CN114452409B - 靶向c-Met的近红外荧光显像剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域，特别是涉及靶向c‑Met的近红外荧光显像剂及其用途，所述近红外荧光显像剂的结构式为cMBP‑Sulfo‑ICG‑dyes，其中cMBP为氨基酸序列为KSLSRHDHIHHHK的肽，Sulfo‑ICG‑dyes选自Sulfo‑ICG‑Maleimide。所述靶向c‑Met的近红外荧光显像剂能用于制备或筛选头颈部鳞状细胞癌治疗、诊断药物中。所述靶向c‑Met的近红外荧光显像剂分子量小，肿瘤穿透力强，免疫原性低，可以辅助口腔癌筛查程序、肿瘤切除过程中的手术指导以及肿瘤边缘的描绘；可表面涂抹或含漱，增加该类药物在临床上的应用范围，并进一步降低了成本以及潜在副作用，同时还简化了成像方案。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及靶向c-Met的近红外荧光显像剂及其用途。
背景技术
头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)包括口腔、口咽、下咽和喉鳞状细胞癌，其发病率占所有系统性恶性肿瘤的5％，而且它的发病率越来越高。HNSCC是可致死肿瘤之一，尽管医学发展和新疗法(手术、放疗、化疗和靶向药物)取得了进展，HNSCC患者的生存率仍无法有效提高。高局部复发率(50％-60％)导致HNSCC死亡率接近50％，平均5年生存率仅为42％左右。适当的手术切除范围可以在尽可能保留患者的口腔和面部功能的同时，降低局部复发率。然而，由于HNSCC的侵袭性和异质性的特点，该肿瘤的切除范围还没有公认的标准。
靶向光学成像探针具有确定手术边界的能力，有可能改善HNSCC的治疗效果。这些可视化探针可以提供肿瘤相关的分子信息，作为目视检查的补充，并为识别口腔中可疑区域提供相对确切的可视化证据，在术前为手术方案制定提供客观信息。成功的靶向光学成像需要选择HNSCC的可靠生物标记物，并将其用作分子成像的靶点，通过相应探针的靶头进行靶向成像。HNSCC成像的一个生物靶点是细胞间充质上皮转换因子(cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met)，它是一种由肝细胞生长因子(HGF)结合激活的受体酪氨酸激酶。c-Met在多种实体瘤中过度表达，包括胃癌、结肠癌和肝癌。
到目前为止，已在临床前实验中使用了几种针对HNSCC的c-Met探针，并取得了较好的结果，但其中大多数是聚合物材料或金属纳米颗粒。由于这些生物材料合成的不确定性和复杂性，考虑到其潜在的急慢性副作用，它们可能很难转化为临床应用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供靶向c-Met的近红外荧光显像剂及其用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供靶向c-Met的物质在制备或筛选头颈部鳞状细胞癌治疗、诊断药物中的用途。
优选的，所述靶向c-Met的物质为cMBP-Sulfo-ICG-Maleimide。
优选的，所述头颈部鳞状细胞癌选自口腔鳞状细胞癌、舌鳞状细胞癌、咽鳞状细胞癌或喉鳞状细胞癌。
本发明还提供一种近红外荧光显像剂，所述近红外荧光显像剂的结构式为cMBP-Sulfo-ICG-dyes，其中cMBP为氨基酸序列为KSLSRHDHIHHHK的肽。
所述近红外荧光显像剂的结构式为：
本发明还提供一种头颈部鳞状细胞癌诊断药物，所述头颈部鳞状细胞癌诊断药物包括所述光学显像剂以及药学上可接受的载体或辅料。
如上所述，本发明的靶向c-Met的近红外荧光显像剂及其用途，具有以下有益效果：分子量小，肿瘤穿透力强，免疫原性低。可以辅助口腔癌筛查程序、肿瘤切除过程中的手术指导以及肿瘤边缘的描绘，可局部应用，简化了给药流程，增加药物在临床上的广度和多功能性，并进一步降低了成本以及潜在副作用，同时还降低了成像方案的学习要求，与其他分子成像方式(如PET或MRI)相比，光学荧光成像设备价格更低，且更为便捷。综上，靶向c-Met的近红外荧光显像剂可降低困扰口腔鳞癌患者的根治性手术的复发率。
附图说明
图1显示为c-MET在人类口腔癌组织中的表达，以及在邻近健康组织中的表达，其中(a)采用抗c-MET抗体和免疫组化检测，在福尔马林固定、石蜡包埋、手术切除的人舌鳞状细胞癌组织上，对不同恶性程度的口腔癌组织(上排)和邻近正常舌组织(下排)进行检测。棕色代表c-MET阳性组织。蓝色代表苏木精复染细胞核。所示图像为从n＝12个样本中选择的三个代表性示例。(b)为在c-MET阳性组织区域的小提琴图中，人类舌肿瘤组织中的c-MET定量。在每个样本中，分析肿瘤区域或邻近健康组织的5个视野。显示的是中位数(直线)和四分位数(虚线)。ad＝正常邻近组织；颜色代码：红色＝恶性组织(低级别和高级别鳞状细胞癌)，粉红色＝癌前病例(高级别上皮内瘤变，原位癌)，绿色＝相应的正常邻近舌组织。(c)为c-MET阳性组织区域，分为正常邻近组织、癌前组织和恶性组织。采用方差分析确定统计显著性，其中多重比较采用Holm-Sidak校正，家族误差(FWE)率控制在0.05.***＝P<0.0001，**＝P<0.01。不同组c-MET阳性面积的平均值标注在其误差条上方。(d)为人舌肿瘤组织中的c-MET定量显示c-MET阳性组织面积，单位为％。对于每个标本，显示恶性组织和相应的健康相邻组织。显示所有样本的中位数±95％置信区间。(e)为使用受试者操作特征(ROC)曲线评估c-MET作为肿瘤和正常组织分类器的性能。
图2显示为头颈癌细胞系和异种移植物中c-MET蛋白的表达情况，其中a为HSF人角蛋白上皮细胞和FaDu、Cal27、HN30 OSCC中的c-Met蛋白条带；b为通过流式细胞术定量测量FITC标记的c-MET在HNSCC细胞系和对照角蛋白上皮细胞系中的表达水平；c为与健康舌组织相比，HN30皮下肿瘤组织离体切片的H&E、IHC和IF结果。
图3显示为本发明的近红外荧光显像剂结构式(a)及其吸收/发射光谱(b)和体外细胞毒性(c)。
图4显示为cMBP摄取与c-MET表达的相关性，其中a和b为c-MET抗体染色与cMBP/FITC荧光高度共定位；c为9个ROI的平均像素信号强度统计。
图5显示为活体动物和离体组织中对cMBP ICG摄取的近红外成像结果，其中(a)为使用DPM-III-01荧光立体镜对局部注射cMBP ICG(25nmol/5μl PBS)或对照ICG(25nmol/5μl PBS)的荷瘤小鼠舌体(CAL-27)和健康小鼠舌体进行成像。图像是在亮场和789nm激光激发下拍摄的。荧光图像以灰度和强度比例显示(“+”＝最大信号，”-”＝最小信号)。肿瘤组织和正常组织信号背景荧光比(SBR)的比较。(b)为从左至右，分别是荷瘤全舌冰冻切片的苏木精-伊红染色图、c-MET免疫组织化学染色图，和荷瘤全舌离体亮场荧光重合图和荧光伪彩图像。(c)为免疫荧光染色法检测冰冻切片中c-MET蛋白的分布。
图6显示为表面涂抹cMBP ICG后的成像结果，其中(a)为使用基于cMBP ICG的表面涂抹给药方式检测OSCC的可能成像程序。在舌体表面涂抹cMBP ICG一分钟后，用纯水去除未结合或非特异性结合的化合物，然后用荧光成像仪器对病变进行成像。(b)为cMBP ICG特异性结合OSCC肿瘤细胞进行近红外成像的微观示意图。(c)为使用DPM-III-01荧光立体镜对带有cMBP ICG(25nmol/5μl PBS)或对照ICG(25nmol/5μl PBS)的动物的荷瘤舌头(CAL-27)和健康小鼠舌头进行成像。图像是在亮场和789nm激光激发下拍摄的。荧光图像以灰度和强度比例显示(“+”＝最大信号，”-”＝最小信号)。肿瘤组织和正常组织信号背景荧光比(SBR)的比较。
具体实施方式
本发明首先提供靶向c-Met的物质在制备或筛选头颈部鳞状细胞癌治疗、诊断药物中的用途。
在本发明的某些实施方式中还提供c-Met在制备或筛选头颈部鳞状细胞癌治疗、诊断药物中的用途。
所述筛选头颈部鳞状细胞癌治疗、诊断药物的方法例如为将待筛选药物给予高表达c-Met的细胞、组织或器官，检测待筛选药物是否能有效降低c-Met的表达。
所述靶向c-Met的物质选自核酸分子、脂类、小分子化合物、抗体、多肽、蛋白或干扰慢病毒中的任一种或多种的组合物。
所述核酸选自反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。
在本发明的某些实施方式中，所述靶向c-Met的物质选自小分子化合物和多肽的组合物。
在本发明的某些实施方式中，所述小分子化合物选自荧光染料或其衍生物。所述荧光染料优选为近红外荧光染料。
在本发明的某些实施方式中，所述荧光染料选自吲哚菁绿(ICG)或其衍生物。ICG是一种水溶性的荧光染料，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。ICG的激发波长约为780nm，发射波长约为800nm，是荧光强度高且光稳定性强的长波长染料。其在体内的清除经肝脏排入胆道，最后进入肠道排出体外。当ICG受到波长为780nm的波长激发以后，会释放出波长大约为800nm的红外光。在生物体内，近红外光可以穿透深层组织且被检测到，因此可以利用近红外成像确定病灶的位置以及范围，达到辅助诊断的效果。
所述吲哚菁绿衍生物选自ICG-COOH、ICG-NHS、ICG-amine、ICG-azide、ICG-alkyne、ICG-DBCO、ICG-Tz、ICG-TCO、ICG-Mal、Sulfo-ICG-COOH、Sulfo-ICG-amine、Sulfo-ICG-DBCO、Sulfo-ICG-azide、Sulfo-ICG-alkyne、Sulfo-ICG-DBCO、Sulfo-ICG-Maleimide中任一种或多种的组合。
在本发明的某些实施方式中，所述多肽选自cMBP，氨基酸序列为KSLSRHDHIHHHK。
在本发明的某些实施方式中，所述靶向c-Met的物质为cMBP-Sulfo-ICG-Maleimide。
所述头颈部鳞状细胞癌治疗、诊断药物的施用量为足够降低c-Met基因的转录或翻译，或者足够降低c-Met蛋白的表达或活性的剂量，以使c-Met基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。
本发明中，所述头颈部鳞状细胞癌选自口腔鳞状细胞癌、舌鳞状细胞癌、咽鳞状细胞癌或喉鳞状细胞癌。
在本发明的某些实施方式中，所述头颈部鳞状细胞癌治疗或诊断药物的剂型为冻干粉或含漱剂。
在本发明的某些实施方式中，所述头颈部鳞状细胞癌治疗或诊断药物使用方法为注射或含漱。
本发明还提供一种近红外荧光显像剂，所述近红外荧光显像剂的结构式为cMBP-Sulfo-ICG-dyes(或简称为cMBP ICG)，其中cMBP为氨基酸序列为KSLSRHDHIHHHK的肽。
所述近红外波长范围为780～2526nm。
“显像剂”是指适合于对哺乳动物身体进行体内成像的化合物。优选的，所述哺乳动物为人。所述体内成像为非侵入式的。
cMBP(c-Met binding peptide，c-Met结合多肽)为靶向c-Met的多肽。
所述Sulfo-ICG-dyes连接至cMBP的N末端。
所述Sulfo-ICG-dyes选自Sulfo-ICG-COOH、Sulfo-ICG-amine、Sulfo-ICG-DBCO、Sulfo-ICG-azide、Sulfo-ICG-alkyne、Sulfo-ICG-DBCO、Sulfo-ICG-Maleimide中的任一种或多种。
在本发明的某些实施方式中，所述Sulfo-ICG-dyes选自Sulfo-ICG-Maleimide。
所述近红外荧光显像剂的结构式为：
所述光学显像剂为用于制备头颈部鳞状细胞癌诊断药物的显像剂。
所述头颈部鳞状细胞癌诊断药物的剂型为冻干粉或含潄剂。
本发明还提供一种头颈部鳞状细胞癌诊断药物，所述头颈部鳞状细胞癌诊断药物包括所述光学显像剂以及药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当药物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在服用的情况下产生可接受的口感或气味。
在一种实施方式中，所述头颈部鳞状细胞癌诊断药物的剂型为冻干粉或含漱剂。
在本发明的某些实施方式中，所述头颈部鳞状细胞癌治疗或诊断药物使用方法为注射或含漱。优选的，所述使用方法为含漱。
本发明还提供一种头颈部鳞状细胞癌诊断方法，所述方法包括向受试者给予有效量的所述头颈部鳞状细胞癌诊断药物或所述光学显像剂。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
以下实施例中首先使用NHSCC患者的生物样本确定了c-Met在人类NHSCC中的表达，并确定了反映人类疾病的HNSCC小鼠模型，包括c-Met的表达水平。然后在这些小鼠模型中测试了cMBP-FITC，并确认其临床相关性。然后，非侵入性成像系统能够在局部注射和局部施用cMBP ICG后以高对比度显示NHSCC，这表明cMBP ICG可用于回答临床诊断相关问题。
以下实施例中用到的细胞及培养方式如下：口腔鳞状细胞癌细胞系FaDu(咽鳞状细胞癌；中国上海生物化学与细胞生物学研究所)、Cal27(舌鳞状细胞癌；中国上海生物化学与细胞生物学研究所)、WSU-HN30(咽鳞状细胞癌；中国上海尤卡塞尔)和HSF(人皮肤成纤维细胞；Yukacell，上海，中国)在37℃的单层培养中，在5％CO2增湿气氛中生长。FaDu细胞孵育在MEM培养基中，其他细胞孵育在D-MEM培养基中，两者均含有10％(v/v)胎牛血清，1％双抗。
以下实施例中用到的人体组织为从上海第九人民医院病理科获得的人类舌癌标本(n＝12)。组织的使用由上海第九人民医院的机构审查委员会(IRB)批准，并获得所有受试者的知情同意。
以下实施例中用到的动物模型的构建方法如下：
雄性3周龄BALB/c-nu/nu小鼠(中国上海SLCA实验动物有限公司)在标准条件下自由饮水和进食。在整个过程中，用2％异氟醚麻醉动物。
为了构建皮下人类口腔鳞状细胞癌(OSCC)模型，将2×106FaDu或Cal27细胞用100μl PBS重悬，并注射到动物的下背部。当肿瘤体积达到100—150mm3时进行实验。
对于原位OSCC模型，将30μl PBS中的1.2×106CAL27细胞直接注射到舌体，每天观察小鼠的肿瘤生长和体重减轻情况。通常在2-3周后进行成像。
所有动物实验均按照机构指南进行，并经上海交通大学上海第九人民医院药学院伦理委员会批准(SH9H-2020-A620-1)，并遵循NIH动物福利指南。
实施例1 c-MET在组织中的表达
使用免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)染色技术检测人类口腔癌组织、HN30异种移植物和小鼠组织中的c-MET抗原，在上海药物研究所(中国科学院，上海，中国)使用共焦显微镜(NOL-LSM 710，卡尔蔡司，德国)进行。石蜡包埋福尔马林固定的3μm切片用EZPrep缓冲液脱蜡，用CC1缓冲液(亚利桑那州图森市Ventana医疗系统)进行抗原提取，并用背景Buster溶液(加利福尼亚州里士满市Innovex)封闭切片30分钟。抗c-MET抗体以1:300稀释度孵育5小时。
对于IHC检测，使用抗c-MET兔单克隆抗体(ab51067；Abcam，中国上海)进行检测后，根据制造商的说明使用DAB检测试剂盒(DAB-0031；MXB Biotechnologies，中国)，进行显色，并用苏木精复染，盖上中性树胶(宾夕法尼亚州匹兹堡费希尔科学公司)。为了对组织特征进行形态学评估，在相邻切片上进行H&E染色。对于c-MET蛋白定量，使用NanoZoomer数字病理(NDP)扫描仪(NanoZoomer 2.0-RS，Hamamatsu Photonics)对染色的肿瘤切片进行数字化。在每个切片至少10个视野中，使用NanoZoomer数字病理学(NDP.view2)软件对c-MET的表达进行量化。在IHC染色的组织中，对棕色(c-MET)和蓝色(组织)区域进行阈值分割，并通过将棕色区域除以总组织区域来计算相对c-MET阳性区域。
对于IF检测，抗c-MET兔单克隆抗体进行一抗孵育，然后使用根据制造商说明制备的Alexa 488结合物(#4412，Cell Signaling Technology，Inc.)进行荧光二抗孵育。切片用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)复染10分钟，并用/>封片剂(密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich)封片。对照组用兔IgG取代一抗体孵育，以控制二抗的非特异性结合。c-MET阳性区域通过阈值化红色荧光区域并将其除以整个组织区域来确定，整个组织区域是根据所有细胞核中的蓝色荧光密度确定的，使用DAPI染色阈值化。测量的荧光强度在每个视野的所有原子核上取平均值，强度值范围为0-255。
对于c-Met蛋白表达的western印迹分析，使用RIPA裂解缓冲液(BeyotimeBiotechnology，中国上海)从细胞系中浓缩蛋白质。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(Beyotime Biotechnology，中国上海)在每个细胞系或人食管组织中使用10μg纯化蛋白进行电泳。将分离出的蛋白质转移到微孔聚偏二氟乙烯膜(美国罗氏)上，然后用5％牛血清白蛋白封闭(中国福州科学Phygene)。然后将膜在4℃下在抗c-MET兔单克隆抗体(ab51067；Abcam，中国上海)或GAPDH单克隆抗体(5174，cell signaling，MA，美国)中孵育过夜。在室温下用HRP结合的二级抗体(#98164，cell signaling，MA，美国)洗涤和培养1小时后，GensionTM增强ECL(溶液A:溶液B＝1:1)(中国广州Genson)用于检测蛋白质条带，并在ChemiDocXRS+成像系统(美国Bio-Rad)上成像。使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)对c-Met和GAPDH进行半定量分析。
对于c-Met表达的流式细胞术分析，使用Accutase(Sigma，CA，USA)分离粘附生长的细胞，收获的细胞与300μL兔IgG同种型抗体(02-6102；Invitrogen)或兔抗c-Met单克隆抗体(ab216574；Abcam，中国上海)在4℃孵育30分钟。随后，将细胞在PBS中漂洗，并与AlexaFluor 488二级山羊抗兔抗体(#4412，cell signaling，MA，USA)孵育30分钟。漂洗后，将细胞重新悬浮在400μL PBS中。使用流式细胞仪(CytoFLEX LX，美国贝克曼库尔特公司)进行荧光分析，每个样本的活细胞计数为1×104。
本实施例研究了c-MET在人类口腔癌组织中的表达模式，以及c-MET在邻近健康组织中的表达，其组织病理学分为3个阶段：癌前、低级别癌和高级别舌癌。每个阶段的组织包括三个标本。癌前组织被分类为高级别上皮内瘤变和原位鳞状细胞癌；低级别癌组织被分类为大多数肿瘤细胞看起来像正常组织，并且癌症“分化良好”；高级别的癌组织被归类为肿瘤细胞看起来与正常组织非常不同，并且肿瘤是“低分化”的。所有组织标本，包括9个切除的外科标本和3个细针活检标本，均取自肿瘤边缘，并具有肿瘤组织和健康周围组织的特征(图1a)。在所有病例中，通过免疫组织化学(IHC)确定的c-MET的高表达能明显区分肿瘤与邻近正常组织(图1a)。在正常组织中，IHC上的c-MET阳性区域范围为9.2％至25.6％，而对于所有恶性和癌前标本，其范围为23.0％至82.0％，两组之间几乎没有重叠(图1b和d)。正常组织的平均c-MET阳性面积为15.11±9.6％，癌前组织为31.67±14.8％(P＝0.0027vs.正常)，恶性组织为74.50±9.8％(P<0.0001vs.正常，P<0.0001vs.癌前，图1c)。使用受试者操作特征(ROC)曲线(图1e)评估c-MET作为鉴别肿瘤和正常组织标志物的效能。对于所有样本，c-MET的表达作为检测肿瘤组织的标志物的特异性为0.978，敏感性为0.756。
头颈癌细胞系和异种移植物中c-MET蛋白的表达。Western blot用于定量c-Met在癌细胞中的表达。图2a显示了HSF(人皮肤成纤维细胞)和FaDu、Cal27、HN30(头颈癌细胞)中的c-Met蛋白条带。半定量分析表明，c-Met在口腔鳞状细胞癌中的表达高于人皮肤成纤维细胞(P<0.05)，而在口腔鳞状细胞癌之间的差异不显著(P>0.05)。通过流式细胞术定量测量FITC标记的c-MET在头颈癌细胞系和对照角蛋白上皮细胞系中的表达水平，结果显示，与阴性对照相比，HSF中的MET阳性率为3.53％，FaDu、CAL27和HN30中的阳性率分别为9.95％、19.1％和28.0％(图2b)。基于上述结果，选择HN30细胞作为c-Met阳性OSCC的代表细胞，建立人OSCC异种移植模型。与健康舌组织相比，HN30皮下肿瘤组织离体切片的H&E、免疫组织化学染色和免疫荧光显示出明显的阳性区域(图2c)。
实施例2 cMBP ICG的合成
委托第三方公司合成cMBP ICG：近红外(NIR)荧光染料Sulfo ICG马来酰亚胺(Sulfo-ICG-Maleimide，美国圣地亚哥艾迪根公司)与肽(KSLSRHDHIHHHK)结合，并通过制备性HPLC(Waters′XTerra C-18 5μm柱，7ml/min，15min内5％至95％乙腈)纯化，以70–80％的产率提供cMBP ICG作为冻干粉末或结晶。
高效液相色谱分析(Waters’T3 C18 5μm 4.6×250mm柱)显示显像剂纯度高(>99％)。
使用ESI-MS(MS(+)m/z＝663.4[m+Na]+)确认cMBP ICG的结构正确。
对于成像研究，将PBS(5μl)缓慢添加到cMBP ICG(70ng)的冻干粉中以获得最终注射量。
cMBP ICG是一种靶向显像剂，在近红外范围内发出荧光(图3a)，并聚集在表达c-MET的细胞膜。cMBP ICG的吸收/发射光谱为789/803nm(图3b)。
实施例3体外细胞毒性试验
体外细胞毒性试验采用CCK-8法。将OSCC细胞和对照角蛋白上皮细胞以3000细胞/孔的密度接种到96孔板中，并在治疗前培养过夜。然后，将cMBP ICG以病毒浓度添加到培养基中，并继续培养48小时。培养完成后，将培养基替换为含有10μL CCK-8溶液的110μL新鲜培养基。在进一步培养2小时后，通过微孔板读取器(ELx800，Bio-Tek)测量每个孔450nm的吸光度。
结果如图3c所示，OSCC在不同浓度的cMBP ICG下都具有较高的细胞活力，直到浓度达到10μM/mL。HSF细胞具有更高的细胞活力，在10μM/mL时超过90％。
实施例4 OSCC细胞爬片中cMBP摄取与c-MET表达的相关性
由于cMBP ICG的发射波长超过普通显微镜的可接受范围，FITC标记的cMBP被用作评估cMBP ICG摄取的替代物。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记肽时，用0.025mol/L pH 9.2碳酸盐缓冲液将肽稀释至1％浓度，并将其放入透析袋中。用相同的缓冲液将FITC溶解于0.1mg/ml溶液中，置于圆形容器中，将透析袋浸入其中，并在4℃下搅拌24h。从透析袋中取出肽溶液，通过凝胶过滤(G-25树脂)去除多余的FITC。使用FITC标记的cMBP和抗c-MET兔单克隆抗体(ab51067；Abcam，中国上海)处理HN30和HSF细胞玻片并于4℃环境下孵育过夜。然后，将抗c-MET抗体孵育的载玻片与Alexa 647结合物(cell signaling公司，8940)孵育1小时。所有载玻片用DAPI复染10分钟，并用/>安装介质(密苏里州圣路易斯市西格玛·奥尔德里奇)覆盖载玻片。为了检测荧光cMBP/FITC发射，设置激发波长为495nm，发射波长为519nm。对于荧光c-MET/AF647发射的检测，设置激发波长为652nm，发射波长为668nm。通过测量感兴趣区域(ROI)的平均辐射效率，对信号进行半定量分析。
c-MET抗体染色与cMBP/FITC荧光高度共定位(Rcoloc.＝0.9145，R2＝0.8363；95％置信区间0.8467至0.9531；图4a，b)。这表明cMBP不仅与表达c-MET的细胞特异性结合，而且还定量反映细胞中存在的c-MET的数量(图4b)。使用ImageJ(n＝3)分析来自3个细胞玻片的9个ROI的平均像素信号强度。统计显著性(P<0.001)通过非配对t检验确定，并通过idák方法校正多重比较，α值为0.05。
实施例5活体动物和离体组织中对cMBP ICG摄取的近红外成像
为了确定cMBP ICG在肿瘤组织内积累的特异性，在组织切片中测定了靶向荧光探针与c-MET抗原的细胞间和细胞内的共定位。建立OSCC的原位CDX模型，在舌体瘤旁局部注射(即静脉注射)cMBP ICG(5μl PBS，70ng cMBP ICG冻干粉)和随后成像期间，用氯胺酮(0.1mg/g体重)麻醉原位舌癌模型(CAL27细胞)小鼠。使用临床前荧光喉镜成像系统(DPM-III-01，珠海迪普医疗科技有限公司)进行实时荧光成像。使用荧光喉镜在局部注射之前和30分钟之后采集视频。所有成像程序使用相同的仪器设置(30ms曝光时间，20％激发功率，增益：3dB)。此外，与组织表面的距离保持在10mm左右。通过缓慢扫描肿瘤区域和周围正常粘膜(非肿瘤区域)获得视频。在此过程中，实时白光图像用于视觉引导和聚焦，荧光灰度图用于评价荧光强度。对于图像分析，使用ImageJ软件。肿瘤与背景比(TBR)采用肿瘤/邻近组织公式计算。
采集整个舌头进行离体成像后，将肿瘤组织固定在4％多聚甲醛和最佳切割温度化合物(SAKURA，USA)中进行IHC检查以及冷冻组织免疫荧光成像。同实施例4中相同的，cMBP ICG暂不便用于镜下显像，故用FITC标记的cMBP对冰冻切片进行染色，并以c-Met单抗/AF647共染，用于佐证cMBP ICG活体显像的靶向性。10μm冰冻切片在4％多聚甲醛中固定8分钟，然后在PBS中用3％(v/v)山羊血清(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)阻断。抗体在1％(w/v)BSA和0.3％(v/v)Triton X-100PBS中稀释。抗c-MET一级抗体(sc-7150，加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司)在4℃(1μg/ml)下培养过夜，然后用PBS洗涤三次10分钟，并在4℃(2μg/ml)下与次级Alexa680山羊抗兔抗体(A21076，分子探针，Eugene，OR)培养1小时。在另一次5分钟PBS清洗后，用含有Hoechst 33342DNA染色剂(密苏里州圣路易斯市西格玛·奥尔德里奇)的/>(密苏里州圣路易斯市西格玛·奥尔德里奇)对切片进行固定。使用徕卡(Buffalo Grove，IL)SP8倒置共焦显微镜捕获荧光图像，该显微镜配备用于检测细胞核的405nm激光、用于检测体内应用的cMBP/FITC的488nm激光和用于检测c-MET抗体染色的670nm激光，每一个都配有合适的发射滤光片。用非特异性兔IgG或PBS代替一抗孵育切片证实结合特异性。通过未在体内注射cMBP/FITC(488nm通道中不应看到信号)或未经c-MET染色(670nm通道中不应看到信号)的成像切片排除信号渗入其他通道。cMBP/FITC和c-MET信号强度之间的相关性分析使用/>软件(加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件公司)进行。
荧光成像显示，在明显荷瘤部分舌组织中，cMBP ICG有很强的积累。而在注射cMBPICG后，在无肿瘤的舌头中未观察到信号积累，TBR有统计学意义(P<0.01)，表明cMBP ICG作为靶向OSCC可视化探针，在近红外活体成像中，能有效区分OSCC肿瘤及正常组织，即其可有效区分肿瘤边界。尽管观察到ICG局部注射组的信号强度低于cMBP ICG局部注射组，但统计意义尚不确定(P＝0.309)(图5a)。这可能是因为注射和成像之间的间隔时间很短。较长的间隔时间可能会清除非目标小分子量探针(如ICG)，而目标探针(如cMBP ICG)可能会保留。
cMBP ICG信号与全舌冰冻切片H&E和IHC染色的相关性证实，局部注射后的药物滞留在肿瘤生长区域最强(图5b)，表明cMBP ICG可靶向显影OSCC，且有辅助冰冻切片荧光显像的潜力。荷瘤全舌组织切片中的cMBP/FITC荧光染色显示肿瘤区域出荧光浓聚，且c-MET/AF647再次确认cMBP/FITC阳性区域与c-MET蛋白过表达的一致性(图5c)。
实施例6表面涂抹cMBP ICG后的口腔癌成像
对于表面涂抹cMBP ICG，使用氯胺酮(0.1mg/g体重)麻醉患有或不患有原位舌癌的小鼠，并使用镊子暴露舌头。表面涂抹的方法如下：将舌头浸入一个96孔板的孔中，该孔中填充有相应的试剂，将舌头按照如下顺序孵育：漱口液(李斯特林，强生公司，中国)中清洗30秒，然后在水中清洗20秒，第三次孵育1分钟5μM cMBP ICG或ICG(PBS作为溶剂)，最后水洗两次除残留的未结合化合物，每次30秒。通过上述临床前荧光喉镜成像系统对动物进行成像，然后计算肿瘤背景信号比(TBR)。
cMBP ICG作为漱口水漱口的新型检查方式，可无创筛查口腔溃肿、白斑的病理特性。在口腔病变难以定性的漫长随访中，可帮助医生及早发现病变的异变，避免漏诊及误诊。在舌OSCC的临床前模型中，本实施例研究了表明涂抹应用cMBP ICG对肿瘤显像的对比度是否与局部注射相当。使用表观荧光成像的宏观评估证实cMBP ICG与存在原位肿瘤的舌部区域共定位。荧光成像显示，在明显受OSCC影响的部分舌中，cMBP ICG有较强的积聚，而在无肿瘤的舌中未观察到信号积聚，TBR有统计学意义(P<0.01)，表明对OSCC这类表浅鳞癌来说，表面涂抹cMBP ICG也可作为一种可靠的成像给药方式。ICG表面涂抹组的信号强度明显低于cMBP ICG表面涂抹组，TBR具有统计学意义(P<0.01)(图6c)，表明表面涂抹cMBP ICG也可达到对肿瘤的靶向显像。且局部注射和表面涂抹这两种给药方法相比，局部注射这种给药方式中，cMBP ICG组与ICG组的TBR无明显统计学差异，而表面涂抹的给药方式中，cMBPICG组与ICG组的TBR有明显统计学差异，说明表面涂抹可能能更好发挥cMBP ICG对于OSCC的靶向显影特性。
实施例中使用GraphPad Prism 9.2对临床前数据进行统计分析。除非另有说明，数据点代表平均值，误差条代表生物复制的标准偏差。P值采用Student的非配对t检验进行计算，并通过Holm-Sidak方法进行多重比较校正，α值为0.05作为显著性的截止值。对于临床标本，使用核密度估计分别估计正常组织和恶性组织的c-MET阳性面积百分比分布。使用c-MET表达区分恶性组织和邻近正常组织的能力通过受试者操作特征(ROC)曲线来表征。
本发明中合成了一种c-Met靶向NIRF探针cMBP ICG，体内实验显示cMBP ICG被c-Met阳性OSCC特异性摄取。此外，使用绿色荧光通道的荧光成像系统已进入临床实践，cMBPICG有望辅助口腔癌筛查程序，cMBP ICG的应用方法从静脉注射改为表面涂抹或漱口，可降低使用的复杂性，增加药物在临床上的广度和多功能性。同时，局部应用(表面涂抹或漱口)将进一步降低成本、潜在副作用和简化成像方案，与其他分子成像方式(如PET或MRI)相比，光学荧光成像设备价格更低，且更为便捷。
总之，本申请的研究结果表明，口腔鳞状细胞癌的cMBP ICG成像具有广泛的应用前景，包括癌症筛查、肿瘤切除过程中的手术指导以及肿瘤边缘的描绘、术后长期随诊复查等等。因此，c-MET成像可以早期发现口腔癌，并降低困扰口腔鳞癌患者的根治性手术的复发率。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (5)
1.靶向c-Met的物质在制备头颈部鳞状细胞癌诊断药物中的用途，所述靶向c-Met的物质为cMBP-Sulfo-ICG-Maleimide，所述cMBP-Sulfo-ICG-Maleimide的结构式为：
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述头颈部鳞状细胞癌选自口腔鳞状细胞癌、舌鳞状细胞癌、咽鳞状细胞癌或喉鳞状细胞癌。
3.一种靶向c-Met的近红外荧光显像剂，其特征在于，所述近红外荧光显像剂为
cMBP-Sulfo-ICG-dyes，其中cMBP为氨基酸序列为KSLSRHDHIHHHK的肽，所述近红外荧光显像剂的结构式为：
4.一种头颈部鳞状细胞癌诊断药物，其特征在于，所述头颈部鳞状细胞癌诊断药物包括权利要求3所述的近红外荧光显像剂以及药学上可接受的载体或辅料。
5.根据权利要求4所述的头颈部鳞状细胞癌诊断药物，其特征在于，所述头颈部鳞状细胞癌诊断药物的剂型为冻干粉或含潄剂。
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| Current trends and key considerations in the clinical translation of targeted fluorescent probes for intraoperative navigation;Renfa Liu等;《Aggregate》;第2卷(第3期);1-23 * |
| 吲哚菁绿在口腔癌可视化治疗中的应用;张誉等;《口腔疾病防治》;第28卷(第2期);118-122 * |
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