NO169292B

NO169292B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive tetrapyrrol-amino-monocarboxylsyreaddukter

Info

Publication number: NO169292B
Application number: NO861722A
Authority: NO
Inventors: Jerry C Bommer; Bruce F Burnham
Original assignee: Nippon Petrochemicals Co Ltd
Priority date: 1985-04-30
Filing date: 1986-04-30
Publication date: 1992-02-24
Also published as: DE3686683D1; JPS625924A; NO861722L; ATE80297T1; AU5688986A; DK197386A; CA1314042C; US4977177A; EP0213272A3; DE3686683T2; EP0213272A2; DK197386D0; NO169292C; AU583373B2; DK168512B1; EP0213272B1; JPH0794392B2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive tetrapyrrol-amino-monocarboxylsyreaddukter, anvendelig til fotodiagnostisering og fotobehandling av tumorer og cancervev i det humane eller animale legeme.

Det er kjent å bestråle tumorer og cancervev i det menneskelige legeme med intenst lys etter administrering av et hematoporfyrinderivat i bølgelengdeområdet på 626 til 636 nanometer for å redusere - og enkelte ganger ødelegge - cancercellene (se PCT publisert patentsøknad WO 83/00811); Det er også kjent at porfyriner, spesielt natriumsaltet av protoporfyriner, kan opprettholde eller aktivere de normale funksjoner av celler og er anvendbare for å forhindre genese, vekst, metastase og tilbakefall av ondartede tumorer. Japansk publisert patentsøknad 125737/76 beskriver anvendelsen av porfyriner som tumorinhiberende midler, idet den eksemplifiserer etioporfyrin, mesoporfyrin, protoporfyrin, deuteroporfyrin, hematoporfyrin, coproporfyrin og uro-porfyrin.

I Tetrahedron Letters, nr. 23, s. 2017-2020 (1978) er det beskrevet et aminomonocarboxylsyreaddukt av pigmentet bonellin, erholdt ved ekstraksjon av i første rekke kropps-veggen av det marine echuroid B. viridis. Strukturen av disse addukter er antatt å være et amid dannet gjennom enhver av frie carboxygrupper av bonellin og aminomono-carboxylsyren. Hydrolyse av adduktet gir en blanding av valin, isoleucin, leucin og alloisoleucin. Ikke noen anvendelse for disse aminosyreaddukter er beskrevet i denne pub-likasjon.

At tetrapyrroler fremkaller intens fotosensibilitet i dyr, er velkjent og er blitt dokumentert i et utall av artikler i litteraturen, f.eks. J. Intr. Sei. Vitaminol. 27, 521-527 (1981); Agric. Biol. Chem. 46 (9), 2183-2193 (1982); Chem. Abst. 98, 276 (1983) og 88/ 6976m (1928).

De terapeutiske midler som tas i betraktning ifølge foreliggende oppfinnelse, er sykliske tetra-

pyrroler avledet ved forskjellige prosedyrer fra naturlig forekommende tetrapyrroler. De sykliske tetrapyrroler har

som felles modertetrapyrrol uroporfyrinogen og utviser følgende ringstruktur:

hvori posisjonene i molekylet er nummerert 1-20, og ringene identifisert ved bokstavene A, B, C og D, og som også innbefatter perhydro-, f.eks. dihydro- og tetrahydroderivater av angitte ringstruktur, f.eks. forbindelser hvori én eller flere dobbeltbindinger er fraværende. Det foreligger i ringsystemet fire pyrrolringer bundet gjennom a-stillingene av de respektive pyrrolringer med en methingruppe, dvs.. -CH=. Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen betegnes som derivater av tetrapyrrolene av praktiske grunner i foreliggende beskrivelse og de medfølgende krav, og det skal forstås at uttrykket "tetrapyrrol" betegner forbindelser med den ovenfor angitte karakteristiske ringstruktur, så vel som de tilsvarende perhydroderivater.

Tetrapyrrolene anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse er alle avledet på forskjellig måte og ved forskjellige alternative prosedyrer fra naturlige tetrapyrroler. De naturlig forekommende tetrapyrroler har som felles stamfar uroporfyrinogen III, et hexahydroporfyrin redusert ved bro-stillingene. Eksempelvis er syntetiske eller biosyntetiske derivater eller produkter av protoporfyrin IX eller proto-porfyrinogen IX velkjent innen faget, se f.eks. Porphyrins and Metalloporphyrins, K. Smith Elsivier; The Porphyrins (Vol. 1-7), D. Dolphin, Academic Press og Biosynthetic Pathways, Vol. III, kapittel av B. Burnham, utg. D.M. Greenberg, Academic Press.

Et ytterligere karakteristisk trekk ved foreliggende terapeutiske forbindelser er nærvær av minst én amidbinding i en substituent ved en hvilken som helst av de nummererte stillinger på ringstrukturen. Disse er tilstedeværende i foreliggende nye forbindelser sammen med andre substituenter som definert i det etterfølgende.

Foreliggende oppfinnelse angår således fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser inneholdende aminosyre eller peptidderivater av forbindelser sem inneholder kromoforen av porfyriner, chloriner eller bakteriochloriner, så vel som beslektede porfyrinforbindelser. Peptidbindingen innbefatter en carboxygruppe av den kromoforbærende forbindelse og aminogruppen av den spesifiserte aminosyre. Foreliggende nye terapuetiske preparater innbefatter bl.a. derivater av tetrapyrroler som inneholder en fri carboxygruppe. Disse derivater innbefatter hovedklassene av tetrapyrroler, carboxyholdige porfyriner, chloriner og bakteriochloriner, som er velkjente innen faget.

Aminosyrene anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse

for å danne den ovenfor angitte peptidbinding, er aminomonocarboxylsyrer hvori aminogruppen selvsagt er lokalisert på

et carbonatom av monocarboxylsyren. Minst to aminomonocarboxylsyrer er nødvendig. Den spesifikke stilling av aminogruppen i carbonatomkjeden er ikke kritisk, det eneste krav er at aminogruppen er tilgjengelig for å danne den krevede peptidbinding med carboxylgruppen av det valgte porfyrin. Således er et utall av aminomonocarboxylsyrer anvendbare ifølge oppfinnelsen, innbefattende serin, glycin, a-aminoalanin, p-aminoalanin, e-amino-n-capronsyre, piperi-din-2-carboxylsyre, piperidin-6-carboxylsyre, pyrroi-2-carboxylsyre, pyrrol-5-carboxylsyre, piperidin-6-propion-syre, pyrrol-5-eddiksyre og liknende syrer. Disse amino-

syrer kan være substituert med vinklede alkylgrupper slik som methyl- og ethylgrupper, så vel som andre grupper som ikke ugunstig påvirker aminogruppens evne til å danne peptidbindingen, f.eks. alkoxygrupper eller acyloxygrupper, og som også kan innbefatte ytterligere aminogrupper. De foretrukne aminosyrer er de naturlig forekommende a-aminosyrer, serin, alanin og glycin, som er lett tigjengelige og hittil har gitt de beste resultater.

Eksempler på forbindelser av tetrapyrrolklassen er illustrert i tabell I, hvori de nummererte stillinger av tetrapyrrolringstrukturen er anvendt for å angi stillingen av den angitte substituent. Fravær av dobbeltbindinger i ringsystemet er angitt under "dihydro" med hvert sett av tall (ringstilling) som indikerer fraværet av en dobbelt-binding mellom de angitte stillinger.

tabell I forts.

Ringposisjon

Merknader:

Me: -CH3 (methylgruppe)

Pr: -CH2CH2COOH (propionsyregruppe) V: -CH=CH2 (vinylgruppe)

Et: CH2CH3 (ethylgruppe)

Ac: -CH2COOH (eddiksyregruppe) ACL: CH3-CO- (acetylgruppe)

Ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive tetrapyrrol-amino-monocarboxylsyreaddukter, anvendelig til fotodiagnostisering og fotobehandling av tumorer, med formel:

-eller de tilsvarende di- eller tetrahydrotetrapyrroler hvori R_ er methyl; R. er ethyl eller 4

R_ er methyl;

Rfi er CH2CH2C02H, CH2CH2COR eller C02H;

R? er CH2CH2C02H, CH2CH2COR eller f-CI^C^CC^H

Rg er methyl eller f~CH3

Rg er H, CH2COOH eller CH2COR

forutsatt at når Rn , Rn, R-., R., R-, og RQ betegner to substi-1 Z J 4 / O

tuenter eller er divalente og bundet til samme carbonatom,

er den respektive pyrrolring til hvilken de er bundet et di-hydropyrrol;

R er serinyl, glycyl, alanyl, 6-amino-n-capryol, asparaginyl eller cysteinyl; hvor minst en av R6 ,, R_ 7 eller RQ inneholder gruppen R;

forutsatt at minst en av Ri~Rg innbefatter en fri carboxylgruppe, eller farmasøytisk akseptable salter derav,

hvilken fremgangsmåte.er kjennetegnet ved at tetrapyrrol med den ovenfor angitte formel, hvor R = OH, omsettes med én eller flere amino-monocarboxylsyrer i et egnet løsningsmiddel under amid-dannende betingelser, og eventuelt at det erholdte produkt omdannes til et salt.

Forbindelsene i de terapeutiske preparater danner salter med enten syrer eller baser. Syresaltene er særlig anvendbare for rensing og/eller separering av amidsluttproduktene slik som også salter dannet med baser. Basesaltene er imidlertid særlig foretrukne for diagnostisk og terapeutisk bruk som beskrevet i det etterfølgende.

Syresaltene dannes med et utall syrer slik som uorgan-iske syrer, slik som saltsyre, hydrobromsyre, salpetersyre og svovelsyre, organiske syrer slik som toluensulfonsyre og benzensulfonsyre.

Basesaltene innbefatter f.eks. natrium-, kalium-, calcium-, magnesium-, ammonium-, triethylammonium-, tri-methylammonium-, morfolin- og piperidinsalter og liknende salter.

Syre- og basesaltene dannes ved enkel oppløsning av det valgte aminosyretetrapyrrolamid i en vandig løsning av syren eller basen og fordampning av løsningen til tørrhet. Anvendelse av et vannblandbart løsningsmiddel for amidet kan medhjelpe til å oppløse amidet.

Amidsluttproduktene kan også omdannes til metallkomplekser, f.eks. ved omsetning med metallsalter. Magnesium-kompleksene kan være anvendbare for samme formål som addukt-produktet. Andre metallkomplekser, så vel som magnesiumkom-plekset, innbefattende f.eks. jern og zink, er anvendbare for å utelukke forurensning under bearbeidelse av addukt-produktet med metaller slik som nikkel, kobolt og kopper, hvilke er vanskelig å fjerne. Zink og magnesium fjernes lett fra sluttadduktproduktet etter at bearbeidelsen er fullført.

Da mange av aminomonocarboxylsyrene eksisterer i både i D- og L-former og også anvendes i blandinger av disse former, så vel som D,L-formen, vil valget av utgangsamino-syre selvsagt resultere i produkter hvori den respektive isomer eller blanding av isomerer foreligger. Foreliggende oppfinnelse tar i betraktning anvendelse av alle slike isomerer, men L-formen er særlig foretrukket.

Foreliggende nye forbindelser fremstilles ved de vanlige peptidsynteser som generelt innbefatter enhver amiddannende reaksjon mellom den valgte aminosyre og det spesifikke tetrapyrrol. Således kan ethvert amiddannende derivat av tetrapyrrolcarboxylsyren anvendes ved fremstilling av foreliggende nye peptider, f.eks. lavere alkyl-estere, anhydrider og blandede anhydrider.

Den foretrukne fremgangsmåte gjør bruk av blandede anhydrider av carboxylsyren eller carbodiimider. Reaktan-tene bringes i kontakt i et egnet løsningsmiddel og tillates å reagere. Temperaturer opp til tilbakeløpstemperaturen kan anvendes hvor høyere temperaturer reduserer reaksjonstiden. For høye temperaturer er vanligvis ikke foretrukne for å unngå uønskede bireaksjoner.

Prosedyrene for dannelse av foreliggende peptider er velkjent innen faget og er illustrert i detalj i de etter-følgende eksempler.

Da det valgte tetrapyrrol inneholder mer enn én carboxylgruppe, kan blandinger av produkter dannes innbefattende isomere di- og til og med tri- eller høyere peptid-produkter, avhengig av antall carboxylgrupper og avhengig av den valgte støkiometri. Når således ekvivalente blandinger av aminosyre og tetrapyrrol omsettes, kan produktet inne-holde noe monopeptid, men det vil også være til stede di-eller polypeptider. Det er generelt mulig å separere mono-peptidene og høyere peptider under anvendelse av kjente kromatografiske teknikker. Slike separasjoner er imidlertid ikke nødvendig, da de blandede peptider vanligvis er sammen-liknbare med de separerte produkter når det gjelder deres endelige anvendelse. Således kan blandinger av mono-, di-

og tripeptider av samme tetrapyrrol anvendes.

Vanligvis separeres uomsatt tetrapyrrol fra peptid-produktene under rensing, slik som f.eks. ved kromatografiske teknikker.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er anvendbare for fotodiagnose og fototerapi av tumor, cancer og ondartet vev (heretter angitt som "tumor").

Når et dyr eller menneske som har tumor behandles med doser av en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen, og når riktige lysstråler eller elektromagnetiske bølger påføres, utstråler forbindelsen lys, dvs. utviser fluorescens. Eksistens, posisjon og størrelse av tumoren kan derved påvises, dvs. en fotodiagnose kan foretas.

Når tumoren bestråles med lys av riktig bølgelengde og intensitet, aktiveres forbindelsen til å utvise en celledrepende effekt mot tumoren. Dette kalles "fototerapi".

Forbindelser beregnet for fotodiagnose og fototerapi skal ideelt sett utvise følgende egenskaper: (a) være ikke-toksiske ved normale terapeutiske doser med mindre og inntil de aktiveres med lys; (b) skal være selektivt fotoaktive; (c) når lysstråler eller elektromagnetiske bølger påføres, skal de utsende karakteristisk og påvisbar fluorescens ; (d) når de bestråles med lysstråler, eller når elektromagnetiske bølger påføres, skal de aktiveres til en grad hvor de utviser en celledrepende effekt mot tumoren; og (e) være lett metaboliserbare eller utskilles etter behandling.

Ifølge den hittil foretatte testing har forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen de ovenfor angitte egenskaper og er også karakterisert ved en rimelig løselighet i saltvann ved fysiologisk pH.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen utviser større fluorescens i tumorer enn i tilsvarende basiske tetrapyrroler. Deres anvendelse gir den beste kontrast i tumorer sammenliknet med normalt vev rundt tumoren. Foreliggende forbindelse absorberer aktiveringsenergi for fototerapi i det hensiktsmessige område på 600-800 nanometer, hvor de foretrukne forbindelser absorberer i området 620-760 nanometer, dvs. lys med lengre bølgelengde som lettere muliggjør penetrering av energi inn i tumoren for fototerapeutiske formål.

Ifølge foreliggende erfaring fordeles foreliggende forbindelser mer ensartet gjennom tumoren enn det basiske tetrapyrrol, hvilket muliggjør anvendelse av betydelig lavere doser (1/10 av den nødvendige normale dose av tetrapyrrolet), hvilket reduserer - om ikke fullt ut eliminerer - fotosensibiliseringen i verten. De utviser også en mer ensartet fluorescens, mens enkelte av de tilsvarende tetrapyrroler viser uensartet fluorescens eller fluorescens som varierer fra dag til dag i verten.

En særlig fordelaktig egenskap ved de nye forbindelser ligger i den letthet med hvilken de utskilles av verten. Innen 48-72 timer etter intravenøs eller intraperitoneal administrering er det generelt lite eller ingen påvisbare mengder i normalt muskelvev. De nye forbindelser som utskilles med deres kromofor intakt, gjenvinnes fra feces av verten i løpet av 48-72 timer etter injeksjon. Under ekvivalente omstendigheter vil betydelige mengder av de tilsvarende tetrapyrroler være tilbake sammenliknet med at bare mindre mengder av peptider dannet med aminosyrene er tilbake i verten, f.eks. opptil 20 %. Denne egenskap er meget viktig ved at den bidrar til en minimering av fotosensibilisering av verten.

Foreliggende preparater kan anvendes for diagnose og terapeutisk behandling av et bredt område av tumorer. Eksempler på tumorer er magecancer, enterisk cancer, lunge-cancer, brystcancer, uterin cancer, øsofagial cancer, ovariecancer, pankreatincancer, faryngial cancer, sarcomas, hepatisk cancer, cancer i urinblæren, cancer i overkjeven, cancer i galletrakten, cancer på tungen, cerebral tumor, hudcancer, ondartet struma, prostatisk cancer, cancer i parotidkjertelen, Hodkins' sykdom, multippel myeloma, renal cancer, leukemi og ondartet lymfocytoma.

For diagnose er det eneste kravet at tumoren er i stand til selektivt å fluorescere da den utsettes for riktig lys. For behandling må tumoren være penetrerbar av aktiver-ingsenergien. For diagnose anvendes lys av kortere bølge-lengde, mens for terapeutiske formål anvendes lys av lengre bølgelengde for å muliggjøre en penetrering av tumorvevet. For diagnose kan således lys på fra 360-760 nanometer anvendes, og for behandling fra 620-760 nanometer, avhengig av de individuelle karakteristika av tetrapyrrolet. Absorpsjons-karakteristikaene for foreliggende nye forbindelser er hovedsakelig de samme som tetrapyrrolet, fra hvilket de er avledet.

Det er nødvendig at lysstrålene er så intense at de forårsaker at forbindelsene utstråler fluorescens for diagnose og utviser en celledrepende effekt for terapi.

Bestrålingskilden for fotodiagnose og fototerapi er ikke begrenset, men laserstrålen foretrekkes på grunn av at intense lysstråler i et ønsket bølgelengdeområde selektivt kan påføres. Ved f.eks. fotodiagnose administreres forbindelsen ifølge oppfinnelsen til et menneske eller dyr, og etter et bestemt tidsrom påføres lysstråler til den del som skal undersøkes. Når et endoskop kan anvendes for den påvirkede del, slik som lunger, svelg, mage, livmor, urinblære eller rektum, bestråles denne under anvendelse av endo-skopet, og tumordelen utstråler selektivt fluorescens. Denne del observeres visuelt eller observeres gjennom et tilpasset fiberskop visuelt eller på en CRT-skjerm.

Etter administrering av dosen ved fototerapi utføres bestrålingen ved hjelp av laserstråler fra spissen av kvartsfibere. Ved siden av bestråling av tumoroverflaten kan den indre del av tumoren bestråles ved å innføre spissen av kvartsfibere inn i tumoren. Bestrålingen kan observers visuelt eller gjenspeiles på en CRT-skjerm.

For diagnose er lys med bølgelengder mellom 360 og 760 nanomenter egnet for å aktivere foreliggende tetrapyrrolfor-bindelser. Hver forbindelse har selvsagt en spesifikk opti-mal bølgelengde for aktivering. En ultrafiolett lampe med

lang bølgelengde er særlig egnet for fotodiagnose. Liknende

metoder for å betrakte den behandlede tumor kan anvendes, som allerede beskrevet for fototerapi.

Dosene av forbindelsene vil variere, avhengig av den ønskede effekt, dvs. hvorvidt de skal anvendes for diagnose eller behandling. For diagnose vil doser så lave som 1 mg/ kg være effektive, og doser opptil 20 mg/kg kan anvendes. For behandling vil dosen vanligvis være tilnærmet 0,5 mg/kg. Selvsagt kan dosen for enten diagnose eller behandling vari-eres vidt i lys av de ovenfor angitte fordelaktige egenskaper av de nye forbindelser, eksempelvis den lette elimi-nering fra verten.

Foreliggende forbindelser er tilsynelatende ikke-toksiske ved de doseringsnivåer som anvendes for diagnose eller behandling. Ingen dødelighet av testdyr på grunn av foreliggende forbindelser er blitt observert ved studier hvor det har vært anvendt doseringsnivåer opptil 20 mg/kg. Både for diagnose og behandling kan foreliggende preparater administreres oralt, intravenøst eller intramuskulært. De kan formuleres som lyofiliserte sterile, pyrogenfrie forbindelser, fortrinnsvis i form av basiske salter, f.eks. natriumsalt. De foretrukne doseringsformer tilveiebringes som injiserbare løsninger (isotoniske).

Den anvendte bestrålingskilde ved behandling av tumorer inneholdende forbindelser ifølge oppfinnelsen, er en filtrert, kontinuerlig høyintensitetskilde eller pumpet fargelaser, eller annen laser- og lysutleveringssystem som er i stand til å virke innen følgende grenser: kraftintensi-tet 20-500 mw/cm<2> ved bølgelengder mellom 620 og 760 nanometer, og en total ytelse på minst 500 mw eller mer. Flere for tiden kommersielt tilgjengelige lasere oppfyller disse kriterier.

Tetrapyrrolene kan fremstilles ved et utall syntese-metoder som finnes i litteraturen, f.eks.:

Feoforbider

Willstatter, R., Stoll, A.: Investigations on Chloro-phyll (Transl. Schertz, F.M.M., Merz, A.R.), s. 249. Science Printing Press, Lancaster, Pennsylvania, 1928.

Pennington, F.C., Strain, H.H., Svec, W.A., Katz, J.J.: J.

Amer. Chem. Soc. 86, 1418 (1964).

Chlorin eg

Willstatter, R., Stoll, A.: Investigations on Chloro-phyll (Trans. Schertz, F.M., Merz, A.R.), s. 176. Science Printing Press, Lancaster, Pennsylvania, 1928.

Willstatter, R., Isler, M.: Ann. Chem. 390, 269

(1912).

Fisher, H., Baumler, R.: -Ann. Chem. 474, 65 (1929). Fisher, H., Siebel, H.: Ann. Chem. 499, 84 (1932).

Conant, J.B., Mayer, W.W.: J. Amer. Chem. Soc. 52, 3013 (1930).

Chlorin 64

Fisher, H., Heckmaier, J., Plotz, E.: Justus Leibigs Ann. Chem. 500, 215 (1933).

Chlorin eg, e ^, isochlorin e ^, mesochlorin 64, bakteriofeo-forbid, bakteriochlorin eg

Fisher og Orth: "Des Chemie des Pyrrole", Akademische Verlazsgesellschaft, Leipzig, 1940, vol. II, del 2. Generell referanse for porfyriner

"Porphyrins and Metalloporphyrins", utg. Kevin M. Smith, Elsevier 1975 N.Y.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan administreres til verten i et utall former tilpasset den valgte administreringsmåte, dvs. oralt, intravenøst, intramuskulært eller subkutant.

Eksempel 1

Di- og mono- ( DL) serinylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

400 mg (0,0007 mol) mesoporfyrin IX ble suspendert i 50 ml tetrahydrofuran (THF). 360 ul (0,0035 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 340 u.1 (0,0031 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 761 mg (0,0072 mol) DL-serin tilsatt til THF-løsningen. Denne løsning ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC mht. produkt. Benzen/methanol/88 % maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient av 20-70 % methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsamler, og rørinnholdet ble oppsamlet iht. de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var di-DL-serinylmesoporfyrin IX og usubstituert mesoporfyrin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet bla vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble tørket under vakuum. Utbyttet av di- (DL) serinylmesoporfyrin IX var 95,6 mg..

Eksempel 2

Di- og monoglycylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

100 mg (0,000175 mol) mesoporfyrin IX ble suspendert i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 360 ul (0,0035 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 340 u.1 (0,0031 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 500 mg (0,0066 mol) glycin tilsatt til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 0-50 % methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet i en fraksjonsoppsamler, og innholdet ble sortert iht. de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var diglycylmesoporfyrin IX, monoglycylmesoporfyrin IX og usubstituert mesoporfyrin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet bla vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble tørket under vakuum.

Eksempel 3

Di- og mono- q- ODI») alanylmesoporfyrinIX ( blandet anhydrldmetode

100 mg (0,000175 mol) mesoporfyrin IX ble suspendert i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 210 ul (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 195 ul (0,00177 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 500 mg (0,0056 mol) a- (DL) alanin tilsatt til THF-løsningen.

Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC mht. produkt. Benzen/methanol/88 % maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for

å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til

pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 20-70 % methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via fraksjonsoppsamler,

og rørinnholdet ble sortert iht. de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var di-a- (DL) alanylmesoporfyrin IX, mono-a (DL) alanylmesoporfyrin IX og usubstituert mesoporfyrin IX.

Eksempel 4

Di- og mono- 3- alanylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

400 mg (0,0007 mol) mesoporfyrin IX ble suspendert i

100 ml tetrahydrofuran (THF). 360 ul (0,0035 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 340 ul (0,0031 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 400 mg (0,0044 mol) (3-alanin tilsatt til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 40-80 % methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via fraksjonsoppsamler, og rørinnholdet ble oppsamlet iht. de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var di-p-alanylmesoporfyrin IX, mono-p-alanylmesoporfyrin IX og usubstituert mesoporfyrin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet bla vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble tørket under vakuum. Utbyttet av di-p-alanylmesoporfyrin IX var 40 mg, og utbyttet av mono-p-alanylmesoporfyrin IX var 23 mg.

Eksempel 5

Di- og mono- s- amino- n- caproylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

400 mg (0,0007 mol) mesoporfyrin IX ble suspendert i 50 ml tetrahydrofuran (THF). 360 ul (0,0035 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 340 ul (0,0031 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 543 mg (0,00414 mol) e-amino-n-capronsyre tilsatt til THF-løs-ningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 20-70 % methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsamler, og rørinnholdet ble oppsamlet iht. de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var di-e-amino-n-caproylmesoporfyrin IX, mono-e-amino-n-caproylmesoporfyrin IX og usubstituert mesoporfyrin IX.

Methanolen ble avdrevet, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet bla vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble tørket under vakuum. Utbyttet av di-e-amino-n-caproylmesoporfyrin IX var 237 mg.

Eksempel 6

Di- og mono- 3- alanylhematoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

400 mg (0,00059 mol) hematoporfyrin IX dihydroklorid ble suspendert i 50 ml tetrahydrofuran (THF).

360 ul (0,0035 mol) triethylamin ble tilsatt under om-røring. Etter 10 min. ble 340 ul (0,0031 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 400 mg (0,0044 mol) (3-alanin tilsatt

til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble fjernet ved flashfor-dampning, idet temperaturen ble holdt under 50°C. Reaksjonsblandingen ble sjekket mht. produkt med silica TLC under anvendelse av benzen/methanol/88 % maursyre (8,5/1,5/ 0,13) som løsningsmiddel for å fremkalle kromatogrammet.

Løsningen ble justert til pH 7,5-8,0 med HCl og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Blandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 40-80 % methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum). De individuelle komponenter ble oppsamlet etter som de kom ut av kolonnen i rekkefølgen di-|3-alanylhematoporfyrin IX, mono-p-alanylhematoporfyrin IX og

hematoporfyrin IX.

Methanolen ble fjernet fra hver komponent ved flash-fordampning, og materialet ble utfelt ved justering av pH til 2,5-3,0 med HCl. Bunnfallet bla vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann på sentrifugen, og produktene ble tørket under vakuum. Utbyttet av di-p-alanylhematoporfyrin IX var 52 mg, og av mono-p-alanylhematoporfyrin var utbyttet 30 mg.

Eksempel 7

Di- L- g- serinylchlorin eg ( blandet anhydridmetode)

650 mg chlorin eg ble oppløst i 30 ml dimethylformamid (DMF). 277 ul (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt til DMF-løsningen. Etter omrøring i 5 min. ble 201 ul (0,002 mol) ethylklorformiat tilsatt, og omrøringen ble fortsatt i ytterligere 30 min. 0,95 g (0,09 mol) L-a-serin ble tilsatt til DMF-løsningen og ble omrørt i en time ved 50-60°C.

DMF-løsningen ble sjekket mht. produktdannelse ved omvendt fase- (C-18 silica) TLC under anvendelse av methanol/ 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH 6,85 (7,0/3,0) for å fremkalle kromatogrammet. DMF-løsningen ble flashfordampet til tilnærmet tørrhet og reaksjonsblandingen ble deretter tatt opp i fortynnet NaOH, og pH ble justert til 2,5-3,0 for å utfelle blandingen. Bunnfallet ble deretter sentrifugert og vasket to ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Bunnfallet ble deretter oppløst på nytt i fortynnet NaOH og pH ble justert til 7,0. Dette ble anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 3,7 x 45 cm.

Produktet ble eluert fra kolonnen med en løsning av 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH 6,85/methanol (7,0/3,0). Fraksjonene ble oppsamlet, og fraksjonene av rent di-L-a-serinylchlorin eg ble oppsamlet. Methanolen ble drevet av, og produktet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble sentrifugert, vasket tre ganger med fortynnet eddiskyre og ble tørket under vakuum. Utbyttet var 200 mg av di-L-a-serinylchlorin eg.

Monoamider

Eksempel 8

Mono- ( DL) serinylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

400 mg (0,0007 mol) mesoporfyrin IX ble suspendert i 50 ml tetrahydrofuran (THF). 360 ul (0,0035 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 340 ul (0,0031 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 761 mg (0,0072 mol) DL-serin tilsatt til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble drevet av, og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC mht. produkt. Benzen/methanol/88 % maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsamler, og rørinnholdet ble oppsamlet iht. de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var diserinylmesoporfyrin IX, monoserinylmesoporfyrin IX og usubstituert mesoporfyrin

IX.

Methanolen ble drevet av, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble tørket under vakuum.

Eksempel 9

Monoglycylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

100 mg (0,000175 mol) mesoporfyrin IX ble suspendert i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 360 ul (0,0035 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 340 ul

(0,0031 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 500 mg (0,0066 mol) glycin tilsatt til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Eksempel 10

Mono- a- ( DL) alanylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

100 mg (0,000175 mol) mesoporfyrin IX ble suspendert i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 210 ul (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 195 ul (0,00177 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 500 mg (0,0056 mol) a- (DL) alanin tilsatt til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsamler, og rørinnholdet ble oppsamlet iht. de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var di-a- (DL) alanylmesoporfyrin IX, mono-a- (DL) alanylmesoporfyrin IX og usubstituert mesoporfyrin IX.

Eksempel 11

Mono- 3- alanylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

400 mg (0,0007 mol) mesoporfyrin IX ble suspendert i 100 ml tetrahydrofuran (THF). 360 ul (0,0035 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 340 ul (0,0031 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 400 mg (0,0044 mol) (3-alanin tilsatt til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5-8,0 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient av 40-80 % methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via en fraksjonsoppsamler, og rørinnholdet ble oppsamlet iht. de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var di-3-alanylmesoporfyrin IX, mono-3-alanylmesoporfyrin IX og usubstituert mesoporfyrin IX.

Methanolen ble drevet av, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble tørket under vakuum. Utbyttet av mono-3-alanylmesoporfyrin IX var 23 mg.

Eksempel 12

Mono- e- amino- n- caproylmesoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode )

400 mg (0,0007 mol) mesoporfyrin IX ble suspendert i 50 ml tetrahydrofuran (THF). 360 ul (0,0035 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 340 ul (0,00414 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 543 mg (0,00369 mol) e-amino-n-capronsyre tilsatt til THF-løs-ningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtemperatur.

Eksempel 13

Mono- g- alanylhematoporfyrin IX ( blandet anhydridmetode)

400 mg (0,00059 mol) hematoporfyrin IX dihydroklorid ble suspendert i 50 ml tetrahydrofuran (THF). 360 ul (0,0035 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 min. ble 340 ul (0,0031 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble 10 ml (0,01 mol) 1 M KOH inneholdende 400 mg (0,0044 mol) (3-alanin tilsatt til THF-løs-ningen. Denne blanding ble omrørt i 60 min. ved romtempera-

tur.

Det organiske løsningsmiddel ble fjernet ved flashfor-dampning, idet temperaturen ble holdt under 50°C. Reaksjonsblandingen ble sjekket mht. produkt ved silica TLC under anvendelse av benzen/methanol/88 % maursyre (8,5/1,5/0,13) som løsningsmiddel for å fremkalle kromatogrammet.

Løsningen ble justert til pH 7,5-8,0 med HC1 og anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Blandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 40-80 % methanol i 0,01 M KP04-buffer, pH 6,85 (1 1 totalt volum). De individuelle komponenter ble oppsamlet etter som de kom ut av kolonnen i rekkefølgen di-p-alanylhematoporfyrin IX, mono-3-alanylhematoporfyrin IX og hematoporfyrin IX.

Methanolen ble fjernet fra hver komponent ved flash-fordampning, og materialet ble utfelt ved justering av pH til 2,5-3,0 under anvendelse av HC1. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann på sentrifugen, og produktene ble tørket under vakuum. Utbyttet av di-3-alanylhematoporfyrin IX var 52 mg, og utbyttet av mono-g-alanylhematoporfyrin var 30 mg.

Eksempel 14

Mono- glycylchlorin eg ( blandet anhydridmetode)

625 mg chlorin eg ble oppløst i 300 ml dimethylformamid (DMF), og 277 ul (0,002 mol) triethylamin (TEA) ble tilsatt til DMF-løsningen. Etter omrøring i 5 min. ble 201 ul (0,002 mol) ethylklorformiat (EC) tilsatt, og blandingen ble omrørt i 1 1/2 time ved romtemperatur. 75 mg (0,0009 mol) glycin (ammoniakkfri) ble tilsatt til DMF-løsningen, og blandingen ble omrørt i 3 timer ved 50-60°C.

DMF-løsningen ble testet mht. produkt ved omvendt fase- (C-18 silica) TLC under anvendelse av methanol/0,01 M natriumfosfatbuffer, pH 6,85, 70/30 for å fremkalle kromatogrammet.

DMF-løsningen ble avdrevet til tilnærmet tørrhet og ble deretter oppløst i fortynnet NaOH, og pH ble justert til 2,5-3 for å utfelle det faste materiale. Bunnfallt ble deretter anbrakt på en omvendt fase- (C-18 silica) kolonne på 3,7 x 45 cm.

Fraksjonene ble eluert under anvendelse av 20-40 % methanol i 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH 6,85. Fraksjonene ble oppsamlet iht. de individuelle komponenter.

Methanolen ble drevet av, og materialet ble utfelt ved pH 2,5-3,0. Bunnfallet ble vasket og sentrifugert tre ganger i fortynnet eddiksyre i vann. Produktet ble tørket under vakuum. Utbyttet av monoglycylchlorin eg var 87,5 mg.

Eksempel 15

Fremstilling av mono- L- serinylchlorin eg

Chlorin eg ble fremstilt iht. den prosedyre som er beskrevet av Fischer og Stem, Die Chemie des Pyrroles, vol. II, andre halvdel, Leipzig, 1940, Akademische Verlagsgesellschaft, s. 91-93.

100 mg av chlorin e6 (fri syreform) og 35 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydroklorid ble opp-løst i 2 ml N, N'-dimethylformamid. Etter 5 min. ble 125 mg L-serinbenzylester-hydroklorid tilsatt, blandingen ble kraftig omrørt inntil oppløsningen var fullført, hvorpå løs-ningen fikk stå ved romtemperatur i 2 timer. Etter dette tidsrom ble 0,5 ml eddiksyre tilsatt og deretter 30 ml methanol og 12 ml H2O.

Løsningen ble anbrakt på en C-18 omvendt fasekolonne (14 x 2 cm). Kolonnen ble vasket med 100 ml H2O, deretter 4 ml 1 M NH4OH og deretter igjen med 50 ml H2O. Produktet ble eluert med MeOH/H20. Fraksjoner eluert fra kolonnen med 30-80 % MeOH inneholdt produktet så vel som carbodiimidakti-vert chlorin, som bestemt ved TLC, på C-18 omvendte fase-plater med løsningsmiddel 70 % MeOH/30 % buffer (0,1 M natriumfosfat, pH 6,85) V/V.

Disse fraksjoner ble oppsamlet, og tilstrekkelig 3 N NaOH ble tilsatt for å bringe løsningen til 0,1 N i NaOH. Etter en time var hydrolysen fullført, som bestemt ved TLC i det ovenfor angitte system. Methanolen ble fjernet ved rotasjonsfordampning, og pH på løsningen ble justert til 7,5 med HC1. Chlorinløsningen ble deretter på nytt anbrakt på samme omvendte fasekolonne, ble vasket med vann og eluert med MeOH under anvendelse av en trinnvis gradient fra 10-50 % methanol. Fraksjonene inneholdende rent mono-L-serinylchlorin som bestemt ved TLC (Rf noe større enn usubstituert chlorin) ble oppsamlet, methanolen ble fjernet ved rotasjonsfordampning, og produktet ble tørket som trinatriumsaltet ved lyofilisering.

Eksempel 16

Fremstilling av mono- L- asparaginylchlorin eg

500 mg chlorin e6 og 175 mg l-ethyl-3-(3-dimethylamin-propyl)-carbodiimid-hydroklorid ble oppløst i 10 ml N,N'-dimethylformamid. Etter 5 min. ble 410 mg L-asparagin tilsatt. Løsningen ble omrørt i 4 timer. Asparaginet ble ikke fullstendig oppløst under denne reaksjon, men omvendt fase-(C-18) TLC 70/30 MeOH/0,01 M natriumfosfatbuffer, pH 6,85, viste noe produkt ved dette tidspunkt (Rf svakt større enn chlorin eg. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 2,5 ml iseddik, blandingen ble deretter fortynnet til et totalt volum på 100 ml med methanol, hvorpå 25 ml H2O langsomt ble tilsatt under omrøring. Løsningen ble deretter anbrakt på en 14 x 2 cm's omvendt fase- (C-18) kolonne, ble vasket med vann og deretter med 5 ml 0,1 M NaOH og til slutt med 50 ml 0,01 M natriumfosfatbuffer, pH 6,85. Produktet ble eluert av med MeOH/^O i en trinnvis gradient fra 20 % MeOH til 50 % MeOH. Fraksjonene inneholdende rent mono-L-asparaginylchlorin eg, som bestemt ved TLC under anvendelse av de ovenfor angitte betingelser, ble oppsamlet, og methanolen ble fjernet ved rotasjonsfordampning. Produktet ble isolert som trinatriumsaltet ved lyofilisering.

Eksempel 17

Fremstilling av mono- L- cysteinylchlorin eg

300 mg chlorin eg og 105 mg l-ethyl-3-(3-dimethylamin-propyl)-carbodiimid-hydroklorid ble oppløst i 6 ml N,N'-dimethylformamid. Etter 5 min. ble 255 mg L-cystein-hydroklorid tilsatt. Løsningen ble omrørt ved romtemperatur i 5 timer. Resten av prosedyren var den samme som for fremstilling av mono-L-asparaginylchlorin eg.

Eksempel 18

Fremstilling av mono- L- serinyl- 2- formylchlorin eg ( mono- L-serinyl- 2- desvinyl- 2- formylchlorin eg)

500 mg chlorin eg-trimethylester ble fremstilt iht. prosedyren beskrevet av Fisher og Stern, i Die Chemie des Pyrroles, vol. II, andre halvdel, Leipzig 1940, Akademische Verlagsgesellschaft, s. 98-102. Chlorin eg-trimethylester ble oppløst i 600 ml tilbakeløpskokende aceton. 400 mg kaliumpermanganat og 800 mg magnesiumsulfat oppløst i 130 ml H2O ble langsomt tilsatt i løpet av en time til den tilbake-løpskokende acetonløsning. Løsningen fikk koke under til-bakeløpskjøling i en halv time etter at tilsetningen var fullført. Etter avkjøling ble 300 ml methylenklorid tilsatt, og blandingen ble vasket tre ganger med vann i en skilletrakt. Volumet av methylenklorid ble redusert, og produktet ble kromatografert på silicagel og eluert med en gradvis økende prosent av ethylacetat i CH2CL2• Det første brune hovedbånd som ble eluert ble oppsamlet som produkt, 2-desvinyl-2-formylchlorin eg.

Produktet ble forsåpet ved oppløsning i tilbakeløps-kokende n-propanol (0,1 ml/mg) og tilsetning av en seksdobbel ekvivalent 1 N KOH. Trikaliumsaltet ble filtrert fra, vasket med n-propanol og tørket under dannele av 2-formylchlorin eg.

100 mg 2-formylchlorin eg (fri syreform) og 35 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydroklorid ble oppløst i 2 ml N,N'-dimethylformamid. Etter 5 min. ble 125 mg L-serinbenzylester-hydroklorid tilsatt, ble omrørt. kraftig inntil oppløsningen var fullført og fikk deretter stå ved romtemperatur i 2 timer. Ved dette tidspunkt ble 0,5 ml iseddik tilsatt og deretter 30 ml methanol og 12 ml H20.

Løsningen ble anbrakt på en C-18 omvendt fasekolonne (14 x 2 cm). Kolonnen ble vasket med 100 ml H2O, deretter 4 ml 1 M NH4OH og deretter igjen med 50 ml H2O. Produktet ble eluert med MeOH/^O. Fraksjoner eluert fra kolonnen med 30 % til 80 % MeOH inneholdt produkt så vel som carbodiimid-aktivert chlorin, som bestemt ved TLC på C-18 omvendte fase-plater med løsningsmiddel 70 % MeOH/30 % buffer (0,1 M

natriumfosfat, pH 6,85) V/V.

Disse fraksjoner ble oppsamlet, og tilstrekkelig 3 N NaOH ble tilsatt for å bringe løsningen til 0,1 N i NaOH. Etter en time var hydrolysen fullført, som bestemt ved TLC i det ovenfor angitte system. Methanolen ble fjernet ved rotasjonsfordampning, og pH på løsningen ble justert til 7,5 med HC1. Chlorinløsningen ble deretter anbrakt på nytt på samme omvendte fasekolonne, ble vasket med vann og eluert med MeOH/vann under anvendelse av en trinnvis gradient fra 10 til 50 % methanol. Fraksjonene inneholdende rent mono-L-serinylchlorin, som bestemt ved TLC (Rf svakt større enn usubstituert chlorin), ble oppsamlet, methanolen ble fjernet ved rotasjonsfordampning, og produktet ble tørket som trinatriumsaltet ved lyofilisering.

Eksempel 19

Fremstilling av mono- L- serinyl- deuterochlorin eg ( mono- L-serinyl- 2- desvinylchlorin eg

A. Deuterochlorin eg

Deuterochlorin eg ble fremstilt iht. prosedyren beskrevet av Fisher og Stern, i Die Chemie des Pyrroles, vol. II, andre halvdel, Leipzig 1940, Akademische Verlagsgesellschaft, s. 104.

Trimethylesteren ble deretter hydrolysert til den frie syre ved oppløsning i tilbakeløpskokende n-propanol (0,1 ml/ mg) og tilsetning av den seksdoble ekvivalentmengde av 1 N KOH. Produktet ble oppsamlet ved filtrering etter avkjøling som kaliumsaltet og ble tørket under vakuum.

B. Mono-L-serinyldeuterochlorin eg

100 mg deuterochlorin eg (fri syreform) og 35 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydroklorid ble oppløst i 2 ml N,N'-dimethylformamid. Etter 5 min. ble 125 mg L-serinbenzylester-hydroklorid tilsatt, blandingen ble omrørt kraftig inntil oppløsningen var fullført og fikk

deretter stå ved romtemperatur i 2 timer. Ved dette tidspunkt ble 0,5 ml iseddik tilsatt, deretter 30 ml methanol og 12 ml H20.

Løsningen ble anbrakt på en C-18 omvendt fasekolonne (14 x 2 cm). Kolonnen ble vasket med 100 ml H20, deretter 4 ml 1 M NH4OH og deretter igjen med 50 ml H20. Produktet

ble eluert med MeOH/H20. Fraksjoner eluert fra kolonnen med

30 % til 80 % MeOH inneholdt produkt så vel som carbodiimid-aktivert chlorin, som bestemt ved TLC på C-18 omvendte fase-plater med løsningsmiddel 70 % MeOH/30 % buffer (0,1 M

natriumfosfat, pH 6,85) V/V.

Disse fraksjoner ble oppsamlet, og tilstrekkelig 3 N NaOH ble tilsatt for å bringe løsningen til 0,1 N i NaOH. Etter en time var hydrolysen fullført, som bestemt ved TLC i det ovenfor angitte system. Methanolen ble fjernet ved rotasjonsfordampning, og pH på løsningen ble justert til 7,5 med HC1. Chlorinløsningen ble deretter anbrakt på nytt på samme omvendte fasekolonne, ble vasket med vann og eluert med MeOH/vann under anvendelse av en trinnvis gradient fra 10 til 50 % methanol. Fraksjonene inneholdende rent mono-L-serinylchlorin, som bestemt ved TLC (Rf ubetydelig større enn det usubstituerte chlorin), ble oppsamlet, methanolen ble fjernet ved rotasjonsfordampning, og produktet ble tørket som trinatriumsaltet ved lyofilisering.

Eksempel 20

Fremstilling av mono- L- serinyl- 2- acetylchlorin eg ( mono- L-serinyl- 2- desvinyl- 2- acetylchlorin eg

A. 2-acetylchlorin eg

2-acetylchlorin eg-trimethylester ble fremstilt iht. prosedyren beskrevet av Fisher og Stem, Die Chemie des Pyrroles, vol. II, andre halvdel, Leipzig 1940, Akademische Verlagsgesellschaft, s. 185.

Trimethylesteren ble deretter hydrolysert til den frie syre ved oppløsning i tilbakeløpskokende n-propanol (0,1 ml/ mg) og tilsetning av seksdobbel ekvivalentmengde av 1 N KOH. Produktet ble etter avkjøling oppsamlet ved filtrering som

kaliumsaltet og ble tørket under vakuum.

B. L-serinyl-2-acetylchlorin eg

100 mg 2-acetylchlorin eg (fri syreform) og 35 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydroklorid ble oppløst i 2 ml N,N'-dimethylformamid. Etter 5 min. ble 125 mg L-serinbenzylester-hydroklorid tilsatt, blandingen ble omrørt kraftig inntil oppløsningen var fullført og fikk deretter stå ved romtemperatur i 2 timer. Ved dette tidspunkt ble 0,5 ml iseddik tilsatt, deretter 30 ml methanol og 12 ml H2<0.>

Løsningen ble anbrakt på en C-18 omvendt fasekolonne (14 x 2 cm). Kolonnen ble vasket med 100 ml H20, deretter 4 ral 1 M NH4OH og deretter igjen med 50 ml H20. Produktet

ble eluert med MeOH/H20. Fraksjoner eluert fra kolonnen med

natriumfosfat, pH 6,85) V/V.

Eksempel 21

Fremstilling av mono- L- serinylmesochlorin eg

A. Mesochlorin eg

Mesochlorin eg-trimethylester ble fremstilt iht. den prosedyre som er beskrevet av Fisher og Stern, Die Chemie des Pyrroles, vol. II, andre halvdel, Leipzig 1940, Akademische Verlagsgesellschaft, s. 102.

Mesochlorin eg-trimethylester ble deretter hydrolysert til den frie syre ved oppløsning i tilbakeløpskokende n-propanol (0,1 ml/mg) og tilsetning av seksdobbel ekvivalentmengde av 1 N KOH. Produktet ble etter avkjøling oppsamlet ved filtrering som kaliumsaltet og ble tørket under vakuum. B. Mono-L-serinylmesochlorin eg

100 mg mesochlorin eg (fri syreform) og 35 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydroklorid ble opp-løst i 2 ml N,N'-dimethylformamid. Etter 5 min. ble 125 mg L-serinbenzylester-hydroklorid tilsatt, blandingen ble kraftig omrørt inntil oppløsningen var fullført og fikk deretter stå ved romtemperatur i 2 timer. Ved dette tidspunkt ble 0,5 ml iseddik tilsatt, deretter 30 ml methanol og 12 ml H20.

Løsningen ble anbrakt på en C-18 omvendt fasekolonne (14 x 2 cm). Kolonnen ble vasket med 100 ml H20, deretter 4 ml 1 M NH^OH og deretter igjen med 50 ml H20. Produktet ble eluert med MeOH/H20. Fraksjoner eluert fra kolonnen med 30 % til 80 % MeOH inneholdt produkt så vel som carbodiimid-aktivert chlorin, som bestemt ved TLC på C-18 omvendte fase-plater med løsningsmiddel 70 % MeOH/30 % buffer (0,1 H natriumfosfat, pH 6,85) V/V.

Disse fraksjoner ble oppsamlet, og tilstrekkelig 3 N NaOH ble tilsatt for å bringe løsningen til 0,1 N i NaOH. Etter en time var hydrolysen fullført, som bestemt ved TLC i det ovenfor angitte system. Methanolen ble fjernet ved rotasjonsfordampning, og pH på løsningen ble justert til 7,5 med HC1. Chlorinløsningen ble deretter anbrakt på nytt på samme omvendte fasekolonne, ble vasket med vann og eluert med MeOH/vann under anvendelse av en trinnvis gradient fra 10 til 50 % methanol. Fraksjonene inneholdende rent mono-L-serinylchlorin, som bestemt ved TLC (Rf ubetydelig større enn usubstituert chlorin), ble oppsamlet, methanolen ble fjernet ved rotasjonsfordampning, og produktet ble tørket som trinatriumsaltet ved lyofilisering.

Fysikalske karakteristika for forbindelsene (relativ polaritet) ble målt med et standard kromatografisk system.

De kromatografiske data (Rf-verdier) ble målt på Baker silicagel C-18 tynnsjiktskromatografiske plater, hvor partikkelstørrelsen var 20 um og belegningstykkelsen var 200 um. Løsningsmiddelsystemet for disse kromatografiske forsøk bestod av 75 % methanol og 25 % 0,01 M kaliumfosfat-buffér, pH 6,85. Forbindelsene ble flekkvis anbrakt og tørket på platen som natriumsaltene ved tilnærmet nøytral pH og minimal saltkonsentrasjon. Rf-verdiene for forskjellige derivater er oppført i tabell I.- Spektroskopiske data er angitt i tabell 2.

Absorpsjonsdata for aminosyrekonjugatene er identiske med moderchlorinene.

Den etterfølgende protokoll beskriver prosedyren for anvendelse av disse nye forbindelser ifølge oppfinnelsen ved behandling av tumorer.

Eksempel 22

De fotodynamiske terapiforsøk ble utført på Buffalo-rotter under anvendelse av den transplanterbare tumor Morris hepatoma 7777. Tumorene ble transplantert subkutant på utsiden av låret. Under behandlingen varierte tumorene i størrelse mellom 1 og 2,5 cm i diamter.

Den generelle behandlingsprosedyre var som følger: Rottene ble injisert med en løsning av chlorinet fremstilt som følger: 20 mg av natriumsaltet av chlorinet ble oppløst i 1 ml 0,9 % NaCl. Chlorinløsningen ble deretter injisert intravenøst gjennom den ytre halsvene mens rotten var bedøvet med ether. Volumet av injisert løsning ble beregnet basert på vekten av dyret og dosen, på en vekt-til-vekt-basis, for det bestemte forsøk. Et spesifisert tidsinter-vall fikk deretter forløpe før lysbehandlingen ble satt i gang.

Lysbehandlingen av rottene ble utført uten bedøvelse. Rottene ble fastspent, håret ble fjernet i behandlingsområdet og ble behandlet med laserlyset fra en Cooper Aurora argonpumpet, avstembar fargelaser.

Laseren var utstyrt med et fiberoptisk lysutleveringssystem koplet til et mikrolinsesystem utviklet av dr. Daniel Doiron, D.R.D. Consulting, Santa Barbåre, California.

Linsene dispergerer laserstrålen og tilveibringer en sirkulær fordeling av lys med homogen lysintensitet gjennom området av den innfallende lysstråle. Bølgelengden på lyset ble justert under anvendelse av et Hartridge reversjonsspek-troskop. Lysintensiteten ble bestemt under anvendelse av et Yellow Springs instrument, modell 65A, radiometer.

Mikrolinsene var anordnet i en slik avstand fra huden på dyret at det ble tilveibrakt en belysningsdiameter på 1,5 cm, og lysfluksen ble variert ved kontroll av laser-utgangen.

Etter belysningen fikk dyrene vende tilbake til burene, og 24 timer senere ble de behandlet intravenøst i den ytre halsvene med 14 mg av Evans Blue fargestoff, oppløst i 250 ul 0,9 % NaCl. To timer etter injeksjonen ble dyrene avlivet, og tumoren ble snittet opp på tvers. Graden av tumornekrose ble bestemt ved mangel på fargeopptak,<!> og dybden av det nekrotiske tverrsnitt av tumoren ble nedtegnet i mm.

Tabell III angir effektene av disse legemidler på tumorer og innbefatter et område for bølgelengder, doser, intensitet og tidsintervaller for behandling. Dette var <1->M.C. Berenbaum, Br. J. Cancer, 45: 571 (1982) nødvendig for å fastslå de optimale betingelser for fototerapi under anvendelse av dette nye legemiddel. De be-skrevne betingelser førte til en målbar og signifikant skade på tumorene.

I alle tilfeller, bortsett fra hvor det spesielt er angitt, oppstod vevskade selektivt på tumorvevet som bestemt ved Evans Blue-metoden, selv om normal hud i nesten alle tilfeller lå over tumoren og behandlingsområdet overlappet signifikant områder med normalt muskelvev.

De fotodynamiske terapidata er presentert i tabell-form. Spalte 2 er den totale administrerte lysdose uttrykt i joules pr. cm<2>. Spalte 3 er dosen av administrert chlorin uttrykt i mg legemiddel pr. kg kroppsvekt. Spalte 4 er tidsintervallet mellom administrering av legemiddel og behandling med laserlys. Spalte 5 er bølgelengden for-behandlings lyset i nm. Spalte 6 er intensiteten av behand-lingslyset i mW pr. kvadratcentimeter. I spalte 7 er x den midlere dybde av nekrose i mm av tumorvevet, dvs. distansen fra den nekrotiske topp av tumoren nærmest huden til den nekrotiske kant av tumoren fjernest fra huden.

S.D. er standardavvik av TT.

(N) er antall tumorer eller lår involvert i forsøket.

Spalte 8 er området for dybden av nekrose i mm innen gruppen.

Eksempel 23

Behandlings- og vurderingsprosedyren var som følger: DBA/2 Ha Ros-d+Ha-mus med SMT-F-transplanterte tumorer enten 1 den ytre del av bakfoten eller på siden av musene ble injisert intravenøst via den ytre halsvene eller intraperi-tonealt med det fotosensibiliserende legemiddel. Ved et spesifisert tidspunkt etter injeksjon ble området over tumoren barbert, og lysbehandlingen startet.

Lys fra en Cooper Aurora argonpumpet avstembar fargelaser ble administrert via et mikrolinsesystem (utviklet av dr. Daniel Doiron, D.R.D. Consulting, Santa Barbara, California) koplet gjennom en kvartsfiber til laseren, idet de optiske egenskaper av linsene var slik at lyset utgikk fra linsene i et sirkulært mønster med homogen intensitet over det belyste område. Diameteren på det belyste område var en funksjon av distansen fra linsene.

Lysintensiteten ble målt med et Yellow Springs instrument, modell 65A, radiometer ved behandlingspunktet. En sirkel med diameter på 1,5 cm på dyrets hud, sentrert så nært som mulig over tumoren, ble bestrålt i alle forsøk. Intensiteten, bølgelengde og dose av lys er innbefattet i dataene for de individuelle grupper av dyr. Bølgelengder ble justert under anvendelse av et Hartridge reversjonsspek-troskop innen 1 nm av den angitte verdi. 24 timer etter lysbehandlingen mottok hver mus 5 mg Evans Blue fargestoff intravenøst<2.> Etter ytterligere 2 timer ble musene avlivet og tumorene ble oppsnittet vertikalt gjennom senteret av det lysbehandlede område. Upåvirket tumor ble farget blå slik som upåvirket normalt vev. Nekrotiske eller påvirkede områder var hvite eller røde av utseende. Målinger av både hele tumorer og påvirkede områder av tumorene ble foretatt vertikalt og horisontalt med passere til den nærmeste halve mm. Resultatene for representative forbindelser er angitt i etterfølgende tabeller: <2>M.C. Berenbaum, Br. J. Cancer 45:571 (1982).

Fotnoter: se tabell IV

Fotnoter: se tabell IV. Resultatene angitt i tabell IV-IX er oppsummert i etterfølgende tabell X.

Fotnoter: se tabell IV

Tabell XI - 2

Fotnote Mono-L-a-serinylchlorin eg

1 49 49 49 49

2

3 5 6 7 84 4 f f-f f 5 20,7 22,7 20,9 19,4 6 100,0 100,0 100,0 100,0

7 I.v. I.v. I.v. I.v.

8 24,0 24,0 24,0 24,0

9 SMT-F SMT-F SMT-F SMT-F

10 h. lår h. lår h. lår h. lår

11 75,0 75,0 75,0 75,0 12 20,0 20,0 20,0 20,0 13 665 665 665 665 14 15 1,60 1,60 1,50 0,90 16 1,05 0,90 1,25 0,75 17 0,65 0,70 0,70 0,70 18 19 1,20 1,70 1,90 1,45 20 1,05 1,05 1,35 0,95 21 0,80 0,80 0,85 0,80 22 1,20 1,50 1,50 1,30 23 1,05 0,95 1,00 0,95 24 0,50 0,50 0,70 0,60 25 Hovent lår, Hovent lår, Hovent lår, Hovent lår hud lyse- hud lyse- hud lyse- hud lyse-rød over rød over rød over rød over behand- behand- behand- behandlings- lings- lings- lings-omrøde, område, område, område, øvre 2/3 øvre 2/3 øvre 1/2 øvre 1/2 av tumor av tumor av tumor av tumor rød rød rød rød Fotnoter: se tabell IV

Fotnoter: se tabell IV

Fotnoter: se tabell IV. Resultatene angitt i tabellene XI og XII er summert i tabell XIII.

Fremstilling av farmakologiske preparater for administrering av den aktive bestanddel, dvs. aminosyreporfyrin-adduktene fremstilt ifølge eksemplene 1-21, er illustrert som følger:

Eksempel 2 4

Fremstilling av et metallsalt

Natriumsaltet av porfyrinaminosyreadduktet ble fremstilt ved oppløsning av angitte addukt i vann inneholdende en ekvimolar mengde natriumhydroxyd, og blandingen ble frysetørket. På denne måte ble andre metallsalter fremstilt, innbefattende kalium-, calcium- og lithiumsalter.

Fremstilling av et syresalt

Aminosyreporfyrinadduktet beskrevet i det foregående eksempel ble omdannet til syresalter, f.eks. hydroklorid, ved oppløsning i en vandig løsning inneholdende en ekvivalent mengde syre, f.eks. saltsyre, hvorpå løsningen ble fordampet til tørrhet under dannelse av det faste salt.. Alternativt kan alkoholiske løsninger av hydrogenkloridgass, oppløst i ethanol, anvendes i stedet for den vandige syre-løsning, og syresaltet erholdes ved fordampning av løsnings-midlet eller krystallisering fra alkoholen, f.eks. ved tilsetning av et ikke-løsningsmiddel.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive tetrapyrrol-amino-monocarboxylsyreaddukter, anvendelig til fotodiagnostisering og fotobehandling av tumorer, med formel:

eller de tilsvarende di- eller tetrahydrotetrapyrroler hvori

er methyl eller

v R„ er H, vinyl, ethyl. R_ er methyl; R^ er ethyl eller

Rj. er methyl;

R6 er CH2CH2C02Hf CH2CH2COR eller C02H;

Ry er CH2CH2C02H, CH2CH2COR eller RQ er methyl eller

Rg er H, CH2COOH eller CH2COR

forutsatt at når R^ R2, R^, R4, R? og Rg betegner to substituenter eller er divalente og bundet til samme carbonatom,

er den respektive pyrrolring til hvilken de er bundet et di-hydropyrrol;

R er serinyl, glycyl, alanyl, £-amino-n-capryol f asparaginyl eller cysteinyl; hvor minst en av R6 c, R_ 7 eller RQ inneholder gruppen R;

forutsatt at minst en av R^-Rg innbefatter en fri carboxylgruppe, eller farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert v e~ d at tetrapyrrol med den ovenfor angitte formel, hvor R = OH, omsettes med én eller flere amino-monocarboxylsyrer i et egnet løsningsmiddel under amid-dannende betingelser, og eventuelt at det erholdte produkt omdannes til et salt.