JPH11502204A - 親油性のペプチドホルモン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 親ペプチドホルモンのＮ末端のアミノ酸に親油性置換基ＷまたはＣ末端のアミノ酸に親油性置換基Ｚを導入することにより修飾された薬理学的活性をもつペプチドホルモンまたはその類縁体であって、前記親油性置換基が８〜４０の炭素原子をもち、持続的作用特性を有するペプチドホルモンまたはその類縁体。

Description

【発明の詳細な説明】 親油性のペプチドホルモン誘導体発明の分野 本発明は、持続的作用特性を有する新規ペプチドホルモン誘導体およびその類 縁体ならびにそれらの製造方法および使用方法に関する。発明の背景 ペプチドホルモンは、医療において広く用いられており、組み換えＤＮＡ技術 により製造できるため、その重要性は今後も増大すると予想されている。天然の ペプチドホルモンまたはその類縁体を治療に用いると、一般的にそれらのクリア ランス速度は、高いことが分かる。治療薬のクリアランス速度が高いことは、長 期間にわたって高い血中レベルを維持することが望まれる場合には反復投与を要 することになるため、不都合である。高いクリアランス速度をもつペプチドホル モンの例として、：副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、コルチコトロピン放出因子 、アンギオテンシン、カルシトニン、インシュリンならびにその断片および類縁 体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチドならびにその類縁体および断片、インシ ュリン様増殖因子１（IGF-1）、インシュリン様増殖因子２（IGF-2）、エンテロ ガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモ ン、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、視床下部性放出因子、プロラク チン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン類、エンケファリン類、バソプレッ シン、オキシトシン、オピオイド類およびそれらの類縁体、スーパーオキシドジ スムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン デアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびリボヌクレアーゼがある。 適切な薬学的組成物を利用することによって、ペプチドホルモンの放出特性(r elease profile)に影響を与えることが可能な場合もあるが、このアプローチは 様々な欠点をもち、一般的には適用できない。そのため、ペプチドホルモンの投 与における分野では、いまだ改良が必要とされている。発明の概要 本明細書において、ペプチドという用語は、小ペプチド、ポリペプチド、およ びタンパクの全てを意味する。ペプチドおよびペプチドホルモンという用語は、 天然および合成ペプチドホルモンならびにそれらの断片および類縁体を意味する 。類縁体とは、親ペプチドの１以上のアミノ酸が欠失、もしくは他のアミノ酸で 置換されているか、または１以上のアミノ酸が付加されており、質的に（必ずし も量的であることは要しない）親ペプチドと同じ薬理学的効果を維持しているも のをいう。 本発明は、持続的作用特性をもつペプチドホルモンの新規誘導体に関する。 このため、最も包括的にいえば、本発明は、天然のペプチドホルモンまたはそ の類縁体のＮ末端またはＣ末端アミノ酸のいずれかに、８以上４０以下の炭素原 子を含む親油性置換基を導入して修飾した薬理学的活性を有するペプチドホルモ ンである。ただし、前記親油性置換基は、Ｎ末端のアミノ基に付着したとき負に 帯電し得る基を含み、さらに前記ペプチドホルモンは、インシュリンまたはその 類縁体ではない。 本発明の１つの好適な実施態様によれば、親油性基Ｗに含まれるカルボキシル 基は、親ペプチドのアミノ酸のＮ末端のα−アミノ基とアミド結合を形成する。 本発明の他の好適な実施態様によれば、親油性基Ｗに含まれるカルボキシル基 は、Ｎ末端のリジンのε−アミノ基とアミド結合を形成する。 本発明の他の好適な実施態様によれば、親油性基Ｗは、スペーサーおよび巨大 な親油性置換基からなっている。好ましくは、スペーサーは、コハク酸、グルタ ミン酸またはアスパラギン酸である。好ましくは、巨大な親油性置換基は、アミ ノ基を有するものをも含む直鎖脂肪酸である。コハク酸をスペーサーとして用い たときには、カルボキシル基のうちの一つは、親ペプチドのＮ末端のアミノ酸中 のアミノ基とアミド結合を形成し、もう一方のカルボキシル基は巨大な親油性基 中のアミノ基とアミド結合を形成する。グルタミン酸またはアスパラギン酸が、 スペーサーとして用いられたときには、カルボキシル基のうち１つは、親ペプチ ドのＮ末端のアミノ酸中のアミノ基とアミド結合を形成し、巨大な親油性置換基 は、好ましくは、直鎖脂肪酸または一部もしくは全部が水素化されたシクロペン タノフェナントレン骨格を含む酸のアシル基であり、そのアシル基が、スペーサ ーのアミノ基に付着している。 本発明の他の好適な実施態様によれば、親油性基Ｚに含まれるアミノ基は、親 ペプチドのＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基とアミド結合を形成する。 本発明の他の好適な実施態様によれば、Ｚは、アミノ基を有する直鎖脂肪酸で ある。 本発明の他の好適な実施態様によれば、Ｚは、負に帯電し得る基を有する。 本発明の他の好適な実施態様によれば、Ｚは、遊離のカルボン酸基を有する。 本発明の他の好適な実施態様によれば、親油性基Ｚは、スペーサーおよび巨大 な親油性置換基からなる。好ましくは、スペーサーは、リジン、グルタミン酸、 またはアスパラギン酸である。リジンがスペーサーとして用いられるときは、１ つの好適な実施態様において、巨大な親油性置換基は、直鎖脂肪酸または一部も しくは全部が水素化されているシクロペンタノフェナントレン骨格を含有する酸 のアシル基であり、そのアシル基がスペーサー群のアミノ基に付着している。さ らなる好適な実施態様において、リジンをスペーサーとして用いるときには、リ ジンのε−アミノ基と巨大な親油性置換基との間に、さらにスペーサーが挿入さ れる。１つの好適な実施態様において、このようにさらに挿入されるスペーサー は、コハク酸であり、リジンのε−アミノ基および巨大な親油性置換基中のアミ ノ基とアミド結合を形成する。他の好適な実施態様においては、このようにさら に挿入されるスペーサーは、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、リジン のε−アミノ基、さらに巨大な親油性置換基中のカルボキシル基とアミド結合を 形成する。ここで、前記親油性置換基は、好ましくは、直鎖脂肪酸または一部も しくは全部が水素化されたシクロペンタノフェナントレン骨格を有する。 他の好適な実施態様においては、本発明は、当該発明のペプチド誘導体を薬剤 として使用することに関する。 他の好適な実施態様においては、本発明は、当該発明のペプチド誘導体を含有 する薬剤に関する。 他の好適な実施態様においては、本発明は、薬理学的受容能をもつキャリアー とともに、当該発明によるＩＧＦ−１誘導体を治療的有効量含んでなる治療を必 要とする患者の骨粗鬆症を治療するための薬学的組成物に関する。 他の好適な実施態様においては、本発明は、患者に薬理学的受容能をもつキャ リアーとともに、当該発明によるＩＧＦ−１誘導体を治療的有効量投与すること を含んでなる治療を必要とする患者の骨粗鬆症を治療する方法に関する。 本発明に関連する親ペプチドのうち興味深い例は、以下のとおり： 副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、アンギオテンシン、カルシ トニン、インシュリンならびにその断片および類縁体、グルカゴン、グルカゴン 様ペプチドならびにその類縁体および断片（例えばGLP-1およびGLP-2ならびにそ の類縁体および断片）、インシュリン様増殖因子１、インシュリン様増殖因子２ 、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲 状腺ホルモン、、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、視床下部性放出因 子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン類、エンケファリン類 、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド類およびそれらの類縁体、スーパ ーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナ ーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびリボヌクレアー ゼである。 特に好適なＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１類縁体の誘導体の例として： Lys⁶⁸（Ｎ^ε−テトラデカノイル）デス（69,70）ヒトIGF-1； Lys⁶⁸［Ｎ^ε-γ-Glu（Ｎ^α−ヘキサデカノイルOH）］−OH デス（69,70）ヒトI GF-1； Ｌｙｓ⁶⁹（Ｎ^ε−テトラデカノイル）デス（７０）ヒトＩＧＦ−１； Ｓｅｒ⁶⁹−ＮＨ（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ デス（７０）ヒトＩＧＦ−１（ここで、ｎ は１２以上２４以下の整数）； Ｓｅｒ⁶⁹−ＮＨ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃ デス（７０）ヒトＩＧＦ−１（ここで、ｎは １２以上２４以下の整数）； Ｌｙｓ⁷¹（Ｎ^ε−テトラデカノイル）ヒトＩＧＦ−１； Ａｌａ⁷⁰−ＮＨ（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ ヒトＩＧＦ−１、（ここで、ｎは１２以上 ２４以下の整数）； および Ａｌａ⁷⁰−ＮＨ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃ ヒトＩＧＦ−１、（ここで、ｎは１２以上２ ４以下の整数） 好適なソマトスタチン誘導体は、： Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Tyr-Thr-Ser-Cys-Lys［Ｎ^ε-γ-Glu （Ｎ^α−テトラデカノイル−ＯＨ）］−ＯＨ（２つのシステイン残基は、ジスル フィド架橋で結合している。） 好適なGLP-1誘導体は、： His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys［Ｎ^ε-γ-Glu(Ｎ^α-テトラデカノイ ル）-OH］-OH 好適なＡＮＰ類縁体は、： Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln- Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-Lys［Ｎ^ε-γ-Glu（Ｎ^α-テトラデ カノイル）-OH］-OH 好適なダイノルフィン類縁体の誘導体の型は、： Tyr-Gly-Gly-Phe-Cys-Arg-Arg-D-Ala-Arg.Pro-Cys-NH-(CH₂)_nCOOH(ここで、ｎは ８以上２４以下の整数) 好適なエンテロガストリンの誘導体は、： H-Ala-Pro-Gly-Pro-Arg-Lys（Ｎ^ε-テトラデカノイル）-OH発明の詳細な説明 薬学的組成物 本発明によるペプチド誘導体を含む薬学的組成物は、治療を要する患者に、非 経口的に投与し得る。非経口投与は、注射器（ペン状注射器も可）を用いた皮下 、筋肉内または静脈内注射によりなし得る。あるいは、非経口投与は、注入用ポ ンプを用いて行ってもよい。さらに、点鼻スプレーの形でペプチド誘導体を投与 するために、組成物は、粉末または液体とすることもできる。さらにまた、ペプ チド誘導体は、経皮的に投与してもよい。 本発明の化合物を含有する薬学的組成物は、例えば、１９８５年のRemington' sPharmaceutical Sciencesに記載されているような従来技術によって、調製し得 る。 このため、本発明のペプチド誘導体の注射可能な組成物は、希望の最終産物を 得るための添加物の溶解および混合を含む製薬産業の従来技術を用いて、適切に 調製し得る。 このため、１つの手順に従えば、ペプチド誘導体は、調製すべき組成物の最終 容量よりわずかに少ない量の水に溶解される。必要なものとして等張剤(isotoni cagents)、防腐剤および緩衝液が添加され、必要なら、酸（例えば塩酸）または 塩基（例えば水酸化ナトリウム水溶液）を用いてｐＨ値を調整する。最後に、溶 液の容量を水で調整し、成分を希望の濃度にする。 等張剤の例としては、塩化ナトリウム、マニトールおよびグリセロールがある 防腐剤の例としては、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルｐ−ヒドロキシ安 息香酸、およびベンジルアルコールがある。 適当な緩衝液の例としては、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムがある。 ある種のペプチドホルモンの点鼻投与用の組成物は、例えば、（ノボノルディ クス Ａ／Ｓに対する）European Patent第２７２０９７号に記載されているよ うに調整し得る。 この発明のペプチド誘導体は、様々な疾病の治療に用いることができる。使用 すべきペプチド誘導体および患者に対する至適量のレベルは、治療すべき疾病； 用いる該ペプチド誘導体の効力、年齢、体重、身体の活力、患者の食事を含む種 々の要因；他の薬物との組み合わせ；患者の重症度などに依存する。本発明のペ プチド誘導体の投薬量は、他の既知のペプチドホルモンと同様、その分野の熟練 者によって、各患者ごとに決定することが望ましい。 以下の実施例によって、さらに本発明の説明を行うが、これは保護の範囲を制 限するものと解するべきではない。前記の記載および以下の例中で開示される特 徴は、これらを独立でまたは任意に組み合わせて、本発明を多様な形態で実施す るための基礎となろう。実施例 略称 Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル Ｆｏｒ ：ホルミル Ｄｄｅ ：１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリジン）− エチル ＤＭＦ ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド Ｔｂｕ ：ｔｅｒt−ブチル Ａｃｍ ：アセトアミドメチル ＤＩＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド ＨＯＢＴ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸分析 産物の分子量は、Bio-Ion 20装置（Bio-Ion Nordic AB、Uppsala,Sweden）を 用いたプラズマ脱着質量分析（PDMS）により得た。親油性の決定 ヒトインシュリンに対するペプチドおよびペプチド誘導体の相対的親油性（Ｋ '_rel）は、Ａ）１０％アセトニトリルを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液 、ｐＨ７．３、Ｂ）溶出用の５０％アセトニトリル水溶液の混合液を用いた、Li Chrosorb RP18(5μｍ、4×250mm)高速液体クロマトグラフィーカラムを、４０℃ で無勾配溶出させて測定した。溶出物は、２１４ｎｍでの溶出液の紫外線吸収を 観測することによってモニターした。空隙時間（vold time；ｔ₀）は、０．１ｍ Ｍ 硝酸ナトリウムを注入して決定した、ヒトインシュリンの保持時間（_{tinsul in} ）は、Ａ溶液とＢ溶液の比率を変えて、少なくとも２t₀になるように調整した 。 Ｋ' _rel＝（ｔ_derivative−ｔ₀）／（ｔ_insulin−ｔ₀）実施例１ For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys（Ｎ^ε-テトラデカノイル）-OHの合成 For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Ly-OHは、Bachem Feinchemikalien AG、スイスから購 入した。本ペプチドは、ヒト好中球の強力な化学誘因物質である。表題の化合物 は、１７ｍｇのFor-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-OHを５ｍｌのＤＭＦに溶解し、そ の後３５μｌのトリエチルアミン、さらに２０ｍｇの固体のテトラデカノイン酸 サクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシ−エステルを添加して調製する。反応は、逆相 Ｃ１８シリカ物質を充填したカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーで モニターした。溶出には、０．１％ＴＦＡ水溶液中のエタノールを３０％から８ ０％にする勾配を使用した。産物は、逆相Ｃ１８シリカ材を充填したカラム（長 さ２５０ｍｍ、直径２０ｍｍ）で精製した。得られた化合物は、７４％エタノー ル／０．１％ＴＦＡ水溶液に溶かし、次にカラムにかけ、温度４０℃、流速６ｍ ｌ／時間で、同じ緩衝液を用いて、イソクラティック溶出で精製した。収量は、 ２０ｍｇであった。化合物の同定は、ＰＤＭＳによって確認した。 ＰＤＭＳによって示された分子量：１０３４、理論値：１０３４ ヒトインシュリンに対する表題の化合物の親油性は、８．２×１０³であった。参照 参照物質、For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-OHは、Bachem Feinchemikalien AG 、スイスから購入し、そのまま用いた。ヒトインシュリンに対する参照物質の親 油性は、２．３であった。実施例２ H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Lys（Ｎ^εテトラデカノイル）-OHの合成 エンケファリン誘導体、H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Lys（Ｎ^εテトラデカノイ ル）-OHは、（A-2435 Bachem Feinchemikalien AG、スイス）から作成された。B oc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Lys-OHは、実施例１で述べたように、テトラデカノ イン酸サクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシエステルでアシル化した。反応混合液は 、乾燥するまで蒸発させ、残存物をＴＦＡに溶解し、これを乾燥するまで蒸発さ せ、エタノール／水／０．１％に溶かし込んで実施例１の記述のように逆相高速 液体クロマトグラフィーにより精製した.、収量は、１５ｍｇであった。 ＰＤＭＳで求めた分子量：９０９、理論値：９０７ ヒトインシュリンに対する表題の化合物の親油性は、２．３×１０³であった 。参照 参照物質、H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Lys-OH は、２０ｍｇのBoc-Tyr-D-Ala-G ly-Phe-Leu-Lys-OHを２００μｌのＴＦＡに溶かし、乾燥するまで蒸発させるこ とにより、合成した。残存物を５％酢酸に溶解させ、凍結乾燥した。ヒトインシ ュリンに対する参照物質の親油性は、３．０×１０^-3であった。実施例３ H-Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys(Ｎ^εテトラデカノイル)-OHの合成 Fmoc- Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys-OH （ Bachem Feinchem ikalien AG、スイスより入手）は、レニンの強力な阻害剤であり、実施例１で述 べたように、テトラデカノイン酸サクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシ−エステルと 反応させた。アシル化反応後、Ｆｍｏｃ基は、反応混合液に最終濃度２０％にな るようにピペリジンを添加して、除去した。表題の化合物は、実施例１に記載し たように逆相高速液体クロマトグラフィーで分離した。収量は、２３ｍｇであっ た。 ＰＤＭＳで求めた分子量：１５２９．６、理論値：１５２９ ヒトインシュリンに対する相対的親油度は、５．３×１０³であった。参照 参照物質、H-Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys-OHは、Fmoc-Pro-His -Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys-OH(Bachem Feinchemikalien AG、スイスよ り入手)から合成した。具体的には、２０ｍｇのFmoc-Pro-His-Pro-Phe-His-Phe- Phe-Val-Tyr-Lys-OHを５００μｌの２０％ビペリジンのＤＭＦ溶液に溶解し、２ ０分放置した。参照物質は、実施例１に記載したように逆相高速液体クロマトグ ラフィーにより精製した。 ヒトインシュリンに対する参照物質の相対的親油度は、２．３×１０²であっ た。実施例４ Arg⁴、Arg⁹、Lys¹⁵（Ｎ^ε-テトラデカノイル）ソマトスタチンの合成 表題の物質は、Saxon Biochemicals GMBH、ハノーバー、ドイツから入手した Fmoc-Arg⁴、Arg⁹、Lys¹⁵ソマトスタチンから合成した。５０ｍｇのFmoc-Arg⁴、Arg⁹ 、Lys¹⁵ソマトスタチンを３４６μｌのＤＭＦと５３．９μｌの４−メチルモル フォリンの混合液に溶かした。混合液を１５℃に冷やし、１００μｌのＤＭＦに 溶かした１５．９ｍｇのテトラデカノイン酸サクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシ− エステルを添加した。反応は、３時間２０分進行させた後、５％酢酸のＤＭＦ溶 液を４１４０μｌ添加して停止させた。表題の化合物は、逆相高速液体クロマト グラフィーを用いて、以下のように精製した。 ：サンプルは、Lichrosorb RP-18(7μｍ)Merck、ドイツ、Ａｒｔ．９３９４．カ ラム（１０×２５０ｍｍ）にかけた。カラムは、９０％の緩衝液Ａ（５ｏｍＭ ｔ ｒｉｓ、７５ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、硫酸でｐＨ７．０に調整、２０％アセト ニトリル）と１０％の緩衝液Ｂ（８０％アセトニトリル）の混合液で平衡化され たものである。サンプルをカラムにのせて、流速４ｍｌ／時間、４０℃で緩衝液 Ａ中の緩衝液Ｂの濃度を１０％から９０％にする線形勾配で溶出した。表題化合 物を含む画分を乾燥するまで蒸発させ、５０％酢酸に溶解し、４℃でBIO GEL P2 （BIO RAD、カリフォルニア、アメリカ）カラムを使用したゲル濾過によって脱 塩した。希望する産物を含む画分を水で希釈し、凍結乾燥した。収量は、２ｍｇ であった。化合物の同定は、ＰＤＭＳにより確認した。 ＰＤＭＳで求めた分子量：２０３３、理論値：２０３２ 豚における延長効果の測定 実施例４の表題ペプチドをボールトンとハンターの試薬（Boulton ＆Hunters' reagent;Boulton、A.E.and Hunter、Ｗ.Ｍ.(1973)）を用いて、以下のように¹²⁵ Ｉでラベルした。： ５０ｎｍｏｌのペプチドを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解した後、４００μｌのＤＭＦ と２μｌのＮ−エチルイソプロピルアミンを添加する。５００μＣｉの放射能を 含むボールトンとハンターの試薬に溶液を添加する。反応を２０分間進行させ、 エタノールアミンのＤＭＦ溶液１０μｌを加える。得られたポリペプチドを、上 述のように流速１ｍｌ／分で、カラム（４×２５０ｍｍ）を用いた逆相高速液体 クロマトグラフィーで精製、単離した。 延長効果を測定するために、豚における消失速度を調べ、Ｔ_50%を決定した。Ｔ_{5 0%} 、とは、外部のガンマカウンターを用いて測定したとき、注入部位から¹²⁵Ｉ でラベルしたペプチドのうちの５０％が消失する時間である。(Ribel、Uら、The Pigas a Model for Subcutaneous Absorption in Man.:M.Serrano-Rios、P.J.Lef ebre(Eds):Diabetes 1985;Proceeding of the 12th Congress of the Internati onal Diabetes Federation,Madrid 、 Spain 、 1985(Excerpta Medica 、Amseterdam(1986)891-96) 豚の皮下に注射した¹²⁵Ｉでラベルしたペプチド誘導体は、Ｔ_50%が１．７±０ ．５時間（ｎ＝４）であったが、テトラデカノイル化されていない¹²⁵Ｉでラベ ルしたペプチドでは０．７±０．１時間であった。参照 ¹²⁵Ｉでラベルした参照ペプチドは、Fmoc-Arg⁴、Arg⁹、Lys¹⁵ソマトスタチンか ら合成された。具体的には、２０ｍｇのFmoc-Arg⁴、Arg⁹、Lys¹⁵ソマトスタチンを １０００μｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦに溶解した。２０分後、産物を逆相高 速液体クロマトグラフィーで精製、脱塩、凍結乾燥し、実施例４で述べたように ボールトンとハンターの試薬でラベルする。実施例５ Lys¹⁵（Ｎ^ε−テトラデカノイル）心房性ナトリウム利尿ペプチドの合成 ヒト（H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gl y-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-Lys（Ｎ^ε-テトラデカノ イル）−COOHは、標準的Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（Methods in Molecular Bio logy、Vol.35:Peptide syntheis Protocols）により合成した。Ｃ末端のリジンの ε−アミノ基は、下記の手順に従ってテトラデカノイン酸サクシニミジル−Ｎ− ヒドロキシ−エステルを用いてアシル化した。合成は、ポリオキシエチレンを植 え付けたた低架橋度のポリスチレンをベースとした樹脂（TentaGel Resin）上で 、ポリプロピレンの注射器の中で手動でなされた。手順 １グラムの樹脂に、３倍等量の酸に弱いであるリンカ−４−ヒドロキシメチル フェノキシ酢酸（HMPA）を添加する。活性化試薬として０．５倍等量の4-ジメチ ルアミノピリジン存在下、３倍等量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを第一 のアミノ酸として結合させた。保護基であるＦｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭ Ｆを３０分間作用させて、切断する。他の全てのアミノ酸は、活性化試薬とし てＤＩＣとＨＯＢＴを１：１で混合したＤＭＦ溶液を用いて、Ｎα−Ｆｍｏｃで 保護したアミノ酸の形で結合させた。アミノ酸のうちシステインは、Ｆｍｏｃ− Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨの形で結合させた。システインの保護基をはずし、１０ ｍＭヨードのＤＭＦ溶液で２分間処理して酸化した。最後のＦｍｏｃ保護基を除 去した後、最後に結合したアミノ酸のＮ^α基を、５倍等量のジ−ｔｅｒｔ−ブチ ルジ炭酸と結合させにより、Ｂｏｃ基で保護した。Ｎ^ε−ＬｙｓのＤｄｅ保護基 は、２０分間、２％ヒドラジン／ＤＭＦで処理して切断し、遊離のＮ^ε基は、５ 倍量のテトラデカノイン三サクシニジミルＮ−ヒドロキシエステルを用いて切断 した。Ｂｏｃ−、ｔＢｕ保護基、ＨＭＰＡリンカーは、１．５時間、９５％ＴＦ Ａ、５％水を作用させてアシル化した。ＴＦＡ／水は、減圧下で蒸発させ、ペプ チドはジエチルエーテル中でＨＣｌ塩として沈殿させて、１０ｍＭ 炭酸水素ア ンモニウム（ｐＨ８．８）から凍結乾燥した。総収量は、３５ｍｇであった。、 Ｎ末端の配列決定により、産物は正しい配列をもっていることが示された。 ＰＤＭＳによって示された分子量：３４１７ これは計算で求めた分子量にナトリウムを加えたものに相当する。実施例６ Lys³⁰（Ｎ^ε−デカノイル）グルカゴン 表題の化合物は、Saxon Biochemicals GMBH、ハノーバー、ドイツに合成を依 頼し、購入した。 ４．３２ｍｇのLys³⁰（Ｎ^ε−デカノイル）グルカゴン（グルカゴン４ｍｇに相 当）を０．９％塩化ナトリウムを添加した１．８ｍＭ塩酸４ｍｌ（ｐＨの測定値 は、２．７）に溶解した。得られた溶液を濾過により除菌し、小瓶にうつした。 ２群のウサギ（ｎ＝６）に、１匹につき２ＩＵのインシュリン アクトラピッ ド（Insulin Actrapid）を−６０分に注射した。０分において、グループ１には 、ウサギ１匹につきのモル等量のLys³⁰（Ｎ^ε−デカノイル）グルカゴン０．５ ４ｍｇを皮下に、グループ２には、ウサギ１匹につき０．５ｍｇのグルカゴンを 皮下 に投与した。血液は、−６０，０，１５，３０，６０，１２０，１８０および２ ４０分に採取し、グルコース濃度をヘキソキナーゼ法で決定した。得られた血液 のグルコース濃度を表にmg glucose/100mlの単位で示した。 表から明らかなように、グルカゴンの血中グルコースを上昇させる効果が、Lys^{3 0} （Ｎ^ε−デカノイル）グルカゴンで保持され、作用も延長している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/58 Ａ６１Ｋ 37/02 14/605 37/48 14/655 37/24 // Ｃ０７Ｋ 105:00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハンセン、ペール・ヘルツ デンマーク国、デーコー−2800 リングビ ー、ニーブロベイ 222 (72)発明者 クルツハルス、ペーター アメリカ合衆国、マサチューセッツ州 02146、ブルックリン、チャペル・ストリ ート 20、アパートメント エー411 (72)発明者 ハルストロム、ジョン・ブロベルグ デンマーク国、デーコー−3390 ハンデス テッド、ソンデルガーデ 44

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．薬理学的活性を有するペプチドホルモン誘導体またはその類縁体であって、 親ペプチドのＮ末端アミノ酸への親油性置換基Ｗの導入または親ペプチドのＣ末 端アミノ酸への親油性置換基Ｚの導入により親ペプチドホルモンが修飾されてお り、前記親油性基は８以上４０以下の炭素原子を有するペプチドホルモン誘導体 またはその類縁体。（ただし、前記親油性置換基は、Ｎ末端のアミノ基に付着し たとき負に帯電し得る基を含み、さらに前記ペプチドホルモンはインシュリンま たはその類縁体ではない。） ２．請求項１に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記親油性基Ｗが存在 するペプチドホルモン誘導体。 ３．請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｗが、１２以上３ ５以下のの炭素原子を有するペプチドホルモン誘導体。 ４．請求項１に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｚが存在するペプ チドホルモン誘導体。 ５．請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｚが、１２以上３ ５以下の炭素原子を有するペプチドホルモン誘導体。 ６．請求項１に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記親ペプチドホルモ ンが、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、アンギオテンシン、 カルシトニン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチドならびにその類縁体および断 片、インシュリン様増殖因子１、インシュリン様増殖因子２、エンテロガストリ ン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、、ト ロンボポイエチン、エリスロポイエチン、視床下部性放出因子、プロラクチン、 甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン類、エンケファリン類、バソプレッシン、 オキシトシン、オピオイド類およびそれらの類縁体、スーパーオキシドジスムタ ーゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミ ナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびリボヌクレアーゼからなる群から選択さ れるペプチドホルモン誘導体。 ７．請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｗに含有されるカ ルボキシル基が、Ｎ末端のαアミノ基とアミド結合を形成しているペプチドホル モン誘導体。 ８．請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｗに含有されるカ ルボキシル基が、Ｎ末端のリジンのε−アミノ基とアミド結合を形成しているペ プチドホルモン誘導体。 ９．請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記ＷがCH₃(CH₂)_n((C H₂)_mCOOH)CHNH-CO(CH₂)₂CO-であり、ｎおよびｍが整数で、炭素原子が８以上４ ０以下、好ましくは１２以上３５以下であるペプチドホルモン誘導体。 １０．請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｗは、一般式が CH₃(CH₂)_rCO-NHCH(COOH)(CH₂)₂CO-の基であり、前記ｒが１０以上２４以下の整 数であるペプチドホルモン誘導体。 １１．請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｗは、一般式が CH₃(CH₂)_sCO-NHCH((CH₂)₂COOH)CO-の基であり、前記ｓが８以上２４以下の整数 であるペプチドホルモン誘導体。 １２ 請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｚに含有される アミノ基が、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基とアミド結合を形成しているペプ チドホルモン誘導体。 １３．請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｚは、一般式-N HCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)_mCH₃の基であり、前記ｍが８以上１８以下の整数で ある、すなわちＺがＮ^ε−アシルリジン残基であるペプチドホルモン誘導体。 １４．請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であり、前記Ｚは、一般式が-N HCH(COOH)(CH₂)₄NH-CONH((CH₂)₂COOH)NH-CO(CH₂)_pCH₃の基であり、前記ｐが１０ 以上１６以下の整数であるペプチドホルモン誘導体。 １５．請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であり、前記Ｚは、一般式が-N HCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)₂CH(COOH)NH-CO(CH₂)_qCH₃の基であり、前記ｑが１０ 以上１６以下の整数であるペプチドホルモン誘導体。 １６．請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であり、前記Ｚは、一般式- NHCH(COOH)(CH₂)₄NH-CO(CH₂)₂CH(COOH)NHCO(CH₂)_tCH₃の基であり、前記ｔが０ま たは１以上２２以下の整数であるペプチドホルモン誘導体。 １７．請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であり、Gly-Lysジペプチドの 形態のスペーサーが、親油性基Ｚと親ペプチドホルモンとの間に挿入されている ペプチドホルモン誘導体。 １８．請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であり、前記Ｚは、一部または 全部が水素化されたシクロペンタノフェナントレン骨格を含むペプチドホルモン 誘導体。 １９．親ペプチドに比して持続的作用特性をもつ薬理学的活性を有するペプチド ホルモン誘導体の製造方法であって、親ペプチドのＮ末端アミノ酸への親油性置 換基Ｗの導入または親ペプチドホルモンのＣ末端アミノ酸への親油性置換基Ｚの 導入により、親ペプチドホルモンを修飾することを含んでなり、前記親油性置換 基は、８以上４０以下の炭素原子を有する方法。（ただし、親油性置換基がＮ末 端アミノ基に付着したとき負に帯電し得る基を含むという条件、さらに前記ペプ チドホルモンはインシュリンまたはその類縁体ではないという条件を満たす。）