CN102245642A - Glp-1激动剂的结合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明的特征在于一种具有式A-X-B的化合物，其中，A是能够增强化合物转运穿过血脑屏障或进入特定细胞类型的肽载体，X是连接子，而B是GLP-1激动剂(如醋酸艾塞那肽(exendin-4)或醋酸艾塞那肽类似物)。本发明的化合物能够用于治疗其中需要提高GLP-1活性的任何疾病，例如代谢病，如肥胖症和糖尿病。

Description

GLP-1激动剂的结合物及其用途
技术领域
本发明涉及包含结合至肽载体的GLP-1激动剂(如醋酸艾塞那肽(exendin-4))的化合物及其用途。这种用途包括治疗、预防和减少包括糖尿病和肥胖症的代谢紊乱(代谢异常，metabolic disorders)。
背景技术
由于血糖水平在餐后升高，会分泌胰岛素并刺激周围组织(骨骼肌和脂肪)的细胞主动从血液摄取葡萄糖作为能量源。由于不良胰岛素分泌或作用所致的葡萄糖动态平衡失调典型地导致代谢紊乱如糖尿病，其可以由肥胖症协同促发或进一步恶化。由于这些病症常常是致命的，因而需要重塑从血流中充分清除血糖的策略。
尽管糖尿病可能继发于任何造成胰腺广泛受损的病症(如胰腺炎、肿瘤、某些药物如皮质类固醇或戊双脒的给予、铁过载(如血色素沉积症)、获得性或遗传性内分泌病和手术切除)，但是最常见的糖尿病形式典型地源于胰岛素信号系统的原发性紊乱。现有两种主要的糖尿病类型，即1型糖尿病(也称为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和2型糖尿病(也称为胰岛素非依赖型或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM))，尽管它们的发病机理不同，却都伴随着常见的长期并发症。
1型糖尿病，占所有原发性糖尿病病例的约10％，是一种器官特异性的自身免疫性疾病，特征在于胰腺中产生胰岛素的β细胞广泛受损。由此胰岛素的产生减少，不可避免地导致葡萄糖代谢失调。尽管给予胰岛素为患有该病症的患者提供显著的益处，但胰岛素较短的血清半衰期是维持正常血糖量的主要障碍。可替换的治疗方法是胰岛移植，但是这种策略成功有限。
2型糖尿病，影响着更多的人群，特征在于胰岛素分泌失调和/或周围组织对胰岛素响应降低，即胰岛素抗性。尽管2型糖尿病的病理仍不清楚，但是流行病学研究表明，这种形式的糖尿病是由多遗传缺陷或多态性的综合作用所致，它们各自有助于其自身的易患病风险并通过环境因素而改变，包括超重、饮食、少动、药物和过度饮酒。尽管各种治疗性治疗可用于应对2型糖尿病，但它们都伴随有各种衰弱性副作用。因此，诊断患有2型糖尿病或具有患2型糖尿病风险的患者经常被建议采取更健康的生活方式，包括减肥、改变饮食、锻炼、和适量饮酒。然而，这种生活方式的改变不足以逆转由糖尿病所致的脉管和器官受损。
由于当前可用于应对代谢紊乱如糖尿病的策略并不理想，因而迫切需要更有效的、且不伴随发生此类衰弱性副作用的治疗。
发明内容
我们已经开发出包含GLP-1激动剂(如醋酸艾塞那肽(exendin-4))和肽载体的化合物。这些化合物适用于治疗代谢紊乱如糖尿病和肥胖症。这种肽载体能够将GLP-1激动剂转运穿过血脑屏障(BBB)或进入特定细胞类型(如肝、肺、肾、脾和肌肉)。由于结合物靶向为穿过BBB或到达特定细胞类型，因而与未结合的GLP-1激动剂相比可采用较低剂量或以较小频率给药来实现治疗有效性，由此降低了副作用的严重程度或发生率和/或提高疗效。结合物也可表现为稳定性提高、药代动力学改善或体内降解降低。
因此，在第一方面，本发明的特征在于具有下式的化合物：
A-X-B
其中，A是能够被转运穿过血脑屏障(BBB)或进入特定细胞类型(如肝、肺、肾、脾和肌肉)的肽载体，X是连接子(linker)，而B是GLP-1激动剂(如本文中描述的任何激动剂如肽激动剂)。转运穿过BBB或进入细胞，可以提高至少10％、25％、50％、75％、100％、200％、500％、750％、1000％、1500％、2000％、5000％或10,000％。该化合物可以是基本上纯的。该化合物可以与药用载体一起配制(如本文中所述的任何载体)。
在另一方面，本发明的特征在于制备化合物A-X-B的方法。在一个实施方式中，该方法包括将肽载体(A)结合至连接子(X)，并将所述肽载体-连接子(A-X)结合至GLP-1激动剂(B)，由此形成化合物A-X-B。在另一实施方式中，该方法包括将GLP-1激动剂(B)结合至连接子(X)，并将GLP-1激动剂/连接子(X-B)结合至肽载体(A)，由此形成化合物A-X-B。在另一实施方式中，该方法包括将肽载体(A)结合至GLP-1激动剂(B)，其中A或B可选地包含连接子(X)，以形成化合物A-X-B。
在另一方面，本发明的特征在于一种编码化合物A-X-B的核酸分子，其中该化合物是多肽。核酸分子可以可操作地连接于启动子并可以是核酸载体的一部分。该载体可以处于细胞中，例如原核细胞(如细菌细胞)或真核细胞(如酵母或哺乳动物细胞，如人细胞)。
在另一方面，本发明的特征在于一种制备式A-X-B的化合物的方法，其中A-X-B是多肽。在一个实施方式中，该方法包括在细胞中表达以上方面的核酸载体以产生多肽；以及纯化该多肽。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗(如预防性治疗)患有代谢紊乱的主体的方法。所述方法包括以足以治疗所述紊乱的量给予所述第一方面的化合物。所述代谢紊乱可以是糖尿病(如I型或II型)、肥胖症、由肥胖症所致的糖尿病、高血糖症、血脂异常症、高甘油三酯血症、X综合症、胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低(葡萄糖耐受不良，IGT)、糖尿病性血脂异常症、高血脂症、心血管疾病或高血压。
在另一方面，本发明的特征在于一种减少主体食物摄取或减小主体体重的方法。所述方法包括以足以减少食物摄取或减小体重的量给予主体所述第一方面的化合物。所述主体可能体重超重、肥胖、或食欲过盛。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗(如预防性治疗)选自焦虑症、运动障碍、敌对行为(攻击行为，aggression)、精神病、抽搐(发作，seizures)、惊恐发作、癔病、睡眠障碍、阿茨海默氏病和帕金森病构成的组中的紊乱的方法。所述方法包括以足以治疗或预防紊乱的量向主体给予所述第一方面的化合物。
本发明的特征还在于一种提高主体中神经发生的方法。所述方法包括向主体给予所述第一方面的化合物。所述主体可能要求、或可能需要神经发生。在某些实施方式中，所述主体可能患有中枢神经系统的疾病或紊乱如帕金森病、阿茨海默氏病、亨廷顿舞蹈症(Huntington’s Disease)、ALS、中风、ADD和神经精神综合症(neuropsychiatric syndromes)。在其他实施方式中，神经发生的提高能够改善学习或增强神经保护。
在另一方面，本发明的特征在于一种通过给予有效量的GLP-1激动剂用于在主体中将肝干细胞/祖细胞转化成功能性胰腺细胞；预防β-细胞退化和刺激β-细胞增殖；治疗肥胖症；抑制食欲并引起饱腹感(饱足，satiety)；治疗肠易激综合症；降低与心肌梗塞和中风相关的发病率和/或死亡率；治疗特征为无Q-波性心肌梗塞的急性冠脉综合症；减少术后代谢变化；治疗冬眠心肌(hibernating infarction)或糖尿病性心肌病；抑制去甲肾上腺素的血浆血液水平；提高尿钠排泄；降低尿钾浓度；治疗毒性血量增多(toxic hypervolemia)相关的病症或紊乱，如肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合症、肝硬化、肺水肿和高血压；诱发肌力反应(inotropicresponse)和增强心肌收缩；治疗多囊卵巢综合征；治疗呼吸窘迫；改善经由非消化道的营养作用，即经由静脉、皮下、肌肉内、腹膜内或其他注射或输注；治疗肾病；治疗左心室收缩功能不全(如具有异常左心室射血分数)；抑制胃肠(antro-duodenal)运动(例如用于消化道紊乱如腹泻、术后倾倒综合症和肠易激综合症的治疗或预防，及作为内视镜程序的术前用药；治疗危重病性多发性神经病(critical illness polyneiropathy，CIPN)和全身炎症反应综合症(SIRS)；调节甘油三酯水平和治疗血脂异常症；治疗缺血后血流再灌注所致的器官组织损伤；或治疗冠心病风险因素(coronary heart disease risk factor，CHDRF)综合症的方法。
在另一方面，本发明的特征在于一种提高主体中GLP-1受体活性的方法。所述方法包括以足以提高GLP-1受体活性的量向主体给予所述第一方面的化合物。所述方法可以降低主体中的葡萄糖水平。
在任何涉及向主体给予化合物的方法中，足够的量可小于未结合至肽载体时GLP-1的相当剂量(equivalent dose)所需量的90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、或0.1％。相比于未结合至肽载体时给予有效量的GLP-1激动剂，该足够的量可以减少副作用(如呕吐、恶心、或腹泻)。所述主体可以是哺乳动物，如人。
在以上任何方面中，所述肽载体可以是基本上同一于表1所列任何序列的多肽、或其片段。在某些实施方式中，所述载体多肽具有血管肽(Angiopep)-1(SEQ ID NO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)、血管肽-3(SEQ ID NO：107)、血管肽-4a(SEQ ID NO：108)、血管肽-4b(SEQ IDNO：109)、血管肽-5(SEQ ID NO：110)、血管肽-6(SEQ ID NO：111)、或血管肽-7(SEQ ID NO：112))的序列。所述肽载体或结合物可以被有效转运进入特定细胞类型(如肝、肺、肾、脾和肌肉中的任何一种、两种、三种、四种或五种)或可以有效穿过哺乳动物BBB(如血管肽-1、-2、-3、-4a、-4b、-5和-6)。在另一实施方式中，所述肽载体或结合物能够进入特定细胞类型(如肝、肺、肾、脾和肌肉中的任何一种、两种、三种、四种或五种)但是不能有效穿过BBB(如包括血管肽-7的结合物)。所述肽载体可以是任何长度，如至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、75、100、200、或500个氨基酸，或这些数之间的任何范围。在某些实施方式中，所述肽载体长度为10～50个氨基酸。所述多肽可以通过重组遗传技术或化学合成进行生产。
表1：示例性多肽
Figure BDA0000068259820000061
Figure BDA0000068259820000071
Figure BDA0000068259820000081
Figure BDA0000068259820000091
多肽No.5、67、76和91分别包括SEQ ID NO：5、67、76和91的序列，并在C-端酰胺化。
多肽No.107、109和110分别包括SEQ ID NO：97、109和110的序列，并在N-端乙酰化。
在以上任何方面中，所述肽载体可以包含具有下式的氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19
其中X1-X19各自(如X1-X6、X8、X9、X11-X14和X16-X19)独立地是任何氨基酸(如天然存在的氨基酸如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)或不存在，而X1、X10和X15中的至少一个(如2或3个)是精氨酸。在一些实施方式中，X7是Ser或Cys；或X10和X15各自独立地是Arg或Lys。在一些实施方式中，X1至X19(包括X1和X19)的残基，基本上同一于SEQ ID NO：1-105和107-116中任一个的任何氨基酸序列(如血管肽-1、血管肽-2、血管肽-3、血管肽-4a、血管肽-4b、血管肽-5、血管肽-6和血管肽-7)。在一些实施方式中，氨基酸X1-X19中至少一个(如2、3、4或5个)是Arg。在一些实施方式中，所述多肽在该多肽的N-端、该多肽的C-端、或两端具有一个或多个另外的半胱氨酸残基。
在以上任何方面中，所述GLP-1激动剂可以是肽激动剂。GLP-1激动剂可以是GLP-1、醋酸艾塞那肽(Exendin-4)、艾塞那肽(Exendin-3)或其类似物或片段(如本文中描述的任何类似物或片段)。在具体实施方式中，所述GLP-1激动剂是选自[Lys39]醋酸艾塞那肽和[Cys32]醋酸艾塞那肽构成的组中的醋酸艾塞那肽类似物。
在以上任何方面的某些实施方式中，所述肽载体或肽GLP-1激动剂是经修饰的(如本文中的描述)。所述多肽可进行酰胺化、乙酰化、或同时进行酰胺化和乙酰化。这种多肽修饰可以在多肽的氨基端或羧基端进行。所述多肽也可以包括本文中描述的任何多肽的肽模拟物(如本文中描述的那些)。所述多肽可以是多聚体形式，如二聚体形式(如通过经由半胱氨酸残基的二硫化物结合而形成)。
在某些实施方式中，所述多肽包含具有至少一个氨基酸替换(替代，substitution)(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个替换)、插入或缺失的本文中所述的氨基酸序列。所述多肽可以包含例如1～12、1～10、1～5、或1～3个氨基酸替换，如1至10(如至9、8、7、6、5、4、3、2)个氨基酸替换。所述氨基酸替换可以是保守性或非保守性替换。如所述肽载体可以在对应于任何SEQ ID NO：1、血管肽-1、血管肽-2、血管肽-3、血管肽-4a、血管肽-4b、血管肽-5、血管肽-6和血管肽-7的氨基酸序列的位置1、10和15的1个、2个或3个位置上具有精氨酸。所述GLP-1激动剂可以在任何位置具有半胱氨酸或赖氨酸替换或添加(如在N-端或C-端位置的赖氨酸替换、或在对应于醋酸艾塞那肽序列的氨基酸32的位置处的半胱氨酸替换)。
在以上任何方面中，所述化合物可以具体排除包括任何SEQ ID NO：1-105和107-116(如血管肽-1、血管肽-2、血管肽-3、血管肽-4a、血管肽-4b、血管肽-5、血管肽-6和血管肽-7)的多肽或由其构成的多肽。在一些实施方式中，本发明的所述多肽和结合物排除SEQ ID NO：102、103、104和105的多肽。
在以上任何方面中，所述连接子(X)可以是本领域已知的或本文中所述的任何连接子。在具体实施方式中，所述连接子是共价键(如肽键)、化学连接剂(如本文中描述的那些)、氨基酸或肽(如2、3、4、5、8、10或更多个氨基酸)。在某些实施方式中，所述连接子具有下式：
Figure BDA0000068259820000111
其中，n是2～15的整数(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15)；要么Y是A上的硫醇基(thiol)而Z是B上的伯胺基(primary amine)、要么Y是B上的硫醇基而Z是A上的伯胺基(primaryamino)。
“GLP-1激动剂”是指能够活化GLP-1受体(如哺乳动物或人GLP-1受体)的任何化合物。激动剂可包括肽或小分子化合物(如任何如本文中描述的那些)。确定具体化合物是否为GLP-1激动剂的分析在本领域内是已知的，且在本文中描述。
“肽载体”是指能够被转运进入特定细胞类型(如肝、肺、肾、脾或肌肉)或穿过BBB的化合物或分子如多肽或多肽模拟物。载体可以连接至(共价或非共价)或结合至试剂(如GPL-1激动剂)而由此能够将该试剂转运到特定细胞类型或穿过BBB。在某些实施方式中，载体可以结合至癌细胞或脑内皮细胞上存在的受体而由此通过胞转作用(transcytosis)而被转运进入癌细胞或穿过BBB。载体可以是因此可获得高水平跨内皮转运而不会影响该细胞或BBB完整性的分子。这种载体可以是多肽或肽模拟物且可以是天然存在的或通过化学合成或重组遗传技术生产。
“基本上同一”是指表现为与参照氨基酸或核酸序列具有至少35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、95％、或甚至99％同一性的多肽或核酸。对于多肽，比对序列的长度将一般为至少4(如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、或100)个氨基酸。对于核酸，比对序列的长度将一般为至少60个核苷酸，优选至少90个核苷酸，而更优选至少120个核苷酸，或全长。在本文中应该理解到，在同一或类似于原始多肽氨基酸的类似物的氨基酸之间可以发现间隙(空缺，gaps)。这种间隙可以包括没有氨基酸、一个或多个与原始多肽不同一或类似的氨基酸。本发明的载体(多肽)的生物活性类似物都涵盖其中。同一性百分数可以例如采用Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0中的n算法GAP、BESTFIT、或FASTA利用缺省间隙重量(gap weights)进行确定。
“治疗”主体中疾病、紊乱或病症是指通过向该主体给予治疗剂而缓解该疾病、紊乱或病症的至少一种症状。
“预防性治疗”主体中的疾病、紊乱或病症是指通过向该主体给予治疗剂而降低(如预防)疾病、紊乱或病症的发生率或降低疾病、紊乱或病症的严重程度。
因为代谢紊乱而受治疗的主体是已经由从业医师诊断为患有这种病症的主体。诊断可以通过任何合适的方式，如本文中描述的那些进行实施。正在预防糖尿病或肥胖症发展的主体可以接受或不接受这种诊断。本领域技术人员将会理解到，本发明的主体可能已经经受标准测试或可能无需检测已证实为具有高风险，因为存在一种或多种风险因素，如家族病史、肥胖症、特殊种族(例如非裔美国人和西班牙裔美国人)、妊娠期糖尿病或生产的孩子体重超过9磅、高血压、患有易感肥胖症或糖尿病的病理学病症、高血液水平甘油三酯、高血液水平胆固醇、存在分子标记(例如存在自身抗体)和年龄(超过45岁)。当个体体重超过其身高所需的最大体重20％(女性为25％)或更高时就认为其肥胖。体重超重100磅的成年，被认为是病态肥胖。肥胖症也定义为身体质量指数(BMI)超过30kg/m2。
“代谢紊乱”是指任何由主体中的代谢改变所致的病理学病症。这种紊乱包括由葡萄糖动态平衡改变而导致的那些病症，如高血糖症。根据本发明，葡萄糖水平改变典型地是葡萄糖水平相对于健康个体内的这种水平而升高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或甚至100％。代谢紊乱包括肥胖症和糖尿病(如I型糖尿病、II型糖尿病、MODY、和妊娠期糖尿病)、饱腹感(satiety)和老龄化内分泌不足(endocrine deficiencies of aging)。
“降低葡萄糖水平”是指相对于未治疗的对照而降低葡萄糖水平至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％。理想地，葡萄糖水平降低至正常血糖水平，即，150～60mg/dL、140～70mg/dL、130～70mg/dL、125～80mg/dL、而优选120～80mg/dL。这种葡萄糖水平的降低可以通过提高任何一种与血液葡萄糖的清除相关的生物活性(如提高胰岛素生产、分泌或作用)而获得。
“主体”是指人或非人动物(如哺乳动物)。
“提高GLP-1受体活性”是指相比于未治疗的对照而提高采用标准技术测定的受体活化(如cAMP活化)水平，如至少％、20％、50％、75％、100％、200％、或500％。
“相当剂量”是指相比于未结合的GLP-1激动剂，实现化合物中相同摩尔量的GLP-1激动剂所需的本发明化合物的量。例如，1.0μg醋酸艾塞那肽的相当剂量是约1.6μg本文中描述的[Lys39-MHA]醋酸艾塞那肽/血管肽-2-Cys-NH2结合物。
“有效转运穿过BBB”的多肽是指能够至少与血管肽-6一样有效地穿过BBB(即，在2007年5月29日提交的美国专利申请No.11/807,597中描述的原位脑灌注分析中的超过38.5％的血管肽-1(250nM)，其结合于本文中作为参考)的多肽。因此，“未有效转运穿过BBB”的多肽则是以较低水平转运到大脑中(如转运效率低于血管肽-6)。
“有效转运至特定细胞类型”的多肽或化合物是指能够在那种细胞类型中累积(例如，要么是由于进入细胞的转运提高、从细胞的流出减少、要么由于它们的组合)至超过对照物质(或者在结合物的情况下相比于未结合试剂)至少10％(如25％、50％、100％、200％、500％、1,000％、5,000％、或10,000％)程度的多肽或化合物。这种活性详细描述于国际申请公开No.WO 2007/009229中，其结合于本文中作为参考。
本发明的其它特点和优点由以下详细描述、附图和权利要求将会显而易见。
附图说明
图1是示出本文中所述实验中所用的醋酸艾塞那肽和醋酸艾塞那肽类似物的表格和示意图。
图2是用于将Cys-血管肽2、血管肽-2-Cys-NH2和血管肽-1结合至[Lys39-MHA]醋酸艾塞那肽的合成图解的示意图。
图3是用于将[Cys32]醋酸艾塞那肽结合至(马来酰亚胺基丙酸(MPA))-血管肽-2、(马来酰亚胺基己酸(MHA))-血管肽-2和(马来酰亚胺基十一酸(MUA))-血管肽-2的合成图解的示意图。
图4是示出转运醋酸艾塞那肽(左)和醋酸艾塞那肽/血管肽-2(N-端，中心；C-端，右)穿过BBB的示图。示出了在大脑中的总量，连同在毛细血管和实质中的量。
图5是示出给予对照、醋酸艾塞那肽或[Lys39-MHA]醋酸艾塞那肽/血管肽-2-Cys-NH2结合物(Exen-An2)后(ob/ob)小鼠体重升高的示图。醋酸艾塞那肽和Ex-An2二者都观察到相比于接受对照的动物的增重减小。
图6是示出给予小鼠对照、醋酸艾塞那肽、或Exen-An2的情况下(ob/ob)小鼠总食物消耗的示图。醋酸艾塞那肽和Ex-An2二者都观察到相比于接受对照的动物食物摄取减少。
图7是示出给予两剂量的醋酸艾塞那肽(3μg/kg和30μg/kg)和相当剂量的Exen-An2(4.8μg/kg和48μg/kg)之后血糖降低的示图。以较低剂量的Exen-An2，相比于较高剂量的醋酸艾塞那肽，观察到血糖的类似降低。在该实验期间，对照组中一只小鼠在12天时死亡。
图8A是示出醋酸艾塞那肽-血管肽-2二聚体结合物(Ex4(Lys39(MHA))-AN2-AN2)结构的示意图。该化合物具有以下结构
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPK(MHA)-TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC-(MPA)-TFFYGGSRGKRNNFKTEEY-OH，其中MHA是马来酰亚胺基己酸而MPA是马来酰亚胺基丙酸。
图8B是用作对照的醋酸艾塞那肽-混杂(不规则，scramble)-血管肽-2(Ex4(Cys32)-ANS4(N-Term)或Exen-S4)的示意性结构。这种化合物具有以下结构
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPCSGAPPPS-(MHA)-GYKGERYRGFKETNFNTFS-OH，其中MHA是马来酰亚胺基己酸。
图9是从左至右示出醋酸艾塞那肽；醋酸艾塞那肽-血管肽-2结合物C3、C6和C11；Exen-S4；和当结合于血管肽-2二聚体形式时的醋酸艾塞那肽的穿过BBB的能力的示图。
图10是示出醋酸艾塞那肽和Exen-An2-An2降低小鼠中血糖的能力的示图。
具体实施方式
我们采用示例性的GLP-1激动剂醋酸艾塞那肽和醋酸艾塞那肽类似物已经开发出具有增强的穿过血脑屏障(BBB)或进入特定细胞类型(如肝、肺、肾、脾和肌肉)的能力的GLP-1激动剂/肽结合物。本发明的肽结合物可包括GLP-1激动剂和增强转运穿过BBB的肽载体。
我们也已经证明，相比于未结合的GLP-1激动剂，较低剂量的本发明的化合物能有效治疗GLP-1相关的紊乱，包括血糖降低。通过给予较低剂量的结合肽，采用未结合激动剂观察到的副作用如呕吐、恶心和腹泻能够被减少或消除。可替换地，在较高剂量下可以获得提高的疗效。
GLP-1激动剂可以是本领域内已知的包括诸如以下所述肽的任何GLP-1激动剂。具体的GLP-1激动剂包括醋酸艾塞那肽(exendin-4)、GLP-1和艾塞那肽(exendin-3)片段、替换物(如保守或非保守替换物、或非-天然存在的氨基酸的替换物)、和这些氨基酸序列的化学修饰物(如本文中描述的那些)。以下详细描述具体的GLP-1激动剂。
GLP-1激动剂
本发明的结合物可包括本领域内已知的任何GLP-1激动剂。具体的GLP-1激动剂包括GLP-1、醋酸艾塞那肽、及其类似物。以下将进行描述示例性的类似物。
醋酸艾塞那肽和醋酸艾塞那肽类似物
醋酸艾塞那肽和醋酸艾塞那肽类似物也可应用于本发明的组合物、方法和试剂盒中。本发明的所述化合物可包括醋酸艾塞那肽序列的片段。醋酸艾塞那肽具有以下序列。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
具体的醋酸艾塞那肽类似物包括具有半胱氨酸替换(如[Cys32]醋酸艾塞那肽)或赖氨酸替换(如[Lys39]醋酸艾塞那肽)的那些。
醋酸艾塞那肽类似物也描述于美国专利No.7,157,555中且包括下式的那些类似物：
X1-X2-X3-Gly-Thr-X4-X5-X6-X7-X8-Ser-Lys-Gln-X9-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-X10-X11-X12-X13-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-X14-Ser-Ser-Gly-Ala-X15-X16-X17-X18-Z
其中，X1是His、Arg或Tyr；X2是Ser、Gly、Ala或Thr；X3是Asp或Glu；X4是Phe、Tyr或Nal；X5是Thr或Ser；X6是Ser或Thr；X7是Asp或Glu；X8是Leu、Ile、Val、pGly或Met；X9是Leu、Ile、pGly、Val或Met；X10是Phe、Tyr或Nal；X11是Ile、Val、Leu、pGly、t-BuG或Met；X12是Glu或Asp；X13是Trp、Phe、Tyr或Nal；X14、X15、X16和X17独立地是Pro、HPro、3Hyp、4Hyp、TPro、N-烷基甘氨酸、N-烷基-pGly、或N-烷基丙氨酸；X18是Ser、Thr、或Tyr；而Z是-OH或-NH2(例如，条件是该化合物不是艾塞那肽或醋酸艾塞那肽)。
N-烷基甘氨酸、N-烷基-pGly和N-烷基丙氨酸所优选的N-烷基基团包括低级烷基基团(如C1-6烷基或C1-4烷基)。
在某些实施方式中，X1是His或Tyr(如His)。X2可以是Gly。X9可以是Leu、pGly、或Met。X13可以是Trp或Phe。X4可以是Phe或Nal；X11可以是Ile或Val、而X14、X15、X16和X17可独立地选自Pro、HPro、TPro、或N-烷基丙氨酸(例如，其中N-烷基丙氨酸具有1至约6个碳原子的N-烷基基团)。在一个方面中、X15、X16和X17是相同的氨基酸残基。X18可以是Ser或Tyr(如Ser)。Z可以是-NH2。
在其他实施方式中，X1是His或Tyr(如His)；X2是Gly；X4是Phe或Nal；X9是Leu、pGly、或Met；X10是Phe或Nal；X11是Ile或Val；X14、X15、X16和X17独立地选自Pro、HPro、TPro或N-烷基丙氨酸；而X18是Ser或Tyr，(如Ser)。Z可以是-NH2。
在其他实施方式中，X1是His或Arg；X2是Gly；X3是Asp或Glu；X4是Phe或萘基丙氨酸；X5是Thr或Ser；X6是Ser或Thr；X7是Asp或Glu；X8是Leu或pGly；X9是Leu或pGly；X10是Phe或Nal；X11是Ile、Val、或叔丁基甘氨酸(butyltylglycine)；X12是Glu或Asp；X13是Trp或Phe；X14、X15、X16和X17独立地是Pro、HPro、TPro、或N-甲基丙氨酸；X18是Ser或Tyr；而Z是-OH或-NH2(例如，其中该化合物不是艾塞那肽或醋酸艾塞那肽)。Z可以是-NH2。
在另一实施方式中，X9是Leu、Ile、Val、或pGly(如Leu或pGly)而X13是Phe、Tyr、或Nal(如Phe或Nal)。这些化合物在体内和体外，以及在化合物合成期间，都可表现出有利的作用持久性和较少经受氧化降解。
其它醋酸艾塞那肽类似物也描述于美国专利No.7,157,555和7,223,725，包括下式的那些化合物：
X1-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-Z1
其中X1是His、Arg、或Tyr；X2是Ser、Gly、Ala、或Thr；X3是Asp或Glu；X5是Ala或Thr；X6是Ala、Phe、Tyr、或Nal；X7是Thr或Ser；X8是Ala、Ser、或Thr；X9是Asp或Glu；X10是Ala、Leu、Ile、Val、pGly、或Met；X11是Ala或Ser；X12是Ala或Lys；X13是Ala或Gln；X14是Ala、Leu、Ile、pGly、Val、或Met；X15是Ala或Glu；X16是Ala或Glu；X17是Ala或Glu；X19是Ala或Val；X20是Ala或Arg；X21是Ala或Leu；X22是Phe、Tyr、或Nal；X23是Ile、Val、Leu、pGly、t-BuG、或Met；X24是Ala、Glu、或Asp；X25是Ala、Trp、Phe、Tyr、或Nal；X26是Ala或Leu；X27是Ala或Lys；X28是Ala或Asn；Z1是-OH、-NH2、Gly-Z2、Gly-Gly-Z2、Gly-Gly-X31-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-X37-Z2或Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-X37-X38-Z2；X31、X36、X37和X38独立地是Pro、HPro、3Hyp、4Hyp、TPro、N-烷基甘氨酸、N-烷基-pGly或N-烷基丙氨酸；而Z2是-OH或-NH2(例如，条件是X5、X6、X8、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X19、X20、X21、X24、X25、X26、X27和X28中不多于三个是Ala)。N-烷基甘氨酸、N-烷基-pGly和N-烷基丙氨酸所优选的N-烷基基团包括1至约6个碳原子(如1至4个碳原子)的低级烷基基团。
在某些实施方式中，X1是His或Tyr(如His)。X2可以是Gly。X14可以是Leu、pGly或Met。X25可以是Trp或Phe。在一些实施方式中，X6是Phe或Nal，X22是Phe或Nal，而X23是Ile或Val。X31、X36、X37和X38可独立地选自Pro、HPro、Tpro和N-烷基丙氨酸。在某些实施方式中，Z1是-NH2或Z2是-NH2。
在另一实施方式中，X1是His或Tyr(如His)；X2是Gly；X6是Phe或Nal；X14是Leu、pGly或Met；X22是Phe或Nal；X23是Ile或Val；X31、X36、X37和X38独立地选自Pro、HPro、TPro、或N-烷基丙氨酸。在具体实施方式中，Z1是-NH2。
在另一实施方式中，X1是His或Arg；X2是Gly或Ala；X3是Asp或Glu；X5是Ala或Thr；X6是Ala、Phe、或萘基丙氨酸；X7是Thr或Ser；X8是Ala、Ser或Thr；X9是Asp或Glu；X10是Ala、Leu、或pGly；X11是Ala或Ser；X12是Ala或Lys；X13是Ala或Gln；X14是Ala、Leu、或pGly；X15是Ala或Glu；X16是Ala或Glu；X17是Ala或Glu；X19是Ala或Val；X20是Ala或Arg；X21是Ala或Leu；X22是Phe或Nal；X23是Ile、Val或t-BuG；X24是Ala、Glu或Asp；X25是Ala、Trp或Phe；X26是Ala或Leu；X27是Ala或Lys；X28是Ala或Asn；Z1是-OH、-NH2、Gly-Z2、Gly-Gly-Z2、Gly-Gly-X31-Z2、Gly-Gly X31-Ser-Z2、Gly-Gly-X31Ser-Ser-Z2、Gly-Gly-X31 Ser-Ser-Gly-Z2、Gly-Gly-X31 Ser-Ser-Gly Ala-Z2、Gly-Gly-X31 Ser-Ser-Gly-Ala-X36-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-X37-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X36-X37-X38-Z2；X31、X36、X37和X38独立地是Pro HPro、TPro或N-甲基丙氨酸；而Z2是-OH或-NH2(例如，条件是X3、X5、X6、X8、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X19、X20、X21、X24、X25、X26、X27和X28中不超过3个是Ala)。
在还有的另一实施方式中，X14是Leu、Ile、Val或pGly(如Leu或pGly)，而X25是Phe、Tyr或Nal(如Phe或Nal)。
描述于美国专利No.7,220,721中的醋酸艾塞那肽类似物包括下式的化合物：
X1-X2-X3-X4-X-5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-Z1
其中，X1是His、Arg、Tyr、Ala、Norval、Val、或Norleu；X2是Ser、Gly、Ala、或Thr；X3是Ala、Asp、或Glu；X4是Ala、Norval、Val、Norleu、或Gly；X5是Ala或Thr；X6是Phe、Tyr或Nal；X7是Thr或Ser；X8是Ala、Ser或Thr；X9是Ala、Norval、Val、Norleu、Asp、或Glu；X10是Ala、Leu、Ile、Val、pGly、或Met；X11是Ala或Ser；X12是Ala或Lys；X13是Ala或Gln；X14是Ala、Leu、Ile、pGly、Val、或Met；X15是Ala或Glu；X16是Ala或Glu；X17是Ala或Glu；X19是Ala或Val；X20是Ala或Arg；X21是Ala或Leu；X22是Phe、Tyr、或Nal；X23是Ile、Val、Leu、pGly、t-BuG、或Met；X24是Ala、Glu、或Asp；X25是Ala、Trp、Phe、Tyr、或Nal；X26是Ala或Leu；X27是Ala或Lys；X28是Ala或Asn；Z1是-OH、-NH2、Gly-Z2、Gly-Gly-Z2、Gly-Gly-X31-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Z2、Gly-Gly-X31Ser-Ser-Gly-Ala-Z2、Gly-Gly-X31-Ser-Ser-Gly-Ala-X13-Z2、Gly-Gly-X31Ser-Ser-Gly-Ala-X36-X37-Z2、Gly-Gly X31Ser Ser Gly Ala X36X37X31-Z2或Gly Gly X31Ser Ser Gly Ala X36X37X38X39-Z2；其中X31、X36、X37和X38独立地是Pro、HPro、3Hyp、4Hyp、TPro、N-烷基甘氨酸、N-烷基-pGly、或N-烷基丙氨酸；而Z2是-OH或-NH2(例如，条件是X3、X4、X5、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X19、X20、X21、X24、X25、X26、X27和X28中不超过3个是Ala，和/或还有的条件是，如果X1是His、Arg、或Tyr，则X3、X4和X9至少一个是Ala)。
醋酸艾塞那肽类似物的具体实例包括醋酸艾塞那肽(1-30)、醋酸艾塞那肽(1-30)酰胺、醋酸艾塞那肽(1-28)酰胺、[Leu14，Phe25]醋酸艾塞那肽酰胺、[Leu14，Phe25]醋酸艾塞那肽(1-28)酰胺、和[Leu14，Ala22，Phe25]醋酸艾塞那肽(1-28)酰胺。
美国专利No.7,329,646描述了具有以下通式的醋酸艾塞那肽类似物：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-X20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-X40.
其中，X14是Arg、Leu、Ile、或Met；X20是His、Arg、或Lys；X40是Arg-OH、-OH、-NH2或Lys-OH。在某些实施方式中，当X14是Met而X20是Arg时，X40不能是-NH2。其它醋酸艾塞那肽衍生物包括[(Ile/Leu/Met)14，(His/Lys)20，Arg40]醋酸艾塞那肽；[(非Lys/非Arg)12，(非Lys/非Arg)20，(非Lys/非Arg)27，Arg40]醋酸艾塞那肽；以及[(非Lys/非Arg)20，Arg40]醋酸艾塞那肽。具体的醋酸艾塞那肽类似物包括[Lys20，Arg40]醋酸艾塞那肽、[His20，Arg40]醋酸艾塞那肽；和[Leu14，Lys20，Arg40]醋酸艾塞那肽。
本发明也可以采用本文中描述的醋酸艾塞那肽或任何醋酸艾塞那肽类似物的截短形式。截短形式可以包括从N端、从C-端或其组合缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。具体的醋酸艾塞那肽片段包括醋酸艾塞那肽(1-31)。醋酸艾塞那肽的其它片段描述于美国专利申请公开No.2007/0037747中并具有下式：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-X6-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-X20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-X30-Pro-X32
其中，X6是Phe或Tyr，X14是Met、He或Leu，X20是Lys；X30是Gly或不存在；X32是Arg或不存在。
GLP-1和GLP-1类似物
在本发明的组合物、方法和试剂盒中使用的GLP-1激动剂可以是GLP-1或GLP-1类似物。在某些实施方式中，GLP-1类似物是肽，其可以是截短的，可以具有一个或多个野生型序列的替换(如人野生型序列)，或可以具有其它化学修饰。GLP-1激动剂也可以是非-肽化合物，如描述于美国专利No.6,927,214中。具体的类似物包括LY548806、CJC-1131和利拉糖肽(Liraglutide)。
GLP-1类似物可以是GLP-1的截短形式。GLP-1肽可以从其N-端、其C-端或其组合被截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、20、或更多个残基。在某些实施方式中，截短的GLP-1类似物是GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、或GLP-1(7-37)人肽或其C-端酰胺化形式。
在本发明的其他实施方式中，使用截短GLP-1肽的修饰形式。示例性类似物描述于美国专利No.5,545,618并具有以下氨基酸序列：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-(Gly)-(Arg)-(Gly)
其中，取决于所示链长度，(Gly)、(Arg)和(Gly)存在或不存在，具有至少一个选自以下构成的组中的修饰：(a)中性氨基酸Arg、或Lys的D形式替换在位置26和/或34的Lys和/或中性氨基酸Lys、或Arg的D形式替换在位置36的Arg；(b)抗氧化性的氨基酸替换在位置31的Trp；(c)依据以下至少之一的替换：Tyr替换在位置16的Val；Lys替换在位置18的Ser；Asp替换在位置21的Glu；Ser替换在位置22的Gly；Arg替换在位置23的Gln；Arg替换在位置24的Ala；以及Gln替换在位置26的Lys；(d)包括以下之一的替换：可替换的(alternative)小中性氨基酸替换在位置8的Ala；可替换的酸性氨基酸或中性氨基酸替换在位置9的Glu；可替换的中性氨基酸替换在位置10的Gly；以及可替换的酸性氨基酸替换在位置15的Asp；以及(e)可替换的中性氨基酸或Asp或His的N-乙酰化或烷基化形式替换在位置7的His。至于修饰(a)、(b)、(d)和(e)，替换的氨基酸可以是D形式。位置7替换的氨基酸也可以是N-酰基化或N-烷基化的氨基酸。示例性GLP-1类似物包括[D-His7]GLP-1(7-37)、[Tyr7]GLP-1(7-37)、[N-乙酰基-His7]GLP-1(7-37)、[N-异丙基-His7]GLP-1(7-37)、[D-Ala8]GLP-1(7-37)、[D-Glu9]GLP-1(7-37)、[Asp9]GLP-1(7-37)、[D-Asp9]GLP-1(7-37)、[D-Phe10]GLP-1(7-37)、[Ser22，Arg23，Arg24，Gln26]GLP-1(7-37)和[Ser8，Gln9，Tyr16，Lys18，Asp21]GLP-1(7-37)。
其它GLP-1片段描述于美国专利No.5,574,008中，具有下式：
R1-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X-Gly-Arg-R2
其中，R1是H2N；H2N-Ser；H2N-Val-Ser；H2N-Asp-Val-Ser；H2N-Ser-Asp-Val-Ser    ；H2N-Thr-Ser-Asp-Val-Ser    ；H2N-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser  ；H2N-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser  ；H2N-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser    ；H2N-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser    ；或H2N-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser；X是Lys或Arg；而R2是NH2、OH、Gly-NH2、或Gly-OH。
其它GLP-1类似物，描述于美国专利No.5,118,666，包括序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X，其中X是Lys、Lys-Gly、或Lys-Gly-Arg。
GLP-1类似物也包括下式的肽：H2N-X-CO-R1，其中R1是OH、OM、或-NR2R3；M是药用阳离子或低级支化或未支化的烷基基团(如C1-6烷基)；R2和R3独立地选自氢和低级支化或未支化的烷基基团(如C1-6烷基)构成的组中；X    是包含序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg的肽；NH2是X氨基端的胺基；而CO是X羧基端的羰基；其酸加成盐；和其保护或部分保护的衍生物。这些化合物可以具有超过GLP-1(1-36)或GLP-1(1-37)的促胰岛素活性。
其它GLP-1类似物描述于美国专利No.5,981,488并具有下式：
R1-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R2
其中，R1是His、D-His、脱氨基-His、2-氨基-His、β-羟基-His、高组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-His、或α-甲基-His；X是Met、Asp、Lys、Thr、Leu、Asn、Gln、Phe、Val、或Tyr；Y和Z独立地选自Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；而R2选自NH2和Gly-OH(例如，条件是，如果R1是His，X是Val，Y是Glu，而Z是Glu，则R2是NH2)。
其它GLP-1类似物描述于美国专利No.5,512,549并具有下式：
R1-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(R2)-Gly-Arg-R3
其中R1是4-咪唑并丙酰基(脱氨基-组胺酰基)、4-咪唑并乙酰基、或4-咪唑并-α，α二甲基-乙酰基；R2，结合至Lsy的侧链(如通过ε氨基)，是C6-10未支化酰基或不存在；R3是Gly-OH或NH2；而Xaa是Lys或Arg。
还有的其它GLP-1类似物描述于美国专利No.7,084,243。在一个实施方式中，GLP-1类似物具有下式：
His-X8-Glu-Gly-X11-X12-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-X22-X23-X24-Ala-X26-X27-Phe-Ile-Ala-X31-Leu-X33-X34-X35-X36-R
其中，X8是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、或Thr；X11是Asp、Glu、Arg、Thr、Ala、Lys或His；X12是His、Trp、Phe或Tyr；X16是Leu、Ser、Thr、Trp、His、Phe、Asp、Val、Tyr、Glu或Ala；X22是Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys或Cya；X23是His、Asp、Lys、Glu或Gln；X24是Glu、His、Ala或Lys；X26是Asp、Lys、Glu或His；X27是Ala、Glu、His、Phe、Tyr、Trp、Arg或Lys；X30是Ala、Glu、Asp、Ser或His；X33是Asp、Arg、Val、Lys、Ala、Gly或Glu；X34是Glu、Lys或Asp；X35是Thr、Ser、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Asp、Gly、Pro、His或Glu；X36是Arg、Glu或His；R是Lys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、-NH2、Gly、Gly-Pro或Gly-Pro-NH2、或被缺失(例如，条件是该多肽不具有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列且条件是该多肽不是Gly8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、Val8-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-GLP-1(7-37)OH、Leu8-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-GLP-1(7-37)OH、Ile8-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-GLP-1(7-37)OH、Ser8-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-GLP-1(7-37)OH、或Thr8-GLP-1(7-36)NH2、Ala11-Glp-1(7-37)OH、Ala11-Glp-1(7-36)NH2、Ala16-Glp-1(7-37)OH、Ala16-Glp-1(7-36)NH2、Ala27-Glp-1(7-37)OH、Ala27-Glp-1(7-36)NH2、Ala27-Glp-1(7-37)OH、Ala27-Glp-1(7-36)NH2、Ala33-Glp-1(7-37)OH、或Ala33-GLP-1(7-36)NH2)。
在另一实施方式中，该多肽具有氨基酸序列：
His-X8-Glu-Gly-Thr-X12-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-X22-X23-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-Val-Lys-X35-Arg-R
其中，X8是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、或Thr；X12是His、Trp、Phe或Tyr；X16是Leu、Ser、Thr、Trp、His、Phe、Asp、Val、Glu或Ala；X22是Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys或Cya；X23是His、Asp、Lys、Glu或Gln；X26是Asp、Lys、Glu或His；X30是Ala、Glu、Asp、Ser、或His；X35是Thr、Ser、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Asp、Gly、Pro、His或Glu；R是Lys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、-NH2、Gly、Gly-Pro、Gly-Pro-NH2、或被缺失(例如，条件是该多肽不具有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列且条件是该多肽不是Gly8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、Val8-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-GLP-1(7-37)OH、Leu8-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-GLP-1(7-37)OH、Ile8-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-GLP-1(7-37)OH、Ser8-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-GLP-1(7-37)OH、Thr8-GLP-1(7-36)NH2、Ala16-GLP(7-37)OH、或Ala16-GLP-1(7-36)NH2)。
在另一实施方式中，该多肽具有以下氨基酸序列：
His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-X22-X23-Ala-Ala-Lys-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
其中，X8是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；X22是Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys或Cya；X23是His、Asp、Lys、Glu或Gln；X27是Ala、Glu、His、Phe、Tyr、Trp、Arg或Lys，X30是Ala、Glu、Asp、Ser或His；R是Lys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、-NH2、Gly、Gly-Pro或Gly-Pro-NH2、或被缺失(例如，条件是该多肽不具有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2的序列且条件是该多肽不是Gly8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、Val8-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-GLP-1(7-37)OH、Leu8-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-GLP-1(7-37)OH、Ile8-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-GLP-1(7-37)OH、Ser8-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-GLP-1(7-37)OH、Thr8-GLP-1(7-36)NH2、Ala16-GLP-1(7-37)OH、Ala16-Glp-1(7-36)NH2、Glu27-Glp-1(7-37)OH或Glu27-Glp-1(7-36)NH2。
在另一实施方式中，该多肽具有以下氨基酸序列：
X7-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-X22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
其中，X7是L-His、D-His、脱氨基-His、2氨基-His、β-羟基-His、高-His、α-氟甲基-His或α-甲基-His；X8是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr(如Gly、Val、Leu、Ile、Ser或Thr)；X22是Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys或Cya，而R是-NH2或Gly(OH)。
在另一实施方式中，GLP-1化合物在位置8具有除丙氨酸之外的氨基酸且在位置22具有除甘氨酸之外的氨基酸。GLP-1化合物的具体实例包括[Glu22]GLP-1(7-37)OH、[Asp22]GLP-1(7-37)OH、[Arg22]GLP-1(7-37)OH、[Lys22]GLP-1(7-37)OH    、[Cya22]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Asp22]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Arg22]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Lys22]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Cya22]GLP-1(7-37)OH    、[Gly8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Gly8，Asp22]GLP-1(7-37)OH    、[Gly8，Arg22]GLP-1(7-37)OH    、[Gly8，Lys22]GLP-1(7-37)OH、[Gly8，Cya22]GLP-1(7-37)OH、[Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Arg22]GLP-1(7-36)NH2、[Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Cya22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Arg22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Cya22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Arg22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Cya22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Lys23]GLP-1(7-37)OH、[Val8，Ala27]GLP-1(7-37)OH、[Val8，Glu30]GLP-1(7-37)OH、[Gly8，Glu30]GLP-1(7-37)OH、[Val8，His35]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，His37]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Glu22，Lys23]GLP-1(7-37)OH  、[Val8，Glu22，Glu2]GLP-1(7-37)OH  、[Val8，Glu22，Ala27]GLP-1(7-37)OH、[Val8，Gly34，Lys35]GLP-1(7-37)OH、[Val8，His37]GLP-1(7-37)OH、[Gly8，His37]GLP-1(7-37)OH。
其它GLP-1类似物描述于美国专利No.7,101,843并包括具有下式的那些类似物：
X7-X8-Glu-Gly-Thr-X12-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-X18-X19-X20-Glu-X22-Gln-Ala-X25-Lys-X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33-Lys-Gly-Arg-X37
其中：X7是L-His、D-His、脱氨基-His、2-氨基-His、β-羟基-His、高组氨酸、α-氟甲基-His或α-甲基-His；X8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；X12是Phe、Trp或Tyr；X16是Val、Trp、Ile、Leu、Phe或Tyr；X18是Ser、Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、Leu或Val；X19是Tyr、Trp或Phe；X20是Leu、Phe、Tyr或Trp；X22是Gly、Glu、Asp或Lys；X25是Ala、Val、Ile或Leu；X27是Glu、Ile或Ala；X30是Ala或Glu；X33是Val或Ile；而X37是Gly、His、NH2、或不存在(例如，条件是该化合物不具有序列GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)-NH2、[Gly8]GLP-1(7-37)OH、[Gly8]GLP-1(7-36)NH2、[Val8]GLP-1(7-37)OH、[Val8]GLP-1(7-36)NH2、[Leu8]GLP-1(7-37)OH、[Leu8]GLP-1(7-36)NH2、[Ile8]GLP-1(7-37)OH、[Ile8]GLP-1(7-36)NH2、[Ser8]GLP-1(7-37)OH、[Ser8]GLP-1(7-36)NH2、[Thr8]GLP-1(7-37)OH、[Thr8]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Tyr12]GLP-1(7-37)OH、[Val8，Tyr22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Tyr16]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Tyr16]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Glu22]GLP-l(7-37)OH    、[Gly8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Asp22]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Asp22]GLP-1(7-37)OH、[Gly8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Lys22]GLP-1(7-37)OH、[Val8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Lys22]GLP-1(7-37)OH    、[Gly8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Leu8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Leu8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Ile8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Ile8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Leu8，Asp22]GLP-1(7-37)OH    、[Leu8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Ile8，Asp22]GLP-1(7-37)OH    、[He8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Leu8，Lys22]GLP-1(7-37)OH    、[Leu8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Ile8，Lys22]GLP-1(7-37)OH    、[Ile8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Ser8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Ser8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Thr8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Thr8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Ser8，Asp22]GLP-1(7-37)OH    、[Ser8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Thr8，Asp22]GLP-1(7-37)OH、[Thr8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Ser8，Lys22]GLP-1(7-37)OH、[Ser8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Thr8，Lys22]GLP-1(7-37)OH、[Thr8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Glu2]GLP-1(7-36)NH2、[Asp22]GLP-1(7-37)OH、[Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Lys22]GLP-1(7-37)OH    、[Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Ala27]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Glu22，Ala27]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Glu30]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Glu30]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Glu30]GLP-1(7-37)OH    、[Gly8，Glu30]GLP-1(7-36)NH2、[Leu8，Glu30]GLP-1(7-37)OH    、[Leu8，Glu3O]GLP-1(7-36)NH2、[Ile8，Glu30]GLP-1(7-37)OH    、[Ile8，Glu30]GLP-1(7-36)NH2、[Ser8，Glu30]GLP-1(7-37)OH    、[Ser8，Glu30]GLP-1(7-36)NH2、[Thr8，Glu30]GLP-1(7-37)OH    、[Thr8，Glu30]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，His37]GLP-1(7-37)OH、[Val8，His37]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，His37]GLP-1(7-37)OH、[Gly8，His37]GLP-1(7-36)NH2、[Leu8，His37]GLP-1(7-37)OH、[Leu8，His37]GLP-1(7-36)NH2、[Ile8，His37]GLP-1(7-37)OH    、[Ile8，His37]GLP-1(7-36)NH2、[Ser8，His37]GLP-1(7-37)OH    、[Ser8，His37]GLP-1(7-36)NH2、[Thr8，His37]GLP-1(7-37)OH    、[Thr8，His37]GLP-1(7-36)NH2)。
描述于美国专利No.7,101,843中的其它GLP-1类似物具有下式：
X7-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X16-Ser-X18-Tyr-Leu-Glu-X22-Gln-Ala-X25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-X33-Lys-Gly-Arg-X37
其中：X7是L-His、D-His、脱氨基-His、2-氨基-His、β-羟基-His、高组氨酸、α-氟甲基-His或α-甲基-His；X8是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；X16是Val、Phe、Tyr或Trp；X18是Ser、Tyr、Trp、Phe、Lys、Ile、Leu或Val；X22是Gly、Glu、Asp、或Lys；X25是Ala、Val、Ile或Leu；X33是Val或Ile；而X37是Gly、NH2、或不存在(例如，条件是GLP-1化合物不具有序列GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)-NH2、[Gly8]GLP-1(7-37)OH、[Gly8]GLP-1(7-36)NH2、[Val8]GLP-1(7-37)OH、[Val8]GLP-1(7-36)NH2、[Leu8]GLP-1(7-37)OH、[Leu8]GLP-1(7-36)NH2、[Ile8]GLP-1(7-37)OH、[Ile8]GLP-1(7-36)NH2、[Ser8]GLP-1(7-37)OH、[Ser8]GLP-1(7-36)NH2、[Thr8]GLP-1(7-37)OH、[Thr8]GLP-1(7-36)NH2、[Val8-Tyr16]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Tyr16]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Gly8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8，Asp22]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Asp22]GLP-1(7-37)OH    、[Gly8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2[Val8，Lys22]GLP-1(7-37)OH    、[Val8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8，Lys22]GLP-1(7-37)OH    、[Gly8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Leu8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Leu8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Ile8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Ile8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Leu8，Asp22]GLPl(7-37)OH     、[Leu8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Ile8，Asp22]GLP-1(7-37)OH    、[Ile8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Leu8，Lys22]GLP-1(7-37)OH    、[Leu8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Ile8，Lys22]GLP-1(7-37)OH    、[Ile8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Ser8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Ser8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Thr8，Glu22]GLP-1(7-37)OH    、[Thr8，Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Ser8，Asp22]GLP-1(7-37)OH    、[Ser8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Thr8，Asp22]GLP-1(7-37)OH    、[Thr8，Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Ser8，Lys22]GLP-1(7-37)OH    、[Ser8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Thr8，Lys22]GLP-1(7-37)OH、[Thr8，Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Glu22]GLP-1(7-37)OH  、[Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Asp22]GLP-1(7-37)OH  、[Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Lys22]GLP-1(7-37)OH、[Lys22]GLP-1(7-36)NH2)。
GLP-1类似物也描述于美国专利No.7,238,670并具有以下结构：
A-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Y-Z-B
其中X1-9各自是天然或非天然存在的氨基酸残基；Y和Z是氨基酸残基；而Y和Z的α-碳原子处的取代之一可以各自独立地被选自以下构成的组中的主取代基(初次取代基，primary substituent)取代：氢、烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基烷基、芳烷基和杂芳烷基、杂环基烷基，所述主取代基可选地被选自环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基的次取代基(二次取代基，secondary substituent)取代；任何所述主取代基或次取代基进一步可以被H、烷基、环烷基、芳烷基、芳基、杂环基、杂芳基、烯基、炔基、卤素、羟基、巯基、硝基、氰基、氨基、酰基氨基、叠氮基、胍基、脒基、羧基、羧酰胺基、羧酰胺基烷基、甲酰基、酰基、羧烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、杂芳氧基、杂环氧基、酰氧基、巯基、巯烷基、巯芳基、巯基酰基、卤素、氰基、硝基、叠氮基、氨基、胍基烷基、胍基酰基、磺基、磺酰胺基、烷磺酰基、芳磺酰基或膦酰基(phosphonic group)中的一种或多种取代；其中，主取代基或次取代基可以可选地通过共价键桥接而相互形成一个或多个稠合环或杂环体系；其中，在Y的α-碳上的其它取代可以被H、C1-6烷基、氨烷基、羟烷基或羧烷基取代；其中在Z的α-碳上的其它取代可以用氢、C1-12烷基、氨烷基、羟烷基或羧烷基取代；
A和B可选地存在，其中A存在且A是H、氨基酸或含约1-15个氨基酸残基的肽、R基团、R-C(O)(酰胺)基团、氨基甲酸酯基团RO-C(O)、脲R4R5N-C(O)、磺酰胺基R-SO2或R4R5N-SO2；其中R选自氢、C1-12烷基、C3-10环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、芳氧基烷基、杂芳烷基和杂芳氧基烷基构成的组中；R4和R5各自独立地选自H、烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、芳氧基烷基、杂芳烷基和杂芳氧基烷基构成的组中；其中X1的α-氨基被H或烷基取代，所述烷基可以可选地与A形成环；其中B存在且B是OR1、NR1R2、或氨基酸或含1～15个氨基酸残基(如1～10或1～5)并在C-端作为羧酰胺、取代的羧酰胺、酯、游离羧酸或氨基-醇而封端的肽；其中R1和R2独立地选自H、C1-12烷基、C3-10环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、芳氧基烷基、杂芳烷基或杂芳氧基烷基。
在Y和Z的α-碳原子上的示例性取代包括杂芳基芳基甲基、芳基杂芳基甲基、以及形成联苯丙氨酸残基的联苯甲基，其任何一个也可选地被一个或多个氢、烷基、环烷基、芳烷基、芳基、杂环基、杂芳基、烯基、炔基、卤素、羟基、巯基、硝基、氰基、氨基、酰基氨基、叠氮基、胍基、脒基、羧基、羧酰胺基、羧酰胺基烷基、甲酰基、酰基、羧烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、杂芳氧基、杂环氧基、酰氧基、巯基、巯基烷基、巯基芳基、巯基酰基、卤素、氰基、硝基、叠氮基、氨基、胍基烷基、胍基酰基、磺基、磺酰胺基、烷磺酰基、芳磺酰基和膦酰基取代。
其它实施方式包括分离的多肽，其中在Y的α-碳上的其它取代被H、甲基或乙基取代；且其中在Z的α-碳上的其它取代被H、甲基或乙基取代。
另外的实施方式包括如上所述的分离的多肽，其中X1是天然或非-天然存在的氨基酸残基，其中在α-碳上的取代之一是选自杂环基烷基、杂芳基、杂芳烷基和芳烷基构成的组中的主取代基，所述主取代基可选地被选自杂芳基或杂环基的次取代基取代；其中在α-碳上的其他取代是H或烷基；X2是天然存在或非天然存在的氨基酸残基，其中在α-碳上的取代之一是烷基或环烷基，其中所述烷基基团可以可选地与X2的氮形成环；而其中在α-碳上的其它取代是H或烷基；X3是天然存在或非天然存在的氨基酸残基，其中在α-碳上的取代之一是羧烷基、二羧烷基、磺基烷基、杂烷基或巯基烷基；且其中在α-碳上的其它取代是氢或烷基；X4是天然存在或非天然存在的氨基酸残基，其中α-碳未取代，或其中在α-碳上的取代之一是氨烷基、羧烷基杂芳烷基或杂环基烷基；X5是天然存在或非天然存在的氨基酸残基，其中在α-碳上的取代之一是烷基或羟烷基，而其中在α-碳上的其它取代是氢或烷基；X6是天然存在或非天然存在的氨基酸残基，其中在α-碳上的取代之一是C1-12烷基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基烷基、杂环基烷基、芳烷基或杂芳烷基基团，而在α-碳上的其它取代是H或烷基；X7是天然存在或非天然存在的氨基酸残基，其中在α-碳上的取代之一是羟烷基基团；X8是天然存在或非天然存在的氨基酸残基，其中在α-碳上的取代之一是C1-12烷基、羟烷基、杂芳烷基或羧酰胺基烷基，而在α-碳上的其它取代是H或烷基；X9是天然存在或非天然存在的氨基酸残基，其中在α-碳上的取代之一是羧烷基、二羧烷基、羧芳基、磺基烷基、羧酰胺基烷基或杂芳烷基；而其中A是H、氨基酸或含约1～约5个氨基酸残基的肽、R基团、R-C(O)酰胺基团、氨基甲酸酯基团RO-C(O)、脲R4R5N-C(O)、磺酰胺基R-SO2或R4R5N-SO2。
在某些实施方式中，X1是His、D-His、N-甲基-His、D-N-甲基-His、4-噻唑基Ala或D-4-噻唑基Ala；X2是Ala、D-Ala、Pro、Gly、D-Ser、D-Asn、Nma、D-Nma、4-硫醇基Pro、4-Hyp、L-2-Pip、L-2-Azt、Aib、S-或R-Iva和Acc3；X3是Glu、N-甲基-Glu、Asp、D-Asp、His、Gla、Adp、Cys或4-噻唑基Ala；X4是Gly、His、Lys或Asp；X5是Thr、D-Thr、Nle、Met、Nva或L-Aoc；X6是Phe、Tyr、Tyr(Bzl)、Tyr(3-NO2)、Nle、Trp、Phe(五氟)、D-Phe(五氟)、Phe(2-氟)、Phe(3-氟)、Phe(4-氟)、Phe(2，3-二氟)、Phe(3，4-二氟)、Phe(3，5-二氟)、Phe(2，6-二氟)、Phe(3，4，5-三氟)、Phe(2-碘)、Phe(2-OH)、Phe(2-OMe)、Phe(3-OMe)、Phe(3-氰基)、Phe(2-氯)、Phe(2-NH2)、Phe(3-NH2)、Phe(4-NH2)、Phe(4-NO2)、Phe(4-Me)、Phe(4-烯丙基)、Phe(正丁基)、Phe(4-环己基)、Phe(4-环己氧基)、Phe(4-苯氧基)、2-Nal、2-吡啶基Ala、4-噻唑基Ala、2-Thi、α-Me-Phe、D-α-Me-Phe、α-Et-Phe、D-α-Et-Phe、α-Me-Phe(2-氟)、D-α-Me-Phe(2-氟)、α-Me-Phe(2，3-二氟)、D-α-Me-Phe(2，3-二氟)、α-Me-Phe(2，6-二氟)、D-α-Me-Phe(2，6-二氟)、α-Me-Phe(五氟)和D-α-Me-Phe(五氟)；X7是Thr、D-Thr、Ser或hSer；X8是Ser、hSer、His、Asn或α-Me-Ser；而X9是Asp、Glu、Gla、Adp、Asn或His。
其它实施方式包括其中Y是Bip、D-Bip、L-Bip(2-Me)、D-Bip(2-Me)、L-Bip(2′-Me)、L-Bip(2-Et)、D-Bip(2-Et)、L-Bip(3-Et)、L-Bip(4-Et)、L-Bip(2-正丙基)、L-Bip(2-正丙基，4-OMe)、L-Bip(2-正丙基，2′-Me)、L-Bip(3-Me)、L-Bip(4-Me)、L-Bip(2，3-二-Me)、L-Bip(2，4-二-Me)、L-Bip(2，6-二-Me)、L-Bip(2，4-二-Et)、L-Bip(2-Me，2′-Me)、L-Bip(2-Et，2′-Me)、L-Bip(2-Et，2′-Et)、L-Bip(2-Me，4-OMe)、L-Bip(2-Et，4-OMe)、D-Bip(2-Et，4-OMe)、L-Bip(3-OMe)、L-Bip(4-OMe)、L-Bip(2，4，6-三-Me)、L-Bip(2，3-二-OMe)、L-Bip(2，4-二-OMe)、L-Bip(2，5-二-OMe)、L-Bip(3，4-二-OMe)、L-Bip(2-Et，4，5-二-OMe)、L-Bip(3，4-亚甲基-二-氧基)、L-Bip(2-Et，4，5-亚甲基-二-氧基)、L-Bip(2-CH2OH，4-OMe)、L-Bip(2-Ac)、L-Bip(3-NH-Ac)、L-Bip(4-NH-Ac)、L-Bip(2，3-二-氯)、L-Bip(2，4-二-氯)、L-Bip(2，5-二-氯)、L-Bip(3，4-二-氯)、L-Bip(4-氟)、L-Bip(3，4-二氟)、L-Bip(2，5-二氟)、L-Bip(3-正丙基)、L-Bip(4-正丙基)、L-Bip(2-异丙基)、L-Bip(3-异丙基)、L-Bip(4-异丙基)、L-Bip(4-叔丁基)、L-Bip(3-苯基)、L-Bip(2-氯)、L-Bip(3-氯)、L-Bip(2-氟)、L-Bip(3-氟)、L-Bip(2-CF3)、L-Bip(3-CF3)、L-Bip(4-CF3)、L-Bip(3-NO2)、L-Bip(3-OCF3)、L-Bip(4-OCF3)、L-Bip(2-OEt)、L-Bip(3-OEt)、L-Bip(4-OEt)、L-Bip(4-SMe)、L-Bip(2-OH)、L-Bip(3-OH)、L-Bip(4-OH)、L-Bip(2-CH2-COOH)、L-Bip(3-CH2-COOH)、L-Bip(4-CH2-COOH)、L-Bip(2-CH2-NH2)、L-Bip(3-CH2-NH2)、L-Bip(4-CH2-NH2)、L-Bip(2-CH2-OH)、L-Bip(3-CH2-OH)、L-Bip(4-CH2-OH)、L-Phe[4-(1-炔丙基)]、L-Phe[4-(1-丙烯基)]、L-Phe[4-正丁基]、L-Phe[4-环己基]、Phe(4-苯氧基)、L-Phe(五氟)、L-2-(9，10-二氢菲基)-Ala、4-(2-苯并(b)呋喃)-Phe、4-(4-二苯并呋喃)-Phe、4-(4-吩噁噻(phenoxathiin))-Phe、4-(2-苯并(b)噻吩)-Phe、4-(3-噻吩)-Phe、4-(3-喹啉)-Phe、4-(2-萘基)-Phe、4-(1-萘基)-Phe、4-(4-(3，5-二甲基异噁唑))-Phe、4-(2，4-二甲氧基嘧啶)-Phe、高Phe(homoPhe)、Tyr(Bzl)、Phe(3，4-二-氯)、Phe(4-碘)、2-萘基-Ala、L-α-Me-Bip或D-α-Me-Bip；Z是L-Bip、D-Bip、L-Bip(2-Me)、D-Bip(2-Me)、L-Bip(2′-Me)、L-Bip(2-Et)、D-Bip(2-Et)、L-Bip(3-Me)、L-Bip(4-Me)、L-Bip(3-OMe)、L-Bip(4-OMe)、L-Bip(4-Et)、L-Bip(2-正丙基，2′-Me)、L-Bip(2，4-二-Me)、L-Bip(2-Me，2′-Me)、L-Bip(2-Me，4-OMe)、L-Bip(2-Et，4-OMe)、D-Bip(2-Et，4-OMe)、L-Bip(2，6-二-Me)、L-Bip(2，4，6-三-Me)、L-Bip(2，3，4，5-四-Me)、L-Bip(3，4-二-OMe)、L-Bip(2，5-二-OMe)、L-Bip(3，4-亚甲基-二-氧基)、L-Bip(3-NH-Ac)、L-Bip(2-异丙基)、L-Bip(4-异丙基)、L-Bip(2-苯基)、L-Bip(4-苯基)、L-Bip(2-氟)、L-Bip(4-CF3)、L-Bip(4-OCF3)、L-Bip(2-OEt)、L-Bip(4-OEt)、L-Bip(4-SMe)、L-Bip(2-CH2-COOH)、D-Bip(2-CH2-COOH)、L-Bip(2′-CH2-COOH)、L-Bip(3-CH2-COOH)、L-Bip(4-CH2-COOH)、L-Bip(2-CH2-NH2)、L-Bip(3-CH2-NH2)、L-Bip(4-CH2-NH2)、L-Bip(2-CH2-OH)、L-Bip(3-CH2-OH)、L-Bip(4-CH2-OH)、L-Phe(3-苯基)、L-Phe[4-正丁基]、L-Phe[4-环己基]、Phe(4-苯氧基)、L-Phe(五氟)、L-2-(9，10-二氢菲基)-Ala、4-(3-吡啶基)-Phe、4-(2-萘基)-Phe、4-(1-萘基)-Phe、2-萘基-Ala、2-芴基-Ala、L-α-Me-Bip、D-α-Me-Bip、L-Phe(4-NO2)或L-Phe(4-碘)；A是H、乙酰基、β-Ala、Ahx、Gly、Asp、Glu、Phe、Lys、Nva、Asn、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、己内酰胺、Bip、Ser(Bzl)、3-吡啶基Ala、Phe(4-Me)、Phe(五氟)、4-甲基苄基、4-氟苄基、正丙基、正己基、环己基甲基、6-羟基戊基、2-噻嗯基甲基、3-噻嗯基甲基、五氟苄基、2-萘基甲基、4-联苯基甲基、9-蒽基甲基、苄基、(S)-(2-氨基-3-苯基)丙基、甲基、2-氨基乙基或(S)-2-氨基丙基；而B是OH、NH2、Trp-NH2、2-萘基Ala-NH2、Phe(五氟)-NH2、Ser(Bzl)-NH2、Phe(4-NO2)-NH2、3-吡啶基Ala-NH2、Nva-NH2、LyS-NH2、Asp-NH2、Ser-NH2、His-NH2、Tyr-NH2、Phe-NH2、L-Bip-NH2、D-Ser-NH2、Gly-OH、β-Ala-OH、GABA-OH或APA-OH的那些。
在某些实施方式中，当A不存在时，而X1是R基团、R-C(O)(酰胺)基团、氨基甲酸酯基团RO-C(O)、脲R4R5N-C(O)、磺酰胺基R-SO2或R4R5N-SO2；其中R是H、C1-12烷基、C3-10环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、芳氧基烷基、杂芳烷基、杂芳氧基烷基或杂芳基烷氧基烷基；而其中R4和R5每一个独立地是H、C1-12烷基、C3-10环烷基、环烷基烷基、杂环基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、芳氧基烷基、杂芳烷基或杂芳氧基烷基。
在某些实施方式中，当B不存在时，而Z是OR1、NR1R2或氨基-醇；其中R1和R2独立地是H、C1-12烷基、C3-10环烷基、环烷基烷基、杂环、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、芳氧基烷基、杂芳烷基或杂芳氧基烷基。在某些实施方式中，X1(适用时)、X2和X3是N-H或N-烷基化的(如N-甲基化的)氨基酸残基。这种多肽可以是10-mer至15-mer且能够结合至并活化GLP-1受体。
缩写
Nal＝萘基丙氨酸
pGly＝戊基甘氨酸
t-BuG或＝叔丁基甘氨酸
TPro＝硫代脯氨酸
HPro＝高脯氨酸(homoproline)
NmA＝N-甲基丙氨酸
Cya＝半胱氨酸(磺基丙氨酸)
Thi＝β2-噻嗯基-Ala
hSer＝高丝氨酸
Aib＝a-氨基异丁酸
Bip＝联苯丙氨酸
Nle＝正亮氨酸
Ahx＝2-氨基己酸
Nva＝正缬氨酸
GLP-1类似物的修饰形式
GLP-1类似物的修饰形式
本文中描述的任何肽GLP-1类似物可以进行修饰(改性，modified)(如本文中所述或本领域已知的)。正如在美国专利No.6,924,264中所述，这种多肽能够结合至聚合物而增大其分子量。示例性聚合物包括聚乙二醇聚合物、聚氨基酸、白蛋白、明胶、琥珀酰基-明胶、(羟丙基)-甲基丙烯酰胺、脂肪酸、多糖、脂质氨基酸和葡聚糖。
在一种情况下，这种多肽通过加入白蛋白(如人白蛋白)、或其类似物或片段、或免疫球蛋白的Fc部分而进行修饰。这种方法描述于如美国专利No.7,271,149中。
在一个实例中，这种多肽通过加入亲脂性取代基而改性，这描述于PCT公开WO 98/08871。这种亲脂性取代基可以包括部分或完全氢化的环戊烷并菲(cyclopentanophenathrene)骨架、直链或支链烷基；直链或支链脂肪酸的酰基(例如，包括CH3(CH2)nCO-或HOOC(CH2)mCO-的基团，其中n或m为4～38)；直链或支链烷烃α，ω-二羧酸的酰基基团；CH3(CH2)p((CH2)q，COOH)CHNH-CO(CH2)2CO-，其中p和q是整数而p+q为8～33；CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-，其中r为10～24；CH3(CH2)SCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-，其中s为8～24；COOH(CH2)tCO-，其中t为8～24；-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3，其中u为8～18；-NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)WCH3，其中w为10～16；-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)XCH3，其中x  为10～16；或-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NHCO(CH2)yCH3，其中y为1～22。
在其他实施方式中，GLP-1肽通过加入化学反应性基团如马来酰亚胺基团进行修饰，这描述于美国专利No.6,593,295。这些基团能够与血液组分上的可利用的反应性官能团反应而形成共价键并能够延长经修饰的促胰岛素肽的体内有效治疗的半衰期。为了与蛋白上官能团形成共价键，作为化学反应性基团可使用各种活性羧基基团(如酯)，其中羟基部分以用来修饰肽所需的水平在生理上是可接受的。具体试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHTS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺基丙酸(MPA)马来酰亚胺基己酸(MHA)和马来酰亚胺基十一酸(MUA)。
伯胺是NHS酯的主要靶。存在于蛋白N-端和赖氨酸的ε-胺上的可接近α-胺基团与NHS酯反应。在NHS酯结合反应与伯胺反应释放N-羟基琥珀酰亚胺时，酰胺键形成。这些含反应性基团的琥珀酰亚胺在本文中称为琥珀酰亚胺基基团。在本发明某些实施方式中，蛋白上的官能团是硫醇基基团而化学反应性基团是含马来酰亚胺基的基团如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA)。这种含马来酰亚胺的基团在本文中称为马来酰亚胺基(maleido)基团。
当反应混合物的pH为6.5-7.4时，马来酰亚胺基基团对于肽上的巯基基团最具选择性。在pH 7.0时，马来酰亚胺基基团与巯基(例如，蛋白如血清白蛋白或IgG上的硫醇基基团)的反应速率比与胺反应快1000倍。因此，在马来酰亚胺基基团和巯基之间形成稳定的硫醚连接，这在生理条件下是不能断裂的。
肽载体
本发明的所述化合物的特征在于本文中所述的任何多肽，例如，表1中所述的任何肽(如血管肽-1或血管肽-2)、或其片段或类似物。在某些实施方式中，这种多肽与本文中所述的多肽具有至少35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至100％的同一性。这种多肽相对于本文中所述的一个序列可以具有一个或多个(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15)替换。以下将更为详细地描述其它修饰。
本发明的特征还在于这些多肽的片段(如功能性片段)。在某些实施方式中，这些片段能够有效转运或累积于特定细胞类型(如肝、眼、肺、肾或脾)中或有效转运穿过BBB。这些多肽的截短体可以是从多肽的N-端、多肽的C-端或其组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个氨基酸。其它片段包括其中多肽的居间部分被缺失的序列。
另外的多肽可以通过使用本文中描述的一种分析或方法进行识别。例如，候选多肽可以通过传统的肽合成生产，与紫杉醇结合而向实验室动物给予。生物活性多肽结合物可以例如基于注射肿瘤细胞并用结合物治疗的动物相对于没有用结合物治疗(如用未结合试剂治疗)的对照的存活率的提高而识别。例如，生物活性多肽可以按照原位脑灌注分析基于其在实质中的位置而识别。
在其它组织中确定累积的分析也可以实施。标记的多肽结合物可向动物给予，并可测定不同器官中的累积。例如，结合于可检测标记(如近IR荧光光谱标记，如Cy5.5)的多肽容许体内活体观察。这种多肽可向动物给予，并可检测器官中多肽的存在，由此容许确定在所需器官中多肽累积的速率和量。在其他实施方式中，这种多肽可用放射活性同位素(如125I)标记。这种多肽随后给予动物。在一定时间之后，动物被处死并提取器官。随后采用本领域内任何已知方式测定每一器官中的放射同位素的量。通过比较特定器官中标记的候选多肽相对于标记的对照多肽的量，能够确定候选多肽进入和累积于特定组织中的能力。合适的阴性对照包括已知不能有效转运进入特定细胞类型的任何肽或多肽(例如，与不能穿过BBB的血管肽相关的肽，或任何其它肽)。
另外的序列描述于美国专利No.5,807,980(如本文中的SEQ ID NO：102)、5,780,265(如SEQ ID NO：103)、5,118,668(如SEQ ID NO：105)。编码抑肽酶类似物的示例性核苷酸序列atgagaccag atttctgcct cgagccgccgtacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatc cgttacttct acaatgcaaa ggcaggcctg tgtcagaccttcgtatacgg cggctgcaga gctaagcgta acaacttcaa atccgcggaa gactgcatgc gtacttgcggtggtgcttag；SEQ ID NO：6；Genbank登录号X04666)。抑肽酶类似物的其它实例可以采用国际专利申请No.PCT/CA2004/000011中公开的合成抑肽酶序列(或其部分)通过实施蛋白BLAST(基因库：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)而发现。示例性抑肽酶类似物也能按照登录号CAA37967(GI：58005)和1405218C(GI：3604747)找到。
修饰多肽
本发明中所用的肽载体和肽GLP-1激动剂可以具有修饰的氨基酸序列。在某些实施方式中，这种修饰并不会显著损坏所需的生物活性(如穿过BBB的能力或GLP-1激动剂活性)。这种修饰可以降低(如至少5％、10％、20％、25％、35％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、或95％)，可以无效于，或可以提高(如至少5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％、或1000％)原始多肽的生物活性。这种修饰肽可以具有或可以优化多肽的特性，如体内稳定性、生物利用度、毒性、免疫活性、免疫特性(immunological identity)和结合性能。
修饰包括通过天然加工，例如翻译后加工，或通过本领域内已知的化学修饰技术的那些修饰。修饰可以发生于多肽中的任何位置，包括多肽骨架、氨基酸侧链和氨基-或羧基-端。相同类型的修饰在给定多肽中的几个位置处以相同或不同的程度存在，而多肽可以包含不只一种类型的修饰。多肽可以因为遍在蛋白化(泛素化，ubiquitination)而支化，且它们可以是环状的，支化或未支化。环状的、支化的以及支化环状的多肽可以源自翻译后的天然加工或可以通过合成获得。其它修饰包括聚乙二醇化、乙酰化、酰基化、乙酰氨基甲基(acetomidomethyl，Acm)基团的添加、ADP-核糖基化、烷基化、酰胺化、生物素化、氨基酰化、羧乙基化、酯化、共价连接至核黄素(fiavin)、共价连接至血红素部分、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、药物的共价连接、标记(荧光或放射活性)的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键的形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷胺酯(pyroglutamate)的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸添加至蛋白，如精氨酰化和遍在蛋白化。
修饰的多肽也可包括多肽序列中的氨基酸插入、缺失或替换，要么保守要么非保守(如D-氨基酸、脱氨基酸)(例如，其中这种变化基本上不会改变多肽的生物活性)。具体而言，将一个或多个半胱氨酸残基添加至本发明任何多肽的氨基端或羧基端，能够有利于这些多肽(例如通过二硫键)结合。例如，血管肽-1(SEQ ID NO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)或血管肽-7(SEQ ID NO：112)能够经过修饰而在氨基端包含单个半胱氨酸残基(分别是SEQ ID NO：71、113和115)或在羧基端包含单个半胱氨酸残基(分别是SEQ ID NO：72、114和116)。氨基酸替换可以是保守的(即，其中残基被同一简并类型(通用类型，general type)或类别中的另一个氨基酸替代)或非-保守的(即，其中残基被另一种类型的氨基酸替代)。另外，非-天然存在的氨基酸能够替换天然存在的氨基酸(即，非-天然存在的保守氨基酸替换或非-天然存在的非-保守氨基酸替换)。
合成的多肽可包括DNA非天然编码的氨基酸的替换(如非天然存在的或非天然氨基酸)。非天然存在的氨基酸的实例包括D-氨基酸、具有连接至半胱氨酸的硫原子的乙酰基氨基甲基的氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、其中n为2-6的式NH2(CH2)nCOOH的ω氨基酸、中性非极性氨基酸如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。苯基甘氨酸可以替换Trp、Tyr、或Phe；瓜氨酸和蛋氨酸亚砜是中性非极性的，半胱氨酸是酸性的，而鸟氨酸是碱性的。脯氨酸可以用羟基脯氨酸替换而保持赋予其性质的构象。
类似物可以通过替换突变(替换诱变，substitutional mutagenesis)产生并保持原始多肽的生物活性。被识别为“保守替换”的替换实例如表2中所示。如果这种替换导致非所需的变化，则引入其它类型的替换(在表3中命名为“示例性替换”，或正如本文中参照氨基酸分类所述的)，并筛选产物。
功能或免疫学特性(identity)的实质性修饰通过选择替换而实现，这些替换在其对维持(a)在替换区域的多肽骨架的结构、如作为片状或螺旋构象、(b)靶位点的分子电荷或疏水性、或(c)侧链的体积的效果方面显著不同。天然存在残基基于常见的侧链性质而进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、蛋氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)；
(2)中性亲水性：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)；
(3)酸性/带负电：天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；
(4)碱性：天门冬酰胺酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)；
(5)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；
(6)芳族：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)；
(7)极性：Ser、Thr、Asn、Gln
(8)碱性带正电：Arg、Lys、His；和
(9)带电：Asp、Glu、Arg、Lys、His。
其它氨基酸替换列于表3中。
表2：氨基酸替换
  原始残基   示例性替换   保守替换
  Ala(A)   Val，Leu，Ile   Val
  Arg(R)   Lys，Gln，Asn   Lys
  Asn(N)   Gln，His，Lys，Arg   Gln
  Asp(D)   Glu   Glu
  Cys(C)   Ser   Ser
  Gln(Q)   Asn   Asn
  Glu(E)   Asp   Asp
  Gly(G)   Pro   Pro
  His(H)   Asn，Gln，Lys，Arg   Arg
  Ile(I)   Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸   Leu
  Leu(L)   正亮氨酸，Ile，Val，Mel，Ala，Phe   Ile
  Lys(K)   Arg，Gln，Asn   Arg
  Met(M)   Leu，Phe，Ile   Leu
  Phe(F)   Leu，Val，Ile，Ala   Leu
  Pro(P)   Gly   Gly
  Ser(S)   Thr   Thr
  Thr(T)   Ser   Ser
  Trp(W)   Tyr   Tyr
  Tyr(Y)   Trp，Phe，Thr，Ser   Phe
  Val(V)   Ile，Leu，Met，Phe，Ala，正亮氨酸   Leu
多肽衍生物和肽模拟物
除了由天然存在的氨基酸构成的多肽之外，肽模拟物或多肽类似物也被本发明涵盖并能够构成本发明化合物中所用的肽载体或GLP-1激动剂。多肽类似物常见用于制药工业，作为具有类似于那些模板多肽的性质的非肽药物。非肽化合物称之为“模拟肽”或肽模拟物(Fauchere et al.，Infect.Immun.54：283-287，1986和Evans et al.，J.Med.Chem.30：1229-1239，1987)。结构上与药用肽或多肽相关的模拟肽可以用于产生相当的或增强的治疗或预防效果。一般而言，肽模拟物结构上类似于范例多肽(即，具有生物或药物活性的多肽)如天然存在的受体结合多肽，但是具有一个或多个通过本领域内众所周知的方法可选地被连接基(linkages)如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-CH2SO-、-CH(OH)CH2-、-COCH2-等取代的肽连接基(Spatola，Peptide Backbone Modifications，VegaData，1：267，1983；Spatola et al.，Life Sci.38：1243-1249，1986；Hudson etal.，Int.J.Pept.Res.14：177-185，1979；和Weinstein，1983，Chemistry andBiochemistry，of Amino Acids，Peptides and Proteins，Weinstein eds，MarcelDekker，New York)。这种模拟多肽可能具有优于天然存在多肽的显著优点，包括生产更经济、化学稳定更好、药物学性质增强(如半衰期、吸收、效力、效能)、抗原性降低等。
尽管本文中所描述的肽载体可以有效地穿过BBB或靶向特定细胞类型(如本文中描述的那些)，但由于存在蛋白酶可能使其效率降低。同样，本发明中所用的GLP-1激动剂的效率可能类似地降低。血清蛋白酶具有特异性底物要求，包括用于裂解的L-氨基酸和肽键。而且，外肽酶(代表血清中蛋白酶活性的最突出组分)，通常作用于多肽的第一个肽键上并需要游离的N-端(Powell et al.，Pharm.Res.10：1268-1273，1993)。鉴于此，常常有利的是采用修饰形式的多肽。修饰多肽保持原始L氨基酸多肽的结构特性，但有利是其不易于被蛋白酶和/或外肽酶解裂。
用相同类型的D-氨基酸(如对映体；D-赖氨酸替代L-赖氨酸)对一致性序列(consensus sequence)中的一个或多个氨基酸的系统性替换，可以用于产生更稳定的多肽。因此，如本文中描述的多肽衍生物或肽模拟物可以都是L-多肽、都是D-多肽或混合的D、L-多肽。N-端或C-端的D-氨基酸的存在，提高了多肽的体内稳定性，因为肽酶不能利用D-氨基酸作为底物(Powell et al.，Pharm.Res.10：1268-1273，1993)。反(逆，reverse)-D多肽是含D-氨基酸的多肽，相对于含L-氨基酸的多肽排列为反序列(reverse sequence)中。因此，L-氨基酸多肽的C-端残基变成了D-氨基酸多肽的N-端，等等。反-D-多肽保留了相同的三级构象而因此保持了作为L-氨基酸多肽的相同活性，但是对于体外和体内酶降解则更稳定，而由此比原始多肽具有更高的疗效(Brady and Dodson，Nature 368：692-693，1994and Jameson et al.，Nature 368：744-746，1994)。除了反-D-肽之外，包含一致性序列或基本同一的一致性序列变体的限制性多肽(constrainedpolypeptides)，可以通过本领域内众所周知的方法产生(Rizo et al.，Ann.Rev.Biochem.61：387-418，1992)。例如，限制性多肽可以通过加入能够形成二硫桥的半胱氨酸残基而由此形成环状多肽而产生。环状多肽不具有游离的N-或C-端。因此，它们并不易于通过外肽酶发生蛋白水解，但是它们当然易受内肽酶作用，这种酶不会在多肽末端上进行裂解。具有N-端或C-端D-氨基酸的多肽和环状多肽的氨基酸序列，除了分别存在N-端或C-端D-氨基酸残基、或其环状结构外，通常同一于其对应的多肽的序列。
含有分子内二硫键的环状衍生物可以通过传统的固相合成法制备，同时在选择用于环化的位置如氨基和羧基端引入合适的S-保护半胱氨酸或高半胱氨酸残基(Sah et al.，J.Pharm.Pharmacol.48：197，1996)。在完成链组装之后，环化能够通过以下方式进行：(1)对相应的两个游离SH-官能的后续载体上氧化(on-support oxidation)选择性除去S-保护基团而形成S-S键，接着从载体上常规地去除产物并进行合适的纯化步骤，或(2)随着侧链完全脱保护而从载体上去除多肽，接着在高度稀释的水溶液中对游离的SH-官能进行氧化。
含有分子内酰胺键的环状衍生物可以通过传统的固相合方法制备，同时在选择用于环化的位置引入合适的氨基和羧基侧链保护的氨基酸衍生物。含分子内-S-烷基键的环状衍生物可通过传统的固相化学法制备，同时在选择用于环化的位置引入具有合适的氨基-保护侧链的氨基酸残基、和合适的S-保护的半胱氨酸或高半胱氨酸残基。
另一种赋予对肽酶(其作用于多肽的N-端或C-端残基)的抗性的有效方法是在多肽末端上添加化学基团，使得修饰的多肽不再是肽酶的底物。一种这样的化学修饰是在任意一端或两端对多肽进行糖基化。某些化学修饰，特别是N-端糖基化，已经证实提高了多肽在人血清中的稳定性(Powell et al.，Pharm.Res.10：1268-1273，1993)。其它增强血清稳定性的化学修饰，包括但不限于，添加N-端烷基基团(其由1～20个碳的低级烷基构成，如乙酰基)，和/或添加C-端酰胺或取代的酰胺基团。具体而言，本发明包括包括由具有N端乙酰基和/或C-端酰胺基的多肽构成的修饰多肽。
本发明也包括其它类型的多肽衍生物，其包含通常不作为多肽部分的其它化学部分，条件是衍生物要保持这种多肽的所需功能活性。这种衍生物的实例包括(1)氨基端或另一游离氨基的N-酰基衍生物，其中酰基基团可以是烷酰基(如乙酰基、己酰基、辛酰基)和芳酰基(如苯甲酰基)或封端基团如F-moc(芴基甲基-O-CO-)；(2)羧基端或另一游离羧基或羟基的酯；(3)通过与氨或与合适的胺反应而产生的羧基端或另一游离羧基的酰胺；(4)磷酸化衍生物；(5)结合于抗体或其它生物配体的衍生物和其它类型的衍生物。
由向本文中所描述的多肽添加其它氨基酸残基而获得的较长多肽序列也涵盖于本发明中。这种较长的多肽序列能够预期具有与以上所述多肽相同的生物活性和特异性(专化性，specificity)(如细胞趋性，cell tropism)。尽管具有大量其它氨基酸的多肽并不排除在外，但应该认识到，一些大的多肽可能呈现出遮蔽有效序列的构象，由此妨碍结合至靶(例如，LRP受体家族的成员，如LRP或LRP2)。这些衍生物可用作竞争性拮抗剂。因此，尽管本发明涵盖了本文中所述具有延伸范围的多肽或多肽衍生物，然而期望的是该延伸范围不破坏多肽或其衍生物的细胞靶向活性。
其它包含于本发明中的衍生物是直接或通过间隔子(如通过丙氨酸残基的短链段或通过蛋白水解(如通过组织蛋白酶，参见美国专利No.5,126,249和欧洲专利No.495049)的推定位置)彼此共价连接的如本文中所述的两个相同或两个不同多肽的双多肽(双重多肽，dualpolypeptides)。本文中描述的多肽的多聚体由相同或不同的多肽或其衍生物形成的分子聚合物构成。
本发明也涵盖多肽衍生物，该多肽衍生物是嵌合或融合蛋白，包含本文中所述的多肽、或其片段，在其氨基或羧基末端或两端连接至不同蛋白质的氨基酸序列。这种嵌合或融合蛋白可以通过重组表达编码蛋白的核酸而进行生产。例如，嵌合或融合蛋白可以包含与一个所述多肽共享的至少6个氨基酸，其理想地产生具有相当或更高功能活性的嵌合或融合蛋白。
鉴定肽模拟物的分析
如上所述，用来复制本文所述多肽的骨架几何和药效团表现(pharmacophore display)的非肽化合物(肽模拟物)，经常具有更大的代谢稳定性、更高的效力、更长的作用持久性和更好的生物利用度。
肽模拟物化合物能够采用本领域内已知的组合文库方法中的多种方法中的任何一种获得，包括生物文库、空间可寻址并行固相或液相文库、需要去卷积的合成文库法、“一珠一化合物”文库法和采用亲和色谱选择的合成文库法。生物学文库法局限于肽文库，而其它四种方法则适用于肽、非肽低聚物、或小分子化合物文库(Lam，Anticancer Drug Des.12：145，1997)。合成分子文库的方法实例能够在本领域内找到，例如：De Witt etal.{Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909，1993)；Erb et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422，1994)；Zuckermann et al.(J.Med.Chem.37：2678，1994)；Cho et al.(Science 261：1303，1993)；Carell et al.(Angew.Chem，Int.Ed.Engl.33：2059，1994 and ibid 2061)；以及Gallop et al.(Med.Chem.37：1233，1994)。化合物文库可以呈现在溶液中(如Houghten，Biotechniques13：412-421，1992)或呈现在珠上(Lam，Nature 354：82-84，1991)、碎片(chips)上(Fodor，Nature 364：555-556，1993)、细菌或孢子上(美国专利No.5,223,409)、质粒上(Cull et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869，1992)或噬菌体上(Scott and Smith，Science 249：386-390，1990)、或荧光素酶以及通过测定合适底物转化成产物而检测的酶标记。
一旦本文中所述的多肽被识别，就能够分离并通过任何多种标准方法进行纯化，包括但不限于，差异溶解度(如沉淀法)、离心法、色谱法(如亲合性、离子交换和体积排阻)、或通过任何用于纯化肽、肽模拟物或蛋白的其它标准技术。所识别的感兴趣多肽的功能性质可以采用任何本领域内已知的任何功能性分析法进行评价。理想地，采用评价胞内信号传递中下游受体功能的分析法(如细胞增殖)。
例如，本发明的肽模拟物化合物可以采用以下三阶段方法获得：(1)扫描本文中所述多肽而识别靶向本文中所述特定细胞类型所必需的二级结构的区域；(2)采用构象上受限制的二肽替代物来精修骨架几何结构并提供对应于这些替代物的有机平台；和(3)采用最佳有机平台来表现设计用于模拟所需天然多肽活性的候选物文库中的有机药效团。更详细地，三阶段法如下所述。在阶段1中，扫描主要的候选多肽并消减其结构而识别其活性必要的条件。合成一系列原始多肽的多肽类似物。在阶段2中，采用构象上受限制的二肽替代物来探究最佳多肽类似物。吲哚里西啶-2-酮(indolizidin-2-one)、吲哚里西啶-9-酮和喹啉里西啶酮(quinolizidinone)氨基酸(分别为I2aa，I9aa和Qaa)用作研究最佳肽候选物的骨架几何结构的平台。这些和相关的平台(综述于文献Halab et al，Biopolymers 55：101-122，2000和Hanessian et al.，Tetrahedron 53：12789-12854，1997中)可以在多肽的特定区域引入而在不同方向上定向药效团。这些类似物的生物学评价识别出模拟活性所必需的几何条件的改善的前导多肽(lead polypeptides)。在阶段3中，最具活性的前导多肽的平台用于表现产生天然肽活性的药效团的有机替代物。药效团和支架结合为并行合成形式。多肽的衍生化和上述阶段可通过采用本领域内已知方法的其它方式完成。
由文中所述的多肽、多肽衍生物、肽模拟物或其它小分子确定的结构功能关系可用于精修和制备具有类似或更好性能的类似分子结构。因此，本发明的化合物也包括共享本文中所述多肽的结构、极性、电荷特性和侧链性质的分子。
总之，基于本文的公开内容，本领域的技术人员能够开发出适用于识别将药剂靶向特定细胞类型(如本文中描述的那些)的化合物的肽和肽模拟物筛选分析法。本发明的分析法可以开发用于低通量、高通量或超高通量筛选形式。本发明的分析法包括适用于自动化的分析法。
连接子
GLP-1激动剂可以直接结合至载体肽(例如，通过共价键，如肽键)或可以通过连接子结合。这种连接子包括化学连接剂(如可裂解的连接子)和肽。
在一些实施方式中，连接子是化学连接剂。GLP-1激动剂和载体肽可以通过巯基基团、氨基基团(胺)和/或碳水化合物或任何合适的反应性基团结合。同双官能性(homobifunctional)和杂双官能性交联连接子(结合剂)可从任何商业来源获得。可用于交联的区域可在本发明的多肽上找到。交联连接子可以包含柔性臂(flexible arm)，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个碳原子。示例性的交联连接子包括BS3([双(磺基琥珀酰亚胺基)底物]；BS3是靶向可接近的伯胺的同双官能N-羟基琥珀酰亚胺酯)、NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-′(二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺；NHS/EDC容许伯胺基团结合羧基基团)、磺基-EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酸]酰肼；磺基-EMCS是对巯基和氨基基团具有反应性的杂双官能反应基(马来酰亚胺和NHS-酯))、酰肼(大多数蛋白包含暴露的碳水化合物而酰肼是适用于将羧基连接至伯胺的有用试剂)和SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基巯基乙酸；SATA对胺具有反应性并加入保护的巯基基团)。
为了形成共价键，可采用各种活性羧基基团(例如酯)作为化学反应性基团，其中羟基部分在修饰肽所需的水平下为生理上可接受的。具体试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺基丙酸(MPA)、马来酰亚胺基己酸(MHA)和马来酰亚胺基十一酸(MUA)。
伯胺是NHS酯的主要靶。存在于蛋白N-端的可接近的α-胺基和赖氨酸的ε-胺与NHS酯发生反应。酰胺键在NHS酯结合反应与释放N-羟基琥珀酰亚胺的伯胺反应时形成。这些含反应基的琥珀酰亚胺在本文中称之为琥珀酰亚胺基基团。在本发明的某些实施方式中，在蛋白上的官能团是硫醇基团而化学反应性基团是含马来酰亚胺基的基团如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA)。这种含马来酰亚胺基的基团在本文中称之为马来酰亚胺基基团。
马来酰亚胺基基团当反应混合物pH为6.5-7.4时对于肽上的巯基基团最具选择性。在pH 7.0下，马来酰亚胺基基团与巯基(例如，蛋白质如血清白蛋白或IgG上的硫醇基基团)的反应速率比与胺反应快1000倍。因此，马来酰亚胺基基团和巯基之间的稳定硫醚连接能够形成。
在其他实施方式中，连接子包含至少一个氨基酸(如至少2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40、或50个氨基酸的肽)。在某些实施方式中，连接子是单个氨基酸(例如，任何天然存在的氨基酸，如Cys)。在其他实施方式中，使用富含甘氨酸的肽，如具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n为1、2、3、4、5或6，其描述于美国专利No.7,271,149中。在其他实施方式中，使用富含丝氨酸的肽连接子，其描述于美国专利No.5,525,491中。富含丝氨酸的肽连接子包括式[X-X-X-X-Gly]y的那些，其中多达2个x是Thr，而其余X是Ser，且y为1～5(例如，Ser-Ser-Ser-Ser-Gly，其中y大于1)。在一些情况下，连接子是单个氨基酸(如任何氨基酸，如Gly或Cys)。
合适连接子的实例有琥珀酸、Lys、Glu和Asp，或二肽如Gly-Lys。当连接子是琥珀酸时，其一个羧基可以与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，而其另一羧基可以例如与肽或取代基的氨基基团形成酰胺键。当这种连接子是Lys、Glu或Asp时，其羧基基团可以与氨基酸残基的氨基基团形成酰胺键，其氨基基团可以例如与取代基的羧基基团形成酰胺键。当Lys用作连接子时，另一连接子可以插入Lys的ε-氨基基团和取代基之间。在一个具体实施方式中，另一连接子是琥珀酸，例如其与Lys的ε-氨基基团和取代基中存在的氨基基团形成酰胺键。在一个实施方式中，另一连接子是Glu或Asp(例如其与Lys的ε-氨基基团形成酰胺键并与取代基中存在的氨基基团形成另一酰胺键)，即，这种取代基是Nε-酰基化赖氨酸残基。
GLP-1激动剂活性分析
确定化合物是否具有GLP-1激动剂活性，可采用本领域内已知的任何方法进行实施。来自表达GLP-1受体(如人受体)的细胞的环状AMP(cAMP)生产可在存在和不存在这种化合物时进行测定，其中cAMP生产升高则表明这种化合物是GLP-1激动剂。
描述于美国专利申请公开No.2008/0207507中的一个实施例中，表达克隆的人GLP-1受体(BHK-467-12A)的幼仓鼠肾(BHK)细胞在加入100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、5％胎牛血清和0.5mg/mL遗传霉素G-418(Life Technologies)的DMEM培养基中生长。该细胞在磷酸盐缓冲盐水中冲洗2次后用维尔烯(Versene)收集。通过用Ultraturrax在缓冲液1(20mM HEPES-Na，10mM EDTA，pH 7.4)中均质化而从这种细胞中制备质膜。匀浆在48,000×g于4℃下离心15min。沉淀(颗粒，pellet)通过在缓冲液2(20mM HEPES-Na，0.1mM EDTA，pH 7.4)中均质化而悬浮，随后在48,000×g于4℃下离心15min。冲洗过程重复1次以上。最终的沉淀(颗粒)悬浮于缓冲液2中并立即用于分析或储存于-80℃下。
功能受体分析通过测定cAMP(作为对促胰岛素试剂的刺激的响应)而进行实施。形成的cAMP通过AlphaScreenTM cAMP Kit(Perkin Elmer LifeSciences)定量。培养在半区96-孔微孔板中以总体积50μL缓冲剂3(50mMTris-HCl、5mM HEPES、10mM MgCl2，pH 7.4)并添加以下物质而进行实施：1mM ATP、1μM GTP、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.01％吐温-20、0.1％BSA、6μg膜制剂、15μg/ml受体珠、20μg/mL用6nM生物素基-cAMP预培养的供体珠。将进行激动剂活性测试的化合物溶解并稀释于缓冲液3中。GTP每次实验都新鲜制备。板在黑暗中于室温下伴随缓慢搅拌培养3小时，接着在FusionTM仪(Perkin Elmer Life Sciences)中计数。浓度响应曲线对单个化合物描点作图并利用四参数逻辑模型以Prism v.4.0(GraphPad，Carlsbad，Calif)估算EC50值。
治疗应用
本发明的化合物能够应用于任何需要大脑中或特定组织中GLP-1激动剂活性的治疗应用中。GLP-1激动剂活性与刺激胰岛素分泌(即，起到肠降血糖素的作用)和抑制胰高血糖素分泌有关，由此有助于限制餐后血糖偏离。GLP-1激动剂也能够抑制消化道运动和分泌，由此起到肠抑胃素和部分“回肠刹车(回肠闸，ileal brake)”机制的作用。GLP-1也表现为食欲和食物摄取的心理调节剂。因为这些作用，GLP-1和GLP-1受体激动剂能够用于代谢紊乱的治疗，综述于例如Kinzig et al.，J Neurosci 23：6163-6170，2003中。这种紊乱包括肥胖症、高血糖症、血脂异常症、高甘油三酯血症、X综合症、胰岛素抗性、IGT、糖尿病性血脂异常症、高血脂症、心血管疾病和高血压。
GLP-1也具有包括镇静或抗焦虑效应的神经学效应，这描述于美国专利No.5,846,937中。因此，GLP-1激动剂能够用于治疗焦虑症、敌对行为、精神病、抽搐(发作，seizures)、惊恐发作、癔病或睡眠障碍。GLP-1激动剂也能够用于治疗阿茨海默氏病，因为GLP-1激动剂已经证实可保护神经元而对抗淀粉体-β肽和谷氨酸盐-引起的细胞凋亡(Perry et al.，CurrAlzheimer Res 2：377-85，2005)。
GLP-1激动剂的其它治疗用途包括改善学习、增强神经保护和缓解中枢神经系统的疾病或紊乱的症状(如通过调节神经发生)，如帕金森病、阿茨海默氏病、亨廷顿舞蹈症、ALS、中风、ADD和神经精神病综合症(美国专利No.6,969,702和美国专利申请No.2002/0115605)。采用GLP-1激动剂的神经发生刺激描述于例如Bertilsson et al.，J Neurosci Res86：326-338，2008中。
还有的其它治疗用途包括将肝干细胞/祖细胞转化成功能性胰腺细胞(美国专利申请公开No.2005/0053588)；预防β-细胞退化(美国专利No.7,259,233和6,569,832)和刺激β-细胞增殖(美国专利申请公开No.2003/0224983)；治疗肥胖症(美国专利No.7,211,557)；抑制食欲和引起饱腹感(美国专利申请公开No.2003/0232754)；治疗肠易激综合症(美国专利No.6,348,447)；降低与心肌梗塞相关的发病率和/或死亡率(美国专利No.6,747,006)和中风(PCT公开No.WO 00/16797)；治疗特征在于无Q-波性心肌梗塞的急性冠脉综合症(美国专利No.7,056,887)；减小术后代谢变化(美国专利No.6,006,753)；治疗冬眠心肌或糖尿病心肌病(美国专利No.6,894,024)；抑制去甲肾上腺素的血浆血液水平(美国专利No.6,894,024)；提高尿钠排泄，降低尿钾浓度(美国专利No.6,703,359)；治疗毒性血量增多相关的病症或紊乱，如肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合症、肝硬化、肺水肿和高血压(美国专利No.6,703,359)；诱发肌力反应和增强心肌收缩(美国专利No.6,703,359)；治疗多囊卵巢综合征(美国专利No.7,105,489)；治疗呼吸窘迫(美国专利申请公开No.2004/0235726)；改善经由非消化道的营养作用，即经由静脉、皮下、肌肉内、腹膜内或其他注射或输注(美国专利No.6,852,690)；治疗肾病(美国专利申请公开No.2004/0209803)；治疗左心室收缩功能不全，如异常左心室射血分数(美国专利No.7,192,922)；抑制胃肠运动，如用于消化道紊乱的治疗或预防，如腹泻、术后倾倒综合症和肠易激综合症，作为内视镜程序的术前用药(美国专利No.6,579,851)；治疗危重病性多发性神经病(CIPN)和全身炎症反应综合症(SIRS)(美国专利申请公开No.2003/0199445)；调节甘油三酯水平和治疗血脂异常症(美国专利申请公开No.2003/0036504和2003/0143183)；治疗缺血后血流再灌注引起的器官组织损伤(美国专利No.6,284,725)；治疗冠心病风险因素(CHDRF)综合症(美国专利No.6,528,520)；等等。
给予和剂量
本发明的特征还在于包含治疗有效量的本发明化合物的药物组合物。组合物能够配制用于各种药物递送系统。一种或多种生理可接受的赋形剂或载体也能够包含在合适制剂的组合物中。适用于本发明的合适制剂见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.，1985中。对于药物递送方法的简单综述，参见如Langer(Science 249：1527-1533，1990)。
药物组合物预期用于非肠道、鼻腔、外用、口服或局部给予(如通过经皮肤方式)，用于预防性和/或治疗性治疗。药物组合物可进行非肠道给予(如通过静脉、肌肉内或皮下注射)，或通过口服消化，或通过在由血管或肿瘤病症影响的区域进行局部施用或关节内注射。其它给予途径包括脉管内、动脉内、瘤内、腹膜内、腔室内、硬膜内、以及鼻、眼、巩膜内、眼窝内、直肠、外用或雾化吸入给予。缓释给予也特别地包含在本发明中，例如借助于储药池注射(depot injections)或易蚀移植物或组分。因此本发明提供用于非肠道给予的组合物，其包含上述溶解于或悬浮于可接受载体，优选水性载体，如水、缓冲水、盐水PBS等中的药剂。组合物可以包含按近似生理条件所需的药用辅助物质，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。本发明也提供了用于口服递送的组合物，其可以包含用于配制片剂、胶囊等的惰性成分，如粘合剂或填料。而且，本发明提供了用于局部给予的组合物，其可以包含用于配制霜剂、油膏等的惰性成分，如溶剂或乳化剂。
这些组合物可以通过传统的灭菌技术灭菌，或可以进行无菌过滤。所得的水性溶液可以就此包装待用，或冻干，冻干的制剂与无菌水性载体在给予之前合并。制剂的pH值典型地为3～11，更优选5～9或6～8，而最优选7～8，如7～7.5。固体形式的所得组合物可以包装于多个单剂量单元中，每个包含固定量的上述药剂或多种药剂，如包装在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也能够以灵活的量包装于容器中，如包装于设计用于外用霜剂或油膏的挤压管中。
含有有效量的组合物能够给予用于预防性和治疗性治疗。在预防应用中，组合物能够向临床确定对于代谢紊乱或神经学疾病具有倾向或易感性提高的主体给予。本发明的组合物可按照足以延缓、降低或优选防止临床疾病发作的量向患者(如人)给予。在治疗应用中，组合物向已经患有疾病(如本文中描述的那些代谢紊乱，或神经疾病)的主体(如人)以足以治愈或至少部分抑制病症症状及其综合症的剂量给予。足以实现这个目的的量定义为“治疗有效量”，足以基本上改善一些与疾病或医学病症相关的症状的化合物的量。例如，在代谢紊乱(本文中描述的那些)的治疗中，降低、预防、延缓、抑制或遏制这种疾病或病症的任何症状的药剂或化合物是治疗上有效的。治疗有效剂量的药剂或化合物并不需要治愈疾病或病症，但是将会提供对疾病或病症的治疗使得这种疾病或病症的发作得以延缓、阻滞或防止，或使这种疾病或病症的症状被改善，或使这种疾病或病症的期限被改变或者例如在个体中变得不太严重或加速恢复。
醋酸艾塞那肽典型地以5μg或10μg/剂量日服2次用于糖尿病的治疗。本发明的化合物可以按照醋酸艾塞那肽指定的相当剂量给予，可以按照较高的相当剂量(如10％、25％、50％、100％、200％、500％、1000％更高剂量)给予，或能够按照较低的相当剂量(如90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％的相当剂量)给予。这种用途的有效量可以根据疾病或病症的严重程度和患者的体重和一般状态确定，但是一般范围为约0.05μg～约1000μg(如0.5-100μg)醋酸艾塞那肽相当剂量的药剂或多种药剂/剂量/患者。初始给予和增强给予的合适方案典型地为初始给予然后是以一或多小时、天、星期或月间隔进行后续给予重复剂量。本发明组合物中存在的药剂的总有效量可以单剂量，作为丸剂或通过在相对较短的时期内输注给予哺乳动物，或可采用分级治疗方案(fractional treatment protocol)进行给予，其中多剂量在更加延长的时期内(如每4-6、8-12、14-16或18-24h一次，或每2-4天、1-2星期一次，每月一次的剂量)给予。另外，足以维持血液中治疗有效浓度的连续静脉输注被考虑在内。
在本发明组合物中存在和在本发明方法中用于哺乳动物(如人)的一种或多种药剂的治疗有效量能够通过普通的技术人员考虑哺乳动物的年龄、体重和病症的个体差异而确定。因为本发明的某些化合物表现出增强的穿过BBB的能力，本发明的化合物的量可低于(如低于或等于约90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％)未结合GLP-1激动剂治疗效果所需的相当剂量。本发明的药剂以有效量向主体(如哺乳动物，如人)给予，有效量是在治疗主体中产生所需疗效(如血糖降低、增重减小、减重增加和食物摄取减少)的量。治疗有效量也能够通过本领域的技术人员经验性确定。
患者也可以接受范围在相比于醋酸艾塞那肽为约0.05～1,000μg相当剂量1次或多次/每星期(如2、3、4、5、6、或7或多次/星期)、0.1～2,500(如2,000、1,500、1,000、500、100、10、1、0.5、或0.1)μg剂量/星期的药剂。患者也可以接受范围为0.1～3,000μg/剂量每2星期或3星期一次的组合物的药剂。
单次或多次给予包含有效量的本发明组合物能够通过治疗医师所选的剂量水平和方式实施。剂量和给予方案能够基于患者中的疾病或病症的严重程度进行确定和调节，这可以根据临床医师产用的或本文中所描述的方法在整个疗程中进行监控。
本发明的化合物可以结合传统治疗方法或疗法使用或独立于传统治疗方法或疗法使用。
当本发明的化合物结合采用其它药剂的疗法给予时，它们可以按序或同时向个体给予。可替换地，根据本发明的药物组合物可由本发明化合物连同本文中描述的药用赋形剂、本领域内已知的另一种治疗或预防药剂的组合构成。
实施例1
合成GLP-1激动剂-血管肽结合物
示例性GLP-1结合物，醋酸艾塞那肽-cysAn2N-端和醋酸艾塞那肽-cysAn2C-端、以及血管肽-1/醋酸艾塞那肽结合物，通过在1×PBS缓冲溶液中向cys-An2(SEQ ID NO：113)、An2-cys(SEQ ID NO：114)或血管肽-1(SEQ ID NO：67)中的硫化物结合[Lys(马来酰亚胺基己酸)39]醋酸艾塞那肽一小时而制备。由此生产出醋酸艾塞那肽/血管肽结合物，如图2中所示。
第二组醋酸艾塞那肽/血管肽结合物通过使具有结合至其N-端的马来酰亚胺基丙酸(MPA)、马来酰亚胺基己酸(MHA)、或马来酰亚胺基十一酸(MUA)的血管肽-2与[Cys32]醋酸艾塞那肽反应形成结合物而制得，如图3所示。
实施例2
醋酸艾塞那肽/血管肽-2结合物的原位脑吸收
为了测定大脑对醋酸艾塞那肽/血管肽-2结合物的吸收，我们采用了原位灌注分析。这种分析，描述于美国专利申请公开No.2006/0189515中，按照如下实施。标记的醋酸艾塞那肽和醋酸艾塞那肽/血管肽-2结合物的吸收采用原位脑灌注方法测定，这种方法适用于在实验室中进行小鼠脑中药物摄取的研究(Dagenais et al.，J Cereb Blood Flow Metab.20：381-6，2000；Cisternino et al.，Pharm Res 18，183-190，2001)。简单而言，用氯胺酮/甲苯噻嗪(140/8mg/kg i.p.)麻醉的小鼠右颈总动脉被暴露并在颈总动脉的分岔点的水平处，嘴至枕动脉进行结扎。随后总颈动脉用以肝素(25U/mL)填充并安装26-规格针的聚乙烯套管从嘴插入导管。装有灌注流体(在Krebs/碳酸氢盐缓冲液pH 7.4中的[125I]-蛋白或[125I]-肽，用95％O2和5％CO2充气)的注射器置于输液泵(Harvard pump PHD 2000；HarvardApparatus)中并连接至导管。在灌注之前，通过切断心脏心室而消除对侧血流分布。大脑以1.15mL/min的流速灌注5min。在灌注放射标记分子之后，大脑另外灌注Krebs缓冲溶液60s，而冲洗掉过量的[125I]-蛋白。小鼠随后被斩首而终止灌注并将右脑半球分离而在发生毛细血管减液(capillary depletion)之前放置于冰上。匀浆、上清液、沉淀(颗粒)和灌注液的等分试样用于测定其含量并评价分布的表观体积。
由这些实验，醋酸艾塞那肽/血管肽-2结合物的大脑分布都比未结合的醋酸艾塞那肽分布提高了15～50倍。醋酸艾塞那肽的脑分布观察为0.2mL/100g/2min，而在其N-端修饰的结合物观察为3mL/100g/2min，且在其C-端修饰的结合物观察为10mL/100g/2min。结果如图4所示。
实施例3
用醋酸艾塞那肽/血管肽-2结合物治疗肥胖小鼠
肥胖小鼠(ob/ob小鼠)被给予[Lys39-MHA]醋酸艾塞那肽/血管肽-2-Cys-NH2结合物(Exen-An2)。
测定醋酸艾塞那肽-血管肽-2结合物效力的体内研究
Figure BDA0000068259820000511
1.6μg/kg剂量的Exen-An2相当于1μg/kg剂量的醋酸艾塞那肽。每日测定每只小鼠的体重。食物摄取基于每组的平均值进行估算，而在治疗之后1小时测定血糖。在10天治疗后，以较高剂量的醋酸艾塞那肽或结合物治疗的小鼠的体重增加和食物摄取低于对照(图5)。相比于对照，在接受较高剂量的醋酸艾塞那肽或结合物的小鼠中食物摄取也减少(图6)。
血糖测定表明，较低剂量的结合结合物具有与较高剂量的醋酸艾塞那肽或Exen-An2的相同效果(图7)。因此，采用结合物，相比于醋酸艾塞那肽观察到了1/10的剂量对于血糖的类似效应。
实施例4
醋酸艾塞那肽-血管肽-2二聚体结合物的生成
采用本文描述的结合化学或类似的化学，生成具有如图8A所示结构的醋酸艾塞那肽-血管肽-2二聚体。简而言之，在[Lys39]醋酸艾塞那肽的C-端赖氨酸上的氨基通过第一血管肽-2肽的N-端苏氨酸上的MHA连接子结合至血管肽-2二聚体。N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)连接子连接至其N端的血管肽-2-Cys肽。通过这个半胱氨酸，血管肽-2-Cys肽结合至第二血管肽-2肽，其已被修饰而含有MPA连接子。这个二聚体通过MHA连接子连接至[Lys39]醋酸艾塞那肽。对照分子(Exen-S4)也采用在其N-端通过MHA连接子结合至[Cys32]醋酸艾塞那肽的半胱氨酸的血管肽-2的混杂形式(scrambed form)生成(图8B)。这些结合物制备成三氟乙酸(TFA)盐。
实施例5
醋酸艾塞那肽-血管肽-2二聚体结合物的表征
示例性GLP-1激动剂，醋酸艾塞那肽在未结合、结合至单个血管肽-2、结合至混杂血管肽-2(S4)、或结合至二聚体形式血管肽-2时原位测定其脑吸收。实验按照以上实施例2中所述进行实施。
由这些结果，我们观察到，醋酸艾塞那肽类似物结合至二聚体形式血管肽-2产生的结合物，相比于未结合的醋酸艾塞那肽或结合至单个血管肽-2的醋酸艾塞那肽，具有令人惊讶的更大的穿过BBB的能力(图9)。
我们也测试了醋酸艾塞那肽-血管肽-2二聚体结合物降低DIO小鼠中血糖的能力。小鼠注射含对照、醋酸艾塞那肽或醋酸艾塞那肽-血管肽-2二聚体结合物的推注液(bolus)。接受醋酸艾塞那肽或结合物的小鼠相比于接受对照的小鼠表现出血糖降低(图10)
实施例6
醋酸艾塞那肽-血管肽-2二聚体结合物的表征
示例性GLP-1激动剂，醋酸艾塞那肽在未结合、结合至单个血管肽-2、结合至S4、或结合至二聚体形式的血管肽-2时原位测定脑吸收。实验按照以上实施例2中所述进行实施。
由这些结果，我们观察到，醋酸艾塞那肽类似物结合至二聚体形式血管肽-2产生的结合物，相比于未结合的醋酸艾塞那肽或结合至单个血管肽-2的醋酸艾塞那肽，具有令人惊讶的更大的穿过BBB的能力(图8)。
我们也测试了醋酸艾塞那肽-血管肽-2二聚体结合物降低DIO小鼠中血糖的能力。小鼠注射含对照、醋酸艾塞那肽或醋酸艾塞那肽-血管肽-2二聚体结合物的推注液。接受醋酸艾塞那肽或结合物的小鼠相比于接受对照的小鼠表现出血糖降低(图9)。
其它实施方式
所有专利、专利申请，包括2008年10月15日提交的美国临时专利申请No.61/105,618，以及在本说明书中提到的公开，都结合于本文中作为参考，结合程度如同指出每一独立专利、专利申请或公开明确地且单独地被结合于本文中作为参考一样。

Claims (38)

1.一种具有下式的化合物
A-X-B
其中，A是能够穿过血脑屏障的肽；X是连接子；且B是GLP-1激动剂，或其药用盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，A包含基本上同一于选自SEQID NO：1-105、107-111、113和114构成的组中的序列的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，A是具有至少70％同一于选自血管肽-1(SEQ ID NO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)、Cys-血管肽-2(SEQ ID NO：113)和血管肽-2-cys(SEQ ID NO：114)构成的组中的序列的氨基酸序列的多肽。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中，所述序列同一性为至少90％。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中，所述多肽包含选自血管肽-1(SEQ ID NO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)、Cys-血管肽-2(SEQID NO：113)和血管肽-2-cys(SEQ ID NO：114)构成的组中的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中，所述多肽由选自血管肽-1(SEQID NO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)、Cys-血管肽-2(SEQ IDNO：113)和血管肽-2-cys(SEQ ID NO：114)构成的组中的氨基酸序列构成。
7.根据权利要求1-6任一项所述的化合物，其中，A是二聚多肽。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中，A是血管肽-2的二聚体。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中，所述化合物包含以下结构：
Figure FDA0000068259810000021
或其药用盐。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中，B包含多肽。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中，B包含醋酸艾塞那肽、或其具有GLP-1激动剂活性的类似物或片段。
12.根据权利要求10所述的化合物，其中，B是醋酸艾塞那肽、[Lys39]醋酸艾塞那肽、或[Cys32]醋酸艾塞那肽。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中，A包含血管肽-1(SEQ IDNO：67)、血管肽-2(SEQ ID NO：97)、Cys-血管肽-2(SEQ ID NO：113)或血管肽-2-cys(SEQ ID NO：114)。
14.根据权利要求1-13任一项所述的化合物，其中，X具有下式：
Figure FDA0000068259810000022
其中，n是2～15的整数；Y是A上的硫醇基而Z是B上的伯胺基，或者Y是B上的硫醇基而Z是A上的伯胺基。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中，n为3、6或11。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中，A是cys-血管肽-2(SEQ IDNO：113)、血管肽-2-cys-NH2(SEQ ID NO：114)而B是[Lys39]醋酸艾塞那肽，并且Y是A的半胱氨酸上的硫醇基，而Z是B的Lys39的ε-胺基。
17.根据权利要求1所述的化合物，其中，B是多肽而X是肽键。
18.根据权利要求1所述的化合物，其中，B是多肽，X是至少一种氨基酸，而A和B各自通过肽键共价结合至X。
19.一种编码权利要求17或18所述的化合物的核酸分子。
20.一种包含权利要求19所述的核酸分子的载体，其中，所述核酸可操作地连接至启动子。
21.一种制备权利要求17或18所述的化合物的方法，所述方法包括在细胞中表达由权利要求20所述的载体编码的多肽，并纯化所述多肽。
22.一种制备权利要求17或18所述的化合物的方法，所述方法包括在固体载体上合成所述化合物。
23.一种治疗患有代谢紊乱的主体的方法，所述方法包括以足以治疗所述紊乱的量给予权利要求1-18任一项所述的化合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述足量低于所述GLP-1激动剂未结合至所述肽载体时的相当剂量所需量的50％。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述量低于15％。
26.根据权利要求23所述的方法，其中，所述代谢紊乱是糖尿病、肥胖症、由肥胖症所致的糖尿病、高血糖症、血脂异常症、高甘油三酯血症、X综合症、胰岛素抗性、葡萄糖耐量降低(IGT)、糖尿病性血脂异常症、高血脂症、心血管疾病、或高血压。
27.根据权利要求23所述的方法，其中，所述紊乱是糖尿病。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述紊乱是II型糖尿病。
29.根据权利要求23所述的方法，其中，所述紊乱是肥胖症。
30.一种减少主体食物摄取、或降低主体体重的方法，所述方法包括向主体以足以减少食物摄取或降低体重的量给予权利要求1-18任一项所述的化合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述主体体重超重或肥胖。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述主体食欲过盛。
33.一种治疗或预防选自焦虑、运动障碍、敌对行为、精神病、抽搐、惊恐发作、癔病、睡眠障碍、阿茨海默氏病、和帕金森病构成的组中的紊乱的方法，所述方法包括向主体以足以治疗或预防所述紊乱的量给予根据要求1-18任一项所述的化合物。
34.一种提高主体中神经发生的方法，所述方法包括向所述主体给予有效量的权利要求1-18任一项所述的化合物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述主体患有帕金森病、阿茨海默氏病、亨廷顿舞蹈症、ALS、中风、ADD、或神经精神病综合症。
36.根据权利要求34所述的方法，其中，所述神经发生的提高在所述主体中改善学习或增强神经保护。
37.一种用于在主体中将肝干细胞/祖细胞转化成功能性胰腺细胞；预防β-细胞退化和刺激β-细胞增殖；治疗肥胖症；抑制食欲并引起饱腹感；治疗肠易激综合症；降低与心肌梗塞和中风相关的发病率和/或死亡率；治疗特征为无Q-波性心肌梗塞的急性冠脉综合症；减缓术后代谢变化；治疗冬眠心肌或糖尿病心肌病；抑制去甲肾上腺素的血浆血液水平；提高尿钠排泄；降低尿钾浓度；治疗毒性血量增多相关的病症或紊乱，如肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合症、肝硬化、肺水肿、和高血压；诱发肌力反应和增强心肌收缩；治疗多囊卵巢综合征；治疗呼吸窘迫；改善经由非消化道的营养作用，即经由静脉、皮下、肌肉内、腹膜内或其他注射或输注；治疗肾病；治疗左心室收缩功能不全(如具有异常的左心室射血分数)；抑制胃肠运动(例如，用于消化道紊乱如腹泻、术后倾倒综合症和肠易激综合症的治疗或预防，及作为内视镜程序中的术前用药)；治疗危重病性多发性神经病(CIPN)和全身炎症反应综合症(SIRS)；调节甘油三酯水平和治疗血脂异常症；治疗缺血后血流再灌注引起的器官组织损伤；或治疗冠心病风险因素(CHDRF)综合症的方法，所述方法包括向所述主体给予有效量的权利要求1-18任一项所述的化合物。
38.一种提高主体中GLP-1受体活性的方法，所述方法包括以足以提高GLP-1受体活性的量向主体给予权利要求1-18任一项所述的化合物。
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