DE60314495T2

DE60314495T2 - Aminosäuresequenzen, die in der lage sind die durchdringung einer biologischen barriere zu erleichtern

Info

Publication number: DE60314495T2
Application number: DE60314495T
Authority: DE
Inventors: Shmuel A. Ben-Sasson; Einat Cohen
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 2002-02-07
Filing date: 2003-02-07
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2023-02-08
Also published as: DE60314495D1; CA2474283A1; AU2003209577A1; ATE365213T1; JP2005517024A; EP1472351B1; EP1472351A2; WO2003066859A3; US20060251713A1; US7115707B2; WO2003066859A2; US20040146549A1

Description

Techniken, die einen wirksamen Transfer einer interessierenden Substanz über eine biologische Barriere erlauben, sind von beachtlichem Interesse im Gebiet der Biotechnologie. Zum Beispiel können solche Techniken für den Transport einer Vielfalt unterschiedlicher Substanzen über eine biologische Barriere verwendet werden, der durch Tight Junctions (d.h. den Schleimhautepithelien, die Darm- und Atemepithelien einschließen, und den Gefäßepithelien, welche die Bluthirnschranke einschließen) reguliert wird.
Das Darmepithel stellt die Hauptbarriere zur Absorption oral verabreichter Verbindungen, z.B. Arzneimittel und Peptide, in den systemischen Kreislauf dar. Diese Barriere ist aus einer einzigen Schicht säulenartiger epithelialer Zellen (hauptsächlich Enterozyten, Becherzellen, endokrinen Zellen und Panethzellen) zusammengesetzt, die an ihren apikalen Oberflächen durch die Tight Junctions verbunden sind. Siehe Madara et al., PHYSIOLOGY OF THE GASTROINTESTINAL TRACT; 2. Aufl., Johnson, Hrsg., Raven Press, New York, S. 1251–66 (1987).
Verbindungen, die im Darmlumen vorliegen, können durch aktiven oder erleichterten Transport, passiven transzellulären Transport oder passiven parazellulären Transport in den Blutstrom eintreten. Aktiver oder erleichterter Transport erfolgt über zelluläre Träger und ist auf einen Transport von Abbauprodukten komplexer Moleküle mit geringem Molekulargewicht beschränkt, wie Proteinen und Zuckern, z.B. Aminosäuren, Pentosen und Hexosen. Ein passiver transzellulärer Transport erfordert sowohl über die apikalen als auch die basolateralen Membranen ein Aufteilen des Moleküls. Dieser Vorgang ist auf relativ kleine hydrophobe Verbindungen beschränkt. Siehe Jackson, PHYSIOLOGY OF THE GASTROINTESTINAL TRACT; 2. Aufl., Johnson, Hrsg., Raven Press, New York, S. 1597–1621 (1987). Infolgedessen ist, mit der Ausnahme jener Moleküle, die durch aktive oder erleichterte Mechanismen transportiert werden, eine Absorption größerer, hydrophilerer Moleküle größtenteils auf die parazelluläre Bahn beschränkt. Jedoch ist der Eintritt von Molekülen über die parazelluläre Bahn hauptsächlich durch die Anwesenheit der Tight Junctions beschränkt. Siehe Gumbiner, Am. J. Physiol., 253:C749–C758 (1987); Madara, J. Clin. Invest., 83:1089–94 (1989).
In der Transmissionselektronenmikroskopie erscheinen Tight Junctions als ein ungefähr 80 nm langer Bereich an der Grenze benachbarter Zellen, in dem die an Plasmamembranen angrenzende Zellen in eine enge Gegenstellung gebracht sind. Siehe Farquhar, et al., J. Cell Biol., 17:375–412 (1963). Diese Struktur umschreibt epitheliale Zellen unmittelbar unter dem Bürstensaum (apikale Domäne), wodurch ein Verschluss zwischen epithelialen Zellen und ihren Nachbarn gebildet wird. Siehe Pappenheimer, et al., J. Membrane Biol., 102:2125–2136 (1986); Claude et al., J. Cell Biol., 58:390–400 (1973); und Bakker, et al., J. Membrane Biol., 98:1209–1221 (1985). Die Tight Junctions wirken, um eine apikale und basale Membranpolarität durch ein Beschränken des Austausches von Membranlipiden und -Proteinen zwischen den beiden zu definieren und um den parazellulären Transport von Wasser, gelösten Stoffen und Immunzellen zu regulieren. Siehe Heiskala, et al., Traffic, 2:92–98 (2001).
Beachtliches Augenmerk wurde auf das Auffinden von Wegen gerichtet, um den parazellulären Transport durch "Lösen" von Tight Junctions zu erhöhen. Ein Ansatz, die Beschränkung des parazellulären Transports zu überwinden, ist es, biologisch aktive Bestandteile mit absorptionsverstärkenden Mitteln in einer Mischung zusammen zu verabreichen. Im Allgemeinen schließen Darm/Atem Absorptionsenhancer Calciumchelatoren, wie Zitrat und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); oberflächenaktive Mittel, wie Natriumdodecylsulfat, Gallensalze, Palmitoylcarnitin und Natriumsalze von Fettsäuren; oder Toxine, wie ein Zonula Occludens Toxin ("ZOT") ein, sind aber nicht darauf beschränkt. ZOT wirkt durch ein Erhöhen der Bioverfügbarkeit von oralem Insulin in diabetischen Tieren. Siehe Fasano und Uzzau, J. Clin. Invest., 99:1158–64 (1997). EDTA, das dafür bekannt ist, Tight Junctions durch Chelatbildung mit Calcium zu unterbrechen, verstärkt die Wirksamkeit eines Gentransfers in das Atemepithel des Atemwegs in Patienten mit zystischer Fibrose. Siehe Wang, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 22:129–138 (2000). Ein Nachteil all dieser Verfahren ist jedoch, dass sie die unterschiedslose Durchdringung irgendeines eines in der Nähe liegenden Moleküls erleich tern, das sich zufälligerweise im Magendarm- oder Atemwegslumen befindet. Zusätzlich hat jeder dieser Darm/Atem Absorptionsenhancer Eigenschaften, die deren allgemeinen Nutzen als ein Mittel einschränken, eine Absorption verschiedener Moleküle über eine biologische Barriere zu fördern.
Mit der Verwendung grenzflächenaktiver Mittel wirft die potenziell lytische Eigenschaft dieser Mittel darüber hinaus Bedenken in Bezug auf die Sicherheit auf. Insbesondere stellen die Darm- und Atemepithelien eine Barriere gegen den Eintritt von Toxinen, Bakterien und Viren von der schädlichen Außenseite bereit. Deshalb werfen sowohl die Möglichkeit einer Abblätterung des Epithels unter Verwendung von grenzflächenaktiven Mitteln als auch die potenziellen Komplikationen, die sich durch eine erhöhte epitheliale Reparatur ergeben, Sicherheitsbedenken über die Verwendung von grenzflächenaktiven Mitteln als Darm/Atem Absorptionsenhancer auf.
Falls Calciumchelatoren als Darm/Atem Absorptionsenhancer verwendet werden, wirkt eine Ca²⁺ Auszehrung nicht direkt auf die Tight Junctions, sondern induziert eher globale Veränderungen in den Zellen, die eine Störung von Aktinfilamenten, eine von Störung haftenden Junctions, eine abgeschwächte Zelladhäsion und eine Aktivierung von Proteinkinasen einschließen. Siehe Citi, J. Cell Biol., 117:169–178 (1992). Da typische Calciumchelatoren nur Zugang zur Schleimhautoberfläche haben und eine Ca⁺² Konzentration des Lumens variieren kann, können darüber hinaus allgemein keine ausreichenden Mengen eines Chelators verabreicht werden, um die Ca⁺² Spiegel zu senken, um das Öffnen von Tight Junctions in einer schnellen, reversiblen und reproduzierbaren Weise zu induzieren.
Zusätzlich scheinen einige Toxine, wie Clostridium difficile Toxin A und B, eine parazellulären Permeabilität irreversibel zu erhöhen und sind so mit einer Zerstörung des Tight Junction Komplexes assoziiert. Siehe Hecht, et al., J. Clin. Invest., 82:1516–24 (1988); Fiorentini und Thelestam, Toxicon, 29:543–67 (1991). Andere Toxine, wie Vibrio cholerae Zonula Occludens Toxin (ZOT), modulieren die Struktur intrazellulärer Tight Junctions. Als ein Ergebnis wird die Darmschleimhaut permeabler. Siehe Fasano, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8:5242–46 (1991); U.S. Patent Nr. 5,827,534 . Jedoch führt dies auch zu Diarrhöe.
Andere durchdringende Strukturen werden in der WO-A-9605858 (Washington & Stanford Universitäten) und Inf. Immun. 68(8), Seiten 4616–23 (2000) beschrieben.
So verbleibt ein Bedarf nach einem wirksamen, spezifischen, nicht invasiven Mittel mit niedrigem Risikos, um auf verschiedene biologische Barrieren für die Verabreichung biologisch aktiver Moleküle abzuzielen, wie Polypeptide, Arzneimittel und anderer therapeutische Mittel.
Die vorliegende Erfindung stellt deshalb ein Durchdringungsmodul bereit, umfassend ein Durchdringungspeptid und einen Effektor, der mit dem Durchdringungspeptid gekoppelt oder fusioniert ist, wobei das Durchdringungspeptid in der Lage ist, über eine biologische Barriere zu translozieren, wie in Anspruch 1 unten beansprucht. Die Erfindung betrifft auch ein ex vivo Verfahren unter Verwendung eines Durchdringungspeptids, um einen Effektor über eine biologische Barriere zu translozieren, und Verfahren zur Herstellung eines solchen Durchdringungsmoduls.
Das Durchdringungspeptid weist eine Aminosäuresequenz auf, die aus irgendeiner der SEQ ID NRN: 1–15 und 24–29 ausgewählt ist. In verschiedenen Ausführungsformen kann das Durchdringungspeptid eine Länge von weniger als dreißig (30), weniger als fünfundzwanzig (25) oder weniger als zwanzig (20) Aminosäuren aufweisen.
Wie hier verwendet ist ein "Durchdringungspeptid" irgendein Peptid, das die Translokation einer Substanz über eine biologische Barriere erleichtert. Beispiele biologischer Barrieren schließen Tight Junctions und die Plasmamembran ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Darüber hinaus wird der Fachmann erkennen, dass die Translokation über eine biologische Barriere in einem Gewebe, wie epithelialen Zellen oder endothelialen Zellen, erfolgen kann.
Das Durchdringungspeptid ist mit einem Effektor fusioniert, gekoppelt oder daran angeheftet. Der "Effektor" kann irgendein geeignetes Molekül sein, das DNA, RNA, ein Protein, ein Peptid oder ein pharmazeutisch aktives Mittel, wie zum Beispiel ein Hormon, einen Wachstumsfaktor, einen neurotropher Faktor, ein bioaktives Peptid, Heparin, ein Toxin, ein Antibiotikum, ein antipathogenes Mittel, ein Antigen, einen Antikörper, ein Antikörperfragment, einen Immunmodulator und ein Enzym; oder ein therapeutisches Mittel einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist. Bioaktive Peptide schließen zum Beispiel Insulin, Wachstumshormon, ein Gonadotropin, einem Wachstumsfaktor, Erythropoetin, einen Granulozyten/Monozyten Koloniestimulierenden Faktor (engl.: granulocyte/monocyte colony stimulating factor (GM-CSF)), α-MSH, Enkephalin, Dalargin, Kyotorphin, EPO, bFGF, Hirulog, ein luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (engl.: lutenizing hormone releasing hormone (LHRH)) Analog und neutrotrophe Faktoren ein. Pharmazeutisch aktive Mittel schließen zum Beispiel ein Antikoagulans, ein Toxin, ein Antibiotikum, ein antipathogenes Mittel, ein Antigen, ein Antikörperfragment, ein Vitamin, einen Immunmodulator, ein Enzym, ein antineoplastisches Mittel, Heparin, Methotrexat und ein therapeutisches Mittel ein.
Wie hier verwendet bedeuten die Begriffe "Fusion" oder "fusioniert" oder "gekoppelt" oder "angeheftet", dass alle solche spezifischen Interaktionen eingeschlossen sind, die zu zwei oder mehr Molekülen führen, die eine Präferenz für einander relativ zu irgendeinem dritten Molekül zeigen, wobei jede Art von Interaktion eingeschlossen ist, die eine physikalische Assoziation zwischen einem Effektor oder einem Molekulargefäß und einem Durchdringungspeptid erlaubt. Dies schließt Vorgänge, wie eine kovalente, ionische, hydrophobe und Wasserstoffbindung, ein, ist aber nicht darauf beschränkt, schließt aber keine unspezifischen Assoziationen, wie Lösungsmittelpräferenzen, ein. Die Assoziation muss ausreichend stark sein, so dass der Effektor vor oder während dem Durchdringen der biologischen Barriere nicht dissoziiert. Die Fusion kann unter Verwendung irgendeines chemischen, biochemischen, enzymatischen oder genetischen Kopplungsverfahrens erreicht werden, das dem Fachmann bekannt ist. Der interessierende Effektor ist vorzugsweise mit dem C-terminalen Ende des Durchdringungspeptids gekoppelt.
In anderen Ausführungsformen könnte das Durchdringungspeptid auch ein Komplex sein, der aus dem Durchdringungspeptid besteht, das an einem "Molekulargefäß" angeheftet ist, in dem ein Effektor eingeschlossen ist. Geeignete Effektoren schließen irgendeines der geeigneten bioaktiven Peptide oder pharmazeutisch aktiven Mittel ein, die hier beschrieben sind, sind aber nicht darauf beschränkt. Ein Molekulargefäß könnte ein löslicher Rezeptor oder ein Teil eines löslichen Rezeptors sein (z.B. ein "Minirezeptor", wie in Kristensens, et al., J. Biol. Chem., 274(52):37351–56 (1999) beschrieben). Ein Molekulargefäß kann auch ein Bindungsprotein sein. Das Molekulargefäß wird als eine Bindungstasche mit hoher Affinität für die Verabreichung des intakten Effektors dienen, wie eines Hormons, eines Wachstumsfaktors oder irgendeines anderen Effektors. Ein Beispiel eines Molekulargefäßes ist ein löslicher Insulinrezeptor oder die Liganden Bindungsdomäne des Insulinrezeptors (z.B. der oben erwähnte "Minirezeptor"), um Insulin als einen Effektor zu binden und zu liefern. Ein anderes Beispiel für die Verwendung eines Molekulargefäßes, um nicht-permeable Effektoren zu liefern, ist die Verwendung eines intrinsischen Faktors, der an dem Durchdringungspeptid angeheftet ist, um die Verabreichung von Vitamin B12 als einen Effektor zu erlauben. In einer Weise dient das Molekulargefäß als ein "Trojanisches Pferd", um den sonst nicht permeablen Effektor über eine biologische Barriere zu translozieren. Der "Effektor" kann irgendein geeignetes Molekül sein, wie oben definiert.
Die hier beschriebenen Peptide können als die Grundlage für die Gestaltung von therapeutischen Arzneimittel enthaltenden Mikropartikeln/Tropfen dienen. Zum Beispiel sind Durchdringungspeptide an Fettresten angeheftet und in den Zwischenraum bzw. an der Grenzfläche eines hydrophoben Vesikels eingebaut, das die gewünschte pharmazeutische Zusammensetzung enthält. Dies kann über eine Amidbildung der freien Aminogruppe von (einem) zusätzlichen Lysin/en, das/die am C-Terminus des Durchdringungspeptids zugegeben werden, unter Verwendung langer Fettsäuren erreicht werden, wie Stearoyl, Palmitoyl oder Myristoyl.
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform schließt die Verwendung des erfindungsgemäßen Durchdringungsmoduls in der Herstellung eines Impfstoffs für orale Impfung durch Verabreichung an ein Subjekt. Das Durchdringungspeptid kann an ein gewünschtes Antigenprotein angeheftet sein. In einer Ausführungsform schließt die Erfindung ein ex vivo Verfahren zum Translozieren eines Effektors über eine biologische Barriere durch Koppeln des Effektors mit einem Durchdringungspeptidmodul ein, das in die biologische Barriere eingeführt werden kann.
Wie hier verwendet bedeutet der Begriff "biologische Barriere", dass biologische Membranen eingeschlossen sind, wie die Plasmamembran ebenso wie irgendwelche biologischen Strukturen, die durch Tight Junctions (oder verschließende Junctions) verschlossen sind, wie die Schleimhautepithelien, welche die Darm- oder Atemepithelien einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind, oder die Gefäßendothelien, welche die Bluthirnschranke einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
In noch weiteren Ausführungsformen schließt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung ein, die eine therapeutische oder prophylaktische wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Durchdringungsmoduls und einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthält.
Bevorzugte "pharmazeutische Zusammensetzungen" schließen Magensaft resistente Tabletten und Gallertkapseln ein, welche die aktiven Bestandteile zusammen mit a) Verdünnungsmitteln, z.B. Lactose, Dextrose, Sucrose, Mannitol, Sorbitol, Zellulose und/oder Glycin; b) Proteaseinhibitoren, wie Aprotinin oder Trasylol; c) Gleitmitteln, z.B. Kieselsäure, Talkum, Stearinsäure, ihrem Magnesium oder Calciumsalz, Poloxamer und/oder Polyethylenglykol; für Tabletten auch d) Bindemitteln, z.B. Magnesiumaluminiumsilikat, Stärkepaste, Gallerte, Traganth, Methylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon; e) ionischen oberflächenaktiven Mitteln, wie Gallensalzen, falls gewünscht f) unwesentlichen Bestandteilen, z.B. Stärken, Agar, Alginsäure oder ihrem Natriumsalz oder schäumenden Mischungen; und/oder g) Absorptionsmitteln, Farbstoffen, Geschmacksmitteln und Süßstoffen umfassen. Die Zusammenset zungen können sterilisiert werden und/oder Hilfsmittel enthalten, wie Konservierungsmittel, Reduktionsmittel, z. B. NAC (N-Acetyl-L-cystein) Stabilisierungs-, Befeuchtungs- oder Emulsionsmittel, Lösungsvermittler, Salze zum Regulieren des osmotischen Drucks und/oder Pufferlösungen. Zusätzlich können sie auch andere therapeutisch wertvolle Substanzen enthalten. Die Zusammensetzungen werden jeweils gemäß herkömmlichen Mischungs-, Granulierungs- bzw. Beschichtungsverfahren hergestellt und enthalten ungefähr 0,01 bis 75 %, vorzugsweise ungefähr 0,1 bis 10 % des aktiven Bestandteils.
Diese Zusammensetzungen können weiter eine Mischung aus mindestens zwei Substanzen enthalten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem nichtionischen Detergens, einem ionischen Detergens, einem Proteaseinhibitor und einem Reduktionsmittel besteht. Das nichtionische Detergens kann zum Beispiel ein Poloxamer sein; das Poloxamer kann Pluronic F-68 sein; das ionische Detergens kann ein Gallensalz sein; und das Gallensalz kann Taurodesoxycholat sein; der Proteaseinhibitor kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Aprotonin und Sojabohnen Trypsininhibitor besteht; und/oder das Reduktionsmittel kann NAC sein.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Durchdringungsmoduls durch Koppeln eines Effektors mit einem Durchdringungspeptid bereit. Das Durchdringungsmodul kann zum Beispiel durch Transfizieren einer Herstellungszelle mit einem Vektor, der ein Nukleinsäuremolekül eines Fusionsproteins aufweist, welches das Durchdringungspeptid und einen Effektor kodiert, der operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist; Kultivieren der Herstellungszelle unter Bedingungen, welche die Herstellung eines Fusionsproteins erlauben, welches das Durchdringungspeptid und ein Effektorpeptid einschließt; und Isolieren des Fusionsproteins hergestellt werden. Das Durchdringungsmodul kann auch zum Beispiel durch Verwenden von Festphasenpeptid Syntheseverfahren hergestellt werden, wie im Stand der Technik gut bekannt ist. Die Durchdringungsmodule, die durch die Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Durchdringungspeptids hergestellt sind, können auch weiter chemisch modifiziert werden. Ein oder mehrere Polyethylenglykol (PEG) Rest/e kann/können zum Beispiel an die erfindungsgemäßen Durchdringungspeptide angeheftet werden.
In einer anderen Ausführungsform kann der Effektor mit dem Durchdringungspeptid durch eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung gekoppelt sein. Die kovalente Bindung kann zum Beispiel eine Peptidbindung sein, oder die kovalente Bindung kann durch ein homo- oder ein heterofunktionelles Brückenreagens erreicht werden. Das Brückenreagens kann ein Reagens des Typs eines Succinimidyl-(N-Maleimidmethyl)cyclohexan-1-carboxylats (SMCC) sein. Die kovalente Bindung kann auch durch Verwenden eines Peptidlinkers erreicht werden. In einigen Ausführungsformen kann der Peptidlinker eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 16 oder 17 aufweisen und kann durch ein Enzym gespalten werden. In einigen Ausführungsformen kann das Enzym konditionell in einem bestimmten physiologischen Zustand aktiviert werden, und der freigesetzte Faktor kann diesen physiologischen Zustand günstig beeinflussen. In anderen Ausführungsformen kann die nicht-kovalente Bindung durch eine Anheftung eines hydrophoben Rests an das Durchdringungspeptid erreicht werden, so dass es der hydrophobe Rest dem Durchdringungsmodul erlaubt, an der Grenzfläche eines hydrophoben Vesikels eingebaut zu werden, in dem der Effektor enthalten ist. In anderen Ausführungsformen kann die nicht-kovalente Bindung das Ergebnis einer Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin Interaktion sein.
In verschiedenen anderen Ausführungsformen sind die Durchdringungspeptide von einem pathogenen oder nicht pathogenen Bakterium abgeleitet, das durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, biologische Barrieren in vivo zu durchdringen. In einigen Ausführungsformen sind die Durchdringungspeptide von integralen Membranproteinen pathogener oder nicht pathogener Bakterien abgeleitet. In anderen Ausführungsformen sind die Durchdringungspeptide von extrazellulären Proteinen abgeleitet, die durch pathogene oder nicht pathogene Bakterien freigesetzt werden. In anderen Ausführungsformen ist das Durchdringungspeptid von einem Bakterientoxin abgeleitet. In noch anderen Ausführungsformen sind die Durchdringungspeptide von humanen Neurokinin Rezepto ren abgeleitet, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet sind, biologische Barrieren in vivo zu durchdringen, oder sie sind von viralen Proteinen abgeleitet.
In noch weiteren Ausführungsformen ist das Konzept eines konditionell aktivierten Effektors gestaltet, um eine selektive Freisetzung und Aktivierung von Proteinen unter Bedingungen zu erlauben, bei welchen und an Stellen an welchen ihre Aktivität vorteilhaft ist.
In dieser Ausführungsform wird das vorteilhafte Protein (der Effektor) mit dem Durchdringungspeptid durch ein abspaltbares Linkerpeptid gekoppelt. Die Schnittstelle wird endogen erkannt und durch ein Enzym der Kaskade abgespalten, das durch den Effektor zum Ziel gemacht wird. Der freigesetzte Effektor kann als ein Inhibitorprotein oder ein Aktivator gewünschter Vorgänge wirken.
Schließlich schließt eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform die Verwendung eines erfindungsgemäßen Durchdringungsmoduls in der Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Verhindern einer Erkrankung oder eines pathologischen Zustandes durch Verabreichung an ein Subjekt ein, in dem eine solche Behandlung oder Verhinderung gewünscht ist. Die Erkrankung oder der Zustand, der behandelt werden soll, kann zum Beispiel endokrine Störungen, die Diabetes, Unfruchtbarkeit, Hormondefizienzen und Osteoporose einschließen; neurodegenerative Störungen, die Alzheimer'sche Erkrankung, Parkinsonsche Erkrankung und Huntington'sche Erkrankung einschließen; Herzkreislaufstörungen, die Atherosklerose, Zustände mit erhöhter Gerinnung und Zustände mit verringerter Gerinnung, Herzerkrankung und zerebrovaskuläre Ereignisse einschließen; metabolische Störungen, die Fettleibigkeit und Vitamindefizienzen einschließen; hämatologische Störungen und neoplastische Störungen einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Die Details einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Ausführungsformen sind in der beigefügten Beschreibung unten angegeben. Obwohl jegliche Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu jenen sind, die hier beschrieben sind, in der Durch führung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben. Andere erfindungsgemäße Merkmale, Gegenstände und Vorteile werden aus der Beschreibung und aus den Ansprüchen ersichtlich. In der Beschreibung und den angehängten Ansprüchen schließen die singulären Formen Pluralentsprechungen ein, sofern es der Zusammenhang nicht klar anders angibt. Sofern nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet sind, dieselbe Bedeutung, wie sie im Allgemeinen durch den Fachmann verstanden wird, den diese Erfindung betrifft.
Die Vorteile der Verwendung kleiner Peptidträger schließen hohe Qualität und Reinheit, geringe Immunogenität und das Potenzial für eine hoch wirksame Verabreichung an biologische Barrieren in einem Organismus ein. Entsprechend haben Peptidträger das Potenzial, auf herkömmlichen Transportern, wie Liposomen oder Viren, die wirksame Verabreichung vieler Makromoleküle zu verbessern. Die vorliegende Erfindung setzt ein kurzes Peptidmotiv ein, um insbesondere ein Durchdringungsmodul zu bilden, um Makromoleküle über biologische Barrieren zu transportieren, die durch Tight Junctions verschlossen sind.
Das erfindungsgemäße Durchdringungsmodul zielt insbesondere auf verschiedene Gewebe ab, insbesondere epitheliale und endotheliale, zur Verabreichung von Arzneimitteln und anderen therapeutischen Mitteln über eine biologische Barriere. Bestehende Transportsysteme im Stand der Technik sind zu begrenzt um eine allgemeine Anwendung darzustellen, weil sie unwirksam sind, die biologischen Eigenschaften der aktiven Substanz verändern, die Zielzelle abtöten, die biologische Barriere irreversibel zerstören und/oder ein zu hohes Risiko darstellen, um in menschlichen Subjekten verwendet zu werden.
Die vorliegende Erfindung verwendet konservierte Peptidsequenzen von verschiedenen Proteinen, die an Parazytose beteiligt sind, um ein Durchdringungsmodul zu bilden, das in der Lage ist, biologische Barrieren zu durchqueren. Zum Beispiel erleichtert ein Peptid, das kodiert wird durch oder abgeleitet ist von ORF HI0638 von Haemophilus in fluenzae, ein Durchdringen dieses Bakteriums zwischen humanen epithelialen Zellen der Lunge ohne die epitheliale Barriere zu beeinträchtigen. Die Peptidsequenz, die für den ORF HI0638 kodiert, ist im Allgemeinen in pathogenen Bakterien oder Symbionten konserviert, die zum Beispiel Haemophilus influenzae, Pasteurella multocida, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Buchnera aphidicola, Pseudomonas aeruginosa und Xylella fastidiosa einschließen. Ein Peptid das zur N-terminalen Sequenz von HI0638 homolog ist, wird auch in anderen Bakterien gefunden, die zum Beispiel Rhizobium loti, Chlamydia pneumoniae, NprB von Bacillus subtilis und Piline von Kingella dentrificans (bzw. denitrificans) und Eikenella corrodens einschließen.
Darüber hinaus ist eine ähnliche Peptidsequenz auch in Proteinen eukaryotischen Ursprungs konserviert, wie die Neurokininrezeptor Familienproteine, welche die humanen NK-1 und NK-2 Rezeptoren einschließen. Es ist bekannt, dass die Neurokininrezeptor Familie an der Kontrolle interzellulärer Permeabilität beteiligt ist, die Plasma Extravasation und Ödembildung einschließt. Der Extravasation, dem Austritt und der Ausbreitung von Blut oder Flüssigkeit aus Gefäßen in die umgebenden Gewebe, folgen häufig Entzündungsvorgänge, die an Gewebeschädigung, Allergie, Verbrennungen und Entzündung beteiligt sind. Insbesondere falls NK-1 Rezeptoren auf Blutgefäßen aktiviert werden, erfolgt eine Hautentzündung, die auf eine Zunahme von Gefäßpermeabilität zurückzuführen ist. Siehe Inoue, et al., Inflamm. Res., 45:316–323 (1996). Der Neurokinin NK-1 Rezeptor vermittelt auch durale und extrakraniale Plasmaprotein Extravasation, wodurch der NK-1 Rezeptor mit der Pathophysiologie von Migränekopfschmerz in Zusammenhang gebracht wird. Siehe O'Shaughnessy und Connor, Euro. J. of Pharm., 236:319–321 (1993).
Die Sequenzen beispielhafter Durchdringungspeptide zur erfindungsgemäßen Verwendung sind in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1
Alternativ kann das erfindungsgemäße Durchdringungsmodul ein Peptid einschließen, das mindestens 12 zusammenhängende Aminosäuren irgendeines der Peptide enthält, die durch die SEQ ID NRN: 1–15 und 24–29 definiert sind.
Das erfindungsgemäße Durchdringungsmodul zeigt eine wirksame, nicht invasive Verabreichung einer unveränderten biologisch aktiven Substanz. Das erfindungsgemäße Durchdringungsmodul kann zum Beispiel in der Behandlung von Diabetes verwendet werden. Insulinspiegel im Blutstrom müssen genau reguliert werden. Das erfindungsgemäße Durchdringungsmodul kann verwendet werden, um Insulin über das Schleimhautepithel bei einer hohen Ausbeute zu liefern. Alternative nicht invasive Insulin Verabreichungsverfahren, die zuvor im Stand der Technik bekannt waren, weisen typische Ausbeuten von 1–5 % auf und verursachen nicht tolerierbare Schwankungen in der Menge an absorbiertem Insulin.
Zusätzlich können diese Durchdringungsmodule verwendet werden, um Zustände zu behandeln, die sich durch Atherosklerose und die Bildung von Thrombi und Emboli ergeben, wie einen myokardialen Infarkt und zerebrovaskuläre Unfälle. Insbesondere können die Durchdringungsmodule verwendet werden, um Heparin über die Schleimhautepithelien zu liefern.
Die erfindungsgemäßen Durchdringungsmodule können auch verwendet werden, um weibliche Fruchtbarkeitsschwierigkeiten zu behandeln. Zum Beispiel können die Durchdringungsmodule verwendet, um Follikel stimulierendes Hormon ("FSH") über die Schleimhautepithelien zu transportieren.
Zuvor erforderte die Verabreichung von Effektoren (z.B. die Verabreichung von Insulin oder Heparin an den Blutstrom) invasive Techniken, wie intravenöse oder intramuskuläre Injektionen. Ein Vorteil der Durchdringungsmodule ist, dass sie Effektoren über biologische Barrieren durch nicht invasive Verabreichung liefern können, die zum Beispiel orale, bukkale, Inhalation, Insufflation, transdermale oder depositorische einschließen.
Zusätzlich ist ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Durchdringungsmodule, dass die Bluthirnschranke überqueren können, wodurch Effektoren an das ZNS geliefert werden.
Die hier beschriebenen Peptide können als die Grundlage für die Gestaltung therapeutischer "Frachten" dienen, nämlich das Koppeln der Träger ("Durchdringungspeptid") mit einem oder mehreren therapeutischen Mitteln ("Effektoren"). Eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung kann verwendet werden, um ein Durchdringungspeptid mit einem oder mehreren Effektoren oder Molekulargefäßen zu koppeln. Peptidlinker, die durch endogene Peptidasen abgespalten werden, können verwendet werden, um Durchdringungspeptide und Effektoren oder Molekulargefäße zu koppeln. Ein Beispiel eines abtrennbaren Peptidlinkers ist die Aminosäuresequenz IEGR (SEQ ID NR: 16), die im Blutstrom durch einen Faktor Xa abgespalten werden kann (siehe z.B. Karlheinz, P., et al., Circulation 101:1158–1164 (2000)).
Peptidlinker sind kurze Sequenzen, die zwischen den Aminosäuresequenzen des Durchdringungspeptids und des Effektors auftreten. Diese Peptidlinker werden durch endogene Peptidasen oder andere Enzyme abgespalten, wodurch das Koppeln des Durchdringungspeptids mit dem Effektor dissoziiert. Solche Peptidlinker können für die Bildung konditionell aktivierter Effektoren verwendet werden. Konditionell aktivierte Effektoren werden mit Durchdringungspeptiden durch Peptidlinker gekoppelt, die vorzugsweise während besonderer physiologischer Vorgänge abgespalten werden. Sobald er abgespalten ist, wird der Effektor freigesetzt, um den Vorgang zu modulieren – zum Beispiel eine Hemmung einer Signalkaskade. Vorzugsweise wird eine Abspaltung durch Verwenden von Linkersequenzen erreicht, die durch Proteasen abgespalten werden, die durch die ausgelöste Kaskade physiologisch aktiviert werden. So dient der konditionell aktivierte Effektor als ein "negativer Rückkopplungs-"Mechanismus, der den physiologischen Vorgang hemmt, der ihn aktiviert.
Ein Beispiel eines konditionell aktivierten Effektors ist ein Thrombolyse Aktivator, z.B. tPA (Gewebeplasminogen Aktivator; engl.: tissue plasminogen activator). Durch Ver wenden des oben erwähnten Linkers (d.h. SEQ ID NR: 16) zur Abspaltung durch den Faktor Xa wird tPA vorzugsweise an Stellen aktiver Koagulation freigesetzt. Auf diese Weise können übermäßige Koagulationskaskaden moduliert werden, um eine pathologische Thrombose aufgrund der lokalen Freisetzung von tPA zu verringern. Alternativ können andere Koagulationsinhibitoren anstatt von tPAs verwendet werden, z.B. Hirudin, Hirulog, Protein C, Protein C Aktivator oder Protein S.
Ein anderes Beispiel konditionell aktivierter Effektoren ist ein Komplementkaskade Inhibitor, z.B. C1q Inhibitor. In diesem Beispiel wird ein Peptidlinker eingebaut, der spezifisch durch Elemente der Komplementkaskade, z.B. C3a, abgespalten wird. So wird eine übermäßige Komplementaktivierung gehemmt, wodurch das Ausmaß pathologischer Entzündungsvorgänge abgeschwächt wird.
Durch ein nicht beschränkendes Beispiel können konditionell aktivierte erfindungsgemäße Effektoren z.B. in der Hemmung übermäßiger Blutgerinnung, in der Hemmung pathologischer Entzündungsvorgänge, in der Hemmung von Bluthochdruck und kongestivem Herzfehler durch eine von einem Angiotensin umsetzenden Enzym (engl.: angiotensin converting enzyme (ACE)) abhängige Freisetzung eines geeigneten Effektors, wie eines vom Gehirn abgeleiteten natriuretischen Peptids (engl.: brain-derived natriuric peptide (BNP)), oder in der Hemmung eines übermäßigen extrazellulären Matrixabbaus, wie dem Abbau, der während Entzündungsprozessen oder Tumorinvasion erfolgt, durch eine von Matrix Metalloproteinasen (MPP) abhängige Freisetzung eines Effektors, wie eines Gewebeinhibitors von Metalloproteinasen (TIMP), verwendet werden.
Alternativ kann das Durchdringungspeptid an einen Linker angeheftet werden, an dem Bild gebende Verbindungen kovalent angeheftet werden können, zum Beispiel durch freie Aminogruppen von Lysinresten. Solche Linker schließen die Aminosäuresequenz GGKGGK (SEQ ID NR: 17) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein Durchdringungspeptid ist ein Peptid, das den Durchtritt, die Translokation oder die Durchdringung einer Substanz über eine biologische Barriere erleichtert, insbesondere zwischen Zellen, die durch Tight Junctions "verschlossen" sind. Die Translokation kann durch irgendein Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, nachgewiesen werden, das ein Verwenden von radioaktiver Markieren und/oder fluoreszierender Sonden einschließt, die in ein Durchdringungsmodul in Verbindung mit einem Parazytosetest eingebaut sind, wie zum Beispiel in Schilfgaarde, et al., Infect. and Immun., 68(8):4616–23 (2000) beschrieben. Im Allgemeinen wird ein Parazytosetest durchgeführt durch: a) Inkubieren einer Zellschicht mit einem Durchdringungspeptid oder -modul; b) Herstellen von Querschnitten der Zellschichten; und c) Nachweisen der Anwesenheit der Peptide oder Peptidmodule. Der Nachweisschritt kann durch Inkubieren der fixierten Zellschnitte mit markierten Antikörpern durchgeführt werden, die gegen das Peptid gerichtet sind, gefolgt durch einen Nachweis einer immunologischen Reaktion zwischen dem Peptid und dem markierten Antikörper. Alternativ kann das Peptid unter Verwendung einer radioaktiven Markierung oder einer fluoreszierenden Markierung oder eines Farbstoffs markiert werden, um die Anwesenheit des Peptids direkt nachzuweisen. Ferner kann ein Biotest verwendet werden, um die Peptidtranslokation zu überwachen. Zum Beispiel kann unter Verwendung eines bioaktiven Peptids, wie Insulin, das an ein Durchdringungsmodul angeheftet ist, der Abfall im Blutglucosespiegel gemessen werden.
Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff "Effektor" irgendein Molekül oder irgendeine Verbindung von zum Beispiel biologischem, therapeutischem, pharmazeutischem, diagnostischem Interesse, Interesse für Tracing oder Nahrungsmittelverarbeitung. Er kann aus Nukleinsäuren (Ribonukleinsäure, Desoxyribonukleinsäure) verschiedener Ursprünge und insbesondere aus humanem, viralem, tierischem, eukaryotischem oder prokaryotischem, pflanzlichem, synthetischem Ursprung etc. bestehen. Eine interessierende Nukleinsäure kann eine Vielfalt von Größen aufweisen, die von zum Beispiel einem einfachen Trace Nukleotid bis zu einem Genomfragment oder einem ganzen Genom reichen. Sie kann ein virales Genom oder ein Plasmid sein. Alternativ kann der interessierende Effektor auch ein Protein, wie zum Beispiel ein Enzym, ein Hormon, ein Zytokin, ein Apolipoprotein, ein Wachstumsfaktor, eine bioaktives Peptid, ein Antigen oder ein Antikörper etc. sein. Darüber hinaus kann der Effektor ein pharmazeutisches aktives Mittel sein, wie zum Beispiel ein Toxin, ein therapeutisches Mittel oder ein antipathogenes Mittel, wie ein Antibiotikum, ein antivirales, antifungales oder ein antiparasitisches Mittel. Der Effektor kann auch ein physiologisch aktives Molekül sein, wie ein Vitamin. Der interessierende Effektor kann selbst direkt aktiv sein oder kann in situ durch das Peptid, durch das Molekulargefäß, durch eine bestimmte Substanz oder durch Umweltbedingungen aktiviert werden.
Der Begriff "pharmazeutisch aktives Mittel" und "therapeutisches Mittel" werden wir hier verwendet, um ein chemisches Material oder eine Verbindung, die, wenn sie einem Organismus verabreicht wird, einen nachweisbaren pharmakologischen und/oder physiologischen Effekt induziert.
Die erfindungsgemäßen Durchdringungsmoleküle werden durch die Tatsache gekennzeichnet, dass ihre Durchdringungsfähigkeit von der Art des Effektors oder des Molekulargefäßes, das mit ihm gekoppelt ist, nahezu unabhängig ist.
In die Erfindung eingeschlossen sind auch Verfahren zur Herstellung der hier beschriebenen Durchdringungsmodule. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßes Durchdringungsmodul durch standardmäßige rekombinante DNA Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Durch ein nicht einschränkendes Beispiel können DNA Fragmente, die für die unterschiedlichen Polypeptidsequenzen kodieren, im Leseraster gemäß herkömmlicher Techniken zusammen ligiert werden, z.B. durch Einsetzen stumpf endender oder gestaffelt endender Termini zur Ligierung, Restriktionsenzymspaltung, um passende Termini bereitzustellen, Einfüllen kohäsiver Enden, wie passend, alkalische Phosphatasebehandlung, um ungewünschtes Verbinden zu vermeiden, und enzymatische Ligierung. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen durch herkömmliche Techniken synthetisiert werden, die automatisierte DNA Synthetisier-Geräte einschließen.
Alternativ kann eine PCR Amplifikation von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern durchgeführt werden, was zu komplementären Überständen zwischen zwei aufeinander folgenden Genfragmenten führt, die anschließend reassoziiert und reamplifiziert werden können, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (siehe z.B. Ausubel, et al. (Hrsg.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Darüber hinaus sind viele Expressionsvektoren kommerziell verfügbar, die schon einen Fusionsrest kodieren (z.B. ein GST Polypeptid). Ein Nukleinsäure, die ein Durchdringungspeptid kodiert, kann in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, so dass der Fusionsrest im Leseraster zu dem Durchdringungspeptid verknüpft ist.
Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure zu transportieren, mit der sie verknüpft worden ist. Ein Typ eines Vektors ist ein "Plasmid", das eine zirkuläre doppelsträngige DNA Schleife bezeichnet, in die zusätzliche DNA Segmente ligiert werden können. Ein anderer Typ eines Vektors ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren sind in der Lage, sich in einer Wirtszelle autonom zu replizieren, in die sie eingeführt werden (z.B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomalen Säugetier Vektoren). Andere Vektoren (z.B. nicht episomale Säugetier Vektoren) werden nach einem Einführen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren in der Lage, die Expression von Genen zu steuern, mit denen sie operativ verknüpft sind. Solche Vektoren sind hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren zu einer Verwendung in rekombinanten DNA Techniken häufig in der Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" synonym verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist. Jedoch wird beabsichtigt, dass die Erfindung solche anderen Formen von Expressionsvektoren einschließt, wie virale Vektoren (z.B. replikationsgestörte Retroviren, Adenoviren und Adeno assoziierte Viren), die als äquivalente Funktionen dienen.
Rekombinante Expressionsvektoren umfassen eine Nukleinsäure in einer Form, die zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen einschließen, die auf der Grundlage der Wirtszellen ausgewählt sind, um sie für eine Expression zu verwenden, die mit der Nukleinsäuresequenz operativ verknüpft ist/sind, um sie zu exprimieren. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors soll "operativ verknüpft" bedeuten, dass die interessierende Nukleotidsequenz mit der/den regulatorischen Sequenz/en in einer Weise verknüpft ist, die eine Expression der Nukleotidsequenz ermöglicht (z.B. in einem in vitro Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, falls der Vektor in die Wirtszelle eingeführt ist).
Der Begriff "regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale) einschließen. Solche regulatorischen Sequenzen sind zum Beispiel in Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) beschrieben. Regulatorische Sequenzen schließen jene ein, die eine konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Typen einer Wirtszelle steuern, und jene, die eine Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern (z.B. Gewebe spezifische regulatorische Sequenzen). Es wird vom Fachmann erkannt werden, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von solchen Faktoren abhängen kann, wie die Auswahl der Wirtszelle, die transformiert werden soll, dem Spiegel einer Expression eines gewünschten Proteins, etc.. Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, um dadurch Proteine oder Peptide herzustellen, die Fusionsproteine oder -peptide einschließen, die durch Nukleinsäuren kodiert werden, wie hier beschrieben (z.B. Durchdringungspeptide oder -module).
Rekombinante Expressionsvektoren können zur Expression von Durchdringungspeptiden oder -modulen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen gestaltet werden. Zum Beispiel können Durchdringungspeptide oder Module in bakteriellen Zellen, wie Escherichia coli, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden in Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) weiter diskutiert. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro zum Beispiel unter Verwendung von T7 Promotor Regulationssequenzen und T7 Polymerase transkribiert und translatiert werden.
Eine Expression von Proteinen in Prokaryoten wird häufig in Escherichia coli mit Vektoren durchgeführt, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche die Expression entweder von Fusions- oder nicht Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren geben eine Anzahl von Aminosäuren zu einem Protein, das darin kodiert ist, gewöhnlich zu dem Aminoterminus des rekombinanten Proteins zu. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise drei Zwecken: (i) um eine Expression von rekombinantem Protein zu erhöhen; (ii) um die Löslichkeit des rekombinanten Proteins zu erhöhen; und (iii) um in der Reinigung des rekombinanten Proteins durch ein Wirken als ein Ligand in einer Affinitätsreinigung behilflich zu sein. Häufig wird in Fusionsexpressionsvektoren eine proteolytische Schnittstelle an der Verbindung des Fusionsrests und des rekombinanten Proteins eingeführt, um eine Trennung des rekombinanten Proteins vom Fusionsrest im Anschluss an eine Reinigung des Fusionsproteins zu erlauben. Solche Enzyme und ihre verwandten Erkennungssequenzen schließen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase ein. Typische Fusionsexpressionsvektoren schließen pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith und Johnson, 1988, Gene 67:31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) ein, die jeweils Glutathion S-Transferase (GST), Maltose E Bindungsprotein bzw. Protein A mit dem rekombinanten Zielprotein fusionieren.
Beispiele geeigneter induzierbarer, nicht Fusions E. coli Expressionsvektoren schließen pTrc (Amrann, et al., (1988) Gene 69:301–315) und pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) (60–89) ein.
Eine Strategie rekombinante Proteinexpression in E. coli zu maximieren ist es, das Protein in einem Wirtsbakterium mit einer beeinträchtigten Kapazität das rekombinante Protein proteolytisch abzuspalten, zu exprimieren. Siehe z.B. Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119–128. Eine andere Strategie ist es, die Nukleinsäuresequenz der Nukleinsäure zu verändern, die in einem Expressionsvektor eingeführt werden soll, so dass die einzelnen Kodons für jede Aminosäure jene sind, die in E. coli vorzugsweise verwendet werden (siehe z.B. Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111–2118). Eine solche Veränderung von Nukleinsäuresequenzen, welche die erfindungsgemäßen Durchdringungspeptide oder -module kodieren, kann durch Standard DNA Synthesetechniken durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist der Expressionsvektor ein Hefe Expressionsvektor. Beispiele von Vektoren zur Expression in Hefe Saccharomyces cerivisae schließen pYepSec1 (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, 1982. Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz, et al., 1987. Gene 54: 113–123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) und picZ (Invitrogen Corp., San Diego, Calif.) ein.
Alternativ kann ein Durchdringungspeptid oder -modul in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus Vektoren, die zur Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen verfügbar sind (z.B. SF9 Zellen), schließen die pAc Serien (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156–2165) und die pVL Serien (Lucklow und Summers, 1989. Virology 170: 31–39) ein.
In noch einer anderen Ausführungsform wird eine Nukleinsäure, welche die erfindungsgemäßen Durchdringungsmodule kodiert, in Säugetierzellen unter Verwendung eines Säugetier Expressionsvektor exprimiert. Beispiele von Säugetier Expressionsvektoren schließen pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187–195) ein. Wenn sie in Säugetierzellen verwendet werden, werden die Kontrollfunktionen der Expressionsvektoren häufig durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Zum Beispiel sind allgemein verwendete Promotoren vom Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian Virus 40 abgeleitet. Für andere geeignete Ex pressionssysteme für sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen siehe z.B. Kapitel 16 und 17 von Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
In einer anderen Ausführungsform ist der rekombinante Säugetier Expressionsvektor in der Lage, die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem besonderen Zelltyp zu steuern (z.B. werden Gewebe spezifische regulatorische Elemente verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren). Gewebe spezifische regulatorische Elemente sind im Stand der Technik bekannt. Nicht beschränkende Beispiele geeigneter Gewebe spezifischer Promotoren schließen den Albuminpromotor (Leber spezifisch; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268–277), Lymphoid spezifische Promotoren (Calame und Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235–275), insbesondere Promotoren von T Zellrezeptoren (Winoto und Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729–733) und Immunglobuline (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729–740; Queen und Baltimore, 1983. Cell 33: 741–748), Neuron spezifische Promotoren (z.B. der Neurofilament Promotor; Byrne und Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473–5477), Pankreas spezifische Promotoren (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912–916) und Brustdrüsen spezifische Promotoren (z.B. Milchserum Promotor; das U.S. Pat. Nr. 4,873,316 und die Veröffentlichung der europäischen Anmeldung Nr. 264,166 ) ein. Entwicklungsregulierte Promotoren sind auch umfasst, z.B. die Mäuse Hox Promotoren (Kessel und Gruss, 1990. Science 249: 374–379) und der α-Fetoprotein Promotor (Campes und Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537–546).
Die Erfindung stellt weiter einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein DNA Molekül umfasst, welches das erfindungsgemäße Durchdringungsmodul kodiert, das in den Expressionsvektor in einer Antisense Orientierung kloniert ist. Das heißt, dass das DNA Molekül operativ mit einer regulatorischen Sequenz in einer Weise verknüpft ist, die eine Expression (durch Transkription des DNA Moleküls) eines RNA Moleküls erlaubt, das zu der Durchdringungspeptid oder -modul mRNA antisense ist. Es können regulatorische Sequenzen, die operativ mit einer Nukleinsäure verknüpft sind, die in der Antisense Orientierung kloniert ist, ausgewählt werden, welche die fortdauernde Ex pression des Antisense RNA Moleküls in einer Vielfalt von Zelltypen regeln, zum Beispiel virale Promotoren und/oder Enhancer, oder es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die eine konstitutive, Gewebe spezifische oder Zelltyp spezifische Expression von Antisense RNA steuern. Der Antisense Expressionsvektor kann in der Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus vorliegen, in dem Antisense Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines hoch wirksamen regulatorischen Bereichs hergestellt werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp bestimmt werden kann, in den der Vektor eingeführt ist. Für eine Diskussion der Regulation von Genexpression unter Verwendung von Antisense Genen siehe z.B. Weintraub, et al., "Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis", Reviews-Trends in Genetics, Band 1(1) 1986.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in die ein rekombinanter Expressionsvektor eingeführt worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier synonym verwendet. Es wird verstanden, dass solche Begriffe nicht nur die besonderen Subjektzellen bezeichnen, sondern auch die Vorläufer oder potenziellen Vorläufer einer solchen Zelle. Da bestimmte Modifikationen in aufeinander folgenden Generationen entweder aufgrund von Mutationen oder Umwelteinflüssen erfolgen können, darf ein solcher Vorläufer in der Tat mit der Vorgängerzelle nicht identisch sein, er ist aber noch in dem Schutzbereich des Begriffs eingeschlossen, wie hier verwendet.
Eine Wirtszelle kann irgendeine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Zum Beispiel kann das Durchdringungspeptid oder -modul in bakteriellen Zellen, wie E. coli, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie chinesische Hamster Eierstockzellen (engl.: Chinese hamster ovary cells (CHO) oder COS Zellen), exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
Vektor DNA kann in prokaryotische oder eurkaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Wie hier verwendet, beabsichtigen die Begriffe "Transformation" und "Transfektion" eine Vielfalt von im Stand der Technik bekannten Techniken zum Einführen fremder Nukleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle zu bezeichnen, die Calciumphosphat oder Calciumchlorid Kopräzipitation, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation einschließen. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen können in Sambrook, et al. (MOLCEULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) und anderen Laborhandbüchern gefunden werden.
Für eine stabile Transfektion von Säugetierzellen ist es bekannt, dass, in Abhängigkeit vom Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik, nur ein kleiner Anteil von Zellen die fremde DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integratoren zu identifizieren und auszuwählen, wird im Allgemeinen ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert (z.B. eine Resistenz gegen Antibiotika) in die Wirtszelle zusammen mit dem interessierenden Gen eingeführt. Verschiedene selektierbare Marker schließen jene ein, die eine Resistenz gegen Arzneimittel übertragen, wie G418, Hygromycin und Methotrexat. Eine Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker kodiert, kann in die Wirtszelle auf demselben Vektor eingeführt werden, wie jener, der das Durchdringungspeptid oder -modul kodiert, oder kann auf einem getrennten Vektor eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfiziert sind, können durch eine Arzneimittelselektion identifiziert werden (z.B. werden Zellen, die das selektierbare Markergen eingebaut haben überleben, während die anderen Zellen sterben).
Eine Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann verwendet werden, um ein Durchdringungspeptid oder -modul herzustellen (d.h. zu exprimieren). Dementsprechend stellt die Erfindung weiter Verfahren zur Herstellung von Durchdringungsmodulen unter Verwendung der Wirtszellen bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ein Kultivieren der Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor eingeführt worden ist, der ein Durchdringungsmodul kodiert) in einem geeigneten Medium, so dass das Durchdringungsmodul hergestellt wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter ein Isolieren des Durchdringungsmoduls vom Medium oder der Wirtszelle.
Die erfindungsgemäßen Durchdringungsmodule können auch unter Verwendung von Festphasenpeptid Syntheseverfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel kann ein Durchdringungspeptid unter Verwendung des Merrifield Festphasen Syntheseverfahrens synthetisiert werden. (Siehe z.B. Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963); ENCYLOPEDIA OF MOLECULAR BIOLOGY 806 (1. Aufl. 1994)). Bei diesem Verfahren wird die C-terminale Aminosäure an ein nicht lösliches polymeres Trägerharz (z.B. Polystyrolkügelchen) angeheftet, wodurch eine immobilisierte Aminosäure gebildet wird. Um ungewollte Reaktionen zu vermeiden, wenn die C-terminale Aminosäure an das Harz angeheftet wird, wird die Aminogruppe der C-terminalen Aminosäure unter Verwendung von z.B. einer tert-Butyloxylcarbonyl (t-BOC) Gruppe geschützt oder "blockiert". Die Blockierungsgruppe, z.B. t-BOC, an der immobilisierten Aminosäure wird anschließend durch Zugeben einer verdünnten Säure zu der Lösung entfernt. Bevor eine zweite Aminosäure an die immobilisierte Peptidkette angeheftet wird, wird die Aminogruppe der zweiten Aminosäure blockiert, wie oben beschrieben, und die α-Carboxylgruppe der zweiten Aminosäure wird durch eine Reaktion mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) aktiviert. Die aktivierte α-Carboxylgruppe der zweiten Aminosäure reagiert anschließend mit der freien Aminogruppe der immobilisierten Aminosäure, um eine Peptidbindung zu bilden. Zusätzliche Aminosäuren werden anschließend einzeln zu der terminalen Aminosäure der immobilisierten Peptidkette gemäß der erforderlichen Sequenz für das gewünschte Durchdringungspeptid oder -modul zugegeben. Sobald die Aminosäuren in der erforderlichen Sequenz zugegeben worden sind, wird das vollständige Peptid vom Harz freigesetzt, wie zum Beispiel durch Verwenden von Fluorwasserstoff, der die Peptidbindungen nicht angreift.
Das erfindunsgemäße Durchdringungsmodul kann auch unter Verwendung von Fmoc Festphasen Peptidsynthese synthetisiert werden. (Siehe z.B. University of Illinois at Urbana-Champaign Protein Sciences Facility, Solid-Phase Peptide Synthesis (SPPS), at http://www.biotech.uiuc.edu/spps.htm). Bei diesem Verfahren wird die C-terminale Aminosäure an ein unlösliches polymeres Trägerharz (z.B. Polystyrolkügelchen, vernetzte Polystyrolharze, etc.) angeheftet, wie zum Beispiel über eine säurelabile Bindung mit einem Linkermolekül. Um ungewollte Reaktionen zu vermeiden, wenn die C-terminale Aminosäure an das Harz angeheftet wird, wird die Aminogruppe der C-terminalen Aminosäure unter Verwendung einer Fmoc Gruppe blockiert. Die Blockierungsgruppe, z.B. Fmoc, an der terminalen Aminosäure der immobilisierten Aminosäure wird anschließend durch Zugeben einer Base zu der Lösung entfernt. Funktionelle Seitenkettengruppen werden auch unter Verwendung irgendwelcher basenstabilen, säurelabilen Gruppen geschützt, um ungewollte Reaktionen zu vermeiden. Bevor die zweite Aminosäure an die immobilisierte Aminosäure angeheftet wird, wird die Aminogruppe der zweiten Aminosäure blockiert, wie oben beschrieben, und die α-Carboxylgruppe jeder folgenden Aminosäure wird durch Bilden eines N-Hydroxybenzotriazol (HOBt) Esters in situ aktiviert. Die aktivierte α-Carboxylgruppe der zweiten Aminosäure und die freie Aminogruppe der immobilisierten Aminosäure reagieren anschließend in der Anwesenheit einer Base, um eine neue Peptidbindung zu bilden. Zusätzliche Aminosäuren werden dann aufeinander folgend zu der terminalen Aminosäure der immobilisierten Peptidkette zugegeben, bis das gewünschte Peptid aufgebaut worden ist. Sobald die nötigen Aminosäuren angeheftet worden sind, kann die Peptidkette vom Harz abgespalten werden, wie zum Beispiel unter Verwendung einer Mischung aus Trifluoressigsäure (engl.: trifluoroacetic acid (TFA)) und Radikalfängern (z.B. Phenol, Thioanisol, Wasser, Ethandithiol (EDT) und Triisopropylsilan (TIS)), die wirksam sind, um irgendwelche Kationen zu neutralisieren, die gebildet wurden als die Schutzgruppen entfernt wurden, die an die funktionellen Seitenketten der zusammengebauten Peptidkette angeheftet waren.
Es ist dem Fachmann gut bekannt, dass Proteine oder Peptide, die durch irgendeines der obigen Verfahren hergestellt werden, weiter chemisch modifiziert werden können, um die Halbwertszeit eines Proteins im Kreislauf zu erhöhen. Durch nicht einschränkende Beispiele können Polyethylenglykol (PEG) Reste an die erfindungsgemäßen Durchdringungspeptide angeheftet werden. Ein Konjugieren von Biomolekülen mit PEG, ein Vorgang, der als Pegylierung bekannt ist, ist ein etabliertes Verfahren zum Erhöhen der Kreislauf Halbwertszeit von Proteinen. Polyethylenglykole sind nicht toxische wasserlösliche Polymere, die aufgrund ihres großen hydrodynamischen Volumens eine Abschirmung um das pegylierte Molekül bilden, wodurch sie es von einer Ausscheidung über die Niere, einem enzymatischen Abbau ebenso wie vor einem Erkennen durch Zellen des Immunsystems schützen.
Mittel spezifische Pegylierungsverfahren sind in den letzten Jahren verwendet worden, um Pegylierungsmoleküle herzustellen (z.B. Arzneimittel, Proteine, Mittel, Enzyme, etc.), die eine biologische Aktivität aufweisen, welche dieselbe ist oder größer ist als die des "Vorgänger" Moleküls. Diese Mittel haben deutliche in vivo pharmakokinetische und pharmakodynamische Eigenschaften, wie durch die selbst regulierte Ausscheidung von Pegfilgrastim, der verlängerten Absorptionshalbwertszeit von pegyliertem Interferon Alpha-2a exemplarisch dargelegt ist. Pegylierte Moleküle weisen Dosierungsschemata auf, die geeigneter und für Patienten angenehmer sind, die eine nützliche Wirkung auf die Lebensqualität von Patienten haben können. (Siehe z.B. Yowell, S.L. et al., Cancer Treat Rev 28 Suppl. A:3–6 (Apr. 2002)).
Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zum in Kontaktbringen einer biologischen Barriere mit einem Durchdringungsmodul oder -peptid in einer Menge ein, die ausreicht, um eine wirksame Durchdringung zwischen den Zellen zu erlauben. Das Modul oder Peptid kann in vitro, ex vivo oder in vivo bereitgestellt werden. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Durchdringungspeptid in der Lage sein, die biologische Aktivität der gekoppelten Substanz zu potentialisieren. Deshalb ist ein anderer Zweck dieser Erfindung ein Verfahren zum Verwenden von Durchdringungspeptiden, um die biologische Aktivität des Effektors zu erhöhen, mit dem es gekoppelt ist.
Zusätzlich zu den Peptid Effektormodulen oder -peptiden und Peptid Molekulargefäß Effektormodulen stellt die Erfindung auch eine pharmazeutisch geeignete Base oder ein pharmazeutisch geeignetes Säureadditionssalz, Hydrat, einen pharmazeutisch geeigneten Ester, ein pharmazeutisch geeignetes Solvat, Vorläuferarzneimittel, Metabolit, Stereoisomer oder eine pharmazeutisch geeignete Mischung davon bereit. Die Erfindung schließt auch pharmazeutische Zubereitungen ein, die ein Peptideffektor "Modul" oder Peptid Molekulargefäß Effektormodul zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger, Verdünnungsmittel, Proteaseinhibitor, oberflächenaktiven Mittel oder einer pharmazeutisch geeigneten Arzneimittelträgersubstanz umfasst.
Salze, die im Begriff "pharmazeutisch geeignete Salze" umfasst sind, bezeichnen nicht toxische Salze der erfindungsgemäßen Erfindungen, die im Allgemeinen durch Umsetzen der freien Base mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden, um "pharmazeutisch geeignete Säureadditionssalze" der hier beschriebenen Verbindungen herzustellen. Diese Verbindungen behalten die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Basen. Vertreter solcher Salze sind die wasserlöslichen und wasserunlöslichen Salze, wie das Acetat, Amsonat (4,4-Diaminostilben-2,2'-disulfonat), Benzensulfonat, Benzonat, Bicarbonat Bisulfat, Bitartrat, Borat, Bromid, Butyrat, Calciumedetat, Camsylat, Carbonat, Chlorid, Zitrat, Clavulariat, Dihydrochlorid, Edetat, Edisylat, Estolat, Esylat, Fumarat, Gluceptat, Gluconat, Glutamat, Glykollylarsanilat, Hexafluorphosphat, Hexylresorcinat, Hydrabamin, Hydrobromid, Hydrochlorid, Hydroxynaphthoat, Iodid, Isothionat, Lactat, Lactobionat, Laurat, Malst, Malest, Mandelat, Mesylat, Methylbromid, Methylnitrat, Methylsulfat, Mucat, Napsylat, Nitrat, N-Methylglucamin Ammoniumsalz, 3-Hydroxy-2-naphthoat, Oleat, Oxalat, Plamitat, Pamoat (1,1-Methylen-bis-2-hydroxy-3-naphthoat, Embonat), Pantothenat, Phosphat/Diphosphat, Picrat, Polygalacturonat, Propionat, p-Toluolsulfonat, Salicylat, Stearat, Subacetat, Succinat, Sulfat, Sulfosaliculat, Suramat, Tannat, Tartrat, Teoclat, Tosylat, Triethiodid und Valeratsalze.
Ein menschlicher Patient kann mit einer pharmakologisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Moduls behandelt werden. Der Begriff "pharmakologisch wirksame Menge" bedeutet die Menge eines Arzneimittels oder pharmazeutischen Mittels (der Effektor), welche die biologische oder medizinische Antwort eines Gewebes, Systems, Tieres oder Menschen auslösen wird, die von einem Wissenschaftler oder praktizierenden Arzt angestrebt wird.
Die Erfindung schließt auch pharmazeutische Zusammensetzungen ein, die zum Einführen eines interessierenden Effektors über eine biologische Barriere geeignet sind.
Die Zusammensetzungen sind vorzugsweise zur inneren Verwendung geeignet und schließen eine wirksame Menge einer pharmakologisch aktiven erfindungsgemäßen Verbindung allein oder in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch geeigneten Trägern ein. Die Verbindungen sind insbesondere darin nützlich, dass sie eine sehr geringe, falls überhaupt eine Toxizität aufweisen.
Bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen sind Tabletten und Gallertkapseln, die den aktiven Bestandteil zusammen mit a) Verdünnungsmitteln, z.B. Lactose, Dextrose, Sucrose, Mannitol, Sorbitol, Zellulose und/oder Glycin; b) Proteaseinhibitoren; c) Gleitmitteln, z.B. Kieselsäure, Talkum, Stearinsäure, ihr Magnesium oder Calciumsalz, Poloxamer und/oder Polyethylenglykol; für Tabletten auch d) Bindemittel, z.B. Magnesiumaluminiumsilikat, Stärkepaste, Gallerte, Traganth, Methylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon; falls gewünscht e) unwesentlichen Bestandteilen, z.B. Stärken, Agar, Alginsäure oder ihr Natriumsalz oder schäumende Mischungen; und/oder f) Absorptionsmitteln, Farbstoffen, Geschmacksmitteln und Süßstoffen umfassen. Injizierbare Zusammensetzungen sind vorzugsweise wässerige isotone Lösungen oder Suspensionen, und Zäpfchen sind vorteilhafterweise aus Fett Emulsionen oder Suspensionen hergestellt. Die Zusammensetzungen können sterilisiert werden und/oder Hilfsmittel enthalten, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Befeuchtungs- oder Emulsionsmittel, Lösungsvermittler, Salze zum Regulieren des osmotischen Drucks und/oder Pufferlösungen. Zusätzlich können sie auch andere therapeutisch wertvolle Substanzen enthalten. Die Zusammensetzungen werden jeweils gemäß herkömmlichen Mischungs-, Granulierungs- bzw. Beschichtungsverfahren hergestellt und enthalten ungefähr 0,01 bis 75 %, vorzugsweise ungefähr 0,1 bis 10 % des aktiven Bestandteils.
Eine Verabreichung der hier beschriebenen aktiven Verbindungen und Salze kann über irgendwelche der geeigneten Weisen zum Verabreichen von therapeutischen Mitteln erfolgen. Diese Verfahren schließen eine systemische Verabreichung, wie eine intrave nöse oder lokale Verabreichung, wie orale, bukkale, anale, bronchiale, nasale, parenterale, transdermale, subkutane oder topische Verabreichungsweisen ein.
In Abhängigkeit von der beabsichtigten Verabreichungsweise können die Zusammensetzungen in einer festen, halbfesten oder flüssigen Dosierungsform vorliegen, wie zum Beispiel injizierbare Formen, Tabletten, Zäpfchen, Pillen, Kapseln zur Freisetzung mit der Zeit, Pulver, Flüssigkeiten, Suspensionen, Aerosol oder dergleichen vorzugsweise in Einheitsdosierungen. Die Zusammensetzungen werden eine wirksame Menge der aktiven Verbindung oder des pharmazeutisch geeigneten Salzes davon einschließen und können zusätzlich auch irgendwelche herkömmlichen pharmazeutischen Arzneimittel Trägersubstanzen und andere medizinische pharmazeutische Arzneimittel oder Mittel, Träger, Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel, Proteaseinhibitoren, etc. einschließen, wie sie üblicherweise in den pharmazeutischen Wissenschaften verwendet werden.
Für feste Zusammensetzungen schließen Arzneimittel Trägersubstanzen pharmazeutische Reinheitsgrade von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Zellulose, Glucose, Sucrose, Magnesiumcarbonat ein, und dergleichen kann verwendet werden. Die oben definierte aktive Verbindung kann auch als Zäpfchen unter Verwendung von zum Beispiel Polyalkylenglykolen, zum Beispiel Polypropylenglykol als dem Träger zubereitet werden.
Flüssige, insbesondere injizierbare Zusammensetzungen können zum Beispiel durch Lösen, Dispergieren etc. hergestellt werden. Die aktive Verbindung wird in einem pharmazeutisch reinen Lösungsmittel gelöst oder mit einem pharmazeutisch reinen Lösungsmittel gemischt, zum Beispiel Wasser, Salzlösung, wässrige Dextrose, Glycerol, Ethanol und dergleichen, um dadurch die injizierbare Lösung oder Suspension zu bilden.
Falls gewünscht kann die pharmazeutische Zusammensetzung, die verabreicht werden soll, auch geringe Mengen nicht toxischer zusätzlicher Substanzen enthalten, wie Be feuchtungs- oder Emulsionsmittel, pH puffernde Mittel und andere Substanzen, die zum Beispiel Natriumacetat, Triethanolamin Oleat, etc. enthalten.
Eine parenterale injizierbare Verabreichung wird im Allgemeinen für subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektionen und Infusionen verwendet. Injizierbare Formen können in herkömmlichen Formen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen oder festen Formen hergestellt werden, die für ein Lösen in Flüssigkeit vor einer Injektion geeignet sind.
Ein Ansatz zur parenteralen Verabreichung setzt die Implantierung eines langsam freisetzenden oder anhaltend freisetzenden Systems ein, das sicher stellt, dass ein konstanter Spiegel einer Dosierung gemäß dem U.S. Pat. Nr. 3,710,795 aufrecht erhalten wird.
Der Fachmann wird erkennen, dass das erfindungsgemäße Durchdringungsmodul als ein oraler Impfstoff verwendet werden kann. Ein solcher Impfstoff kann ein Durchdringungspeptid umfassen, das mit einer gewünschten Antigensequenz gekoppelt ist, die einschließt aber nicht beschränkt ist auf das PA Antigen von Anthrax. Dieses Fusionsprotein wird dann oral einem Subjekt verabreicht, das eine Impfung benötigt.
Ein "Antigen" ist ein Molekül oder ein Anteil eines Moleküls, der in der Lage ist, eine Immunantwort zu stimulieren, die zusätzlich in der Lage ist, ein Tier oder einen Menschen zu induzieren, einen Antikörper herzustellen, der in der Lage ist, an ein Epitop dieses Antigens zu binden. Ein "Epitop" ist der Anteil irgendeines Moleküls, der in der Lage ist, durch ein Haupt Histokompatibilitätskomplex (engl.: major histocompatability complex ("MHC")) Molekül erkannt und gebunden zu werden und durch eine T Zelle erkannt zu werden oder durch einen Antikörper gebunden zu werden. Ein typisches Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop aufweisen. Das spezifische Erkennen zeigt an, dass das Antigen in einer hoch selektiven Weise mit seinem entsprechenden MHC und seiner entsprechenden T Zelle oder seinem entsprechenden Antikörper und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper reagieren wird, die durch andere Antigene hervorgerufen werden können.
Ein Peptid ist "immunologisch reaktiv" mit einer T Zelle oder einem Antikörper, wenn es an einen MHC bindet und durch eine T Zelle erkannt wird oder an einen Antikörper aufgrund eines Erkennens (oder der genauen Passform) eines spezifischen Epitops bindet, das innerhalb des Peptids enthalten ist. Eine immunologische Reaktivität kann durch ein Messen einer T Zellantwort in vitro oder durch eine Antikörperbindung, insbesondere durch die Kinetiken einer Antikörperbindung, oder durch eine Kompetition im Binden unter Verwendung bekannter Peptide bestimmt werden, die ein Epitop enthalten, gegen das der Antikörper oder die T Zellantwort als Kompetitoren gerichtet sind.
Techniken, die verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Peptid immunologisch mit einer T Zelle oder mit einem Antikörper reaktiv ist, sind im Stand der Technik bekannt. Peptide können auf Wirksamkeit durch in vitro und in vivo Tests gescreent werden. Solche Tests setzen eine Immunisierung eines Tieres, z.B. einer Maus, eines Kaninchens oder eines Primaten mit dem Peptid und eine Evaluierung des sich ergebenden Antikörpertiters ein.
Auch in die Erfindung eingeschlossen sind Impfstoffe, welche die Herstellung von sekretorischen Antikörpern (IgA) gegen das entsprechende Antigen auslösen, als solche dienen Antikörper als die erste Verteidigungslinie gegen eine Vielfalt von Pathogenen. Eine orale Impfung, welche die Vorteile aufweist ein nicht invasiver Weg einer Verabreichung zu sein, ist das bevorzugte Mittel einer Immunisierung zum Erhalten sekretorischer Antikörper.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in solchen oralen Dosierungsformen verabreicht werden, wie Tabletten, Kapseln (jeweils einschließlich Zubereitungen mit zeitverzögerter Freisetzung und anhaltender Freisetzung), Pillen, Pulvern, Granulaten, Elixieren, Tinkturen, Suspensionen, Sirupen und Emulsionen. Dergleichen können sie auch in intravenöser (sowohl Bolus als auch Infusion), intraperitonealer, subkutaner oder intramusklärer Form und allen Verwendungsformen verabreicht werden, die dem Fachmann des pharmazeutischen Standes der Technik bekannt sind.
Der Dosierungsbehandlungsplan, der die Verbindungen verwendet, wird in Übereinstimmung mit einer Vielfalt von Faktoren verwendet, die Typ, Art, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischen Zustand des Patienten; die Schwere des Zustandes, das behandelt werden soll; den Weg der Verabreichung; die Nieren- und Leberfunktion des Patienten; und die eingesetzte besondere Verbindung oder das Salz davon einschließen. Ein Fachmann in Form eines Mediziners oder Tiermediziners kann die wirksame Menge des Arzneimittels leicht bestimmen und verschreiben, die erforderlich ist, um das Fortschreiten des Zustandes zu verhindern, ihm zu begegnen oder es anzuhalten.
Erfindungsgemäße orale Dosierungen können, falls sie für die angegebenen Wirkungen verwendet werden, in der Form von teilbare Tabletten bereitgestellt werden, die 0,005, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 oder 1000,0 mg des aktiven Bestandteils enthalten.
Erfindungsgemäße Verbindungen können in einer einzigen täglichen Dosis verabreicht werden, oder die gesamte tägliche Dosierung kann in aufgeteilten Dosen zwei-, drei- oder viermal täglich verabreicht werden. Darüber hinaus können bevorzugte verbindungsgemäße Verbindungen in einer bukkalen Form über eine topische Verwendung geeigneter bukkaler Träger, bronchialen Form über geeignete Aerosole oder Inhalate, intranasalen Form über eine topische Verwendung geeigneter intranasaler Träger oder über transdermale Wege unter Verwendung jener Formen transdermaler Hautpflaster verabreicht werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Um in der Form eines transdermalen Verabreichungssystems verabreicht zu werden, wird die Dosierungsverabreichung natürlich eher fortlaufend als mit Unterbrechungen während des ganzen Dosierungsbehandlungsplans sein. Andere bevorzugte topische Herstellungen schließen Cremes, Salben, Lotionen, Aerosolsprays und Gele ein, wobei die Konzentration des aktiven Bestandteils von 0,1 % bis 15 % w/w oder w/v reichen würde.
Die Verbindungen, die hier im Detail beschrieben sind, können den aktiven Bestandteil bilden und werden typischerweise in Beimischung mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Arzneimittelträgersubstanzen oder Trägern (hier insgesamt als "Träger" Materialien bezeichnet) verabreicht, die bezüglich der beabsichtigten Verabreichungsform geeignet ausgewählt werden, das heißt orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirupe und dergleichen, und mit herkömmlichen pharmazeutischen Gebräuchlichkeiten übereinstimmen.
Zum Beispiel kann für eine orale Verabreichung in der Form einer Tablette oder Kapsel der aktive Arzneimittelbestandteil mit einem oralen, nicht-toxischen pharmazeutisch geeigneten inerten Träger kombiniert werden, wie Ethanol, Glycerol, Wasser und dergleichen. Darüber hinaus können, falls gewünscht oder nötig, geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Proteaseinhibitoren, auflösende Mittel und färbende Mittel auch in die Mischung eingebaut werden. Geeignete Bindemittel schließen Stärke, Gallerte, natürliche Zucker, wie Glucose oder Beta-Lactose, Getreidesüßstoffe, natürliche und synthetische Gummis, wie Akazie, Traganth oder Natriumalginat, Carboxymethylzellulose, Poloxamer, Polyethylenglykol, Wachse und dergleichen ein. Gleitmittel, die in diesen Dosierungsformen verwendet werden, schließen Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und dergleichen ein. Auflösende Mittel schließen ohne Beschränkung Stärke, Methylzellulose, Agar, Bentonit, Xanthan Gummi und dergleichen ein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in der Form von Liposomen Verabreichungssystemen verabreicht werden, wie kleinen einschichtigen Vesikeln, großen einschichtigen Vesikeln und vielschichtigen Vesikeln. Liposomen können aus einer Vielfalt von Phospholipiden gebildet werden, die Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholine enthält. In einigen Ausführungsformen wird ein Film aus Lipid Bestandteilen mit einer wässrigen Lösung eines Arzneimittels hydriert, um eine Lipidschicht zu bilden, welche das Arzneimittel verkapselt, wie in dem U.S. Pat. Nr. 5,262,564 beschrieben.
Erfindungsgemäße Verbindungen können auch mit Arzneimittelträgern aus löslichen Polymeren gekoppelt werden, auf die abgezielt wird. Solche Polymere können Polyvinylpyrrolidon, Pyran Copolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamid Phenol, Polyhydroxyethylaspanamid Phenol oder Polyethylenoxid Polylysin einschließen, das/die mit Palmitoyl Resten substituiert ist/sind. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer Klasse biologisch abbaubarer Polymere gekoppelt werden, die im Erreichen einer kontrollierten Freisetzung eines Arzneimittels nützlich sind, zum Beispiel Polymilchsäure, Polyepsilon Caprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoestern, Polyacetalen, Polydihydropyranen, Polycyanoacrylaten und vernetzten oder amphiphatischen Blockierungscopolymeren von Hydrogelen.
Jede der obigen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann 0,01–99 %, vorzugsweise 0,1–10% der aktiven Verbindungen als aktive Bestandteile enthalten.
Es folgt nur exemplarisch eine Beschreibung mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen erfindungsgemäßer Ausführungsformen.
In den Zeichnungen:
1 zeigt eine Aminosäuresequenzanordnung von ORF HI0638 und ihren Homologen aus anderen pathogenen Bakterien.
2 zeigt sowohl eine Aminosäuresequenzanordnung der Peptide, die in dieser Erfindung als Durchdringungsmodule verwendet werden, als auch ihre Ursprungsorganismen.
BEISPIELE
Beispiel 1. Darstellung der Wirksamkeit des Durchdringungsmoduls, um die Translokation eines Peptids durch eine epitheliale Barriere zu erlauben.
Das getestete Peptid, das ein Durchdringungspeptid und eine radioaktiv markierte Sonden in einem angrenzenden Konstrukt von SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 17 darstellt, hier als IBW 002 bezeichnet (Novtide, Charge 40139-45, Sequenz: Ac-N-Y-Y-D-I-T-L-A-L-A-G-I-C-Q-S-A-R-L-V-Q-Q-L-A-G-G-G-K-G-G-K-NH₂ (SEQ ID NR: 22)), wurde unter Verwendung der Bolton Hunter Reagens ¹²⁵I-markiert (Biochem. J. 133:529–39 (1973)). Das markierte Peptid wurde auf eine Sephadex G10 Säule geladen, mit Phosphatpuffer gewaschen und mit 3M Thiocyanat in DDW + 50 % n-Butanol eluiert. Der Höchstwert, der 6 Fraktionen enthielt, wurde aufbewahrt und für in vivo Experimente verwendet.
Die Testprobe wurde hergestellt, wie in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

¹²⁵I-IBW-002 Probe 26 μl

PE 6.200 20 μl

Aprotinin 100 μl

PB 849 μl

NAC (Stammlösung 9,8 mg/ml) 5 μl
In vivo experimentelles Verfahren:
Vier männlichen BALB/c Mäusen, die 9–10 Wochen alt waren, wurde 18 Stunden vor dem Experiment das Futter entzogen.
Die Mäuse wurden durch eine i.p. Injektion aus 0,05 ml einer Mischung aus 0,15 ml Xylazin + 0,85 ml Ketamin anästhesiert. Ein 2 cm langer Einschnitt wurde entlang dem Zentrum des Abdomens durch die Haut und die Abdominalwand angebracht. Eine Darmschlinge wurde sanft durch den Einschnitt herausgezogen und auf feuchte Gaze neben das Tier gelegt. Die Schlinge blieb während des ganzen Verfahrens intakt und wurde während der ganzen Zeit feucht gehalten. Die getestete Verbindung, 0,2 ml/Maus, die ungefähr 200.000 cpm enthielten, wurde unter Verwendung einer 26G Nadel in die Schlinge injiziert. Fünfzehn Minuten nach der Injektion wurde die Spitze des Schwanzes abgeschnitten, und eine 50 μl Blutprobe wurde in eine Glaskapillare gezogen. Dies wurde 30 und 60 Minuten nach der Injektion wiederholt. Das Tier wurde anschließend getötet. Die folgenden Organe wurden entfernt: epididymales Fett, Nieren, Leber, Lungen und Gehirn. Die Radioaktivität wurde in jedem Organ und in Blutproben gezählt. Eine 5 μl Probe der Injektionslösung wurde gezählt, um die gesamten injizierten cpm (engl.: counts per minute; Zerfälle pro Minute) pro Maus zu bestimmen.
Ergebnisse:

Die gesamte radioaktive Markierung, die pro Maus injiziert wurde, betrug 224,160 cpm. Die cpm, die aus jedem Gewebe zurück gewonnen wurden, sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Die gesamten cpm im Blut wurden auf der Grundlage der 50 μl Blutprobe, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion gezogen wurde, unter der Annahme berechnet, dass das gesamte Blutvolumen jeder Maus 2 ml beträgt. Tabelle 3

	Maus #1	Maus #2	Maus #3	Maus #4	Mittelwert	± SEM
Blut 15'	37.080	68.960	62.280	80.280	62.150	9.145
Blut 30'	36.120	60.680	52.320	70.840	54.990	7.342
Blut 60'	29.720	47.800	44.000	59.720	45.310	6.182
epididymales Fett	547	869	973	1.174	891	131
Niere	4.068	6.614	6.400	7.650	6.183	756
Leber	6.102	9.709	8.718	11.674	9.051	1.159
Lungen	865	1.343	1.349	1.806	1.341	192
Gehirn	138	190	202	301	208	34
zurück gewonnene cpm/Maus zurück gewonnene/injizierte cpm (%)	41.440	66.525	61.642	82.325	62.983	8.429
	18,49	29,68	27,50	36,73	28,10	3,76

Die Prozent an ¹²⁵I-IBW-002 im Blut relativ zu dem gesamten injizierten ¹²⁵I-IBW-002 zu den drei verschiedenen Zeitpunkten wird in Tabelle 4 dargestellt.

Wie in Tabelle gesehen werden kann, erreichte die relative Menge von ¹²⁵-I-IBW-022 im Blut schon nach 15 Minuten nach Darmverabreichung ihren Höchstwert und nahm mit der Zeit ab. Dies zeigt wahrscheinlich eine Peptidverteilung vom Blut in verschiedene Organe an. Tabelle 4

	Maus #1	Maus #2	Maus #3	Maus #4	Mittelwert	± SEM
Blut/injizierte cpm (%), 15'	16,54	30,76	27,78	35,81	27,73	4,08
Blut/injizierte cpm (%), 30'	16,11	27,07	23,34	31,60	24,53	3,28
Blut/injizierte cpm (%), 60'	13,26	21,32	19,63	26,64	20,21	2,76

In ähnlichen Experimenten wurde ein ¹²⁵I-markiertes Kontrollpeptid (SEQ ID NR: 17), dem die Durchdringungspeptid Sequenz fehlte, in eine Darmschlinge einer Maus injiziert. Die durchschnittliche Menge des Kontrollpeptids, das aus dem Blut und verschiedenen Organen zurück gewonnen wurde, betrug nur ungefähr 1/5 von dem, was mit dem vollständigen Konjugat des IBW-002 Peptids erhalten wurde, obwohl dieses Kontrollpeptid im Vergleich zu IBW-002 ungefähr ¼ mal so groß ist.
Beispiel 2. Entwicklung einer optimalen Zubereitung.
Um eine verbesserte Zubereitung zu erreichen, wurde ein Anzahl von Verbindungen in Experimenten getestet, die dem ähnlich waren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, mit den folgenden Änderungen: Es wurde Urin gesammelt, und die gemessene Radioaktivität wurde zu der des zurück gewonnenen Gewebes zugegeben. a. Nichtionische Detergenzien (vorzugsweise Poloxamere) Tabelle 5. Anfängliche Zubereitung mit Pluronic PE 6.200

Peptidprobe (radioaktiv markiert) 10 μl

PE 6.200 20 μl

Aprotinin 100 μl

PB 5 μl

NAC (9,8 mg/ml) 5 μl

Die gesamte radioaktive Markierung, die pro Maus injiziert wurde, betrug 125.320 cpm. Die cpm, die aus jedem Gewebe zurück gewonnen wurden, sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Die gesamten cpm im Blut wurden auf der Grundlage der 50 μl Blutprobe, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion gezogen wurde, unter der Annahme berechnet, dass das gesamte Blutvolumen jeder Maus 2 ml beträgt. Tabelle 6

	Maus #1	Maus #2	Mittelwert	± SEM
Blut 15'	19.920	19.560	19.740	180
Blut 30	18.800	15.880	17.340	1.460
Blut 60'	14.560	10.960	12.760	1.800
epididymales Fett	321	288	305	17
Niere	2.564	3.799	3.182	618
Leber	2.994	2.786	2.890	104
Lungen	476	377	427	50
Gehirn	95	110	103	8
Urin	14.749	21.747	18.248	3.499
zurück gewonnene cpm/Maus zurück gewonnene/injizierte cpm (%)	35.759	40.067	37.913	2.154
	28,53	31,97	30,25	1,72

Die Prozent an ¹²⁵I-IBW-002 im Blut relativ zu dem gesamten injizierten ¹²⁵I-IBW-002 zu den drei verschiedenen Zeitpunkten wird in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7

Maus #1 Maus #2 Mittelwert ±SEM

Blut/injizierte cpm (%), 15' 15,90 15,61 15,75 0,14

Blut/injizierte cpm (%), 30' 15,00 12,67 13,84 1,17

Blut/injizierte cpm (%), 60' 11,62 8,75 10,18 1,44
Die berechnete gesamte Rückgewinnung betrug 30,25 %. b. Gallensalze (vorzugsweise Taurodesoxycholinsäure) Tabelle 8

Peptidprobe (radioaktiv markiert) 10 μl

PE 6.200 20 μl

Aprotinin 100 μl

PB 802,5 μl

NAC (9,8 mg/ml) 5 μl

Taurodesoxycholinsaure (8 % in DDW) 62,5 μl

Die gesamte radioaktive Markierung, die pro Maus injiziert wurde, betrug 195.900 cpm. Die cpm, die aus jedem Gewebe zurück gewonnen wurden, sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Die gesamten cpm im Blut wurde auf der Grundlage der 50 μl Blutprobe, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion gezogen wurde, unter der Annahme berechnet, dass das gesamte Blutvolumen jeder Maus 2 ml beträgt. Tabelle 9

	Maus #1	Maus #2	Maus #3	Maus #4	Mittelwert	± SEM
Blut 15	40.600	39.440	51.920	36.200	42.040	3.422
Blut 30'	37.440	31.720	48.440	34.720	38.080	3.646
Blut 60'	33.880	23.080	40.840	30.200	32.000	3.702
epididymales Fett	1.081	805	903	846	909	61
Niere	9.513	7.878	10.661	8.929	9.245	581
Leber	8.194	5.154	9.615	8.708	7.918	967

Lungen	1.048	636	1.221	1.303	1.052	149
Gehirn	206	176	284	173	210	26
Urin	39.992	30.651	25.445	40.361	34.112	3.660
zurück gewonnene cpm/Maus zurück gewonnene/injizierte cpm (%)	93.914	68.380	88.969	90.520	85.446	5.782
	47,94	34,91	45,42	46,21	43,62	2,95

Die Prozent an ¹²⁵I-IBW-002 im Blut relativ zu dem gesamten injizierten ¹²⁵I-IBW-002 zu den drei verschiedenen Zeitpunkten wird in Tabelle 10 dargestellt. Tabelle 10

	Maus #1	Maus #2	Maus #3	Maus #4	Mittelwert	± SEM
Blut/injizierte cpm (%), 15'	20,72	20,13	26,50	18,48	21,46	1,75
Blut/injizierte cpm (%), 30'	19,11	16,19	24,73	17,72	19,44	1,86
Blut/injizierte cpm (%), 60'	17,29	11,78	20,85	15,42	16,33	1,89

Die berechnete gesamte Rückgewinnung betrug 43,62 %. c. Pluronic F-68 als ein bevorzugtes Poloxamer. Tabelle 11

Peptidprobe (radioaktiv markiert) 18 μl

Pluronic F-68 (2,72 % in PB) 735 μl

Aprotinin 100 μl

PB 80 μl

NAC (9,8 mg/ml) 5 μl

Taurodesoxycholinsäure (8 % in DDW) 62,5 μl

Die gesamte radioaktive Markierung, die pro Maus injiziert wurde, betrug 143.000 cpm. Die cpm, die aus jedem Gewebe zurück gewonnen wurden, sind in Tabelle 12 zusam mengefasst. Die gesamten cpm im Blut wurden auf der Grundlage der 50 μl Blutprobe, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion gezogen wurde, unter der Annahme berechnet, dass das gesamte Blutvolumen jeder Maus 2 ml beträgt. Tabelle 12

	Maus #1	Maus #2	Maus #3	Maus #4	Mittelwert	± SEM
Blut 5'	29.400	29.120	34.240	32.920	31.420	1.277
Blut 10'	26.680	32.320	28.200	27.760	28.740	1.235
Blut 20'	20.280	30.960	27.240	21.800	25.070	2.467
Blut 60'	11.880	22.840	16.280	14.440	16.360	2.341
epididymales Fett	375	591	462	465	473	44
Niere	2.397	4.407	5.018	5.772	4.399	723
Leber	3.516	6.546	6.561	4.807	5.358	739
Lungen	393	643	582	533	538	53
Gehirn	76	106	94	74	88	8
Urin	59.442	32.158	35.831	53.271	45.176	6.620
zurück gewonnene cpm/Maus zurück gewonnene/injizierte cpm (%)	78.079	67.291	64.828	79.362	72.390	3.699
	54,60	47,06	45,33	55,50	50,62	2,59

Die Prozent an ¹²⁵I-IBW-002 im Blut relativ zu dem gesamten injizierten ¹²⁵I-IBW-002 zu den vier verschiedenen Zeitpunkten ist in Tabelle 13 dargestellt. Tabelle 13

	Maus #1	Maus #2	Maus #3	Maus #4	Mittelwert	± SEM
Blut/injizierte cpm (%), 5'	20,56	20,36	23,94	23,02	21,97	0,89
Blut/injizierte cpm (%), 10'	18,66	22,60	19,72	19,41	20,10	0,86
Blut/injizierte cpm (%), 20'	14,18	21,65	19,05	15,24	17,53	1,73
Blut/injizierte cpm (%), 60'	8,31	15,97	11,38	10,10	11,44	1,64

Die berechnete gesamte Rückgewinnung betrug 50,62 %. Tabelle 14. Zusammenfassung von Zubereitungsergebnissen unter Bezugnahme der zugegebenen Detergenzien

Zubereitung Rückgewinnung (%)

2 % PE 6.200 30,25

2 % PE 6.200 + 0,5 % Taurodesoxycholinsäure 43,62

2 % Pluronic F-68 + 0,5 % Taurodesoxycholinsäure 50,62
Beispiel 3. Relative Potenz von Durchdringungspeptiden, wie in Mäusen getestet.
Tabelle 15
Beispiel 4. Konditionell aktivierte Effektoren: Hemmung übermäßiger Blutkoagulation.
Die SEQ ID NR: 3 (oder irgendeine andere Sequenz aus SEQ ID NR: 1–15, 24–29) wird mit einem Koagulationsinhibitorprotein (z.B. Hirudin, Hirulog, Protein C, Protein C Aktivator oder Protein S) oder einem Thrombolyse aktivierenden Protein (d.h. tPA) durch die Sequenz IEGR (SEQ ID NR: 16) gekoppelt, einer Schnittstelle, die durch einen Faktor Xa erkannt wird.
An Stellen übermäßiger Blutkoagulation wird die Linkersequenz durch den reichlich vorhandenen Faktor Xa geschnitten werden, wodurch das gekoppelte Koagulationsinhi bitorprotein freigesetzt wird. Als ein Ergebnis wird der Koagulationsvorgang abgeschwächt werden. Eine Hemmung übermäßiger oder pathologischer Koagulation kann lokal durch eine Verringerung von Thrombusgröße, Morphologie und Weiterleitung entlang des Gefäßsystems beurteilt werden.
Schließlich kann eine Verringerung einer ischämischen Schädigung durch ein histologisches und funktionelles Ausmaß eines Infarkts dargestellt werden. Systemische Wirkungen können durch eine verlängerte Prothromin Zeit (engl.: Prothromin Time (PT)) und Partielle Thromboplastin Zeit (engl.: Partial Thromboplastin Time (PTT)) und verringerte Spiegel von Fibrinogen Abbauprodukten und D-Dimeren (engl.: fibrinogen degradation products (FDPs)) beurteilt werden.
Beispiel 5: Konditionell aktivierte Effektoren: Hemmung von pathologischen Entzündungsvorgängen.
Die SEQ ID NR: 3 (oder irgendeine andere Sequenz aus SEQ ID NR: 1–15, 24–29) wird mit einem Komplement Inhibitorprotein (z.B. einem Clq Inhibitor) durch eine Schnittstelle gekoppelt, die durch Komplementkaskaden Proteine (z.B. C3a) erkannt wird.
In Fällen pathologischer Komplementaktivierung, wie übermäßiger Entzündungsvorgängen, wird der Komplement Inhibitor freigesetzt werden. Eine Hemmung der Komplementkaskade kann direkt durch eine Verringerung von CH50 oder einzelner C3 und C4 Aktivität beurteilt werden. Eine gesamte Modulation einer Entzündung kann durch eine Verringerung von Spiegeln Akutphase Proteine, z.B. C reaktives Protein (CRP), oder eine Verringerung einer erhöhten Sedimentationsgeschwindigkeit (engl.: elevated sedimentation rate (ESR)) bestimmt werden.
Beispiel 6: Verwendung des Durchdringungsmodul zur oralen Impfung.
Die SEQ ID NR: 3 (oder irgendeine andere Sequenz aus SEQ ID NR: 1–15, 24–29) wird mit einer gewünschten antigenen Sequenz gekoppelt. Zum Beispiel wird ein Fusionsprotein, das aus dem Durchdringungsmodul zusammengesetzt ist, mit dem PA Antigen von Anthrax gekoppelt. Ein solches Fusionsprotein kann an ein Subjekt verabreicht werden, das eine Impfung benötigt.
Dieses Verfahren erlaubt eine einfache und schnelle Impfung großer Populationen, die davon benötigen. Ein anderer Vorteil dieses Verfahrens ist die Herstellung eines hohen Titers von IgA Antikörpern und die anschließende Anwesenheit von IgA Antikörpern in der epithelialen Schleimhaut, welche die Stellen einer Exposition gegenüber Antigenen sind.
Eine Wirksamkeit der Impfung kann sowohl durch die Messung spezifischer Antikörpertiter, insbesondere für IgA, als auch die Messung immunologischer Antworten auf eine Stimulation dargestellt werden, wie zum Beispiel über eine Hypersensitivitätshautreaktion als Antwort auf eine subkutane Verabreichung eines Antigens.
Beispiel 7: Verwendung des Durchdringungsmoduls für eine Translokation in großen Mengen.
Durch ein kovalentes Anheften von Stearylresten an die freien Aminogruppen der zwei Lysine am C-Terminus der SEQ ID NR: 22 wird ein hydrophob gemachtes Durchdringungspeptid hergestellt. Dieses hydrophob gemachte Durchdringungspeptid wird dann in die Grenzfläche eines Taxol enthaltenen Mikropartikels eingebaut, das aus einem Triglycerid Medium zusammengesetzt ist.
Dieses Verfahren erlaubt die Translokation von hoch hydrophoben Arzneimitteln, wie Taxol, vom Darm in den Blutstrom. Da solche Arzneimittel nicht anders aus dem Darm absorbiert werden können, werden sie an Patienten typischerweise über invasive Mittel verabreicht.
Die Wirkungen von Taxol enthaltenden Mikropartikeln können durch eine Verringerung von Tumorgröße, Metastasen oder anderen Tumor bezogenen Markern dargestellt werden.
Beispiel 8. Verabreichung von rekombinantem humanem Insulin (rh-Insulin) über Schleimhautepithelien durch ein Fusionskonstrukt
Die SEQ ID NR: 3 (oder irgendeine andere Sequenz aus SEQ ID NR: 1–15, 24–29) wird mit rh-Insulin über einen von zwei Wegen gekoppelt:

1. durch eine Schnittstelle: NYYDITLALAGICQSARLVQQLA-GG-IEGR- rh-Insulin (SEQ ID NR: 18)
2. ohne eine Schnittstelle: NYYDITLALAGICQSARLVQQLA-GG- rh-Insulin (SEQ ID NR: 19).

Die sich ergebende Verbindung wird in einer 2 % Pluronic PE 6200 wässrigen Lösung gelöst. Zweihundert μl dieser Lösung (oder ein Träger allein) werden in eine Darmschlinge einer Maus injiziert, und die Blutglucosespiegel werden anschließend gemessen.
Die Blutglucosespiegel sinken im Verhältnis zu der Menge an Insulin, die aus dem Darm in den Blutstrom absorbiert wird (d.h. in einer Menge, die mit der Menge an absorbiertem Insulin korreliert). So kann dieses Arzneimittel Verabreichungssystem den Bedarf nach Insulininjektionen ersetzen, wodurch ein wirksamer, sicherer und geeigneter Weg einer Verabreichung für Diabetes Patienten bereitgestellt wird.
Beispiel 9. Verabreichung von rekombinantem humanem Insulin (rh-Insulin) über Schleimhautepithelien durch ein Molekulargefäß Fusionskonstrukt
Die SEQ ID NR: 3 (oder irgendeine andere Sequenz aus SEQ ID NR: 1–15, 24–29) wird mit einer Liganden Bindungsdomäne des Insulinrezeptors (oder Minirezeptors) gekoppelt, die wiederum an rh-Insulin wie folgt gebunden ist:
NYYDITLALAGICQSARLVQQLA-GG- linearisierter Insulinrezeptor (SEQ ID NR: 23) (siehe Kristensen, et al., J. Biol. Chem., 274(52):37351–56 (1999)) plus eine äquimolare Menge an rh-Insulin.
Der sich ergebende Komplex wird in einer 2 % Pluronic PE 6200 wässrigen Lösung gelöst. Zweihundert μl des obigen gelösten Komplexes (oder ein Träger allein) werden in eine Darmschlinge einer Maus injiziert, und die Blutglucosespiegel werden anschließend gemessen.
Die Blutglucosespiegel sinken im Verhältnis zu der Menge an Insulin, die aus dem Darm in den Blutstrom absorbiert wird (d.h. in einer Menge, die mit der Menge an absorbiertem Insulin korreliert). So kann dieses Arzneimittel Verabreichungssystem den Bedarf nach Insulininjektionen ersetzen, wodurch ein wirksamer, sicherer und geeigneter Weg einer Verabreichung für Diabetes Patienten bereitgestellt wird.
Beispiel 10: Verabreichung von Heparin mit geringem Molekulargewicht über Schleimhautepithelien
SEQ ID NR: 3 (oder irgendeine andere Sequenz aus SEQ ID NR: 1–15, 24–29) wird zum Beispiel mit Heparin durch die freie Aminogruppe eines extra Lysins, das am C-Terminus zugegeben wird, über einem von zwei Wegen gekoppelt:

1. durch eine Schnittstelle: NYYDITLALAGICQSARLVQQLA-GG-IEGR-K- Heparin (SEQ ID NR: 20)
2. ohne eine Schnittstelle: NYYDITLALAGICQSARLVQQLA-GG-K- Heparin (SEQ ID NR: 21).

Die sich ergebende Verbindung wird in einer 2 % Pluronic PE 6200 wässrigen Lösung gelöst. Zweihundert μl dieser Lösung (oder ein Träger allein) werden in eine Darmschlinge einer Maus injiziert. Die Partiellen Thrombin Zeit (PTT) Werte werden anschließend gemessen.
Die Partiellen Thrombin Zeit (PTT) Werte sinken im Verhältnis zu der Menge an Heparin, die aus der Darmschlinge in den Blutstrom absorbiert wird (d.h. in einer Menge, die mit der Menge an absorbiertem Insulin korreliert). Deshalb wird dieses Arzneimittel Verabreichungssystem die Verwendung von Heparin Injektionen ersetzen.
ANDERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Aus der vorangegangenen detaillierten Beschreibung der besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen sollte es klar sein, dass einzigartige Verfahren einer Translokation über epitheliale und endotheliale Barrieren beschrieben worden sind. Obwohl besondere Ausführungsformen hier im Detail offenbart worden sind, ist dies nur exemplarisch zu Zwecken einer Darstellung durchgeführt worden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Durchdringungsmodul umfassend ein Durchdringungspeptid und einen Effektor, der mit dem Durchdringungspeptid gekoppelt oder fusioniert ist, das Durchdringungspeptid besteht aus mindestens einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus (a) SEQ ID NRN: 1–5; und (b) SEQ ID NRN: 24–29; wobei das Durchdringungspeptid in der Lage ist, über eine biologische Barriere zu translozieren.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 3, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 12 oder SEQ ID NR: 24 ist.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der Effektor ein bioaktives Peptid ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Insulin, Wachstumshormon, einem Gonadotropin, einem Wachstumsfaktor, Erythropoietin, Granulozyten/Monozyten Koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF), α-MSH, Enkephalin, Dalargin, Kyotorphin, EPO, bFGF, Hirulog, einem luteinisierendes Hormon freisetzenden Hormon (LHRL) Analog und neutrotrophen Faktoren besteht.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der Effektor ein pharmazeutisch aktives Mittel ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Antikoagulans, einem Toxin, einem Antibiotikum, einem antipathogenen Mittel, einem Antigen, einem Antikörperfragment, einem Immunmodulator, einem Vitamin, einem Enzym, einem antineoplastischen Mittel und einem therapeutischen Mittel besteht.
Ex vivo Verfahren zum Translozieren eines Durchdringungspeptids über eine biologische Barriere, wobei das Durchdringungspeptid ein Durchdringungspeptid wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, ist.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Translokation über eine biologische Barriere innerhalb eines Gewebes stattfindet, das ausgewählt ist aus epithelialen Zellen und endothelialen Zellen.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die biologische Barriere ausgewählt ist aus Tight Junctions und der Plasmamembran, und wobei die Tight Junctions ausgewählt sind aus Schleimhautepithel, Darmepithel, Atemepithel und Gefäßepithel.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei das Gefäßepithel die Bluthirnschranke einschließt.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines Durchdringungsmoduls wie in Anspruch 1 beansprucht, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei die Zusammensetzung weiterhin eine Mischung aus mindestens zwei Substanzen umfasst, die ausgewählt sind aus einem nichtionischen Detergens, einem ionischen Detergens, einem Proteaseinhibitor und einem Reduktionsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei das nichtionische Detergens ein Poloxamer, wahlweise Pluronic^® F-68 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei das ionische Detergens ein Gallensalz, wahlweise Taurodesoxycholat ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei der Proteaseinhibitor ausgewählt ist aus Aprotinin und Sojabohnen Trypsininhibitor.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Reduktionsmittel N-Acetyl-L-cystein (NAC) ist.
Verfahren zur Herstellung eines Durchdringungsmoduls wie in Anspruch 1 beansprucht, umfassend das Koppeln des Effektors an das Durchdringungspeptid.
Verfahren wie in Anspruch 15 beansprucht, wobei das Koppeln des Effektors durch eine kovalente Bindung erreicht wird.
Verfahren wie in Anspruch 16 beansprucht, wobei die kovalente Bindung eine Peptidbindung ist.
Verfahren wie in Anspruch 16 beansprucht, wobei die kovalente Bindung durch ein homo- oder ein heterofunktionelles Brückenreagens erreicht wird, und wobei das Brückenreagens wahlweise ein Reagens des Typs eines Succinimidyl-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylats (SMCC) ist.
Verfahren wie in Anspruch 16 beansprucht, wobei die kovalente Bindung durch einen Peptidlinker erreicht wird, der wahlweise die Sequenz von SEQ ID NR: 16 oder SEQ ID NR: 17 aufweist, oder der wahlweise durch ein Enzym gespalten werden kann.
Verfahren wie in Anspruch 19 beansprucht, wobei der Peptidlinker derart ausgestaltet ist, das er durch ein Enzym gespalten wird, dass konditionell unter einem bestimmten physiologischen Zustand aktiviert wird, und wobei der freigesetzte Effektor den physiologischen Zustand vorteilhaft beeinflusst.
Verfahren wie in Anspruch 15 beansprucht, wobei das Koppeln des Effektors durch eine nicht-kovalente Bindung erreicht wird.
Verfahren wie in Anspruch 21 beansprucht, wobei die nicht-kovalente Bindung durch eine Anheftung eines hydrophoben Rests an das Durchdringungspeptid erreicht wird, wobei der hydrophobe Rest es dem Durchdringungsmodul erlaubt, in den Zwischenraum eines hydrophoben Vesikels, in dem der Effektor enthalten ist, eingebaut zu werden.
Verfahren wie in Anspruch 21 beansprucht, wobei die nicht-kovalente Bindung das Ergebnis einer Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin Interaktion ist.
Ex vivo Verfahren zum Translozieren eines Effektors über eine biologische Barriere, wobei das Verfahren umfasst: a) Koppeln des Effektors an ein Durchdringungspeptid um ein Durchdringungsmodul, wie in Anspruch 1 beansprucht, zu bilden; und b) Einführen des Durchdringungsmoduls in die biologische Barriere.
Verwendung eines Durchdringungsmoduls wie in Anspruch 1 beansprucht in der Herstellung eines Impfstoffs für orale Impfung für die Verabreichung an ein Subjekt, wobei das Durchdringungspeptid mit einem gewünschten Antigen gekoppelt ist.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie in Anspruch 9 beansprucht in der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an ein Subjekt zum Behandeln oder Verhindern einer Erkrankung oder eines pathologischen Zustandes, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Menge verwendet wird, die ausreichend ist, um die Erkrankung oder den pathologischen Zustand in dem Subjekt zu behandeln oder zu verhindern.
Verwendung wie in Anspruch 26 beansprucht, wobei die Erkrankung oder der pathologische Zustand ausgewählt ist aus endokrinen Störungen, Diabetes, Unfruchtbarkeit, Hormondefizienzen, Osteoporose, neurodegenerativen Störungen, Alzheimer'scher Erkrankung, Parkinson'scher Erkrankung, Huntington'scher Erkrankung, Herzkreislaufstörungen, Atherosklerose, Zuständen mit erhöhter Gerinnung, Zuständen mit verringerter Gerinnung, Herzerkrankung, zerebrovaskulären Ereignissen, metabolischen Störungen, Fettleibigkeit, Vitamindefizienzen, hämatologischen Störungen und neoplastischer Erkrankung.
Verfahren zur Herstellung eines Durchdringungsmoduls wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Verfahren umfasst: a) Transfizieren einer Herstellungszelle mit einem Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül eines Fusionsproteins, welches das Durchdringungspeptid und einen Effektor kodiert, der operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist; b) Kultivieren der Herstellungszelle unter Bedingungen, welche die Herstellung eines Fusionsproteins erlauben, das aus dem Durchdringungspeptid und einem Effektorpeptid besteht; und c) Isolieren des Fusionsproteins.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Durchdringungspeptid mit einem Molekulargefäß fusioniert ist, wobei das Molekulargefäß einen Effektor einschließt.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 29 beansprucht, wobei der Effektor ausgewählt ist aus einem bioaktiven Peptid und einem pharmazeutisch aktiven Mittel.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 30 beansprucht, wobei das bioaktive Peptid ausgewählt ist aus Insulin, Wachtumshormon, einem Gonadotropin, einem Wachstumsfaktor, Erythropoietin, GM-CSF, α-MSH, Enkephalin, Dalargin, Kyotorphin, EPO, bFGF, Hirulog, einem LHRH Analog und neurotrophen Faktoren.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 31 beansprucht, wobei das pharmazeutisch aktive Mittel ausgewählt ist aus einem Antikoagulans, einem Toxin, einem Antibiotikum, einem antipathogenen Mittel, einem Antigen, einem Antikörperfragment, einem Vitamin, einem Immunmodulator, einem Enzym, einem antineoplastischen Mittel, Heparin, Methotraxat und einem therapeutischen Mittel.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 29 beansprucht, wobei das Molekulargefäß ausgewählt ist aus einem löslichen Rezeptor, einem Minirezeptor und einem Bindungsprotein.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 33 beansprucht, wobei der lösliche Rezeptor ein löslicher Insulinrezeptor ist, oder wobei der Minirezeptor eine ligandenbindende Domäne des Insulinrezeptors ist, oder wobei das Bindungsprotein der intrinsische Faktor ist.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 33 beansprucht, wobei der Effektor Vitamin B12 ist, oder ein Durchdringungsmodul wie in Anspruch 34 beansprucht, wobei der Effektor Insulin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines Durchdringungsmoduls wie in Anspruch 29 beansprucht, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verfahren zur Herstellung eines Durchdringungsmoduls wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Verfahren Verwenden von Festphasensynthese, um das Peptid zu konstruieren, und Fusionieren des Effektors an das Peptid, umfasst.
Durchdringungsmodul wie in Anspruch 1 beansprucht, das weiterhin einen oder mehrere Polyethylenglykol Reste, angeheftet an das Durchdringungspeptid, umfasst.
Verfahren wie in Anspruch 28 beansprucht, wobei das Fusionsprotein weiterhin einen oder mehrere Polyethylenglykol Rest/e, angeheftet an das Fusionsprotein, umfasst.