JPS63503086A - インヒビンの分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インヒビンの分析法 本発明はインヒビンの分析方法、特にインヒビンの最近、ウシ卵胞液より分子量 が５８ＫＤおよび３ｉＫＤの二種のインヒビンが単一にｎ久された（国際特許出 願ｐａＴ／ＡＵ／８５１００１１９およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８５年、 １９８６年）。還元条件下で両者共それぞれ分子量４３ＫＤと１５ｘＤ、および ２０ＫＤとｉ　５ＫＤの二つのサブユニットから成る。

ウシ顆粒膜細胞ｍＲＮＡに由来するＣＤＮＡ［のクローニングおよび分析により 、それらのアミノ酸−次配列が明かにされた（国際特許出願ＰＯＴ　／ＡＵ８６ ／　０００９７　；Ｆｏｒａｇｅら、１９８６年）。これらの研究から３１ＫＤ のインヒビンは５８ｘＤ分子がプロセシングさレタモのであることを示す。１） ＦＦインヒビンと同じようなサブユニット構造の３ｌ−３２ＫＤインヒビン分子 が豚の卵胞液から単離され（Ｍｉ７ａｍＯｔＯら、１９８５’年、Ｌｉｎｇら、 １９８５年）、配列決定されている（　Ｍａｓｏｎら、１９８５年）。

現在、インヒビ／活性は各檀インビボおよびインビ１９８１年）。これらの系は 時間がかかり、費用も高く、アッセイの感度および精度に限界があり、多数の試 料に応用するには実用的でない（Ｂａｋｅｒら、本発明は今まで使用できたもの よりも便利なインヒる好ましいアッセイ法はラジオイムノアッセイであり、以下 の記載は好ましいアッセイ法に向けているが、本発明をラジオイムノアッセイに 限定して解釈すべきでない。本発明の範囲にある他のアッセイ法としては、ＥＬ ＩＳＡ法、螢光検出に基づいたイムノアッセイおよびインヒビンに対するポリク ローナルおよびモノクローナル抗体に依存した類似のアッセイ法がある。

発明の好ましｂ実施態様 本発明の一つの態様によると、インヒビン含有試料のインヒビン測定のための、 インヒビンに対して形成した抗体を用いるステップを含むイムノアッセイ法が提 供される。

好ましくは抗体は、天然または組換えインヒビン、またはサブユニット、断片、 或いはそれらの誘導体より成るグループから選択される抗原を動物に注射して誘 導した抗血清中に含有される。特に好ましいＶＣ，原はインヒヒン、楕久ウシ５ ３ＫＤインヒビン、摺入ウシ３１ＫＤインヒビン、ヒトインヒビン、或いは組換 えＤＮＡ技術を用いて生産したヒトまたはウシインヒビン或いはそれらの断片で ある。

適した動物としてはマウス、ウサギ、ウマ、ロバ、犬、羊および山羊などの哨乳 動物およびニワトリのような鳥類がある。

或いは、上述のインヒビ７のいずれかに対して形成されたモノクローナル抗体ま たは工ｇＧを用いることも出来る。

最も好ましくは、抗体はインヒビ７の生物活性を中和することが出来る。

好ましくはイムノアッセイはさらに標識した５８ＫＤマタは３ｉＫＤインヒビン をトレーサーとして用いるステップを有する。さらに好ましくは該トレーサーが １２５沃素（１２吋）、酵素、或いは螢光マーカーで標識される。

好ましくはアッセイはラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着測定法（Ｅ Ｌ工ＳＡ　）　、或いは螢光イムノアッセイである。

本発明は種々の動物（ヒトを含む）由来の卵胞液または血清などの試料中のイン ヒビ７を測定するための方法で、測定試料中のインヒビ７および１２５工標識イ ンヒビンのクシ５８ＫＤインヒビン抗血清との拮抗結合とそれに続く結合１２５ 工標にインヒビ７の沈でんおよび測定により、卵胞液または血清中のインヒビン 濃夏を標準液中のイ：／ヒクン勇度から計算するものである。

本発明の好ましい特有のインヒビンラジオイムノアツセイ系はウシおよびヒト卵 胞液および血清に応用でき、沃素化３ｉＫＤまたは５８ＫＤインヒビンをトレー ・サーとして用いて（ａｉｍしたウシ）５８ＫＤインヒビンに対する抗血清を使 用できる。

−本発明の二つ目の態様としては、クロラミンＴ法を用いたインヒビ７の沃素化 およびアフィニティー分画ステップによる１２５エーインヒビンの精製のステッ プかう成る１２５ニー標識インヒビントレーサーの調製および精製の方法を提供 する。

好ましくはアフィニティー分画のステップでＭａｔｒｅｘ　Ｒｅｄ　Ａを用いる 。

好ましくは精製段階でゲルＩＩ！過ステップをさらに含む。

本発明の三つ目の態様として、天然に存在するインヒビ７または組換えインヒビ ７、或いはそれらの断片または誘導体より成るグループから選択されるアッセイ 標準を提供する。好ましくは標準はアッセイに於いて試験中の試料と対応を示す 。

特に好ましい標準としてはウシ３ｉＫＤインヒビン、および部分精製または精製 ヒトインヒビンがある。

アッセイの条件、特にインキュベーション時間は目的の感度を得るために変わる 。

感度を高めた改良型ラジオイムノアッセイは以下より成る： 試料および抗血清を４℃で４日間インキュベートし、次に１２５ニー３１ＫＤイ ンヒビントレーサーを添加して４℃で３日間インキュベートシ、二回目の抗体を 添加し、沈でんさせて結合した１２５工標識インヒビンを測定する。

特に好ましいヒト血清試料中のインヒビン測定に適した実施態様では、トレーサ ーは１２５ニー　３１　Ｋ　Ｄインヒビンであり、非特異効果を最小限にするた めにトレーサーとのインキュベーションをインヒビン非含有血清存在下で高温（ ３０°Ｃ）で行なう。インヒビン非含有血清の適当な材料は雄子牛またはその他 の去勢した雄の動物、卵巣を摘出した女性、未成熟の卵巣不全症の女性および閉 経期後の女性などである。

第１図は１２５ニー５３ＫＤおよび１２５ニー　３１Ｋ　Ｄインヒビンの還元下 における分析用ＳＤＳ　−ＰＡＧＥの分画を示す。

第２図はウサギを５３ＫＤインヒビンで免疫処理した時の経時変化を示す。

第３図は５８ＫＤインヒビンに対して形成した抗血清によるｂＦＦインヒビンの インビトロの中和反応ヲ示す。

第４図は１２５ニー３１ＫＤまたは１２５ニー５８ＫＤイ精製５８ＫＤおよび３ １ＫＤインヒビンおよびウシ顆粒膜細胞培養培地（ＢＧＣＭ　）のラジオイムノ アッセイ検量曲線を示す。

第５図はＲｏｂｅｒｔｓｏｎら（１９８６年）のインヒビン′ｎＩｇ法の各ステ ップでのｂＦＦ’の分画後のインヒビ７のインビトロ生物活性および免疫活性の プロフィルを示す。

第６図は１２５ニー５８ＫＤおよび１２５ニー３ｉＫＤインヒビンを血清インヒ ビンのＲ１で使用する条件下でｔ）ＦＦおよび血清とインキュベートした後の非 還元５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィルを示す。

第７図は１２５１−３ｉＫＤインヒビンの抗血清への結合に対する温度の影響を 示す。

第８図は１２５ニー３１ＫＤインヒビンをトレーサーとして使用したプラズマＲ ＩＡ系に於けるウシおよびヒト血清のロジットーログ検量線を示す。

第９図は人工受精（工ｖｙ　）プログラムに関与した２６名の女性および１名の 正常女性（、＃２７）の排卵誘導およびＦＳＨ，ＬＨ，インヒビ７およびエスト ラジオール（Ｒ２）の血中レベルを示す。

第１０図は第９図のいくつかのデータについて血中Ｅ２およびインヒビン量の比 較である。

第１１図は血清中の形成された卵子の数とＲ２またはインヒビン量との相関関係 を示す。

第１２図は超音波により検出される卵胞の数と血清中のインヒビン最大量との間 の相関関係を示す。

第１３図は卵母細胞回復後の非妊娠検体（ｎ＝１６）の血清中のインヒビン、Ｆ ＳＨ，プロプステロンおよびエストラジオールの量を示す。

第１４図は卵母細胞回復後の妊娠検体（ｎ−３）の血清中のインヒビン、ＦＳＨ ，プロプステロンおよびエストラジオールの含量を示す。

第１５図は非妊娠検体の黄体期の血清インヒビンおよびＦＳＨの関係を示す。こ の分析でインヒビンの値が検出できなかったのは（ｎ−２９）アッセイ感度の限 界のためと思われる。

第１６図は正常女性の月経周期中の抗−３ｉＫＤインヒビンを用いて測定したイ ンヒビン、ＦＳＸ、ＬＨ。

エストラジオールおよびプロプステロンの血中濃度をｂｙＦ：ウシ卵胞液 ｈＦＦ：ヒト卵胞液 ｏＦＦ　：ヒツジ卵胞液 ｏＲＴＦ　：ヒツジ翠丸網液 ＨＰＬ（１！　：高速液体クロマトグラフィー５ＤＳ−ｐＡＧＥ：　ドデシル硫 酸ナトリウムポリアクリルアミドデル電気泳動 Ｒ工Ａ　ニラジオイムノアッセイ ＳＳ　：雄子牛血清 ＢＳ　：雄牛血清 Ｏ８＝雌牛血清 ＦＭＳ　：ヒト閉経後血清 ＲＦＰ　：ヒト雌プラズマ ｂＦＦ　３１Ｋ　Ｄおよび５８ＫＤインヒビンの精製は既に報告されている方法 （Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８５年、１９８６年）に基づいた（第５図−）。

（ａｌ　ｂＦＦを０．０５　Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ７，０中でセファクリル ５２００（９ｘ９０α）のデル濾過カラムで分画した。

（ｂｌ　（ａｌのボイド画分をｐＨ４，７５で沈でんさせ、４Ｍ酢酸中でセファ デックスＧ１００（９Ｘ９０α）で分画（ｃｌおよび（ａ （ｂｌのビークＩ　（５８ＫＤインヒビン）およびピーク１１（３１ＫＤインヒ ビン）画分を０．１％トリフルオロ酢！中０−５０％アセトニトリル勾配を用い たＲＰＳＯＵｌｔｒａｐｏｒｅのカラム（０，４６ｘ　７．６ｃｍ、ベックマン ）で分画した。第５図で連続した線は（ａｌと（ｂ）は２８　ＯｎＩｎ、　（ｃ ｌと（ａ）は２５４　ｎｍの吸光度を表わす。

斜線部分はインヒビンの生物活性を示す。

Ｏ・・・・・・０１２５ニー５８ＫＤインヒビンヲトレーサーとしたＲ工Ａ０ □□□−−ラ１２５ニー３１ＫＤインヒビンをトレーサーＢＳＡ−ウシ血清アル ブミン（分子量、６７，０００　）。

０ＶＡ−卵アルブミン（分子量、４３．０００　）。

ｎ尖インヒビンはＳＤＳ電気電気溶面緩衝液１　［１ｍＭＮＨ４ＨＣ０３中およ そ３％ＳＤＳ　）中で保存して沃素化を行なった。バイオアッセイではＳＤＳを 除去するためにメタノール沈でんを一２０℃で行ない、３７℃で１時間加熱して 可溶化後音波処理した。

インヒビン精製過程で生物活性インヒビンと免疫活性インヒビンとは同じプロフ ィルを示した。精美３１ＫＤおよび５３ＫＤインヒビンの多くの調製物で両トレ ーサーを用いたラジオイムノアッセイで生物活性と免疫活性との比は０．３０− ０．４３の範囲であった。

（ｂｌ試料の調製 ヒト卵胞液はメルボルンのニブワース病院（Ｅｐｗｏｒｔｈ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ 　）、クイーンビクトリア医療センター（Ｑｕｅｅｎ　Ｖｉｃｔｏｒｉａ　Ｍｅ ｄｉｃａｌ　Ｃ！ｅｎｔｅｒ　）の人工受精プログラムの卵母細胞コレクション から入手した。

卵胞液を炭素処理（１００ｍｙ／ｍｌのデキストリン被覆炭素で４°０１１時間 ）シ、凍結乾燥して一２０℃で保存する。アッセイの前にアッセイ緩衝液または 培養培地中で音波処理して溶解した。ヒツジ卵胞液（ＯＦＦ　）は地元の屠殺場 で集めた卵巣を吸引して得られた。ヒツジ皐丸網液は凍結乾燥インヒビン調表物 （Ｂａｋｅｒら、１９８５年）である。ラッテ卵巣抽出物は炭素処理のラッテ卵 巣細胞質調製物である。これらのインヒビン調製物の生物活性の詳細は第１表に まとめである。

排卵誘発療法（クエン酸クロミアエンおよびヒト閉経期向生殖腺細胞治療）を受 けている４０人の女性からプラズマ採取時のプラズマエストラジオール含量が４ ０−２．９００　ｐＥ／ｍｌの血液をリチウムヘパリン管に採取した。各検体か ら等量の血清を合わせてヒト女性の女性からのプラズマを合わせて閉経後血清プ ール（ＦＭＳ　）と呼ぶプールを得た。

ウシ血液、卵巣および精巣は地元の屠殺場から水冷採取し、１時間以内に処理し た。全ての試料は固体Ｃｏ２／エタノール中で急凍結し、−２０℃で保存した。

未処理成熟検体（ＢＳ、ｎ−９）および去勢雄（Ｓ　Ｓ。

ｎ−１）および雌（ａｓ、ｎ＝１０）ウシからの血液プールは遠心分離して保存 する前に４℃で一晩凝固させた。ウシ卵巣小胞を片側切断して顆粒細胞を吸引し て集め、ウェル当り１０５の生細胞数の濃度で４００μｌＤＭＥＭ　／　Ｆ　１ ２完全培地中で４０時間培養した（コスタ−４８穴プレート）。アッセイまで培 養物は一２０°Ｃで凍結保存した。４頭の雄牛からの精巣は被膜除去して等ｗ／ ｖのデルベツコりん酸緩衝液中でウルトラーチュラツクス（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒ ｒａｘ　）組織分散機（Ｊａｎｋｅａｎｄ　Ｋｕｎｋａｌ　Ｋ　Ｓ　、スタウフ エン、西独）を用いてホモジナイズし、１００，０００，９Ｘ１時間４℃で遠心 分離してから一２０℃で保存した。アッセイの前に上澄液をデルベツコのりん酸 緩衝液中１％のＮｏｒｉｔ　Ａの等量で炭素処理し、遠心分離およびアッセイの 前に４°Ｃで３０分間インキュベートした（　Ａｕら、１９８３年）。

免疫処理の方法 精製５８ＫＤインヒビン（５００μｌのデルベッコのりん酸緩衝液中１４μｇ） を等量のアジュバント（Ｍａｒｃｏｌ　５２［Ｅｓ５ｏ　、オーストラリア、： ｌ　：　Ｍｏｎｔａｎｉ＋ｄｅ８８８　（ｓ、Ｅ、ｐ、ｐ、工、ｃ、パリ〕を９ ：１の割合）で乳化し、未処理の雄ニューシーラント白ウサギに皮肉６ケ所、皮 下１ケ所注射した。１４μｓの二回のブースター注射を同条件下で６週目および １年目に行なった。

実験中血清を集めてインビトロの中和活性、沃素化インヒビンへの結合活性およ びプラズマＦＳＨ含量を確認した。

同様な方法を用いてｆｉｆ表３１ＫＤインヒビンに対する抗体も形成させた。

１２５Ｉ　−５８ｘ　Ｄインヒビンの実験では０．５％ＢＳＡ　。

１２５ニー３１ＫＤインヒビンでは０．５％ボリペプを含有する１　００　ｍＭ りん酸緩衝液ｐＨ７，４の等量中で血清およびｂＦＦを種々の温度でインキュベ ートした。等量（５μｌ）の試料および１０％ＳＤＳおよびデルベラコノリン酸 緩衝液ｐＨ７，４（３０μｌｌ）を沸とう湯浴中２分間、続いて水中に置く。次 にグリセ。−ル（６２，５％水溶液）中のプロモフェノールプ”−（０，００６ ％）１０μｌを添加してから混合液を遠心分離し、１２．５％のスラブデルで電 気泳動にかける（３時間、２０−２０−３Ｏ。

蛋白質分子量マーカーはｂＦＦおよび血清非存在下で沃素化試料と一緒に電気泳 動にかけるか、これらの存在下で別の列でかげる。ゲルは固定し、ｏ、１％クマ シーブリリアントプルー含有のエタノール二Ｈ２ｏ：ホルムアルデヒド（１８０ ：４２０：１００）中−晩染色した。各列を５０個の２　＊ｚ断片に分け、ガン マ−測定計で計測した。

逆相ＨＰＬＯ １２５エーインヒビンをＵｌｔｒａｐｏｒｅ　ＲＰＳＯカラム（０−４６Ｘ　７ ．５　ｃｍ、ベックマン、米国カリポルニア州、バークレイ）にのせ、ウォータ ーズＨＰＬＯ装置（モデル６０００Ａポンプおよびモデル６６ｏプログラマ−１ 米国マサチュセッッ州ミル７オルド）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸中の０ ．５０％アセトニトリルの直線勾配でｉ　ｍｌ　／　ｍｉｎおよびＱ、５＋＋ｔ Ａ！分画で分画した。

インビトロのバイオアッセイ インヒビン活性はラッテ下垂体細胞培養に於ける濃度依存のＦＳＨ細胞含量の抑 制に基づくインビトロのバイオアッセイで、平行線バイオアツセイデデイン（５ ｃｏｔｔら、１９８０年）を利用して決定した。炭素処理したウシ卵胞液調製液 はリンパ液の対照物を用いて１単位／■の任意のユニット（５ｃｏｔｔら、１９ ８０年）を採用した。

ウサギＦＳＨはＡ、Ｆ、　ＰａｒｌＯｗ　ｌｖ±（米国力リホルニア州、トラン ス）により有難く提供されたＲ工Ａキットを用い、結合および遊離ホルモンを分 離するのに１５％ポリエチレングリコールを採用して測定した。アッセイの感度 はウサギＦＳＨＡＦＰ、　５３８．０を標準として用いて０．９　ｎ、９／ｍｌ であった。アッセイ内の偏差の度合は８．１％で、全ての試料を一回のアッセイ で測定した。

（１１）ラッテＦＳＨのラジオイムノアッセイ下垂体細胞の培養で生成するラッ テＦＳＨはＮ工ＡＭＤＤにより供給される試薬を用いた特異的ラジオイムノアッ セイにより測定した。１２５１−ラッテＦＳＨ（工５）をトレーサーとして用い 、ＦＳＨＲＰ−２を標準として使用した。アッセイ内の偏差の度合は７％であっ た。

ｆｉｉ）ヒトホルモンのＲＩＡ 血清ＦＳＨは二回目の工ＲＰ　ＦＳＨを標準として用いたＲＩＡ　（Ａｍｅｒｌ ｅｘ　−Ｍ　、米国アマ−ジャム社）により測定し、３１回のアッセイからのア ッセイ間のＣｖは７．０％であった。ＬＨは二回目の工ＲＰ　Ｌ　Ｈを標準とし て周込たＲＩＡ（ＬＨＲ工Ａ、米国ルイジアナ州、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｐｒ ｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒｐ、　）により測定し、６１回のアッセイでアッセイ間の ＣＶは１０．１％であった。

ニスドアジオールおよびプロプストロンの両者はＲＩＡ（Ｃｏａｔ−ａ−Ｃｏｕ ｎｔ　、ルイジアナ州、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒｐ、　 ）を用いて測定し、１５０回のアッセイからのアッセイ間のＣＶはそれぞれ８． ７％および８．１％であった。血清中のｂｃＧベーターサブユニットはｈｃｏ二 回目の工Ｓを標準として用いたＲＩＡ　（Ｂ−ｈｃ。

ＲＩＡ−Ｑｕａｎｔ　、米国セントルイス、ＭｉｌｌｌｎＣｒＯｄｔ社）により 測定し、３０回のアッセイでアッセイ間のＣＶが１０．４％であった。

計算 ＲＨｋによる検量曲線はロジット一対数濃度変換を用いて直線化した。異なる大 きさのグループの倍数範囲テスト（Ｋｒａｍｅｒ、１９５６年）を用いて或いは 対を一検定により検量曲線の勾配値を比較することから対応性を確認した。活性 値は標準平行線バイオアッセイ統計を用いて決定した。測定試料と標準物質の検 量曲線間に対応性が認められない場合には、活性値はそれらのＥ　Ｄ５゜値の比 から決定した。感度（ＥＤよ。）はアッセイで１０％の置換を示すのに必要なホ ルモンの量として定義し、一方ＥＤ５ｏは５０％の置換を示すのに必要な量に相 当する。

アッセイの精度を示すのに精度指数（Ｇａｄｄｕｍ　。

１９３６年’；　Ｆｉｎｎｅｙ、１９６４年）を用いた。アッセイ間の偏差は部 分ｎＩ尖インヒビンのくり返し測定の偏差係数から計算した。解離定数（Ｋｄｌ ｅ　）は１２５１−ホルモンおよび異なる量の非標識ホルモンを用いて５ｃａｔ ｃｈａｒｄ分析により決定した。分析に使用した１２５ニーホルモンの量はその 比活性（μＣｈｉ／μ、！７）から決定した。

本発明は以下の例を参考に説明するがそれらに限定されるものではない。

５８ＫＤおよび３ｉ　ＫＤインヒビンに対する抗血清は免疫処理後にプラズマＦ ＳＨおよびインヒビン抗体価に対応した変化が観察されることがわかり、これは インビボでのインヒビン中和反応を示す。抗血清はインビトロのバイオアッセイ で１）ＦＦ　、　ｈ汁および精製した３１ＫＤおよび５８ＫＤインヒビン活性を 中和した。

以下に記載する結果は抗−５８ＫＤインヒビンに関するものであるが、抗−３１ ＫＤインヒビンを用いても同様な結果が得られた。

（ａｌ免疫処理に対するインビトロの応答第一回目のブースター（第２ａ図）後 、抗体がインビトロでインヒビン生物活性を中和する能力および１２５１　５８ ＫＤインヒビンへの結合能によりその抗体価が確認された。ブースター注射後１ −８週間にこれらの活性の急激な上昇が観察された。この期間に血清ＦＳＲの有 意な（Ｐ　Ｏ，０５）上昇＜　６．６３±０．９５　ｎ９／ｒｎｌ。

ｎ＝５ｖｓ４．９７ｆＯ，８７ｎＪ／ｍ／、ｎ＝６’ｃ平均±Ｉ　５Ｄ））が見 られた。二回目のブースター（第２ｂ図）直後に血清の１２５ニー３ｉ　ＫＤイ ンヒビン結合能および血清ＦＳＨの持続した上昇が観察された。血清ＦＳＨの対 照値は過去５ケ月間に亘る１４回の観察の平均＋２８．Ｄ、から確認された（第 ２ｂ図斜線部分）。

これらの結果はウシ卵胞液からＮ製したインヒビンを用いてウサギを免疫処理し てインヒビン生物活性を中和する抗血清を生成させることが出来ることを示す。

抗血清価（沃素化インヒビン結合およびインビトロの中和能により確認）のピー ク時期にウサギのプラズマＦＳＨ含量が上昇することより、形成した抗体が内在 インヒビンを中和する能力があることを示す。インビボおよびインビトロの両方 でのインヒビン中和および中和活性と沃素化インヒビン結合能の強い関連性はこ の抗血清の特異性を証明する。

（・ｂ）インビトロのインヒビン中和 つシ卵胞液インヒビン（２単位）を培養ウェル当り１μｊの抗血清で定量的に中 和したところ、ウェル当り０．３５μｌで生物活性の７５％阻害が見られた（第 ３図、第１表）。第３図で垂直な点線はインヒビン活性の７５％中和に必要な抗 血清量を示し、これを抗血清中和価の任意パラメーターとする。ｆｌ＃製した５ ８および３ｉＫＤインヒビンはそれぞれ０．３６および０．６８μｌで対応する ７５％阻害を示した。比較として、ｈＦＦインヒビン生物活性の中和には１．３ ２μｌを必要としくｎ＝２、第１表）、ｂＦＦインヒビンと比較して２７％の交 叉反応性を示した。ヒツジ由来（卵胞液、畢丸網液）のインヒビンはそれぞれ８ および６％の交叉反応性を示した。

この抗血清は毒性を示さない最大量のウェル当り４μ！でもラッテ卵巣細胞質抽 出物のインヒビン活性２単位を中和しなかった。

５８ＫＤまたは３ｉＫＤインヒビンの沃素化は従来のクロラミンＴ沃素化法を用 いて行ない、沃素化によるかなりの損傷を伴なった。従ってトレーサーのｒＩ製 を必要とし、セファデックスＧ２５のゲル濾過クロマトグラフィーでは精製でき なかった。沃素化ホルモンをＭａｔｒｅｘ　Ｒｅｄ　Ａに特異的に結合すること で満足いくｎ１表が出来たが回収率は低かった。このようにｈａした沃素化イン ヒビンはいずれも非沃素化と同じ物理化学的性状を有した。

イオドジエン（工ｏｄｏｇｅｎ　）　、イオドビーズ（工ｏｄｏｂｅａｄｓ　） 、ラクトパーオキシダーゼ、或いはポルトン−ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎ ｔｅｒ　）試薬を用いた他の沃素化法はインヒビン分子に与える損傷は少なかっ たが、放射活性の取り込みが低かった。従ってクロラミンＴを用いた沃素化の方 が好ましかった。

インビトロのインヒビン中和反応およびラジオイムノアッセイによる各種インヒ ビンの交叉反応性インビトロの中和反応 １２４ニー　５８　Ｋ　Ｄインヒビン ウシ　５２００　０．３５±０．０４（６）　１００ヒト　１６８土３２（６） 　１．３２　（２）　２７ヒツジ　２７．０００（２）　４．４　（２）　８． ０卵巣抽出 ラッテ　３８４　（２）　＞　６　（２）　＜　６．０ヒツジ　１０４０”　＞ ６．０　（１）　＜６．０平均上ＳＤ（ｎ） 第１表（続き） ラジオイムノアッセイ ′ｋ“１６Ｕインヒビンでも置換なし 平均上Ｓ　Ｄ　（ｎ） 絹製した５８ＫＤまたは３１ＫＤインヒビン（２５μｌの電気泳動溶出緩衝液中 １−２μｇ）を０．５Ｍりん酸緩衝ｇｐＪ（７，２の２５μｌに添加した。

Ｎａ１２５工（０，５ｍｃｉ　、５　μｌ　ｙ　英国ハックス、アマージャム社 ）を添加する。クロラミンＴ（４０μｌ）をクロラミンＴとホルモンの割合が８ ：１となるように添加した。反応を室温で６０秒間攪拌して進行させ、２０μｌ の異性重亜硫酸す）　ＩＪウム（３ｍ９７ｍｌ”）で終結させた。反応液を０． １％ＢＳＡまたは０．５％ボリペプ（Ｓｉｇｍａ社１米国ミズリー州、セントル イス）加２Ｑ　ｍＭりん酸緩衝液ｐＨ６，０で５０μｌとし、セファデックス０ ２５カラム（ＰＤ１０１ファルマシア社、スウェーデン、ウプサラ）でゲル濾過 して１２５工を除去した。ボイド量の画分を集めて２０ｍ１とし、２ｏｏμｌの Ｍａｔｒｅｔ　Ｒｅｄ　Ａカラム（アミコン社、米国マサチュセツツ州、ダンバ ース）にのせて４００ｍＭ’　ＭＣＩ含有のりん酸緩衝液で洗い、洗液は捨てる 。１２５１−インヒビンはりん酸緩衝液中ｉＭＫＯ１／４Ｍ尿素で溶出した。沃 素化インヒビンはさらにＸａ１／尿素を除去するために適当なＲ工Ａ緩衝液（下 記参照）を用いてセファデックス０２５カラム（ＰＤｌｏ）でゲル濾過した。

５８ＫＤおよび３１ＫＤインヒビンの沃素化後、セファデックスＧ２５クロマト グラフイーのボイド量にそれぞれ６０μＣ１および２５μＣ１が回収された。お よそ３０％が１ＭＫｃ！ｌ／尿素緩衝液で溶出した。ＳＤＳ　−ＰＡＧＥでの分 子量からの確認で１２５エーインヒビンはこの画分に認められた。

沃素化物の比活性は、沃素化に用いたホルモンを標準とした自己置換法（Ｍａｒ ａｎａら、１９７９年）を使用したラジオイムノアッセイで確認した。５８ＫＤ インヒビンで５０−６０μＣ１／μ１３１ｘＤインヒビンで２４μｃｉ　／μｇ の比活性が得られ、回収率は５−２５％の範囲であった。

例　３　沃素化インヒビンの性状 ＲＰ　−ＨＰＬＣ！およびＳＤＳ　−ＰＡＧＥを用いて１２５エーインヒビンの 物理化学的性状を調べた。５８ＫＤおよび３ｉＫＤのいずれについても放射活性 プロフィルと生物活性プロフィルの間に近い対応が見られた（データは示してい ない）。ＳＤＳ　−ＰＡ（）Ｅでの１２吋−５８ＫＤインヒビンの分子量は非還 元（５８ＫＤ）および還元（４３ＫＤおよび１５ＫＤ）条件下共に精製非沃素化 インヒビンと同じようであった。但し、還元条件下で未知の５８ＫＤ物質が比較 的少量（１８％）観察された（第１図）。使用した分子量マーカーはＢＳＡ　（ ウシ薄情アルブミン）　６７，０００　；　ＯＶ　（卵アルブミン）４３．００ ０　；　ＯＡ　（カルボニックアンヒドラーゼ）２９．０００　；　Ｇ　Ｌ　（ ガチョウ卵リゾチーム＞　２０，３００；およびＣＬにワトリ卵リゾチーム）　 １４．３００である。第１図の矢印は試料をのせた位置を示す。４７番目の画分 以後に見られる放射活性は浴媒先端の遊離沃素を表わす。沃素化に使用したイン ヒビンの純度をＳＤＳ　−ＰＡＧＥ上の銀染色で調べたところ、１２５ニー５８ ＫＤ物質は沃素化された混在物でないことを示唆している。確認のため１２５ニ ー５８ＫＤインヒビンをｐＨ３，５−１０および４−８の範囲でミクロ等電点電 気泳動で分画した結果、ｐ１値が７．４．６．２および５．２に放射活性ピーク が検出された。ＳＤＳ　−ＰＡＧＥで還元するとこれらのどのピークも１２５ニ ー５８ＫＤ物質を有した。

この結果は１２５ニー　５８　Ｋ　Ｄ物質は混在蛋白の沃素化によるものでなく 、沃素化したホルモンが還元され難いことに起因すると示唆する。

１２５ニー３ｉ　ＫＤインヒビンをＳＤＳ　−ＰＡＧＥ　テ分画すると非還元条 件下で３０．２００の分子量、還元すると２０．０００および１５，０００のサ ブユニットを示した。

これらの値は非沃素化ホルモンの値と類似している。

いずれのトレーサーを用いても二つ目の抗体Ｒ，ｌ系で精ｍ３１ＫＤおよび５８ ＫＤインヒビンとの間に対応した置換が観察された。

例　４　ラジオイムノアッセイ法 使用したアッセイ用緩衝液は１３ｍＭりん酸、Ｑ、１５　Ｍ　Ｎａ１ｌ、０．５ ％ＢＳＡ　ＸＰＨ７，２である。トレーサー添加を遅らせた二つ目の抗体アッセ イ系を用いた。

試料および抗血清を３００μｌの容量で室＠１６時間インキュベートシ、１２５ エ−イ７ヒヒ７（１ｏ、ｏｏｏｃｐｍＮ１００μｌ）を添加してさらに室温で一 晩、または４°Ｃで４８時間インキュベーションを続ける。二番目の抗体（ウサ ギエｇＧに対する山羊抗血清、１ｏｏμｌ）を添加し、４℃で１時間インキュベ ートしてから６％ポリエチレングリコールを１ｍｌ加えた。管を攪拌混合してさ らに３０分間インキュベートして４°Ｃで２０００．９３０分間遠心分離後、上 澄を取って計測した。

アッセイ緩衝液にトリトンＸ−１００を加えると（終濃度０．０２５％）非特異 結合を４から０．５％に低下させることが出来る。

３ｉＫＤおよび５８ＫＤインヒビントレーサーの両方を用いてラジオイムノアッ セイ法を確立した。検量曲線のロジットーログ濃度変換後、各トレーサーの直接 的置換がインヒビン試料の範囲内で観察された。但し、３１ＫＤインヒビンで１ ２５１−５８ＫＤインヒビンをトレーサーとして使用した時ロジン）　−０，５ （６８％Ｂ／Ｂｏ）以下で直線性からはずれた（第４図）。

第４図で各値はミロの平均上ＳＤを表わす。各アッセイの特性を第２表にまとめ る。５ｃａｔｃｈａｒｄ分析からどちらのインヒビンにも抗血清に対する同じよ うな親和性があることがわかった。ｂＦＦと１２５１　３１　Ｋ　Ｄインヒビン をトレーサーとした３１ＫＤインヒビンまたは１２５ニー５８ＫＤインヒビンを インヒビントレーサーとした５８ＫＤインヒビンとの間に非対応検量曲線が見ら れた。いずれのホルモンでも各アッセイの感度（ＥＤよ。）およびＥＤ５ｏ値は 同等であった。

第　２　表 １２５ニー３１ＫＤ　１２５ニー５８ＫＤインヒビン　インヒビン 抗体希釈　１　：８０００　１　：４０００トレ一サー結合（ＢＯ）　３０％　 １８％親和性（ｌｉｅ）　ｘ　Ｏ，６６０，７２１０−”Ｍ、２０°Ｃ ＥＤｌｏ（ｎｇ、ｆｍ） ３１ＫＤインヒビン　０．１０，３．０　０．１３．’４．４５８ＫＤインヒビ ン　０．０７，１．２　０．１３，２．２Ｅ　Ｄ５０（ｎｇ） ３’ｉＫＤインヒビン　０．３０　１０．１　０．５１．１７．１５８ＫＤイン ヒビン　０．２６　４．３　０．４３．　７．０勾配” ｂＦｙ　１．３７　＝ｌ＝　０．０９ａ（８）　１．４７　±０．０９°（８） ３ｉＫＤインヒビン　１．５３±０．０９ｂ（５）　１．６８±０．０８　（３ ）５８ＫＤインヒビン　１．５０±０．０７（３）　１．７３±０．１４（ｌ（ ５）第　２　表　（続き） １２５ニー３１ＫＤ　１２５ニー５８ＫＤインヒビン　インヒビン 精度”　０．０３６　（５）　０．０３８　（５）アッセイ間の　１４　（５） 　８．５％（５）偏差″“ Ｂｉｏ／Ｉｎｎ比 ３１ＫＤインヒビン　０．３４±０．０９（１６）　０．４３±０．１３　（４ ）５８ＫＤインヒビン　０．３０±０．１２（７）　０．３７±０．１２　（５ ）ＢＧＣＭ　０．２５　（１） 平均±ＳＤ チ　カッコ内の数字：試料の数 ０　カッコ内の数字：アッセイの回数 ＢＧＯＭ−ウシ顆粒膜細胞培養培地 詳細は本文参照のこと。

例　５　アッセイの特異性 特異性は以下に基づいて調べた。先ず、各種動物からのインヒビンのいずれかの トレーサーを用いたＲ工Ａでの交叉反応およびインビトロの中和反応実験の同じ 段階を観察した（第１表）。異なる糧からのインヒビンのラジオイムノアッセイ での交叉反応性を生物活性で表わすと、ｂｙｐ　１００％、ｈＦＦ　３　Ｑ％、 ヒツジＦ７１％およびラッテ卵巣抽出物非検出であった。この抗血清に関しては 雌雄ウシインヒビンとヒトインヒビンは他の二種のインヒビンには存在しない共 通の抗原決定因子を有することがわかる。このことは両方の性の両種で構造的類 似性があることを示す。二番目に、精製糖蛋白質およびポリペプチドの範囲では 交叉反応性が見られなかった（０．５％）。ラッテＬＨおよびＦＳＨ。

ヒツジＬＨおよびＦＳＨ、ｈｃＧ　１　ウシＴＳＨ、ＬＨＲＨ、卵アルブミンお よびウシ血清アルブミンはいずれのトレーサーを用いても０．５％以下の交叉反 応性であった。

さらに、ウシ顆粒膜細胞培養培地（第４図）およびウシ翠丸抽出物（データーは 示していない）はインヒビン生物活性を示し、Ｒ工ＡでｂＦＦインヒビンに対し て並列した置換を呈した。ウシ顆粒膜細胞培養培地のインヒビン生物活性および 免疫活性のインヒビン標準液での相似希釈は既に示唆されているように（Ｅｒ１ ｃｋｓｏｎおよびＨｓｕｅｈ、　１９７８年；　ＨｅｎｄｅｒｓｏｎおよびＦｒ ａｎ−ｃｈｉｍｏｎｔ　、１９８１・年）、これらの細胞がインヒビン生産部位 である証拠となる。第三に、ｂＦＦのデルＩＩ！ＳクロマトグラフィーおよびＲ Ｐ　−ＨＰＬＯの分画で生物的活性と免役的活性のプロフィルに類似性が観察さ れた。しかし、七フアクリルＳ　２００　ｈ　ラム（Ｗ、　５　ａ　図）の４Ｏ −６０ＫＤ分子量の範囲で生物活性に対して８−４０倍の高い免疫活性が存在し 、これは回収される免疫活性の１２−１８％を占める。

ｂＦＦインヒビンのデル濾過およびＲＰ　−ＨＰＬＯ（第５図）の分画後の精製 インヒビン調製物の間で炭素処理ｂＦＦを標準として使用して生物活性／免疫活 性の比に大きい偏差が見られた（第２表）。その比はｎ尖過程の画分て０．０２ −２．０９、精Ｗイ７ヒヒン”ｃ−ｏ、３０−０．４３であった。

結論として、Ｒ工Ａ法では生物活性を持たな因分子を検出せず、逆にセファクリ ル５２００クロマトグラムの低分子領域（４０−６０ＫＤ）では例外である。こ の低分子物質がＲ工Ａと交叉反応を示すインヒビンと異なる蛋白か生物活性のな いインヒビンかはまだ明かにされていなめ。

インヒビン関連蛋白質のＲ工ＡによるｂＦＦインヒビンに対する相対的交叉反応 性は以下の通りである：豚トランスフォーミング成長因子−ベータ（Ｒ＆Ｄシス テム社、米国ミネソタ州）　＜　０．９％、ウシミュレリアン阻害物質（メルボ ルン、Ｒｏｙａｌ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ　’ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌのＪ、　ｎｕｔ ｓｏｎ博士よりの提供）　＜　０．３％、梢裂つシインヒビンＢサブユニットの 二量体く２％および還元およびアルキル化により得られる３　１ＫＤａ　ｂＦＦ インヒビンのサブユニソ）　＜　３．１％。広範囲の糖蛋白および成長因子も以 前に試験されている（　、ＭＣＬａＣｈｌＯｎら、１９８６年）が、抗−５８Ｋ Ｄインヒビンに対する交叉反応性は１．０％未満であった。抗−３１ＫＤインヒ ビンの特異性も同じようで、交叉反応性は１．０％未満Ｒ工Ａを血清に応用する ためには実質的な改良が必要テアツタ。先ず０．１５　Ｍ　Ｍａｉｌ、０．５％ ＢＳＡを含有する１　００　ｍＭりん酸緩衝液ｐＨ７，４を使用し、血清中での 安定性のために只工Ａトレサーとしては１２５ニー５８ＫＤインヒビンよりも１ ２５ニー３ｉＫＤインヒビンの方が好ましかった。次に雄子牛血清による１２５ ニー３１ＫＤインヒビンの抗血清への結合に対する温度依存型阻害が観察され、 結合の増加（Ｂ／Ｂｏ　）は４℃の５７％がら３７℃で９４％であった（第７図 ）。この図は各種血清およびインヒビン試料（ｂＦＦ、３ｉＫＤインヒビン、雄 子牛血清（ＳＳ）、雌ウシ血清（ｃｓ）、雄ウシ血清（ＢＳ）、ヒト閉経後の血 清（ＦＭＳ　）　、ヒト雌血清プール（ＮＦＰ　）　）中で１６時間インキュベ ートした後の温度依存性を示す。雄子牛血清存在下でトレーサー結合（Ｂ／Ｔ） は３０°Ｃで最大となり、８７．１±３．４％（ｎ＝５）であった。１２５ニー ３ｉＫＤインヒビンの’ｂＦＦまたは３１ＫＤインヒビンによる置換は温度によ って犬きく影響することはなかった。ヒトＦＭＳ　＆’！、　ｍ度Ｋ　ヨリｍ合 ＆’！、増加（Ｂ／Ｂｏ　１１０　１２０％）したが温度に関連した阻害は示さ なかった。

これらの結果よりウシまたはヒト血清インヒビンのアッセイ条件を確立した。そ れは１２５ニー３　ｉ　Ｋ　Ｄインヒビンをトレーサーとして一晩６０℃でイン キュベートし、ＳＳまたはＦＭＳ　（インヒビンを含有しないと考えられる）に よる低レベルの阻害を補正するために標準液および試料はＳＳまたはＦＭＳで希 釈した。

雄子牛およびヒト閉経後の血清には活性は検出されなかったが、雄ウシおよびヒ ト雌血清では対応する卵胞液標準と相同な検量曲線を示し、血中含量はそれぞれ ０．９および１．Ｉｎ、９であった。

インヒビン試料または血清試料はＳＳまたはＰＭＳで２００μｌに希釈した。抗 血清（１００μ１１最終希釈度１　：８０００）および試料（２００μｌ）を３ ０°Ｃで４時間インキュベートシ、さらにトレーサー存在下で３０００にて１６ 時間インキュベーションを続ケタ。

二番目の抗体を添加して４℃で２４時間インキュベートした後２　ｍｌのＱ、ｉ 　５　Ｍ　Ｍａｉｌを添加して遠心分離をした。

三つ目として、ウシ血清インヒビンのＲ工Ａに於ける標準物質の選択に関して、 血清中での安定性の点で精Ｗ３１ｘＤインヒビンの方が望ましかった。稍裂ヒト インヒビン調製物がない場合にはヒト血清インヒビンのＲ１でも３１ＫＤウシイ ンヒビンを標準として使用できる。しかし上述の部分精ｇｈＦｙインヒビンが入 手可能なら標準として最も好ましい。ゴナドトロピンの投与による排卵誘発治療 中の女性の血清中のインヒビン検出量はＬｅｅら（１９８２年）の報告と類似し ており、ＰＭＳＧ処理の未成熟雌ラッテのインヒビン活性レベル、特に５８ＫＤ および３１ＫＤインヒビンに対して、が検出されている。

個々の抗血清がアッセイで異なる挙動を示すから個個のケースでアッセイパラメ ーターを決定しなければならない。抗血清の間で感度の偏差もかなり観察され、 特に３１ＫＤおよび５８ＫＤインヒビンに対して生成した抗血清の間で大きかっ た。抗−３１ＫＤインヒビンは今まで試験した試料では抗−５３ＫＤインヒビン よりもより感度が高かった。

例　７　ヒト血清用の感度改良型Ｒ工Ａアッセイの感度を高めるために上述のア ッセイ操作を以下のように改良した：アッセイの全量を４００から３００μｌに 減少した（試料２００μｌ、）レーサー５０μ゛ｌおよび抗血清５０μｌより成 る）。アッセイ用緩衝液は１５０　ｍＭりん酸、０．２％ＢＳＡ　ｐＨ７−４と し、試料と抗血清のインキュベーションは４°Ｃで４日間、続いてトレーサー添 加後４°Ｃで３日間行なって二番目の抗体を添加した。この方法を用いると感度 が２．５倍上昇した。この改良アッセイ法を応用してヒトプラズマインヒビンの 測定を行なった。本改良法では正常男性プラズマおよび正常月経周期中のプラズ マの定量を行なうことができた。

ＫＤインヒビンの安定性 １２５ニー５８ＫＤインヒビンを血清（ＳＳおよびＦＭＳ　）と−晩インキユベ ートした後のＳＤＳ　−ＰＡＧＥプロフィルは緩衝液またはｂＦＦ　（（５％４ ℃および３０°Ｃ：第６図）と比較して１２５ニ一３ＱＫＤ成分の生成が増加し た（４℃で回収活性の１２％；６０°Ｃで１７％）。

トレーサーは４℃または３０℃でｂＦＦ　、雄子牛血清（ＳＳ）またはヒト閉経 後血清（ＦＭＳ　）と−晩インキユベートした。、いずれのトレーサーもＲＩＡ 緩衝液のみとインキュベートするとｂＦＦとのインキュベーションと同じような プロフィルを示した。分子量マーカーは第１図で説明しである。いずれのトレー サーでもカルボニックアンヒドラーゼのマーカー位置と溶媒先端の間には放射活 性は認められなかった。結果はくり返し３回の実験の平均上ＳＤとして表示しで ある。一方、同じインキュベーション条件下での１２５ニー３１ＫＤインヒビン のＳＤＳ　−ＰＡＧＥプロフィルは有意な変化を示さなかった。いずれのトレー サーの場合も放射活性の回収は温度或いはｂＦＦまたは血清の存在によって影響 を受けなかった。

インヒビンのＲ工Ａをウシの血清に応用するとｂＦＦまたは３１ＫＤインヒビン を標準としてＢＳの平行ロジット一対数検量曲線が得られた（第８図）。第８図 に示す応答はウシおよびヒト血清をそれぞれ雄子牛血清または閉経後の血清で希 釈し、１２５ニー３１ＫＤインヒビンをトレーサーとしたプラズマＲ工Ａアッセ イ系のものである。Ｒ工Ａ標準（ｂＦＦ、３１ＫＤインヒビン、ｈＦＦ　）の活 性値はりん酸緩衝液（２００μＪＳＯ）または雄子牛血清（２００μ１１・）或 いは閉経後血清（２００μ１１ム）の存在下で測定し、ロジットプロットをそれ ぞれの非特異結合およびＢｏ値を用いて計算した。雌ウシ血清が最低の検出免疫 応答を示す。免疫活性を３ｉＫＤインヒビン標準として表わすと、ＢＳ中のイン ヒビンは０．９１±０．２７　（ｎ　−３）Ｉ！／ｍ／でａＳは０．１　ｒｄｌ ／ｍｌであった０３１ＫＤインヒビンおよびｈＦＦを標準としたＲ工ＡでＲＦＰ の平行応答直線が観察され、その値は１．０５＝０．０７（ｎ＝３）ｎｇ／ｍ７ ！であった。正常プラズマ（ｎ＝８）のレベルはアッセイ感度（０，１ｎｌ／ｒ ｎｌ　）と同じかそれ以下であった。

前述のラジオイムノアッセイを閉経後の検体のプラズマおよび血清（インヒビン を含まないと考えられる、ｎ−８）および排卵不全の若い女性（未成熟排卵不全 ｎ＝２、ターナ−症候群ｎ＝１、卵巣切除ｎ＝１）のプラズマおよび血清に応用 した。これらの２つのグループの間にアッセイで１２５ニ一３１ＫＤインヒビン 結合に差が見られなかった。従って閉経後の血清をアッセイの際の希釈液として 使用した。

本性を以下に応用した： （ａｌ　自然月経周動の正常女性の卵胞初期から排卵までのプラズマ（ｎ＝２、 例’ＦＬ’、第９図）。１３日目まではインヒピン免疫活性はアッセイ検出限界 以下であり、その増加は１６日目と１４日目のエストラジオール（Ｅ２）、ＬＨ およびＦＳＨの血中濃度の増加と相関していた。

（ｂｌ　正常男性（ｎ−７）血清中のインヒビン免疫活性はアッセイ検出限界以 下であった。

（ｃ）　ビクトリアのリッチモンド、Ｅｐｗｏｒｔｈ病院で人工受精プログラム で４周期目の排卵誘導を行なっている任意の２６人の女性からプラズマを得た。

簡単に説明すると、これはクエン酸りロミフエン１００−１５０　！ｎ９を月経 周期の５−９日に毎日投与し、次の５−７日間、毎日ヒト閉経ゴナドトロピン（ ｈＭＧ）を−日７５−２２５Ｕ投与するものである。卵胞の十分な発達は血中エ ストラジオールの増加および卵巣の一超音波により調べた。内生ＬＨスパイクが 観察され〜ば排卵は自然に起り、それが観察されない時にはヒト絨毛ゴナドトロ ピン（ｈＣＧ）の５０００工Ｕを投与して排卵を誘発する。自然排卵の例につい ては第９に図の“ＢＵ’　＃１１を、ｈＣＧ−誘発排卵については第９ａ図の° ＪＯ°１を参照のこと。

精製３１ＫＤインヒビン標準を用いた生物活性としての血液試料のインヒビン免 疫活性は血中エストラジオールレベルと強い相関々係を示した（第１０図）。

第９図の全データから相関定数を計算した。排卵誘発周期中の血中エストラジオ ールとインヒビンの対応の例は第９ｂ図の°ＢＥ°＃９の例に見られる。また血 中エストラジオール濃度のピークと回収される卵子の数、および血中インヒビン 濃度のピークと回収される卵子の数との間にも有意な相関々係があった（第１１ 図）。

またさら忙、血中インヒビン濃度のピークと卵子吸引前に超音波で検出される卵 胞の数との間にも強い相関関係が認められた（第１２図）。従って、血中インヒ ビン量およびエストラジオール量は卵胞発達および健康のパラメーターであって 多くの場合にこれらが近い対応を示す。

ｍ中インヒピンと血中エストラジオール濃度との間に相関が観察されない例もあ り（第９ｈおよび９ｊ図の°ＢＹ’＃６および°ＢＲ゛＃１０）、卵胞発達中の これらのパラメーターの異なる調節を示唆している。インヒビンは卵巣顆粒膜細 胞が生産するペプチドでヒトに於ける血中エストラジオールは主として卵巣卵胞 膜細胞の産物であるから血中インヒビンのアッセイは顆粒膜細胞／卵母細胞の健 康と成熟の第一次の直接パラメーターである。従って血中インヒビンとＥ２の非 相関は血中インヒビンが卵胞発達の直接的な尺度であるという点で治療上重要で あり、その評価は排卵誘発および卵母細胞採取の時期に影響する。

工ＶＦプログラムで卵母細胞採取により得られたヒト卵胞液（ｈＦＦ）をｂＦＦ インヒビンで記載される（　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８５年）に２回のデル クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣにより調製してラジオイムノアッセイ（ ＲＩＡ　）標準に使用した。本物質はインビトロの受精のため卵巣誘発を行って いる女性から得られたヒト雌血清インヒビンと平行検量線を示した。

この部分Ｎ裂したヒト卵胞液（ｈｐＦ）インヒビン標準物質をＦＳＨ細胞含量の 濃度依存抑制に基づくインヒビンバイオアツセイ（５ｃｏｔｔら、１９８０年） を用いてインビトロのインヒビン生物活性から定義した。これをＲ１標準として 使用したところ、インビトロ受精のために卵巣誘発を行なっている女性から得ら れた血清インヒビンおよび妊娠女性血清のインヒビンと平行な検量線を示した。

ｈＦＦインヒビン標準の五ニットはインヒビンバイオアツセイを用いたヒツジ翠 丸リンパ標準溶液のユニット１Ｕ／ｍ９に換算して計算した。ＲＩＡはアッセイ 間の偏差定数（ｃ　ｖ　）　６．４％（ｎ＝５アツセイ）、感度（ロジット＋２ ）が０．５７０　／　ｍｅであった。

ＲＩＡはウシおよびヒトインヒビンに特異的であり、糖蛋白質および生長因子の 範囲との交叉反応は０．３％未満であった。さらに、インヒビン関連ペプチドと は次のとおりに交叉反応を示した：ブタトランスフォーミング成長因子ベーター ０．９％、ウシミュレリアン阻害物質（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏ ｒｙ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　）　０−６％）ａ表つシインヒビンＢサプユニット 二量体く１％および還元およびアルキル化後の３１　ｘ：ｏａ　ｂＦＦインヒビ ンサブユニツ）　＜　３．１％。去勢した動物、閉経後の女性或いはターナ−症 候群の検体からの血清には免疫活性は全く検出されなかった。ＲＩＡはアッセイ 間の偏差定数８．３％（ｎ＝５アツセイ）、感度０．５７Ｕ／ｍｌであった。

インヒビン含量は部分精製したｈＦＦ標準液に対して相互関連曲線適応法（Ｂｕ ｒｇｅｒら、１９７３年）を用いて１希釈段階で測定した。結果の計算では個々 の値の対数正常分布（Ｇａｄｄｕｍら、１９３３年）を統計し、即ち、計算は全 て対数的に変換した値を用いて幾何平均を出し、信頼区間６７％で行なった。妊 娠群と非妊娠群の統計的比較は非対を一検定を用いて行なった。

例１３　卵巣黄体期および妊娠初期のインヒビン濃度モナシュ大学工ＶＦプログ ラムで治療を続けている１９名の女性を調べた。これらの女性の不妊は臨床的に 卵管疾病（ｎ＝７）、子宮内膜症（ｎ＝６）、原因不明（ｎ＝５　）または精液 の質的原因（ｎ＝４　）によるものであった。排卵誘発のプロトコールは他に記 載されている（　ＷｏｏｄおよびＴｒＯｕｎＳｏｎ　、　１９８４年）。

簡単には、全患者は周期の５日目から９日目の間に毎日１００−１５０ｍ９のク エン酸りロミフエン（Ｏｌｏｍｉｄ。

メレルダウ社、シｒニー）を、又６日目から毎日７５−２２５単位のＨＭＧ　（ Ｐｅｒｇｏｎａｌ、七ロノ社、ローマ）を投与された。ＨＭＧ療法の投与量およ び投与期間は血中のエストラジオール濃度測定および卵巣超音波による卵胞の大 きさから最適化した。Ｈ（！Ｇ　（Ｐｒｅｇｎｙｌ　、オルガノン社、○ｓｓ　 ）を５０００工Ｕ筋肉注射して排卵を誘発し、３６時間後に卵母細胞を回収した 。肝移植はＷｏｏｄおよびＴｒｏｕｎｓｏｎ　（１９８４年）により記載される ように行なった。腹腔鏡検査後第１８目および第２日目から１４日目まで２日毎 に血液を採取し、血清全保存してＦＳＨＸ　ＬＨ，βサブユニットｈｃＧ　、エ ストラジオール、プロプ”ステロンおよびインヒビンを測定した。１９名の中３ 名の女性が妊娠した。

２４名の正常妊娠女性より妊娠の各時期にそれぞれ１回血清試料を得た。

試料について例１１に記載したｈＦＦインヒビン標準液を用いてインヒビンの測 定を行なった。妊娠しなかった１６名の患者で卵巣黄体期のインヒビン含量が６ 日目に２．５　Ｕ　／　ｍｌのピーク値に上昇し、その後減少して１４日目まで に検出できなくなった。これらの結果は第１３図に示す。

一日当りの血清試料の数は１３−１６であったが第１日目のみは８試料しか入手 できなかった。結果は幾何平均±６７％信頼区間で表示している。破線はインヒ ビンラジオイムノアツセイの感度限界を示す。インヒビン値が検出できなかった 検定の数をカッコ内に示しである。検出できなかった値は平均上信頼区間には含 まれていな−。

妊娠した３検体では、第２日目から８日目の間は非妊娠周期と同様なインヒビン 量であり、その後上昇して１２日目までには非妊娠グループより有意に高込（ｐ Ｏ，ｏｏｌ）値になる。第１４図にこれらの結果を示す。値は幾何平均±６７％ 信頼区間で表わす。破線はインヒビンのラジオイムノアッセイの感度を示す。

”　ｐ　＜　０．０５、”　１）　＜　０．Ｃ１１、”ｐ　＜　０．００１は同 じ日の妊娠群と非妊娠群のホルモル値の比較である。二つ目のパネル中の有効値 は血清ＦＳＨのものである。妊娠検体での血清インヒビンの卵巣黄体期での上昇 は血清βｈａＧの上昇および血清ＦＳＨの非妊娠群の値以下への下降と一致した 。

血清ＦＳＨは非妊娠周期の卵巣黄体期でインヒビンと有意な逆相関を示した（　 ｒ　＝　０．５１、ｎ＝ｉ　１３、ｐ＜０．００１）（第１５図）。データをプ ロプステロン濃度が正常な排卵黄体期範囲（２５１００ｎｍ或いはそれ以上かに より分析した時のＦＳＨとインヒビンの間にも同様な逆相関が観察された（　ｒ 　−０，３８、ｎ＝７６＼　ｐ＜ｏ、ｏｏ　１　ｖθ　ｒ　＝　０．３　７、　 ｎ−３７、ｐ＜Ｃ１，０５、勾配は統計的に差がない）。また黄体期ＦＳＨとプ ログ９ストロン（ｒ　−ＣＪ、６４、ｎ＝１１５、ｐ＜０．００１）およびエス トラジオール（ｒ　＝　０．５２、ｎ＝１１４、ｐ＜０．００１）との間にも逆 相関が存在した。

妊娠が起らなかった周期の黄体期で血中インヒピンとプロプステロン濃度は有意 に相関しく　ｒ　＝　０．８１、ｎ−８５、ｐ＜０．００１）、血清インヒヒン とエストラジオール濃度との間でも同様であった（ｒ＝０．６５、ａ＝８５、ｐ ＜０．００１　）。妊娠検体では黄体期インヒビン含量はプロプステロンまたは エストラジオールのいずれとも有意な相関を示さなかった。血清ＬＨ量は（デー タは示していなｌＡ）第１白目（２１，０（１７，０−２６，１：］　ｎ＋工Ｕ 　／ｍｌ　）から８日目に最低値（３，５（１，２−９，８）ｍ工１７　／　ｍ ｅ　）に急激に減少した。

別の実験で２４名の正常妊婦の妊娠中の血清インヒビン量を測定した。妊娠２０ 過以前の平均値（１，６１（０，９５１，８０）Ｕ／ｍ／Ｘｎ＝１３）はこの時 期以後の値（２，０２ｕ／ｍｌｃ　１．３２−３．１０　）　Ｕ／ｍｅ。

ｎ＝１１）よりも有意に低かった（　ｐ　＜　０．０２　）。

従って、誘導月経周期の黄体期および妊娠中の血中インヒビン量は高いと言える 。

例　４　正常月経周期中のインヒビン濃度さらに他の実験で、６名の正常女性に つめて月経周期中の血清インヒビンを３ｉＫＤインヒビンに対スる抗血清を用い たラジオイムノアッセイで測定した。月経周期が正常であることはＦＳＨ，ＬＨ ，プロプステロンおよびエストラジオールの血清プロフィルより確認したＯこの 抗血清を用いることでアッセイの感度が増加し、試料の９７％以上でインヒビン が検出できた。

結果は第１６図に示す。

１、　本アッセイは血清、プラズマ、尿、卵胞液、組織ホモジネートおよび培養 液のような広範囲の生物試料中のインヒビン濃度を測定するのに利用できる。

２、本アッセイは組織、生物液体または培養培地からのインヒビン精尖をモニタ ーするため、或いはトランスフェクション実験の追跡のために使用できる。

３、　インヒビンの濃度は顆粒膜細胞機能、卵胞発達、卵巣誘発後の卵胞の数お よび妊娠初期の胎児福利のような生殖機能およびセルトリ細胞機能のパラメータ ー指標として使用できる。

本発明は一般態様として上述の具体例に限定されるものではないことは明確に理 解される。

上述の記載で用いた次の用語は商標である：Ａｍ８　ｒ　ｌ　ｅ　Ｘ　Ｍ　−、 Ｃ！　１０ｍ１　ｄ　−、ＣＯａｔ−ａＯＯｕｎ　’ｅ　ＸＭａ　ｒ　ＣＯ１５ ２、Ｍａｔｒｅｘ　Ｒｅｄ　Ａ　ＸＭｏｎｔａｎｉｄｅ　８３８、Ｎｏｒ、ｉｔ 　Ａ　、　Ｐｅｒｇｏｎａｌ、Ｐｏ１ｙｐｅｐ　ＸＰｒｅｇｎｙｌ、ＲｌＡ−Ｑ ｎａｎｔ　％　Ｅｉｅｐｈａｃｒｙｌ　。

５ｅｐｈａｄｅｘ　、　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ｏＯ１Ｕｌｔｒａｐｏｒｅおよび Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ　０ 記載した文献は以下の頁にリストする。

引用文献 Ａｕ、　Ｃ，Ｌ、、　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｄ、Ｍ、　ａｎｄ　ｄｅ　Ｋｒｅ ｔｓｅｒ、　Ｄ、Ｍ。

（１９３３）　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１２．２３９２４４゜Ｂａｋｅ ｒ、　Ｈ，Ｗ、Ｇ、、　Ｅｄｄｉｅ、　Ｌ、Ｗ、、　Ｈｌｇｇｉｎｓｏｎ、　Ｒ ，Ｅ、。

Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｂ、、　Ｋｅｏｇｈ、　Ｅ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｎ１ａｌｌ、　Ｈ ，Ｄ、　（１９８１）Ａｓｓａｙｓ　ｏｆ　Ｉｎｈｉｂｉｎ　０工ｎ　Ｐ、　Ｆ ｒａｎｃｈｉｍｏｎｔ　ａｎｄ　（！、Ｐ。

Ｏｈａｎｎｉｎｇ　（Ｅｄｓ）、　■ｎｔｒａｇｏｎａｄａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔ ｉｏｎ　０ｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　 ｐｐ、　１９３−２２８゜Ｂａｋｅｒ、　Ｈ，Ｗ、Ｇ、、　Ｅｄｄｉｅ、　Ｌ、 Ｗ、、　Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｂ、　ａｎｄＮｉａｌｌ、　Ｈ，Ｄ、　（１９８５） 　Ａｕ５ｔｒａｌｉａｎ　Ｊ、　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　（ｉ ｎ　Ｐｒｅｓθ）。

Ｂｕｒｇｅｒ、　Ｈ，Ｇ、、　Ｌｅｅ、　Ｖ、Ｗ、に、、　ａｎｄ　Ｒｅｎｎ１ ｓ、　Ｌ、Ｃ！。

（１９８３）　Ｊ、　Ｌａｂ、　０１ｉｎ、　Ｍａｄ、　８０３０２−３０８゜ Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ、Ｇ、Ｆ、、ａｎｄ　Ｈｓｕｅｈ、Ａ、Ｊ、Ｗ、（１９７８） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ７１０３．１９６０１９６３゜Ｆｉｎｎｅｙ、　Ｄ、 Ｊ、　（ｉ９７１）　５ｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｃｉ　ｉｎＢｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ａｙ、　２ｎｄ　ａｄ、　Ｏ，Ｇｒｉｆｆｉｎ　＆　Ｃｏ 、　Ｌｔｄ、。

ＬＯｎｄＯｎ　０ Ｆｏｒａｇｅ　Ｒ，Ｇ、、Ｒｉｎｇ、Ｊ、Ｍ、、Ｂｒｏｗｎ、Ｒ，Ｗ、、−Ｍｃ Ｉｎｅｒｎｅｙ。

Ｂ、Ｖ、、０ｏｂｏｎ、Ｇ、Ｓ、、Ｇｒｅｇｓｏｎ、Ｒ，Ｐ、、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｏｎ。

Ｄ、Ｍ、、Ｍｏｒｇａｎ、’Ｆ、Ｊ、、１ｅａｒｎ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、、Ｆｉｎｄｌ ａｙ、：Ｊ、に、。

Ｗｅｔｔｅｎｈａｌｌ、Ｒ，Ｅ、Ｈ，、Ｂｕｒｇｅｒ、Ｈ，Ｇ、、ａｎｄ　ｄｅ 　Ｋｒｅｔｓｅｒ。

Ｆｏｕｌｄｓ、Ｌ、Ｍ、ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｓｔｏｎ、Ｄ、Ｍ、（１９８３）Ｍ ｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｅｎｄｏｃｒ、３１，１１７１３０゜Ｇａｄｄｕｍ、Ｊ、Ｈ，（１９ ３３）Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＣｏｕｎｃｉｌＳｐｅｃｉａｌ　Ｒ ｅｐｏｒｔ　５ｅｒｉｅｓ、１８３゜Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、に、Ｍ、ａｎｄ　Ｆ ｒａｎｃｉｍｏｎｔ、Ｐ　（１９８１）Ｊ。

Ｒｅｐｒｏｄ、Ｆｅｒｔ、６３，４３１　４４２゜ｘｒａｍｅｒ、Ｏ，Ｙ、（１ ９５６）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ　１２，３０７３１０゜Ｌｅｅ、Ｖ、Ｗ、に、、 ＭｃＭａｓｔｅｒ、Ｊ、、Ｑｕｉｇｇ、Ｈ，ａｎｄＬｉｎｇ、Ｎ、、Ｙｉｎｇ、 、Ｓ−Ｙ、Ｕｅｎｏ、Ｎ、、Ｅａｃｈ、Ｆ、。

Ｄｅｎｏｒｏｙ、Ｌ、ａｎｄ　Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ、Ｒ，（１９３５）Ｐｒｏｃ −ＮａｔｌＭａｒａｎａ、Ｒ，、Ｓｕｇｉｎａｍｉ、Ｈ，、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ 、Ｄ、Ｍ、ａｎｄＤｉｃｚｆａｌｕｓｙ、Ｅ、（ｉ９７９）Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏｌ、（Ｋｂｈ、）９２．５８５−５９８゜ Ｍａｓｏｎ、Ａ、Ｊ、、Ｈａｙｆｌｉｃｋ、Ｊ、Ｓ、、Ｌｉｎｇ、Ｎ、、Ｅｓｃ ｈ、Ｆ、。

Ｕｅｎｏ、Ｎ、、Ｙｉｎｇ、Ｓ−Ｙ、Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ、Ｒ，、Ｎ１ａｌｌ、 Ｈ，。

ａｎｄ　Ｓｅｂｕｒｇ、Ｐ、Ｈ，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１８，６５９６ ６５゜Ｍｉｙａｍｏｔｏ、に、、Ｈａｓｅｇａｗａ、Ｙ、、Ｆｕｋｕｄａ、Ｍ、 、Ｎｏｍｕｒａ。

Ｍｌ　工ｇａｒａｓｈｉ、Ｍ、、Ｋａｎｇａｗａ、に、、ａｎａ　Ｍａｔｓｕｏ 、Ｈ。

（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｙｓ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１２９．　３ ９６−４０３゜Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｄ、Ｍ＋、Ｆｏｕｌｄｓ、Ｌ、Ｍ、Ｌｅｖ ｅｒｓｈａ、Ｌ、。

Ｍｏｒｇａｎ、Ｐ、Ｊ、、Ｈｅａｒｎ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、、Ｂｕｒｇｅｒ、Ｈ，Ｇ、 。

Ｗｅｔｔｅｎｈａｌｌ、Ｒ，Ｅ、Ｈ，ａｎｄ　ｄｅ　Ｋｒｅｔｓｅｒ、Ｄ、Ｍ、 （ｉ９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１２６＋　 ２２０２２６゜Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｄ、Ｍ、、ｄｅ　ＶＯ［］、Ｆ、Ｌ、、Ｆ ｏｕｌ＋ｉｓ、Ｌ、Ｍ、。

ＭｃＬａｃｈｌａｎ、Ｒ，工、Ｂｕｒｇｅｒ、Ｈ，Ｇ、、Ｍｏｒｇａｎ、Ｆ、、 ｒ、。

Ｈｅａｒｎ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、ａｎｄ　ｄｅ　Ｋｒｅｔｓｅｒ、Ｄ、Ｍ、（１９８６ ）Ｍｏｌ。

Ｃｅ１ｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　４４，２７１−２７７Ｓｃｏｔｔ、Ｒ，Ｓ、 、Ｂｕｒｇ＋ｓｒ、Ｈ，Ｇ、ａｎｄ　Ｑｕｉｇｇ、Ｈ，（ｉ９８［］）Ｗｏｏ（ １，Ｅ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｔｒｏｕｎｓｏｎ、Ａ＋Ｏ，（ｅｄｓ）、工ｎ　ｖｉｔ ｒ。

ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　（１ ９８４）Ｏｈｕｒｃｈｉｌｌ　ＬｉｖｉｎｇｓｔＯｎｅ釆δＡ’”Ｓ　■−イン 巳ピン〜１０１　ａ＋　町−インヒピン−８／７１０−→リ’ｌ−５８ＫＯイン こ仁−ン　１ン）トコＩＫＯイン仁ヒッｂＦＦ（Ｕ）　３１ＫＤ（ｎｃ＋）　ｈ ＦＦ（ｐｌ）インヒこ１１ン イン０ゴンＵ／ｍ１ ｌ−１Ｐ胞畝 （Ａ） Ｎｏ　卵テ 亙−／／　−ＲＬＦｆ；ｌ＃Ｒえ８．１３゜９、。１−一。

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Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．インヒビンに対して生成させた抗体を用いるステップを含むインヒビン含有 試料中のインヒビン測定のための免疫アッセイの方法。
2. ２．天然存在の、または組換えインヒビン、或いはそれらのサブユニット、断片 または誘導体から成るグループより選択される抗原を動物に注射して生成させた 抗血清中に抗体が含有されている請求の範囲第１項の方法。
3. ３．抗原がインヒビンを含有する調製物、精製ウシ５８ＫＤインヒビン、精製ウ シ３１ＫＤインヒビン、ヒトインヒビン、或いは組換えＤＮＡ技術により生産さ れるヒトまたはウシインヒビンまたはそれらのサブユニット、断片または誘導体 より成るグループから選択される請求の範囲第２項の方法。
4. ４．抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１項の方法。
5. ５．抗体がインヒビンの生物活性を中和することが出来る請求の範囲第１項の方 法。
6. ６．さらに標識５８ＫＤまたは３１ＫＤインヒビンをトレーサーとして使用する ステツプを含む請求の範囲第１項の方法。
7. ７．アツセイがラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、または螢光 検出に基づいた免疫アッセイである請求の範囲第１項の方法。
8. ８．アッセイ標準が天然存在の、または組換えインヒビン或いはそれらのサブユ ニット、断片または誘導体から成るグループより選択されるアッセイ標準を用い る請求の範囲第１項の方法。
9. ９．標準がアツセイの際に試験試料と平行関係を示す請求の範囲第８項の方法。
10. １０．標準がウシ３１ＫＤインヒビン、部分精製ヒトインヒビンおよび精製ヒト インヒビンより成るグループから選択される請求の範囲第８項の方法。
11. １１．ａ）試料および抗血清を４°から３０℃で４時間から４日間インキュベー トし、 ｂ）１２５エーインヒビンを添加して室温で一晩、４℃で４８から７２時間また は３０℃で１６時間インキュベートし、 ｃ）第二の抗体を添加して４℃で３０分から２４時間インキュベートし、 ｄ）沈でんを分離し、そして ｅ）結合した１２５エーインヒビンを計測するステップより成る生物試料中のイ ンヒビンを測定するためのラジオイムノアッセイ。
12. １２．アツセイする試料をインヒビンを含有しない血清で希釈する請求の範囲第 １１項のラジオイムノアッセイ。
13. １３．標準が天然由来の、または組換えウシ３１ＫＤインヒビンおよび天然由来 の、または組換えヒトインヒビンから成るグループより選択されるアッセイ標準 を用いる請求の範囲第１１項のラジオイムノアッセイ。
14. １４．１２５エーインヒビンとのインキュベーションが３０℃である請求の範囲 第１１項のラジオイムノアッセイ。
15. １５．第二の抗体とのインキユベーシヨン後にポリエチレングリコールを添加し てさらに３０分間インキユベートする請求の範囲第１１項のラジオイムノアッセ イ。
16. １６．アッセイする試料にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を取り込ませた請求の範囲第 １１項のラジオイムノアッセイ。
17. １７．卵胞液または血清中のインヒビン濃度を１２５エー標識インヒビンおよび 測定試料中のインヒビンのウシ５８ＫＤインヒビン抗血清との拮抗結合と続く結 合１２５エーインヒビンの沈でんと計測によって算出する除に標準液中のインヒ ビン濃度を使用する卵胞液または各種（ヒトを含む）血清のような試料中のイン ヒビンを測定する方法。
18. １８．クロラミンＴ法を用いてインヒビンを沃素化し、アフイニテイ分画ステツ プにより１２５エーインヒビンの精製を行たうステツプを含む１２５エー標識の インヒビントレーサーの調製および精製の方法。
19. １９．アフイニテイ分画ステップにＭａｔｒｅｘＲｅｄＡを用いる請求の範囲第 １８項の方法。
20. ２０．さらにグル濾過ステツプを含む請求の範囲第１８項の方法。
21. ２１．天然由来または組換えインヒビン、或いはそれらの断片または誘導体から 成るグループより選択され、請求の範囲第１項、第１１項または第１７項で定義 される方法によるインヒビン測定のためのアッセイ標準。
22. ２２．３１ＫＤウシインヒビンおよびヒトインヒビンから選択される請求の範囲 第２１項のアツセィ標準。
23. ２３．ａ）標識インヒビン ｂ）インヒビンに対する抗体 ｃ）請求の範囲第２１項のアッセイ標準より成るグループから選択される試薬を 含む、試料中のインヒビン測定のためのテストキット。
24. ２４．標識インヒビンを請求の範囲第１８項の方法で調製する請求の範囲第２３ 項のテストキット。
25. ２５．インヒビンに対する抗体が請求の範囲第２項に定義される抗血清中に含有 される請求の範囲第２３項のテストキット。
26. ２６．添付した図面を参照して本明細書に実質的に記載される生産物および方法 。