JP2002537776A

JP2002537776A - 早発性卵巣機能不全の診断及び治療

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Publication number: JP2002537776A
Application number: JP2000601201A
Authority: JP
Inventors: アンドリューニールシェリング
Original assignee: オークランドユニサーヴィスィズリミテッド
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 2000-02-25
Publication date: 2002-11-12
Also published as: EP1163365A1; AU2702700A; EP1163365A4; WO2000050638A1; AU779576B2; US6787311B1

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、早発性卵巣機能不全（ＰＯＦ）の素因を決定することができる方法を提供する。とりわけ、発明はインヒビンをコードする遺伝子における変質（変異）に関して女性がＰＯＦの素因を有するかどうかを検出する方法を提供する。【解決手段】本発明は、インヒビンをコードする遺伝子の変質の存在又は非存在を検出する工程を含む、女性被験者にＰＯＦの素因があるかどうかを検出するための試験方法であって、変質の存在が早発性卵巣機能不全（ＰＯＦ）の素因を示す試験方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、早発卵巣機能不全の素因を検出することができる方法及び早発性卵
巣機能不全の診断法に関する。さらに本発明は治療法に関する。

【０００２】（背景）早発性卵巣機能不全（ＰＯＦ）は、４０歳未満の女性において二次無月経、低
エストロゲンニズム、及び性腺刺激ホルモンの上昇を起こす状態である。ＰＯＦ
は、４０歳前の女性の１％に、３０歳前の女性の０．１％すなわち１０００人に
１人に生じる（Coulam Adamson et al., 1986）。ＰＯＦは家族性で遺伝的に受
け継がれうるか、又は疾患の家族歴がなく散発性でありうる。この数年、特に分
子遺伝学の分野においてＰＯＦの原因に関する多くの進展があったにも拘わらず
、ほとんどの症例におけるＰＯＦの原因は謎に包まれている。特発性ＰＯＦを呈
するほとんどの女性は、症状が発症する前には、正常な月経歴、初潮年齢及び受
胎性を有している。かつて、ＰＯＦはあらゆる症例で閉経におけるが如く不可逆
性であると考えられていたが、間欠性の卵巣機能不全が報告され、診断の後、患
者のおよそ１０％で妊娠は起き得ている。

【０００３】ＰＯＦの女性の最も切迫した関心事は、この症候群の心理学的な影響と相まっ
た循環エストラジオールの低下によって彼女達が経験する閉経症状である。閉経
症状には、のぼせ、寝汗、不眠、動悸、頭痛、失禁、及び膣の乾燥による性交疼
痛症が挙げられる。ＰＯＦの心理的な影響は単に、健忘性、集中力の低下、イラ
イラ及び気分のムラのような閉経に関連したものが挙げられるだけではない。

【０００４】ＰＯＦの二次的な帰結は受胎性の喪失である。中には自然に排卵し、自然に妊
娠を達成する女性もいるが、ＰＯＦに罹った大半の女性はそうではない。多くの
症例では卵巣は卵胞を残していないので不妊治療は困難である。卵胞が生検で検
知できる場合でも、卵巣はすでにＦＳＨ不応答になっている。従って、ＰＯＦの
女性はほとんど、養子をもらうか、又は卵子の提供によるＩＶＦを受ける。しか
しながら、提供卵子を入手するのは困難であり、この方法は極めて高価である。
生体が卵巣のエストロゲンなしでいる時間が増加することによってＰＯＦの予後
も長期になる。骨粗鬆症及び心臓血管系疾患のリスクは、このような疾患に対し
て防護効果を提供すると考えられるエストロゲンの低下によって閉経後、高まる
。ＰＯＦの女性は、正常の女性よりも２０〜３０年の間長く、低下したエストロ
ゲン濃度を有する。従って、ＰＯＦの女性ではこのような疾患のリスクは極めて
大きいと考えられる。このような理由で、ＰＯＦ患者は、ホルモン補充療法（Ｈ
ＲＴ）を処方されている。しかしながら、このような女性は更に懸念を抱いてい
る。ＨＲＴの長期にわたる使用は、乳癌、子宮内膜癌及び胆石に罹るリスクの増
加に関係している。ＰＯＦの女性におけるＨＲＴの長期にわたる効果に関する研
究が行われるまで、この問題はこのような女性の主な懸念となるであろう。

【０００５】従って、この症状の根底にある分子事象を理解するには、ＰＯＦの素因となる
遺伝子の同定が必須のステップである。それは、患者の臨床的管理及びＰＯＦの
治療にとっても重要である。

【０００６】ＰＯＦの女性はほとんど卵胞を有していることが見い出されているが、それら
は正常な性腺刺激ホルモンの刺激に反応するとは考えられない。しかしながら、
性腺刺激ホルモン又はその受容体には突然変異はほとんど見つかっていない。Ｆ
ＳＨ受容体で同定された、機能の喪失となる突然変異、５６６Ｃ→Ｔ（Aittomak
i, et al., 1995）は、フィンランドの一群の家族において原発性無月経と共に
卵巣機能不全を起こすことが見い出された。ほかの集団では検出されたことがな
いので、ＦＳＨ受容体の突然変異はほかでは稀であると思われる（Conway, 1997
; Layman, et al., 1998）。卵巣の抵抗性は、黄体形成ホルモンの受容体遺伝子
における早すぎる停止コドンと関係していることも見い出されている（Latronic
o et al, 1996）。しかしながら、このようなデータは、卵巣機能におけるＦＳ
Ｈ軸の明らかな重要性を立証している一方で、それらは、どの分子事象がＰＯＦ
の原因であるのかは同定していない。

【０００７】本出願人らは今や、突然変異した場合、ＰＯＦになるヒト側における素因に関
係すると思われる、ヒトにおける遺伝子を同定した。それがこの成果であり、Ｐ
ＯＦのスクリーニング及び管理（特に、ＰＯＦの家族歴のある人々にとって）に
対して密接な関係を持ち、本発明の根底に横たわっている。

【０００８】（発明の要約）従って、第１の態様では、本発明は、インヒビンをコードする遺伝子における
変質（alteration）（突然変異）の存在又は非存在を検出する工程を含み、ヒト
（個人）がＰＯＦを有する、又はＰＯＦの素因を有するかどうかを検出するため
に試験をする方法を広く提供する。

【０００９】用語『インヒビンをコードする遺伝子』は、本明細書で使用するとき、それら
の非コーディングのフランキング配列及び調節要素とともにＩＮＨα、ＩＮＨβ
Ａ及びＩＮＨβＢを意味する。

【００１０】１つの（好ましい）実施態様では、突然変異の存在又は非存在は、インヒビン
及び／又はその調節要素をコードするＤＮＡの解析を介して検出される。

【００１１】別の方法としての実施態様では、突然変異の存在又は非存在は、インヒビンを
コードするＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの解析を介して検出される。

【００１２】更にもう１つの実施態様では、突然変異の存在又は非存在は、発現されたイン
ヒビンタンパク質のアミノ酸配列の解析を介して検出される。

【００１３】別の実施態様として、本発明は、個人の中で野生型インヒビンタンパク質の活
性のある濃度を高め、維持し及び／又は回復する工程を含み、上記で定義された
方法によってＰＯＦのリスクを有すると同定された、又はそのようなリスクを有
することが疑われた前記個人のＰＯＦに対する予防法及び／又は治療的処置法を
提供する。

【００１４】都合の良いことに、本方法は遺伝子治療法であり、個人に野生型インヒビン遺
伝子の機能を供給することを含む。

【００１５】最も好ましくは、本方法は、個人に野生型インヒビン遺伝子を投与することを
含む。

【００１６】更にもう１つの態様では、本発明は、ＰＯＦを治療する又は予防するための薬
剤の製造におけるインヒビンの使用を提供する。発明は上記で定義したように広義であるが、それに限定されることなく、以下
の説明が実施例を提供する実施態様も包含することは十分理解されるであろう。
その上、以下に添付の図面を参照することにより発明の更に良好な理解が得られ
るであろう。

【００１７】（発明の説明）上記で定義したように、本発明の方法は、ＰＯＦに対する素因を検出する又は
ＰＯＦの診断に用いる。本出願人によって為された重要な発見は、少なくともＰ
ＯＦの中には、インヒビンをコードする遺伝子の変質（突然変異）による例があ
るということである。この発見は本発明の基礎を形成する。

【００１８】インヒビンは構造的にはＴＧＦ−βスーパーファミリーに関係する。成熟イン
ヒビンは、２つの１４ｋＤａβサブユニットの１つに２つのジスルフィド結合で
結合した１８ｋＤａのαサブユニットから成る３１〜３２ｋＤａのヘテロダイマ
ー糖タンパク質である（Halvorson and Decherney, 1996）。従って２つの型の
インヒビン、すなわちインヒビンＡ（α−β_Ａ）及びインヒビンＢ（α−β_Ｂ）
がある。βサブユニットのホモダイマーは糖タンパク質アクチビンを形成し、そ
れはインヒビンと反対の機能を有する。インヒビンのサブユニットは３つの別々
の遺伝子、すなわちＩＮＨα、ＩＮＨβＡ及びＩＮＨβＢによってコードされる
。

【００１９】上記で示すように、ＩＮＨα、ＩＮＨβＡ及びＩＮＨβＢは、その非コーディ
ングのフランキング配列及び調節要素とともに本明細書では集合的に『インヒビ
ンをコードする遺伝子』という。

【００２０】血清中のインヒビンの濃度は、月経周期にわたって及び生涯の生殖段階にわた
って変化し、それが、下垂体−性腺軸及び性腺機能の重要なモジュレータである
ことを示唆している（Halvorson and Decherney, 1996）。インヒビンは、卵巣
機能が開始する性的成熟の開始と共に増加し、性機能のある卵巣内で周期性を示
し、卵巣が非生殖的状態に入る閉経に近づいて減少する。

【００２１】雌におけるインヒビンの主要な機能は、下垂体ＦＳＨ分泌の調節である。性腺
刺激ホルモン及びその他のＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β並びにアクチビンのような因
子に反応して、発達している卵胞及び黄体の双方の顆粒膜細胞がインヒビンを分
泌する。ＦＳＨの誘導された分泌は今度はＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びフォリスタチ
ンによって抑制される。フォリスタチンは、インヒビン及びアクチビン双方の結
合タンパク質としても作用するインヒビン様のＦＳＨサプレッサであり、パラク
リン（傍分泌）機能及びオートクリン（自己分泌）機能を調節する（Halvorson
and Decherney, 1996）。

【００２２】発達中の卵胞はインヒビンＢを分泌して卵胞期におけるＦＳＨ分泌を抑制する
と考えられる。黄体期ではＦＳＨを調節するために分泌される唯一のダイマーは
インヒビンＡである。インヒビンはそのＦＳＨの調節と共に卵巣の中でオートク
リン効果とパラクリン効果の両方を呈する。これらには、ステロイド合成、細胞
増殖及び細胞分化の調節が挙げられる。インヒビンは、ＬＨに対する卵胞膜細胞
の反応性を高めることによってアンドロゲン産生を高める。インヒビンはアクチ
ビンと共に優勢な卵胞を選択し、早過ぎる黄体化を妨げるメカニズムに関与して
いることも示唆されている（Wallace and Healy, 1996）。

【００２３】しかしながら、今日まで、インヒビンをコードする遺伝子における変質／突然
変異がＰＯＦに対する感受性の何らかの素因である、又はＰＯＦの診断に用いら
れるような示唆はなかった。

【００２４】インヒビンをコードするアミノ酸配列及びｃＤＮＡヌクレオチド配列はＧｅｎ
ｂａｎｋから入手し易い。どちらの配列のいかなる変化も本明細書で使用すると
きの用語『変質』の範囲に包含される。

【００２５】インヒビンの非コーディングフランキング配列及び調節要素に関しては、それ
らの中での変質は、転写の不安定性及び／又は転写抑制を生じる可能性がある。
関連する調節要素には、転写スプライシングに関する部位が挙げられる。

【００２６】本発明に基づいた１つのアプローチでは、野生型インヒビン遺伝子の変質が検
出される。

【００２７】『野生型インヒビン遺伝子の変質』は、コーディング及び非コーディング領域
における欠失、挿入、ミスセンス及び点突然変異を含むあらゆる形態の変質を包
含する。欠失は遺伝子全体であっても、又は遺伝子の一部であってもよい。点突
然変異は、結果として停止コドン、フレームシフト突然変異又はアミノ酸置換と
なってもよい。

【００２８】非機能的遺伝子産物を導く突然変異が主としてＰＯＦを招くと考えられている
。しかしながら、インヒビン遺伝子産物の発現を低下させる突然変異もＰＯＦを
招く可能性がある。点突然変異事象は、遺伝子のプロモータのような調節領域で
生じ、ｍＲＮＡ発現の喪失又は不均化を招く可能性がある。点突然変異はまた、
適当なＲＮＡプロセッシングを失い、インヒビン遺伝子産物の発現の喪失、又は
ｍＲＮＡの安定性又は転写効率の低下を招く可能性がある。

【００２９】１又はそれより多くの制限酵素、好ましくは多数の制限酵素で切断したＤＮＡ
の一連のサザンブロットを観察することによって、ＤＮＡ配列における欠失を検
出する予備的な解析を行うことができる。各ブロットは、一連の正常個人からの
及び一連の試験症例からのＤＮＡを含有する。サザンブロットが示すハイブリッ
ド形成した断片（インヒビン遺伝子座の近傍又はそれを含む配列をプローブとし
たとき対照ＤＮＡと長さが異なる）は、起こりうる突然変異を示す。極めて長い
制限断片を作る制限酵素を使用する場合は、パルス・フィールド・ゲル電気泳動
（『ＰＦＧＥ』）を用いることができる。

【００３０】公知の技術を用いた、インヒビン遺伝子の分子クローニング及びその遺伝子の
配列決定によって点突然変異の検出を達成してもよい。別の方法として、既知の
ポリヌクレオチド増幅技術を用い、試料組織からのゲノムＤＮＡ調製物から直接
、遺伝子配列を増幅してもよい。使用することができる増幅技術には、ポリメラ
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション増幅（又はリガーゼ鎖反応、ＬＣＲ）、
及びＱベータ・レプリカーゼの使用に基づいた増幅法のような方法が挙げられる
。このような方法は周知であり、当該技術で広く実践されている。例えば、米国
特許第４，６８３，１９５号並びに第４，６８３，２０２号、及びＩｎｎｉｓ
ｅｔａｌ．１９９０年（ＰＣＲに関して）並びにＷｕｅｔａｌ．１９８９
年a（ＬＣＲに関して）を参照のこと。増幅を行うための試薬及びハードウエア
は市販されている。インヒビン領域に由来する配列を増幅するのに有用なプライ
マーは、インヒビン領域における配列又はその中の標的領域に隣接する領域にお
ける配列に好ましくは相補的であり、それらと特異的にハイブリッド形成する。

【００３１】増幅により生成されたインヒビン配列を直接配列決定してもよい。別の方法と
して、あまり望ましくないが、配列解析の前に増幅された配列をクローニングし
てもよい。酵素を用いて増幅したゲノム断片の直接クローニング及び配列解析の
方法は、Ｓｃｈａｒｆ、１９８６年によって記載された。

【００３２】突然変異遺伝子の存在を確認する周知の、多数の方法がある。それらには、１
）１本鎖構造多型現象（『ＳＳＣＰ』）（Orita et al., 1989）；２）変性勾配
ゲル電気泳動（『ＤＧＧＥ』）（Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 19
89）；３）ＲＮＡ分解酵素保護アッセイ（Finkelstein et al., 1990; Kinsler
et al., 1991）；４）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（Conner
et al., 1983）；５）大腸菌ｍｕｔＳタンパク質のようなヌクレオチドのミス
マッチを認識するタンパク質の使用（Modrich, 1991）；及び６）対立遺伝子特
異的ＰＣＲ（Rano & Kidd, 1989）が挙げられる。対立遺伝子特異的なＰＣＲに
ついては、特定のインヒビン突然変異に対して３’末端にてハイブリッド形成す
るプライマーが使用される。特定のインヒビン突然変異が存在しない場合、増幅
産物は認められない。

【００３３】使用することができる他のアプローチには、欧州特許出願公開第０３３２４３
５号及びＮｅｗｔｏｎｅｔａｌ（１９８９年）で開示されているような増幅
不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）が挙げられる。クローニング、配列決定及
び増幅によって遺伝子の挿入及び欠失も検出することができる。更に、多型のあ
る断片において対立遺伝子の変化又は挿入を検出するために、遺伝子又は周辺の
マーカー遺伝子に対する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを用いることがで
きる。そのような方法は特に、個人に見い出されたインヒビン突然変異の存在に
関して影響を受けている該個人の親族をスクリーニングするのに有用である。

【００３４】最初の３つの方法（即ち、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ及びＲＮＡ分解酵素保護アッセ
イ）では、新しい電気泳動バンドが出現する。ＳＳＣＰは、配列の変化が１本鎖
分子内塩基対に差異を生じるので、差次的に移動するバンドを検出する。ＤＧＧ
Ｅは、変性した勾配のあるゲルを用いて、野生型配列に比べた突然変異配列の移
動度の差異を検出する。ＲＮＡ分解酵素保護アッセイは、突然変異ポリヌクレオ
チドの１又はそれより多くの断片への切断を含む。対立遺伝子特異的オリゴヌク
レオチドアッセイでは、特異的な配列を検出するオリゴヌクレオチドを設計し、
ハイブリッド形成シグナルの有無を検出することによってアッセイを行う。ｍｕ
ｔＳアッセイでは、タンパク質は、突然変異配列と野生型配列のヘテロ２本鎖に
おけるヌクレオチドのミスマッチを含有する配列のみと結合する。

【００３５】２つの鎖が１００％相補的ではない２本鎖にミスマッチのヌクレオチドはハイ
ブリッド形成する。完全な相同性の欠如は、欠失、挿入、反転又は置換による可
能性がある。遺伝子又はそのｍＲＮＡ産物における点突然変異の検出には、ミス
マッチ検出を用いることができる。このような技術は配列決定よりも感度は低い
けれども、それらは多数の試料で行うには更に簡単である。

【００３６】ミスマッチ切断法の例はＲＮＡ分解酵素保護アッセイである。この方法は、ヒ
トの野生型インヒビン遺伝子をコードする配列に相補的な標識したリボプローブ
の使用を含む。リボプローブと試験組織から単離されたｍＲＮＡ又はＤＮＡのど
ちらかとを共にアニーリングし（ハイブリッド形成し）、続けて、２本鎖ＲＮＡ
構造における一部のミスマッチを検出することができる酵素、すなわちＲＮＡ分
解酵素Ａで消化する。ＲＮＡ分解酵素Ａによってミスマッチが検出される場合、
それはミスマッチ部位で切断する。従って、アニーリングしたＲＮＡ調製物が電
気泳動ゲル基質上で分離されるとき、もしミスマッチが検出され、ＲＮＡ分解酵
素Ａによって切断されていると、リボプローブとｍＲＮＡ又はＤＮＡに対する完
全長の２本鎖ＲＮＡよりも小さいＲＮＡ産物が観察される。

【００３７】リボプローブはインヒビンｍＲＮＡ又は遺伝子の完全長である必要はないが、
どちらかの断片であればよい。リボプローブがインヒビンｍＲＮＡ又は遺伝子の
一断片のみを含んでいる場合、ミスマッチについて全ｍＲＮＡ配列をスクリーニ
ングするにはこのようなプローブを多数使用することが望ましい。

【００３８】同様に、ミスマッチを検出するのに、酵素切断又は化学的切断を介してＤＮＡ
プローブを用いることができる。Ｃｏｔｔｏｎｅｔａｌ．，１９８９年；Ｓ
ｈｅｎｋｅｔａｌ．，１９７５年；Ｎｏｖａｃｋｅｔａｌ．，１９８６
年を参照のこと。別の方法としては、一致した２本鎖に対するミスマッチ２本鎖
の電気泳動移動度におけるズレによってミスマッチを検出することができる。Ｃ
ａｒｉｅｌｌｏ、１９８８年を参照のこと。リボプローブ又はＤＮＡプローブの
どちらかによってハイブリッド形成の前にＰＣＲを用いて、突然変異を含有する
可能性がある細胞性のｍＲＮＡ又はＤＮＡを増幅することができる。特に変化が
、欠失及び挿入のような全体の再配列である場合、サザンハイブリッド形成を用
いてインヒビン遺伝子のＤＮＡにおける変化を検出することができる。

【００３９】対立遺伝子特異的プローブを用いて、ＰＣＲの使用によって増幅されたインヒ
ビン遺伝子のＤＮＡ配列をスクリーニングしてもよい。このようなプローブは、
それぞれ既知の突然変異を抱え込んだインヒビン遺伝子配列の一領域を含有して
いる核酸オリゴマーである。例えば、１つのオリゴマーは、インヒビン遺伝子配
列の一部に相当する長さ約２０個のヌクレオチドであってもよい。インヒビン遺
伝子の中で以前同定された突然変異の存在を同定するために、ＰＣＲの増幅産物
をスクリーニングすることができる。

【００４０】対立遺伝子特異的プローブの増幅されたインヒビン配列とのハイブリッド形成
は、例えば、ハイボンドのようなナイロンフィルター上で行うことができる。厳
密なハイブリッド形成条件下における特定のプローブとのハイブリッド形成は、
試料中に対立遺伝子特異的プローブと同じ突然変異が存在することを示している
。

【００４１】インヒビンのコーディング領域の外側に位置する、病気に罹り易い可能性があ
る患者に由来する突然変異は、インヒビン遺伝子の近傍又はその中のイントロン
及び調節配列のような非コーディング領域を調べることによって検出することが
できる。非コーディング領域における突然変異が重要であるという初期の指摘
は、対照個人に比べてＰＯＦ患者において異常なサイズ又は多量のメッセンジャ
ーＲＮＡ分子を示すノーザンブロット実験によってもたらされる可能性がある。

【００４２】公知のいかなる技術によってもインヒビンのｍＲＮＡ発現の変質を検出するこ
とができる。これらには、ノーザンブロット解析、ＰＣＲによる増幅及びＲＮＡ
分解酵素保護が挙げられる。減少したｍＲＮＡ発現は野生型インヒビン遺伝子の
変質を示す。野生型インヒビンのタンパク質の変質をスクリーニングすることに
よっても野生型インヒビン遺伝子の変質を検出することができる。例えば、イン
ヒビンの突然変異を示すことになる、結合抗原の欠如によって組織をスクリーニ
ングするのに野生型インヒビンと免疫的に反応するモノクローナル抗体を用いる
ことができる。

【００４３】例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８年）又はＧｏｄｉｎｇ（１９
８６年）に記載されているような常法によって、１０^−８Ｍ^−１、好ましくは１
０^−９Ｍ^−１〜１０^−１０Ｍ^−１以上に強い親和性のモノクローナル抗体が典型
的に作製される。簡単に言えば、適当な動物を選択し、所望の免疫プロトコール
に従う。適当な期間の後、そのような動物の脾臓を摘出し、適当な選抜条件下に
て、典型的には不死化した骨髄腫細胞と個々の脾臓細胞を融合する。その後、各
細胞をクローンに分離し、抗原の所望の領域に特異的な適当な抗体の産生につい
て、各クローンの培養上清を調べる。

【００４４】抗体を調製するために、そのほかに好適な技術には、抗原ポリペプチドへのｉ
ｎｖｉｔｒｏにおけるリンパ球の暴露があり、別の方法としては、ファージ又
は同様のベクターにおける抗体ライブラリの選択がある。１９８９年のＨｕｓｅ
ｅｔａｌを参照のこと。

【００４５】また、当該技術で既知の手法を用いて、組換え免疫グロブリンを製造してもよ
い（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。

【００４６】抗体は改変して用いても、改変せずに用いてもよい。検出可能なシグナルを提
供する物質を共有結合で、又は非共有結合で結合することにより抗体を標識する
ことが多いであろう。多種多様な標識及び共役技法が広く文献で知られており、
報告されている。好適な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、
蛍光物質、化学発光物質、磁気粒子などが挙げられる。そのような標識の使用を
教示している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５
２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３
７号、第４，２７５，１４９号及び第４，３６６，２４１号が挙げられる。

【００４７】突然変異のインヒビン遺伝子産物を検出するために、突然変異対立遺伝子の産
物に特異的な抗体を用いることもできる。かかる抗体は、上述したような野生型
インヒビンに対する抗体と同等の方法で製造することができる。

【００４８】抗体を用いる免疫アッセイには、公知のいかなる好都合な形式を含めることも
できる。そのような形式には、ウエスタンブロット、免疫組織化学的アッセイ及
びＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。更に、タンパク質結合定量のような機能的
アッセイも使用することができる。

【００４９】要約すれば、分析がＤＮＡそれ自体のものであれ、ＤＮＡから転写されたｍＲ
ＮＡのものであれ、又はＤＮＡの最終発現産物であるタンパク質のものであれ、
野生型インヒビンの発現をコードする基本を成すＤＮＡにおける変質を検出する
ためには、いかなるアプローチを採用することもできる。

【００５０】以下の実験の項は、詳細に行われた種々の分析の要点を述べている。これらは
例示のみの理由で包含されている。

【００５１】（実験）（材料と方法）ＤＮＡの抽出１０ｍｌの血液試料からゲノムＤＮＡを抽出した。リンパ球はＮＹＣＯＭＥＤ
リンホプレップＴＭキットを用いて血液試料から単離した。３．５ｍｌの６Ｍ
ＧｕＨＣｌ_２、２５０μｌの７．５ＭＮＨ_４Ａｃ、５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ
プロテイナーゼＫ及び２５０μｌの２０％Ｎａサルコシルと共に６５℃にて１時
間、細胞をインキュベートした。冷却した２ｍｌのＣＨＣｌ_３に細胞を加え、２
０００ｒｐｍにて３分間遠心した。最上層を回収し、１０ｍｌの冷無水エタノー
ルに加え、ＤＮＡを沈殿させた。２００μｌのＴＥ緩衝液中で４℃にてＤＮＡを
保管した。

【００５２】一般集団における変異の罹病率を調べるのに必要な正常ＤＮＡ試料は、志願者
の唾液から得た（プロメガ・ウイザード・ゲノムＤＮＡ精製キットから適用した
方法）。食物の残りカスを除くために水で口をすすいだ１０分後に被験者から唾
液試料を採集した。ＤＮＡ抽出を行うまで４℃に試料を保管した。１ｍｌの唾液
を４ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．１に加え、３０００ｒｐ
ｍにて５分間遠心した。１８０μｌのＰＢＳと２０μｌの２０ｍｇ／ｍｌのＲＮ
Ａ分解酵素Ａ溶液に沈殿物を再浮遊した。３００μｌの核溶解液（Nuclear Lysi
s Solution)（プロメガ・キット）で細胞を溶解し、次いで、１００ｍｌのタン
パク質溶解液（プロメガ・キット）でボルテックスすることによりタンパク質を
沈殿させ、１３０００ｒｐｍにて３分間遠心した。上清を回収し、３００μｌの
イソプロパノールにてＤＮＡを沈殿させ、１３０００ｒｐｍにて１分間遠心した
。ＤＮＡ沈殿物を１００μｌのＤＮＡ水和液（プロメガ・キット）に再浮遊し、
４℃にて保管した。

【００５３】ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）Ｌａｓｅｇｅｎｅ１９９４に由来するＤＮＡスター・コンピュータプログラム
におけるプライマーセレクト・モジュールを用い、ＩＮＨα（Mayo et al., 198
6）、ＩＮＨβＡ（Mason et al., 1986）、及びＩＮＨβＢ（Mason et al., 198
6）に対する各遺伝子の機能サブユニットを橋渡しして、ＰＣＲプライマーを設
計した。ＤＮＡの配列決定に使用する、各遺伝子についての大きな断片を１つ得
るために、全領域に隣接するプライマーを設計した。同様に、２００〜３００塩
基対のより小さな重なり合った断片を設計して、機能的領域を橋渡しして、ＳＳ
ＣＰ解析に用いた。各断片に隣接するプライマーを表１に示す。

【００５４】

【表１】

【００５５】ＰＣＲの条件キアゲンＴａｑＤＮＡポリメラーゼとＰＣＲ緩衝液を用いてＰＣＲを行った。
２．５μｌのＰＣＲ緩衝液（１ｘ）、２５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、５ｎｍｏｌの
前向き及び逆向きプライマー及び０．１２５μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを
含有する２５μｌ容量の反応においてゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）を増幅した。
全ＰＣＲ反応についてβグロビンを陽性対照として用い、ＤＮＡを含まない反応
を陰性対照として用いた。標準ＰＣＲ条件は、９４℃における１分間の変性、５
８℃における１分間のアニーリング及び７２℃における１分間の伸展を３０サイ
クル含んでいた。タッチダウンＰＣＲの条件は、９４℃で４５秒間の変性、６５
℃〜５５℃（−０．５℃／サイクル）での４５秒間のアニーリング及び７２℃で
１分間の伸展を２０サイクル、次いで５５℃でのアニーリングを更に１５サイク
ル含んでいた。タッチダウンＰＣＲ及び反応当り５μｌのキアゲンＱ溶液を用い
て、４つのインヒビンα断片のすべて、ＩＮＨα（６０１ｂｐ）、ＩＮＨα１、
ＩＮＨα２及びＩＮＨα３を、大きなインヒビンβＡ断片、ＩＮＨβＡ（５２９
ｂｐ）及び大きなインヒビンβＢ断片、ＩＮＨβＢ（５８６ｂｐ）と共に増幅し
た。２つの小さなインヒビンβＡ（ＩＮＨβＡ１、ＩＮＨβＡ２）及び３つの小
さなインヒビンβＢ断片（ＩＮＨβＢ１、ＩＮＨβＢ２、ＩＮＨβＢ３）は標準
ＰＣＲ条件下で増幅した。

【００５６】増幅後、予想されたサイズの単一バンドが存在することを確認するために、５
μｌの各ＰＣＲ産物の電気泳動を１．５％アガロースゲル中で行い、臭化エチジ
ウム染色を用いてＵＶ光のもとで視覚化した。

【００５７】１本鎖配列多型（ＳＳＣＰ）ＳＳＣＰが突然変異を検出する戦略に好適であるかどうかを定めるために１２
人の患者から得た最初の群の試料をＳＳＣＰによって解析した。残りの３２試料
はすべてＤＮＡの配列決定でのみ解析した。無菌の水にてＰＣＲ産物を１／１０
に希釈した。等量の希釈した試料と２ｘのホルムアミド負荷緩衝液を９５℃にて
３分間加熱して試料を変性させ、ＤＮＡ鎖が再アニーリングするのを防ぐために
直ちに氷上に置いた。非変性及び変性対照と並行して３μｌの各試料を電気泳動
した。ＳＳＣＰゲルは、１ｘＴＢＥ緩衝液、８％又は１０％のポリアクリルアミ
ドゲルを含有し、グリセロール（５％）を含む場合も含まない場合もあった。各
１０ｍｌの非変性ゲルに対して設定した試薬は、１５μｌの２５％（ｗ／ｖ）過
硫酸アンモニウムと１５μｌのＴＥＭＥＤであった。０．５ｘＴＢＥ泳動緩衝液
を用いて室温（２０〜２４℃）にて電気泳動を行った。ミニゲル（バイオラッド
、ミニプロテアンＩＩセル）は１７０Ｖにて２〜３時間泳動し、大きなゲル（バ
イオラッド、セクゲン配列決定用セル）は２００〜３００Ｖにて一晩泳動した。
銀染色にてＤＮＡを視覚化した。等量の４０％エタノールと１０％酢酸中にて少
なくとも３０分間ゲルを固定し、次いで、１０％エタノールと５％酢酸の第２の
混合物中で１５分間の洗浄を２回行った。固定の後、Ｋ_２Ｃｒ_２Ｏ_７を基にした
酸化剤中で１５分間洗浄した。次いで酸化剤の黄色い着色が完全に消えるまで、
蒸留水にてゲルを洗浄した。次いで、１８０ｍｌの蒸留水に溶解した２０ｍｌの
銀試薬中でゲルを２０分間染色した。蒸留水で１分間、次いで２００ｍｌの顕色
剤で３回洗浄し、最後に５％の酢酸で５分間洗浄することによりゲルの顕色を行
った。ゲルを洗浄して酢酸を除き、ワットマン３ｍｍろ紙に移して、乾燥させ、
保存した。

【００５８】ＤＮＡの配列決定３つのインヒビン遺伝子それぞれの全体的な機能的領域を橋渡しする大きなＰ
ＣＲ断片、ＩＮＨα（６０１ｂｐ）、ＩＮＨβＡ（５２９ｂｐ）及びＩＮＨβＢ
（５８６ｂｐ）をＤＮＡ配列決定の鋳型として用いた。プロメガのウイザードＰ
ＣＲ調製物ＤＮＡ精製システムを用いて試料を精製し、アプライド・バイオシス
テムズの３７７型自動シーケンサー及び２μｌの鋳型ＤＮＡを用いて配列決定を
行った。

【００５９】変異型の性状分析ＩＮＨα遺伝子のサブユニットにおける７６９番目のＧ→Ａの変異型に関して
、集団の試料のＰＣＲ産物を解析した。この変異型が自然に生じた多型なのか、
ＰＯＦに関与する可能性がある変異型なのかを定めるために、ＲＦＬＰ解析では
Ｂｓｔ７１Ｉを制限酵素として用いた。一般集団の代表として、年齢にかかわり
ない、５０人の男女の唾液から正常ＤＮＡを回収した。既知の配列であるＤＮＡ
を陰性対照ＤＮＡとして用い、変異型７６９番目のＧ→Ａのキャリアであること
が示された（図１ｂのレーン３）患者１からのＤＮＡを陽性対照として作用させ
た。２．５ＵのＢｓｔ７１Ｉ、０．２μｌのアセチル化ＢＳＡ、５μｌのＰＣＲ
産物、及び無菌水を用いた１ｘの制限緩衝液で総容量２０μｌとして制限酵素に
よる消化を行った。３７℃にて１〜２時間、制限酵素混合物をインキュベートし
、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色した。断片を更
によく分離するために、一部の試料では、８％のポリアクリルアミドゲルでも電
気泳動を行い、続いてシブル（Sybr）ゴールドで染色した。Ｂｓｔ７１Ｉ酵素を
除く上記試薬をすべて含有した反応混合物中での消化していないＤＮＡ対照もイ
ンキュベートし、ＰＣＲの消化産物と並行して電気泳動を行った。Ｂｓｔ７１Ｉ
で消化した場合、野生型のＩＮＨα１ＰＣＲ産物では３つの断片、８５ｂｐ、２
５ｂｐ及び１３４ｂｐの断片が生じた。７６９番目のＧ→Ａの変異型では、ＣＧ
ＴＣＧ（ｎ）１２の酵素認識部位が消失し、従って２つの断片、８５ｂｐと１５
９ｂｐの断片が生じた。ヘテロ接合体の試料は、４つの断片すべてを示した。

【００６０】結果１２人の非縁故関係のニュージーランド人ＰＯＦ患者である最初の群ではＳＳ
ＣＰ解析を用いて２つの変異型を検出した。第１に、患者８のＩＮＨβＡ１断片
で変異型が見られた（図１ａのレーン１１）。第２に、患者１でＩＮＨα１断片
が、野生型ＤＮＡと比べて余分な（extra）バンドを示した（図１ｂ、レーン３
）。野生型ＤＮＡと比べた場合、どの患者の試料においても、ＩＮＨα２、ＩＮ
Ｈα３、ＩＮＨβＡ２、ＩＮＨβＡ１、ＩＮＨβＢ１、ＩＮＨβＢ２、及びＩＮ
ＨβＢ３は、いかなる移動変異も示さなかった（データは示さず）。

【００６１】ＩＮＨβＡ１断片で検出された移動度のズレは、１０３２番目のヌクレオチド
Ｃ→Ｔのサイレント置換により生じた（図２ａ）。この変異型は、ＧＧＣ（グリ
シン）からＧＧＴ（グリシン）の変化を生じるコドンの３番目で起きているので
、インヒビンβＡサブユニットのアミノ酸配列を変化させなかった。

【００６２】ＰＣＲ産物の直接的なＤＮＡ配列決定によってＳＳＣＰを用いて、検出された
ＩＮＨα１変異型を確認した。変異型は、コドン２５７番目をＧＣＴからＡＣＴ
に変え、結果的にＩＮＨα遺伝子のサブユニットでアラニンからスレオニンへの
アミノ酸置換を生じる、ヌクレオチド７６９番目（図２ｂ）におけるＧ→Ａのミ
スセンス置換の結果であった。ＩＮＨα７６９のＧ→Ａ変異が配列決定の間違い
でないことを確認するために、ＩＮＨα１断片を元々のＤＮＡ試料、第２の血液
試料から抽出したＤＮＡの両方から増幅し、それぞれ両方向から配列決定した。
再び、同一の配列変異が同定された。最終的に、１２人の患者全員のＩＮＨα増
幅産物で配列決定を行ったが、追加の変異型は見い出されなかった。

【００６３】ニュージーランドからは更に６人、フィンランドから１人及びスロベニアから
２５人のＰＯＦ女性患者からＤＮＡを収集した。原発性無月経症の７人の女性か
らもＤＮＡを収集した。４４人の明らかに非縁故関係のＰＯＦ患者及び７人の原
発性無月経症患者から、ＩＮＨα（６０１ｂｐ）、ＩＮＨβＡ（５２９ｂｐ）及
びＩＮＨβＢ（５８６ｂｐ）の断片を増幅した。更に２人の患者がＩＮＨα７６
９のＧ→Ａ変異を持っていることが判った。

【００６４】ＩＮＨα７６９のＧ→Ａ変異の存在を同定するために迅速ＲＦＬＰスクリーニ
ングを開発した。この変異型はＢｓｔ７１Ｉ制限酵素部位を消失した。４８人の
健常人のＤＮＡ試料からの２４４ｂｐのＩＮＨα増幅物のＲＦＬＰ解析は、１３
４ｂｐと８５ｂｐの断片だけを示した；最も小さな２５ｂｐの断片は現れなかっ
た（データは示さず）。７６９のＧ→Ａ変異を持つ患者は、１５９ｂｐ、１３４
ｂｐ及び８５ｂｐの長さの断片と共にへテロ接合体であることを示していた。

【００６５】考察ＩＮＨα７６９のＧ→Ａの変換は１９６番目のコドンにおいてアラニンからス
レオニンへの置換を生じた。ＲＦＬＰ解析は、正常集団ではこの変異型が稀であ
ることを示した。アラニンからスレオニンは、官能基の側鎖において脂肪族ヒド
ロキシル基の付加を生じるので非保存的置換はありそうなことである。ヒドロキ
シル基はアラニンよりも親水性で反応性であるスレオニンを生じる。

【００６６】ヒトのインヒビンα遺伝子は、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラット及びマウス
の配列との８０％の相同性が立証されている（Yamanouchi, Yoshida et al., 19
95）。ラットの配列を除いて、これらすべての配列において変異部位でのアミノ
酸アラニンは保存されていた。ラットの配列はアラニンの代わりにセリンを含有
していた。セリンはアラニンのヒドロキシル化型である。しかしながら、スレオ
ニンは、ヒドロキシル基同様にメチル基を付加して大型アミノ酸になっている。
従って、ラットにおけるアラニンのセリンへの置換は、ＩＮＨα突然変異で誘導
されたスレオニン置換よりも保存的な変質である。また、これらの種の中で、ヒ
トのＩＮＨα遺伝子と比較した場合、ラットは最も離れて分岐している。

【００６７】インヒビンαは、ＴＧＦ−β２（形質転換増殖因子−β２）及びＯＰ−１（骨
形成タンパク質−１）とそれぞれ２４％及び２６％のアミノ酸配列の相同性を示
す（Kinsley, 1994）。ＴＧＦ−β２及びＯＰ−１の三次元結晶構造は知られて
おり、３つともすべて特有の７−システインドメインを示し、システインノット
と名付けられた環状構造を生じる。７６９のＧ→Ａの変換は、５番目のシステイ
ン残基とジスルフィド結合を形成する１番目のシステイン残基に隣接している。
その結果、突然変異は、二量体化に関与するジスルフィド結合を形成する４番目
のシステイン残基の近傍に引き付けられている。従って、この突然変異は、イン
ヒビンαサブユニットのインヒビンβサブユニットとの結合を阻害する可能性を
有する。これは、ニ量体形成に関与するジスルフィド結合を阻害することによっ
て直接的にであってもよいし、システインノットの三次構造を乱すのでニ量体化
する能力を阻害することによって間接的にであってもよい。

【００６８】（産業上の利用）インヒビン遺伝子（特にＩＮＨα）における突然変異がＰＯＦの例に関係して
いることを立証することは数多くの意味合いを有する。上記で示したように、第
１の意味合いは、ＰＯＦの素因に関するリスクを検出する方法又はＰＯＦ診断の
方法である。

【００６９】早期にリスクがあることを決定するのは早期の処置に対する機会を提供する。
突然変異のキャリアは、問題が出現する前に治療を受けるのを選択することがで
きる。調べることによってキャリアは重要な人生の決定（例えば、早期の出産）
を下すこともできる。キャリアでない人にとって、ＰＯＦの家族歴がある場合は
、調べることによって心の平静がもたらされ、監視の必要性が除かれる。

【００７０】推定上のＰＯＦ感受性遺伝子としてのインヒビンの同定は、早期の決断を越え
る意味合いを有する。ＰＯＦの発症を遅らせる予防的アプローチの可能性も生じ
る。

【００７１】これらには、まず、十分量の野生型インヒビンを感受性の女性に直接投与して
、インヒビンの活性濃度を推定上の『正常な』レベルに回復することが含まれる
。

【００７２】かかるアプローチのために、従来のキャリア、媒体、希釈剤又は賦形剤と組み
合わせて薬剤としてインヒビンを調製することができる。

【００７３】遺伝子治療を用いた治療的又は矯正的アプローチの可能性もある。これには、
突然変異インヒビン遺伝子を持っているヒトに野生型インヒビン機能を供給する
ことが含まれる。かかる機能を供給することによってＰＯＦの進展が妨げられる
はずである。遺伝子が染色体外に留まるように、かかるヒトの細胞にベクターの
中で野生型インヒビン遺伝子又は遺伝子の一部を導入してもよい。かかる状況で
は、遺伝子は染色体外の位置から細胞によって発現される。野生型インヒビン遺
伝子又はその一部がゲノムＤＮＡに統合されるような方法で突然変異細胞に導入
されるような状況は更に普通である。野生型インヒビン遺伝子又はその一部が細
胞に存在する内因性の突然変異型インヒビン遺伝子と組換えを生じるような方法
で突然変異細胞に導入するような状況はあまり普通ではない。かかる組換えには
、インヒビン遺伝子の突然変異を是正するような二重組換えが必要である。組換
え及び染色体外での維持の両方に関する遺伝子導入のためのベクターは公知であ
り、好適なベクターはいかなるものを使用してもよい。エレクトロポレーション
、リン酸カルシウム共沈殿及びウイルスによる形質導入のようなＤＮＡを細胞に
導入する方法は公知である。

【００７４】上記で一般的に考察したように、標的細胞におけるかかる遺伝子の発現産物の
量を高めるために、遺伝子治療の方法において適用可能な野生型インヒビン遺伝
子又は断片を用いてもよい。かかる遺伝子治療は、正常細胞と比べてインヒビン
ポリペプチドのレベルがない又は減少している細胞において使用するのに特に適
している。突然変異遺伝子が『正常な』レベルに発現しているが、遺伝子産物が
完全には機能していないような細胞でさえ、任意のインヒビン遺伝子の発現レベ
ルを高めるためには有用である可能性がある。

【００７５】例えば、Ｋｒｅｎｅｔａｌ（１９９８年）に記載されているような、又は
『遺伝病の治療法』（T. Friedman編、Oxford University Press、1991）の１０
５〜１２１ページでＦｒｉｅｄｍａｎが記載しているような一般的に受け入れら
れている方法に従って、遺伝子治療は行われる。まず最初にインヒビンポリペプ
チドの産生を確かめるために上記の方法によって患者から得た細胞を分析する。
発現制御因子と結合し、標的細胞の内部で複製することができるインヒビン遺伝
子を１コピー含有するウイルスベクター又はプラスミドベクターを調製する。好
適なベクターは、米国特許第５，２５２，４７９号に記載され、出願ＷＯ第９
３／０７２８２号に公開されているように既知である。次いで、標的部位に局所
的に、又は全身性に（遠隔部位の可能性があるいかなる標的細胞にも到達する
ために）、ベクターを患者に注射する。移入された遺伝子が各標的細胞のゲノム
に永続的に組み入れられない場合はは、定期的に処置を反復しなければならない
可能性がある。

【００７６】遺伝子治療法の実践では、公知の遺伝子移入システムが有用な可能性がある。
これらにはウイルス性及び非ウイルス性の移入方法が挙げられる。多数のウイル
スが遺伝子移入ベクターとして使用されており、パポバウイルス（例えば、ＳＶ
４０、Madzak et al., 1992）、アデノウイルス（Berkner, 1992）、ワクシニア
ウイルス（Moss, 1992）、アデノ関連ウイルス（Muzyczka, 1992）、ＨＳＶ及び
ＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Margolskee, 1992; Johnson et al., 1992: Fi
nk et al., 1992; Breakfield & Geller, 1987; Freese et al., 1990）、及び
鳥類（Petropoulos et al., 1992）、マウス（Miller, 1992）、並びにヒト（Sh
imada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschache
r & Panganiban, 1992）のレトロウイルスが挙げられる。

【００７７】当該技術で既知の非ウイルス性の遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈殿
（Pellicer et al., 1980）のような化学的技法；例えばマイクロインジェクシ
ョン（Anderson et al., 1980）のような機械的技法；リポソーム（Lim et al.,
1992）を介した膜融合が介在する移入及び直接的なＤＮＡの取り込み並びに受
容体が介在するＤＮＡの移入（Wolff et al, 1990; Wu et al., 1991）が挙げら
れる。ウイルスが介在する遺伝子移入はリポソーム送達を用いたｉｎｖｉｖｏ
の直接遺伝子移入と組合せることができ、ウイルスベクターを標的細胞に向ける
ことができる。別の方法として、レトロウイルスベクター産生細胞株を患者に注
射することができる（Culver et al., 1992）。産生細胞の注射はその結果、継
続したベクター粒子源を提供する。

【００７８】生物学的遺伝子移入法と化学的遺伝子移入法を組合せたアプローチでは、いか
なるサイズのプラスミドＤＮＡもアデノウイルスのヘキソンタンパク質に特異的
なポリリジンを共役させた抗体と組合せられ、得られた複合体は、アデノウイル
スベクターに結合する。次いでその三分子複合体を用いて細胞に感染させる。ア
デノウイルスベクターによって、結合したＤＮＡが損傷を受ける前に、十分な結
合、取り込み及びエンドソームの分解ができる。

【００７９】リポソーム／ＤＮＡ複合体はｉｎｖｉｖｏにおける遺伝子移入に直接介在で
きることが明らかにされている。通常のリポソーム調製物では、遺伝子移入過程
は非特異的である一方で、ｉｎｖｉｖｏでの局限された取り込みや発現は、例
えば、ｉｎｓｉｔｕの直接投与の後、組織沈着性であることが報告されている
（Nabel, 1992）。

【００８０】当業者は、上記記載が単に例示を目的として提供されていること、及びそれは
添付のクレームの法的な範囲によってのみ限定されることを十分理解するであろ
う。

【参１】

【参２】

【参３】

【参４】

【参５】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１ａは、５％グリセロールを含有する８％ポリアクリルアミドゲル上におけ
るＩＮＨβＡ１断片のＳＳＣＰの結果を示す。レーン１は、マーカーを示し、レ
ーン２は非変性ＰＣＲ断片であり、レーン３は正常の対照試料であり、レーン４
〜１１は患者の試料を表す（それぞれ患者１〜８）。レーン１１（患者８）の余
分なバンドは配列の変異を示す。図１ｂは、８％ポリアクリルアミドゲル上におけるＩＮＨα１断片のＳＳＣＰ
の結果を示す。レーン１は、マーカーを示し、レーン２は正常の対照試料であり
、レーン３〜７は患者の試料を表す（それぞれ患者１〜５）。レーン３（患者１
）の余分なバンドは配列の変異を示す。

【図２】図２ａは、野生型（ＷＴ）配列と比較したＩＮＨβＡ１変異（患者８）の配列
を示す電気泳動図である。矢印は変異型におけるＣからＴへの配列変化、及び野
生型配列において相当する配列を示す。図２ｂは、野生型（ＷＴ）配列と比較したＩＮＨα１変異（患者１）の配列を
示す電気泳動図である。矢印は変異型におけるＧからＡへの配列変化、及び野生
型配列において相当するヌクレオチドを示す。

【図３】図３は、Ｂｓｔ７１Ｉを用いたＩＮＨα１断片のＲＦＬＰ解析の結果を示す。
未消化のＤＮＡは２４４ｂｐの単一バンドを持つ。野生型（ＷＴ）は１３４ｂｐ
、８５ｂｐ及び２５ｂｐの３本のバンドを生じる。変異型のホモ接合体では１５
０ｂｐと８５ｂｐの２つの断片を生じる。ヘテロ接合体のキャリアは全部で４つ
の断片（１５０ｂｐ、１３４ｂｐ、８５ｂｐ及び２５ｂｐ）を持つ。消化したと
き、野生型と変異断片の両方を生じるので変異型はヘテロ接合体である。８％ポ
リアクリルアミドゲル上では２５ｂｐの断片は検出できない。レーン１はマーカ
ーであり、レーン２は未消化のＤＮＡ、レーン３〜５は、ＤＮＡの配列決定によ
り変異に関してへテロ接合体であると同定されたＰＯＦ患者を表し、レーン６は
正常の対照試料であり、レーン７〜９は、ＤＮＡ配列決定によって変異に関して
ホモ接合体の正常であることが示されたＰＯＦ患者である。

【図４】図４は、ヒト、ウマ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシ、フクロネズミ、ニワトリ
及びラット由来のＩＮＨα遺伝子サブユニットのアミノ酸配列の配置を示す。Ｄ
ＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋから得た。矢印はＧからＡへの突然変異によって変化
したアミノ酸を示す。

【図５】図５は閉経年齢を示す。閉経年齢は各患者から得て、年齢に従ってプロットし
た。７６９番目のＧ→Ａ変異を持つ３人の女性をマルで示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＭＧ０１Ｎ 33/53 33/566 Ａ６１Ｋ 35/76 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA03 CA12 CA20 HA09 HA11 HA17 4B063 QA01 QA13 QA17 QA19 QQ43 QQ53 QR08 QR14 QR32 QR40 QR42 QR48 QR62 QS16 QS25 QS36 QX02 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA22 CA53 DB51 DB61 NA10 NA14 ZA812 ZB262 4C087 BC83 ZA81

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インヒビンをコードする遺伝子の変質の存在又は非存在を検
出する工程を含む、女性被験者にＰＯＦの素因があるかどうかを検出するための
試験方法であって、変質の存在が早発性卵巣機能不全（ＰＯＦ）の素因を示す試
験方法。
【請求項２】変質の存在又は非存在が、インヒビンをコードするＤＮＡの
解析によって決定される請求項１に記載の方法。
【請求項３】変質の存在又は非存在が、前記被験者の試料からのＤＮＡの
配列を、野生型インヒビンをコードするＤＮＡ配列と比較することによって決定
される請求項２に記載の方法。
【請求項４】変質の存在又は非存在が、制限酵素Ｂｓｔ７１Ｉを用いた制
限断片長多型（ＲＦＬＰ）によって決定される請求項２に記載の方法。
【請求項５】変質の存在又は非存在が、インヒビンをコードするＤＮＡか
ら転写されたｍＲＮＡの解析によって決定される請求項１に記載の方法。
【請求項６】変質の存在又は非存在が、前記被験者の試料からのｍＲＮＡ
の配列を、野生型インヒビンをコードするＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの配列
と比較することによって決定される請求項５に記載の方法。
【請求項７】変質の存在又は非存在が、発現されたインヒビンタンパク質
のアミノ酸配列の解析によって決定される請求項１に記載の方法。
【請求項８】変質の存在又は非存在が、前記被験者の試料からの発現され
ているインヒビンタンパク質のアミノ酸配列を、野生型インヒビンタンパク質の
アミノ酸配列と比較することによって決定される請求項７に記載の方法。
【請求項９】変質の存在又は非存在が、前記被験者の試料に存在するイン
ヒビンタンパク質の発現／活性のレベルを、野生型インヒビンタンパク質の発現
／活性のレベルと比較することによって決定される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】ＩＮＨαのヌクレオチド７６９番目におけるＧ→Ｔ置換の
存在がＰＯＦの素因を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記クレームのいずれかに記載の方法によって癌の素因に
対するリスクを有するとして同定された前記女性の早発性卵巣機能不全（ＰＯＦ
）に対する予防的処置及び／又は治療的処置の方法であって、女性において野生
型インヒビンタンパク質の活性濃度を高め、維持し及び／又は回復する工程を含
む方法。
【請求項１２】前記女性に野生型インヒビン遺伝子の機能を供給すること
を含む請求項１１に記載の治療方法。
【請求項１３】前記女性に野生型インヒビンを投与することを含む請求項
１１に記載の治療方法。
【請求項１４】女性において早発性卵巣機能不全（ＰＯＦ）を治療する又
は予防するための薬剤の製造における野生型インヒビンの使用。