DK168296B1 - Fluorescerende mono-, di- eller polyamider af en amino-monocarboxylsyre og en tetrapyrrolforbindelse samt anvendelse af disse til fremstilling af et farmaceutisk præparat til fotodiagnose og/eller fototerapi af tumorer - Google Patents

Description

i DK 168296 B1

Denne opfindelse angår hidtil ukendte forbindelser, som er nyttige ved fotodiagnose og fototerapi, især til detektering og behandling tumorer og cancerøse væv i menneske- eller dyrekroppen.

5

Beskrivelse af den kendte teknik

Det er kendt at bestråle tumorer og cancerøse væv i menneskekroppen med intensivt lys i bølgelængdeområdet 626-10 636 nm efter indgivelse af et hæmatoporphyr i nderivat for at reducere og, til tider, ødelægge de cancerøse celler (se den offentliggjorte internationale patentansøgning WO 83/00811). Det er også kendt, at porphyriner, især natriumsaltet af protoporphyriner, kan bevare eller fremme 15 cellers normale funktioner og er nyttige til forhindring af genese, vækst, metastase og relaps af maligne tumorer.

Den offentligt tilgængelige japanske patentansøgning nr. 125737/76 beskriver anvendelser af porphyriner som tumor-inhiberende midler, idet der som eksempler anføres etio-20 porphyrin, mesoporphyrin, protoporphyrin, deuteroporphy-rin, hæmatoporphyrin, coproporphyrin og uroporphyrin.

I Tetrahedron Letters No. 23, side 2017-2020 (1978), er beskrevet et aminomonocarboxylsyre-additionsprodukt af 25 pigmentet bonellin opnået ved ekstraktion af hovedsageligt kropsvæggen af den marine echiuroide B. viridis. Strukturen af disse additionsprodukter antages at være et amid dannet via den ene eller den anden af bonellins frie carboxylgrupper og aminocarboxylsyren. Hydrolyse af addi-30 tionsproduktet gav en blanding af valin, isoleucin, leu-cin og alloisoleucin. Der er ikke beskrevet nogen anvendelse for disse aminosyreadditionsprodukter i denne reference.

35 Mesoporphyrin- og mesohæmin-bis-aminosyreestere og de tilsvarende aminosyrer er beskrevet i Chemische Berichte, vol. 90, no. 4, 1957(side 470-481). Specifikke bis-amino- 2 DK 168296 B1 syre-forbindelser inkluderer bis-additionsprodukter af DL-valin-, DL-leucin-, DL-phenylalanin-, DL-isoleucin- og L-glutaminsyreestere (og de tilsvarende frie syrer) til mesoporphyrin og mesohæmin. Imidlertid er der ikke angi-5 vet nogen terapeutisk anvendelse af disse forbindelser.

Den offentliggjorte internationale patentansøgning nr. WO 84/01382 beskriver et hidtil ukendt derivat af hæmatopor-phyrin som nyttigt til lokalisering og behandling af tu-10 morer.

EP-A-0 168 831 og EP-A-0 168 832, begge offentliggjort d.

22. januar 1986, angiver fluorescerende mono-, di- eller polyamider af en aminodicarboxylsyre og en tetrapyrrol-15 forbindelse indeholdende carboxylgrupper. Forbindelserne anføres at være nyttige til detektion og/eller behandling af pattedyrtumorer.

At tetrapyrrolerne forårsager intens fotosensitivitet i 20 dyr er velkendt og er blevet dokumenteret i talrige artikler i litteraturen, f.eks. J. Intr. Sci. Vitaminol, 27, 521-527 (1981); Agric. Biol. Chem., 46(9), 2183-2193 (1982); Chem. Abst. 98, 276 (1983) og 88, 69764m (1928).

25 Sammenfatning af opfindelsen

De hidtil ukendte produkter ifølge denne opfindelse er fluorescerende mono-, di- eller polyamider af en amino-carboxylsyre og en tetrapyrrolforbindelse med' formlen; 30 35 3 DK 168296 B1 y e

B

ρΛΝ/Η —\ ^Ί A NH HN c

Ml--/ \—-I COOH

N

L/ >4 D CH- \ ά

M-j--H COOH

H (<fH2)2 COOH

eller perhydroderivater deraf, hvori X = H, vinyl, ethyl eller formyl, Y = methyl eller formyl, M = methyl, og E = ethyl, og farmaceutisk acceptable salte deraf.

De cykliske tetrapyrroler ifølge opfindelsen er baseret på den fælles udgangs-tetrapyrrol, uroporphyrinogen, som har den følgende ringstruktur: 1 2 19 20 A ’i 4 "ΓΛ /=γ D NH KH b 16 \βί ij N 8

_# V=J

14 13 ^ IC 9 12 Π 4 DK 168296 B1 hvori positionerne i molekylet er nummereret 1-20, og ringene identificeres ved bogstaverne A, B, C og D. Der findes i ringsystemet 4 pyrrolringe sammenføjet via a-po-sitionerne i de respektive pyrrolringe af en methingrup-pe, dvs. -CH=.

De tetrapyrroler, som anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, er alle kendte eller afledt fra naturlige tetrapyrroler ved forskellige midler og forskellige ændringsprocedurer. De naturligt forekommende tetrapyrroler har som deres fælles oprindelse uroporphyrinogen III, en hexahydroporphyrin reduceret i bropositionerne.

En yderligere karakteristisk egenskab ved de omhandlede hidtil ukendte forbindelser er tilstedeværelsen af mindst én amidbinding i en substituent ved enhver af de nummererede positioner i ringstrukturen. Disse er tilstede i de omhandlede hidtil ukendte forbindelser sammen med andre substituenter som defineret i det følgende.

Således omfatter den foreliggende opfindelse aminosyre-eller peptidderivater af forbindelser, som indeholder chromophoren af visse chloriner og bacteriochloriner såvel som beslægtede porphyrinforbindelser. Peptidbindingen involverer en carboxylgruppe i den chromophorbærende forbindelse og aminogruppen i en aminomonocarboxylsyre. De foreliggende hidtil ukendte forbindelser omfatter derivater af tetrapyrrolerne, som indeholder 3 carboxylgrupper. Disse derivater inkluderer porphyriner af ;tetrapyrrol-hovedklasserne: chloriner og bacteriochloriner, som er velkendte for fagfolk.

De aminosyrer, der anvendes ifølge opfindelsen til dannelse af den førnævnte peptidbinding, er aminomonocarbo-xylsyrer, hvori aminogruppen selvfølgelig er lokaliseret på et af carboxylsyrens carbonatomer. Den specifikke position af aminogruppen i carbonkæden er ikke kritisk, 5 DK 168296 B1 idet det eneste krav er, at aminogruppen er til rådighed til dannelse af den nødvendige peptidbinding med carbo-xylgruppen i den valgte porphyrin. Således er en række forskellige aminomonocarboxylsyrer nyttige i forbindelse 5 den foreliggende opfindelse, herunder serin, glycin, me-thionin, α-alanin, Ø-alanin, α-phenylalanin, e-aminoca-pronsyre, piperidin-2-carboxylsyre, pyrrol-2-carboxylsy-re, piperidin-2-propionsyre, pyrrol-2-eddikesyre, lysin, threonin, cystein og andre naturlige aminosyrer. Disse 10 aminosyrer kan være substitueret med angulære alkylgrup-per, såsom methyl- og ethylgrupper, såvel som andre grupper, der ikke virker skadeligt på aminogruppens evne til at danne peptidbindingen, f.eks. hydroxy-, alkoxy- eller acyloxygrupper, og kan også inkludere yderligere amino-15 grupper. Fortrinsvis er aminosyren en «-aminosyre, og det foretrækkes yderligere, at en sådan α-aminosyre er polær. Endvidere foretrækkes det, at amidet er et mono- eller diamid.

20 De foretrukne aminosyrer er polære aminosyrer, især de naturligt forekommende polære «-aminosyrer, serin, me-thionin, threonin og cystein, der er let tilgængelige og hidtil har givet de bedste resultater. Til denne opfindelses formål inkluderer "polære aminosyrer" de aminosy-25 rer, som foruden de nødvendige amino- og carboxylsyre-grupper indeholder oxygen-, nitrogen- eller svovlholdige grupper, især oxygenholdige grupper, såsom hydroxy-, ace-toxy- og methoxygrupper.

30 Eksempler på forbindelser indenfor tetrapyrrolklasserne er vist i tabel I, hvori de nummererede positioner i te-trapyrrolringstrukturen anvendes til at betegne positionen af den angivne substituent. Fraværet af dobbeltbindinger i ringsystemet angives under "dihydro" med hvert sæt 35 ringpositioner, mellem hvilke dobbeltbindingen mangler.

6 DK 168296 B1

TABEL I

Ringposition

5 A B C D

PORPHYRIN 1 2 6 7 11 12 14 16 17 Dihydro

Chlorin eg Me V Me Et Me C02H Ac Η Η 16,17 10 Pr Me

Mesochlorin e^ Me Et Me Et Me CX^H Ac Η H 16,17

Pr Me 15 2-Des vinyl- Me H Me Et Me C02H Ac Η H 16,17 chlorin e^ Pr Me (eller deutero-chlorin eg) 20 2-Formyl- Me CHO Me Et Me C02H Ac Η H 16,17 chlorin eg Pr Me

Rhodin g? Me V CHO Et Me C02H Ac Η H 16,17

Pr Me 25

Noter:

Me: -CHg (methylgruppe)

Pr: -CH2CH2COOH (propionsyregruppe) 30 V: ~CH=CH2 (vinylgruppe)

Et: -CH^H^ (ethylgruppe)

Ac: -CH2C00H (eddikesyregruppe) Særligt foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen in-35 kluderer: 7 DK 168296 B1

Chlorinderivater

Mono-, di- og triserinyl-chlorin eg Mono-, di- og triserinyl-mesochlorin e^ 5 Mono-, di- og trithreoninyl-chlorin eg

Mono-, di- og triglycyl-acetylchlorin eg Mono-, di- og triserinyl-rhodin g^

Mono-, di- og trimethionyl-formylchlorin eg Mono-, di- og trithreoninyl-rhodin g^ 10 Mono-, di- og tricysteinyl-chlorin eg Mono-, di- og tricysteinyl-rhodin gy

Bacteriochlorinderivater

Mono-, di- og triserinyl-bacteriochlorin eg 15 Mono-, di- og trithreoninyl-bacteriochlorin eg

Mono-, di- og tricysteinyl-bacteriochlorin eg

Yderligere foretrukne forbindelser inkluderer: 20 mono- eller di-L-serinyl-chlorin eg, mono- eller di-L-serinyl-bacteriochlorin eg, mono- eller di-L-cysteinyl-bacteriochlorin eg, mono- eller di-L-serinyl-rhodin g^, mono- eller di-L-cysteinyl-rhodin g7, 25 mono- eller di-L-cysteinyl-mesochlorin eg, mono- eller di-L-serinyl-mesochlorin eg, mono- eller dialanyl-chlorin eg, dileucyl-chlorin eg, dimethionyl-chlorin eg, 30 mono- eller diglycyl-chlorin eg, mono- eller dithreoninyl-chlorin eg, mono- eller dicysteinyl-chlorin eg, dityrosyl-chlorin eg, diarginyl-chlorin eg, 35 dihistidyl-chlorin eg, mono- eller di-e-amino-caproyl-chlorin eg, eller farmaceutisk acceptable salte deraf.

8 DK 168296 B1

De omhandlede hidtil ukendte forbindelser danner salte med enten syrer eller baser. Syresaltene er særlig nyttige til rensning og/eller separation af de endelige amidprodukter ligesom saltene dannet med baser. Basesaltene 5 er imidlertid særligt foretrukne til diagnostisk og terapeutisk anvendelse som beskrevet i denne beskrivelse.

Syresaltene dannes med en række forskellige syrer, såsom mineralsyrerne saltsyre, hydrogenbromidsyre, salpetersyre 10 og svovlsyre, og organiske syrer, såsom toluensulfonsyre eller benzensulfonsyre.

Basesaltene inkluderer f.eks. natrium-, kalium-, calcium-, magnesium-, ammonium-, triethylammonium-, trime-15 thylammonium-, morpholin- og piperidinsalte og salte med lignende kationer.

Syre- og basesaltene dannes ved den simple foranstaltning at opløse det valgte aminosyretetrapyrrolamid i en vandig 20 opløsning af syren eller basen og inddampe opløsningen til tørhed. Anvendelsen af et med vand blandbart opløsningsmiddel for amidet kan hjælpe med til opløsning af amidet.

25 De endelige amidprodukter kan også omdannes til metalkomplekser, f.eks ved omsætning med metalsalte. Magnesiumkomplekserne kan være nyttige til de samme formål som additionsprodukterne. Andre metalkomplekser, f.eks. komplekser med jern og zink, er ligesom magnesiuinkomplekser-30 ne nyttige til at udelukke forurening af additionsproduktet under forarbejdningen med metaller såsom nikkel, cobalt og kobber, der er vanskelige at fjerne. Zink og magnesium fjernes let fra det endelige additionsprodukt, efter at forarbejdningen er fuldført.

Eftersom mange af aminodicarboxylsyrerne eksisterer i både D- og L-formerne og også anvendes i blandinger af dis- 35 9 DK 168296 B1 se former såvel som D,L-formen, vil valget af udgangsami-nosyren selvfølgelig resultere i produkter, hvori den respektive isomer eller blanding af isomere forkommer. Opfindelsen omfatter anvendelsen af alle sådanne isomere, 5 men L-formen er særlig foretrukken.

De omhandlede hidtil ukendte forbindelser fremstilles ad de sædvanlige peptidsynteseveje, som almindeligvis inkluderer enhver amiddannende reaktion mellem den valgte ami-10 nosyre og den specificerede tetrapyrrol. Således kan ethvert amiddannende derivat af tetrapyrrolcarboxylsyren anvendes til fremstilling af de omhandlede hidtil ukendte peptider, f.eks. lavere alkylestere, anhydrider og blandede anhydrider.

15

De foretrukne fremstillingsmetoder anvender blandede anhydrider af carboxylsyren eller carbodiimider. Reaktanterne bringes blot i kontakt i et egnet opløsningsmiddel for dem og får lov at reagere. Temperaturer op til tilba-20 gesvalingstemperaturen kan anvendes, idet de højere temperaturer blot reducerer reaktionstiden. Det foretrækkes imidlertid sædvanligvis at undgå overdrevent høje temperaturer for at undgå uønskede bireaktioner.

25 Procedurerne til dannelse af de omhandlede peptider er velkendte indenfor faget og belyses i detaljer i de efterfølgende eksempler.

Da den valgte tetrapyrrol indeholder mindst:3 carboxyl-30 grupper, kan der dannes blandinger af produkter inkluderende isomere monopeptidprodukter og endog tri- eller højere peptidprodukter afhængigt af antallet af carboxyl-grupper og afhængigt af den valgte støkiometri. Når der således omsættes ækvimolære blandinger af aminosyre og 35 tetrapyrrol, opnås ikke kun monopeptider, men dipeptider, selvom monopeptidet vil være overvejende. Med højere molære forhold vil arten af produkterne variere på lignende 10 DK 168296 B1 måde. Det er almindeligvis muligt at adskille monopeptiderne og højere peptider under anvendelse af. kendt chro-matografisk teknik. Imidlertid er sådanne separationer ikke nødvendige, da de blandede peptider sædvanligvis er 5 sammenlignelige med de separerede produkter ved deres endelige anvendelse. Således kan der anvendes blandinger af mono-, di- og tripeptiderne af den samme tetrapyrrol.

Sædvanligvis separeres ureageret tetrapyrrol fra peptid-10 produkterne ifølge opfindelsen under rensningen, f.eks. ved chromatografisk teknik.

Fotodiagnose og fototerapi 15 Forbindelserne ifølge opfindelsen er nyttige til fotodiagnose og fototerapi af tumor-, cancer- og malignt væv, i det følgende betegnet som "tumor".

Når et menneske eller dyr, som har tumor, behandles med 20 doser af en forbindelse ifølge opfindelsen, og når der påføres passende lysstråler eller elektromagnetiske bølger, udsender forbindelsen lys, dvs. fluorescens. Derved kan eksistensen, positionen og størrelsen af tumoren de-tekteres, dvs. fotodiagnose.

25 Når tumoren bestråles med lys af den rette bølgelængde og intensitet, aktiveres forbindelsen til at udøve en celledræbende virkning overfor tumoren. Dette kaldes fototerapi.

30

Forbindelser egnet til fotodiagnose og fototerapi bør ideelt have de følgende egenskaber: (a) de bør være ikke-toxiske i en normal terapeutisk do-35 sering, med mindre og indtil de aktiveres af lys; 11 DK 168296 B1 (b) de bør være selektivt fotoaktive; (c) når der påføres lysstråler eller elektromagnetiske bølger, bør de udsende karakteristisk og detekterbar fluorescens; (d) når de bestråles med lysstråler eller elektromagnetiske bølger, bør de aktiveres i en sådan grad, at de udøver en celledræbende virkning overfor tumor; og (e) de bør metaboliseres eller udskilles let efter behandlingen.

Ifølge prøvning til dato har de hidtil ukendte forbindelser ifølge opfindelsen ovenstående egenskaber og karakteriseres også af rimelig opløselighed i saltopløsning ved fysiologisk pH-værdi.

De omhandlede hidtil ukendte forbindelser udviser større fluorescens i tumorer end de tilsvarende basiske tetra-pyrroler. Deres anvendelse giver den bedste kontrast i tumorer sammenlignet med normalt væv omkring tumoren. De omhandlede forbindelser absorberer aktiverende energi til fototerapi i det hensigtsmæssige område 600-800 nm, idet de foretrukne forbindelser absorberer i området 620-760 nm, dvs. lys af længere bølgelængder, som muliggør lettere indtrængen af energi i tumoren til fototerapeutisk formål.

Efter den nuværende erfaring fordeles de omhandlede forbindelser mere ensartet igennem tumoren end den basiske tetrapyrrol, hvilket muliggør anvendelsen af betydeligt lavere dosering (ned til omkring 1/10 af den krævede normale dosis af den basiske tetrapyrrol) og således formindsker, om ikke eliminerer, fotosensitivering i værten.

De har også en mere vedblivende fluorescens, medens nogle af de tilsvarende tetrapyrroler viser ikke-vedvarende 12 DK 168296 B1 fluorescens eller fluorescensen varierer fra dag til dag i værten.

En særlig fordelagtig egenskab ved de omhandlede forbindelser er den lethed, hvormed de udskilles af værten. Almindeligvis er der indenfor 24-72 timer efter intravenøs eller intraperitoneal indgivelse kun små eller ingen de-tekterbare mængder i normalt muskelvæv. Op til omkring 50% af de omhandlede forbindelser genfindes i værtens fæces indenfor 24-72 timer fra injektion, medens der under ækvivalente omstændigheder forbliver væsentlige mængder af de tilsvarende tetrapyrroler tilbage, og forbliver op til omkring 20% peptider dannet med aminomonocarbOKylsyrer, tilbage. Denne egenskab er yderst vigtig derved, at den medvirker til minimering af fotosensitivering hos værten.

De omhandlede forbindelser kan anvendes til diagnose og til terapeutisk behandling af et bredt område af tumorer. Eksempler på tumorer er mavecancer, tarmcancer, lungecancer, brystcancer, livmodercancer, spiserørscancer, ovariecancer, pancreascancer, strubecancer, sarkomer, levercancer, cancer i urinblæren, cancer i overkæben, cancer i galdegangen, cancer i tungen, hjernetumor, hudcancer, malign struma, prostatacancer, cancer i spytkirtlen, Hodgkins' s sygdom, multipel myeloma, nyrecancer, leukæmi og malignt lymfocytoma. Til diagnose er det eneste krav, at tumoren er i stand til at fluorescere selektivt, når den udsættes for det rette lys. Til behandling må tumoren være gennemtrængelig af aktiveringsenergien. Til diagnose anvendes lys af kortere bølgelængde, medens der til terapeutiske formål anvendes lys af længere bølgelængde for at muliggøre let gennemtrængning af tumorvævet. Således kan der til diagnose anvendes lys på 360-760 nm og til behandling lys på 620-760 nm, afhængigt af tetrapyrrolens individuelle egenskaber. De omhandlede hidtil ukendte forbindelsers absorptionsegenskaber er i det væsentlig de 13 DK 168296 B1 samme som hos den tetrapyrrol, hvorfra de er afledt.

Det er nødvendigt, at lysstrålerne er så intense, at de får forbindelserne til at udsende fluorescens til diagnose og til at udøve en celledræbende virkning til terapi.

Bestrålingskilden til fotodiagnose og fototerapi er ikke begrænset, men laserstrålen foretrækkes, fordi der selektivt kan påføres intensive lysstråler i et ønsket bølgelængdeområde. F.eks. indgives forbindelsen ifølge opfindelsen ved fotodiagnose til en menneske- eller dyrekrop, og efter et vist tidsrum påføres lysstråler på den del, som skal undersøges. Når et endoskop kan anvendes til den påvirkede del, såsom lunger, spiserør, mave, livmoder, urinblære eller rectum, bestråles den under anvendelse af endoskopet, og tumorportionen udsender selektivt fluorescens. Denne portion iagttages visuelt eller iagttages igennem et tilpasset fiberskop med øjet eller på en CRT-skærm.

Ved fototerapien udføres bestrålingen efter indgivningen af doseringen ved hjælp af laserstråler fra spidsen af kvartsfibre. Foruden bestrålingen af tumorens overflade kan den indre del af tumoren bestråles ved indsætning af spidsen af kvartsfibrene i tumoren. Bestrålingen kan iagttages visuelt eller afbildes på en CRT-skærm.

Til fotodiagnose er lys af bølgelængder mellem 360-760 nm egnet til aktivering af de omhandlede tetrapyrrolforbin-delser. Selvfølgelig har hver forbindelse en specifik optimal aktiveringsbølgelængde. En langbølget ultraviolet lampe er særligt egnet til fotodiagnose. Der kan anvendes lignende metoder til betragtningen af den behandlede tumor, som allerede er beskrevet for fototerapi.

Doseringerne af de omhandlede hidtil ukendte forbindelser vil variere afhængigt af den ønskede virkning, hvad enten 14 DK 168296 B1 det gælder diagnose eller behandling. Til diagnose vil doser på så lidt som 1 mg/kg være effektive, og der kan anvendes op til omkring 7,5 mg/kg. Til behandling vil dosen sædvanligvis være omkring 0,5 mg/kg. Selvfølgelig kan 5 doseringen for enhver diagnose eller behandling varieres bredt i betragtning af de før nævnte fordelagtige egenskaber ved de omhandlede forbindelser, f.eks. den lethed, hvormed de elimineres fra værten.

10 De omhandlede forbindelser er tilsyneladende ikke-toxiske i de doseringsniveauer, der anvendes til diagnose eller behandling. Der er ikke blevet bemærket nogen dødelighed af prøvedyr på grund af de omhandlede forbindelser ved undersøgelser under anvendelse af doseringsniveauer på op 15 til 20 mg/kg.

Til både diagnose og behandling kan de omhandlede forbindelser indgives ad oral, intravenøs eller intramuskulær vej. De kan sammensættes som lyophiliserede sterile pyro-20 genfrie forbindelser, fortrinsvis i form af basesalte, f.eks. natriumsalte. De fortrukne doseringsformer tilvejebringes som injicerbare opløsninger (isotoniske).

Den bestrålingskilde, som anvendes ved behandling af tu-25 morer indeholdende forbindelser ifølge opfindelsen, er en filtreret, højintensitets, kontinuert eller pumpet-farvestof- eller anden laserlyskilde, som er i stand til at arbejde indenfor de følgende grænser: strålings-strømtæt- 2 hed 20-500 mW/cm ved bølgelængder mellem 620 og 680 nm 30 og en total udgangseffekt på mindst 4 W eller mere. Flere for tiden kommercielt tilgængelige lasere opfylder disse kriterier.

Tetrapyrrolerne kan fremstilles ved forskellige syntese-35 metoder, som findes i litteraturen, f.eks.

15 DK 168296 B1

Chlorin e, _5

Willståtter, R., Stoll, A.; Investigations on Chlorophyll, (Trans., Schertz, F.M., Merz, A.R.,) side 176, Science Printing Press, Lacaster, Pennsylvania, 1928.

Willståtter, R., Isler, M.; Ann. Chem., 390, 269 (1912).

Fischer, H., Baumler, R.; Ann. Chem., 474, 65 (1929).

Fischer, H., Siebel, H.; Ann. Chem., 499, 84 (1932).

Conant, J.B., Mayer, W.W.; J. Amer. Chem. Soc., 52, 3013 (1930).

Chlorin e^,_e^, mesochlorin e^, bacteriochlorin e^

Fischer und Orth, "Die Chemie des Pyrrols", Akademische Verlagsgesellschaft, Leipzig, 1940, Band II, Teil 2.

Almen reference for porphyriner "Porphyrins and Metalloporphyrins" ed. Kevin M. Smith, Elsevier, New York 1975.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan indgives til værten i en række forskellige former tilpasset den valgte indgivelsesvej, dvs. oralt, intravenøst, intramuskulært eller subkutant. :

Den aktive forbindelse kan indgives oralt, f.eks. med et inert fortyndingsmiddel eller med en assimilerbar spiselig bærer, eller den kan indgives i gelatinekapsler med hård eller blød skal, eller den kan komprimeres til tabletter, eller den kan inkorporeres direkte i føden eller diæten. Til oral terapeutisk indgivelse kan den aktive forbindelse inkorporeres med excipienter og anvendes i 16 DK 168296 B1 form af indtagelige tabletter, sugetabletter, trokisker, kapsler eliksirer, suspensioner, sirupper,. oblater og lignende. Sådanne præparater bør indeholde mindst 0,1% aktiv forbindelse. Procentindholdet i præparatet kan selvfølgelig varieres og kan hensigtsmæssigt være fra omkring 2 til omkring 60 vægtprocent af enheden. Mængden af aktiv forbindelse i sådanne terapeutisk nyttige præparater er sådan, at der vil blive opnået en egnet dosering. Foretrukne præparater af forbindelserne ifølge opfindelsen fremstilles således, at en oral doseringsenhedsform indeholder mellem ca. 50 og 300 mg aktiv forbindelse.

Tabletterne, trokiskerne, pillerne, kapslerne og lignende kan også indeholde følgende: Et bindemiddel, såsom traga-canthgummi, acaciagummi, majsstivelse eller gelatine; ex-cipienter såsom dicalciumphosphat; et nedbrydningsmiddel, såsom majsstivelse, kartoffelstivelse, alginsyre og lignende; et glittemiddel, såsom magnesiumstearat; og et sødemiddel, såsom sucrose, lactose, saccharin, eller et aromamiddel, såsom pebermynte, vintergrøntolie eller kirsebæraroma. Når doseringsenhedsformen er en kapsel, kan den foruden materialer af den ovennævnte type indeholde en flydende bærer. Forskellige andre materialer kan være tilstede som overtræk eller til på anden måde at modificere doseringsenhedens fysiske form. F.eks. kan tabletter, piller eller kapsler være overtrukket med shellak, sukker eller begge dele. En sirup eller en eliksir kan indeholde den aktive forbindelse, sucrose som sødemiddel, methyl- og propylparabener som konserveringsmidler, et farvestof og en aroma, såsom kirsebær- eller appelsinaroma. Selvfølgelig bør ethvert materiale, der anvendes til fremstilling af enhver doseringsenhedsform, være farmaceutisk rent og i det væsentlige ikke-toxisk i de anvendte mængder. Desuden kan den aktive forbindelse inkorporeres i præparater og sammensætninger med forlænget afgivelse.

17 DK 168296 B1

Den aktive forbindelse kan også indgives parenteralt eller intraperitonealt. Opløsninger af den aktive forbindelse som fri base eller farmakologisk acceptabelt salt kan fremstilles i vand, passende blandet med et overfladeaktivt middel, såsom hydroxypropylcellulose. Dispersioner kan også fremstilles i glycerol, flydende polyethy-lenglycoler og blandinger deraf og i olier. Under almindelige betingelser for opbevaring og brug, indeholder disse præparater et konserveringsmiddel for at forhindre væksten af mikroorganismer.

De farmaceutiske former, som er egnet til injektion, inkluderer sterile vandige opløsninger eller dispersioner og sterile pulvere til fremstillingen af sterile injicer-bare opløsninger eller dispersioner på stedet. I alle tilfælde må formen være steril og må være flydende i en sådan grad, at den er let at fylde på sprøjte. Den må være stabil under fremstillings- og opbevaringsbetingelserne og må være konserveret mod den kontaminerende virkning af mikroorganismer, såsom bakterier og svampe. Bæreren kan være et opløsningsmiddel eller dispersionsmedium indeholdende f.eks. vand, ethanol, polyol (f.eks. glycerol, prolylenglycol og flydende polyethylenglycol), egnede blandinger deraf og vegetabilske olier. Den rette flydeevne kan f.eks. opretholdes ved anvendelse af et overtræk, såsom lecithin, ved opretholdelse af den krævede partikelstørrelse i tilfælde af dispersion og ved anvendelse af overfladeaktive midler. Forhindringen af virkningen af mikroorganismer kan frembringes. af forskellige antibakterielle og antifungale midler, f.eks. parabener, chlorbutanol, phenol, sorbinsyre, thimerosal og lignende.

I mange tilfælde vil det være at foretrække at inkludere isotoniske midler, f.eks. sukkerstoffer eller natrium-chlorid. Forlænget absorption af de injicerbare præparater kan frembringes ved inkorporering i præparaterne af midler, som forsinker absorption, f.eks. aluminiummono-stearat og gelatine.

DK 168296 Bl 18

Sterile injicerbare opløsninger fremstilles ved inkorporering af den aktive forbindelse i den krævede mængde i det passende opløsningsmiddel med forskellige af de andre ingredienser, som er opregnet ovenfor, efter behov, efterfulgt af sterilfiltrering. Almindeligvis fremstilles dispersioner ved inkorporering af den på forskellig vis steriliserede aktive ingrediens i et sterilt medium, som indeholder grunddispersionsmediet og de krævede andre ingredienser blandt de ovenfor opregnede. I tilfælde af sterile pulvere til fremstilling af injicerbare opløsninger, er de foretrukne fremstillingsmetoder vakuumtørrings- og frysetørrings teknik, som giver et pulver af den aktive ingrediens plus enhver yderligere ønsket ingrediens ud fra en i forvejen sterilfiltreret opløsning deraf.

De omhandlede hidtil ukendte forbindelser kan også påføres direkte på tumorer hos værten, hvad enten det er internt eller eksternt, i topiske præparater. Eksempler på sådanne præparater inkluderer opløsninger af de hidtil ukendte forbindelser i opløsningsmidler, især vandige opløsningsmidler, og fortrinsvis vand. Alternativt kan de omhandlede hidtil ukendte forbindelser til topisk anvendelse, især på hudtumorer, dispergeres i de sædvanlige creme- eller salvepræparater, som almindeligvis anvendes til dette formål, eller de kan tilvejebringes i form af sprøjteopløsninger eller suspensioner, som kan inkuldere et drivmiddel, der sædvanligvis anvendes i aerosolpræparater .

I denne beskrivelse med krav inkluderer betegnelsen "farmaceutisk acceptabel bærer" alle opløsningsmidler, dispersionsmedier, overtræk, antibakterielle og antifungale midler, isotoniske og absorptionsforsinkende midler og lignende. Anvendelsen af sådanne medier og midler i forbindelse med farmaceutisk aktive stoffer er velkendt indenfor faget. Med undtagelse af det tilfælde, hvor et eller andet konventionelt middel er uforeneligt med den ak- 19 DK 168296 B1 tive ingrediens, kommer dets anvendelse i de terapeutiske præparater i betragtning. Supplerende aktive ingredienser kan også inkorporeres i præparaterne.

5 Det er særligt fordelagtigt at sammensætte parenterale præparater i doseringsenhedsform med henblik på let indgivelse og ensartet dosering. "Doseringsenhedsform" anvendes i denne beskrivelse med krav om fysisk adskilte enheder, som er egnede som enhedsdoseringer for de patte-10 dyrindivider, som skal behandles, idet hver enhed indeholder en forud fastsat mængde aktivt materiale udregnet til at bringe den ønskede terapeutiske virkning i forbindelse med den nødvendige farmaceutiske bærer. Specifikationen for de hidtil ukendte doseringsenhedsformer ifølge 15 opfindelsen er dikteret af og direkte afhængig af (a) det aktive materiales enestående egenskaber og den bestemte terapeutiske virkning, som skal opnås, og (b) de faget iboende begrænsninger for sammensætningen af et sådant aktivt materiale til behandlingen af tumorer i le-20 vende individer.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

25 Eksempel 1 L-Monoserinyl-chlorin e^ (carbodiimid-metoden) METODE I 30 150 mg chlorin e^ og 250 mg L-serin-t-butylester-hydro-chlorid opløses i 20 ml dimethylformamid. Der foretages 3 tilsætninger af N,N'-dicyclohexylcarbodiimid på hver 100 mg med en times intervaller. Efter 4 timer fortyndes re-35 aktionsblandingen med 300 ml ether, vaskes 2 gange med 200 ml vand og ekstraheres derpå med 40 ml 1 M KOH-opløs-ning. KOH-opløsningen får lov at hydrolysere natten over 20 DK 168296 B1 og opvarmes derpå til 70 °C i 10 minutter.

Opløsningens pH-værdi indstilles til 7, og al resterende ether fjernes ved lyninddampning. Opløsningen sættes derefter på en revers-fase (C^g-silicagel) kolonne (1,5 cm x 30 cm) og renses ved trinvis eluering med methanol/0,01 M kaliumphosphat-puffer (pH 6,85), idet der elueres med 5% methanol, indtil uønskede polære pigmenter er fjernet, monoserinyl-chlorin e^ elueres af med 6-8% methanol, og ureageret chlorin e^ fjernes med 25% methanol.

Produktet udfældes ved pH 3 efter kortvarig lynafdampning for at fjerne methanol og vaskes derpå 3 gange i centrifugen med fortyndet eddikesyre. Produktet tørres under vakuum.

METODE II

Chlorin e^ blev fremstillet ifølge proceduren beskrevet af Fischer og Stern i "Die Chemie des Pyrrols", Band II,

Teil 2, Akademische Verlagsgesellschaft, Leipzig 1940, side 91-93.

100 mg chlorin e^ (i form af den frie syre) og 35 mg 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl )carbodiimid-hydrochlorid blev opløst i 2 ml N,N*-dimethylformamid. Efter 5 minutter tilsattes 125 mg L-serin-benzylester-hydrochlorid, der omrørtes kraftigt, indtil stoffet var fuldstændigt opløst, og opløsningen fik derefter lov at stå ved stuetemperatur i 2 timer. Ved dette tidspunkt tilsattes 0,5 ml iseddike og derpå 30 ml methanol og 12 ml vand.

Opløsningen blev sat på en C^g-revers-fase-kolonne (14 x 2 cm). Kolonnen blev vasket med vand (100 ml), derpå med 4 ml 1M NHgOH-opløsning, og derpå med vand igen (50 ml). Produktet blev elueret med methanol/vand. Fraktioner elueret fra kolonnen med 30-80% methanol indeholdt pro 21 DK 168296 B1 dukt såvel som carbodiimid-aktiveret chlorin som bestemt ved TLC på C18 -revers-fase-plader med et opløsningsmiddel bestående af 70 vol.-% methanol/30 vol.-% puffer (0,1 M natriumphosphat, pH 6,85).

Disse fraktioner blev hældt sammen, og der tilsattes tilstrækkeligt 3N NaOH-opløsning til at gøre opløsningen 0,1N med hensyn til NaOH. Efter 1 time var hydrolysen fuldført som bestemt ved TLC i det ovenstående system. Methanolet blev fjernet ved rotationsfordampning, og opløsningens pH-værdi blev indstillet til 7,5 med saltsyre. Chlorinopløsningen blev derpå igen sat på den samme revers-fase-kolonne, og der blev vasket med vand og elue-ret med methanol/vand under anvendelse af en trinvis gradient fra 10 til 50% methanol. Fraktionerne indeholdende rent mono-L-serinylchlorin som bestemt ved TLC (R^ lidt større end for den usubstituerede chlorin) blev hældt sammen, methanolet blev fjernet ved rotationsfordampning, og produktet tørret som trinatriumsaltet ved lyophilise-ring.

Eksempel 2

Mono- og Di-(L)-serinyl-chlorin e^ (carbodiimid-metoden) 400 mg chlorin e& og 1 g L-serin-benzylester-p-tosylat opløses i 75 ml dimethylformamid. Opløsningens temperatur holdes ved 65-70 °C under omrøring, og der tilsættes 100 mg N,N’-dicyclohexylcarbodiimid. (Der foretages i alt 3 tilsætninger med 2 timers intervaller). Opløsningen omrøres ved denne temperatur i 20 timer og undersøges derpå ved TLC (revers-fase) på C^g-silicagel-plade med 70% me-thanol/30% 0,01M kaliumphosphat-puffer (pH 6,85). TLC'en viser mere end 50% monosubstitution med nogen disubstitution.

22 DK 168296 B1

Der tilsættes 150 ml ether og omrøres med 100 ml vand og nogle dråber iseddike. Etherfasen skilles fra, og den vandige fase ekstraheres flere gange mere med 100 ml ether. Etherekstrakterne kombineres og vaskes med vand (100 ml) 4 gange for at fjerne dimethylformamid.

Serinyl-chlorin-eg-esterne ekstraheres derpå ind i 100 ml 1M KOH-opløning (4 ekstraktioner med 25 ml hver). KOH-op-løsningen får lov at stå ved stuetemperatur i 24 timer for at hydrolysere. Komponenterne skilles fra ved neutralisering af opløsningen til pH 7 og påsætning på en revers-fase- (C1g-silicagel) kolonne (1,5 cm x 30 cm). Elue-ringen gennemføres under anvendelse af en 1 liters gradient af 30% til 80% methanol med 0,1M kaliumphosphat-puf-fer (pH 6,85). Fraktioner opsamles og karakteriseres ved TLC. Elueringsrækkefølgen er di(L)-diserinyl-chlorin e^, L-monoserinyl-chlorin e^ og chlorin eg. Methanolet fjernes ved lynfordampning, og de individuelle komponenter udfældes ved pH 3 under anvendelse af saltsyre.

Produkterne opsamles ved centrifugering og vaskes flere gange med meget fortyndet eddikesyre og tørres under vakuum.

Eksempel 3

Monoglycol-chlorin e^ (blandet-anhydrid-metoden) 625 mg chlorin e^ blev opløst i 300 ml dimethyl formamid (DMF), og 277 ul (0,002 mol) triethylamin blev sat (TEA) til DMF-opløsningen. Efter omrøring i 5 minutter tilsattes 201 ul (0,002 mol) ethylchlorformiat (EC), og der blev omrørt i 1½ time ved stuetemperatur.

75 mg (0,0009 mol) glycin (ammoniak-fri) blev sat til DMF-opløsningen, og opløsningen blev omrørt i 3 timer ved 50-60 °C.

23 DK 168296 B1 DMF-opløsningen blev prøvet for produkt ved revers-fase-(Cig-eilioagel) TLC under anvendelse af 70% methanol/30% 0,01 M natriumphosphat-puffer (pH 6,85) til at udvikle chromatogrammet.

DMF-opløsningen blev lyninddampet til nær ved tørhed, hvorpå den blev opløst i fortyndet NaOH-opløsning, og pH-værdien blev indstillet til 2,5-3 for at udfælde det faste stof. Bundfaldet blev derpå anbragt på en reversfase- (C^g-silicagel) kolonne (3,7 cm x 45 cm).

Fraktioner blev elueret under anvendelse 20-40% methanol i 0,01 M natriumphosphat-puffer (pH 6,85). Fraktionerne blev hældt sammen ifølge de individuelle komponenter.

Methanolet blev lynafdampet, og materialet blev udfældet ved pH 2,5-3,0. Bundfaldet blev vasket og centrifugeret 3 gange i fortyndet eddikesyre og vand. Produktet blev tørret under vakuum. Udbyttet af monoglycyl-chlorin eg var 87,5 mg.

Eksempel 4

Fremstilling af mono-L-asparaginyl-chlorin eg 500 mg chlorin eg og 175 mg l-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid-hydrochlorid blev opløst i 10 ml N,N'-dimethylformamid. Efter 5 minutter tilsattes 410 mg L-as-paragin. Opløsningen blev omrørt i 4 timer,r Asparaginet opløstes ikke helt under denne reaktion, men revers-fase-(Cig-silicagel) TLC under anvendelse af 70% methanol/0,01 M natriumphosphat-puffer (pH 6,85) viste noget produkt ved dette tidspunkt (lidt større end chlorin eg). Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 2,5 ml iseddike, og der blev fortyndet til et totalvolumen på 100 ml methanol og derpå tilsat 25 ml vand langsomt under omrøring. Opløsningen blev derpå sat på en 14 x 2 cm revers 24 DK 168296 B1 fase-(C^g-silicagel) kolonne vasket med vand og derpå med 5 ml 0,1 M NaOH-opløsning og endelig med 50 ml 0,01 M na-triumphosphat-puffer (pH 6,85). Produktet blev elueret af med methanol/vand i en trinvis gradient fra 20% methanol til 50% methanol. Fraktionerne indeholdende rent mono-L-asparaginyl-chlorin e^ som bestemt ved TLC under anvendelse af de ovenfor angivne betingelser blev hældt sammen, og methanolet blev fjernet ved rotationsinddampning. Produktet blev isoleret som trinatriumsaltet ved lyophi-lisering.

Eksempel 5 L-monocysteinyl-chlorin e^ (carbodiimid-metoden)

METODE I

130 mg chlorin e^ og 260 mg L-cystein-methylester-hydro-chlorid opløses i 18 ml dimethylformamid. Der tilsættes 100 mg N,N'-dicyclohexycarbodiimid, og reaktionsblandingen omrøres i 1 time. Derpå tilsættes yderligere 50 mg carbodiimid. Efter 1 time viser reaktionsblandingen sig at indeholde 75-80% af det monosubstituerede produkt ved revers-fase-TLC (C^g-plader med 70% methanol/30% 0,01 M kaliumphosphat, pH 6,85). Der tilsættes 200 ml diethyl-ether, vaskes 2 gange med 100 ml vand og elueres derpå med 30 ml 1 M KOH-opløsning.

Produktet får lov at hydrolyseres i mørke i KOH-opløsnin-gen i 12 timer og opvarmes derpå til 70 °C i 10 minutter for at fuldføre hydrolysen af estergrupperne. Produktet skilles derpå fra ved revers-fase-kolonne-chromatografi (C^g-revers-fase-silicagel, 1,5 cm x 30 cm) under anvendelse af trinvis-gradient-eluering med methanol i pufferen 0,01 M kaliumphosphat (pH 6,85). 5% methanol fjerner polære urenheder. Chlorin e^ elueres af fra kolonnen med 26% methanol. Methanolet fjernes ved lyninddampning, og 25 DK 168296 B1 L-monocysteinyl-chlorin eg udfældes ved pH 3, opsamles og vaskes 3 gange på centrifugen med fortyndet eddikesyre og tørres under vakuum.

5 METODE II

300 mg chlorin eg og 105 mg l-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid-hydrochlorid blev opløst i 6 ml N,N’-dimethylformamid. Efter 5 minutter tilsattes 255 mg 10 L-cystein-hydrochlorid. Opløsningen blev omrørt ved stue temperatur i 5 timer. Resten af proceduren er den samme som for fremstillingen af mono-L-asparaginyl-chlorin eg.

Eksempel 6 15

Fremstilling af mono-L-serinyl-2-formylchlorin eg (mono-L-serinyl-2-desvinyl-2-formyl-chlorin eg) 500 mg chlorin-eg-trimethylester blev fremstillet ifølge 20 proceduren beskrevet af Fischer og Stern i "Die Chemie des Pyrrols", Band II, Teil 2, Akademische Verlagsgesell-schaft, Leipzig 1940, side 98-102. Chlorin-eg-trimethyl-esteren blev opløst i 600 ml tilbagesvalende acetone. Der tilsattes langsomt 400 mg kaliumpermanganat og 800 mg 25 magnesiumsulfat opløst i 130 ml vand i løbet af ca. 1 time. Opløsningen blev holdt under tilbagesvaling i % time, efter at tilsætningen var fuldført. Efter afkøling tilsattes 300 ml methylenchlorid, og blandingen blev vasket 3 gange med vand i en skilletragt. Volumenet af me-30 thylenchlorid blev reduceret, og produktet chromatografe-ret på silicagel under eluering med en gradvis stigende procentdel ethylacetat i C^C^· Det første større brune bånd, som elueredes, blev opsamlet som produktet, 2-des-vinyl-2-formyl-chlorin eg. Udbyttet 94 mg.

Produktet blev forsæbet ved opløsning i tilbagesvalende n-propanol (0,1 ml/mg) og tilsætning af det seksdobbelte 35 26 DK 168296 B1 ækvivalent af IN KOH-opløsning. Trikaliumsaltet blev frafiltreret, vasket med n-propanol og tørret under vakuum til opnåelse af 2-formyl-chlorin e^.

100 mg 2-formyl-chlorin (i form af den frie syre) og 35 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydro-chlorid blev opløst i 2 ml N,Ν’-dimethylformamid. Efter 5 minutter tilsattes 125 mg L-serin-benzylester-hydrochlo-rid, der omrørtes kraftigt, indtil stoffet var fuldstændigt opløst, og opløsningen fik derpå lov at stå ved stuetemperatur i 2 timer. Ved dette tidspunkt tilsattes 0,5 ml iseddike og derpå 30 ml methanol og 12 ml vand.

Opløsningen blev sat på en C^g-revers-fase-kolonne (14 x 2 cm). Kolonnen blev vasket med vand (100 ml), derpå med 4 ml 1 M NH^OH-opløsning og derpå med vand igen (50 ml). Produktet blev elueret med methanol/vand. Fraktioner elu-eret fra kolonnen med 30-80% methanol indeholdt produkt såvel som carbodiimid-aktiveret chlorin som bestemt ved TLC på C^g-revers-fase-plader med opløsningsmidlet 70 vol.-% methanol/30 vol.-% puffer (0,1 M natriumphosphat, pH 6,85).

Disse fraktioner blev hældt sammen, og der tilsattes tilstrækkeligt 3 N NaOH-opløsning til at gøre opløsningen 0,1 N med hensyn til NaOH. Efter 1 time var hydrolysen fuldført som bestemt ved TLC i det ovenstående system. Methanolet blev fjernet ved rotationsinddampning, og opløsningens pH-værdi blev indstillet til 7,5 med saltsyre. Chlorinopløsningen blev derefter sat på den samme revers-fase-kolonne, som blev vasket med vand og elueret med me-thanol/vand under anvendelse af en trinvis gradient fra 10-50% methanol. Fraktionerne indeholdende rent mono-L-serinyl-chlorin som bestemt ved TLC (R^ lidt større end for den usubstituerede chlorin) blev hældt sammen, methanolet blev fjernet ved rotationsinddampning, og produktet tørret som trinatriumsaltet ved lyophilisering.

Eksempel 7 27 DK 168296 B1

Fremstilling af mono-L-serinyl-deuterochlorin e^ (mono-L-serinyl-2-desvinyl-chlorin e^ 5 A. Deuterochlorin e, 6

Deuterochlorin-eg-trimethylester blev fremstillet ifølge proceduren beskrevet af Fischer og Stern, i "Die Chemie 10 des Pyrrols, Band II, Teil 2, Akademische Ver lagsgesel 1-schaft, Leipzig 1940, side 104. Trimethylesteren blev derpå hydrolyseret til den frie syre ved opløsning i til-bagesvalende n-propanol (0,1 ml/mg) og tilsætning af 6 gange den ækvivalente mængde af IN KOH-opløsning. Produk-15 tet blev efter opvarmning opsamlet ved filtrering som kaliumsaltet og tørret under vakuum.

B. Mono-L-serinyl-deuterochlorin e^.

20 100 mg deuterochlorin e^ (i form af den frie syre) og 35 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydro- chlorid blev opløst i 2 ml N,Ν'-dimethylformamid. Efter 5 minutter tilsattes 125 mg L-serin-benzylester-hydrochlo-rid, der omrørtes kraftigt, indtil stoffet var fuldstæn-25 digt opløst, og opløsningen fik derpå lov at stå ved stuetemperatur i 2 timer. Ved dette tidspunkt tilsattes 0,5 ml iseddike, og derpå 30 ml methanol og 12 ml vand.

Opløsningen blev sat på en g-revers - fase-kolonne (14 x 30 2 cm). Kolonnen blev vasket med vand (100 ml), derpå med 4 ml 1M NH4OH-opløsning, og derpå med vand igen (50 ml). Produktet blev elueret med methanol/vand. Fraktioner e-lueret fra kolonnen med 30-80% methanol indeholdt produkt såvel som carbodiimid-aktiveret chlorin som bestemt ved 35 TLC på C^g-revers-fase-plader med opløsningsmidlet 70 vol.-% methanol/30 vol.-% puffer (0,1M natriumphosphat, pH 6,85).

28 DK 168296 B1

Disse fraktioner blev hældt sammen, og der tilsattes tilstrækkeligt 3 N NaOH-opløsning til at gøre. opløsningen 0,1 N med hensyn til NaOH. Efter 1 time var hydrolysen fuldført som bestemt ved TLC i det ovenstående system. Methanolet blev fjernet ved rotationsinddampning, og opløsningens pH-værdi blev indstillet til 7,5 med saltsyre. Chlorinopløsningen blev derpå igen sat på den samme re-vers-fase-kolonne, vasket med vand og elueret med metha-nol/vand under anvendelse af en trinvis gradient fra 10-50% methanol. Fraktionerne indeholdende rent mono-L-seri-nyl-chlorin som bestemt ved TLC (Rf lidt større end for den usubstituerede chlorin) blev hældt sammen, methanolet blev fjernet ved rotationsinddampning, og produktet tørret som trinatriumsaltet ved lyophilisering.

Eksempel 8

Fremstilling af mono-L-serinyl-mesochlorin e^ A. Mesochlorin e* 6

Mesochlorin-eg-trimethylesteren blev fremstillet ifølge proceduren beskrevet i Fischer og Stern, "Die Chemie des Pyrrols", Band II, Teil 2, Akademische Verlagsgesell-schaft, Leipzig 1940, side 102.

Mesochlorin-eg-trimethylesteren blev derpå hydrolyseret til den frie syre ved opløsning i tilbagesvalende n-pro-panol (0,1 ml/mg) og tilsætning af 6 gange.d^n ækvivalente mængde 1 N KOH-opløsning. Efter afkøling blev produktet opsamlet ved filtrering som kaliumsaltet og tørret under vakuum.

B. Mono-L-serinyl-mesochlorin e^ 100 mg mesochlorin e^ (i form af den frie syre) og 35 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid 29 DK 168296 B1 blev opløst i 2 ml N,N* -dimethylformamid. Efter 5 minutter tilsattes 125 mg L-serin-benzylester-hydrochlorid, der omrørtes kraftigt, indtil stoffet var fuldstændigt opløst, og opløsningen fik derpå lov at stå ved stuetem-5 peratur i 2 timer. Ved dette tidspunkt tilsattes 0,5 ml iseddike, og derpå 30 ml methanol og 12 ml vand.

Opløsningen blev sat på en C^g-revers-fase-kolonne (14 x 2 cm). Kolonnen blev vasket med vand (100 ml), derpå med 10 4 ml 1 M NH^OH-opløsning og derpå med vand igen (50 ml).

Produktet blev elueret med methanol/vand. Fraktioner elu-eret fra kolonneen med 30-80% methanol indeholdt produkt såvel som carbodiimid-aktiveret chlorin som bestemt ved TLC på C^g-revers-fase-plader med opløsningsmidlet 70 15 vol.-% methanol/30 vol.-% puffer (0,01 M natriumphosphat, pH 6,85).

Disse fraktioner blev hældt sammen, og der tilsattes tilstrækkeligt 3 N NaOH-opløsning til at gøre opløsningen 20 0,1 N med hensyn til NaOH. Efter 1 time var hydrolysen fuldført som bestemt ved TLC i det ovenstående system. Methanolet blev fjernet ved rotationsinddampning, og opløsningens pH-værdi indstillet til 7,5 med saltsyre. Chlorinopløsningen blev derpå igen sat på den samme re-25 vers-fase-kolonne, vasket med vand og elueret med metha-nol/vand under anvendelse af en trinvis gradient fra 10 til 50% methanol. Fraktionerne indeholdende rent mono-L-serinyl-chlorin blev bestemt ved TLC (R^ lidt større end for det usubstituerede chlorin) blev hældt sammen, metha-30 nolet blev fjernet ved rotationsinddampning, og produktet tørret som trinatriumsaltet ved lyophilisering.

35 30

Eksempel 9 DK 168296 B1

Di- (D, L) -serinyl-rhodin g,-, (carbodi imid-metoden) 5 140 mg rhodin g7 og 200 mg (D,L)-serin-methylester-hydro- chlorid opløses i 30 ml dimethylformamid. Der tilsættes 300 mg N,N'-dicyclohexycarbodiimid. Reaktionsblandingen får lov at stå i 1 time, og derpå tilsættes endnu 300 mg carbodiimid. Denne procedure gentages 2 gange, og deref- X0 ter får reaktionsblandingen lov at stå natten over. Reaktionen kan kontrolleres ved tyndtlagschromatografi på si-licagel under anvendelse af opløsningsmiddelblandingen benzen/methanol/88%-myresyre i volumen- forholdet 8,5:1,5:0,13.

15

Det disubstituerede rhodin g7 har den højeste R^-værdi, det usubstituerede rhodin g7 har den laveste, og de monosubstituerede isomerer ligger imellem og uadskilte.

20 Efter henstand natten over viser reaktionsblandingen sig at indeholde mindst 50% af det disubstituerede rhodin g7· Opløsningsmidlet fjernes under vakuum, og det resterende faste stof opløses i 50 ml 3 N saltsyrer.

25 Opløsningen får lov at stå ved stuetemperatur i 48 timer for at hydrolysere estergrupperne, og derpå udfældes chlorin-blandingen ved pH 2,5-3 og opsamles og vaskes med vand på centrifugen.

30 Rhodin-g7-blandingen renses ved opløsning i 0,05M NH^OH-opløsning og påsætning på en revers-fase-(C^g-silicagel) kolonne 2,5 cm x 30 cm. Elueringsproceduren er en lineær gradient fra 40-70% methanol i 0,01 M kaliumphosphat-puf-fer, pH 6,85 (totalvolumen 1 liter).

Det ledende rhodin g7 opsamles og lyninddampes for at fjerne methanol, og derpå udfældes opløsningen ved pH

35 31 DK 168296 B1 2,5-3, og produktet opsamles og vaskes 3 gange på centrifugen med fortyndet eddikesyre. Produktet tørres under vakuum.

5 Eksempel 10

Di- og mono-(L)-serinyl-rhodin gr, (blandet-anhydrid-meto-den) 10 50 mg (0,000087 mol) rhodin g^ opløses i 100 ml tetrahy- drofuran (THF), og der tilsættes 210 μΐ (0,002 mol) tri-ethylamin under omrøring. Efter 10 minutter tilsættes 195 al (0,00179 mol) ethylchlorformiat. Efter omrøring i 10 minutter sættes dråbevis 50 ml (0,01 mol) 0,2 M KOH-op-15 løsning indeholdende 250 mg (0,00169 mol) (L)-serin til THF-opløsningen under omrøring. Denne blanding omrøres i 60 minutter ved stuetemperatur.

Det organiske opløsningsmiddel lynafdampes, og reaktions-20 blandingen kontrolleres ved silicagel TLC for produkt. Benzen/methanol/88% myresyre (volumenforhold 8,5:1,5:0,13) anvendes til at udvikle chromatogrammet.

Efter kontrollering for produkt indstilles opløsningen 25 til pH 7,5-8,0 og anbringes på en revers-fase-(C^-sili-cagel) kolonne 2,5 x 30 cm. Reaktionsblandingen adskilles under anvendelse af en lineær gradient af 40-80% methanol i 0,01 M kaliumphosphat-puffer, pH 6,85 (totalvolumen 1 liter).

30

Kolonneafløbet opsamles via en fraktionsopsamler, og glassenes indhold blev hældt sammen efter de individuelle komponenter. Elueringsrækkefølgen er di-(L)-serinyl-rho-din 3η, mono-(L)-serinyl-rhodin g^ og usubstitueret rho-35 din g7· 32 DK 168296 B1

Methanolet lynafdampes, og materialet udfældes ved pH

2,5-3,0. Bundfaldet vaskes 3 gange med fortyndet eddikesyre i vand og produktet tørres under vakuum.

5 Under anvendelse af de før nævnte carbodiimid- eller blandet-anhydrid-metoder kan følgende forbindelser ifølge opfindelsen syntetiseres: (D,L)-serinyl-mesochlorin e^ 10 Glycyl-chlorin eg

Glycyl-mesochlorin eg «-(D,L)-alanyl-chlorin eg «- ( D, L )-alanyl-mesochlorin eg β-alanyl-chlorin eg 15 β-alanyl-mesochlorin eg e-amino-n-caproyl-chlorin e6 e-amino-n-caproyl-mesochlorin eg (D,L)-serinyl-bacteriochlorin eg Glycyl-bacteriochlorin eg 20 a-(D,L)-alanyl-bacteriochlorin eg β-alanyl-bacteriochlorin eg 6-amino-n-caproyl-bacteriochlorin eg Mono-, di- og triserinyl-chlorin eg Mono-, di- og triserinyl-mesochlorin eg 25 Mono-, di- og trithreoninyl-chlorin eg

Mono-, di- og trithreoninyl-mesochlorin eg Mono- og diglycyl-acetylchlorin eg Mono- og diserinyl-rhodin g^

Mono- og dimethionyl-formylchlorin eg 30 Mono- og dithreoninyl-rhodin g^

Mono- og dicysteinyl-chlorin eg Mono-, di- og triserinyl-bacteriochlorin eg Mono-, di- og trithreoninyl-bacteriochlorin eg Mono-, di- og tricysteinyl-bacteriochlorin eg 35

Eksempel 11 33 DK 168296 B1

Di-L-a-serinyl-chlorin e^ (blandet-anhydrid-metoden) 650 mg chlorin eg blev opløst i 30 ml dimethylformamid (DM). Der sattes 277 al (0,002 mol) triethylamin til DMF-opløsningen. Efter omrøring i 5 minutter til sattes 201 al (0,002 mol) ethylchlorformiat, og omrøringen fortsattes i yderligere 30 minutter. Derpå sattes 0,95 g (0,009 mol) L-a-serin til DMF-opløsningen, og denne blev omrørt i en time ved 50-60 °C.

DMF-opløsningen blev kontrolleret for dannelse af produkt ved revers-fase-(C^-silicagel) TLC under anvendelse af methanol/0,01 M natriumphosphat-puffer, pH 6,85 (i volumenforholdet 7,0:3,0) til at udvikle chromatogrammet. DMF-opløsningen blev lyninddampet til nærved tørhed, og reaktionsblandingen blev derpå optaget i fortyndet NaOH-opløsning, og pH-værdien indstillet til 2,5-3,0 for at udfælde blandingen. Bundfaldet blev derpå centrifugeret ned og vasket 2 gange med fortyndet eddikesyre i vand. Bundfaldet blev derpå genopløst i fortyndet NaOH-opløs-ning, og pH-værdien indstillet til 7,0. Denne opløsning sattes på en revers-fase-(Clg-silicagel) kolonne på 3,7 cm x 45 cm.

Produktet blev elueret fra kolonnen med en blanding af 0,1 M natriumphosphat-puffer (pH 6,85) og methanol i volumenforholdet 7,0:3,0. Der blev opsamlet fraktioner, og fraktionerne af rent di-a-serinyl-chlorin eg blev hældt sammen. Methanolet blev lynafdampet og produktet blev udfældet ved pH 2,5-3,0. Bundfaldet blev centrifugeret ned og vasket 3 gange med fortyndet eddikesyre i vand. Produktet blev lyophiliseret og gav et udbytte på 200 mg di-L-a-serinyl-chlorin eg.

34 DK 168296 B1 På lignende måde kan der ved anvendelse af andre aminosyrer fremstilles peptider som yderligere belyser udførelsesformer af, men ikke begrænser den foreliggende opfindelse, under anvendelse af proceduren fra de forudgående eksempler:

Di- og tri-(D,L)-serinylchlorin eg

Di- og tri-(D,L)-serinyl-mesochlorin eg

Di- og tri-glycyl-chlorin eg

Di- og tri-glycyl-mesochlorin eg

Di- og tri-a-(D,L)-alanyl-chlorin eg

Di- og tri-a-(D,L)-alanyl-mesochlorin eg

Di- og tri-Ø-alanyl-chlorin eg

Di- og tri-Ø-alanyl-mesochlorin eg

Di- og tri-e-amino-n-caproyl-chlorin eg

Di- og tri-e-amino-n-caproyl-mesochlorin eg

Di- og tri-(D,L)-serinylbacteriochlorin eg

Di- og tri-glycylbacteriochlorin eg

Di- og tri-a-(D,L)-alanylbacteriochlorin eg

Di- og tri-/5-alanylbacteriochlorin eg

Di- og tri-e-amino-n-caproylbacteriochlorin eg

Di- og tri-histidyl-chlorin eg

Di- og tri-histidyl-mesohlorin eg

Di- og tri-arginyl-chlorin eg

Di- og tri-arginyl-mesochlorin eg

Di- og tri-tyrosyl-chlorin eg

Di- og tri-tyrosyl-mesochlorin eg

Di- og tri-methionyl-chlorin eg

Di- og tri-methionyl-chlorin eg

Di- og tri-cysteinyl-chlorin eg

Di- og tri-cysteinyl-mesochlorin eg

Di- og tri-threoninyl-chlorin eg

Di- og tri-threoninyl-mesochlorin eg

Di- og tri-leucyl-chlorin eg

Di- og tri-leucyl-mesochlorin eg

Threoninyl-chlorin eg

Tyrosyl-chlorin eg 35 DK 168296 B1

Valyl-chlorin eg Leucyl-chlorin eg Isoleucyl-chlorin eg Prolyl-chlorin eg Methionyl-chlorin eg Histidyl-chlorin eg Arginyl-chlorin eg Lysyl-chlorin eg Glutaminyl-chlorin eg 4- hydroxyprolyl-chlorin eg 5- hydroxylysyl-chlorin eg e-amino-n-caproyl-chlorin eg r-aminobutanoyl-chlorin eg 3- methyl-histidyl-chlorin eg Alanyl-2-acetyl-chlorin eg Valyl-2-acetyl-chlorin eg Leucyl-2-acetyl-chlorin eg Isoleucyl-2-acetyl-chlorin eg Prolyl-2-acetyl-chlorin eg Methionyl-2-acetyl-chlorin eg Glycyl-2-acetyl-chlorin eg Serinyl-2-acetyl-chlorin eg Threoninyl-2-acetyl-chlorin eg Cysteinyl-2-acetyl-chlorin eg Tyrosyl-2-acetyl-chlorin eg Asparaginyl-2-acetyl-chlorin eg Lysyl-2-acetyl-chlorin eg Arginyl-2-acetyl-chlorin eg

Histidyl-2-acetyl-chlorin eg .

Glutaminyl-2-acetyl-chlorin eg 4- hydroxy-prolyl-2-acetyl-chlorin eg 5- hydroxy-lysy1-2-acetyl-chlorin e6 e-amino-n-caproyl-2-acetyl-chlorin eg r-aminobutanoyl-2-acetyl-chlorin eg 3-methyl-histidyl-2-acetyl-chlorin eg Ø-alanyl-2-acetyl-chlorin eg Alanyl-2-formyl-chlorin eg 36 DK 168296 B1

Valyl-2-formyl-chlorin eg Leucyl-2-formyl-chlorin eg Isoleucyl-2-formyl-chlorin eg Prolyl-2-formyl-chlorin eg Methionyl-2-formyl-chlorin eg Glycyl-2-formyl-chlorin eg Serinyl-2-formyl-chlorin eg Threoninyl-2-formyl-chlorin eg Cysteinyl-2-formyl-chlorin eg Tyrosyl-2-£ormyl-chlorin eg Asparaginyl-2-formyl-chlorin eg Lysyl-2-formyl-chlorin eg Arginyl-2-formyl-chlorin eg Histidyl-2-formyl-chlorin eg Glutaminyl-2-formyl-chlorin eg 4- hydroxy-prolyl-2-formyl-chlorin eg 5- hydroxy-lysyl-2-formyl-chlorin eg e-amino-n-caproyl-2-formyl-chlorin eg r-aminobutanoyl-2-formyl-chlorin eg 3-methyl-histidyl-2-formyl-chlorin eg Æ-alanyl-2-formyl-chlorin eg Alanyl-deuterochlorin eg Valyl-deuterochlorin eg Leucyl-deuterochlorin eg Isoleucyl-deuterochlorin eg

Prolyl-deuterochlorin eg Methionyl-deuterochlorin eg Glycyl-deuterochlorin eg

Serinyl-deuterochlorin eg ;

Threoninyl-deuterochlorin eg Cysteinyl-deuterochlorin eg Tyrosyl-deuterochlorin eg Asparaginyl-deuterochlorin eg Lysyl-deuterochlorin eg Arginyl-deuterochlorin eg Histidyl-deuterochlorin eg Glutaminyl-deuterochlorin eg 37 DK 168296 B1 4- hydroxy-prolyl-deuterochlorin eg 5- hydroxy-lysyl-deuterochlorin eg e-amino-n-caproyl-deuterochlorin eg r-aminobutanoyl-deuterochlorin eg 3- methyl-histidyl-deuterochlorin eg /5-alanyl-deuterochlorin eg

Valyl-mesochlorin eg Leucyl-mesochlorin eg Isoleucyl-mesochlorin eg Prolyl-mesochlorin eg Methionyl-mesochlorin eg Serinyl-mesochlorin eg Threoninyl-mesochlorin eg Cysteinyl-mesochlorin eg Tyrosyl-mesochlorin eg Asparaginyl-mesochlorin eg Lysyl-mesochlorin eg Arginyl-mesochlorin eg Histidyl-mesochlorin eg Glutaminyl-mesochlorin eg 4- hydroxy-prolyl-mesochlorin eg 5- hydroxy-lysyl-mesochlorin eg r-aminobutanoyl-mesochlorin eg 3-methyl-histidyl-mesochlorin eg

Der kan også fremstilles andre aminosyrederivater af te-trapyrrolerne. De følgende aminosyrer kan også anvendes til at fremstille di-, tri- eller, hvor det er passende, tetra-aminosyrederivaterne af chlorinerne,. porphyrinerne eller bacteriochlorinerne under anvendelse af procedurerne fra en af de før nævnte metoder: piperidin-2-carboxylsyre, pyrro1-2-carboxylsyre, piperidin-2-propionsyre og pyrrol-2-eddikesyre.

DK 168296 Bl 38

Blandede aminosyrederivater af tetrapyrrolerne kan også fremstilles. De forskellige chlorinderivater, porphyrin-derivater og bacteriochlorinderivater kan inkludere hvilke som helst 2 eller 3 af de følgende aminosyrer: glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin, glutamin, lysin, arginin, histidin, α-alanin, Ø-alanin, valin, leu-cin, isoleucin, prolin, a-phenylalanin, /5 -phenylalanin, tryptophan, methionin, e-amino-n-capronsyre, piperidin-2-carboxylsyre, pyrrol-2-carboxylsyre, piperidin-2-carbo-xylsyre, pyrrol-2-eddikesyre.

Det synlige absorptionsspektrum i pyridin for alle amino-syrederivaterne ifølge opfindelsen er identisk med spektret af udgangs-tetrapyrrolen.

Forbindelsernes fysiske egenskaber (relativ polaritet) måles ved hjælp af et chromatografisk standardsystem. De chromatografiske data (R^-værdier) blev målt på BAKER tyndtlagschromatografiske C^g-silicagel-plader, hvis partikelstørrelse er 20 fim, og hvis overtrækstykkelse er 200 nm. Opløsningsmiddelsystemet for disse chromatografiske forløb bestod af 75% methanol og 25% 0,01 M kaliumphos-phat-puffer, pH 6,85. Forbindelserne blev sat på og tørret på pladen som natriumsaltene ved omkring neutral pH og minimumsaltkoncentrationer. Rf-værdierne for de forskellige derivater er anført i TABEL 1. Spektroskopiske data er angivet i TABEL 2.

DK 168296 B1 39 TABEL 1 R^-værdier

Forbindelser Derivat Rf 5 Chlorin eg — 0,66

Chlorin eg di-L-a-serinyl 0,78 2-formyl-chlorin eg ----- 0,74 2-acetyl-chlorin e& ----- 0,71

Deuterochlorin eg ----- 0,79 10 Mesochlorin eg ----- 0,69 2-formyl-chlorin eg Mono-L-serinyl 0,87 2-acetyl-chlorin eg Mono-L-serinyl 0,86

Deuterochlorin eg Mono-L-serinyl 0,90

Mesochlorin eg Mono-L-serinyl 0,73 15 Chlorin eg Mono-L-asparaginyl 0,72

Chlorin eg Mono-L-cysteinyl 0,93

Chlorin eg Mono-L-serinyl 0,72 TABEL 2 20 Spektroskopiske absorptionsdata

Opløsningsmidlet er i alle tilfælde p-dioxan.

Absorptions- maximum i det Soret- synlige område bånd

25 Forbindelse nm nM

Mesochlorin eg 651 399 2-acetyl-chlorin eg 712, 683 410 2-formyl-chlorin eg 687 412 30 Deuterochlorin eg 653 398

Chlorin eg 666 402

Absorptionsdata for aminosyre-konj ugaterne er identiske med dem for udgangs-chlorinerne.

De følgende forskrifter beskriver proceduren for anvendelsen af de terapeutiske præparater indeholdende forbind- 35 40 DK 168296 B1 eiser ifølge opfindelsen til behandling af rottetumorer. Eksempel 12 5 Forsøgene med fotodynamisk terapi er blevet udført på Buffalo-rotter under anvendelse af den transplanterbare tumor, Morris Hepatoma 7777. Tumorerne blev transplanteret subkutant på ydersiden af låret. Under behandlingen varierer tumorerne i størrelse mellem 1 og 2,5 cm i dia-10 meter.

Den almene behandlingsplan er som følger. Rotterne injiceres med en opløsning af chlorinen fremstillet som følger: 20 mg af natriumsaltet af chlorinen opløst i 1 ml 15 0,9% NaCl-opløsning. Chlorinopløsningen blev derpå inji ceret intravenøst igennem den ydre halsvene, medens rotten var anæstetiseret med ether. Volumenet af injiceret opløsning blev udregnet på basis af dyrets vægt og doseringen, beregnet på vægt, for det bestemte forsøg. Et 20 specificeret tidsinterval fik derpå lov at gå, før lysbehandlingen blev startet.

Lysbehandlingen af rotterne skete uden bedøvelse. Rotterne blev spændt fast, håret fjernet i behandlingsområdet, 25 og de blev behandlet med laserlys fra en Cooper Aurora argonpumpet, justerbar farvestoflaser.

Laseren var udstyret med et fiberoptisk lysfremføringssystem koblet til et mikrolinsesystem udviklet af Dr. Da-30 niel Doiron, D.R.D. Consulting, Santa Barbara, Califor nia, U.S.A.

Linsen spreder laserstrålen og giver en cirkulær fordeling af lys med homogen lysintensitet over hele området 35 af den indfaldende lysstråle. Lysets bølgelængde blev indstillet under anvendelse af et Hartridge reversionsspektroskop. Lysintensiteten blev bestemt under anvendel- 41 DK 168296 B1 se af et radiometer Model 65A fra Yellow Springs Instrument .

Mikrolinsen blev anbragt i en sådan afstand fra dyrets 5 hud, at den gav en belysningsdiameter på 1,5 cm, og lysstrømmen blev varieret ved styring af laserudgangseffekten.

Efter belysningen blev dyret sat tilbage i dets bur, og 10 24 timer senere blev det behandlet intravenøst i den ydre halsvene med 14 mg Evans Blue farvestof opløst i 250 ul 0,9% NaCl-opløsning. To timer efter injektionen blev rotten aflivet, og tumoren gennemskåret på tværs. Graden af tumornekrose blev bedømt efter manglen på farveoptagelse 15 (M. C. Berenbaum, Br. J. Cancer, 45: 751 (1982)), og dyb den af de nekrotiske tværsnit af tumoren blev optegnet i millimeter.

Tabel 3 sammenfatter virkningerne af disse midler på tu-20 morer. De beskrevne betingelser resulterer i målelig og signifikant beskadigelse af tumorerne.

I alle tilfælde, undtagen hvor anført, skete vævsbeskadigelse selektivt på tumorvævet som bedømt ved Evans Blue 25 metoden, selvom der i næsten alle tilfælde lå normal hud over tumoren, og behandlingsområdet overlappede væsentlige områder af normalt muskelvæv.

Dataene for fotodynamisk terapi er anført i tabelform.

30 Spalte nr. 2 er den totale påførte lysdosis angivet i J/cm2. Spalte nr. 3 er den indgivne dosis af chlorin angivet i mg lægemiddel pr. kg rottekropsvægt. Spalte nr. 4 er tidsrummet mellem indgivningen af midlet og behandlingen med laserlys. Spalte nr. 5 er bølgelængden af behand-35 lingslyset i nm. Spalte nr. 6 er intensiteten af behandlingslyset i mW/cm2. I spalte nr. 7 er x gennemsnitsdybden af nekrose i mm af tumorvævet, dvs. afstanden fra den DK 168296 B1 42 nekrotiske top af tumoren nærmest huden til den nekrotiske kant af tumoren fjernest fra huden.

s.d. er standard afvigelsen på ~x.

5 (n) er antallet af tumorer eller ben, som er involveret i forsøget.

Spalte nr. 8 er området af nekrosedybden i mm indenfor 10 gruppen.

TABEL 3 15 I |Dosis |Tid mel-| | | | | |Lys- Jaf Ilem mid-| |lnten-| | | Om- |dosis|midlet|del og |Bølgelængde |sitet | | |råde

Tumor|j/cm|mg/kg |lys/h |nm JmW/cm | x+s.d.|(n)J mm -1-1-1-1-1-1-hH- 20 77771 20 I 20 I 24 | monoglycyl- | 100 |3,9+3,0|(5) |2-91 III I chlorin eg | | | | III I 665 i i i i

III I I I I I

77771 20 | 20 | 24 |mono-L-a-ala- | 100 |3,8+1,8|(2) |2,5-5 25 III |nyl-chlorin eg | | | | III I 665 i i i i

III I I I I I

7777 | 20 I 20 I 24 |mono-L-a-seri- | 100 |6,3+2,7|(6) |3-10

| I I |nyl-chlorin eg | III

30 III I 665 I I I I

35 3 af 8 tumorer viste ingen necrose p.g.a. middel og lys.

43 DK 168296 B1

Eksempel 13

Behandlings- og bedømmelsesproceduren er som følger: 5 DBA/2 Ha Ros-d+Ha mus med transplanterede SmT-F tumorer enten i den nedre del af bagbenet eller i siden af musen blev injiceret intravenøst via den ydre halsvene eller intraperiotonealt med det fotosensitiverende middel. Ved den angivne tid efter injektionen blev området over tumo-10 ren barberet, og lysbehandlingen begyndt.

Lys fra en Cooper Aurora argonpumpet indstillelig farvestoflaser blev påført via et mikrolinsesystem (udviklet af Dr. Daniel Doiron, D.R.D. Consulting, Santa Barbara, 15 California, U.S.A.) koblet til laseren gennem en kvartsfiber. Linsens optiske egenskaber er således, at lyset træder ud af linsen i et cirkulært mønster med homogen intensitet over hele det belyste område. Det belyste områdes diameter er en funktion af afstanden fra linsen.

20

Lysintensiteten blev målt med et Model 65A radiometer fra Yellow Springs Instrument ved behandlingspunktet. En cirkel med diameter 1,5 cm på dyrets hud centreret så tæt som muligt over tumoren blev bestrålet ved alle 3 forsøg.

25 Lysets intensitet, bølgelængde og dosering er inkluderet i dataene for individuelle grupper af dyr. Bølgelængder indstilles under anvendelse af et Hartridge reversionsspektroskop til indenfor 1 nm af den angivne værdi.

30 24 timer efter lysbehandlingen modtog hver mus 5 mg Evans

Blue farvestof intravenøst (M. C. Berenbaum, Br. J. Cancer. 45:571 (1982)). Efter yderligere 2 timer blev musene aflivet, og tumorerne gennemskåret lodret igennem centret af det lysbehandlede område. Upåvirket tumor var farvet 35 blå ligesom upåvirket normalt væv. Nekrotiske eller påvirkede områder var hvide eller røde af udseende. Målinger på både de hele tumorer og påvirkede områder af tumo- 44 DK 168296 B1 rerne blev foretaget lodret og vandret med krumpasser til den nærmeste halve millimeter. Resultaterne for repræsentative forbindelser er vist i de følgende tabeller: 45 DK 168296 B1 TABEL 4 - Musedata

Forbindelse_Morto-L-serinyl-mesochlorin eft_ 1. Gruppe nr. 78 «- *- *- *- 2. Startdato --------------------------------------------- 3. Mus nr. 1234 5 ^ 4. Køn m <- * * *~ 5. Musevægt, g 23,3 25,8 21,0 22,8 26,4 6. Dosis, mg/kg 100,0 «- 7. Indgivningsmetode iv * *- *- *- 8. Tid, h 24,0 «- 10 - 9. Tumortype SMT-F <-♦-<- «- 10. Tumorposition h. ben *- ♦" *- 2 11. Lysintens, mW/cm 200,0 *-<-♦- ♦- 2 12. Lysdosis, J/cm 300,0 *.

15 13. Bølgelængde, nm 651 «- 14. Injekt.dato ---------------------------------------------- 15. Længde 1 1,00 0,90 0,75 0,55 1,05 16. Bredde 1 0,60 0,55 0,65 0,45 0,45 2o - 17. Dybde 1 0,45 0,30 0,30 0,20 0,25 18. Drabsdato ----------------------------------------------- 19. Længde 2 1,30 1,30 0,30 1,90 1,30 ^ 20. Bredde 2 1,20 1,00 0,80 0,70 0,85 21. Dybde 2 0,65 0,70 0,65 0,60 0,60 22. Længde 3 0,00 0,80 0,10 0,60 0,00 23. Bredde 3 0,00 0,40 0,10 0,60 0,00 30 24. Dybde 3 0,00 0,30 0,10 0,20 0,00 25. Bemærkninger ingen rød hud rød hud virk- 0,9x0,9 0,6x0,6 ning cm cm, ingen virkning på tumor 46 DK 168296 B1 TABEL 5 - Musedata

Forbindelse Mono-L-serinyl-2-acetyl-chlorin 1. Gruppe nr. 81 «- 2. Startdato --------------------------- 3. Mus nr. 1 2 4. Kon m m 5. Musevægt, g 26,5 21,0 6. Dosis, mg/kg 100,0 ♦* 7. Indgivningsmetode iv «- 8. Tid, h_24,0 ♦-_ 9. Tumortype SMT-F +· 10. Tumorposition h. ben «- ............................. 2 11. Lysintens. mW/m 200,0 «- 2 12. Lysdosis, J/cm 300,0 * 15 13. Bølgelængde, nm 680 14. Injekt.dato ---------------------------------- 15. Længde 1 0,80 0,80 16. Bredde 1 0,45 0,60 17. Dybde 1_0,40 0,40_ 18. Drabsdato ----------------------------------- 19. Længde 2 1,20 0,90 20. Bredde 2 0,90 0,70 21. Dybde 2_0,60 0,40_ 22. Længde 3 0,00 0,00 25 23. Bredde 3_0,00 0,00_ 24. Dybde 3_0,00 0,00_ 25. Bemærkninger ingen ingen virk- virkning ning 30 35 47 DK 168296 B1 TABEL 6 -_Musedata

Forbindelse Mono-L=56riTiyl-deuterochlorin efi_ 1. Gruppe nr. &2 *- 2. Startdato --------------------------------------------- 3. Mus nr. 12345 5 ----------------------- ........ ------- ------ -------------- ---------------- 4. Kon m «- 5. Musevægt, g 25,7 23,2 21,3 20,5 24,4 6. Dosis, mg/kg 100,0 ♦- 7. Indgivningsmetode iv * *· ♦“ ♦· 8. Tid, h 24,0 <- 10 - 9. Tumortype SMT-F «- 10. Tumorposition h. ben +- *- *- 2 11. Lysintens. mW/cm 200,0 *- 2 12. Lysdosis, J/cm 300,0 + *- *- 15 13. Bølgelængde, nm 655 ♦- 14. Injekt.dato --------------------------------------------- 15. Længde 1 1,40 1,75 1,90 1,45 1,35 ΙβΓ Breddel 1,15 1,10 0,65 1,05 0,85 17. Dybde 1_0,75 1,00 0,20 0,90 0,65 20 18. Drabsdato --------------------------------------------- liT Længde 2 1,70 1,80 2,20 1,75 1,50 20. Bredde 2 0,80 1,15 1,00 1,25 0,85 21. Dybde 2 0,60 0,60 0,80 0,50 0,65 22. Længde 3 0,30 0,40 0,40 1,00 0,00 25 23. Bredde 3 0,35 0,40 0,40 1,15 0,00 24. Dybde 3 0,15 0,20 0,20 0,20 0,00 25. Bemærkninger ingen virkning 30 35 DK 168296 B1 48 TABEL 7 - Musedata

Forbindelse Mono-L-asparaginyl-chlorin efi 1. Gruppe nr. 83 *- *- *- *- 2. Startdato -------------------------------------------- 3. Mus nr. 1 2 3 4 5 5 - 4. Kon m * *- *- *· 5. Musevægt, g 25,4 25,0 25,8 24,6 24,1 6. Dosis, mg/kg 100,0 «-«-«- *- 7. Indgivningsmetode iv *- *- *- *- 8. Tid, h 24,0 «-«-«- «- i0 - 9. Tumortype SMT-F *- *- *· *- 10. Tumorposition h.ben «-«-«- *- 2 11. Lysintens. mW/cm 200,0 «-<-♦- *- 12. Lysdosis, J/cm^ 300,0 +- 15 13. Bølgelængde, nm 665 «-♦-<- *- 14. Injekt.dato --------------------------------------------- 15. Længde 1 1,30 1,20 1,30 1,25 1,00 16. Bredde 1_0,90 0,90 1,05 0,75 0,70 17. Dybde 1_0,60 0,55 0,60 0,60 0,50 20 18. Drabsdato --------------------------------------------- 19. Længde 2 1,05 1,40 1,60 1,60 1,30 20. Bredde 2 0,90 0,85 0,80 0,75 0,90 21. Dybde 2 0,65 0,65 0,60 0,65 0,60 22. Længde 3 1,05 1,40 1,10 1,60 1,05 25 23. Bredde 3 0,90 0,85 0,50 0,75 0,60 24. Dybde 3 0,50 0,60 0,35 0,65 0,45 25. Bemærkninger hudvirk- hudvirk- hudvirk- hudvirk ning ning ning ning 0,65x0,60 0,8x0,9 0,95x0,95 0,5«), 5 __cm_cm_ cm : cm 30 35 49 DK 168296 B1 TABEL 8 - Musedata

Forbindelse Mono-L-Serirtyl-2-formyl-chlorin efi 1. Gruppe nr. 85 «- ♦- <- 2. Startdato ------------------------------------- 3. Mus nr. 1234 5 --------------------- ... ------- ----------------------- 4. Køn m «- *- 5. Musevægt, g 26,0 20,5 20,2 28,8 6. Dosis, mg/kg 100,0 7. Indgivningsmetode iv v 8. Tid, h_24,0 «-_«-_«-_

^ 9. Tumortype SMT-F

10. Tumorposition h. ben 2 11. Lysintens. mW/cm 200,0 *-*-*- 12. Lysdosis, J/cm^ 300,0 15 13. Bølgelængde, nm 690 14. Injekt.dato -------------------------------------- 15. Længde 1 1,60 1,70 1,80 1,60 ϊβΓ Bredde 1 1,00 1,10 1,20 1,00 17. Dybde 1_0,70 0,75 0,60 0,70 20 18. Drabsdato ---------------------------------------- 19. Længde 2 1,60 1,60 1,00 1,70 20. Bredde 2 1,05 1,10 1,30 1,10 21. Dybde 2 0,75 0,80 0,80 0,80 22. Længde 3_0,40 1,30 0,90 0,00 25 23. Bredde 3 0,30 0,60 0,80 0,00 24. Dybde 3_0,15 0,25 0,30 0,00 25. Bemærkninger ingen virk- _ning_ 30 35 DK 168296 B1 50 TABEL 9 - Musedata

Forbindelse Mono-L-cysteinyl-chlorin efi 1. Gruppe nr. 86 «- «- *- 2. Startdato --------------------------------------------- 3. Mus nr. 1234 5 5 - 4. Kon m «- ♦- «- «- 5. Musevægt, g 26,0 26,2 27,1 22,2 26,0 6. Dosis, mg/kg 100,0 ♦-«-«- <- 7. Indgivningsmetode iv *- *· ♦* «- 8. Tid, h 24,0 ♦-«-<- ♦.

10 - 9. Tumortype SMT-F «_ 10. Tumorposition h. ben ♦*«-«- «- 2 11. Lysintens. mW/cm 200,0 «-«-«- <- o 12. Lysdosis, J/cm 300,0 15 13. Bølgelængde, nm 665 «-«_«. ♦* 14. Injekt.dato ----------------------------------------------- 15. Længde 1 1,45 2,05 2,05 0,90 1,80 16. Bredde 1 1,00 1,20 1,60 0,85 1,30 17. Dybde 1_0,75 0,65 0,90 0,60 0,70 20 18. Drabsdato ----------------------------------------------- 19. Længde 2 1,40 1,80 1,80 1,00 2,00 20. Bredde 2_1,00 1,05 1,40 1,10 1,30 21. Dybde 2_0,80 0,70 0,80 0,75 0,80 22. Længde 3_1,40 1,60 1,60 1,00 1,85 25 23. Bredde 3_1,00 1,05 1,10 1,10 1,30 24. Dybde 3_0,80 0,45 0,60 0,70 0,75 25. Bemærkninger rod hud hud- hud- hud- hud- 1,3x1,0 virk- virk- virk- virk- cm, ning ning ning ning nogen 1,6x1,2 1,4x1,4 0,9x0,9 l,5xL,4 muskel- cm cm cm cm skade nogen muskel- 30 muskel- skade skade 35 51 DK 168296 B1

LO O O O O O

VO CO O W CS CO

s «. V * * ·*> ffl O O O O O o

Ό II i i I

HO in in O O O

μ CO ^ o o o ε ε » * «· * o o o o o o o cs ^ o co.cn co

• Η Η O Η O H

TJ s < s v s . o o, o o, o, o, cd ε +l +l +l +l +l

+0 H VD CO Η CS

in vo h in h ^ V K v o o o o o /-s r> /*n C in in cs <Φ w in »1_r> I 0) 0) Ό

D) O

hg in in o o in h «.(Hg <o vo co cn in in

CqhC vDioiOiOiOiO

w cs I g

COtDO OOOOOO

>s0^. OOOOOO

JOO CO CO CO CO CO CO

• I

O I CS

i-ι c +> ε

•Η I Φ U

h ro β +> n oooooo

<D >10) -H 3 OOOOOO

^ tJ+JWg CNJ<N<NCS<SN

(0 μ Η μ h fc fc Λ fc h

o 0) I I I I I I

jj B Q. E"< EH E-* &* iH IH

S 3 >» s s s s s s ε-i 4-> cn to co co co co μ to

<H Ε H CD

c o) α) >i

S Η Ό H

e Ό Η Ό Ε Ή <D Ή O) S· ^

Λ E-ι i g O X! CS<NCS<S<S<S

CD

U O ω Q) Η I I O) 0) Ό > d l Ό cn XJ G-H-HQ)0 > > > > > > i ω h o d ε -μ ·η ·η ·η ·η ·η ·η ^ m < Q) Eh CQ Ο) C -Η I X Λ Λ μ co Ό +J \ σοοοοο Q) Om-HCDO) oooooo Η Q <0 g Η g HH H H; Η Η «Η

0) I

η Η >i i i vo i vo i vo

.μ CHCN<DCS<D<S<D

H >1 l i i I

•H OdHdHdHdH JO

(0 H >i -H >i H >i H >h 0) <d μφαμαμαμΰ^, c φ (0 +> -Η O ·Η O *H O H d

μ CO avoWvD^HMH^H^iH

S H WQ)>1(DQ)X:CDJ3CD£<DM

4J 0) <0 u coocootoocoo ro -c i d i α i i i i i p i h

Η Ή lhlhl>il>il<DlO

c λ οοοοο+^οεο-μοο W μ dHdHdødMdddw φ O 0X50X5000000)0® S εοεοΗΛε^ε-οεε DK 168296 B1 52 TABEL 11-1 Musedata

Forbindelse Mono-L=a-Setinyl-chlorin _ 1. Gruppe nr. 49 <- ♦* *- 2. Startdato ------------------------------------- 3. Mus nr. 12 3 4 5 - 4. Kon m + + + 5. Musevægt, g 24,8 22,1 20,1 16,4 6. Dosis, mg/kg 100,0 <-«-♦- 7. Indgivningsmetode iv ♦- «- «- 8. Tid, h 24^0 ™ " ~ 1Q - 9. Tumortype SMT-F <-♦-«- 10. Tumorposition h. ben 2 11. Lysintens. mW/cm 75,0 +-«-<- 2 12. Lysdosis, J/cm 20,0 <-♦-«- 15 13. Bølgelængde, nm 665 14. Injekt.dato -------------------------------------- 15. Længde 1_0,00 1,40_2^0_1,50 16. Bredde 1 0,00 0,80 1,00 0,90 17. Dybde 1 0,00 0,65 0,60 0,60 20 18. Drabsdato ---------------------------------------- 19. Længde 2_0,00 1,60_^20_1,90 20. Bredde 2 0,00 0,85 1,15 1,15 21. Dybde 2 0,00 0,45 0,65 0,60 22. Længde 3_0,00 1,60_1^20_1,50 25 23. Bredde 3_0,00 0,85 1,00_1,20 24. Dybde 3_0,00 0,45 0,50_0,50 25. Bemærkninger død benet op- benet benet op- af svulmet, opsvul- svulmet, ethe- huden met, hud- huden ren lyserød en lyse- . lyserød over beh. rød over over beh.

området, beh. om- området, 30 øverste rådet, tumoren 2/3 af tumoren rød tumoren rød for- foroven, rød. oven.

35 53 DK 168296 B1 TABEL 11-2 Musedata Forbindelse <- Γ. Gruppe nr. ♦* <- 2. Startdato ----------------------------------------- 3. Mus nr. 5 67 8 5 ----------------------------------....... ..... — " - ------------- — · 4. Kon f f f f 5. Musevægt, g 20,7 22,7 20,9 19,4 6. Dosis, mg/kg «-♦*♦-«- 7. Indgivningsmetode *-*-+-*- 8. Tid, h «-«-«-«- 10 - 9. Tumortype «_♦.«_«- 10. Tumorposition 2 11. Lysintens. mW/cm *-*-*-*- 2 12. Lysdosis, J/cm «-♦-*·«- 15 13. Bølgelængde, nm ♦- *- * *- 14. Injekt.dato ------------------------------------------- 15. Længde 1 1,60 1,60 1,50 0,90 16. Bredde 1_M5_(^90_:^25_0,75 17. Dybde 1 0,65 0,70 0,70 0,70 20 18. Drabsdato -------------------------------------------- 19. Længde 2 1,20 1,70 1,90 1,45 20. Bredde 2 1,05 1,05 1,35 0,95 21. Dybde 2_0J30_0^80_0^85_0,80 22. Længde 3_M0_1^50_l^tiO_1,30 25 23. Bredde 3_M5_^95_1^_0,95 24. Dybde 3_^50_OJ50_0/70_0,60 25. Bemærkninger benet op- benet op- benet op- benet op svulmet, svulmet, svulmet, svulmet, huden huden huden huden lyserød lyserød lyserøcl· lyserød over beh. over beh. over beh. over beh.

området, området, området, området, 30 øverste øverste øverste øverste 2/3 af 2/3 af 1/2 af 2/3 af tumoren tumoren tumoren tumoren rød. rød. rød. rød.

35 DK 168296 B1 54 TABEL 11-3 Musedata

Forbindelse Γ. Gruppe nr. ♦-«-*- 2. Startdato ------------------------------------- 3. Mus nr. 9 10 11 5 --- 4. Køn + + m 5. Musevægt, g 20,6 20,2 19,6 6. Dosis, mg/kg «-«-«- 7. Indgivningsmetode «-«-<- 8. Tid, h *- «- 0,0 10 - 9. Tumortype *- *- 0,0 10. Tumorposition <- <- 0,0 2 11. Lysintens. mW/cm ♦- *- 0,0 2 12. Lysdosis, J/cm *- * 0,0 15 13. Bølgelængde, nm ♦- <- 0,0 14. Injekt.dato -------------------------------------- 15. Længde 1 1/70 1/30 M0 16. Bredde 1 0,95 0,90 0,00 17. Dybde 1_0^5_0^0_0,00 20 18. Drabsdato ---------------------------------------- 19. Længde 2 1,70 1,70 0,00 20. Bredde 2 1,00 1,10 0,00 21. Dybde 2 0,95 0,85 0,00 22. Længde 3 0,40 1,10 0,00 25 23. Bredde 3 0,90 0,95 0,00 24. Dybde 3 0,60 0,45 0,00 25. Bemærkninger benet op- benet op- død af svulmet, svulmet, etheren huden lyse- huden lyse- efter rød over rød over injek- beh. områ- beh. områ- tionen __ det, øverste det, øverste 30 2/3 af tumo- 1/2 af tumoren rød ren rød 35 55 DK 168296 B1 TABEL 12-1 Musedata

Forbindelse MonogiyOyl-chlorin efi_ 1. Gruppe nr. 47 <-«-<- *- 2. Startdato -------------------------------------------- 3. Mus nr. 12345 5 .. -...... ........ ........ - — ........ ------------- ' 4. Kon f * ♦* *- 5. Musevægt, g 20,4 18,7 21,3 19,6 18,4 6. Dosis, mg/kg 100,0 <- *- *- 7. Indgivningsmetode iv «- *- * 8. Tid, h 24,0 « *- - 9. Tumortype SMT-F <-*.*- *- 10. Tumorposition h. ben *- *- *~ 2 11. Lysintens. mW/cm 75,0 <_ 2 12. Lysdosis, J/cm 20,0 ♦- 15 13. Bølgelængde, nm 665 4- ♦- 14. Injekt.dato ------------------------------------------- 15. Længde 1 1,60 1,10 1,80 1,85 1,35 16. Bredde 1_1,00 0,95 1,10 1,50 1,05 17. Dybde 1 0,80 0,65 0,60 0,85 0,65 20 18. Drabsdato ------------------------------------------- 19. Længde 2 1,20 0,00 1,65 1,40 1,25 20. Bredde 2 0,90 0,00 0,40 1,00 0,95 21. Dybde 2_0,90 0,00 1,00 0,90 0,65 22. Længde 3_0,70 0,00 0,40 0,30 0,70 25 23. Bredde 3 0,60 0,00 0,60 0,60 0,80 24. Dybde 3_0,30 0,00 0,20 0,20 0,25 25. Bemærkninger død af farve- injek- tionen, kan ikke 30 aflæses 35 DK 168296 B1 56 TABEL 12-1 Musedata

Forbindelse 1. Gruppe nr. «- «- <-«-«- 2. Startdato --------------------------------------------- 3. Mus nr. 6 7 8 9 10 5 ---— 4. Kon «- *- 5. Musevægt, g 19,6 19,1 20,1 19,8 19,6 6. Dosis, mg/kg *- *- 7. Indgivningsraetode «- *- 8. Tid, h ♦* «- 10 -— 9. Tumortype «- *- 10. Tumorposition *- +- 2 11. Lysintens. mW/cm 2 12. Lysdosis, J/cm «- ♦- <-«-«- 15 13. Bølgelængde, nm ♦- *- +- *- 14. Injekt.dato -------------------------------------- 15. Længde 1 1,30 1,35 1,35 1,35 1,30 16. Bredde 1 0,95 1,00 0,90 1,05 0,90 17. Dybde 1_0,70 0,80_0,60 0,60 0,50 20 18. Drabsdato ------------------------------------------- 19. Længde 2 1,05 1,35 1,40 1,35 1,20 20. Bredde 2_1,00 1,00_1,10 1,00 1,10 21. Dybde 2_0,65 0,90_0,80 0,80 0,70 22. Længde 3_0,00 0,75_0,00 0,00 0,35 25 23. Bredde 3_0,00 0,80_0,00 0,00 0,90 24. Dybde 3_0,00 0,90_0,00 0,00 0,25 25. Bemærkninger ingen ikke ingen ingen virk- klart virk- virkning om virk- ning ning ningen skyldes behand-lingen 35 DK 168296 B1 57 φ ^ co v o >· e(0 I o ME in i i o o o ' o o 'c σ> co σ> co

. o H

|Q k ^ • O o w +1 +1 fe t Φ -H m co in Ό > o> o w h £3 C i *· -

>* «w -ri 3 E O O

D Λ C -P O

I <D

m ό in in o> o> ig g

rH C ΙΟ lO

© æ E

CQ <-1 c

CO <N O O

I Ή E - "

.. co co o o Q

co >< o nj (N

H J tt Ό φ I 03 _

5 C +> E O O

« -Η I © O

4-> I» C ·Ρ \ £1 in

>i Φ -H 3 IN IN

H J ·Ρ B S

+} - «

<0 Ή C C

43 I i +> 0) g +> O 10 -H C Φ JO jo

<0 E C CO O M

«Μ 3 Φ O ·Η >l · · C ΒΜϋ-ΡΌ -C £3 i

i E H CO

(0 © © >< 01 _ H, 2 ^ <n

Ό Η Ό S

fH Ή B Ή D CO 03 φ E- £ E O Λ

CO

2 H M C, fe

I j Q Φ I I

H Cd £ tt fe fe

H S 3 >i Σ Z

< Eh +5 W W

Φ E< S 5,85

® "co Ό -P N. O O

H O 4-1 -Η Φ Ol O O

jg Q <0 E rH E Η H

ffl +* Λ Π ·Η φ° δ1 φ Μ >η C ® © β Γ±

G 03 CO *W Ol ID

φ rH I Μ I Φ 43 φ ο ο ο φ V c Η c c

-u C O ·£ O *H

in -H E ϋ E M

3 £3I I I O

ω ti β H e rH

φ o i >< I -C

K Cd r3 C J O

58 DK 168296 B1

Fremstillingen af farmakologiske doseringsformer til ind-givning af den aktive ingrediens, dvs. aminosyre-porphy-rin-additionsprodukterne, som er fremstillet i de forudgående eksempler, kan ske som følger: 5

Eksempel 14

En tabletgrundmasse blev fremstillet ved blanding af de følgende ingredienser i de angivne vægtmængder: 10

Gram

Sucrose, U.S.P. 80,3

Tapiocastivelse 13,2

Magnesiumstearat 4,4 15 I denne grundmasse blev der iblandet tilstrækkeligt ami-nosyre-porphyrin-additionsprodukt til at give tabletter, som hver indeholdt 100 mg aktiv ingrediens.

20 Eksempel 15

Der fremstilledes en blanding indeholdende de følgende ingredienser: 25 Gram

Calciumphosphat 17,6

Dicalciumphosphat 18,8

Magnesiumtri-silicat, U.S.P. 5,2

Lactose, U.S.P. 5,2 30 Kartoffelstivelse 5,2

Magnesiumstearat A 0,8

Magnesiumstearat B 0,32

Porphyrin-aminosyre-additionsprodukt 20 35 Denne blanding blev delt og formet til kapsler, som hver indeholdt 25 mg aktiv ingrediens.

59 DK 168296 B1

Eksempel 16

Til en kommercielt tilgængelig hindbæraromatiseret sukkersirup sættes ækvivalentet til 40 mg af aminosyre-por-5 phyrin-additionsproduktet pr. ml, og blandingen homogeni seres i en mekanisk indretning til dette formål. Blandingen er særligt egnet til oral indgivning indeholdende 200 mg af den aktive ingrediens.

10 Eksempel 17

Der fremstilles en steril opløsning med følgende sammensætning: 200 mg af natriumsaltet af aminosyre-porphyrin-additionsproduktet opløses i en 0,9% NaCl-opløsning, så-15 ledes at den endelige koncentration er 20 mg/ml.

Denne opløsning er egnet til intravenøs og intramuskulær indgivning.

20 Eksempel 18

Natriumsaltet af aminosyre-porphyrin-additionsproduktet opløses i 0,9% NaCl-opløsning, således at den endelige koncentration er 5 mg/ml. Denne opløsning anbringes i en 25 aerosolbeholder med et carbonhydrid-drivmiddel. Dette præparat er egnet til topisk påføring.

Eksempel 19 30 Fremstilling af et metalsalt

Natriumsaltet af porphyrin-aminosyre-additionsproduktet fremstilles ved opløsning af additionsproduktet i vand indeholdende en ækvimolær mængde natriumhydroxid og fry-35 setørring af den resulterende blanding.

På denne måde fremstilles også andre metalsalte, herunder DK 168296 B1 60 kalium-, calcium- og lithiumsalte.

Fremstilling af et syresalt 5 De i de forudgående eksempler beskrevne aminosyre-porphy-rin-additionsprodukter omdannes til syresalte, f.eks. hy-drochloridet, ved opløsning i en vandig opløsning indeholdende en ækvivalent mængde syre, f.eks. saltsyre, og efterfølgende inddampning af opløsningen til tørhed, 10 hvorved der opnås det faste salt. Alternativt kan der i stedet for den vandige syreopløsning anvendes alkoholiske opløsninger af hydrogenchloridgas, og syresaltet opnås ved afdampning af opløsningsmidlet eller krystallisation fra alkoholen, f.eks. ved tilsætning af et ikke-opløs-15 ningsmiddel.

20 25 30 35

Claims (4)

1. Fluorescerende mono-, dl- eller polyamider af en ami-5 nomonocarboxylsyre og en tetrapyrrolforbindelse med formlen Y E B i \y=i 10 x \ /=rM * nh hn .. / \-S.. 1;-/ \-C00H N 15 —f \=l xo D CH-, \ * M —-H COOH H <«2>2 COOH 20 eller perhydroderivater deraf, hvori X = H, vinyl, ethyl eller formyl, Y = methyl eller formyl, M = methyl, og E = ethyl, 25 og farmaceutisk acceptable salte deraf.

2. Amider ifølge krav 1, hvori aminosyren er en «-aminosyre.

3. Amider ifølge krav 1 eller 2, hvori aminosyren er en polær «-aminosyre. 1

5. Forbindelse ifølge krav 1, som er Et mono- eller diamid ifølge ethvert af kravene 1-3. DK 168296 B1 mono- eller di-L-serinyl-chlorin eg, mono- eller di-L-serinyl-bacteriochlorin eg, mono- eller di-L-cysteinyl-bacteriochlorin eg, mono- eller di-L-serinyl-rhodin g^, 5 mono- eller di-L-cysteinyl-rhodin g7, mono- eller di-L-cysteinyl-mesochlorin eg, mono- eller di-L-serinyl-mesochlorin eg, mono- eller dialanyl-chlorin eg, dileucyl-chlorin eg, 10 dimethionyl-chlorin eg, mono- eller diglycyl-chlorin eg, mono- eller dithreoninyl-chlorin eg, mono- eller dicysteinyl-chlorin eg, dityrosyl-chlorin eg, 15 diarginyl-chlorin eg, dihistidyl-chlorin eg, mono- eller di-e-amino-caproyl-chlorin eg, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. 20 6* Anvendelse af et fluorescerende mono-, di- eller polyamid ifølge krav 1 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til fotodiagnose af tumorer med lys på 360-760 nm og/eller til fototerapi af tumorer med lys på 600-800 nm. 25 30 35