KR101641825B1

KR101641825B1 - 타깃 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 대장용종과 대장암 조기검출용 바이오칩

Info

Publication number: KR101641825B1
Application number: KR1020150032883A
Authority: KR
Inventors: 박종필; 황혜진
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2015-03-10
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2016-07-21

Abstract

본 발명은 대장용종과 대장암 검출에 유용한 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 바이오칩에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 대장용종과 대장암 검출에 관한 타깃 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 분자인식자 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 바이오칩에 관한 것이다.
이를 이용하여 난검출성으로 알려진 대장용종 및 대장암의 조기진단이나, 대장용종으로부터 대장암으로의 진행과정 혹은 진행여부 진단이 가능해진다.

Description

타깃 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 대장용종과 대장암 조기검출용 바이오칩 {The peptide probes high specific and high selective for target biomarker, and the biochip for clinical prediction of colon polyp and carcinoma}

본 발명은 대장용종과 대장암 검출에 유용한 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 바이오칩에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 대장용종과 대장암 검출에 관한 타깃 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 분자인식자 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 바이오칩에 관한 것이다.

이를 이용하여 난검출성으로 알려진 대장용종 및 대장암의 조기진단이나, 대장용종으로부터 대장암으로의 진행과정 혹은 진행여부 진단이 가능해진다.

본 발명의 펩타이드 프로브는, 바이오칩에 널리 사용되는 골드를 포함한 다양한 기판 위에 화학적인 표면 처리공정 없이 선택적으로 고정할 수 있어, 이를 통해 바이오칩 제작공정이 간편해짐은 물론, 복잡한 칩기판의 수식화-식각화 공정이 필요 없게 되어 전체적으로 제조공정이 단순화되어 생산성과 경제성에 큰 향상효과를 기대할 수 있다.

대장은 소화기관에 속하며 소장과 항문 사이에 위치하는 장기이다. 전체 길이가 평균 약 1.5미터 정도이며, 우측에서부터 맹장, 상행결장, 횡행결장, 하행결장, S자결장, 직장으로 나누어 분류된다. 대장암은 주로 대장의 상피세포에서부터 암세포가 발생하게 되는데, 발생하는 위치에 따라 결장에 생기는 암을 결장암, 직장에 생기는 암을 직장암이라고 한다.

대장암의 발생 원인은 크게 환경적 요인과 유전적 요인으로 나누어 볼 수 있으며 환경적 요인 중에서는 식이요소 및 생활습관이 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Lee et al., Korean J Gastroenterol. 2012; Lieberman et al., N Engl J Med 2000; Regula et al., N Engl J Med 2006). 대장, 직장암은 동물성 지방질과 고기를 많이 먹는 미국이나 유럽에 사는 민족에게서 많이 발생하고, 한국이나 일본을 비롯한 아시아 각국에서는 발생률이 낮았으나 근래에는 식생활이 서구화되어감에 따라 대장, 직장암의 발생률이 1980년대 이후 현재까지 꾸준히 증가하고 있다 (Ferlay et al., IARC Press, 2004; N Engl J Med 2006; Journal of Genetic Medicine 2010;).

국가 암등록 통계에 의하면 2011년에 우리나라에 발생한 대장암은 총 28,112건으로 전체 암 발생 (218,017건)의 12.9%를 차지하며 암 발생빈도 3위, 암 사망률 4위를 차지한다 (국가암등록사업 연례보고서, 2011; 보건복지부 중앙암등록본부 2011; 건강보험심사평가원 2013).

대장암 사망률이 계속해서 증가하는 다른 원인은 바로 대장암의 초기증상이 거의 없다는 것과 그로 인해 우리나라 대장암 조기 발견율이 10%도 채 넘지 않을 정도로 낮다는 것에 있다. 많은 대장암 환자들이 다른 장기로 전이가 시작되는 3기와 4기의 전이성 대장암이 되어서야 암을 진단 받는다. 대장암 3기는 림프절로 전이가 있는 경우를 말하고, 4기는 간·폐·뼈 등으로의 원격전이가 있는 경우를 말한다. 대장암 3기 생존율은 28%로 상당히 낮은 편이고, 대장암 4기는 생존율 6%로 대장암 3기 생존율에 비해 더 낮다 (한국인 암등록 조사자료분석 보고서, 보건복지부, 2003).

현재, 대장암을 진단하는 가장 많이 이용되는 방법으로 대장 촬영술(Double contrast Barium-enema)과 대장내시경검사이다 (Sonnenberg et al., Ann Int Med, 2000; Kim et al., 대한소화기내시경학회지 2004). 대장촬영술은 대장을 깨끗이 청소한 후 항문을 통해 작은 관을 삽입하여 바륨이라는 조영제를 주입하고, 이에 다시 공기를 주입하여 대장을 팽창시키면서 바륨을 대장벽에 얇게 도포하여 X-선 투시장치로 영상을 획득하는 검사법이다. 직장에서부터 거꾸로 약을 주입하여 소장 말단부까지 검사를 진행하는데, 대장벽에 붙어있는 분변은 대장용종과 감별이 어려운 경우가 많기 때문에 대장을 깨끗이 비우는 것이 매우 중요하다. 장점으로는 대장의 전체적 윤곽과 형태를 알 수 있고, 대장암의 전반적 위치파악이 용이하며, 염증성 변화나 허혈성 변화 등의 대장벽 변화 및 소장말단부를 검사하는 데에 좋다는 것이다. 그러나 검사와 함께 조직을 얻을 수 없고, 대장이 깨끗하게 청소되지 않으면 정확도가 떨어지며, 작은 용종에 대한 정확도가 대장내시경보다 떨어지는 단점이 있다 (Kim et al., 대한소화기내시경학회지 2004).

대장내시경검사란 불빛과 유연성이 있는 튜브를 이용하여 대장을 직접 보는 검사 방법으로 대장질환의 가장 정확한 진단 방법인데, 그 이유는 의사가 직접 출혈 부위와 병변의 표면을 관찰할 수 있고 조직 상태를 파악할 수 있기 때문이다 (Sonnenberg et al., Ann Int Med, 2000). 내시경 검사와 동시에 조직 검사(생검)도 가능하며, 짧은 시간 동안만 작용하는 수면제를 정맥 주사하여 환자가 자는 동안 수면 내시경을 시행하면 불편감 없이 검사를 받을 수 있다. 이는 대장 종양이나 폴립의 발견에 매우 민감하며 발견한 이상병변에 대해 조직검사 및 초기 병변에 대해 즉시 치료까지 시행할 수 있는 장점이 있는 반면, 검사하는 동안 환자가 느끼는 불편감이 있고 암 등으로 대장 내강이 막혀 있으면 더 이상 검사를 진행할 수 없는 단점이 있다. 그럼에도 불구하고, 대장암의 확진은 대장 내시경 검사를 통한 조직검사를 통해 암세포를 발견해야만 가능하다.

대장암 사망률이 계속해서 증가하는 또 하나의 큰 원인은 바로 대장암의 진단 방법에 있을 것이다. 대장암과 같이 조기에 증상이 없는 암의 경우 정기적인 검진이 필요한데, 검사의 번거로움, 통증, 위험성(간혹 대장 내시경의 경우 천공의 위험이 따른다)을 이유로 검사 자체를 꺼리는 사람이 많은 것으로 나타났다. 대장암 진단에 도움이 되는 또 다른 검사로는 직장수지검사 (rectal examination), 대변검사 (점혈검사), CT 또는 MRI 검사, 초음파검사, 혈액검사 등이 있다 (Mandel et al., N Engl J Med 2000; Lieberman, N Engl J Med 2009; Johnson et al., N Engl J Med 2008; Cotton et al., JAMA 2004; Bosch et al., Clin Colorectal Cancer 2011). 예를 들어, 암태아성항원 (CEA) 검사가 있으며, 혈중 높은 암태아성항원 (CEA)의 수치가 나타난다면 이것은 대장암이나 다른 암이 있을 가능성이 있음을 의미한다. 그러나 이 수치는 간경변증, 간질환, 알코올성 췌장염 환자나 그리고 흡연자에게서도 증가할 수 있으므로, 이 검사는 대장암의 수술 전 단계나 암 치료의 효과를 검사하기 위해서 또는 대장암과 다른 암의 재발 확인을 위한 검사에서 보조적으로 사용되는 것이 일반적이다 (Drew et al., PLoS One. 2014).

최근에는 대장암을 조기 진단하기 위한 시도가 많이 되고 있으며 그 예로서, 독일의 분자진단시약 개발회사인 EpiGenomic사가, 특허기술을 가지고 있는 SEPT9 유전자의 메틸화(methylation)를 검출하는 체외진단용 시약으로 대장내시경의 불편함 없이 혈액을 이용하여 대장암을 조기에 진단할 수 있는 진단시약 "Epi Procolon SEPT9 test"를 개발하였는데, 이 유전자의 메틸화는 혈액에서 대장암을 조기에 진단하는 유용한 마커로서, 혈액 내에 메틸화된 SEPT9 유전자가 검출되면 대장암 발병 확률과 매우 연관성이 있음을 보여준다 (Bhalla et al., Clin Lab Med. 2013; Yatabe et al., Lung Cancer. 2011; 국내공개특허 제10-2011-0103914호, 제10-2010-0012852호, 제10-2010-0044307호, 국내등록특허 제10-0892587호, 국내등록특허 제10-1212024호). 그러나, 이 방법은 혈액에 EDTA를 처리한 후 3.5 mL의 plasma로부터 DNA를 검출하고 Real time PCR을 진행한 뒤 결과를 알 수 있어서 분석 과정이 경제적이지 못하다고 할 수 있다 (Xu et al., BMC Cancer, 2014).

따라서 검사를 위해 번거롭고 많은 시간과 다소의 고통을 동반하는 대장 내시경을 꺼리는 환자들 진단에 유용하게 사용 가능하며, 좀 더 간단하면서 적은 양의 시료(혈액)를 이용하여 정확하고 단시간에 분석이 가능한 진단 시스템이 필요로 되고 있다.

이에 본 발명자들은 난검출성으로 알려진 대장용종 및 대장암의 조기진단이 가능한 바이오칩을 개발하기 위하여, 환자의 혈액 내에 바이오마커 단백질의 발현 양의 차이(증가 혹은 감소)를 이용하여 대장용종 환자 및 대장암의 진행예측이 가능하다고 하는 문헌과 특허상에서 검증된 표준 바이오마커 단백질(LRG1, AHSG, TTR)(공개특허: 10-2014-0088468)을 타깃으로 사용하여 각 단백질에 특이적이며 선택적 결합이 가능한 펩타이드 프로브를 발굴하고 제조하여 이를 활용하여 대장용종과 대장암의 조기검출이 가능한 바이오칩을 개발하고자 하였다.

본 발명자들은 값비싼 항체를 사용하여 칩상 혹은 수용액 상태에 항원-항체반응, 샌드위치방법 등을 통해 전통적으로 질병조기진단에 사용되어온 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 대체하고, 간단 간편하게 경제적인 공정을 통해서 민감도와 특이성을 향상시킬 수 있는 바이오칩을 가능하게 하고자 하였다.

그 결과, 분자진화방법 중의 하나인 M13 박테리오파지를 활용한 biopanning을 수행하여 타깃단백질에 특이적이며 선택적 결합이 가능한 저분자량의 12개 아미노산으로 이루어진 펩타이드 프로브를 발굴하고 제작하고, 상기 펩타이드 프로브를 활용하여 대장용종으로부터 대장암으로의 진행상황 등에 대한 조기예측이 가능한 바이오칩을 제조할 수 있게 하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 타깃단백질에 고특이적(high specific)이면서 고선택적인(high selective) 결합(binding)을 통한 분자감지(molecular recognition)가 가능한 펩타이드 프로브를 발굴하고, 상기 프로브를 구성하는 아미노산을 기본적으로 포함하는 펩타이드 라이브러리를 구축하여, 이를 바이오칩에 고정할 수 있게 하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은,

바이오마커 단백질 LRG1, AHSG 및 TTR 중 적어도 어느 하나를 타깃으로 하는 펩타이드 프로브를 포함하는 대장용종과 대장암 조기검출용 바이오칩인 것을 특징으로 한다.

또한 바이오마커 단백질 LRG1, AHSG 및 TTR을 타깃으로 하는 3개의 펩타이드 프로브를 모두 포함하는 대장용종과 대장암 조기검출용 바이오칩인 것을 특징으로 한다.

이때, 바이오마커 단백질 LRG1에 대한 펩타이드 프로브는 아미노산 서열목록 3(HTSSLWHLFRST)을 포함하는 서열로 구성되고,

바이오마커 단백질 AHSG에 대한 펩타이드 프로브는 아미노산 서열목록 6(AXNXTRXPERHA)을 포함하는 서열로 구성되며,

바이오마커 단백질 TTR에 대한 펩타이드 프로브는 아미노산 서열목록 11(VHWDFRQWWQPS)을 포함하는 서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.

또한 펩타이드 프로브의 아미노산은 D형, L형, 펩타이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

또한 펩타이드 프로브는 N말단 혹은 C말단에 다양한 기능기를 포함하는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 한다.

또한 펩타이드 프로브의 N말단 기능기는 free amine, acetylation, biotin 또는 flurophore를 포함하고,

C말단 기능기는 free acid, amidation, biotin, flurophore를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 아미노산 서열목록 3(HTSSLWHLFRST), 아미노산 서열목록 6(AXNXTRXPERHA) 및 아미노산 서열목록 11(VHWDFRQWWQPS) 중 적어도 어느 하나를 포함하는 서열로 구성되는 대장용종과 대장암 조기검출용 펩타이드 프로브인 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 본 발명에 대해 부연설명한다.

본 발명자는 대장용종 및 대장암 조기검출용 펩타이드 프로브를, M13 bacteriophage를 이용한 biopanning 과정을 포함한 융합된 형태의 기술을 통해서 발굴하였으며, 이때 상기 융합된 형태의 기술의 범위는 적어도 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 기본적으로 포함하도록 하였다.

본 발명의 대장용종 및 대장암 조기검출용 펩타이드 프로브는, attachment, protection, coupling, deprotection, cleavage 과정을 기본적으로 포함하는 liquid-phase synthesis 혹은 solid-phase synthesis 방법을 통해서 제조하였다.

상기 방법을 통해서 제조된 펩타이드 프로브는 각기 다른 아미노산으로 구성된 최소 12개 이상의 아미노산(D형, L형, 펩토이드를 포함한 펩타이드 모방체, 비천연 아미노산)을 포함한다.

또한, 상기 방법을 통해서 제조된 최소 12개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 프로브의 N말단 혹은 C말단은 다양한 기능기를 포함할 수 있다.

또한 상기 방법을 통해서 제조된 펩타이드 프로브의 기능기는 N말단은 free amine, acetylation, biotin, 다양한 flurophore를 포함할 수 있고, C말단은 free acid, amidation, biotin, 다양한 flurophore를 포함할 수 있다.

상기와 같은 펩타이드 프로브는, 바이오칩으로 사용 가능한 다양한 칩(gold, silver, magnetic bead, silica, graphene, carbon nanotube 등)상에 특이적으로 고정될 수 있다. 다만, 본 발명의 특징은 전술한 프로브와 관련된 사항에 있으며 그와 같은 프로브를 바이오칩으로 제조하는 것은 공지기술에 따라 할 수 있는 부분이다.

본 발명의 대장용종 및 대장암 조기검출용 펩타이드 프로브가 장착된 바이오칩을 이용하여 단백질과 단백질 간의 반응, 단백질과 반응리간드 간의 반응, 목적리간드와 반응단백질 간의 반응 또는 목적리간드와 반응리간드 간의 반응을 검출할 수 있다. 상기 반응리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 생체물질, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있다.

상기 반응단백질은 효소 또는 항체일 수 있다.

또한 상기 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있다.

또한 상기 반응 검출은 표지 혹은 비표지체를 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 대장용종과 대장암 진단용 펩타이드 프로브를 이용한 바이오칩은 환자 혈액 내의 LRG1, AHSG, TTR 단백질에 고특이적이고 고선택적 결합이 가능하여 각각의 타깃 바이오마커 단백질의 양(증감 혹은 감소)을 정확히 검출할 수 있어 간편하게 대장용종과 대장암의 조기진단이 가능하게 함으로써 신속한 치료가 가능하게 되어 매년 증가하는 대장암 환자의 생존율을 향상시키고 암 치료로 인한 국가적 손실을 줄이는데 기여할 수 있을 것으로 보인다.

도 1은 선택된 5개의 박테리오파지를 이용하여 타깃단백질인 LRG1에 대한 결합력을 비교하기 위해 ELISA를 진행한 결과이다.
도 2는 타깃단백질인 LRG1 농도에 따른 선택된 박테리오파지(LRG1 R4 #9)의 결합력을 측정한 결과이다.
도 3은 선택된 파지(LRG1 R4 #9) 농도에 따른 LRG1 단백질에 대한 결합력을 측정한 결과이다.
도 4는 선택된 3개의 박테리오파지를 이용하여 타깃단백질인 AHSG에 대한 결합력을 측정한 결과이다.
도 5는 선택된 4개의 박테리오파지를 이용하여 타깃단백질인 TTR에 대한 결합력을 측정한 결과이다.
도 6은 타깃단백질인 TTR 농도에 따른 선택된 박테리오파지(TTR R4#11)의 결합력을 측정한 결과이다.
도 7은 선택된 파지(TTR R4#11) 농도에 따른 TTR 단백질에 대한 결합력을 측정한 결과이다.

본 발명자는 난검출성으로 알려진 대장용종 및 대장암 환자의 혈액 내에서 급격한 발현 양의 차이 (증가 혹은 감소)가 통계학적으로 유효하여 암 조기진단이 가능하여 신뢰할 수 있는 바이오마커 단백질 (LRG1, AHSG, TTR)을 타깃으로 사용함으로써, 상기 각 타깃 단백질을 대상으로 M13 bacteriophage를 이용한 biopanning 과정을 통해 신규 펩타이드 프로브를 발굴하였다.

상기 방법을 통해서 발굴된 신규 펩타이드 프로브는 기본적으로 12개의 아미노산을 포함하는데, 상기 프로브는 N말단 혹은 C말단에 다양한 기능기를 포함하는 이중체, 삼중체 혹은 다중체일 수 있다.

본 발명에서 신규 펩타이드 프로브는 숙주세포에서 재조합단백질 형태로 생산 가능하다. 숙주세포는 대장균으로 할 수 있고, 상기 재조합단백질 형태의 목적단백질의 다양한 태그는 N말단, C말단에 결합될 수 있다.

상기 방법에 의해 생산되고 목적단백질-프로브의 융합단백질이 고정되어 있는 바이오칩을 이용하여 바이오물질 상호작용을 검출할 수 있다. 상기 고정은 특이적 고정화방법을 통한 것, 또는 미세채널(microchannel), 또는 마이크로 어레이(microarray)를 이용한 spotting 방법 등을 활용할 수 있다. 상기 검출은 CV, EIS, QCM, SPR 또는 SPR 이미징을 통해 수행할 수 있다. 즉, 바이오센서 시스템에 흔한 분석 방법을 사용하여 목적단백질-프로브, 목적DNA-프로브 등의 상호작용을 통해 암조기진단에 사용할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지는 않음을 밝힌다.

실시예 1 : 타깃 단백질(LRG1, AHSG, TTR)과 biotinlyation

본 발명에서 사용된 타깃 단백질은 recombinant protein of human leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1 (LRG1, Genbank accession no: NM_001622), recombinant human alpha-2-HS-glycoprotein (AHSG, Genbank accession no:NM_052972), recombinant human transthyretin (TTR, Genbank accession no: NM_000371)으로서, Origene사에서 구입하여 사용하였으며 Thermo scientific사의 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit을 사용하여 biotinylation 과정을 거친 후 Bradford assay에 의해 농도를 계산하고, 사용 전까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다.

실시예 2: M13 박테리오파지 디스플레이를 이용한 LRG1에 고특이적 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 라이브러리 발굴

본 발명에서 사용된 박테리오파지 랜덤 펩타이드 라이브러리 (Phage display peptide library)는 Ph.D.-12 (New England BioLab)로, 이는 M13 박테리오파지의 게놈 중에서 코트 단백질(coat protein)의 일종인 pIII를 생산하는 유전자 말단에 12개의 무작위 아미노산 서열의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 박테리오파지로 구성되어 있다.

총 4회의 패닝 (panning)을 수행하였으며, 패닝에는 streptavidin이 코팅되어 있는 평판(Streptavidin High Binding Capacity Coated 96-Well Plates (Thermo scientific, Cat. No. 15501)을 사용하였다.

먼저, biotinylated LRG1 단백질과 M13 박테리오파지를 상온에서 1시간 동안 반응하여 Pre-complex를 형성하도록 한다. 그다음 streptavidin이 코팅되어 있는 평판을 3회 TBS(트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어준 후, Pre-complex를 microwell에 넣고 상온에서 15분 동안 150 rpm으로 교반하여 주었다. binding되지 않은 박테리오파지는 TBS (트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어주었으며, 최종적으로 LRG1에 특이적으로 결합하는 파지는 100 uL의 0.2M Glycin-HCl (pH 2.2) 용액에 용출되었고, neutralization를 위해 15 uL의 Tris-HCl (pH 9.0)이 첨가되었다. 상기의 과정을 통하여 LRG1에 잘 결합하는 5개의 박테리오파지 후보군을 1차적으로 선별하였고, DNA sequencing을 통해 아미노산서열을 확인하였다 (표 1).

실시예 3: 효소면역측정법 (ELISA)을 이용한 LRG1에 고특이적 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 프로브를 포함하고 있는 박테리오파지 후보군의 결합력 측정

5회 biopanning을 거쳐서 선별된 5개의 박테리오파지 후보군를 ELISA 실험에 이용하기 위해 Amplification을 진행하였다. 각각의 파지 stock을 미리 배양해둔 E.coli ER2738과 함께 LB 배지에 넣은 후 37℃, 150 rpm에서 4-5시간 동안 배양하였다. 원심분리하여 상층액을 회수한 후 20% PEG/2.5M NaCl을 첨가하여 얼음에 1시간 동안 방치하였다. 다시 원심분리하여 얻어진 침전물은 TBS (트리스 완충 식염수)에 녹인 후 파지 Titration을 실시하여 각각의 파지의 농도 (PFU/mL: Plaque forming units/mL)을 계산하였다.

각각의 5개의 파지와 LRG1의 결합력을 비교하기 위하여 다음과 같이 ELISA를 진행하였다. 먼저, 타깃 단백질인 LRG1 100 uL (LRG1 농도: 3.29 ug/ml)를 streptavidin이 코팅되어 있는 평판에 넣은 후 16시간 동안 4℃ 냉장고에서 코팅하였다. 이후 단백질 용액을 제거하고, Blocking 용액 (5% BSA in NaHCO₃, pH8.6) 250 uL을 첨가하여 1시간 동안 4℃ 냉장고에서 반응하였다. 다시 TBS (트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어준 후, 미리 준비된 각각의 파지를 10¹¹ PFU/mL의 농도로 처리한 후 상온에서 1시간 150 rpm으로 교반하여 반응하였다. TBS (트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어준 후, M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 415nm에서 OD 값을 측정 비교하였다. 그 결과, 5개의 파지 중에서 LRG1 R4#9가 LRG1에 대해 가장 큰 결합력을 가지는 것으로 나타났다 (도면 1).

상기와 동일한 ELISA 방법으로 LRG1 농도 변화에 따른 LRG1 R4#9의 결합력 측정 비교한 결과, LRG1 R4#9의 결합력은 LRG1의 농도 증가에 비례하여 결합력이 증가함을 확인하였다. 단, LRG1의 농도가 3.29 ug/ml 이하일 경우에는 유의하게 증가하지 않았다 (도면 2).

상기와 동일한 ELISA 방법으로 동일한 LRG1 단백질을 코팅한 평판에 LRG1 R4#9 파지 농도별로 처리하여 그 결합력을 비교한 결과 마찬가지로 농도비례하여 결합력이 증가함을 관찰하였다 (도면 3). 이 결과는 선택된 파지 LRG1 R4#9가 LRG1에 특이적으로 잘 결합함을 보여주는 것이며, LRG1 R4#9가 가지고 있는 12개 peptide의 서열 "HTSSLWHLFRST"이 peptide 유래 대장암 진단키트 등에 이용될 수 있음을 보여준다.

실시예 4 : M13 박테리오파지 디스플레이를 이용한 AHSG에 고특이적 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 프로브 발굴

총 3회의 biopanning을 수행하였으며, biopanning에는 streptavidin이 코팅되어 있는 평판 (Streptavidin High Binding Capacity Coated 96-Well Plates (Thermo scientific, Cat. No. 15501)을 사용하였다.

먼저, biotinylated AHSG 단백질과 M13 박테리오파지를 상온에서 1시간 동안 반응하여 Pre-complex를 형성하도록 한다. 그다음, streptavidin이 코팅되어 있는 평판을 3회 TBS (트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어준 후, Pre-complex를 microwell에 넣고 상온에서 15분 동안 150 rpm으로 교반하여 주었으며, binding되지 않은 박테리오파지는 TBS (트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20로 씻어주었고, 최종적으로 AHSG에 특이적으로 결합하는 파지는 100 uL의 0.2M Glycin-HCl (pH 2.2) 용액에 용출되었으며, neutralization을 위해 15 uL의 Tris-HCl (pH 9.0)이 첨가되었다. 상기 과정을 통하여 AHSG에 잘 결합하는 3개의 박테리오파지 후보군을 1차적으로 선별하였고, DNA sequencing을 통해 아미노산서열을 확인하였다 (표 2).

실시예 5 : 효소면역측정법 (ELISA)을 이용한 AHSG에 고특이적 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 프로브를 포함하고 있는 박테리오파지 후보군의 결합력 측정

각각의 파지 stock을 미리 배양해둔 E.coli ER2738과 함께 LB 배지에 넣은 후 37℃, 150 rpm에서 4-5시간 동안 배양하였다. 원심분리하여 상층액을 회수한 후 20% PEG/2.5M NaCl을 첨가하여 얼음에 1시간 동안 방치하였다. 다시 원심분리하여 얻어진 침전물은 TBS (트리스 완충 식염수)에 녹인 후 파지 Titration을 실시하여 각각의 파지의 농도 (PFU/mL: Plaque forming units/mL)을 계산하였다.

각각의 3개의 파지와 AHSG의 결합력을 비교하기 위하여 다음과 같이 ELISA를 진행하였다. 먼저, 타깃 단백질인 AHSG 100 uL (AHSG 농도: 4.298 ug/ml)를 streptavidin이 코팅되어 있는 평판에 넣은 후 16시간 동안 4℃ 냉장고에서 코팅하였다. 이 후 단백질 용액을 제거하고, Blocking 용액 (5% BSA in NaHCO₃, pH8.6) 250 uL을 첨가하여 1시간 동안 4℃ 냉장고에서 반응하였다. 다시 TBS (트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어준 후, 미리 준비된 각각의 파지를 10¹¹ PFU/mL의 농도로 처리한 후 상온에서 1시간 150 rpm으로 교반하여 반응하였다. TBS (트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어준 후, M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 415nm에서 OD 값을 측정 비교하였다. 그 결과, 3개의 파지 중에서 AHSG R2#9가 AHSG에 대해 가장 큰 결합력을 가지는 것으로 나타났다 (도면 4).

실시예 6 : M13 박테리오파지 디스플레이를 이용한 TTR에 고특이적 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 프로브 발굴

총 4회의 biopanning을 수행하였으며, biopanning에는 streptavidin이 코팅되어 있는 평판 (Streptavidin High Binding Capacity Coated 96-Well Plates (Thermo scientific, Cat. No. 15501)"을 사용하였다.

먼저, biotinylated TTR 단백질과 M13 박테리오파지를 상온에서 1시간 동안 반응하여 Pre-complex를 형성하도록 한다. 그다음, streptavidin이 코팅되어 있는 평판을 3회 TBS (트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어준 후, Pre-complex를 microwell에 넣고 상온에서 15분 동안 150 rpm으로 교반하여 주었으며, binding되지 않은 박테리오파지는 TBS (트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20로 씻어주었으며, 최종적으로 TTR에 특이적으로 결합하는 파지는 100 uL의 0.2M Glycin-HCl (pH 2.2) 용액에 용출되었고, neutralization를 위해 15 uL의 Tris-HCl (pH 9.0)이 첨가되었다. 상기의 과정을 통하여 TTR에 잘 결합하는 4개의 박테리오파지 후보군을 1차적으로 선별하였고, DNA sequencing을 통해 아미노산서열을 확인하였다 (표 3).

실시예 7 : 효소면역측정법 (ELISA)을 이용한 TTR에 고특이적 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 프로브를 포함하고 있는 박테리오파지 후보군의 결합력 측정

각각의 파지 stock을 미리 배양해둔 E.coli ER2738과 함께 LB 배지에 넣은 후 37℃, 150 rpm에서 4-5시간 동안 배양하였다. 원심분리하여 상층액을 회수한 후 20% PEG/2.5M NaCl을 첨가하여 얼음에 1시간 동안 방치하였다. 다시 원심분리하여 얻어진 침전물은 TBS (트리스 완충 식염수)에 녹인 후 파지 Titration을 실시하여 각각의 파지의 농도 (PFU/mL: Plaque forming units/mL)을 계산하였다. 각각의 4개의 파지와 TTR의 결합력을 비교하기 위하여 다음과 같이 ELISA를 진행하였다. 먼저, 타깃 단백질인 TTR 100 uL (TTR 농도: 2.528 ug/ml)를 streptavidin이 코팅되어 있는 평판에 넣은 후 16시간 동안 4℃ 냉장고에서 코팅하였다. 이후 단백질 용액을 제거하고, Blocking 용액 (5% BSA in NaHCO₃, pH8.6) 250 uL을 첨가하여 1시간 동안 4℃ 냉장고에서 반응하였다. 다시 TBS (트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어준 후, 미리 준비된 각각의 파지를 10¹² PFU/mL의 농도로 처리한 후 상온에서 1시간 150 rpm으로 교반하여 반응하였다. TBS (트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어준 후, M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 415nm에서 OD 값을 측정 비교 하였다. 그 결과, 4개의 파지 중에서 TTR R4#11이 TTR에 대해 가장 큰 결합력을 가지는 것으로 나타났다 (도면 5).

상기와 동일한 ELISA 방법으로 TTR농도 변화에 따른 결합력을 측정 비교한 결과, TTR R4#11의 결합력은 TTR의 농도 증가에 비례하여 결합력이 증가함을 확인하였다. 단, TTR의 농도가 0.02528 ug/ml 이하일 경우에는 유의하게 증가하지 않았다 (도면 6).

상기와 동일한 ELISA 방법으로 동일한 TTR단백질을 코팅한 평판에 파지 농도별로 처리하여 그 결합력을 비교한 결과 마찬가지로 농도비례하여 결합력이 증가함을 관찰하였다 (도면 7). 이 결과는 선택된 파지가 TTR에 특이적으로 잘 결합함을 보여주는 것이며, TTR R4#11이 가지고 있는 12개 peptide의 서열 "VHWDFRQWWQPS"이 peptide 유래 대장암 진단키트 등에 이용될 수 있음을 보여준다.

위에서 살핀 바와 같이, 본 발명자가 안출한 펩타이드 프로브는 환자 혈액 내의 LRG1, AHSG, TTR 단백질에 고특이적이고 고선택적으로 결합 가능하여 각각의 타깃 바이오마커 단백질의 양(증감 혹은 감소)을 정확히 검출할 수 있어, 이를 통하여 간편하게 대장용종과 대장암의 조기진단이 가능해진다.

<110> Industry-academic cooperation foundation Daegu Hanny University <120> The peptide probes high specific and high selective for target biomarker, and the biochip for clinical prediction of colon polyp and carcinoma <130> ULA-0301 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 1 Trp Pro Val Trp Xaa Met Arg Pro Met Val Gln Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 2 Phe Pro Leu Arg Glu Gly His His Trp Asp Ala Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 3 His Thr Ser Ser Leu Trp His Leu Phe Arg Ser Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 4 Gly Leu His Thr Ser Ala Thr Asn Leu Tyr Leu His 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 5 Ser Gly Val Tyr Lys Val Ala Tyr Asp Trp Gln His 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 6 Ala Xaa Asn Xaa Thr Arg Xaa Pro Glu Arg His Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 7 Ser Gly Val Tyr Lys Val Ala Tyr Asp Trp Gln His 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 8 Cys Ile Ala His Ile Gly Pro Thr Lys Gly Asp Val 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 9 Ser Gly Val Tyr Lys Val Ala Tyr Asp Trp Gln His 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 10 Gly Leu His Thr Ser Ala Thr Asn Leu Tyr Leu His 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 11 Val His Trp Asp Phe Arg Gln Trp Trp Gln Pro Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 12 Gly Ser Ala Pro Leu Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys 1 5 10

Claims

삭제
삭제
바이오마커 단백질 LRG1, AHSG 및 TTR 중 적어도 어느 하나를 타깃으로 하는 펩타이드 프로브를 포함하되,
바이오마커 단백질 LRG1에 대한 펩타이드 프로브는 아미노산 서열목록 3(HTSSLWHLFRST)을 포함하는 서열로 구성되고,
바이오마커 단백질 AHSG에 대한 펩타이드 프로브는 아미노산 서열목록 6(AXNXTRXPERHA)을 포함하는 서열로 구성되며,
바이오마커 단백질 TTR에 대한 펩타이드 프로브는 아미노산 서열목록 11(VHWDFRQWWQPS)을 포함하는 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 대장용종과 대장암 조기검출용 바이오칩.
제3항에 있어서,
펩타이드 프로브의 아미노산은 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대장용종과 대장암 조기검출용 바이오칩.
제4항에 있어서,
펩타이드 프로브는 N말단 혹은 C말단에 다양한 기능기를 포함하는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하는 대장용종과 대장암 조기검출용 바이오칩.
제5항에 있어서, 펩타이드 프로브의 N말단 기능기는 free amine, acetylation, biotin 또는 flurophore를 포함하고,
C말단 기능기는 free acid, amidation, biotin, flurophore를 포함하는 것을 특징으로 하는 대장용종과 대장암 조기검출용 바이오칩.
아미노산 서열목록 3(HTSSLWHLFRST), 아미노산 서열목록 6(AXNXTRXPERHA) 및 아미노산 서열목록 11(VHWDFRQWWQPS) 중 적어도 어느 하나를 포함하는 서열로 구성되는 대장용종과 대장암 조기검출용 펩타이드 프로브.