NO169291B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktivt tetrapyrrol-amino-dicarboxylsyreaddukt - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt tetrapyrrol-amino-dicarboxylsyreaddukt, anvendelig til fotodiagnostisering og fotobehandling av tumorer og cancerøst vev i mennesker eller dyr.

Det er kjent å bestråle tumorer og caneervev i

det menneskelige legeme med intenst lys under administrering av et hematoporfyrinderivat i bølgelengdeområdet på

626 til 636 nanometer for å redusere og enkelte ganger ødelegge'cancercellene (se PCT publikasjon WO 83/00811).

Det er også kjent at porfyriner, spesielt natriumsaltet

av protoporfyriner kan opprettholde eller aktivere celle-

nes normale funksjoner og er således anvendbare for å forhindre genese, vekst, metastaser og tilbakefall av ond-artede tumorer. Japansk publisert patentsøknad 125737/76 beskriver anvendelse av porfyriner som tumorinhiberende middel, og eksemplifiserer etioporfyrin, mesoporfyrin, protoporfyrin, deutoroporfyrin, hematoporfyrin, coprofyrin og uroporfyrin.

I Tetrahedron Letters No. 23, s. 2017-2020 (1978)

er det beskrevet et aminomonocarboxylsyreaddukt av pigmentet bonellin erholdt ved ekstraksjon av prinsipalt kroppveggen av det marine echuroid^B. viridis. Strukturen av disse addukterr er antatt å være et amid dannet gjennom den ene eller andre av de fri carboxygrupper av bonelin og amino-monocarboxylsyren. Hydrolyse av adduktet gir en blanding av valin, isoleucin, leucin og alloisoleucin. Ingen anvendelse for disse aminosyreanhydrider er beskrevet i denne publikasjon.

Mesoporfyrin og mesohaemin bis aminosyre-estere og de tilsvarende syrer er beskrevet i Chemische Berichte, vol. 90, nr. 4, 1957 (s. 470-481). Spesifike bis-aminosyre-forbindelser omfatter DL-valin, DL-leucin, DL-fenylalanin, DL-isoleucin og L-glutaminsyreestere (og de tilsvarende

fri syrer) bis-addukter av mesoporfyrin og mesohaemin.

Ingen terapeutisk anvendelse av disse forbindelser er imidlertid beskrevet.

PCT patentsøknad WO 84/01382 beskriver anvendelse av et nytt derivat av hematoporfyrin som er anvendbar for

lokalisering og behandling av tumorer.

At tetrapyrroler fremkaller intens fotosensititet i dyr er velkjent og er dekomentert i et utall artikler innen litteraturen, for eksempel J. Intr. Sei. Vitaminol,

27, 521-527 (1981); Agric. Biol. Chem., 46(9), 2183-2193

(1982); Chem. Abst. 98, 276 (1983) og 88, 69764m (1928).

De cykliske pyrroler har som deres felles moder-tetrapyrrol, uroporfyrinogen, og utviser følgende rings-

struktur:

hvori stillingene i molekylet er nummerert 1 - 20, og ringene identifisert ved bokstavene A, B, C og D, og innbefatter også perhydro-, for eksempel dihydro- og tetra-hydro-, derivater av angitte ringstruktur, for eksempel forbindelser hvori én eller flere dobbeltbindinger er fraværende. I ringsystemet foreligger fire pyrrolringer bundet sammen gjennom alfa-stillingene av de respektive pyrrolringer med en methingruppe, dvs. -CH=. Forbindel-

sene fremstilt ifølge oppfinnelsen er angitt som derivater av tetrapyrrolene av hensiktsmessige grunner i foreliggende be-skrivelse og krav, og det skal forståes at uttrykket "tetra- . pyrrol" vil angir forbindelser av den her angitte karakter-istiske ringstruktur.

Tetrapyrrolene anvendt ifølge oppfinnelsen er

alle kjente eller avledet på forskjellig måte og forskjellige prosedyrer fra naturlige tetrapyrroler. De naturlig forekommende tetrapyrroler har som deres felles stam-forbindelse uroporfyrinogen III, et hexahydroporfyrin redusert ved bromstillingene.

Tetrapyrrolforbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved formelen

hvori

X = vinyl;

Y = methyl eller formyl;

M = methyl;

E = ethyl og

R = OH, aspartyl eller glutamyl; hvor minst en av gruppene R

er en aminosyrerest

og farmasøytisk akseptable salter derav.

Foreliggende oppfinnelse angår således fremstilling av aminosyrer eller peptidderivater av forbindelser som inneholder kromofore av visse kloriner. Peptidbindingen innbefatter en carboxygruppe av den kromofor-bærende forbindelse og aminogruppen av den spesifiserte aminosyre. Foreliggende nye forbindelser omfatter derivater av tetrapyrrolene som inneholder tre carboxygrupper. Disse tre derivater innbefatter porfyriner av hovedklassen: kloriner som er velkjent innen faget.

Analogifremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at tetrapyrrolet med den ovenfor angitte formel, hvor R = OH, omsettes med én, to eller tre amino-dicarboxylsyrer i et egnet løsningsmiddel under amid-dannende betingelser, og eventuelt at det erholdte produkt omdannes til et salt.

Aminosyren anvendt ifølge oppfinnelsen for å danne den ovenfor angitte peptidbinding er amino-dicarboxylsyrer hvori aminogruppen selvsagt er lokalisert på

et carbonatom av dicarboxylsyren. Den spesifikke stilling av aminogruppen i carbonatomkjeden er ikke kritisk, det eneste krav er at aminogruppen er tilgjengelig for å danne den krevede peptidbinding med carboxylgruppen av det valgte porfyrin. Således er et utall av aminodicarboxylsyrer anvendbare ifølge oppfinnelsen, innbefattende a-aminorav-syre (aspartinsyre), a-aminoglutarsyre (glutaminsyre), B-aminoglutarsyre, 6-aminosebacinsyre. 2,6-piperidin-dicarboxylsyre, 2-pyrroldicarboxylsyre, 2-carboxypyrrol-5-eddiksyre, 2-carboxy-piperidin-6-propionsyre, a-amino-adipinsyre, a-aminoazelainsyre, og lignende syrer.

Disse aminosyrer kan være substituert med vinklede alkylgrupper slik som methyl og ethylgrupper, såvel som andre grupper som ikke ugunstig påvirker aminogruppens evne til å danne peptidbinding, for eksempel alkoxygrupper eller acyloxygrupper, og kan også innbefatte ytterligere aminogrupper. De foretrukne aminosyrer er de naturlig forekommende a-aminosyrer, glutaminsyre og asparaginsyre, som er lett tilgjengelig og som hittil har gitt de beste resultater.

Eksempler på forbindelser av tetrapyrrolklassene er illustrert i Tabell I hvori de nummererte stillinger av tetrapyrrolringstrukturen er anvendt for å angi stil-lingen av den angitte substituent. Fravær av dobbeltbindinger i ringsystemet er angitt under "dihydro" med hvert sett av tall (ringstilling) som indikerer fravær av en dobbeltbinding mellom de angitte stillinger.

Særlig foretrukne forbindelser innbefatter: klorinderivater

mono-, di- og triaspartyl-klorin e6

mono-, di- og triglutamyl-klorin efi

mono-, di- og triaspartyl-rhodin g7

mono-, di- og triaspartyl-rhodin g^_

Foreliggende nye forbindelser danner salter med enten syrer eller baser. Syresaltene er særlig anvendbare for rensing og/eller separering av amidsluttproduktene slik som også saltene dannet med baser- Basesaltene er imidlertid særlig foretrukne for diagnostisk og terapeutisk bruk som beskrevet i det etterfølgende.

Syresaltene dannes med et utall syrer slik som de uorganiske syrer, saltsyre, hydrobromsyre, salpetersyre og svovelsyrer, organiske syrer slik som toluensulfonsyre og benzensulfonsyre.

Basesaltene innbefatter for eksempel natrium, kalium, calsium, magnesium, ammonium, triethylammonium, trimethylammonium, morfolin og piperidinsalter og lignende salter.

Syre- og basesaltene dannes ved en enkel oppløs-ning av valgte aminosyretetrapyrrolamid i en vandig løs-ning av syren eller basen, og fordampning av løsningsmid-delet til tørrhet. Anvendelse av et vann-blandbart løs-ningsmiddel for amidet kan medhjelpe til å løse amidet.

Amid-sluttproduktene kan også omdannes til metallkomplekser, for eksempel ved omsetning med metallsalter. Magnesiumkompleksene kan være anvendbare for samme formål som adduktproduktet. Andre metallkomplekser såvel som magnesiumkomplekset, for eksempel jern og zink, er anvendbare for å utelukke forurensning under fremstilling av adduktproduktet med metaller slik som nikkel, kobolt og kobber, hvilke er vanskelig å fjerne. Zink og magnesium fjernes lett fra addukt-sluttproduktet etter at fremstillingen er fullført.

Da mange av aminodicarboxylsyrene foreligger både i D- og L-form, og også anvendes i blandinger av disse former såvel som D,L-formen, vil valg av utgangs-aminosyren selvsagt resultere i produkter hvori den respektive isomer eller blanding av isomerer foreligger.

Foreliggende nye forbindelser fremstilles ved vanlige peptidsynteser som generelt innbefatter enhver amiddannende reaksjon mellom den valgte aminosyre og det spesifikke tetrapyrrol. Således kan et hvilket som helst amid-dannende derivat av tetrapyrrol-carboxylsyren anvendes ved fremstilling av foreliggende nye peptider, f.eks. lavere alkylestere, anhydrider og blandede anhydrider.

De foretrukne preparative metoder gjør bruk av blandede anhydrider av carboxylsyren eller carbodiimidene. Reaktantene bringes bare i kontakt med et egnet løsningsmiddel og tillates å reagere. Temperaturer opp til tilbakeløps-temperaturen kan anvendes, idet høyere temperaturer reduserer reaksjonstiden. Særlig høye temperaturer foretrekkes vanligvis ikke for å unngå uønskede bireaksjoner.

Prosedyrene for dannelse av foreliggende peptider er velkjente innen faget og illustreres i detalj i de etterfølg-ende eksempler.

Dette valgte tetrapyrrol inneholder tre carboxylgrupper, og blandinger av produkter kan dannes omfattende iso-mere mono-, di- og tripeptidprodukter, avhengig av antallet carboxylgrupper og avhengig av den valgte støkiometri.

Når således ekvimolare blandinger av aminosyre og tetrapyrrol omsettes, dannes ikke bare monopeptider men også dipeptider, selv om monopeptidet vil dominere. Med høyere

molarforhold vil arten av produktene variere på tilsvarende måte. Det er generelt mulig å separere monopeptidene og de høyere peptider under anvendelse av kjente kromatografiske teknikker. Slike separasjoner er imidlertid ikke nødvendig da de blandede peptider vanligvis er sammenlign-bare med de separerte produkter når det gjelder deres endelige bruk. Således kan blandinger av mono-, di- og tripeptidene av den samme tetrapyrrol anvendes.

Vanligvis separeres uomsatt tetrapyrrol fra peptidproduktene under rensingen, slik som for eksempel ved kromatografiske teknikker.

Fotodiagnose og fototerapi

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er anvendbare for fotodiagnose og fototerapi av tumor, cancer og ondartet vev (heretter angitt som "tumor").

Når et menneske eller dyr med tumor behandles med doser av en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen og når egnede lysstråler eller elektromagnetiske bølger påføres, utstråler forbindelsen lys, dvs. fluorescens. Derved kan eksistens, posisjon og størrelse av tumoren påvises, dvs. fotodiagnose.

Når tumoren bestråles med lys av en riktig bølge-lengde og intensitet, aktiveres forbindelsen til å utøve en celledrepende effekt mot tumoren. Dette kalles "fototerapi".

Forbindelser beregnet for fotodiagnose og fototerapi skal ideelt ha følgende egenskaper: (a) være ikke-toksiske ved normale terapeutiske doser medmindre og inntil de aktiveres med lys; (b) skal være selektivt fotoaktive; (c) når lysstråler eller elektromagnetiske bøl-ger påføres, skal de utstråle karakteristisk og påvisbar fluorescens; (d) når de bestråles med lysstråler eller når elektromagnetiske bølger påføres, aktiveres disse til en slik grad at de utviser en celledrepende effekt mot tumoren, og (e) skal være lett metaboliserbare eller utskilles etter behandling.

I henhold til den hittil foretatte testing har foreliggende nye forbindelser de ovenfor angitte egenskaper og er også kjennetegnet ved en rimelig løselighet i saltvann ved fysiologisk pH.

Foreliggende nye forbindelser utviser større fluorescens i tumorer enn de tilsvarende tetrapyrroler og til og med peptider dannet med aminomonocarboxylsyrene,

for eksempel alanin og epsilonaminocapronsyre. Anvendelse av disse gir den beste kontrast i tumorer sammenlignet med normalt vev rundt tumoren. Foreliggende forbindelser absorberer aktiveringsenergi for fototerapi i et hensikts-messig område på 600 til 800 nanometer, hvor de foretrukne forbindelser absorberer i området 620 - 760 nanometer,

dvs. lys med lengre bølgelengder som lettere muliggjør penetrering av energi inn i tumoren for fototerapeutiske formål.

Ifølge foreliggende erfaring fordeles foreliggende forbindelser jevnt gjennom tumoren enn tetrapyrrolene, hvilket muliggjør anvendelse av betydelig lavere dose

(opp til 1/10 av den krevde normale dose av tetrapyrrolet)

hvilket reduserer, om ikke eliminerer, fotosensibiliteten i verten. De utviser også en mer ensartet fluorescens mens enkelte av de tilsvarende tetrapyrroler utviser uens-artet fluorescens eller fluorescensen kan variere fra dag til dag i verten.

En særlig fordelaktig egenskap ved de nye forbindelser ligger i den letthet med hvilken de utskilles av verten. Inen 24 til 72 timer etter intravenøs eller intraperitoneal administrering er det generelt lite eller ingen påvisbare mengder i normalt muskelvev. Opp til 50 % av forbindelsene gjenvinnes fra feces av verten innen 24 til 72 timer etter injeksjon, mens under ekvivalente omstendigheter vil betydelige mengder av de tilsvarende tetrapyrroler og peptider dannes med aminomonocarboxyl-syrer være tilbake. Denne egenskap er uhyre viktig ved at den bidrar til en minimering av fotosensitiviteten i verten.

Foreliggende forbindelser kan anvendes for diagnose og terapeutisk behandling av et bredt område av tumorer. Eksempler på tumorer er mavecancer, enterisk cancer, lungecancer, brystcancer, uterincancer, esofageal-canser, ovariancancer, pancreatincancer, pharyngealcancer, sarcomas, hepatitiskcancer, cancer i urinblæren, canser i overkjeven, cancer i galletrakten, cancer på tungen,

cerebral tumor, hudcancer, ondartet struma, prostatisk cancer, cancer på parotidkjertelen, Hodgkins's sykdom,

multippel-myeloma, renalcancer, leukemia og ondartet lymfocytorna.

For diagnose er det eneste krav at tumoren er

i stand til selektivt å fluorescere når den utsettes for

' riktig lys. For behandling må tumoren være gjennomtreng-bar av aktiveringsenergi. For diagnose anvendes lys med kortere bølgelengde mens for terapeutiske formål anvendes lys med lenger bølgelengde for å muliggjøre en lett pene-

trering av tumorvevet. For diagnose kan således lys på fra 360 til 760 nanometer anvendes, og for behandling kan lys på fra 620 til 760 nanometer anvendes, avhengig av de individuelle karakteristika for tetrapyrrolet. Absorp-sjonskarakteristikaene for foreliggende nye forbindelser er hovedsakelig de samme som for tetrapyrrolet fra hvilket de er avledet.

Det er nødvendig at lysstrålene skal være så intense at de forårsaker at forbindelsene utstråler fluorescens for diagnose og utøver en celledrepende effekt for terapi.

Bestrålingskilden for fotodiagnose og fototerapi er ikke begrenset, men laserstrålen er imidlertid foretrukket på grunn av at intense lysstråler i et ønsket bølgelengdeområde kan selektivt påføres. Ved fotodiagnose administreres forbindelsen til et menneske eller dyr, og etter et bestemt tidsrom påføres lysstråler til den del som skal undersøkes. Når et endoskop kan anvendes for den påvirkede del, slik som lunger, svelg, mage, livmor, urinblære eller rectum, bestråles denne under anvendelse av endoskopet, og tumordelen utstråler selektivt fluorescens. Denne del obserfeeres visuelt eller observeres gjennom et tilpasset fiberskop ved hjelp av øyetiéJUsr på et CRT-skjerm.

Etter administrering av dosen utføres ved fototerapien bestrålingen med laserstråler fra spissen av kvartsfibre. Ved siden av bestrålingen av tumoroverflaten kan den indre del av tumoren bestråles ved å innføre spissen av kvartsfibrene inn i tumoren. Bestrålingen kan observeres visuelt eller avbildes på en CRT-skjerm.

For fotodiagnose er lys med bølgelengder mellom 360 og 7 60 nanometer egnet for aktivering av foreliggende tetrapyrrolforbindelser. Hver forbindelse har selvsagt

en spesifikk optimal bølgelengde for aktivering. En ultra-• fiolett lampe med lang bølgelengde er særlig egnet for fotodiagnose. Lignende metoder for avbildning av den behandlede tumor kan anvendes som allerede beskrevet for fototerapien.

Dosene av foreliggende nye forbindelser vil

variere avhengig av den ønskede effekt, dvs. hvorvidt diagnose eller behandling taes i betraktning. For diag-

nose vil doser på så lite som 1 mg/kg være effektive,

men doser opp til 7,5 mg/kg kan anvendes. For behandling vil dosen vanligvis være opp til 0,5 mg/kg. Dosen for diagnose eller behandling kan selvsagt varieres vidt i

lys av de ovenfor anvendte fordelaktige egenskaper av de

nye forbindelser, f.eks. den lette eliminering fra verten.

Foreliggende forbindelser er tilsynelatende ikke toksiske ved de anvendte dosenivåer for diagnose eller behandling. Ingen dødelighet av testdyr på grunn av foreliggende forbindelser er blitt observert i studier hvor det ble anvendt dosenivåer opp til 20 mg/kg.

For både diagnose og behandling kan foreliggende forbindelser administreres oralt, intravenøst eller intramuskulært. De kan formuleres som lyofiliserte sterile, pyrogenfri forbindelser, fortrinnsvis i form av basiske salter, f.eksv natriumsalt. De foretrukne doseringsformer

er injiserbare løsninger (isotoniske).

Bestrålningskilden anvendt ved behandling av tumorer inneholdende forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er en filtrert, høyintensitets, kontinuerlig kilde eller pumpet farvekilde, eller annen laser og lysutleverings-system, som er istand til å virke innen de følgende grenser: kraftintensitet 20 - 500 mW/cm 2og bølgelengder mellom 620 og 680 nanometer hvor porfyrinene og klorinene og 7 00 - 760 nanometer for bakterioklorinene, og en total utgang på minst 500 mW eller mer. Flere kommersielt tilgjengelige lasere oppfyller disse kriterier.

Tetrapyrrolene kan fremstilles ved et utall syntesemetoder som finnes innen litteraturen, f.eks.

Chlorin eg

Willstatter, R., Stoll, A.; Investigations on Chlorophyll,

(Trans., Schertz, F.M., Merz, A.R.,) s. 176. Science Printing Press, Lancaster, Pennsylvania, 1928.

Willstatter, R., Isler, M.; Ann. Chem., 390, 269 (1912).

Fisher, H., Baumler, R.; Ann. Chem., 474, 65 (1929).

Fisher, H., Siebel, H.; Ann. CHem., 499, 84 (1932).

Conant, J.B., Mayer, W.W.; J. Amer. CHeml Soc., 52, 3013

(1930) .

og

Chlorin eg, e4, mesoklorin eg, bacterioklorin eg

Fischer and Orth, "Des Chemie des Pyrrole" Akadamische Verlazsgesellschaft, Leipzig, 1940, Vol. II. Del 2.

Generell referanse for Pyrphyriner

"Porphyrins and Metalloporphyrins" ed. Kevin M. Smith, Elsevier 1975 N.Y.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan administreres til verten i et utall former tilpasset til den valgte administreringsmåte, dvs. oralt, intravenøst, intramuskulært eller subcutant.

Eksempel 1

Mono( L)- aspartylklorin e^ ( carbodiimid- metoden)

150 mg klorin e^ og 250 mg L-aspartinsyre-di-t-butyl-ester-hydroklorid ble oppløst i 20 ml dimethylformamid. Det ble totalt foretatt 3 100 mg's tilsetninger av N,N~-dicyclohexyl-carbodiimid ved én times intervaller. Etter fire timer ble reaksjonsblandingen fortynnet med 3 ml ether, ble vasket ytterligere to ganger med 200 ml vann og ble deretter ekstrahert med 40 ml 1 M KOH. KOH-løsningen fikk hydrolysere over natten, og ble deretter oppvarmet til 70° C i 10 minutter.

pH på løsningen ble justert til 7, hvoretter enhver restether ble fjernet ved flashfordampning. Løs-ningen ble deretter anbragt på en omvendt fase (C-18 silica)-kolonne på 1,5 x 30 cm. Produktet ble renset ved trinnvis eluering av methanol/.0,1 M pH 6,85 KPO^ buffer. Produktet ble eluert med 5 % methanol inntil uønskede polare pigmenter var fjernet. Monoaspartylklorin eg ble eluert fra 6 - 8 % methanol, og uomsatt klorin eg ble fjernet med 25 % methanol.

Produktet ble utfelt ved pH 3 etter flashfordampning for å fjerne methanolen, ble deretter vasket i sentrifugen tre ganger med fortynnet eddiksyre, Produktet ble tørket under vakuum. Utbyttet av mono(L)-aspartylklorin e^ var 50 mg.

Eksempel 2

Mono( L)- glutamyl- klorin- eg- ( carbomidmethoden)

130 mg klorin e^ og 260 mg L-glutaminsyre-dimethylester-hydroklorid ble oppløst i 18 ml dimethylformamid. 100 mg N, N'-dicyclohexy1-carbodiimid ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time. Ytterligere 50 mg carbodiimid ble tilsatt. Etter 1 time inneholdt reaksjonsblandingen 75 - 80 % av det monosubstituerte produkt som vist ved omvendt fase TLC (C-18 plater med 70 % MeOH, 30 %, 0,01 M KP04, pH 6,85). 200 ml diethyl-ether ble tilsatt, blandingen ble vasket to ganger med 100 ml vann og ble deretter ekstrahert med 30 ml IM KOH.

Produktet fikk hydrolysere i mørket i KOH-løsningen i 12 timer og ble deretter oppvarmet til 7 0° C

i 10 minutter for å fullføre hydrolysen av estergruppene. Produktet ble deretter separert ved omvendt fasekolonne-kromatografi (C-18 omvendt fase silicakolonne 1,5 cm x 3 0 cm) under anvendelse av trinnvis gradienteluering med methanol i buffer. 0., 01 M KP04, pH 6,85. 5 % fjernet polare urenheter. Monoglutamylklorin e^ ble eluert med 6 - 8 % methanol. Klorin e^ ble eluert fra kolonnen med 25 % methanol. Methanolen ble fjernet ved flashfordampning og mono(L)-glutamyl-klorin e^ ble utfelt ved pH 3, ble oppsamlet og vasket tre ganger på sentrifugen med fortynnet eddiksyre og ble tørket under vakuum. Utbytte: 40 mg.

Eksempel 3

Mono- og Di-( L)- aspartyl) klorin- ec ( carbodiimid- metoden)

400 mg klorin eg og 1 g L-aspartinsyredibenzyl-ester-p-tosylat ble oppløst i 75 ml dimethylformamid. Temperaturen på løsningen ble opprettholdt ved 65 - 70° C under omrøring, og 100 mg N,N'-dicyclohexyl-carbidiimid ble tilsatt. (Totalt tre tilsetninger ble foretatt med 2 timers intervaller). Løsningen ble omrørt ved denne

temperatur i totalt 20 timer og ble deretter sjekket ved TLC (omvendt fase) (C-1% silicaplater), 70 % methanol, 30 % 0,01 M pH 6,85 KP04 buffer. TLC viste mer enn 50 % monosubstitusjon med noe di-substitusjon.

150 ml ether ble tilsatt og blandingen ble omrørt med 100 ml vann og flere dråper iseddik. Ether-fasen ble fraskilt og den vandige fase ble ekstrahert flere ganger med 100 ml ether. Etherekstraktene ble kom-binert og vasket med 100 ml vann fire ganger for å fjerne diformamid.

Aspartylklorin e^-estrene ble deretter ekstrahert i 100 ml IM KOH (fire ekstraksjoner hver på 25 ml) . KOH-løsningen fikk stå ved omgivende temperatur i 24 timer for å hydrolysere. Kompontene ble separert ved nøytrali-sering av løsningen til pH 7 og anbringelse på en omvendt fase (C-18 silica) kolonne på 1,5 cm x 30 cm. Elueringen ble utført under anvendelse av 1 liter gradient på 30 % methanol til 80 % methanol med 0,01 M pH 6,85 KP04 buffer. Fraksjonene ble oppsamlet og karakterisert ved TLC-Elueringsrekkefølgen var di-(L)-diaspartyl-klorin e^, L-monoaspartyl-klorin e^ og klorin e^. Methanolen ble fjernet ved flashfordampning og de individuelle komponenter ble utfelt ved pH 3 under anvendelse av HC1.

Produktene ble oppsamlet ved sentrifugerihg, vasket flere ganger med meget fortynnet eddiksyre og ble tørket under vakuum. Utbyttet var 23,8 mg av det disubstituerte produkt og 112 mg av monosubstituert klorin e^.

Eksempel 4

di-( D, L)- aspartyl- rhodin- g7 ( carbodiimid- methoden)

140 mg rhodin g? og 200 mg (DL)-aspartinsyre-dimethyl-ester-hydroklorid ble oppløst i 30 ml dimethylformamid. 300 mg N'N-dicyclohexyl-carbodiimid ble tilsatt. Reaksjonsblandingen fikk stå i 1 time hvorpå ytterligere 300 mg carbodiimid ble tilsatt. Denne prosedyre ble gjentatt to ganger hvorpå reaksjonsblandingen fikk stå over natten. Reaksjonen ble overvåket ved tynnskikts-kromatografi på silicagel under anvendelse av løsnings-midlet benzen/methanol/88% maursyre 8,5/1,5/0,13 V/V/V.

Det disubstituerte rhodin g7 har den høyeste R7 verdi, den usubstituerte rhodin g? har den laveste, mens de monosubstituerte isomerer ligger mellom disse og er uoppløselige,

Etter henstand over natten inneholdt reaksjonsblandingen minst 50 % disubstituert rhodin g^. Løsnings-midlet ble fjernet under vakuum og det gjenværende faste materiale ble oppløst i 50 ml 3N HC1.

Løsningen fikk stå ved romtemperatur i 48 timer for å hydrolysere estergruppene, hvorpå klorinblandingen ble utfelt ved pH 2,5 - 3 og oppsamlet og vasket med vann på sentrifugen.

Rhodin g^-blandingen ble renset ved oppløsning

i 0,05 M NH^OH og anbringelse på en omvendt fase (C-18 silica)-kolonne 2,5 x 30 cm. Elueringsprosedyren var en lineær gradient fra 40 til 70 % methanol i 0,01 M KP04 buffer med pH 6,85 (1 liter totalt volum).

Det dominerende rhodin g^-bånd ble oppsamlet

og flashfordampet for å fjerne methylalkoholen, løsningen ble deretter utfelt ved pH 2,5 - 3 og oppsamlet og vasket tre ganger på sentrifugen med fortynnet eddiksyre. Produktet ble tørket under vakuum.

Eksempel 5

Di- og mono ( L)- glutamylrhodin g - j ( blandet anhydrid- metode)

50 mg (0,000087 mol) rhodin gy ble oppløst i

100 ml tetrahydrofuran (THF). 210 mikroliter (0,002 mol) triethylamin ble tilsatt under omrøring. Etter 10 minutter ble 195 mikroliter (0,00179 mol) ethylklorformiat tilsatt. Etter omrøring i 10 minutter ble 50 ml (0,01 mol) 0.2 M KOH inneholdende 250 mg (0,00169 mol) (L)-glutaminsyre dråpevis tilsatt under omrøring til THF-løsningen. Denne blanding ble omrørt i 60 minutter ved romtemperatur.

Det organiske løsningsmiddel ble avdrevet og reaksjonsblandingen ble sjekket ved silica TLC for produkt. Benzen/methanol/88 % maursyre (8,5/1,5/0,13) ble anvendt for å fremkalle kromatogrammet.

Etter sjekking for produkt ble løsningen justert til pH 7,5 - 8,0 og bragt på en omvendt fase (C-18 silica) kolonne på 2,5 x 30 cm. Reaksjonsblandingen ble oppløst under anvendelse av en lineær gradient på 40 - 80 % methanol i 0,01 M KP04 buffer, pH 6,85 (1 liter totalt volum).

Kolonneavløpet ble oppsamlet via fraksjonsopp-samler, og rørinnholdene ble oppsamlet i henhold til de individuelle komponenter. Elueringsrekkefølgen var di-(L)-glutamyl-rhodin g7, mono-(L)-glutamyl-rhodin g? og usubstituert rhodin g^.

Methanolen ble avdrevet og materialet ble utfelt ved pH 2,5 - 3,0. Bunnfallet ble vasket tre ganger med fortynnet eddiksyre i vann, og produktet ble tørket under vakuum.

Fysikalske karakteristika for representative forbindelser (relativ polaritet) ble målt ved et standard kromatografisk system.

Det synlige absorpsjonsspektrum i pyridin for alle aminodicarboxylsyrederivatene er identisk med moder-porfyrinet, klorinet eller bacterioklorinet.

Fremstillingen av farmakologiske preparater for administrering av den aktive bestanddel, dvs. aminosyre-porfyrinadduktene fremstilt ifølge eksempel 1-5, er som følger:

Eksempel 6

Fremstilling av et metallsalt

Natriumsaltet av porfyrinaminosyreadduktet fremstilles ved oppløsning av adduktet i vann inneholdende en ekvimolar mengde natriumhydroxyd, hvorpå den resulterende blanding frysetørkes.

På denne måte kan andre metallsalter, innbefattende kalium, calsium og lithiumsalter fremstilles.

Fremstilling av et syresalt

Aminosyrepyrfyrinadduktene beskrevet i de fore-gående eksempler omdannes til syresalter, f.eksi hydro-klorid, ved oppløsning i en vandig løsning inneholdende en ekvivalent mengde syre, f.eks. saltsyre, hvorpå løsningen fordampes til tørrhet under dannelse av det faste salt.. Alternativt kan alkoholiske løsninger av hydrogenkloridgass, oppløst i ethanol, anvendes i stedet for den vandige syre-løsning, syresaltet erholdes ved fordampning av løsnings-midlet, eller ved krystallisering fra alkoholen, f.eks,,

ved tilsetning av et ikke-løsningsmiddel.

De etterfølgende forsøk beskriver prosedyren for anvendelse av de nye forbindelser ved behandling av rotte-tumorer.

Eksempel 7

De fotodynamiske terapiforsøk er blitt utført under anvendelse av forbindelsen mono-(L)-aspartylklorin eg. To transplanterbare tumorlinjer i Buffalo-rotter ble anvendt, Morris Hepatoma 7777 og Morris Hepatoma 5123 te. Tumorene ble transplantert subcutant på utsiden av låret. Under behandlingen varierte tumorene i størrelse mellom

1 og 2,5 cm i diameter.

Den generelle behandlingsprosedyre var som føl-ger. Rottene ble injisert med en løsning av klorinet fremstilt som følger: 20 mg av natriumsaltet av klorinet ble oppløst i 1 ml 0,9 % NaCl. Klorinløsningen ble deretter injisert intravenøst gjennom den ytre halsvene mens rottene var bedøvet med ether. Volumet av injeksjonsløsningen var beregnet basert på vekten av dyret og dosen, på en vekt til vektbasis, for det bestemte forsøk. Et spesifikt tidsintervall fikk deretter forløpe før lysbehandlingen ble satt igang.

Lysbehandlingen av rottene ble foretatt uten bedøvelse. Rottene ble fastspent, håret ble fjernet på behandlingsområdet og ble behandlet med laserlys fra en Cooper Aurora argon-pumpet, avstembar farvelaser.

Laseren var utstyrt med et fiberoptisk lysav-leveringssystem koblet til et mikrolinsesystem utviklet av Dr. Daniel Doiron, D.R.D. Consulting, Santa Barbara, California.

Linsene dispergerer laserstrålen og tilveie-bringer en sirkulær fordeling av lys med homogen lysintensitet over området for den innfallende lysstråle. Bølge-lengden av lyset ble justert under anvendelse av et Hartridge-reversjonsspektroskop. Lysintensiteten ble bestemt under anvendelse av et Yellow Springs Instrument, Model 65A radiometer.

Mikrolinsene var anordnet i en slik avstand fra huden av dyret at det ble tilveiebragt en belysningsdia-meter på 1,5 cm, og lysfluksen ble variert ved regulering av laserutgangen.

Etter belysningen ble dyrene ført tilbake til burene, og 24 timer senere ble de behandlet intravenøst i den ytre halsvene med 14 mg Evans Blue farvestoff, opp-løst i 250 mikroliter 0,9 % NaCl. 2 timer etter injeksjon ble rottene avlivet og tumoren ble snittoppdelt. Graden av tumornecrose ble bestemt ved mangel på farvestoffopptak, og dybden av det necrotiske tverrsnitt av tumoren ble ned-tegnet i millimeter.

Tabell II angir effektene av disse legemidler på tumorer og innbefatter et område for bølgelengder, doser, intensiteter og tidsintervall for behandling. Dette har vært nødvendig for å kunne fastslå de optimale betin-geiser for fototerapi under anvendelse av dette nye legemiddel. De beskrevne betingelser resulterte i målbare og signifikante skader på tumorene.

I alle tilfeller bortsett fra hvor det spesielt er angitt, oppsto vevskade selektivt på tumorvevet som bestemt ved Evans Blue-metoden, selv om normal hud i praktisk talt alle tilfeller lå over tumoren og behandlingsområdet overlappet signifikant områder med normalt muskelvev.

(1) M.C. Berenbaum, Br. J. Cancer 45; 571(1982)

De fotodynamiske behandlingsdata er presentert

i tabellform. Spalte 2 er den totale administrerte lysdose uttrykt i Joules pr. m 2. Spalte 3 er dosen av administrert mono(L)aspartylklorin e^ uttrykt i mg legemiddel pr. kg kroppsvekt. Spalte 4 er tidsforløpet mellom administrering av legemiddel og behandling med laserlys.

Spalte 5' er bølgelengden for behandlingslyset i nanometer. Spalte 6 er intensiteten av behandlingslyset i milliwatt

2

pr. cm . I spalte 7 angir x den midlere dybde av necrose i millimeter av tumorvevet, dvs. distansen fra den necrotiske topp av tumoren nærmest huden til den necrotiske kant av tumoren fjernest fra huden.

S.D. er standard avvik for x.

(N) er antall tumorer eller ben involvert i forsøket.

Spalte 8 er området for dybden av necrose i millimeter innen gruppen.

Eksempel 8

PDT- forsøk med mus og mono- L- asartylklorin e^

PDT med mono-L-aspartylklorin e^ tetranatrium-saltet ble vurdert i et annet dyr/tumor-mode11system.

Tumoren, SMT-F, ble transplantert subcutant i skulder/ribbeområdet (bare én side) av DBA/2 HaROS D+ Ha mus. Behandlingsprosedyren ble startet når tumorene hadde nådd en dimensjon op 1,5 - 2 cm lengde, 1 cm bredde og 0,7 til 1 cm dybde (ca. 7 til 8 dager etter transplanteringen). Legemidlet ble administrert ved intraperitoneal injeksjon ved en konsentrasjon på 4 mg/ml. Spesifikke parametre og resultater er oppført i etterfølgende tabell. Vurderingen ble foretatt 24 timer etter lysbehandlingen under anvendelse av Evans Blue-beisemiddel i en prosedyre lignende den som ble anvendt for vurdering av tumornecrose i Buffalo-rotter, idet den eneste forskjell var intraperitoneal injeksjon av farvestoff i en dose på 5 mg pr. mus. Overskriftene i hver spalte er den samme som ved rotte-systemet.

Ingen indikasjon på necrose av normalt vev (muskel eller hud) ble observert.

Lignende resultater ble erholdt når forbindelsene fremstilt ifølge Eksempel 1-5 ble administrert til en lignende forbehandlet mus.

Eksempel 9

PDT- forsøk med rotter og mono- L- glutamylklorin e^

Buffaol-rotter med Morris Hepatoma 7777 transplantert subcutant på utsiden av hver bakfot ble under-kastet en fotodynamisk behandling under anvendelse av mono-L-glutamylklorin e6~tetranatriumsalt som legemiddel.

Forsøksprosedyren var den samme som ble anvendt for testing av mono-L-aspartylklorin e^. Spesifikke parametre og resultater er oppført i den etterfølgende tabell.

Ingen synlig skade som bedømt ved Evans Blue-metoden på den overligende hud eller normalt muskelvev som omgir tumoren ble observert, selv om det 1,5 cm (diameter) store område av lysbehandlingen overlappet normalt vev i flere tilfeller.

Spalte 1 er den totale administrerte lysdose uttrykt i Joules pr. cm 2. Spalte 2 er dosen av administrert klorin uttrykt i mg legemiddel pr. kg kroppsvekt. Spalte 3 er tidsforløpet mellom administrering av legemiddel og behandling med laserlys. Spalte 4 er bølgelengden av behandlingslyset i nanometer. Spalte 5 er intensiteten av behandlingslyset i millxwatt pr. cm 2. I spalte 6 angir X en midlere dybde av necroseiL millimeter av tumorvevet, dvs. distansen fra den necrotiske topp av tumoren nærmest huden til den necrotiske kant av tumoren fjernest fra huden. s.d. er standard avvik for X, (n) er antallet tumorer eller ben som er innbefattet i forsøket. D er den midlere diameter av tumornecrose hvori s.d. er standard avviket for D.

Lignende resultater ble erholdt når forbindelsen ifølge eksempel 1-5 ble administrert til lignende for-behandlede rotter.

Eksempel 10

PDT- forsøk med mus og mono- L- glutamyl- klorin e£

SMT-F tumor i DBA/2 Ha ROS D- Ha-mus ble anvendt for å bestemme den fotodynamiske effekt av mono-L-glutamyl-klorin er 6 tetranatriumsalt.

Prosedyren var den samme som ved forsøket innbefattende mono-L-aspartylklorin eg, og spalteoverskrif-tene er de samme som ble anvendt i dette rottesystem.

Joules/ lege- tid i bølge- intensi- X s.d.<*>(n) D s.d. ;middel timer lengde tet (mm) (mm) ;mellom ;lege- ;middel 2;cm mg/ kg og lys nm mW/ cm ;40 40 24 665 100 7,0 - 2,9 8 13,9-3,5 ;<*> En niende mus utviste ingen respons og ble ikke innbefattet i den ovenfor angitte statistiske analyse. Dette på grunn av muligheten for at legemidlet var injisert i tarmen i stedet for i peritoneum.

Eksempel 11

Humane celler (HeLa, stamme D98/AH2) ble incubert i 25 cm 2 plastikkolber i 24 timer for å muliggjøre binding. De ble deretter skyllet, incubert i 10 minutter i Ham's F-12 medium inneholdende porfyriner, ble skyllet igjen i Ham's F-12 medium uten porfyriner i 5 minutter og ble deretter belyst i varierende tidsrom og dyrket ved 37° C

i fullstendig medium i 24 timer. Celletellingen ble deretter foretatt under anvendelse av et fasekontrastmikroskop av fraksjonen av overlevende celler. En glødelyskilde med bredt bånd som ble anvendt ble justert til å gi en innfallende lysintensitet på 5 x 10 5 erg cm —2 sek —1. En justerbar anordning muliggjorde belysning av hver av fem områder av kolben"i forskjellige tidsrom, og et område ble ikke belyst og tjente som en mørk kontroll. Dette ga en dose-overlevelseskurve med fire forskjellige lysdoser fra en enkelte kolbe, og denne teknikk er således egnet for hurtig og økonomisk screening av et stort antall av potensielle fotosensibiliserende midler. Resultatene av dette forsøk er vist i Tabell III.

Eksempel 12

Screening av porpyrinfluorescence som en funksjon av molekylstruktur

To transplanterbare tumorlinjer i Buffalo-rotter ble anvendt, Morris Hepatoma 777 og Morris Hepatoma 5123tc. Tumorene ble transplantert intramuskulært på baksiden av låret på rottene. Etter 10 - 14 dager når tumoren hadde egnet størrelse ble 2 mg (0,5ml) av en aminosyremorfyrin-adduktløsning innført intraperitonealt i rottene. Amino-syreporfyrinadduktløsningen ble fremstilt som følger: 4 mg av aminosyreporfyrinet ble oppløst i 0,1 M NaOH og ble justert til fysiologisk pH med 1 M HC1.

Rottene ble avlivet 24 timer etter injeksjonen. Tumoren ble delt i to in situ. Porfyrinfluorescencen ble bestemt under en UV lyskilde med konstant intensitet.

Tabell IV og V angir de testede porfyrinderivater. Forbindelsene er gruppert alfabetisk.

Etter navnet på porfyrinet er det angitt et tall som indikerer det totale antall av undersøkte tumorer. Den neste spalte i tabellene (A) er et tall beregnet som føl-ger: Porfyrinfluorescencen innen tumoren ble gradert visuelt av en person under en UV lyskilde med konstant intensitet i henhold til skalaen 0, 1, 2, 3, 4. Dette tall ble deretter multiplisert med den prosent av tumoren som utviste denne fluorescence, dvs. (+£) (80%) + (+1)

(10%) = 50. Som oftest representerer A-verdien i tabellen middelverdier erholdt i flere serier av separate forsøk utført ved forskjellige tidspunkt.

"C-verdien" for hver tumor er "A-verdien" for denne tumor dividert med den midlere diameter av tumoren i cm.

En tidsstudie på 12 - 72 timer ble også utført på enkelte av tumorene. Prosedyren er den samme som ovenfor angitt, med det unntak at 1 mg av aminosyreadduk-tet ble anvendt. Resultatene er også angitt i tabell IV.

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt tetrapyrrol-amino-dicarboxylsyreaddukt, anvendelig til fotodiagnostisering og fotobehandling av tumorer, med formel: hvori X = vinyl; Y = methyl eller formyl; M = methyl; E = ethyl og R = OH, aspartyl eller glutamyl; hvor minst en av gruppene R er en aminosyrerest og farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert ved at tetrapyrrolet med den ovenfor angitte formel, hvor R = OH, omsettes med én, to eller tre amino-dicarboxylsyrer i et egnet løsningsmiddel under amid-dannende betingelser, og eventuelt at det erholdte produkt omdannes til et salt.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av mono-L-aspartyl-klorin e6 eller mono-L-glutamyl-klorin e6, karakterisert ved at tilsvarende utgangsfor-bindelser anvendes.