 mg/kg.

Selvsagt kan dosen for enten diagnose eller behandling vari-eres vidt i lys av de ovenfor angitte fordelaktige egenskaper av de nye forbindelser, eksempelvis den lette elimi-nering fra verten.

Foreliggende forbindelser er tilsynelatende ikke-toksiske ved de doseringsnivåer som anvendes for diagnose eller behandling. Ingen dødelighet av testdyr på grunn av foreliggende forbindelser er blitt observert ved studier hvor det har vært anvendt doseringsnivåer opptil 20 mg/kg.

For både diagnose og behandling kan foreliggende forbindelser administreres oralt, intravenøst eller intramuskulært. De kan formuleres som lyofiliserte sterile, pyrogen-frie forbindelser, fortrinnsvis i form av basiske salter, f.eks. natriumsalt. De foretrukne doseringsformer tilveiebringes som injiserbare løsninger (isotoniske).

Bestrålingskilden anvendt ved behandling av tumorer inneholdende forbindelser ifølge oppfinnelsen, er en fil-trert, kontinuerlig høy-intensitetskilde eller "pumped dye", eller annet laser- og lysutleveringssystem som er i stand til å virke innen følgende grenser: kraftintensitet 20-500

2

mw/cm ved bølgelengder mellom 620 og 760 nanometer og en

total ytelse på minst 500 mw eller mer. Flere for tiden

i kommersielt tilgjengelige lasere oppfyller disse kriterier.

Tetrapyrrolene kan fremstilles etter forskjellige syntetiske metoder som finnes i litteraturen, f.eks.:

Feoforbider

Willstatter, R., Stoll, A.; Investigations on Chlorophyll, (Transl. Schertz, FM.M., Merz, A.R.) s. 249. Science Prin-ting Press, Lancaster, Pennsylvania, 1928.

Pennington, F.C., Strain, H.H. , Svec, W.A. , Katz, J.J.; J.

Amer. Chem. Soc., 86, 1418 (1964.)

Klorin e^.

Willstatter, R., Stoll, A.; Investigations on Chlorophyll, (Trans., Schertz, F.M., Merz, A.R.) s. 176. Science Prin-ting Press, Lancaster, Pennsylvania, 1928.

Willstatter, R., Isler, M.; Ann. Chem., 390, 269 (1912). Fisher, H., Baumler, R., Ann. Chem., 474, 65 (1929). Fisher, H., Siebel, H.; Ann. Chem., 499, 84 (1932).

Conant, J.B. , Mayer, W. W. ; J. Amer. Chem. Soc, 52, 3013

(1930) .

Klorin e^

Fisher, H., Heckmaier, J., Plotz, E.; Justus Leibigs Ann. Chem., 500, 215 (1933) .

Klorin eg, e^, isoklorin e^, mesoklorin eg, bacteriofeofor-bid, bakterioklorin eg

Fisher & Orth, "Des Chemie des Pyrrole" Akademische Verlazs-gesellschaft, Leipzig, 1940, vol. II, del 2.

Generell referanse for porfyriner

"Porphyrins and Metalloporphyrins", red. Kevin M. Smith, Elsevier 1975 N.Y.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan administreres til verten i et utall former tilpasset den valgte administreringsmåte, dvs. oralt, intravenøst, intramuskulært eller subkutant.

Eksempel 1

Di-( D, L)- aspartyltransmesoklorin IX ( carbodiimidmetode)

140 mg transmesoklorin og 200 mg (D,L)-aspartinsyre-dimethylester-hydroklorid ble oppløst i 30 ml dimethylformamid. 30 0 mg N,N'-dicyclohexyl-carbodiimid ble tilsatt. Reaksjonsblandingen fikk stå i en time, hvoretter ytterligere 30 mg carbodiimid ble tilsatt. Prosedyren ble gjentatt to ganger, hvorpå reaksjonsblandingen fikk stå over natten.

Reaksjonen ble overvåket ved tynnsjiktskromatografi på silica, under anvendelse av løsningsmiddelsystemet benzen/ methanol/88% maursyre 8,5/1,5/0,13 V/V/V.

Det disubstituerte klorin har den høyeste Rf-verdi, det usubstituerte klorin har den laveste, mens de monosubstituerte isomerer ligger mellom disse og er uoppløste.

Etter henstand over natten syntes reaksjonsblandingen å inneholde minst 50% av det disubstituerte klorin. Løs-ningsmiddelet ble fjernet under vakuum, og det gjenværende faste materialet ble oppløst i 50 ml 3N HCl.

Oppløsningen fikk stå ved romtemperatur i 48 timer for å hydrolysere estergruppene, hvoretter klorinblandingen ble utfelt ved pH 2,5-3 og ble oppsamlet og vasket med vann i sentrifugen. Klorinblandingen ble renset ved oppløsning i 0,05 M NH^OH og innføring i en omvendt fasekolonne (C-18 silica) på 2,5 x 30 cm. Elueringsprosedyren omfattet en lineær gradient fra 40-70% methanol i 0,01 M KP04~buffer ved pH 6,85 (totalt volum på 1 liter).

Det førende ferske bånd (di-D,L-aspartyltransmesoklorin IX) ble oppsamlet og flashfordampet for å fjerne methylalkoholen, løsningen ble deretter utfelt ved pH 2,5-3 og ble oppsamlet og vasket tre ganger i sentrifugen med fortynnet eddiksyre. Produktet ble vakuumtørket. Utbyttet var 67 mg av di- (D,L) aspartyltransmesoklorin IX.

Eksempel 2

Di- og mono-( L)- glutamyltransmesoklorin IX ( blandet anhydridmetode 50 mg (0,000087 mol) transmesoklorin IX ble oppløst i 100 ml tetrahydrofuran (THF) . 210 ,ul (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 195/ul (0,00179 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 50 ml (0,01 mol) 0,2 M KOH, inneholdende 250 mg (0,00169 mol) (L)-glutaminsyre, dråpevis tilsatt under om-<5> røring til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble drevet av, og reaksjonsblandingen ble analysert ved tynnsjiktskromatografi

(TLC) på silica med hensyn til produkt. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvenelse av en lineær gradient på 40-80% methanol i <0>,<01> M <K>P04_buffer ved pH 6/85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var di- (L) glutamyltransmesoklorin IX, mono- (L) glutamyltransmesoklorin IX, og usubstituert transmesoklorin IX.

Methanolen ble drevert av, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket.

Eksempel 3

Di- og mono-( D, L)- aspartylfotoprotoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

313,4 mg fotoprotoporfyrin IX (isomerblanding) ble oppløst i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 210 ,ul triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 210 ,ul ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 50 ml 0,2 m KOH, inneholdende 450 mg (D,L)-aspartinsyre, tilsatt til

THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i en time ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble drevet av, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble pH på blandingen justert til 7,5-8,0, og løsningen ble anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient av 40/80% MeOH i 0,01 M KP04~buffer ved pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter.

Methanolen ble drevet av, og materialet ble utfelt ved pH 3,0-3,5. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket. Utbyttet av mono-(D,L)-aspartylfotoprotoporfyrin IX var 54 mg. Utbyttet av di-(D,L)-aspartylfotoprotoporfyrin IX var 227,8 mg.

Eksempel 4

Di- og mono-( L)- aspartylprotoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

100 mg protoporfyrin IX ble oppløst i 100 ml p-dioxan. 210 ,ul triethylamin ble tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 50/11 0,2 M KOH, inneholdende 500 mg (L)-aspartinsyre, tilsatt til dioxanløsningen. Denne blanding ble omrørt i en time ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble drevet av, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC for produkt. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble pH på løsningen justert til pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 40-70% methanol i 0,01 M KP04~buffer ved pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter.

Methanolen ble drevet av, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble deretter vakuum-

' tørket. Utbyttet av mono-(L)-aspartylprotoporfyrin IX var 12,3 mg, og utbyttet av di-(L)-aspartylprotoporfyrin IX var 54 mg.

Eksempel 5

Di- og mono-( L)- aspartylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

200 mg mesoporfyrin IX ble oppløst i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 210 /al triethylamin ble tilsatt til THF-løsningen. Etter 10 min. omrøring ble 210 ,ul ethylklorformiat tilsatt, og blandingen ble omrørt i 10 min. 50 ml 0,2 M KOH, inneholdende 500 mg (L)-aspartinsyre, ble tilsatt til THF-løsningen, og blandingen ble omrørt i en time ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket for produkt ved silica TLC under anvendelse av benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble pH på blandingen justert til 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient av 40-80% methanol i 0,01 M KP04~buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 3,0-3,5. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket under dannelse av et utbytte på 41,5 mg mono-(L)-aspartylmesoporfyrin og 175,1 mg di-(L)-aspartylmesoporfyrin.

Eksempel 6

Di- og mono-( L)- aspartyldeuteroporfyrin IX ( blandet anhydridmetode

100 mg deuteroporfyrin IX ble oppløst i 50 ml p-dioxan. 210 ,ul triethylamin ble tilsatt under omrøring.

Etter 10 min. ble 210 ,ul isobutylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 50 ml 0,2 M KOH, inneholdende 500 mg L-aspartinsyre, tilsatt til dioxanløsningen. Denne løsning ble omrørt i en time ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC. Benzen/methanol/88% raaursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble pH på blandingen justert til 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 40-70% methanol i 0,01 M KP04~buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter.

MeOH ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket. Utbyttet av mono-(L)-aspartyldeuteroporfyrin IX var 10 mg.

Eksempel 7

( L)- aspartylpyrofeoforbid a ( blandet anhydridmetode)

80 mg pyrofeoforbid a ble oppløst i 100 ml tetrahydrofuran (THF) . 210 ,ul trietylamin ble tilsatt til THF-løsningen. Etter 10 min. omrøring ble 210 ,ul ethylklorformiat tilsatt, og blandingen ble omrørt i 10 min. 50 ml 0,2 M KOH, inneholdende 500 mg (L)-aspartinsyre, ble tilsatt til THF-løsningen, og blandingen ble omrørt i en time ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket for produkt ved silica TLC under anvendelse av benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble pH på blandingen justert til 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient av 40-80% methanol i 0,01 M KOH-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 3,0-3,5. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket under dannelse av et utbytte på 62 mg (L)-aspartylpyrofeoforbid a.

Eksempel 8

Tetra-, tri- og di- ( D, L)- aspartylcoproporfyrin III ( blandet anhydridmetode)

150 mg coproporfyrin III ble oppløst i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 210/11 triethylamin ble tilsatt, og om-røringen ble fortsatt ved 20°C i 10 min. 210 ,ul ethylklorformiat ble deretter tilsatt, og blandingen ble omrørt i 10 min. 50 ml 0,2 M KOH, inneholdende 25 0 mg (D,L)-aspartinsyre ble tilsatt til THF-løsningen. Denne blanding ble deretter omrørt i en time.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC under anvendelse av følgende løsningsmiddelsystem: benzen/methanol/88% maursyre (8,5/4,0/0,2).

pH på blandingen ble deretter justert til 7,5-8,0 og ble kromatografert på en omvende fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av 5-50% methanol i 0,01 M KP04~buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 3,0-3,5. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktene ble tørket under vakuum, og utbyttene var som følger: tetra-(D,L)-aspartylcoproporfyrin III 94 mg, Tri-(D,L)-aspartyl-coproporf yrin III 77,2 mg, di-(D,L)-aspartyl coproporfyrin III 28,4 mg.

Eksempel 9

Di- og mono- ( DL)- aspartyldeuteroporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

175 mg (0,00195 mol) deuteroporfyrin IX ble oppløst i 200 ml tetrahydrofuran (THF). 210 ,ul (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 210 ,ul (0,0019 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 50 ml (0,01 mol) 0,2 M KOH, inneholdende 200 mg (0,003 mol) (DL)-aspartinsyre, tilsatt dråpevis under om-røring til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC for produkt. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient av 40-65% methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var: di-(DL)-aspartyldeuteroporfyrin IX, mono-(DL)-aspartyldeuteroporfyrin IX og usubstituert deuteroporfyrin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket.

Eksempel 10

Di- og mono-( DL)- aspartylhematoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

400 mg (0,0059 mol) hematoporfyrin IX ble oppløst i 50 ml tetrahydrofuran (THF). 360 /il (0,0034 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 340 ,ul (0,0031 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH, inneholdende 600 mg

(0,0045 mol) (DL)-aspartinsyre, tilsatt til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 90 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC for produkt. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 20-70% methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var: di-(DL)-aspartylhematoporfyrin IX, mono-(DL)-aspartylhematoporfyrin IX og usubstituert hematoporfyrin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket.

Eksempel 11

Di- og mono-( D, L)- aspartylprotoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode

300 mg (0,00053 mol) protoporfyrin IX ble oppløst i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 210 /il (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 210 ,ul (0,0019 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 50 ml (0,01 mol) 0,2 M KOH, inneholdende 450 mg (0,0033 mol) (D,L)-aspartinsyre, dråpevis tilsatt under om-røring til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC for produkt. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og ble anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 40-65% methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var: di--(D,L)-aspartylprotoporfyrin IX, mono-(D,L)-aspartylprotoporfyrin IX og usubstituert protoporfyrin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket.

Eksempel 12

Mono-( DL)- aspartylpyrofeoforbid a ( blandet anhydridmetode)

100 mg (0,00187 mol) pyrofeoforbid a ble oppløst i 100 mg tetrahydrofuran (THF). 210 /il (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 210 ,ul (0,0019 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 50 ml (0,01 mol) 0,2 M KOH, inneholdende 200 mg (0,0015 mol) (DL)-aspartinsyre, tilsatt til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC for produkt. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 40-80% methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var: mono-(DL)-aspartylpyrofeoforbid a og deretter usubstituert pyrofeoforbid.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket.

Eksempel 13

Di- og mono- L- alfa- aminoadipyltransmesoklorin IX ( blandet anhydridmetode)

500 mg (0,000087 mol) transmesoklorin IX ble oppløst i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 210 jai (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 210 ,ul (0,0019 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 50 ml (0,01 mol) 0,2 M KOH, inneholdende 250 mg (0,00155 mol) L-alfa-aminoadipinsyre, dråpevis tilsatt under omrøring til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC for produkt. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 40-80% methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var: di-L-alfa-aminoadipyltransmesoklorin IX og usubstituert transmesoklorin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket.

Eksempel 14

Di- og mono-( D)- aspartylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

200 mg (0,00035 mol) mesoporfyrin IX ble oppløst i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 210 ,ul (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 210 ,ul (0,0019 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 50 ml (0,01 mol) 0,2 M KOH, inneholdende 500 mg (0,0038 mol) D-aspartinsyre, tilsatt dråpevis under omrøring

til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC for produkt. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og ble anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient av 40-48% methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var: di-(D)-aspartylmesoporfyrin IX, mono-(D)-aspartylmesoporfyrin IX og usubstituert mesoporfyrin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket.

Eksempel 15

Di- og mono-( L)- glutamylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

400 mg (0,007 mol) mesoporfyrin IX ble oppløst i 50 ml tetrahydrofuran (THF). 360 ,ul (0,0035 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 340,ul (0,0031 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH, inneholdende 543 mg (0,00369 mol) L-glutaminsyre, tilsatt til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC for produkt. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet. Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og ble anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient av 25-60% methanol i 0,01 M KP04~buffer, pH 6,85 (11 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var: di-(L)-glutamylmesoporfyrin IX, mono-(L)-glutamylmesoporfyrin IX og usubstituert mesoporfyrin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket.

Eksempel 16

Di- og mono-( D)- aspartyltransmesoklorin IX ( blandet anhydridmetode i 1, 4- dioxan) 50 mg (0,000087 mol) transmesoklorin IX ble oppløst i 50 ml 1,4-dioxan. 210 ,ul (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 210 ,ul (0,0019 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 50 ml (0,01 mol) 0,2 M KOH, inneholdende 500 mg (0,0038 mol) D-aspartinsyre, tilsatt dråpevis under omrøring til THF-løs-ningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur .

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC for produkt. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og ble anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 40-80% methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var: di-(D)-aspartyltransmesoklorin IX, mono-(D)-aspartyltransmesoklorin IX og usubstituert transmesoklorin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket.

Eksempel 17

Di- og mono-( L)- aspartyltransmesoklorin IX ( blandet anhydridmetode i tetrahydrofuran)

135 mg (0,00023 mol) transmesoklorin IX ble oppløst i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 210 ,ul (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 210 ,ul (0,0019 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 50 ml (0,015 mol) 0,3 M KOH, inneholdende 750 mg (0,0056 mol) L-aspartinsyre, dråpevis tilsatt under omrøring til THF-løsningen. Denne løsning ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC for produkt. Benzen/methanol/88% maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og ble anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 40-80% ethanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsam-ler, og rørinnholdet ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var: di-(L)-aspartyltransmesoklorin IX, mono-(L)-aspartyltransmesoklorin IX og usubstituert transmesoklorin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble vakuumtørket.

Eksempel 18

( D, L)- aspartylfeoforbid a ( carbodiimidmetode)

55 mg feoforbid a ble oppløst i 10 ml dimethylformamid. 50 mg (D,L)-aspartinsyredimethylester-dihydroklorid ble tilsatt, hvoretter 100 mg N,N'-dicyclohexyl-carbodiimid ble tilsatt. Reaksjonsblandingen fikk stå i mørket ved romtemperatur i en time, hvorpå ytterligere 50 mg carbodiimid ble tilsatt. Etter henstand i ytterligere en time ble ytterligere 50 mg carbodiimid tilsatt, og reaksjonsblandingen fikk stå i mørket i 12 timer ved romtemperatur.

Løsningsmiddelet ble fjernet under vakuum, og produktet ble oppløst i 50 ml 1% KOH i methanol med 0,5 ml vann og fikk stå i mørket ved romtemperatur. Hydrolyseforløpet ble fulgt ved tynnsjiktskromatografi (C-18-plater med løs-ningsmiddelet 75/25 MeOH/0,01 M, pH 6,85, KP04~buffer).

Når hydrolysen av estergruppene var hovedsakelig fullført, ble reaksjonen avsluttet ved tilsetning av noen få dråper iseddik. Methanolen ble fjernet under vakuum, og produktet ble oppløst i 20 ml 0,1 M NH^OH. Denne løsning ble anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 1,5 x 30 cm. Elueringsprosedyren omfattet en lineær gradient på fra 50 til 80% methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (500 ml totalt volum).

Det dominerende grønngrå vann, inneholdende (D,L)-aspartylfeoforbid a som ble oppsamlet, ble flashfordampet for å fjerne methylalkoholen og ble utfelt ved pH 3. Bunnfallet ble oppsamlet og vasket tre ganger i sentrifugen med fortynnet eddiksyre. Utbyttet av tørt produkt var 27 mg.

Eksempel 19

L- monoaspartylklorin eg ( carbodiimidmetode)

150 mg klorin eg og 250 mg L-aspartinsyre-di-t.-butylester-hydroklorid ble oppløst i 20 ml dimethylformamid. Totalt 300 mg tilsetninger av N,N<1->dicyclohexyl-carbodiimid ved en times intervaller ble foretatt. Etter fire timer ble reaksjonsblandingen fortynnet med 300 ml ether, vasket to ganger med 200 ml vann og ble deretter ekstrahert med 40 ml 1 M KOH. KOH-løsningen fikk hydrolysere over natten og ble deretter oppvarmet til 70°C i 10 min.

pH på løsningen ble justert til 7, hvoretter enhver restether ble fjernet ved flashfordampning. Løsningen ble deretter påført på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 1,5 x 30 cm. Produktet ble renset ved en trinnvis eluering med methanol/0,01 M, pH 6,85, KP04~buffer. Elueringen ble fortsatt med 5% methanol inntil uønskede polare pigmenter var fjernet. Monoaspartylklorin eg ble eluert fra med 6-8% methanol, og uomsatt klorin eg ble fjernet med 25% methanol.

Produktet ble utfelt ved pH 3 etter flashfordampning for å fjerne methanolen og ble deretter vasket i sentrifugen tre ganger med fortynnet eddiksyre. Produktet ble tørket under vakuum. Utbyttet av L-monoaspartylklorin eg var 50 mg.

Eksempel 20

L- glutamylklorin e^ ( carbodiimidmetode)

110 mg klorin e4 og 220 mg L-glutaminsyre ble oppløst i 15 ml dimethylformamid. 85 mg N,N'-dicyclohexyl-carbodiimid ble deretter tilsatt, og løsningen ble omrørt i en time ved romtemperatur. Ytterligere 42 mg carbodiimid ble tilsatt, hvoretter 50 mg carbodiimid ble tilsatt ved en times intervaller med ytterligere to tilsetninger. Reaksjonsblandingen fikk deretter stå i 12 timer, 50 mg carbodiimid ble tilsatt, og reaksjonsblandingen fikk stå i tre timer. Reak-sjonsforløpet ble fulgt ved omvendt fasetynnsjiktskromato-grafi 80% methanol, 20% KP04~buffer (0,01 M, pH 6,85). Ytterligere 50 mg carbodiimid ble tilsatt, og etter henstand ble det ikke påvist noen ytterligere produktdannelse.

200 ml ether ble tilsatt til reaksjonsblandingen, og etherløsningen ble vasket fire ganger med vann, ca. 100 ml pr. vask. Etheren ble deretter fjernet ved flashfordampning, og produktet ble destillert i ca. 25 ml 3 N HCl. Etter 48 timer ved romtemperatur ble løsningen justert til pH 3 med

NH^OH, og bunnfallet ble oppsamlet og vasket på sentrifugen. Produktet ble oppløst i 20% methanol/vann med litt NH^OH og ble anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 1,5 x 30 cm. Elueringen ble fortsatt med 20% MeOH, KP04~buffer (0,01 M, Ph 6,85). Dette fjernet produktet L-glutamylklorin e4. Methanolkonsentrasjonen ble øket for å fjerne uomsatt klorin e4>

Løsningen ble flashfordampet inntil methanolen var fjernet, hvoretter produktene ble utfelt ved pH 3 ved tilsetning av HCl, ble oppsamlet og vasket på sentrifugen med fortynnet eddiksyre og ble tørket under vakuum. Utbyttet av mono-L-glutamylklorin e4 var 21 mg. Utbyttet av gjenvunnet klorin e4 var 59 mg.

Eksempel 21

L- monoglutamylkolorin eg ( carbodiimidmetode)

13 0 mg klorin eg og 260 mg L-glutaminsyredimethyl-ester-hydroklorid ble oppløst i 18 ml dimethylformamid. 100 mg N, N1-dicyclohexy1-carbodiimid ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble omrørt i en time. Ytterligere 50 mg carbodiimid ble tilsatt. Etter en time inneholdt reaksjonsblandingen 75-80% av det monosubstituerte produkt som vist ved fase-TLC (C-18-plater med 70% MeOH, 30% 0,01 M KP04, pH 6,85). 200 ml diethylether ble tilsatt, blandingen ble vasket to ganger med 100 ml vann og ble deretter ekstrahert med 30 ml 1 M KOH.

Produktet fikk hydrolysere i mørket i KOH-løsningen i 12 timer og ble deretter oppvarmet til 70°C i 10 min. for å fullføre hydrolysen av estergruppene. Produktet ble deretter fraskilt ved omvendt fasekolonnekromatografi (C-18 omvendt fasekolonne, 1,5 cm x 30 cm) under anvendelse av trinnvis gradienteluering med methanol i buffer. 0,01 M KP04, pH 6,85, 5% methanol fjernet polare urenheter. Monoglutamyl-klorin eg ble eluert med 6-8% methanol. Klorin eg ble eluert fra kolonnen med 25% methanol. Methanolen ble fjernet ved flashfordampning, og L-monoaspartylklorin eg ble utfelt ved pH 3, ble oppsamlet og vasket tre ganger på sentrifugen med fortynnet eddiksyre og ble tørket under vakuum. Utbytte 40 mg.

Eksempel 22

Mono- og di-( L)- aspartylklorin eg ( carbodiimidmetode)

400 mg klorin eg og 1 g L-aspartinsyredibenzylester-p-tosylat ble oppløst i 75 ml dimethylformamid. Temperaturen på løsningen ble opprettholdt ved 65-70°C under omrøring, og 100 mg N,N'-dicyclohexy1-carbodiimid ble tilsatt. (Totalt tre tilsetninger ble foretatt ved to timers intervaller). Løsningen ble omrørt ved denne temperatur i totalt 20 timer, ble deretter sjekket ved TLC (omvendt fase) (C-18-silica-plate), 70% methanol, 30% 0,01 M, pH 6,85, KP04~buffer). TLC viste mer enn 50% monosubstitusjon med noe disubstitu-s jon.

150 ml ether ble tilsatt, og blandingen ble omrørt med 100 ml vann og noen få dråper iseddik. Etherfasen ble fraskilt, og den vandige fase ble ekstrahert flere ganger med 10 0 ml ether. Etherekstraktene ble kombinert og vasket med 100 ml vann fire ganger for å fjerne dimethylformamid.

Aspartylklorin e^-estrene ble deretter ekstrahert i 100 ml 1 M KOH (fire ekstraksjoner på hver 25 ml). KOH-løs-ningen fikk stå ved omgivende temperatur i 24 timer for å hydrolysere. Komponentene ble separert ved nøytralisering av løsningen til pH 7 og anbringelse på en omvendt fase-(C-18 silica) kolonne på 1,5 x 30 cm. Elueringen ble utført under anvendelse av 1 1 gradient på 30% methanol til 80% methanol med 0,1 M, pH 6,85, KP04~buffer. Fraksjoner ble oppsamlet og karakterisert ved TLC. Elueringsrekkefølgen var: di-(L)-diaspartylklorin eg, L-monoaspartylklorin eg og klorin eg. Methanolen ble fjernet ved flashfordampning, og de individuelle komponenter ble utfelt ved pH 3 under anvendelse av HCl.

Produktene ble oppsamlet ved sentrifugering, ble vasket flere ganger med meget fortynnet eddiksyre og ble tørket under vakuum. Utbyttet var 23,8 mg.

Fysikalske karakteristika for representative forbindelser (relativ polaritet) ble målt med et standard kroma-tografisk system.

Eksempel 23

Fremstilling av et metallsalt

Natriumsaltet av porfyrinaminosyreadduktet ble fremstilt ved å oppløse angitte addukt i vann inneholdende en ekvimolar mengde natriumhydroxyd, hvorpå den resulterende blanding ble frysetørket. På denne måte ble andre metallsalter fremstilt innbefattende kalium, calcium og lithium-salter.

Fremstilling av et syresalt

Aminosyreporfyrinadduktet beskrevet i de foregående eksempler ble omdannet til syresalter, f.eks. hydroklorid, ved oppløsning i en vandig løsning inneholdende en ekvi-valent mengde syre, f.eks. saltsyre, hvoretter løsningen ble fordampet til tørrhet under dannelse av det faste salt. Alternativt kan alkoholiske løsninger av hydrogenkloridgass, oppløst i ethanol, anvendes i stedet for den vandige syre-løsning, og syresaltet erholdes ved fordampning av løsnings-middelet eller ved krystallisering fra alkoholen, f.eks. ved tilsetning av et ikke-løsningsmiddel.

De etterfølgende forsøk beskriver prosedyren for anvendelse av disse nye forbindelser ved behandling av rotte-tumorer.

Eksempel . 24

De fotodynamiske behandlingsforsøk ble utført under anvendelse av forbindelsen mono-(L)-aspartylklorin eg. To transplanterbare tumorlinjer i Buffalorotter ble anvendt, Morris Hepatoma 7777 og Morris Hepatoma 5123 tc. Tumorene ble transplantert subkutant på utsiden av låret. Under behandlingen varierte tumorene i størrelse mellom 1 og 2,5 cm i diameter.

Den generelle behandlingsprosedyre var som følger: Dyrene ble injisert med en løsning av klorinet fremstilt som følger: 20 mg av natriumsaltet av klorinet ble oppløst i 1 ml 0,9% NaCl. Klorinløsningen ble deretter injisert intra-venøst gjennom den ytre halsvene mens rottene var bedøvet med ether. Volumet av den injiserte løsning var beregnet basert på vekten av dyret og dosen, på en vekt til vekt-basis, for hvert bestemt forsøk. Et spesifisert tidsinter-vall fikk deretter forløpe før lysbehandlingen ble satt i gang.

Lysbehandlingen av rottene ble utført uten bedøvelse.

Rottene ble fastspent, håret ble fjernet i behandlingsområdet og ble behandlet med laserlys fra en Cooper Aurora argonpumpe, avstembar fargelaser.

Laseren var utstyrt med et fiberoptisk lysutleveringssystem koplet til et mikrolinsesystem utviklet av dr. Daniel Doiron, D.R.D. Consulting, Santa Barbara, California.

Linsene dispergerer laserstrålen og tilveiebringer en sirkulær fordeling av lys med homogen lysintensitet gjennom området av den innfallende lysstråle. Bølgelengden av lyset ble justert under anvendelse av et Hartridge reversjonsspek-troskop. Lysintensiteten ble bestemt under anvendelse av et Yellow Springs Instrument, modell 65A, radiometer.

Mikrolinsene var anordnet i en slik avstand fra huden på dyret at det ble tilveiebrakt en belysningsdiameter på 1,5 cm, og lysfluxen ble variert ved kontroll av laserut-gangen.

Etter belysningen fikk dyrene vende tilbake til .burene, og 24 timer senere ble de behandlet intravenøst i den ytre halsvene med 14 mg Evans Blue fargestoff, oppløst i 250yul 0,9% NaCl. To timer etter injeksjonen ble dyrene avlivet, og tumoren ble snittet vinkelrett. Graden av tumornekrose ble bestemt ved mangel på fargeopptak ^, og dybden av det nekrotiske tverrsnitt av tumoren ble nedtegnet i mm.

Tabell II angir effektene av disse legemidler på

tumorer og innbefatter et område for bølgelengder, doser, intensiteten og tidsintervaller for behandling. Dette var nødvendig for å fastslå de optimale betingelser for fototerapi under anvendelse av dette nye legemiddel. De be-skrevne betingelser førte til en målbar og signifikant skade

på tumorene.

i I alle tilfeller, bortsett fra hvor det spesielt er angitt, oppsto vevskade selektivt på tumorvevet som bestemt ved Evans Blue-metoden, selv om normal hud i nesten alle tilfeller lå over tumoren og behandlingsområdet overlappet signifikant områder med normalt muskelvev.

De fotodynamiske terapidata er presentert i tabell-form. Spalte 2 er den totale administrerte lysdose uttrykt i joule pr. cm 2. Spalte 3 er dosen av administrert mono-(L)-aspartylklorin eg uttrykt i mg legemiddel pr. kg kroppsvekt. Spalte 4 er tidsintervallet mellom administrering av legemiddel og behandling med laserlys. Spalte 5 er bølge-lengden for behandlingslyset i nanometer. Spalte 6 er intensiteten av behandlingslyset i mW pr. cm 2. I spalte 7 angir x dybden av nekrose i mm av tumorvev, dvs. distansen fra den nekrotiske topp av tumoren nærmest huden til den nekrotiske kant av tumoren fjernet fra huden.

S.D. er standardavvik av x.

(N) er antall tumorer eller ben involvert i forsøket.

Spalte 8 er området for dybden av nekrose i mm innen gruppen.

^ M.C. Berenbaum, Br. J. Cancer £5: 571 (1982).

Eksempel 2 5

PDT- forsøk med mus og mono-( L)- aspartylklorin e^

PDT med mono-L-aspartylklorin eg tetranatriumsalt ble vurdert i et annet dyr/tumor-modellsystem.

Tumoren, SMT-F, ble transplantert subkutant i skul-deren/ r ibbenområdet (bare én side) av DBA/2 Ha ROS D+ Ha-mus. Behandlingsprosedyren ble startet når tumoren hadde nådd en dimensjon på 1,5-2 cm's lengde, 1 cm's bredde og 0,7-1 cm's dybde (ca. 7-8 dager etter transplantering). Legemiddelet ble administrert via intraperitoneal injeksjon i en konsentrasjon på 4 mg/ml. Spesifikke parametre og resultater er angitt i etterfølgende tabell. Vurderingen ble foretatt 24 timer etter lysbehandlingen under anvendelse av beismiddelet Evans Blue i en prosedyre lik den som ble anvendt for vurdering av tumornekrose i Buffalorotter, med den eneste forskjell at det ble foretatt en intraperitoneal injeksjon av fargestoff i en dose på 5 mg pr. mus. Over-skriftene i hver kolonne er de samme som ved rottesystemet.

Ingen indikasjon på nekrose av normalt vev (muskel eller hud) ble observert.

Liknende resultater ble erholdt når forbindelsene fremstilt ifølge eksemplene 1-22, ble administrert til en liknende forbehandlet mus.

Eksempel 2 6

PDT- forsøk med rotter og mono- L- glutamylklorin e^

Buffalorotter med Morris Hepatoma 7777 transplantert subkutant på utsiden av hver bakfot ble underkastet foto-dynamisk behandling under anvendelse av mono-L-glutamylklorin eg som legemiddel.

Forsøksprosedyren var den samme som ble anvendt for testing av mono-L-aspartylklorin eg. De spesifikke parametre og resultatene er oppført i den etterfølgende tabellen.

Ingen synlig skade som bestemt ved Evans Blue-metoden på overliggende hud eller normalt muskelvev som omga tumoren ble observert, selv om arealet med en diameter på 1,5 cm av lysbehandlingen overlappet normalt vev i flere tilfeller.

Spalte 1 er den totale administrerte lysdose uttrykt i joules pr. cm 2. Spalte 2 er dosen av administrert klorin uttrykt i mg legemiddel pr. kg kroppsvekt. Spalte 3 er tids-rommet mellom administrering av legemiddel og behandling med laserlys. Spalte 4 er bølgelengden på behandlingslyset i nanometer. Spalte 5 er intensiteten av behandlingslyset i mW pr. cm 2. I spalte 6 er x den midlere dybde av nekrose i mm av tumorvevet, dvs. distansen fra den nekrotiske topp av tumoren nærmest huden til den nekrotiske kant av tumoren lengst bort fra huden. S.d. er standardavvik av x, (n) er antall tumorer eller ben innbefattet i forsøket. D er den midlere diameter av tumornekrosen, og s.d. er standardavvik for D.

Liknende resultater ble erholdt når forbindelsene 1-22 ifølge de foregående eksempler ble administrert til liknende forbehandlede rotter.

Eksempel 2 7

PDT- forsøk med mus og mono- L- aspartylklorin e^

SMT-F-tumor i DBA/2 Ha ROS D+ Ha-mus ble anvendt for å vurdere den fotodynamiske effekt av mono-L-glutamylklorin eg tetranatriumsalt.

Prosedyren var den samme som i forsøket innbefattende mono-L-aspartylklorin eg, og kolonneoverskriftene er de samme som de som ble anvendt i dette rottesystem.

Eksempel 28

Humane celler (HeLa, stamme D98/AH2) ble inkubert i 25 cm 2 plastdyrkningskolbe i 24 timer for å muliggjøre binding. De ble deretter skylt, inkubert i 10 min. perioder i Ham's F-12-medium inneholdende porfyriner, skylt igjen i Ham's F-12-medium uten porfyriner i 5 min. og ble deretter belyst i forskjellige tidsrom og dyrket ved 37°C i fullsten-dig medium i 24 timer. Celletellinger ble deretter foretatt under anvendelse av et fasekontrastmikroskop av fraksjonen av overlevende celler. Den anvendte bredbåndede glødelys-kilde ble justert til å gi en innfallende lysintensitet på 5 x 10 5 erg cm -1. En stillbar anordning muliggjorde belysning av hvert av fem områder av kolben i forskjellige tidsrom, idet et område ikke ble belyst og tjente som en mørk kontroll. Dette ga en doseoverlevelseskurve for fire lysdoser fra en enkelt kolbe, og denne teknikk er således egnet for en hurtig og økonomisk undersøkelse av et stort antall potensielle fotosensibiliserende midler. Resultatene av dette forsøk er vist i tabell III.

Eksempel 29

Undersøkelse av porfyrinfluorescens som en funksjon av molekylstruktur

To transplanterbare tumorlinjer i Buffalorotter ble anvendt, Morris Hepatoma 7777 og Morris Hepatoma 5123tc. Tumorene ble transplantert intramuskulært på baksiden av låret på rottene. Etter 10-14 dager når tumoren nådde egnet størrelse, ble 2 mg (0,5 ml) av en aminosyreporfyrinaddukt-løsning administrert intraperitonealt i rottene. Aminosyre-porfyrinadduktløsningen ble fremstilt som følger: 4 mg av aminosyreporfyrinet ble oppløst i 0,1 M NaOH og justert til fysiologisk pH med 1 M HCl.

Rottene ble drept 24 timer etter injeksjonen. Tumoren ble delt i to in situ. Porfyrinfluorescens ble bestemt under en UV-lyskilde med konstant intensitet. Tabell IV, V, VI og VII angir de testede porfyrinderivater. Forbindelsene er

gruppert alfabetisk.

Etter navnet på porfyrinet er angitt et tall som indikerer det totale antall av undersøkte tumorer. Den neste spalte i figurene (A) er et tall beregnet som følger: porfyrinfluorescensen innen tumoren ble rangert visuelt av en person under en UV-lyskilde med konstant intensitet i henhold til skalaen 0, +1/2, 1, 2, 3, 4. Dette tall ble deretter multiplisert med den prosent av tumoren som utviste denne fluorescens, dvs. (+1/2) (80%) + (+1) (10%) = 50. Som regel representerer A-verdien i tabellen gjennomsnitt erholdt i flere serier av separate forsøk utført ved forskjellige tidspunkter.

"C-verdien" for hver tumor er "A-verdien" for denne tumor dividert med den midlere diameter av tumoren i cm.

En tidsstudie på 12-24 timer ble også utført på enkelte av tumorene. Prosedyren er den samme som ovenfor angitt, med det unntak at 1 mg av aminosyreadduktet ble anvendt. Resultatene er også angitt i tabell IV.

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt tetrapyrrol-amino-dicarboxylsyreaddukt, anvendelig til fotodiagnostisering og fotobehandling av tumorer, med formel: eller de tilsvarende di- eller tetrahydrotetrapyrroler hvori R9 er H, COOH, CH2COOH, CH2COR eller methyl; forutsatt at når Rx, R2, R3, R4, R7 og R8 betegner to substituenter eller er divalente og bundet til samme carbonatom, er den respektive pyrrolring til hvilken de er bundet et dihydropyrrol; R er aspartyl, glutamyl, aminoadipyl eller estere derav; hvor esteren er en methylester eller isoamylester og hvor minst en av R2, R4, R6, R7 eller R9 inneholder gruppen R R6 og R9 er sammen forutsatt at minst en av Ri-R9 innbefatter en dicarboxylgruppe og salter derav, karakterisert ved at tetrapyrrolet med den ovenfor angitte formel, hvor R=OH omsettes med én eller flere amino-dicarboxylsyrer i et egnet løsningsmiddel under amiddannende betingelser, og eventuelt at det erholdte produkt omdannes til et salt.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av monoaspartylmesoporfyrin IX, eller diaspartylmesoporfyrin IX, eller monoglutamyltransmesoklorin IX, eller di-L-glutamyltransmesoklorin IX, eller diaspartyltransmesoklorin IX, eller diaspartyldeuteroklorid IX, eller monoglutamylklorid e4, eller monoaspartylcoporfyrin III, eller diaspartylcoporfyrin III, eller triaspartylcoporfyrin III, eller tetraaspartylcoporfyrin, III, eller monoaspartylfeoforbid a, eller monoaspartylpyrofeoforbid a, eller mono- eller diaspartylprotoporfyrin IX, eller mono- eller diaspartylfotoprotoporfyrin IX, L-isomerene derav, D-isomerene derav og racemiske blandinger derav, karakterisert ved at tilsvarende utgangsfor-bindelser anvendes.