MXPA00005494A

MXPA00005494A - Composiciones de proteina hidrofobicamente modificada y metodos.

Info

Publication number: MXPA00005494A
Application number: MXPA00005494A
Authority: MX
Inventors: R Blake Pepinsky
Original assignee: Curis Inc
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-03
Publication date: 2003-05-19
Also published as: DE69830192T2; TR200001612T2; HUP0100535A2; BR9815142A; ES2243018T3; NO20002789L; EP1036092B1; WO1999028343A3; IS5499A; AU757497B2; JP2001525336A; WO1999028343A2; IL136137A0; PT1036092E; DE69830192D1; AU1996699A; DK1036092T3; PL341430A1; CN1294595A; NO20002789D0

Abstract

Se describen proteina hidrofobicamente modificadas y metodos para hacerlas. Una porcion hidrofobica se une a un residuo de aminoacido de superficie de la proteina. La porcion hidrofobica puede ser un lipido o un peptido. Alternativamente, la proteina puede ser derivatizada a traves de una amplia variedad de reacciones quimicas que anexan una estructura hidrofobica a la proteina. La proteina preferida es de origen de mamifero y se selecciona del grupo que consiste de erizo Sonic, Indian, y Desert. La porcion hidrofobica se utiliza como una union conveniente a la cual se puede anexar una vesicula tal como una membrana de celula, liposoma o micela.

Description

COMPOSICIONES DE PROTEiNA H1DROFOBICAMENTE MODIFICADA Y MÉTODOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se sabe que ciertas proteínas exhiben una actividad biológica mayor cuando se unen a otras porciones, ya sea a través de la formación de complejos multiméricos, en donde las proteínas tienen la oportunidad de actuar en concierto, o a través de otras alteraciones en las propiedades físico-químicas de la proteína, tales como la absorción de proteína, biodistribución y vida media. De esta manera, un área actual de búsqueda en la biotecnología implica el desarrollo de métodos para modificar las propiedades fisicoquímicas de proteínas, de manera que estas pueden ser administradas en cantidades más pequeñas, con efectos laterales menores, a través de nuevas rutas y con menos gasto. Por ejemplo, la afinidad de unión de cualquier proteína individual (tal como un ligando para su receptor cognado) puede ser baja. Sin embargo, las células normalmente expresan de cientos a miles de copias de un receptor de superficie particular, y simultáneamente se presentan muchas interacciones de receptor-ligando. Cuando muchas moléculas de superficie queda implicadas en la unión, la afinidad efectiva total es mayor que la suma de las afinidades de unión de las moléculas individuales. En contraste, cuando las proteínas de ligando se remueven de la superficie de célula y se purifican, o se aislan a través de técnicas de ADN recombinante para utilizarse, por ejemplo, como terapéuticos, actúan como monómeros y pierden la ventaja de actuar en concierto con muchas otras copias de la misma proteína asociada estrechamente sobre la superficie de una célula. Así aislada, la baja afinidad de una proteína para su receptor puede volverse una desventaja seria para su efectividad como terapéutico para bloquear una trayectoria de unión particular, ya que debe competir contra interacciones de célula-célula de alta avidez. El tratamiento efectivo puede requerir de la administración constante y/o dosis altas. Dichas desventajas pueden ser evitadas, sin embargo, si se puede encontrar un medio para proporcionar formas multiméricas de una proteína aislada. Similarmente, podría ser útil modificar otras propiedades fisicoquímicas de proteínas biológicamente activas de manera que, por ejemplo, una proteína es inducida para asociarse con una membrana localizándola así en el sitio de administración y mejorando su habilidad para unirse a, o de otra manera interactuar con, un objetivo particular. Dichos cambios también pueden afectar la farmacodistribución de la proteína. Se han desarrollado varios métodos para generar proteínas acopladas. Muchos de estos métodos no son altamente específicos, es decir, no dirigen el punto de acoplamiento a cualquier sitio particular sobre la proteína. Como resultado, los agentes de acoplamiento convencionales pueden atacar sitios funcionales o bloquear estéricamente sitios activos, haciendo que las proteínas acopladas queden inactivas. Además, los productos acoplados pueden ser orientados de manera que los sitios activos no pueden actuar sinergísticamente, haciendo de esta manera que los productos no sean más efectivos que la proteína monomérica sola. Como una motivación adicional para encontrar nuevos métodos para modificación de proteína, las proteínas con un residuo de cisteína N-terminal son susceptibles a oxidación u a otra modificaciones químicas que pueden comprender actividad o vida media. Además, ciertos reguladores de pH comúnmente utilizados en la purificación de proteína tienen componentes o impurezas que pueden modificar la cisteína N-terminal. Aún cuando estos reguladores son evitados, la cisteína N-terminal es modificada con el tiempo, tal vez debido a químicos en los frascos de almacenamiento o en el aire. Consecuentemente, los reguladores de pH de formulación deben incluir un agente protector, tal como ditiotreitol, para evitar la modificación y/u oxidación de la cisteína. Sin embargo, los agentes protectores tienen actividad biológica importante como tales y, por lo tanto, pueden complicar los experimentos y afectar adversamente la actividad terapéutica de una formulación. Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de desarrollar medios más específicos para obtener productos derivatizados o sus formas multiméricas, con el fin de alterar las propiedades de la proteína para afectar su estabilidad, potencia, farmacocinética y farmacodinámica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto de la invención, se ha resuelto el problema de encontrar una forma para hacer convenientemente formas modificadas de proteínas biológicamente activas. Se pueden utilizar los métodos de la invención para derivar formas multiméricas de las proteínas y/o se pueden utilizar para cambiar sus propiedades físico-químicas. Se ha encontrado que al modificar una proteína (es decir, agregar o anexar una porción hidrofóbica a un aminoácido existente o substituyendo una porción hidrofóbica por un aminoácido) con el fin de introducir la porción hidrofóbica a una proteína se puede incrementar la actividad biológica de la proteína y/o su estabilidad. Por ejemplo, se puede utilizar una cisteína N-terminar como un "objetivo" conveniente para unirse a una porción hidrofóbica (por ejemplo, un lípido) y de esta manera modificar proteínas biológicamente activas. Alternativamente, se puede unir una porción hidrofóbica a un residuo C-terminal de una proteína biológicamente activa, tal como una proteína de erizo, para modificar la actividad de la proteína. También se puede anexar una proteína hidrofóbica a un residuo de aminoácido interno para mejorar la actividad de la proteína, siempre que la modificación no afecte la actividad de la proteína, por ejemplo, la habilidad de las proteínas para unirse a un receptor o co-receptor, o afectar la estructura tridimensional de la proteína. Preferiblemente, la porción hidrofóbica se anexa a un residuo de aminoácido interno que está sobre la superficie de la proteína cuando la proteína está en su forma nativa. La modificación hidrofóbica de la invención proporciona un método genéricamente útil para crear proteínas con propiedades fisicoquímicas alteradas según comparado con formas no modificadas. Esta invención se originó del descubrimiento de que cuando se expresó proteína de erizo sónica de longitud completa en células de insecto y de mamífero, la forma madura de la proteína (residuos 1-174 en la secuencia madura), además de tener colesterol en el término C, también se derivatizó en el extremo N-terminal con un ácido graso. Significativamente, esta forma de erizo exhibió aproximadamente un incremento de 30 veces en la potencia según comparado con erizo no modificado, soluble en un ensayo in vitro. Un aspecto de la invención, por lo tanto, es una proteína aislada que comprende un aminoácido N-terminal y un aminoácido C-terminal, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste de una proteína con una cisteína N-terminal que está anexada en por lo menos una porción hidrofóbica; una proteína con un aminoácido N-terminal que no es una cisteína anexada a una porción hidrofóbica; y una proteína con una porción hidrofóbica substituida para el aminoácido N-terminal. La porción hidrofóbica puede ser un péptido hidrofóbico o cualquier lípido o cualquier otra porción química que sea hidrofóbica. La proteína puede ser modificada en su aminoácido N-terminal y preferiblemente el aminoácido N-terminal es una cisteína o un derivado funcional de la misma. La proteína puede ser modificada en su aminoácido C-terminal o tanto en el aminoácido N-terminal como en el aminoácido C-terminal, o por lo menos un aminoácido interno a (es decir, intermediario entre) los aminoácidos N-terminal y C-terminal, o varias combinaciones de estas configuraciones. La proteína puede ser una proteína de señalización extracelular y en modalidades preferidas la proteína es una proteína de erizo que se obtiene de una fuente de vertebrado, muy preferiblemente se puede obtener de un ser humano e incluye erizo "Sonic, Indian, y Desert". Otra modalidad es una proteína aislada de la forma A-Cys-[Sp]- B- X, en donde: A es una porción hidrofóbica; Cys es una cisteína o un derivado equivalente de la misma; (Sp] es una secuencia de péptido separadora opcional; B es una proteína que comprende una pluralidad de aminoácidos, incluyendo por lo menos una secuencia de péptido separadora opcional; y X es opcionalmente otra porción hidrofóbica enlazada a la proteína. La proteína aislada puede ser una proteína de señalización extracelular, preferiblemente una proteína de erizo. Esta proteína puede ser modificada en por lo menos otro aminoácido con al menos una porción hidrofóbica. En otras modalidades, la proteína está en contacto con una vesícula seleccionada del grupo que consiste de una membrana de célula, micela y liposoma.

Otro aspecto de la invención es una proteína aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo diaprolina N-terminal, el grupo tiaprolina formado haciendo reaccionar un aldehido con una cisteína N-terminal de la proteína. Un aspecto más de la invención es una proteína aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo amida N-terminal, el grupo amida formado haciendo reaccionar un tioéster de ácido graso con una cisteína N-terminal de la proteína. Otro aspecto más de la invención es una proteína aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo maleimida N-terminal, el grupo maleimida N-terminal formado haciendo reaccionar un grupo maleimida con la cisteína N-terminal de la proteína. Otro aspecto más de la invención es una proteína aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo acetamida N-terminal. Un aspecto más de la invención es una proteína aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo tiomorfolina N-terminal. En estas modalidades, el aminoácido C-terminal de la proteína puede ser modificado con una porción hidrofóbica. La proteína aislada puede ser una proteína de señalización extracelular, muy preferiblemente una proteína de erizo. Los métodos de la invención incluyen un método para generar un complejo de proteína multivalente que comprende el paso de enlazar, en presencia de una vesícula, una porción hidrofóbica a una cisteína N-terminal de una proteína, o un equivalente funcional de la cisteína N-terminal. El paso de enlace puede incluir enlazar una porción de lípido, la cual se selecciona de ácidos grasos saturados e insaturados que tienen de entre 2 y 24 átomos de carbono. La proteína puede ser una proteína de señalización extracelular, preferiblemente una proteína de erizo seleccionada del grupo que consiste de erizo "Sonic, Indian y Desert". Otro método adicional de la invención es un método para modificar una propiedad físico-química de una proteína, que comprende introducir por lo menos una porción hidrofóbica a una cisteína N-terminal de la proteína o a un equivalente funcional de la cisteína N-terminal. La porción hidrofóbica puede ser una porción de lípido seleccionada de ácidos grasos saturados e insaturados teniendo de entre 2 y 24 átomos de carbono. También puede ser una proteína hidrofóbica. La proteína modificada utilizando este método puede ser una proteína de señalización extracelular, preferiblemente una proteína de erizo seleccionada del grupo que consiste de erizo "Sonic, Indian y Desert". Un complejo de proteína, producido a través de estos métodos también está abarcado por la presente invención.

Otras proteínas de señalización extracelular además de erizo incluyen gelsolina; interferon, y una interleucina, factor de necrosis tumoral, factor de estimulación de colonia de monocito, factor de estimulación de colonia de granulocito, factor de estimulación de colonia de macrófago y granulocito, eritropoyetina, factor de crecimiento derivado de plaqueta, hormona de crecimiento e insulina.

Otro método es un método para modificar una proteína (tal como una proteína de señalización extracelular) que tiene una cisteína N-terminal. Este método comprende hacer reaccionar la cisteína N-terminal con un tioéster de ácido graso para formar una amida, en donde dicha modificación mejora la actividad biológica de la proteína. Otro método más es un método para modificar una proteína (tal como una proteína de señalización extracelular) teniendo una cisteína N-terminal, que comprende hacer reaccionar la cisteína N-terminal con un grupo maleimida, en donde dicha modificación mejora la actividad biológica de la proteína. Otras modalidades de este método implican hacer reaccionar la cisteína N-terminal ya sea con un grupo aldehido, un grupo acetamida o un grupo tiomorfolina.

Un método adicional es un método para modificar la proteína (tal como una proteína de señalización extracelular) que comprende anexar un péptido hidrofóbico a la proteína. La porción hidrofóbica puede ser anexada a un aminoácido de la proteína seleccionado del grupo que consiste del aminoácido N-terminal, el aminoácido C-terminal, un intermediario de aminoácido entre el aminoácido N-terminal y el aminoácido C-terminal, y combinaciones de los anteriores. En una modalidad, la presente invención proporciona polipéptidos de erizo, los cuales son modificados con porciones lipofílicas. En ciertas modalidades, las proteínas de erizo de la presente invención son modificadas a través de una porción o porciones lipofílicas en uno o más sitios internos del dominio extracelular procesado, maduro, y pueden o no pueden ser también derivatizadas con porciones lipofílicas en los residuos N- o C-terminal del polipéptido maduro. En otras modalidades, el polipéptido es modificado en el residuo C-terminal con una porción hidrofóbica diferente a un esterol. En otras modalidades, el polipéptido es modificado en el residuo N-terminal con un grupo lipofílico cíclico (preferiblemente policíclico). Varias combinaciones de los anteriores también están contempladas. Un método terapéutico de la invención es un método para tratar un trastorno neurológico en un paciente que comprende administrar al paciente una proteína hidrofóbicamente modificada de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Caracterización de una forma palmitoilada de Shh. Una forma unida de Shh humano fue purificada en inmunoafinidad de células de insecto de High Five™ y analizada a través de SDS-PAGE. La proteína se tiñó con azul de Coomassie (carril a, Life Technologies, Inc., marcadores de peso molecular alto preteñidos, carril b, Shh soluble (0.6 µg); carril c, Shh unido (0.6 µg); carril d, mezcla de Shh soluble más unido (0.6 µg)) cada uno. La habilidad de Shh e Ihh (ver carril h) para ser modificados con ácido palmítico se analizó utilizando un sistema libre de célula descrito en el Ejemplo 2. Las formas solubles de la proteína de erizo (3 µg/muestra) se incubaron durante 1 hora con microsomas de hígado de rata, ATP, coenzima A y ácido 3H-palmítico, y después se analizaron para palmitoilación a través de SDS-PAGE. Las muestras ilustradas en los carriles e-i fueron visualizadas a través de fluorografía (carril e, Shh; carril f, des 1-10 Shh; carril g, Cys a Ser Shh; carril h, Ihh; carril i, Shh marcado con His) y en los carriles j-k a través de tinción de Coomassie (carril j, Shh; carril k des 1-10 Shh). Figura 2. Análisis de Shh purificado a través de FSI-MS. El Shh humano soluble (A) y el Shh humano unido (B) fueron analizados a través de ESI-MS en un espectrómetro de masa de cuatro polos, trile Micromass Quattro II, equipado con una fuente iónica de electroaspersión. Todos los datos espectrales de masa de electroaspersión fueron adquiridos y almacenados en un modo de perfil y se procesaron utilizando el sistema de datos Micromass MassLynx. Los espectros de masa molecular se presentan (las asignaciones de masa fueron generadas a través del sistema de datos). Figura 3. Análisis de Shh unido a través de HPLC de fase inversa. Shh humano soluble (A), Shh humano unido de células de insecto High Five™ (B), Shh humano unido de células EBNA-293 (C), y Shh de rata asociado con célula (D), fueron sometidos a HPLC de fase inversa en una columna de Vydac C de agujero estrecho (diámetro interno de 2.1 mm por 250 mm). La columna se desarrolló con un gradiente de acetonitrilo al 0-80%, 30 minutos, en 0.1% de ácido trifluoroacético a 0.25 ml/minuto y el efluente se verificó utilizando un detector de disposición de fotodiodo de 200-300 nm (datos mostrados en 214 nm). Las fracciones pico fueron recogidas y caracterizadas adicionalmente a través de SDS-PAGE y MS (datos resumidos en los Cuadros 2, 4 y 5).

Figura 4. Caracterización de Shh a través de LC-MS. El Shh humano unido (A) y el Shh humano soluble (B) fueron alquilados con 4-vin il piridina (muestra de 1 µL/100 µL en 6 M de HCl de guanidina, 1 mM de EDTA, 100 mM de Tris HCl, pH 8.0), etanol precipitado y fue digerido con endoproteinasa Lys-C en 50 mM de Tris HCl, pH 7.0, 2M de urea a una relación de enzima-proteína de 1:5 como se describió previamente (27). Las digestiones fueron analizadas a través de HPLC de fase inversa en línea con un espectrómetro de masa de cuatro polos, triple Micromass Quattro II de electroaspersión. Se obtuvieron exploraciones a través de la operación y se procesaron utilizando el sistema de datos Micromass MassLynx se muestran cromatogramas iónicos totales de las operaciones). Los asteriscos indican las posiciones del péptido N-terminal, que fueron verificados ya sea a través de MALDI PSD o de secuenciación de Edman N-terminal. Figura 5. Secuenciación del péptido Shh N-terminal a través de la medición MALDI PSD. El péptido endoproteinasa Lys-C N-terminal del Shh humano unido se sometió a la medición MALDI PSD en un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo Voyager-DE™. El patrón de fragmentación predicho y la nomenclatura para los iones de fragmento detectado se muestran en la parte superior del panel (PA, ácido palmitoílico; 4vp. Grupo 4-piridiletilo). El resto de la figura muestra el espectro de masa molecular producido por la operación. Los iones relevantes son denotados utilizando la nomenclatura definida en el esquema. Las masas calculadas (Da) para bi-bs son 447.3, 504.3, 601.4, 658.4, 814.5, 871.5, 1018.6, y 1075.6, respectivamente. Para yi-yß, las masas (Da) son 147.1, 204.1, 351.2, 408.2, 564.3, 621.3, 718.4, y 775.4, respectivamente. La masa calculada para z8 es 758.4 Da. La masa observada para b8 contiene 18 Da adicionales debido al agua agregada. Figura 6. Actividad incrementada de Shh unido en el ensayo de C3H10T1/2. Las potencias relativas del Shh soluble y unido sólo (A) o en presencia de Mab 5E1 (B) de neutralización anti-erizo fueron analizadas en células C3H10T1/2 midiendo la inducción de fosfatasa alcalina. Los números presentados reflejan los promedios de determinaciones por duplicado. (A) diluciones dobles en serie de Shh soluble (6) y unido (8) se incubaron con las células durante 5 días y los niveles resultantes de actividad de fosfatasa alcalina se midieron a 405 nm utilizando el fosfato de p-nitrofenilo de substrato cromogénico de fosfatasa alcalina. (B) se incubaron en serie de Mab 5E1 con Shh soluble (5 µg/ml: barras negras) o Shh unido (0.25 µg/ml: barras grises) o el control de vehículo sin Shh agregado (barra blanca) durante 30 minutos y después se sometieron a análisis en el ensayo de C3HT101/2. Figura 7. Análisis de Shh en un ensavo de unión de receptor.

La potencia relativa de Shh soluble (6) y unido (8) para la unión a patched se analizó en células EBNA-293 transfectadas con patched a través de análisis FACS. Se incubaron diluciones en serie de las muestras de prueba con células EBNA-293, se lavaron y después se midió el porcentaje de unión a través de la habilidad de las muestras para competir con Shh-lg para unirse a las células. El Shh-lg unido se cuantificó a través de fluorescencia media utilizando una sonda de anticuerpo anti-lg marcada con FITC como la lectura. Los datos fueron ajustados a una curva hiperbólica a través de regresión no lineal. Figura 8. Alineación del fragmento N-terminal de proteínas de erizo humanas. Las proteínas de erizo humanas de 20 kDa (Sonic "Shh", Desert "Dhh" y Indian "Ihh") se alinearon con respecto a sus cisteína N-terminal (Cys-1 en la secuencia madura). Esta cisteína es normalmente Cys-24 en la proteína de precursor Shh de longitud completa debido a la presencia de la secuencia de señal natural que es removida durante la secreción. La posición real de la cisteína puede variar ligeramente debido a diferencias de especie. Figura 9. Secuencia de consenso del fragmento N-terminal de proteínas de erizo humanas. Figura 10. Efecto de longitud de cadena de lípido sobre la actividad de erizo Sonic humano. Una serie de proteínas de erizo modificadas con ácido graso se sintetizó de acuerdo con la presente invención y el efecto de la longitud de cadena del ácido graso en la actividad de proteína de erizo se probó utilizando el ensayo de inducción de fosfatasa alcalina C3H10T1/2 descrito en la presente. Los resultados se grafican como una gráfica de barra. Figura 11. Ensavo C3H10T1/2 de proteina de erizo Sonic humana palmitoilada, miristoilada, lauroilada, decanoilada y octanoilada. La proteína de erizo Sonic humana palmitoilada, lauroilada, decanoilada y octanoilada formulada en 5 mM Na2HPO pH 5.5, 150 mM NaCI, 1% de octilglucósido, 0.5 mM de DTT y proteína de erizo Sonic humana miristoilada, formulada en 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT, se analizaron en células C3H10T1/2 midiendo la inducción de fosfatasa alcalina. Los números representan la media de determinaciones por duplicado. Se incubaron diluciones de 3 veces en serie de proteína de erizo Sonic humana palmitoilada (O), miristoilada (•), lauroilada (D), decanoilada ("), octanoilada (?), y no modificada (A y x), con las células, durante 5 días y los niveles resultantes de fosfatasa alcalina se midieron a 405 nm utilizando el fosfato de p-nitrofenilo de substrato cromogénico. Las proteínas palmitoiladas, miristoiladas, lauroiladas y decanoiladas fueron analizadas en un experimento con la proteína no modificada mostrada como (A), mientras que la proteína octanoilada se analizó en otro experimento con la proteína no modificada mostrada como (x). La flecha en el eje-y denota el nivel anterior de fosfatasa alcalina en ausencia de proteína de erizo agregada. Figura 12. Estructuras genéricas de varias formas hidrofóbicamente modificadas de proteína de erizo. (A) derivado de amida grasa en donde R = cadena de hidrocarburo de un ácido graso; (B) derivado de tiazolidina en donde R = hidrocarburo, (C) substitución de aminoácido en donde R = cadena lateral de aminoácido hidrofóbico; (D) derivado de maleimida en donde R = hidrocarburo; (E) SH = tiol libre en cisteína N-terminal de proteína de erizo de tipo silvestre; (F) derivado de yodo acetamida en donde Ri = hidrocarburo y R2 = ya sea H o hidrocarburo; y (G) derivado de tiomorfolino en donde R = hidrocarburo. Para todas estructuras, HH = erizo. Figura 13. Potencia relativa de varias formas hidrofóbicamente modificadas de proteína de erizo en el ensavo C4H1oT1/2. La E C 50 (2 µg/ml) de erizo Sonic humano de tipo silvestre no modificado se asignó como 1 x. La potencia de las otras proteínas se expresó como la relación de EC50 de proteína de tipo silvestre dividido entre la EC50 de la proteína modificada. Las modificaciones están en el término N de la proteína a menos que se designe otra cosa. Figura 14. Potencia relativa del mutante Clll no modificado, miristoilado de proteína de erizo Sonic humana en un ensavo de lesión estriatal de rata inducida por malonato. La Figura muestra la reducción en el volumen de lesión inducida por malonato que resulta de la administración ya sea del mutante no modificado, miristoilado o C lll de proteína de erizo Sonic humana al estriato de rata. Figura 15. Ilustra las actividades específicas de polipéptidos de erizo modificados con maleimida y no modificados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la proteína de erizo Sonic humana, expresada como una construcción de longitud completa ya sea en células de insecto o de mamífero, tiene un grupo palmitoilo hidrofóbico anexado a la a-amina de la cisteína N-terminal. Este es el primer ejemplo, de los cuáles los inventores se dieron cuenta, de una proteína de señalización extracelular siendo modificada de tal manera, y, en contraste a modificaciones de ácido palmítico enlazado a tiol cuya unión es fácilmente reversible, está porción de palmitoilo N-enlazada novedosa probablemente es muy estable por analogía con modificación de ácido mirístico. Como una consecuencia directa de este descubrimiento inicial, los inventores han encontrado que incrementando la naturaleza hidrofóbica de la proteína de señalización se puede incrementar la actividad biológica de la proteína. En particular, los inventores han encontrado que anexando una porción hidrofóbica a una proteína de señalización, tal como una proteína de erizo, se puede mejorar la actividad de la proteína. Los inventores han encontrado que la cisteína N-terminal de proteínas biológicamente activas no solamente proporciona un sitio conveniente para anexar una porción hidrofóbica, y de esta manera modificar las propiedades fisicoquímicas de la proteína, sino que también las modificaciones a la cisteína N-terminal también pueden incrementar la estabilidad de la proteína. Además, la adición de una porción hidrofóbica a un residuo de aminoácido interno sobre la superficie de la estructura de proteína mejora la actividad de la proteína. Se utiliza como un ejemplo, el descubrimiento de modificaciones hidrofóbicas (por ejemplo, lípidos y aminoácido hidrofóbicos) de proteína de erizo. Un aspecto de la presente solicitud está dirigido al descubrimiento de que, además de aquellos efectos vistos por la adición de colesterol al término C de fragmentos extracelulares de la proteína, por lo menos ciertas actividades biológicas de los productos de gen de erizo son inesperadamente potenciadas por la derivación de la proteína con porciones lipofílicas en otro sitio sobre la proteína y/o por porciones distintas a colesterol. Ciertos aspectos de la invención están dirigidos a preparaciones de polipéptido de erizo, los cuales son modificados en sitios distintos a los residuos N-terminal o C-terminal de la forma procesada natural de la proteína, y/o los cuales son modificados en dichos residuos terminales con porciones lipofílicas distintas a un esterol en el término C o ácido graso en el término N. Como se describe en las publicaciones de PCT WO 95/18856 y WO 96/17924 (todas se incorporan expresamente aquí por referencia), los polipéptidos de erizo en general son útiles en la reparación y/o regulación in vitro e in vivo del rendimiento funcional de una amplia escala de células, tejidos y órganos, y tienen usos terapéuticos que varían de neuroprotección, neurogeneración, mejoramiento de función neural, regulación de formación de huesos y cartílagos y reparación, regulación de espermatogénesis, regulación de pulmón, hígado y otros órganos que surgen del intestino primativo, regulación de la función hematopoyética, etc. Por consiguiente, los métodos y composiciones de la presente invención el uso de polipéptidos de erizo derivatizados para todos estos usos en donde se vean implicadas las proteínas de erizo. Además, los métodos de la presente pueden ser realizados en células que son provistas en cultivo (in vitro), o en células en un animal entero (¡n vivo). En un aspecto, la presente invención proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden, como un ingrediente activo, un polipéptido de erizo siendo derivatizado por una o más porciones lipofílicas tal como se describe en la presente. Los tratamientos con polipéptido de erizo de la presente son efectivos tanto en seres humanos como en animales. Los animales a los cuales la invención puede ser aplicable se extienden tanto a animales domésticos como ganado, desarrollados ya sea como mascotas o para propósitos comerciales. Los ejemplos son perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos y cabras. Las proteínas de erizo son una familia de proteínas de señalización extracelular que regula varios aspectos del desarrollo embriónico tanto en vertebrados como en invertebrados (para revisión ver 1, 2). La proteína de erizo muy bien caracterizada es erizo Sonic (Shh), involucrada en el patrón anterior-posterior, formación de un reborde ectodérmico ápico, mesodermo de la parte posterior del canal alimenticio, columna espinal, extremidad distante, desarrollo de costillas y desarrollo de pulmón, y en la inducción de tipo de células ventrales en la médula espinal, metencéfalo y prosencéfalo (3-8). Aunque el mecanismo de acción de las proteínas de erizo no está completamente entendido, los datos bioquímicos y genéricos más recientes sugieren que el receptor para Shh es el producto del gen supresor de tumor, patched (9,10) y aquellas otras proteínas; smoothened (10,11), Cubitus interruptus (12,13), y fused (14) están implicadas en la trayectoria de señalización de proteína de erizo. El Shh humano es sintetizado como una proteína precursora de 45 kDa que es dividida autocatalíticamente para producir: (I) un fragmento N-terminal de 20 kDa que es sensible a toda actividad de señalización de proteína de erizo conocida (SEC ID NOS. 1-4); y (II) un fragmento C-terminal de 25 kDa que contiene la actividad de autoprocesamiento (15-17). El fragmento N-terminal consiste de los residuos de aminoácido 24-197 de la secuencia precursora de longitud completa. El fragmento N-terminal permanece asociado en membrana a través de la adición de un colesterol en su término C (18,19). Este colesterol es crítico para restringir la localización de tejido de la señal de erizo. La adición del colesterol es catalizada a través del dominio C-terminal durante el paso de procesamiento. Todas las referencias citadas con detalle en la descripción se, a menos que se indique otra cosa, se incorporan aquí por referencia.

I. Definiciones La invención ahora será descrita haciendo referencia a la siguiente descripción detallada tomada junto con las siguientes definiciones. "Aminoácido" - una unidad monomérica de un péptido, polipéptido o proteína. Existen 21 aminoácidos encontrados en péptidos, polipéptidos y proteínas de existencia natural, todos los cuales son isómeros L. El término también incluye análogos de los aminoácidos e isómeros D de los aminoácidos de proteína y sus análogos. "Proteína" - cualquier polímero que consiste esencialmente de cualquiera de los 20 aminoácidos. Aunque "polipéptido" por lo general se utiliza con referencia a polipéptidos relativamente grandes y "péptido" por lo regular se utiliza con referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la técnica se traslapa y es variado. El término "proteína" como se utiliza en la presente se refiere a péptidos, proteínas y polipéptidos a menos que se indique otra cosa. "Extremo N-terminal" - se refiere al primer aminoácido (aminoácido No. 1) de la forma madura de una proteína. "Cisteína N-terminal" - se refiere al residuo de aminoácido (No. 1) como se muestra en SEC ID NOS. 1-4. También se refiere a cualquier cisteína en la posición 1 de cualquier otra proteína, o equivalentes funcionales de esta cisteína (ver Sección IV). Secuencia "separadora" se refiere a una secuencia corta que puede ser tan pequeña como un aminoácido individual que puede ser insertada entre un aminoácido que será hidrofóbicamente modificado (tal como, por ejemplo, la cisteína N-terminal o equivalente funcional) y el resto de la proteína. Un separador está diseñado para proporcionar la separación entre la modificación hidrofóbica (por ejemplo, la cisteína N-terminal modificada) y el resto de la proteína con el fin de evitar de que la modificación interfiera con la función de la proteína y/o hacer que esta sea más fácil para la modificación (por ejemplo, la cisteína N-terminal) para enlazarse con un lípido, vesícula u otra porción hidrofóbica. De esta manera, si una proteína es modificada en su cisteína N-terminal y en un aminoácido en otro sitio, pueden existir 2, o más secuencias separadoras. Proteína "unida" - se refiere a una proteína hidrofóbicamente modificada de acuerdo con la invención. "Complejo de proteína multivalente" - se refiere a una pluralidad de proteínas (es decir una o más). Un lípido u otra porción hidrofóbica está unida a por lo menos una de una pluralidad de proteínas. El lípido u otra proteína hidrofóbica opcionalmente puede estar en contacto con vesícula. Si una proteína carece de un lípido u otra porción hidrofóbica, entonces esa proteína puede ser entrelazada o unida a un proteína que tenga un lípido u otra porción hidrofóbica. Cada proteína puede ser igual o diferente y cada lípido u otra porción hidrofóbica puede ser igual o diferente. "Vesícula" - se refiere a cualquier agregado de moléculas lipofílicas. La vesícula puede ser obtenida a partir de una fuente biológica (por ejemplo, una bicapa lípida tal como una membrana de célula o una preparación detergente derivada de ácido cólico) o de una fuente no biológica (por ejemplo, una vesícula detergente no biológica como se describe en la Sección VI). La forma, tipo y configuración de la vesícula no está destinada a limitar el alcance de esta invención. "Equivalente funcional" de un residuo de aminoácido (por ejemplo, una cisteína N-terminal) - es (i) un aminoácido que tiene propiedades reactivas similares como el residuo de aminoácido que fue reemplazado por el equivalente funcional; (ii) un aminoácido de un ligando de un polipéptido de la invención, el aminoácido teniendo propiedades de unión de porción hidrofóbica similares (por ejemplo, lípido) como el residuo de aminoácido que fue reemplazado por el equivalente funcional; (iii) una molécula que no es aminoácido que tiene propiedades de unión de porción hidrofóbica (por ejemplo, lípido) similares como el residuo de aminoácido que fue reemplazado por el equivalente funcional. "Fusión genética" - se refiere a un enlace colineal, covalente de dos o más proteínas o sus fragmentos a través de sus estructuras de base de péptido individual, a través de expresión genética de una molécula de polinucleótido que codifica esas proteínas. Una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" - es una fusión de una primera secuencia de aminoácido que codifica un polipéptido de erizo con una segunda secuencia de aminoácido definiendo un dominio extraño a y no substancialmente homólogo con ningún dominio de la proteína hh. Una proteína quimérica puede presentar un dominio extraño, (el cual se encuentra, en lugar de una proteína diferente) en un organismo que también expresa la primera proteína, o que puede ser una fusión de "interespecie", "intergénica", etc., de estructuras de proteínas expresadas por diferentes tipos de organismos. En general, una proteína de fusión puede ser representada por la fórmula general (X)n-(hh)m-(Y)n, en donde hh representa toda o una porción de la proteína de erizo, X e Y cada uno representa independientemente una secuencia de aminoácido que naturalmente no es encontrada como una cadena de polipéptido contigua con la secuencia de erizo, m es un entero mayor que o igual a 1, y cada ocurrencia de n es, independientemente, 0 o un entero mayor que o igual a 1 (n y m preferiblemente no son mayores que 5 o 10). "Mutante" - cualquier cambio en el material genético de un organismo, en particular cualquier cambio (es decir, eliminación, substitución, adición o alteración) en una secuencia de polinucleótido de tipo silvestre o cualquier cambio en una proteína de tipo silvestre. "Tipo silvestre" - la secuencia de polinucleótido de secuencia natural de un exón de una proteína o una porción de la misma, o secuencia de proteína, o porción de la misma, respectivamente, ya que como normalmente existe in vivo. "Condiciones de hibridación estándar" - condiciones de sal y temperaturas substancialmente equivalentes a 0.5 X SSC a aproximadamente 5 X SSC y 65°C tanto para la hibridación como para el lavado. El término "condiciones de hibridación estándar" como se utiliza en la presente, es una definición operacional y abarca una escala de condiciones de hibridación. También ver Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, Secciones 6.3.1-6.3.6, (1989). "Secuencia de control de expresión" - una secuencia de polinucleótidos que controla y regula la expresión de genes cuando se enlazan operativamente a aquellos genes. "Operativamente enlazado" - una secuencia de polinucleótido (ADN, ARN) es operativamente enlazada a una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de polinucleótido. El término "operativamente enlazada" incluye que tiene una señal de inicio apropiada (ATG) enfrente de la secuencia de polinucleótido que será expresada, y mantiene el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia de polinucleótido bajo el control de la secuencia de control de expresión, y la producción del polipéptido deseado codificado por la secuencia de polinucleótido. "Vector de expresión" - un polinucleótido, tal como un plásmido o fago de ADN (entre otros ejemplos comunes) que permite la expresión de por lo menos un gen cuando el vector de expresión es introducido en una célula huésped. El vector puede, o no puede ser capaz de replicarse en una célula. "Aislado" (utilizado intercambiablemente con "substancialmente puro") - cuando se aplica a ácido nucleico, es decir, secuencias de polinucleótido que codifica polipéptidos, significa un polipéptido de ARN o ADN, porción de polinucleótido genómico, ADNc o polinucleótido sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (i) no está asociado con todo el polinucleótido con el cual se asocia por naturaleza (por ejemplo, está presente en una célula huésped como un vector de expresión, o una porción del mismo); o (ii) está enlazado a un ácido nucleico u otra porción química distinta aquella a la cual está enlazado por naturaleza; o (iii) no ocurre por naturaleza. Por "aislado" además se quiere dar una secuencia de polinucleótido que es: (i) amplificada in vitro a través de, por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa (PCR); (ii) sintetizada químicamente; (iii) producida recombinantemente a través de clonación; o (¡v) purificada, tal como a través de escisión y separación de gel. De esta manera, "ácido nucleico substancialmente puro" es un ácido nucleico que no está inmediatamente contiguo con una o ambas de la secuencia de codificación con las cuales está normalmente contiguo en el genoma de existencia natural del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. El ADN substancialmente puro también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica secuencias de erizo adicionales.

"Aislado" (utilizado intercambiablemente "substancíalmente puro") - cuando se aplica a polipéptidos significa un polipéptido o una porción del mismo que, en virtud de su origen y manipulación: (i) está presente en una célula huésped como el producto de expresión de una porción de un vector de expresión; o (ii) está enlazado a una proteína u otra porción química distinta aquella a la cual está enlazado por naturaleza; o (iii) no ocurre por naturaleza, por ejemplo, una proteína que es químicamente manipulada a través de anexo, o agregando por lo menos una porción hidrofóbica a la proteína, de manera que la proteína está en una forma no encontrada en la naturaleza. Por "aislado" además se quiere dar a entender una proteína que es: (i) sintetizada químicamente; o (ii) expresada en una célula huésped y purificada lejos de proteínas asociadas y de contaminación. El término generalmente significa un polipéptido que ha sido separado de otras proteínas y ácidos nucleicos con los cuales ocurre por naturaleza. De preferencia, el polipéptido también está separado de substancias tales como anticuerpos o matrices de gel (poliacrilamida), los cuales se utilizan para purificarlo. "Promotor heterólogo" - como se utiliza en la presente, es un promotor que no está naturalmente asociado con un gen o un ácido nucleico purificado. "Homólogo" - como se utiliza en la presente es sinónimo con el término "identidad" se refiere a la similitud de secuencia entre dos polipéptidos, moléculas, o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición tanto en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad de monómero de aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adeninas, o una posición en cada uno de los dos polipéptidos está ocupada por una lisina), entonces las moléculas respectivas son homologas a esa posición. El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homologas compartidas por las dos secuencias divididas entre el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden o son homologas, entonces las dos secuencias son 60% homologas. A manera de ejemplo, las secuencias de ADN, CTGACT y CAGGTT, comparten un 50% de homología (3 de las 6 posiciones totales coinciden). En general, se hace una comparación cuando dos secuencias son alineadas para dar una homología máxima. Dicha alineación puede ser provista utilizando, por ejemplo, el método de Needleman y otros, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), implementado convenientemente por programas de computadora tales como el programa Align (DNAstar, Inc.). Las secuencias homologas comparten residuos de aminoácido idénticos o similares, en donde residuos similares son substituciones conservadoras para, o "mutaciones de punto permitidas" de, residuos de aminoácido correspondientes en una secuencia de referencia alineada. A este respecto, una "substitución conservadora" de un residuo en una secuencia de referencia son aquellas substituciones que física o funcionalmente son similares a los residuos de referencia correspondientes, por ejemplo, que tienen un tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas similares, incluyendo la habilidad para formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Las substituciones conservadoras particularmente preferidas son aquellas que satisfacen los requerimientos definidos por una "mutación de punto aceptado" en Dayhoff y otros, 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, capítulo 22: 354-352, Nat.

Biomed. Res. Foundation Washington, D. C. (1978). Una "proteína de erizo" o "polipéptido de erizo", ya que los términos son utilizados intercambiablemente, de la invención, se definen términos de tener por lo menos una porción que consiste de la secuencia de aminoácido de consenso de SEC ID NO: 4. El término también significa un polipéptido de erizo, o una variante funcional de polipéptido de erizo, u homólogo de un polipéptido de erizo, o variante funcional, que tiene actividad biológica. En particular, los términos abarcan preparaciones de proteínas de erizo y sus fragmentos de peptidilo, ambos formas agonistas y antagonistas como el contexto específico lo aclarará. Como se utiliza en la presente, el término "fragmento bioactivo de una proteína de erizo) se refiere a un fragmento de un polipéptido de erizo de longitud completas, en donde el fragmento específicamente agoniza o antagoniza eventos inductores mediados por proteínas de rizo de tipo silvestre. El fragmento bioactivo de erizo preferiblemente es una porción extracelular soluble de una proteína de erizo, en donde la solubilidad es con referencia a soluciones fisiológicamente compatibles. Los fragmentos bioactivos ilustrativos se describen en las publicaciones de PCT WO 95/18856 y WO 96/17924. En modalidades preferidas, los polipéptidos de erizo de la presente invención se unen a la proteína patched. El término "corresponde a", cuando se refiere a un polipéptido o secuencia de ácido nucleico particular significa que indica que la secuencia de interés es idéntica u homologa a la secuencia de referencia a la cual se dice que corresponde. Los términos "péptido(s)", "proteína(s)" y "polipéptido(s)" se utilizan intercambiablemente en la presente. Los términos "secuencia de polinucleótidos" y "secuencia de nucleótidos" también se utilizan intercambiablemente aquí. Los términos "fragmento de erizo" y "fragmento de erizo N-terminal" se utilizan intercambiablemente con "erizo". Una molécula de erizo tiene "actividad biológica" si tiene por lo menos una de las siguientes propiedades: (i) la molécula satisface los criterios de consensos de los criterios de erizo como se define en la presente (SEC ID NO:4) y tiene la habilidad de unirse a su receptor, patched o codifica, después de la expresión, un polipéptido que tiene esta característica; (ii) la molécula satisface los criterios de consenso de erizo según definido en la presente o codifica, después de la expresión, un polipéptido que tiene esta característica; y (iii) puede inducir la actividad de fosfatasa alcalina en células C3H10T1/2. Generalmente, cualquier proteína tiene "actividad biológica" si la proteína tiene efectos in vitro, propiedades o características que personas que tienen experiencia en la técnica podrían reconocer como representativas de, de acuerdo con, o predecirse razonablemente, los efectos in vivo de la proteína. El término "hidrofóbico" se refiere a la tendencia de porciones químicas con átomos no polares para interactuar entre sí en lugar de agua u otros átomos polares. Los materiales que son "hidrofóbicos" son, en su mayor parte, insolubles en agua. Los productos naturales con propiedades hidrofóbicas incluyen lípidos, ácidos grasos, fosfolípidos, esfingolípidos, acilgliceroles, ceras, esteróles, esteroides, terpenos, prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, isoprenoides, retenoides, biotina y aminoácidos hidrofóbicos tales como triptofano, fenilalanina, isoleucina, leucina, valina, metionina, alanina, prolina y tirosina. Una porción química también es hidrofóbica o tiene propiedades hidrofóbicas si sus propiedades físicas son determinadas por la presencia de átomos no polares. El término incluye grupos lipofílicos. El término "grupo lipofílico", en el contexto de unirse a un polipéptido, se refiere a un grupo que tiene un alto contenido de hidrocarburo, dando así al grupo una alta afinidad a fases de lípido. Un grupo lipofílico puede ser, por ejemplo, un grupo alquilo o cicloalquilo (preferiblemente n-alquilo) de cadena relativamente larga teniendo de aproximadamente 7 a 30 carbonos. El grupo alquilo puede terminar con un "extremo o cola" hidroxi o amina primaria. Para ilustrar más, las moléculas lipofílicas incluyen porciones aromáticas y no aromáticas de existencia natural y sintéticas tales como ácidos grasos, esteres y alcoholes, otras moléculas de lípido, estructuras de jaula o caja tales como adamantano y bolas de Bucky, e hidrocarburos aromáticos tales como benceno, perileno, fenantreno, antraceno, naftaleno, pireno, criseno y naftaceno. La frase "aminoácido interno" significa cualquier aminoácido en una secuencia de péptido que ni es el aminoácido N-terminal ni el aminoácido C-terminal.

La frase "aminoácido de superficie" significa cualquier aminoácido que está expuesto a solvente cuando una proteína es doblada en su forma nativa. La frase "proteína de señalización extracelular" significa cualquier proteína que tanto es secretada de una célula, como es unida al exterior de una célula, y después de unión al receptor para esa proteína en una célula objetivo activa una respuesta en la célula objetivo. Una "cantidad efectiva" de, por ejemplo, un polipéptido de erizo, con respecto a los métodos de tratamiento de la presente invención, se refiere a una cantidad de polipéptido en una preparación que, cuando se aplica como parte de un régimen de dosis deseado produce, por ejemplo, un cambio en la velocidad de proliferación de célula y/o el estado de diferenciación de una célula y/o las velocidades de sobrevivencia de una célula de acuerdo con estándares clínicamente aceptables para el trastorno que será tratado o el propósito cosmético. Un "paciente" o "sujeto" que será tratado por el método de la presente invención puede ser ya sea un ser humano o un animal que no es ser humano. El "estado de crecimiento o desarrollo" de una célula se refiere a la velocidad de proliferación de la célula y el estado de diferenciación de la célula. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología de célula, cultivo de célula, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, química de proteína e inmunología, las cuales se encuentran dentro de la experiencia de la técnica. Dichas técnicas se describen en la literatura.

II. Propiedades Generales de Proteínas de Erizo Aisladas. La porción de polipéptido de las composiciones de erizo del método de la presente puede ser generada a través de cualquier variedad de técnicas, incluyendo purificación de proteínas de existencia natural, proteínas recombinantemente producidas y química sintética. Las formas de polipéptido de los terapéuticos de erizo preferiblemente se derivan de proteínas de erizo de vertebrado, por ejemplo, tienen secuencias que corresponden a proteínas de erizo de existencia natural, o sus fragmentos, de organismos vertebrados. Sin embargo, se apreciará que el polipéptido de erizo puede corresponder a una proteína de erizo (o fragmento de la misma) que ocurre en cualquier organismo metazoario. Las proteínas de erizo aisladas utilizadas en los métodos de esta invención son proteínas de existencia natural o recombinantes de la familia de erizo y se pueden obtener de cualquier fuente de invertebrado o vertebrado (ver referencias más adelante). Los miembros de la familia de proteína de erizo de vertebrado comparten homología con proteínas codificadas por el gen de erizo (HH) Drosophila (33). Hasta la fecha, la clasificación combinada de colecciones genómicas y de ADNc de ratón a identificado tres contrapartes hh de mamífero denominadas como erizo Sonic (Shh), erizo Indian (Ihh) y erizo Desert (Dhh), que también existen en otros mamíferos, incluyendo seres humanos, así como en peces y en pájaros. Otros miembros incluyen erizo Moontral (Mhh), así como hh Sonic de pollo y hh Sonic de pez cebra. Los genes Shh de ratón y pollo y hh de ratón codifican glicoproteínas que experimentan escisión, produciendo un fragmento amino terminal de aproximadamente 20 kDa (ver Figura 8) y un fragmento carboxi terminal de aproximadamente 25 kDa. El fragmento de 20 kDa muy preferido tiene las secuencias de consenso SEC ID NO: 4 e incluye las secuencias de aminoácidos de SEC ID NOS: 1-3. Varios otros fragmentos que abarcan la porción de 20 kDa se consideran dentro de la invención actualmente reclamada. Las publicaciones que describen estas secuencias, así como sus propiedades químicas y físicas, incluyen (34-38); solicitudes de patente de PCT WO 95/23223 (Jessell, Dodd, Roelink y Edlund). WO 95/18856 (Ingham, McMahon y Tabin) y WO 96/17924 (Beachy y otros). Los miembros de la familia útiles en los métodos de la invención incluyen cualquiera de las proteínas de erizo nativas de existencia natural incluyendo las contrapartes alélicas, filogenéticas u otras variantes de los mismos, ya sea de fuentes naturales o químicamente producidas incluyendo muteínas o proteínas mutantes, así como formas recombinantes y miembros nuevos activos de la familia de erizo. Los polipéptidos de erizo particularmente útiles incluyen SEC ID NOS: 1-4. Los polipéptídos de erizo aislados utilizados en el método de la invención tienen actividad biológica. Los .polipéptidos incluyen una secuencia de aminoácido por lo menos 60%, 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% homologa a una secuencia de aminoácido de SEC ID NOS: 1-4. El polipéptido también puede incluir una secuencia de aminoácido esencialmente igual a la secuencia de aminoácido en SEC ID NOS: 1-4. El polipéptido es por lo menos 5, 10, 20, 50, 100 o 150 aminoácidos en longitud e incluye por lo menos 5, de preferencia al menos 10, preferiblemente al menos 20, muy preferiblemente al menos 50, 100 o 150 aminoácidos contiguos de SEC ID NOS: 1-4. Los polipéptidos preferidos de la invención incluyen una secuencia de polípéptido de erizo así como otras secuencias de aminoácido N-terminal y/o C-terminal o pueden incluir toda o un fragmento de una secuencia de aminoácido de erizo. El polipéptido de erizo aislado también puede ser una proteína de fusión recombinante teniendo una primera porción de erizo y una segunda porción de polipéptido, por ejemplo, una segunda porción de polipéptido teniendo una secuencia de aminoácido no relacionada a erizo. La segunda porción de polipéptido puede ser, por ejemplo, etiqueta de histidina, proteína de unión de maltosa, glutationa-S-transferasa, un dominio de unión de ADN, o un dominio de activación de polimerasa. Los polipéptidos de la invención incluyen aquellos que surgen como resultado de la existencia de genes múltiples, eventos de transcripción alternativa, eventos de división de ARN alternativos, y eventos alternativos de traducción y post-traducción. El polipéptido puede hacerse completamente a través de medios sintéticos o puede ser expresado en sistemas, por ejemplo, células cultivadas, que dan como resultado substancialmente las mismas modificaciones posttraducción presentes cuando la proteína es expresada en una célula nativa, o en sistemas que dan como resultado la omisión de modificaciones de post-traducción presentes cuando se expresa en una célula nativa. En una modalidad preferida, la proteína de erizo aislada es un polipéptido de erizo con una o más de las siguientes características: (i) tiene por lo menos 30, 40, 42, 50, 60, 70, 80, 90 o 95% de identidad de secuencia con los aminoácidos de SEC ID NOS: 1-4. (ii) tiene una cisteína o equivalente funcional como el extremo N-terminal; (iii) puede inducir la actividad de fosfatasa alcalina en células C3H10T1/2; (iv) tiene una identidad de secuencia total de por lo menos 50%, de preferencia al menos 60%, muy preferiblemente por lo menos 70, 80, 90 o 95% con un polipéptido de SEC ID NOS: 1-4; (v) se puede aislar de fuentes naturales tales como células de mamífero; (vi) puede unirse o interactuar con patched; y (vii) se modifica hidrofóbicamente (es decir, tiene por lo menos una porción hidrofóbica unida al polipéptido). lll. Otras Proteínas. Ya que existen técnicas para diseñar por ingeniería un residuo de cisteína (o su equivalente funcional) a una secuencia primaria de polipéptido, virtualmente cualquier proteína puede ser convertida a una forma hidrofóbicamente modificada utilizando los métodos aquí descritos. Los receptores virales, receptores de célula y ligandos de célula son útiles ya que se unen típicamente a células o tejidos que exhiben muchas copias del receptor. Los receptores de proteína viral-célula útiles que pueden formarse en complejo conjuntamente utilizando los métodos de esta invención incluyen ICAMI, un receptor de rinovirus; CD2, el receptor de virus de Epstein-Barr; y CD4, el receptor para virus de inmunodeficiencia humano (VIH). Otras proteínas incluyen miembros de la familia de molécula de adhesión de célula, tales como ELAM-1 y VACM-1 y VCAM-1b y sus contrapartes de linfocito (ligando); los antígenos asociados al linfocito LFA1, LFA2 (CD2) y LFA3 (CD58), CD59 (un segundo ligando de CD2), miembros de la familia CD11/CD18 y muchos antígenos posteriores tales como VLA4 y sus ligandos. Los inmunógenos a partir de una variedad de patógenos (por ejemplo, de bacterias, hongos, virales y otros parásitos eucarióticos) también pueden ser utilizados como polipéptidos en los métodos de la invención. Los inmunógenos bacterianos incluyen, pero no se limitan a, fuentes bacterianas responsables de neumonía bacteriana y neumonía penumocística. Las fuentes de parásitos incluyen el parásito de malaria Plasmodium. Las fuentes virales incluyen poxivirus (por ejemplo, viruela vacuna, herpes simple, citomegalovirus); adenovirus; papovarirus (por ejemplo, papilomavirus); parvovirus (por ejemplo, virus adeno-asociado); retrovirus (por ejemplo, HTLVI, HTLVII, HIV I Y HIV II) y otros. Las inmunoglobulinas, fragmentos de las mismas también pueden ser péptidos que pueden ser modificados de acuerdo con la invención. Se pueden generar fragmentos Fab monoclonales reconociendo antígenos específicos utilizando métodos convencionales (49) y utilizando los dominios Fab individuales como porciones funcionales en construcciones multiméricas de acuerdo con esta invención. Otras proteínas útiles incluyen, gelsolina (50); citocinas, incluyendo los varios interferones (interferon-a, interferón-ß e interferon-?); las varias interleucinas (por ejemplo IL-1, -2, -3, -4, y similares); los factores a y ß de necrosis tumoral; factor de estimulación de colonia de monocito (M-CSF), factor de estimulación de colonia de granulocito (G-CSF), factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF), eritropoyetina, factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), y hormonas humanas y de animal, incluyendo hormona de crecimiento e insulina. Generalmente, la estructura de las proteínas modificadas de esta invención tiene la fórmula general: A-Cys-[Sp]-B-[Sp]-X, en donde A es una porción hidrofóbica; Cys es una cisteína o un equivalente funcional de la misma; [Sp] es una secuencia de péptido separadora opcional; B es una proteína (la cual opcionalmente puede tener otra secuencia de péptido separadora como se muestra), y X es una porción hidrofóbica enlazada (opcionalmente a través del péptido separador) al un extremo C-terminal de la proteína u otro sitio de la superficie de la proteína, en donde la proteína derivatizada incluye por lo menos uno de A o X. Si X es colesterol, entonces B puede o no puede ser una proteína de erizo. Como se discutió anteriormente, el propósito del separador es proporcionar una separación entre la porción hidrofóbica y el resto de la proteína con el fin de facilitar que la porción hidrofóbica (por ejemplo, una cisteína N-terminal modificada) se enlace a otra porción que puede ser un lípido o una vesícula. El separador también está destinado a hacer más difícil la modificación para interferir con la función de proteína. Un separador puede ser un aminoácido individual con una longitud lo más pequeña posible. En general, se prefieren prolinas y glicinas. Una secuencia separadora particularmente preferida se deriva de proteína de erizo Sonic y consiste de la secuencia de aminoácido: G-P-G-R.

IV. Producción de Polipéptidos Recombinantes Los polipéptidos aislados descritos en la presente invención pueden ser producidos a través de cualquier método adecuado conocido en la técnica. Dichos métodos varían de métodos sintéticos de proteína directos a la construcción de una secuencia de ADN que codifica secuencias de polipéptido aislado y expresan aquellas secuencias en un huésped transformado adecuado. En una modalidad de un método recombinante, se construye una secuencia de ADN aislando o sintetizando una secuencia de ADN que codifica una proteína de tipo silvestre de interés. Opcionalmente, la secuencia puede ser mutagenizada a través de mutagénesis específica en el sitio para proporcionar sus análogos funcionales. Ver, por ejemplo, (40) y patente de E.U.A. 4,588,585. Otro método para construir una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés podría ser a través de síntesis química utilizando un sintetizador de oligonucleótido. Dichos oligonucleótidos preferiblemente pueden ser diseñados con base en la secuencia de aminoácido del polipéptido deseado, y preferiblemente seleccionando aquellos codones que son favorecidos en la célula huésped en donde el polipéptido recombinante de interés será producido. Se pueden aplicar métodos estándares para sintetizar una secuencia de polipéptido aislado que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, se puede utilizar una secuencia de aminoácido completa para construir un gen de traducción posterior. Ver, Maniatis y otros, supra. Además, se puede sintetizar un oligómero de ADN teniendo una secuencia de nucleótido que codifica para el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, se pueden sintetizar varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones para el polipéptido deseado y después pueden ser ligados. Los oligonucleótidos individuales típicamente contienen extensiones excesivas 5' o 3' para ensamble complementario. Una vez ensambladas (a través de síntesis, mutagénesis dirigida en el sitio, o a través de otro método), la secuencia de ADN mutante que codifica un polipéptido aislado particular de interés serán insertadas en un vector de expresión y operativamente enlazadas a una secuencia de control de expresión apropiada para la expresión de la proteína en un huésped deseado. El ensamble apropiado puede ser confirmado a través de secuenciación de nucleótido, mapeo de restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Como es bien conocido en la técnica, con el fin de obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen debe ser operativamente enlazado a secuencias de control de expresión transcripcionales y de traducción que son funcionales en el huésped de expresión seleccionado. La selección de la secuencia de control de expresión y el vector de expresión dependerán de la elección del huésped. Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de huésped de expresión/vector. Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucarióticos incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, virus de papiloma de bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de Escherichia coli, incluyendo pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de escala más amplia de huésped, tales como M13 y fagos de ADN de estructura de cadena individual filamentosa. Los vectores de E. coli preferidos incluyen vectores pL conteniendo el promotor pL del fago lambda (patente de E.U.A. 4,874,702), vectores pET conteniendo el promotor de polimerasa T7 (Studier y otros, Methods in Enzymology 185: 60-89, 1990 1) y el vector pSP72 (Kaelin y otros, supra). Los vectores de expresión útiles para células de levadura, por ejemplo, incluyen los plásmidos 2T y centrómero. Además, cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión puede ser utilizada en estos vectores. Dichas secuencias de control de expresión útiles incluyen las secuencias de control de expresión asociadas con genes estructurales con genes estructurales de los vectores de expresión anteriores. Ejemplos de secuencias de control de expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40 o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, las regiones principales de operador y promotor de lambda fago, por ejemplo, pL, las regiones de control de proteína de revestimiento fd, el promotor para 3-fosfoglicerato-cinasa u otras enzimas g licol íticas, los promotores de fosfatasa acida, por ejemplo, Pho5, los promotores del sistema de a-apareamiento de levadura y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas y sus virus y varias combinaciones de las mismas. Cualquier huésped adecuado puede ser utilizado para producir en cantidad los polipéptidos de erizo aislados descritos en la presente, incluyendo células o línea de célula de bacterias, hongos (incluyendo levadura), plantas, insectos, mamíferos u otras células o líneas de célula de animal apropiado, así como animales o plantas transgénicos. Más particularmente, estos huéspedes pueden incluir huéspedes eucarióticos y procarióticos bien conocidos, tales como las cepas de £. coli, Pseudomonas, Bacillus, Sreptomyces, hongos, levadura (por ejemplo, Hansenula), células de insecto tales como Spodoptera frugiperda (SF9), y High Five™ (ver Ejemplo 1), células de animal tal como de ovario de hámster Chino (CHO), células de ratón tales como células NS/O, células de mono verde Africano COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, y BMT 10, y células humanas, así como células de planta. Se debe entender que no todos los vectores y secuencias de control de expresión funcionarán igualmente bien para expresar un polipéptido aislado dado. Ninguno de todos los huéspedes igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la técnica puede hacer una selección entre estos vectores, sistemas de control de expresión y huéspedes sin experimentación indebida. Por ejemplo, para producir un polipéptido aislado de interés en un cultivo de animal a gran escala, el número de copia del vector de expresión debe ser controlado. Los vectores amplíficables son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, (41) y patentes de E. U. A. Nos. 4,470,561 y 5,122,464. Dicho enlace operativo de una secuencia de ADN a una secuencia de control de expresión incluye la provisión de una señal de inicio de traducción en el marco de lectura correcto corriente arriba de la secuencia de ADN. Si la secuencia de ADN particular que se está expresando no empieza con una metionina, la señal de inicio dará como resultado un aminoácido adicional (metionina) siendo ubicado en el término N del producto. Si una porción hidrofóbica va a ser enlazada a la proteína que contiene metionilo N-terminal, la proteína puede ser empleada directamente en las composiciones de la invención. Sin embargo, ya que el extremo N-terminal preferido de la proteína es para que consista de una cisteína (o equivalente funcional), la metionina debe ser removida antes de uso. En la técnica están disponibles métodos para remover dichas metioninas N-terminales de los polipéptidos expresados con las mismas. Por ejemplo, ciertos huéspedes y condiciones de fragmentación permiten la remoción substancialmente de toda la metionina N-terminal, in vivo. Otros huéspedes requieren de remoción in vitro de la metionina N-terminal. Dichos métodos in vitro e in vivo son bien conocidos en la técnica. Las proteínas producidas por un huésped transformado pueden ser purificadas de acuerdo con cualquier método adecuado. Dichos métodos estándares incluyen cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones, cromatografía definida y de columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o a través de cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteína. Para la cromatografía de inmunoafinidad (ver Ejemplo 1), se puede aislar una proteína tal como una proteína de erizo Sonic uniéndola a una columna de afinidad comprendiendo los anticuerpos que fueron desarrollados contra la proteína de erizo Sonic, o una proteína relacionada y se fijaron a un soporte fijo. Alternativamente, se pueden unir etiquetas de afinidad tales como hexahistidina, domino de unión de maltosa, secuencia de revestimiento de influenza, glutationa-s-transferasa, a la proteína para permitir una fácil purificación a través del paso sobre una columna de afinidad apropiada. También se pueden caracterizar proteínas aisladas físicamente utilizando técnicas tales como proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X.

A. Producción de Fragmentos y Análogos También se pueden producir eficientemente fragmentos de una proteína aislada (por ejemplo, fragmentos de SEC ID NOS: 1-4) a través de métodos recombinantes, a través de digestión proteolítíca, o a través de síntesis química utilizando métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. En métodos recombinantes, se pueden generar fragmentos internos o terminales de un polipéptido removiendo uno o más nucleótidos de un extremo (para u n fragmento terminal) o ambos extremos (para un fragmento interno) de una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido de erizo aislado. La expresión del ADN mutagenizado produce fragmentos de polipéptido. La digestión con endonucleasas de "corte de extremo" también puede generar ADNs que codifican una disposición de fragmentos. Los ADNs que codifican fragmentos de una proteína también pueden ser generados a través de corte aleatorio, digestión de restricción, o una combinación de ambos. Los fragmentos de proteína pueden ser generados directamente de proteínas intactas.

Los péptidos pueden ser separados por escisión específicamente a través de enzimas proteolíticas, incluyendo, pero no limitándose a, plasmina, trombina, tripsina, quimiotripsina o pepsina. Cada una de estas enzimas es específica para el tipo de enlace peptídico que ataca. La tripsina cataliza la hidrólisis de enlaces de péptido en donde el grupo carbonilo es de un aminoácido básico, usualmente arginina o lisina. La pepsina y quimiotripsina catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos de aminoácidos aromáticos, tales como triptofano, tirosina y fenilalanina. Los grupos alternativos de fragmentos de proteína divididos son generados evitando la escisión en un sitio que sea susceptible a una enzima proteólitica. Por ejemplo, la reacción del grupo eamino ácido de lisina de trifluoroacetato de etilo en una solución moderadamente básica produce residuos de aminoácido bloqueado cuyo enlace peptídico adyacente ya no es más susceptible a hidrólisis por tripsina. Las proteínas pueden ser modificadas para crear enlaces peptídicos que sean susceptibles a enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la alquilación de residuos de cisteína con ß-haloetilaminas produce enlaces peptídicos que son hidrolizados por tripsina (51). Además, los reactivos químicos que separan cadenas peptídicas en residuos específicos, pueden ser utilizados. Por ejemplo el bromuro de cianógeno divide a los péptidos en residuos metionina (52). De esta manera, tratando las proteínas con varias combinaciones de modificadores, enzimas proteolíticas y/o reactivos químicos, las proteínas pueden ser divididas en fragmentos de una longitud deseada sin ningún traslape de los fragmentos o dividirse de fragmentos traslapantes de una longitud deseada. También se pueden sintetizar fragmentos en forma química utilizando técnicas conocidas en el campo tales como Merrifield de fase sólida de F moc o química de t-Boc. Merrífield, Recent Progress in Hormone Research 23: 451 (1967). Más adelante se describen ejemplos de métodos de la técnica anterior que permiten la producción y pruebas de fragmentos y análogos. Estos, o métodos análogos, pueden ser utilizados para hacer y clasificar fragmentos y análogos de un polipéptido aislado (por ejemplo de erizo) que se puede mostrar que tienen actividad biológica. Un método ilustrativo para probar si los fragmentos y análogos de erizo tienen actividad biológica se encuentra en el Ejemplo 3.

B. Producción de ADN alterado y secuencias de péptido: Métodos Aleatorios Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácido de una proteína (tales como variantes de SEC ID NOS: 1-4) a través de mutagénesis aleatoria de ADN que codifica la proteína o una porción particular de la misma. Los métodos útiles incluyen mutagénesis de PCR y mutagénesis de saturación. También se puede generar una colección de variantes de secuencia de aminoácido aleatorias a través de la síntesis de un grupo de secuencias de oligonucleótido degeneradas. Los métodos para generar variantes de secuencia de aminoácido de una proteína dada utilizando ADN alterado y péptidos son bien conocidos en la técnica. Los siguientes ejemplos de tales métodos no pretenden limitar el alcance de la presente invención, sino que meramente sirven para ¡lustrar técnicas representativas. Las personas con experiencia en la técnica reconocerán que otros métodos también pueden ser útiles a este respecto. Mutagénesis de PCR: en resumen, se utilizó polimerasa Taq (u otra polimerasa) para introducir mutaciones aleatorias a un fragmento clonado de ADN (42). Las condiciones de PCR se seleccionaron de manera que la fidelidad de la síntesis de ADN se redujo a través de polimerasa de ADN-Taq utilizando, por ejemplo, una relación de dGTP/dATP de cinco y agregando Mn2+ a la reacción de PCR. La combinación de fragmentos de ADN amplificados se insertó en vectores de clonación apropiados para proporcionar colecciones de mutantes aleatorias. Mutagénesis de Saturación: generalmente, se describe un método en (43). En resumen, la técnica incluye generación de mutaciones a través de tratamiento químico o irradiación de ADN de estructura de cadena individual in vitro, y la síntesis de una estructura de ADNc. La frecuencia de mutación se moduló a través de la severidad del tratamiento y esencialmente se pueden obtener todas las posibles substituciones de base. Mutagénesis de Oligonucleótido de Degeneración: Se puede generar una colección de péptidos homólogos a partir de un grupo de secuencias de oligonucleótido de degeneración. La síntesis química de secuencias de degeneración puede ser realizada en un sintetizador automático de ADN, y los genes sintéticos después se ligan a un vector de expresión apropiado. Ver, por ejemplo, (44, 45) y Itakura y otros, Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, pág. 273-289 (A. G. Walton, ed.), Elsevier, Amsterdam, 1981.

C. Producción de ADN Alterado y Secuencias de Péptido: Métodos Directos La mutagénesis no aleatoria, o dirigida proporciona secuencias o mutagénesis específicas en porciones específicas de una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido aislado, para proporcionar variantes que incluyen eliminaciones, inserciones o substituciones de residuos de la secuencia de aminoácido conocida del péptido aislado. Los sitios de mutación pueden ser individualmente modificados o en serie, por ejemplo: (1) substituyendo primero con aminoácidos conservados y después con más selecciones radicales dependiendo de los resultados obtenidos; (2) eliminando el residuo objetivo; o (3) insertando residuos de la misma clase o de una clase diferente adyacente al sitio ubicado, o combinaciones de las opciones 1-3. Claramente, dichos métodos dirigidos al sitio son, de una forma en donde una cisteína N-terminal (o equivalente funcional) puede ser introducida a una secuencia de polipéptido dada para proporcionar el sitio de unión para una porción hidrofóbica.

Mutagénesis de Exploración de Alanina: Este método ubica aquellos residuos o regiones de una proteína deseada que son sitios preferidos para la mutagénesis (46). En la clasificación de alanina, un residuo o grupo de residuos objetivo son seleccionados y reemplazados por alanina. Este reemplazo puede afectar la interacción del aminoácido con aminoácidos circundantes y/o con el ambiente acuoso o de membrana circundante. Aquellos que tienen sensibilidad funcional a las substituciones entonces son refinados introduciendo más u otras variantes en, o para, los sitios de substitución. Mutagénesis Mediada por Oligonucleótido: Una versión de este método puede ser utilizada para preparar variantes de substitución, eliminación e inserción de ADN (47). En resumen, el ADN deseado es alterado hibridizando un iniciador de oligonucleótido que codifica una mutación de ADN a una plantilla de ADN, la cual típicamente es la forma de estructura de cadena individual de un plásmido o fago conteniendo la plantilla de secuencia de ADN no alterada o de tipo silvestre de la proteína deseada (por ejemplo, la proteína de erizo). Después de la hibridación, una polimerasa de ADN es utilizada para hacer la segunda estructura de cadena de ADN y complementaria de la plantilla que incorporará el iniciador de oligonucleótido, y codificará para la alteración seleccionada en la secuencia de ADN deseada. Generalmente, los oligonucleótidos de por lo menos 25 nucleótidos en longitud, son utilizados. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios a la plantilla en ambos lados de la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido se hibridizará apropiadamente a la molécula de plantilla de ADN de estructura de cadena individual. Mutagénesis de Cassette: Este método (48) requiere de un plásmido u otro vector que contenga el ADN de subunidad de proteína que será mutado. El codón(es) en el ADN de subunidad de proteína es identificado y ahí se inserta un único sitio de endonucleasa de restricción sobre cada lado del sitio(s) de mutación identificado, utilizando el método de mutagénesis dirigida al oligonucleótido anteriormente descrito. El plásmido después es cortado en estos sitios para linealisarlo. Un oligonucleótido de estructura de cadena doble que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción, pero que contiene la mutación(es) deseada, es sintetizado utilizando procedimientos estándares. Las dos estructuras de cadena son sintetizadas en forma separada y después hibridizadas conjuntamente utilizando métodos estándares. Este oligonucleótido de cadena de estructura doble es el "cassette" y tiene los extremos 3' y 5' que son compatibles con los extremos del plásmido linearisado de manera que puede ser ligado directamente en el mismo. El plásmido ahora contiene la secuencia de ADN de subunidad de proteína deseada mutada. Mutagénesis de Combinación: En una versión de este método (Ladner y otros, WO 88/06630), las secuencias de aminoácido para un grupo de homólogos u otras proteínas relacionadas son alineadas, preferiblemente para promover la homología más alta posible. Todos los aminoácidos que aparecen en una posición dada de las secuencias alineadas pueden ser seleccionados para crear un grupo de degeneración de secuencias de combinación. La colección veteada es generada por mutagénesis de combinación al nivel de ácido nucleico, y es codificada por una colección de gen veteada. Por ejemplo una mezcla de oligonucleótidos sintéticos puede ser ligada enzimáticamente a la secuencia de gen, de manera que el grupo de degeneración de secuencias potenciales se pueden expresar como péptidos individuales, o alternativamente, como un grupo de proteínas conteniendo todo el grupo de secuencias de degeneración.

D. Otras Variantes de Polipéptidos Aislados. Incluidas en la invención se encuentran las moléculas aisladas que son: variantes alélicas, mutantes naturales, mutantes inducidos y proteínas codificadas por ADN que hibridizan bajo condiciones de alta o baja severidad a un ácido nucleico, el cual codifica un péptido tal como el fragmento N-terminal de la proteína de erizo Sonic (SEC ID NO: 1) y polipéptidos unidos específicamente a través de antisueros a péptidos de erizo, especialmente a través de antisueros a un sitio activo o sitio de unión del polipéptido de erizo. Todas las variantes aquí descritas se espera que: (i) retengan la función biológica de la proteína original y (ii) retengan la habilidad de enlazarse a una porción hidrofóbica (por ejemplo, un lípido). Los métodos de la invención también pueden caracterizar usos de fragmentos, preferiblemente fragmentos biológicamente activos, o análogos de un péptido aislado tales como de erizo. Específicamente, un fragmento o análogo biológicamente activo es uno que tiene cualquier actividad in vivo o in vitro, la cual es característica del péptido mostrado en SEC ID NOS: 1-4 o de otro tipo de erizo aislado de existencia natural. Muy preferiblemente, el fragmento hidrofóbicamente modificado o análogo tiene por lo menos un 10%, preferiblemente 40% o más, o muy preferiblemente al menos 90% de la actividad del polipéptido de erizo Sonic (ver Ejemplo 3) en cualquier ensayo in vivo o in vitro. Los análogos pueden diferir de la proteína aislada de existencia natural en una secuencia de aminoácido o en formas que no implican la secuencia, o ambos. Los polipéptidos muy preferidos de la invención tienen modificaciones preferidas que no son de secuencia que incluyen derivatización química in vivo o in vitro (por ejemplo, de su extremo N-terminal), así como posibles cambios en la acetilación, metilación, fosforilación, amidación, carboxilación o glicosilación. Otros análogos incluyen una proteína tal como una proteína de erizo Sonic o sus fragmentos biológicamente activos cuyas secuencias difieren de la secuencia de consenso de tipo silvestre, (por ejemplo, SEC ID NO: 4) a través de una o más substituciones de aminoácido conservadoras o a través de una o más substituciones de aminoácido no conservadoras, o a través de eliminaciones o inserciones que no evitan la actividad biológica de la proteína aislada. Las substituciones conservadoras típicamente incluyen la substitución de un aminoácido para otro con características similares tales como substituciones con los siguientes grupos: valina, alanina y glicina; leucina e isoleucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Los aminoácidos hidrofóbicos no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina cerina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Otras substituciones conservadoras pueden ser fácilmente conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, para la alanina de aminoácido, se puede tomar una substitución conservadora de cualquiera de D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteína, y D-cisteína. Para la lisina, un reemplazo puede ser cualquiera de D-lisina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina, o D-ornitina. Generalmente, las substituciones que se puede esperar que induzcan cambios en las propiedades funcionales de polipéptidos aislados son aquellas en donde: (i) un residuo polar, por ejemplo, serina o treonina, es substituido para "o por" un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina o alanina; (¡i) un residuo de cisteína es substituido para (o por) cualquier otro residuo (ver Ejemplo 10); (iii) un residuo que tenga una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisina, arginina o histidina, es substituido para (o por) un residuo que tenga una cadena lateral electronegativa, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un residuo que tenga una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, es substituido para (o por) uno que no tenga dicha cadena lateral, por ejemplo glicina. Otros análogos utilizados dentro de los métodos de la invención son aquellos con modificaciones que incrementen la estabilidad del péptido. Dichos análogos pueden contener, por ejemplo, uno o más enlaces que no son de péptido (los cuales reemplazan los enlaces de péptido) en la secuencia de péptido. También se incluyen (análogos que incluyen residuos distintos a los L-aminoácidos de existencia natural, tales como D-aminoácidos o aminoácidos de existencia no natural o sintéticos tales como beta o gama aminoácidos y análogos cíclicos. La incorporación de D- en lugar de L-aminoácidos en el polipéptido de erizo aislado puede incrementar su resistencia a proteasa. Ver, patente de E. U. A. 5,219,990 supra. El término "fragmento" como se aplica a un análogo de erizo aislado, puede ser tan pequeño como un aminoácido individual siempre que retenga su actividad biológica. Puede ser por lo menos de aproximadamente 20 residuos, más típicamente al menos alrededor de 20 residuos, de preferencia al menos alrededor de 60 residuos en longitud. Los fragmentos pueden ser generados a través de métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. La habilidad de un fragmento candidato para exhibir actividad biológica de polipéptido de análogo de erizo aislado también puede ser determinada a través de métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica como se describe en la presente.

V. Fabricación de Derivados Hidrofóbicos. Los inventores han descubierto que incrementando la naturaleza total hidrofóbica de una proteína de señalización, tal como una proteína de erizo, se incrementa la actividad biológica de la proteína. La potencia de una proteína de señalización tal como una proteína de erizo, puede ser incrementada: (a) modificando químicamente, tal como agregando una porción hidrofóbica a, el sulfhidrilo y/o a la a-amina de la cisteína N-terminal (Ejemplos 8 y 9); (b) reemplazando la cisteína N-terminal con un aminoácido hidrofóbico (Ejemplo 10); o (c) reemplazando la cisteína N-terminal con un aminoácido diferente y después modificando químicamente el residuo substituido con el fin de agregar una porción hidrofóbica en el sitio de la substitución. Además, la modificación de una proteína tal como una proteína de erizo en un residuo interno sobre la superficie de la proteína con una porción hidrofóbica: (a) reemplazando el residuo interno con un aminoácido hidrofóbico; o (b) reemplazando el residuo interno con un aminoácido diferente y después modificando químicamente el residuo substituido con el fin de agregar una porción hidrofóbica en el sitio de la substitución (ver Ejemplo 10), retendrá o mejorará la actividad biológica de la proteína.

Además, la modificación de una proteína tal como una proteína de erizo, en el término C con una porción hidrofóbica: (a) remplazando el residuo C-terminal con un aminoácido hidrofóbico; o (b) reemplazando el residuo C-terminal con un diferente aminoácido y después modificando químicamente el residuo substituido con el fin de agregar una porción hidrofóbica en el sitio de la substitución, retendrá o mejorará la actividad biológica de la proteína. Existe una amplia variedad de porciones lipofílicas con las cuales los polipéptidos de erizo pueden ser derivatizados. Un grupo lipofílico puede ser, por ejemplo, un grupo alquilo o cicloalquilo de cadena relativamente larga (preferiblemente n-alquilo) teniendo aproximadamente 7 a 30 carbonos. El grupo alquilo puede terminar con un "extremo o cola" hidroxi o amina primaria. Para ilustrar adicionalmente, las moléculas lipofílicas incluyen porciones aromáticas y no aromáticas de existencia natural y sintéticas, tales como ácidos grasos, esteres y alcoholes, otras moléculas de lípido, estructuras de jaula o cajas tales como adamantano y bola de Bucky e hidrocarburos aromáticos tales como benceno, perileno, fenantreno, antraceno, naftaleno, pireno, criseno y naftaceno. Particularmente útiles como moléculas lipofílicas son los hidrocarburos alicíclicos, ácidos grasos saturados e insaturados y otras porciones de lípido y fosfolípido, ceras, colesterol, isoprenoides, terpernos e hidrocarburos polialicíclícos incluyendo adamantano y bola de Bucky, vitaminas, glicol polietilénico o glicol oligoetilénico, diésteres de fosfato de alquilo (C1-C18), -O-CH2- CH(OH)-O-(C12-C18)-alquilo, y en particular conjugados con derivados pireno. La porción lipofílica puede ser un colorante lipofílico adecuado para utilizarse en la invención que incluye, pero no se limita a, difenilhexatrieno, rojo de Nilo, N-fenil-1 -naftilamina, Prodan, Laurodan, Pireno, Perileno, rodamina, rodamina B, tetrametilrodamina, rojo Texas, sulforadamina, perclorato de 1,1'-didodecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina, rodamina B de octadecilo y colorantes BODIPY de Molecular Probes Inc. Otras porciones lipofílicas ilustrativas incluyen grupos de radical de carbonilo alifático que incluyen 1- o 2-adamantilacetilo, 3-metiladamant-1-ilacetilo, 3-metil-3-bromo-1-adamantilacetilo, 1 -decalinacetilo, alcanforaceetilo, alcanfanacetilo, noradamantilacetilo, norbornanacetilo, biciclo[2.2.2.]-oct-5-enacetilo, 1-metoxibiciclo[2.2.2.]-oct-5-en-2-carbonilo, cis-5-norbornen-endo-2,3-dicarbonilo, 5-norbornen-2-ilacetilo, (1 R)-(-)-mirtenantanacetilo, 2-norbornanacetílo, anti-3-oxo-tricíclo[2.2.2.0<2.6>]-heptan-7-carbonilo, decanoilo, dodecanoilo, dodecenoilo, tetradecadienoilo, decinoilo o dodecinoilo. Las estructuras de modificaciones hidrofóbicas ilustrativas se muestran en la Figura 12. Si un aminoácido apropiado no está disponible en una posición específica, se puede utilizar mutagénesis dirigida al sitio para colocar un aminoácido reactivo en ese sitio. Los aminoácidos reactivos incluyen cisteína, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina treonina tirosina, arginina, metionina y triptofano. La mutagénesis puede ser utilizada para colocar el aminoácido reactivo en el término N- o C- o en una posición interna. Por ejemplo, se ha encontrado que es posible modificar químicamente una cisteína N-terminal de una proteína biológicamente activa, tal como una proteína de erizo, o eliminar la cisteína N-terminal conjuntamente y seguir reteniendo la actividad biológica de la proteína, siempre que la porción química modificada o substituida sea hidrofóbica. Los inventores han encontrado que el mejoramiento de la actividad biológica de la proteína de erizo fuertemente se correlaciona con el carácter hidrofóbico de la modificación. Además de mejorar la actividad de la proteína, la modificación o reemplazo de la cisteína N-terminal elimina la reacciones cruzadas y/o modificaciones no deseadas de la cisteína que pueden ocurrir durante producción, purificación, formulación y almacenamiento de la proteína. El tiol de una cisteína N-terminal es un reactivo debido a su cercanía a la a-amina, que reduce el valor de pKa de la cisteína e incrementa la disociación de protones y formación del ion de tiolato reactivo a un pH neutro o ácido. Se ha demostrado que el reemplazo de la cisteína N-terminal de proteína de erizo con un aminoácido hidrofóbico da como resultado una proteína con potencia incrementada en el ensayo de señalización a base de célula. Reemplazando la cisteína, este aspecto elimina el problema de suprimir otras modificaciones no deseadas de la cisteína que puedan ocurrir durante la purificación, producción, formulación y almacenamiento de la proteína. La generalidad de este aspecto está apoyada por el hallazgo de que tres diferentes aminoácidos hidrofóbicos, fenilalanina, isoleucina, y metionina, cada uno tiene una forma más activa de proteína de erizo. Por lo tanto, el reemplazo de la cisteína con cualquier otro aminoácido hidrofóbico debe dar como resultado una proteína activa. Además, ya que se ha encontrado una correlación entre el carácter hidrofóbico de un aminoácido o modificación química y la potencia de la proteína modificada correspondiente en el ensayo C3H10T1/2 (por ejemplo, Phe>Met, ácidos grasos de longitud de cadena larga > longitud de cadena corta), se puede contemplar que el agregar más de un aminoácido hidrofóbico a la secuencia de erizo podría incrementar la potencia de la proteína más allá de aquella lograda con una adición de aminoácido individual. En realidad, la adición de dos residuos de isoleucina consecutivos al término N de la proteína de erizo Sonic humana da como resultado un incremento en la potencia en el ensayo de C3H10T1/2 según comparado con el mutante con solo una ísoleucina individual agregada (ver Ejemplo 10). De esta manera, el añadir aminoácidos hidrofóbicos en el término N- o C- de la proteína de erizo, en un bucle de superficie, o alguna combinación de posiciones se puede esperar que den una forma más activa de la proteína. El aminoácido substituido no necesita ser uno de los 20 aminoácidos comunes. Se han reportados métodos para substituir aminoácidos no naturales en sitios específicos en proteínas (78, 79) y esto podría ser ventajoso si el aminoácido fuera más hidrofóbico en carácter, resistente al ataque proteolítico, o pudiera ser utilizado para dirigir adicionalmente la proteína de erizo a un sitio particular in vivo que podría hacer que su actividad fuera más potente o específica. Se pueden incorporar aminoácidos no naturales en sitios específicos en proteínas durante la traducción in vitro, el progreso siendo reportado para crear sistemas in vivo que permitirán la producción a escala mayor de dichas proteínas modificadas. Es inesperado que una proteína, tal como una proteína de erizo, modificada de acuerdo con la invención, pueda retener su actividad biológica. En primer lugar, la cisteína N-terminal es conservada en todas las secuencias de proteína de erizo conocidas incluyendo peces, ranas, insectos, pájaros y mamíferos. Por lo tanto, es razonable aceptar que el sulfhidrilo libre de la cisteína N-terminal es importante a la estructura o actividad de la proteína. En segundo lugar, las proteínas de erizo que carecen de una cisteína N-terminal, debido a la escisión proteolítica o mutación a aminoácidos hidrofílicos (por ejemplo, ácido aspártico o histidina) son inactivas en un ensayo de C3H10T1/2 basado en células, tal como se describe en el Ejemplo 3. Existen muchas modificaciones de la cisteína N-terminal, las cuales protegen el tiol y anexan una porción hidrofóbica. Estas modificaciones se discuten con mayor detalle más adelante. Un experto en la técnica es capaz de determinar que modificación es la más apropiada para un uso particular terapéutico. Los factores que afectan dicha determinación incluyen el costo y facilidad de producción, purificación y formulación, solubilidad, estabilidad, potencia, farmacodinámica y cinética, seguridad, inmunogeneicidad, y objetivo de tejido.

A. Modificaciones Químicas de la Secuencia de Aminoácido Primaria La modificación química de la cisteína N-terminal para proteger el tiol, con la activación concomitante a través de una porción hidrofóbica puede realizarse en numerosas formas a través de algún experto en la técnica. La porción de sulfhidrilo, con el ion de tiolato como la especia activa, es el grupo funcional más reactivo en una proteína. Existen muchos reactivos que reaccionan más rápido con el tiol que cualquier otro grupo. Ver, Chemistrv of Protein Conjugation and Cross-Linking (S. S. Wong, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991). El tiol de una cisteína N-terminal, tal como se encuentra en todas las proteínas de erizo, se puede esperar que sea más reactivo que las cisteínas internas dentro de la secuencia. Esto se debe a la estrecha cercanía a la a-amina que reducirá el valor de pKa del tiol dando como resultado un grado mayor de disociación de protones al ion de tiolato reactivo a un pH neutro o ácido. Además, la cisteína en el termino N de la estructura es más probable que sea expuesta que las otras dos cisteínas en la secuencia de erizo que se encuentran enterradas en la estructura de proteína. Se ha demostrado que la cisteína N-terminal solamente es el único aminoácido modificado después de una reacción de 1 hora con n-etil maleimida a un pH de 5.5 (ver Ejemplo 9), y después de una reacción de 18 horas con n-¡sopropil yodo acetamida a un pH de 7.0 (ver Ejemplo 9). Otros ejemplos de dichos métodos podrían ser la reacción con otros compuestos a-haloacetilo, organomercurios, reactivos de disulfuro y otras maleimidas N-substituidas. Numerosos derivados hidrofóbicos de estas especies activas están comercialmente disponibles (por ejemplo, yodoacetato de etilo (Aldrich, Milwaukee Wl), disulfuro de fenilo (Aldrich), y N-pirenmaleimida (Molecular Probes, Eugene, OR)) o pueden ser sintetizados fácilmente (por ejemplo, N-alquilyodoacetamidas (84), N-alquilmaleimidas (85), y organomercurios (86)). Se ha mostrado que la cisteína N-terminal de proteína de erizo Sonic humana puede ser específicamente modificada con N-isopropilyodoacetamida y que la proteína hidrofóbicamente modificada es dos veces más potente en el ensayo de C3H10T1/2 que la proteína no modificada (ver Ejemplo 9). Se espera que la modificación de Shh con un derivado de yodoacetamido de alquilo de cadena larga dará como resultado una proteína modificada con un mejoramiento aún mayor en potencia. Dichas N-alquilyodoacetamidas pueden ser sintetizadas fácilmente por aquellos expertos en la técnica, utilizando materiales de partida comercialmente disponibles. Otro aspecto de la reactividad de la cisteína N-terminal es que puede tomar parte en la química de reacción única a su configuración 1 ,2-aminotiol. Un ejemplo es la reacción con grupos tioéster para formar un grupo amina N-terminal a través de un rápido desplazamiento del tioéster de S a N. Esta química de reacción puede acoplar conjuntamente péptidos sintéticos y puede ser utilizada para agregar aminoácidos individuales o múltiples, naturales o no naturales, u otros grupos hidrofóbicos a través del péptido apropiadamente activado. Otro ejemplo, demostrado aquí, es la reacción con aldehidos para formar el aducto de tiazolidina. Numerosos derivados hidrofóbicos de esteres tiólicos (por ejemplo, esteres de coenzima A de acilo graso saturados o insaturados de C2-C24 (Sigma Chemical Co., St. Louis MO)), aldehidos (por ejemplo, butaraldehído, n-decilaldehído y n-miristilaldehído (Aldrich)) y cetonas (por ejemplo, 2-, 3- y 4-decanona (Aldrich)) está comercialmente disponibles o pueden ser sintetizados fácilmente (87, 88). En una forma similar, los derivados de tiomorfolina ¡lustrados por la química de 1 -bromo-2-butanona descrita en el Ejemplo 9, pueden ser preparados a partir de una variedad de materiales de partida de a-halocetona (88). Debido a la facilidad de encontrar rutas alternativas para modificar el tiol de la cisteína N-terminal o cualquier cisteína en una proteína, no se desea que esté ligado por los ejemplos específicos aquí demostrados. La a-amina de una proteína puede ser modificada preferencialmente con relación a otras aminas en una proteína ya que su bajo valor de pKa da como resultado cantidades superiores de la forma no protonada reactiva a un pH neutro o ácido. Se ha demostrado que la modificación de la amina N-terminal con un grupo amida grasa de cadena larga, mientras mantiene un grupo tiol de cisteína libre, activa la proteína de erizo tanto como dos órdenes de magnitud (ver Ejemplo 8). Por lo tanto, las químicas que pueden ser dirigidas para reaccionar preferencialmente con la amina N-terminal puede esperarse que sean el uso para incrementar la potencia de las proteínas de erizo. Los halogenuros de arilo, aldehidos y cetonas, anhídridos de ácido, isocianatos, isotiocianatos, imidoésteres, halogenuros de ácido, n-hidroxisuccinimidilo (por ejemplo, acetato de sulfo-NHS), esteres nitrofenílicos, acrilimidazoles y otros esteres activados, se encuentran entre aquellos conocidos para que reaccionen con funciones amina. El reemplazo con la cisteína N-terminal de la proteína de erizo con ciertos otros aminoácidos, otros métodos químicos pueden ser utilizados para agregar una porción hidrofóbica al término N. Un ejemplo es colocar una cerina o treonina en el término N, oxidar este aminoácido para formar un aldehido y después conjugar la proteína con una porción química conteniendo una estructura 1 ,2-aminotiol (por ejemplo, una cisteína). Un segundo ejemplo podría colocar una histidina en el término N para acoplarse a un ácido tiocarboxílico C-terminal.

Modificación guímica de otros aminoácidos. Existen métodos químicos específicos para la modificación de muchos otros aminoácidos. Por lo tanto, otra ruta para sintetizar una forma más activa de proteína de erizo podría ser unir químicamente una porción hidrofóbica a un aminoácido en la proteína de erizo distinta a la cisteína N-terminal. Si un aminoácido apropiado no está disponible en la posición deseada, la mutagénesis dirigida al sitio puede se utilizada para colocar el aminoácido reactivo en ese sitio en la estructura de erizo, si en el término N- o C- o en otra posición. Los aminoácidos reactivos pueden incluir cisteína, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, cerina, treonina, tirosina, arginina, metionina y triptofano. De esta manera, el objetivo de crear una f horma más hidrofóbica de la proteína de erizo puede lograrse a través de muchos medios químicos y no se pretende que este restringido por ninguna química particular o sitio de modificación, ya que estos resultados apoyan la generalidad de este aspecto. El polipéptido de erizo puede ser enlazado a la porción de erizo en un número de formas incluyendo medios de acoplamiento químicos, o diseño por ingeniería genética. Para ilustrar, existe un gran número de agentes de entrelazamiento químicos que son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Para la presente invención, los agentes de entrelazamiento preferidos son entrelazadores heterofuncionales, los cuales pueden ser utilizados para enlazar el polipéptido de erizo y la porción hidrofóbica en una forma escalonada. Los entrelazadores heterobifuncionales proporcionan la habilidad para diseñar más métodos de acoplamiento específico para conjugarse a proteínas, reduciendo así las ocurrencias de reacciones laterales no deseadas, tales como polímeros de homoproteína. Una amplia variedad de entrelazadores heterobifuncionales se muestra en la técnica. Estos incluyen 4-(n-maleimidometil)ciclohexan-1 -carboxilato de succinimidilo (SMCC), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); (4-yodoacetil) aminobenzoato de n-succinimidilo (SIAB), 4-(p-maleimidofenil)-butirato de succinimidilo (SMBP), clorhidrato de 1 -etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC); 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT), 3-(2-piridilditio) propionato de N-succinimidilo (SPDP), 6-[3-(2-piridilditio)propionato] hexanoato de succinimidilo (LC-SPDP). Aquellos agentes de entrelazamiento que tiene porciones N-hidroxisuccinimida pueden ser obtenidos como los análogos de N-hidroxisulfosuccinimida, los cuales generalmente tienen una solubilidad en el agua mayor. Además, aquellos agentes entrelazadores que tiene puentes de disulfuro dentro de la cadena de enlace pueden ser sintetizados más bien como los derivados de alquilo con el fin de reducir la cantidad de escisión del eslabonador in vivo. Además de los entrelazadores heterobifuncionales, existe un número de otros agentes 'de entrelazamiento incluyendo entrelazadores homobifuncionales y foto-reactivos. El suberato de disuccinimidilo (DSS), bismaleimidohexano (BMH) y 2-clorhidrato de dimetilpimelimidato (DMP) son ejemplos de agentes de entrelazamiento homobifuncionales, y disulfuro de bis[ß-(4-azidosalicilamido)etilo] (BASED) y N-succinimidil-6(4'-azido-2'-nitrofenil-amino)hexanoato (SANPAH) son ejemplos de entrelazadores foto-reactivos útiles para utilizarse en esta invención.

Para una revisión reciente de las técnicas de acoplamiento de proteína, ver Means y otros, (1990) Bioconjugate Chemistry 1:2-12, incorporada aquí por referencia. Una clase particularmente útil de entrelazadores heterobifuncionales, incluidos anteriormente, contienen el grupo reactivo amina primaria, N-hidroxisuccinimida, (NHS), o su análogo soluble en agua N-hidroxisulfoxisuccinimida (sulfo-NHS). Las aminas primarias (grupos epsilon de lisina) a valores de pH alcalino son no protonados y reaccionan a través de ataque nucleofílico sobre NHS o esteres de sulfo-NHS. Esta reacción da como resultado la formación de un. enlace amida, y la liberación de NHS o sulfo-NHS como un subproducto. Otro grupo reactivo útil como parte de un entrelazador heterobifuncional es un grupo reactivo tiol. Los grupos reactivos de tiol comunes incluyen maleimidas, halógenos y disulfuros de piridilo. Las maleimidas reaccionan específicamente con su If h idrilos libres (residuos de cisteína) en minutos, bajo condiciones ligeramente acidas a neutras (pH 6.5-7.5). Los halógenos (funciones de yodo acetilo) reaccionan con grupos -SH a un valor de pH fisiológico. Ambos grupos reactivos dan como resultado la formación de enlaces de tioéter estable. El tercer componente de entrelazador heterobifuncional es el brazo o puente separador. El puente es la estructura que conecta los dos extremos reactivos. El atributo más aparente del puente es su efecto sobre impedimento estérico. En algunos casos, un puente más largo más fácilmente puede expandir más la distancia necesaria para enlazar dos bíomoléculas de complejo. Por ejemplo, SMPB tienen una expansión de 14.5 angstroms. La preparación de conjugados de proteína utilizando reactivos heterobifuncionales es un proceso de dos pasos que implica la reacción de amina y la reacción de sulfhídrilo. Para el primer paso, la reacción de amina, la proteína seleccionada debe contener una amina primaria. Esta puede ser amina de lisina-epsilon o una alfa amina primaria encontrada en el término N en la mayoría de las proteínas. La proteína no debe contener grupos sulfhidrilo libre. En casos en donde ambas proteínas que van a ser conjugadas contengan grupos sulfhidrilo libre, una proteína puede ser modificada de manera que todos los sulf h id ri los queden bloqueados utilizando, por ejemplo, N-etilmaleimida (ver, Partís y otros, (1983) J. Pro. Chem. 2:263, incorporada aquí por referencia). El reactivo de Ellman puede ser utilizado para calcular la cantidad de su If h idrilos en una proteína particular (ver por ejemplo, Ellman y otros (1958) Arch. Biochem. Biophys. 74:443 y Riddles y otros (1979) Anal. Biochem. 94:75, incorporada aquí por referencia). El regulador de pH de reacción debe estar libre de aminas y sulfhidrilos extraños. El pH del regulador de pH de reacción debe ser de 7.0-7.5. Esta escala de pH evita que grupos maleimida reaccionen con aminas, conservando el grupo maleimida para la segunda reacción con sufhidrilos. Los entrelazadores que contienen NHS-éter tienen solubilidad en agua limitada. Deben ser disueltos en una cantidad mínima de solvente orgánico (DMF o DMSO) antes de introducir el entrelazador en la mezcla de reacción. El entrelazador/solvente forma una emulsión que permitirá que ocurra la reacción. Los análogos de sulfo-NHS éster son más solubles en agua, y pueden ser agregados directamente al regulador de pH de reacción. Los reguladores de pH de alta resistencia iónica deben ser evitados, ya que tienden a "salar" los sulfo-NHS esteres. Para evitar la pérdida de reactividad debido a la hidrólisis, el entrelazador es agregado a la mezcla de reacción inmediatamente después de disolver la solución de proteína. Las reacciones pueden ser más eficientes en soluciones de proteínas concentradas. Entre más alcalino es el pH de la mezcla de reacción, más rápida es la velocidad de reacción. La velocidad de hidrólisis de NHS y sulfo-NHS esteres también se incrementará aumentando el valor de pH. Las temperaturas más altas elevarán las velocidades de reacción tanto para hidrólisis como para la acilación.

Una vez que la reacción se completa, la primera proteína ahora está activada, con una porción reactiva sulfhidrilo. La proteína activada puede ser aislada de la mezcla de reacción a través de filtración de gel simple o diálisis. Para realizar el segundo paso del entrelazamiento, la reacción de sulfhidrilo, el grupo lipofílico seleccionado para la reacción con maleimidas, halógenos activados o disulfuros de piridilo debe contener un sulfhidrilo libre. Alternativamente, una amina primaria puede ser modificada agregando un sulfhidrilo. En todos los casos, el regulador de pH debe ser desgasificado para evitar la oxidación de los grupos sulfhidrilo. Se puede agregar EDTA para quelatar cualquier metal de oxidación que pueda estar presente en el regulador de pH. Los reguladores de pH deben estar libres de cualquier compuesto que contenga sulfhidrilo. Las maleimidas reaccionan específicamente con grupos-SH a escalas de pH ligeramente ácido a neutro (6.5-7.5). Un pH neutro es suficiente para las reacciones que implican halógenos y disulfuros de piridilo. Bajo estas condiciones, las maleimidas generalmente reaccionan con grupos-SH en cuestión de minutos. Se requieren tiempos de reacción más largos para halógenos y disulfuros de piridilo. La primera proteína reactiva a sulfhidrilo preparada en el paso de reacción de amina es mezclada con el grupo lipofílico que contiene sulfhidrilo bajo las condiciones apropiadas de regulador de pH. Los conjugados pueden ser aislados de la mezcla de reacción a través de métodos tales como filtración de gel o a través de diálisis.

Las porciones lipofílicas activadas ilustrativas para la conjugación incluyen: N-(1-piren)maleimida, 2,5-dimetoxiestilben-4'-maleimida, eosin-5-maleimida; fluorescein-5-maleimida, N-(4-(6-dimetilamino-2-benzofuranil)fenil)maleimida; benzofenon-4-maleimida; 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-maleimida (DABMI), tetrametilrodamin-5-maleimida, tetrametilrodamin-6-maleimida, Rhodamina Rojo TM C2 maleimida; N-(5-aminopentil)maleimida, sal de ácido trifluoroacético, N-(2-am¡noetil)maleimida, sal de ácido trifluoroacético, Oregon Green TM 488 maleimida, N-(2-((2-(((4-azido-2, 3, 5, 6-tetraf luoro) benzoil)amino)eti I )ditio)et i I) maleimida (TFPAM-SS1), 2-(1-(3-dimetilaminopropil)-indol-3-il)-3-(indol-3-il)-maleimida (bisindolilmaleimida; GF 109203X), BODIPY® FL N-(2-aminometil)maleimida, N-(7-d¡metilam¡no-4-metilcoutnarin-3-il)maleimida (DACM), AlexaTM 488 C5 maleimida, AlexaTM 594 C5 maleimida, sal de sodio de N-(1 -piren)maleimida, 2,5-dimetoxietilben-4'-meleimida, eosin-5-maleimida, fluorescein-5-maleimida, N-(4-(6-dimetilamino-2-benzofuranil)fenil)maleimida, benzo fe nona-4-maleimida, 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-maleimida, metansulfonato de 1-(2-maleimidiletil)-4-(5-(4-metoxifenil)oxazol-2-il)piridinio, tetrametilrhodamina-5-maleimida, tetrametilrhodamina-6-maleimida, Rhodamine Rojo TM C2 maleimida, N-(5-aminopentil)maleimida, N-(2-aminoetil)maleimida, N-(2-((-(((4-azido-2,3,5,6-tetrafluoro)benzoil)amino)etil)ditio)etil)maleimida, 2-(1-(3-dimetilaminopropil)-indol-3-il)-3-(indol-3-il)maleimida, N-(7-dimetilamino-4-metilcoumarin-3-il)maleimida (DACM), 11H-benzo[a]fluoreno, Benzo[a]pireno. En una modalidad, el polipéptido de erizo pude ser derivatizado utilizando piren maleimida la cual puede ser comprada en Molecular Probes (Eugene, Oreg.), por ejemplo N-(1 -piren)maleimida o yodoacetato de 1 -pirenmetilo (éster de PMIA). Como se ilustra en la Figura 1, la proteína de erizo derivada de pireno tiene un perfil de actividad indicando que está absolutamente a dos ordenes de magnitud más activa que la forma no modificada de la proteína.

B. Fabricación de Derivados de Péptido Hidrofóbico. De acuerdo con la invención, la proteína también puede ser modificada utilizando un péptido hidrofóbico, como se utiliza en la presente, el término "péptido" incluye una secuencia de por lo menos un residuo de aminoácido. Preferiblemente, el péptido tiene una longitud entre un aminoácido y 18-26 aminoácidos, estos últimos siendo la longitud típica de un segmento de expansión de membrana de una proteína. Para crear un péptido con carácter hidrofóbico, los aminoácidos son seleccionados predominantemente de los siguientes aminoácidos hidrofóbicos: fenilalanina, isoleucina, leucina, valina, metionina, triptofano, alanina, prolina y tirosina. El péptido hidrofóbico también puede contener análogos de aminoácido no natural con carácter hidrofóbico o D-aminoácidos, enlaces peptoides, acetilación N-terminal u otros aspectos que reducen la susceptibilidad del péptido a la proteólisis. Son conocidos los métodos para substituir aminoácidos no naturales en sitios específicos en proteínas (78, 79). Generalmente, un péptido hidrofóbico es anexado a varios sitios sobre una proteína. Un sitio puede ser el residuo N-terminal. Alternativamente, el péptido hidrofóbico es substituido en lugar del residuo N-terminal. En otra modalidad, un péptido hidrofóbico se anexa al término C de la proteína. Alternativamente, el péptido hidrofóbico es substituido en lugar del residuo C-terminal. El término C puede ser el aminoácido C-terminal nativo, pero también puede ser el término C de una proteína truncada de manera que el péptido hidrofóbico se anexa al aminoácido C-terminal final de la forma truncada, que se sigue denominando como el "término C". Una proteína de erizo truncada retendrá la actividad cuando hasta 11 aminoácidos se eliminen de la secuencia C-terminal nativa. El péptido hidrofóbico también puede ser insertado entre el residuo N-terminal y el residuo interno inmediatamente adyacente al residuo N-terminal, o entre el residuo C-terminal y el residuo inmediatamente adyacente al residuo C-terminal, o entre dos residuos internos. En ciertas modalidades, la porción lipofílica es un polipéptido anfipático, tal como magainina, cecropina, atacina, melitina, gramicidina S, alfa toxina de Staph. aureus, alameticina o un polipéptido anfipático sintético. Las proteínas de revestimiento fusogénicas de partículas virales también pueden ser una fuente conveniente de secuencias anfipáticas para las proteínas de erizo de la presente.

C. Fabricación de Derivados de Lípido. Otra forma de proteína abarcada por la invención es una proteína derivatizada con una variedad de porciones de lípido. Generalmente, un "lípido" es un miembro de una clase heterogénea de substancias hidrofóbicas caracterizadas por una solubilidad variable en solventes orgánicos e insolubilidad, en su mayor parte, en agua. Las clases principales de lípidos que son abarcadas dentro de esta invención son ácidos grasos y esteróles (por ejemplo, colesterol). Las porciones derivatizadas de la invención contienen ácidos grasos, los cuales son ácidos monocarboxílicos cíclicos, acíclicos (es decir, de cadena recta), saturados o insaturados. Los ácidos grasos saturados ilustrativos tienen la fórmula genérica: CH3 (CH2)n COOH. El siguiente cuadro lista ejemplos de algunos aminoácidos que pueden ser derivatizados convenientemente utilizando métodos químicos convencionales.

CUADRO 2 Ácidos Grasos Saturados e Insaturados Ilustrativos Ácidos Saturados: CH3(CH2)nCOOH Valor de n Nombre Común 2 ácido butírico 4 ácido caproico 6 ácido caprílico 8 ácido cáprico 10 ácido lau rí I ico 12 ácido mirístico* 14 ácido palmítico* 16 ácido esteárico* 18 ácido araquídico* 20 ácido behénico 22 ácido lignocérico Ácidos Insaturados: CH3CH = CHCOOH ácido crotónico CH3(CH2)3CH = CH(CH2)7COOH ácido miristoleico* CH3(CH2)5CH = CH(CH2)7COOH ácido palmitoleico* CH3(CH2)7CH = CH(CH2)7COOH ácido oleico* CH3(CH2)3(CH2CH = CH)2(CH2)7COOH ácido linoléico CH3(CH2CH = CH)3(CH2)7COOH ácido linolénico CH3(CH2)3(CH2CH = CH)4(CH2)3COOH ácido araquidónico El asterisco (*) denota los ácidos grasos que se encuentran en la proteína de erizo recombinante decretada de una construcción soluble. Otros lípidos que pueden ser unidos ala proteína incluyen ácidos grados de cadena ramificada y aquellos del grupo de fosfolípido tales como los fosfatidinilinositoles (es decir, 4-monofosfato de fosf atid i I i nositol y 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol), fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina e isoprenoides tales como grupos farnesilo o geranilo. Se ha demostrado que las proteínas de erizo modificadas con lípidos pueden ser purificadas ya sea de una fuente natural, o pueden ser obtenidas modificando químicamente la proteína soluble, no modificada. Para la proteína purificada a través de una fuente natural, se ha mostrado que cuando la proteína de erizo Sonic humana de longitud completa (Shh) se expresa en células de insecto y Shh unida a membrana purificada de las células tratadas con detergente utilizando una combinación de cromatografía de SP- Sepharose y cromatografía de inmunoafinidad, esa proteína purificada emigra en geles SDS-PAGE de reducción como una banda aguda individual con una masa aparente de 20 kDa (ver Ejemplo 1). Las proteínas de Shh solubles y unidas a membrana son fácilmente distinguibles a través de HPLC de fase inversa, en donde las formas unidas se eluyen después en el gradiente de acetonitrilo (ver Ejemplo 1 y Figura 3). Después, se demostró que la proteína de erizo Sonic humana está unida a células de membrana en dos formas, una forma que contiene un colesterol y, por lo tanto, es análoga a los datos reportados previamente para la proteína de erizo Drosophila (18), y una segunda forma novedosa que contiene tanto un colesterol como una modificación de ácido palmítico. Las formas solubles y unidas de Shh fueron analizadas a través de espectroscopia de masa de electroaspersión utilizando un espectrómetro de masa de 4 polos, triple, equipado con una fuente de iones de electroaspersión (Ejemplo 1) así como a través de espectrometría de masa de cromatografía líquida (Ver Ejemplo 1). La identidad del péptido N-terminal de Shh unido digerido con endoproteinasa Lys-C se confirmó a través de una medición espectrométrica de masa MALDI PSD en un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo MALDI. El sitio de palmitoilación fue identificado a través de una combinación de análisis de mapeo y secuencian de péptido y está en el término N de la proteína (residuo 1 de la secuencia de la proteína madura en SEC ID NOS: 1-4). Ambas formas unidas fueron igualmente tan activas en el ensayo de fosfatasa alcalina de C310T1/2, pero de manera interesante ambas fueron aproximadamente 30 veces más potentes que Shh humano soluble carente de un?ón(es) Las modificaciones de lípido no afectaron significativamente la afinidad de unión aparente de Shh para su receptor, patched (Figura 7) Después se probó la utilidad de las formas depvatizadas analizando las potencias relativas del Shh soluble y unido sólo en presencia de Mab 5E1 de neutralización anti-epzo en células C3H10T1/2 midiendo la inducción de fosfatasa alcalina Además, la potencia relativa de Shh soluble y unido para la unión a patched se analizó en células EBNA-293 transfectadas con patched a través del análisis de FACS (Ejemplo 3) Para la proteína de erizo modificada con lípido obtenida modificando químicamente la proteína soluble, no modificada, se mostró que el ácido palmítico y otros lípidos pueden ser agregados al Shh soluble para crear formas modificadas con un lípido con una potencia incrementada en el ensayo de C3H10T1/2 (Ejemplo 8) Se ha mostrado que (Ejemplos 1, 2 y 8) el tiol y a-amina en la cisteína N-terminal contribuyen a la reacción de depvatización de lípido Sin desear que esté unido a ninguna teoría particular, la modificación de lípido sobre proteínas empieza con la formación de un intermediario de tioéster y la porción de lípido después es transferida a la a-amina del término N a través de la formación de un intermediario cíclico En general, por lo tanto, la porción de lípido reactiva puede estar en la forma de tioésteres de ácidos carboxíhcos saturados o insaturados tales como tioésteres de coenzimas A Dichos materiales y sus derivados pueden incluir, por ejemplo, derivados de coenzima A comercialmente disponible tales como coenzima A de palmitoleolilo, coenzima A de araquidoilo, coenzima A de araquidonoilo, coenzima A de lauroilo y similares. Estos materiales están fácilmente disponibles de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO., 1998 catálogo pág. 303-306). El efecto de diferentes porciones de lípido en la actividad funcional de la proteína de erizo ha sido analizado (ver Ejemplo 8 y Figuras 10 y 11). Similarmente, el efecto de diferentes porciones de lípido sobre la actividad funcional de otras proteínas, tales como aquellas descritas anteriormente en la Sección lll puede ser convenientemente probado utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la prueba funcional de gelsolina (59), varios interferones (interferon-a-interferon-ß y interferon-?) las varias interleucinas (por ejemplo, IL-1, -2, -3, -4, y similares), los factores, los factores a y ß de necrosis tumoral, y otros factores de crecimiento que son modificados con un lípido de acuerdo con la invención, pueden lograrse utilizando métodos bien conocidos. Aunque se han establecidos medios químicos a través de los cuales un ácido graso puede ser unido a la cisteína N-terminal de las proteínas de erizo, se puede esperar que los lípidos puedan ser anexados a los mismos sitios o a otros sitios utilizando reacciones enzimáticamente catalizadas. La palmitoilación de proteínas in vivo es catalizada por una clase de enzimas conocidas como palmitoil- CoA: proteína S-palmitoiltransferasas. Utilizando enzimas purificadas, se ha demostrado la acilación in vitro de substratos de proteína (80, 81). Los caracteres específicos del substrato de las enzimas de palmitoiltransferasa no están bien definidos; un análisis de sitios de palmitoilación de proteínas celulares y virales encuentra una pequeña forma de una secuencia de consenso circundando el residuo de cisteína modificado, pero sugiere la presencia común de un residuo de lisina o arginina dentro de dos aminoácidos de la cisteína, y aminoácidos hidrofóbicos grandes cerca de la cisteína. La secuencia amino-terminal de Shh, CGPGRGFG, puede ajustar esta secuencia de consenso y servir como un sitio de reconocimiento para la palmitoilación. Como una alternativa, la miristoilación del término amino de proteínas de erizo puede ser realizado una N-miristoiltransferasa (NMT), un número de la cual ha sido bien caracterizado tanto en mamíferos (82) como en levadura (83). Un sitio de reconocimiento para la N-miristoiltransferasa puede ser diseñado por ingeniería en la secuencia N-terminal de erizo para facilitar el reconocimiento por la enzima. Ambas estrategias podrían requerir del uso de los derivados de acilo graso-coenzima A como substratos, como se utiliza para la acilación grasa no enzimática de la proteína de erizo Sonic humana descrita en el Ejemplo 8. Alternativamente, una proteína con una secuencia de reconocimiento diseñada por ingeniería puede ser miristoilada durante la expresión en una línea de célula adecuada. Otro método para modificar una proteína tal como una proteína de erizo con una porción hidrofóbica es crear un sitio de reconocimiento para la adición de un grupo isoprenoide en el término C de la proteína. El sitio de reconocimiento para la adición de farnesilo y geranilo-geranilo es conocido y la proteína puede ser modificada durante la expresión en la célula eucariótica ((Gelb y otros, Cur. Opin. Chem. Biol. 2: 40-48 (1998)).

VI. Complejos de Proteína Multimérica Las proteínas hidrofóbicamente modificadas aquí descritas son particularmente manejables para hacerse como complejos de proteína multimérica. Los complejos de proteína multimérica de la invención incluyen proteínas, opcionalmente anexadas a través de su porción hidrofóbica (lípido) a una vesícula. La vesícula puede ser una membrana biológica de existencia natural, purificada de un material natural, o la vesícula puede ser una construcción sintética. Las vesículas preferidas son estructuras substancialmente esféricas hechas de anfifilos, agentes tensoactivos o fosfolípidos. Los lípidos de estas vesículas esféricas son generalmente organizados en la forma de lípidos teniendo una o más capas estructurales, por ejemplo, vesículas multilaminares (corazas de tipo cebolla múltiples de bicapas de lípido que abarcan un volumen acuoso entre las bicapas) o micelas. En particular, los liposomas son vesículas pequeñas, esféricas compuestas principalmente de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y componentes lipofílicos secundarios. Estos componentes normalmente están dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípido de las membranas biológicas. Típicamente, el extremo polar de un lípido componente o molécula de tipo lípido está en contacto con la solución circundante, usualmente una solución acuosa, mientras que el extremo hidrofóbico, no polar del lípido o molécula de tipo lípido está en contacto con el extremo hidrofóbico, no polar de otro lípido o molécula de tipo lípido. La membrana de bicapa resultante (es decir, vesícula) es selectivamente permeable a moléculas de cierto tamaño, carácter hidrofóbico, forma y carga neta. La mayoría de las vesículas son lípidos o de tipo lípido por naturaleza, aunque existen formulaciones de bicapa de liposoma alternativas, comprendiendo un agente tensoactivo ya sea con un lípido o un colesterol. Las vesículas de liposoma pueden ser particularmente preferidas ya que encuentran muchas aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, industriales y comerciales. Se utilizan para suministrar moléculas, las cuales no son fácilmente solubles en agua, o cuando se desea una liberación de tiempo dirigido. Debido a su permeabilidad selectiva a muchos compuestos químicos, los liposomas son útiles como vehículos de suministro para fármacos y materiales biológicos. De esta manera, las proteínas derivatizadas por lípido tales como la proteína de erizo, pueden hacerse multiméricas siendo incorporadas en la bicapa de lípido o vesículas de liposoma. Después de llegar al sitio objetivo, los liposomas pueden ser degradados (por ejemplo, a través de enzimas en el tracto gastrointestinal) o pueden fusionarse con las membranas de células. Varios métodos para preparar vesículas tales como liposomas, son conocidos. Es bien conocida la producción de vesículas de fosfolípido (53). Para una revisión general de los métodos comúnmente utilizados, ver (54). Entre los más comunes de estos se encuentra (1) aplicación de sonido a una solución conteniendo lípidos algunas veces seguido por evaporación/lofilización y rehidratación (ver por ejemplo Stryer, Biochemistry, pág. 290-291, Freeman & Co., New York, (1988), y (55); (2) homogeneización de una solución de lípido, algunas veces a alta presión o a alto esfuerzo cortante (ver por ejemplo patente de E.U.A. No. 4,743,449 expedida el 10 de mayo de 1988 y patente de E.U.A. No. 4,753,788 expedida el 28 de junio de 1988), (3) hidratación y algunas veces aplicación de sonido de una película seca de lípidos formadores de vesícula, en donde la película de lípido se prepara a través de la evaporación de una solución de lípidos disueltos en un solvente orgánico (ver, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,452,747 expedida el 5 de junio de 1984, patente de E.U.A. No. 4,895,719 expedida el 23 de enero de 1990, y patente de E.U.A. No. 4,946,787 expedida el 7 de agosto de 1990), (4) liofilización o evaporación e hidratación (ver por ejemplo patente de E.U.A. No. 4, 897,355 expedida el 30 de enero 1990, EP 267,050, publicada el 5 de noviembre de 1988, patente de E.U.A. No. 4,776,981, expedida el 11 de octubre de 1988, EP 172,007 publicado el 19 de febrero de 1986, y solicitud de patente Australiana AU-A- 48713/84, publicada el 24 de abril de 1986), (5) inyección o infusión de solvente de una solución de lípido a un medio acuoso, o viceversa (ver, por ejemplo, (56); patente de E.U.A. No. 4,921,757 expedida el 1°. de mayo de 1990, patente de E.U.A. No. 4,781,871 expedida el 1o. de noviembre de 1988, WO 87/02396 publicada el 24 de marzo de 1988, y patente de E.U.A. No. 4,895,452 expedida el 23 de enero de 1990), (6) secado por aspersión (ver por ejemplo, solicitud de patente Australiana AU-A48713/85, publicada el 24 de abril de 1986, y patente de E.U.A. No. 4,830,858 expedida el 16 de mayo de 1989), (7) filtración (ver por ejemplo, WO 85/01161), (8) evaporación de fase inversa. Ver (57); y (9) combinaciones de los métodos anteriores. Ver por ejemplo (58) y (59). Los lípidos y componentes de tipo lípido adecuados para utilizarse en la preparación de vesículas incluyen fosfolípidos, una mezcla de fosfolípidos, lípidos polares, lípidos neutros, ácidos grasos y sus derivados. Un lípido preferido tiene la característica que cuando se dispersa solo en agua, a una temperatura por arriba de la temperatura de transición del lípido, están en una fase de emulsión de lípido. En ciertas modalidades, el lípido es una cadena alifática individual mayor que aproximadamente 12 carbonos y puede ser ya sea saturada o insaturada, o substituirse en otras formas. Los lípidos adecuados incluyen las formas de éster, alcohol y ácido de los siguientes ácidos grasos: estearato, ácido oleico, ácido linoléico, araquidato, ácido araquidónico y otros ácidos de cadenas alifáticas individuales. Otros candidatos incluyen las formas de éster, alcohol y ácido de los retinóles, en particular, retinol y ácido retinóico. Otros lípidos preferidos incluyen fosfatidilcolina (PC), fosfatidilglicerol (PG) y sus derivados, creados sintéticamente o derivados de una variedad de fuentes naturales. En ciertas modalidades, la vesícula puede ser estabilizada estéricamente a través de la incorporación de glicol polietilénico (PEG), o a través de grupos superiores de PEG de un fosfolípido sintético (PEG conjugado a fosfatidiletanolamina de diestearoilo (DSPE), ver por ejemplo (61)). Los agentes tensoactivos preferidos son aquellos con un buen carácter de miscible tales como Tween™, Tritón™, dodeciisulfato de sodio (SDS), laurilsulf ato de sodio, u octilglicosido de sodio. Los agentes tensoactivos preferidos forman micelas cuando se agregan a una solución acuosa por arriba de la temperatura de transición de fase del agente tensoactivo. Los agentes tensoactivos pueden estar compuestos de una o más cadenas alifáticas. Estas cadenas alifáticas pueden ser saturadas, insaturadas o substituirse en otras formas, tales como a través de etoxilación. Típicamente la cadena alifática contiene más de aproximadamente 12 carbonos. Los agentes tensoactivos adecuados adicionales incluyen los siguientes: lauril-, míristil-, linoleil-, o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil, miristil-, o cetil- betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, o ¡soestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil de sodio, o metil oleil-taurato de disodio; y la serie MONAQUAT (Mona Industries, Inc., Paterson, N. J.). También ver Ejemplo 4. Los esteróles y esteres de esterol preferidos adecuados para utilizarse en la preparación de compuestos de proteína multimérica incluyen colesterol, colestanol, sulfato de colesterol y otros análogos y derivados de colesterol. El hecho de que una vesícula pueda comprender muchos diferentes lípidos y detergentes permite una mayor flexibilidad en el diseño por ingeniería de un complejo de proteína-vesícula unida con propiedades deseadas. Por ejemplo, se pueden producir vesículas que unan un número diferente de proteínas variando la composición de lípido de los materiales de partida para crear vesículas más grandes, o incrementando el porcentaje de los lípidos de fosfatidilinositol en la vesícula.

Vil. Utilidades Generalmente, las proteínas modificadas descritas en la presente son útiles para tratar las mismas condiciones médicas que pueden ser tratadas con las formas no modificadas de las proteínas. Sin embargo, las proteínas hidrofóbicamente modificadas descritas aquí proporcionan varias mejoras importantes sobre las formas no modificadas. Primero, su potencia incrementada permite el tratamiento con cantidades más pequeña de proteína y períodos más cortos. Esto será importante tanto en aplicaciones sistémicas como en CNS. En segundo lugar, el reemplazo de la cisteína N-terminal con un aminoácido químicamente menos reactivo permite una producción más fácil, formulación y almacenamiento de una proteína para uso clínico. En tercer lugar, la farmacodinámica de una proteína será alterada a través de modificación hidrofóbica o esto permitirá que las proteínas sean localizadas cerca del sitio de administración, incrementando así su seguridad, reduciendo al mínimo la exposición sistemática y su efectividad por el incremento de su concentración local. Las proteínas de la invención también son útiles en composiciones de diagnóstico y métodos para detectar sus receptores correspondientes. Como un ejemplo del primer punto, se ha encontrado que la vida media de la proteína de erizo es muy corta después de la aplicación sistémica y que se requieren de múltiples inyecciones para lograr una respuesta robusta a la proteína. La potencia más alta de las formas no modificadas y la posibilidad de formulaciones liposomas proporciona un medio para lograr una respuesta con tratamientos menores. Para aplicaciones en el CNS, la potencia más alta proporciona un medio para suministrar una cantidad adecuada de proteína en los pequeños volúmenes requeridos para la inyección directa en el CNS. La importancia del segundo punto se ilustra por el hecho de que se ha encontrado que la cisteína N-terminal de la proteína de erizo es altamente susceptible a ataque químico, ya sea para formar otros aductos químicos o para oxidativamente dimerizar con otra proteína de erizo. Para evitar esto, se utilizan reguladores de pH y procedimientos especiales durante la purificación, y se utiliza ditiotreitol en la formulación final. Estas precauciones necesitan de una evaluación cuidadosa de los efectos del regulador de pH de formulación en modelos de animal. Como una ejemplo del tercer punto, entre más limitada es la escala sobre la cual una proteína se difunde del sitio de administración, mayor es la concentración local. Esta concentración local superior puede, por lo tanto, permitir respuestas clínicas más específicas durante el tratamiento de trastornos neurológicos después de inyección directa en la región deseada del cerebro o médula espinal. Similarmente, las proteínas modificadas pueden ser administradas localmente al sitio de fracturas de hueso para ayudar a la curación de estas fracturas, en las gónadas para tratar trastornos de fertilidad, intraocularmente para tratar trastornos de los ojos, y por debajo de la piel para tratar condiciones dermatológicas, y para estimular el crecimiento de cabello local. La localización de proteínas hidrofóbicamente modificadas al sitio de administración, por lo tanto, reduce la exposición sistemática posiblemente indeseable a otros tejidos y órganos. Para uso terapéutico, las proteínas hidrofóbicamente modificadas de la invención se colocan en formulaciones isotónicas, estériles, farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente se administran a través de medios estándares bien conocidos en el campo. La formulación preferiblemente es líquida o puede ser polvo liofilizado. Se contempla que una administración terapéutica de, por ejemplo, un complejo de proteína multimérica puede comprender liposomas incorporando las proteínas derivatizadas aquí descritas. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que la administración particular, dosis y aplicaciones clínicas de una proteína hidrofóbicamente modificada de la invención variarán dependiendo de la proteína particular y su actividad biológica. Pero, como un ejemplo de aplicación de la proteína de esta invención en un contexto terapéutico, las proteínas de erizo hidrofóbicamente modificadas, terapéuticas pueden ser administradas a pacientes que padecen de una variedad de condiciones neurológicas. La habilidad de la proteína de erizo para regular diferenciación neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso y también presumiblemente en el estado de adulto indica que la proteína de erizo hidrofóbicamente modificada en forma razonable se puede esperar que facilite el control de neuronas en adultos con respecto al mantenimiento, rendimiento funcional, y envejecimiento de células normales; procesos de reparación y regeneración en células lesionadas; prevención de la degeneración y muerte prematura lo cual resulta de la pérdida de diferenciación en ciertas condiciones patológica. En vista de esto, las composiciones de proteína de erizo hidrofóbicamente modificada de la presente, a través del tratamiento con una infusión local, pueden evitar y/o reducir la severidad de condiciones neurológicas que se derivan de: (i) daño agudo, subagudo o crónico al sistema nervioso, incluyendo daño traumático, daño químico, daño de vasos, y déficit (tales como la isquemia por choque) junto con infecciones y daño inducido por tumor; (ii) envejecimiento del sistema nervioso incluyendo la enfermedad de Alzheimer; (iii) enfermedades neurodegenerativas crónicas del sistema nervioso, incluyendo enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, esclerosis lateral amilotrófica, y similares; y (iv) enfermedades inmunológicas crónicas del sistema nervioso, incluyendo esclerosis múltiple. La proteína hidrofóbicamente modificada también puede ser inyectada en el fluido cerebroespinal, por ejemplo, con el fin de dirigir deficiencias de células del cerebro, o en el sistema linfático o corriente sanguínea, según se requiera para tener como objetivo otros trastornos específicos de sistema de tejido u órgano. Las composiciones de proteína de erizo de la invención pueden ser utilizadas para rescatar, por ejemplo, varias neuronas de muerte inducida por lesión, así como reproyección de guía de estas neuronas después de dicho daño. Este daño puede ser atribuido a condiciones que incluyen pero no se limitan a, infarto por trauma al CNS, infección, enfermedad metabólica, deficiencia nutricional y agentes tóxicos (tales como tratamiento con cisplatina). Ciertas proteínas de erizo ocasionan que las células neoplásticas o hiperplásticas transformadas se vuelvan ya sea post-mitóticas o apoptóticas. Dichas composiciones pueden ser, por lo tanto, para utilizarse en el tratamiento de, por ejemplo, gliomas malignos, meduloblastomas y tumores neuroectodérmicos.

Las proteínas también pueden ser enlazadas a marcadores detectables, tales como substancias fluoroscópica o radiográficamente opacas, y administrarse a un sujeto para permitir la formación de imágenes de los tejidos que expresan receptores de erizo. Las proteínas también pueden ser unidas a substancias, tales como peroxidasa de rábano, las cuales pueden ser utilizadas como cepas inmunocitoquímicas para permitir la visualización de áreas de células positivas de ligando de erizo en secciones histolíticas. Las proteínas hidrofóbicamente modificadas de la invención, ya sean solas o como complejos de proteína multivalente, pueden ser utilizadas para activar específicamente terapias médicas contra cáncer y tumores que expresan el receptor para la proteína. Dichos materiales pueden hacerse más efectivos como terapéuticos para el cáncer utilizándolos como vehículo de suministro para fármacos antineoplásticos, toxinas y radionúclidos citocídicos, tales como itrio 90. Una toxina también puede ser conjugada a proteína de erizo hidrofóbicamente modificada (o sus complejos multivalentes que contienen una vesícula) para activar y aniquilar selectivamente células sensibles a proteína de erizo, tales como un receptor de erizo de expresión de tumor. Otras toxinas son igualmente útiles, como las conocidas por aquellos expertos en la técnica. Dichas toxinas incluyen pero no se limitan a, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Diphtheria, y saporina. Este aspecto debe probar ser útil ya que el receptor(s) de erizo se expresa en un número muy limitados de tejido. Otro aspecto para dichas terapias médicas es utilizar una proteína hidrofóbicamente modificada, marcada con radioisótopo (o sus complejos multivalentes). Dichos compuestos radiomarcados preferencialmente activarán la radioactividad en sitios en células que expresan el receptor(es) de proteína, exceptuando tejidos normales. Dependiendo del radioisótopo empleado, la radiación emitida de una proteína radiomarcada unida a una célula de tumor también puede aniquilar células de tumor malignas cercanas que no expresan el receptor de proteínas. Se puede utilizar una variedad de radionúclidos. El radio-yodo (por ejemplo, 131l) ha sido exitoso cuando se emplea con anticuerpos monoclonales contra CD20 presentes en linfomas de célula B (63). Las composiciones de proteína que serán utilizadas en la terapia serán formuladas y las dosis establecidas en una forma consistente con la práctica médica tomando en cuenta el trastorno que será tratado, la condición del paciente individual, el sitio de suministro del polipéptido asilado, el método de administración y otros factores conocidos por los expertos en la técnica. El terapéutico puede ser preparado para administrarse mezclando una proteína, una vesícula que contiene una proteína, o un complejo derivatizado al grado deseado de pureza con vehículos fisiológicamente aceptables (es decir, vehículos que no son tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones empleadas). Se contempla que el suministro local al sitio será la ruta primaria para la administración terapéutica de las proteínas de esta invención. El suministro intravenoso, el suministro a través de catéter u otra tubería quirúrgica también se contempla. Las rutas alternativas incluyen tabletas y similares, nebulizadores comercialmente disponibles para formulaciones líquidas e inhalación de formulaciones I iof i I izadas o en aerosol. Las formulaciones líquidas pueden ser utilizadas después de la reconstitución a partir de formulaciones en polvo. La dosis administrada dependerá de las propiedades de la vesícula y proteína empleadas por ejemplo, su actividad de unión y vida media de plasma in vivo, la concentración de la vesícula y la proteína en la formulación, la ruta de administración, el sitio y el régimen de dosis, la tolerancia clínica del paciente implicado, la condición patológica que padece el paciente, y similares, como es bien conocido en la técnica. Generalmente, se prefieren dosis de aproximadamente 5 x 10"7 a 5 x 10~9 molares de proteína por paciente por administración, aunque la dosis dependerá de la naturaleza de la proteína. Se pueden utilizar diferentes dosis durante una serie de administraciones secuenciales. La invención también está dirigida a una formulación farmacéutica que incluye una proteína de erizo modificada de acuerdo con la invención en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la formulación también incluye vesículas. Las proteínas de erizo hidrofóbicamente modificadas de la invención también son útiles en métodos de terapia de gen.

Para trastornos neurodegenerativos, están disponibles varios modelos de animal que se cree que tienen algún grado de predicción clínica. Para la enfermedad de Parkinson los modelos implican la protección, o la recuperación en roedores o primates en donde la trayectoria dopaminérgica nigral-estriatal es dañada ya sea por la administración sistémica de MPTP o la administración loca (ntracranial) de 6-hidroxidopamina [6-OHDA], dos toxinas dopaminérgicas selectivas. Los modelos específicos son: modelo de ratón tratado con MPTP (64); modelo de primate tratado con MPTP (tití o Rhesus) (65) y el modelo de rata de lesión por 6-OHDA unilateral (66). Para modelos ALS (esclerosis lateral amiotrófica) implican el tratamiento de varias cepas de ratón que muestran degeneración motora/neurona espontánea, incluyendo los ratones wobbler (67) y pmn (68), y el ratón transgénico que expresa el gen de dismutasa de superoxidasa mutada humana (hSOD) que ha sido enlazada a la familia ALS (69). Para daño de médula espinal, los modelos más comunes implican daño de contusión a ratas, ya sea a través de una caída de peso calibrada, o daño de fluido (hidrodinámico) (70). Para la enfermedad de Huntington, los modelos implican protección de lesión de exitotoxina (NMDA, ácido quinolínico, ácido caínico, ácido 3-nitro-propiónico, APMA) al estrato en ratas (71, 72). Recientemente, un modelo de ratón transgénico sobre-expresando el trinucleótido humano de repetición expandida en el gen huntingtin también se describió (73). Para esclerosis múltiple, EAE en ratones y ratas se indujo a través de inmunización con MBP (proteína básica de mielina), o transferencia pasiva de células T activadas con MBP (74). Para la enfermedad de Alzheimer un modelo de murino relevante es una determinación de protección contra lesión de fimbria-formix en ratas (lesión septal), el haz de nervios principal suministrado la enervación colinérgica del hipocampo (75), así como el uso de ratones transgénicos sobre-expresando el gen beta-amiloide humano. Para neuropatías periféricas, un modelo relevante es protección contra pérdida de conductancia de nervios periféricos ocasionada por agentes quimioterapéuticos tales como taxol, vincristina y cisplatina en ratones y ratas (76). La invención ahora será descrita más completamente haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Proteína de Erizo Sonic Humana es Modificada con Lípido Cuando se Expresa en Células de Insecto A. Expresión de Proteína Erizo Sonic Humana El ADNc para la proteína de erizo Sonic humana de longitud completa (Shh) se proveyó como un fragmento EcoRI de 1.6 kb subclonado en pBluescript SK' (20) (un regalo de David Bumcrot de Ontogeny, Inc., Cambridge MA). Los sitios Notl 5' y 3' inmediatamente flanqueado el marco de lectura abierto de Shh fueron agregados a través de mutagénesis de eliminación de sitio único utilizando un equipo de Pharmacia siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. El fragmento Notl de 1.4 kb llevando el ADNc de Shh de longitud completa después se subclonó en el vector de expresión de insecto pFastBac (Life Technologies, Inc.). Se generó el baculovirus recombinante utilizando los procedimientos suministrados por Life Technologies, Inc.). El virus resultante se utilizó para crear un banco de virus de alta titulación. Los métodos utilizados para la producción y purificación de Shh se describen a continuación. La presencia de Shh asociada a membrana se examinó a través de FACS y a través de análisis de tinción Western. La expresión pico ocurrió 48 horas después de la infección. Para el análisis de tinción Western, los sobrenadantes y lisatos de célula de células infectadas con Shh y no infectadas se sometieron a SDS-PAGE en un gel con un gradiente de 10-20% bajo condiciones de reducción, se transfirieron electroforéticamente a nitrocelulosa, y el la Shh se detectó con un antisuero policlonado de ratón elevado contra un conjugado de hemocianina de limpeto de agujero de péptido de 15-mer de Shh N-terminal. Los lisatos de célula se hicieron incubando las células durante 5 minutos a 25°C en 20 mM Na2HPO4 pH 6.5, 1% Nonidet P-40 y 150 mM NaCI o 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCI, 0.5% Nonidet P-40 y 0.5% de desoxícolato de sodio, y después las partículas se formaron en pellas a 13,000 rpm durante 10 minutos a 4°C en una centrífuga de Eppendorf.

B. Purificación de Proteína de Erizo Sonic Humano de Membrana Unida La forma en unida de membrana de Shh se produjo en células de insecto High Five™ (Invitrogen) utilizando el baculovirus recombinante que codifica Shh de longitud completa discutido anteriormente. Las células de High Five™ se desarrollaron a 28°C en un medio libre de suero sf900 II (Life Technologies, Inc.) en un bio-reactor de 10 litros controlado para oxígeno. Las células fueron infectadas en la última fase de registro a aproximadamente 2 x 106 células/ml con virus a un MOI de 3 y se cosecharon 48 horas después de la infección (la viabilidad de célula en el momento de la cosecha fue de >50%). Las células se recogieron a través de centrifugación y se lavaron en 10 mM Na2HPO4 pH 6.5, 150 mM NaCI pH más 0.5 mM PMSF. La pella de célula resultante (peso húmedo de 150 g se suspendió en 1.2 litros de 10 mM Na2HPO4 pH 6.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM PMSF, 5 µM pepstaina A, 10 µg/ml leupeptina y 2 µg/ml E64, y después se agregaron 120 mL de una solución al 10% de Tritón X-110. Después de una incubación de 30 minutos sobre hielo, las partículas se removieron a través de centrifugación (1500 x g, 10 min). Todos los pasos subsecuentes se realizaron a 4-6°C. el pH del sobrenadante se ajustó a 5.0 con una solución de banco de 0.5 M MES pH 5.0 (50 mM final) y se cargó sobre una columna de flujo rápido de SP-Sepharose de 150 ml (Pharmacia). La columna se lavó con 300 ml de 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM PMSF, 0.1% Nonidet P-40, después con 200 ml de 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 300 mM NaCI, 0.1% Nonidet P-40, y se unió a la proteína de erizo eluída con 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 800 mM NaCI, 0.1% Nonidet P-40. La Shh después se sometió a cromatografía de autoinmunidad en una resina de 5E1 -Sepharose que se preparó conjugando 4 mg de anticuerpo por ml de resina de Sepharose 4B activada con CNBr. La combinación de elusión de SP-Sepharose de diluyó con dos volúmenes de 50 mM HEPES pH 7.5 y se cargó en forma intermitente sobre una resina de 5E1 (1 hora). La resina se recogió en una columna, se lavó con 10 volúmenes de columna de PBS conteniendo 0.1% de Tritón X-100 hidrogenado (Calbiochem), y se eluyó con 25 mM Na2HPO4 pH 3.0, 200 mM NaCI, Tritón X-100 0.1% hidrogenado. Las fracciones de elusión fueron neutralizadas con 0.1 volúmenes de 1M de HEPES, pH 7.5 y se analizaron para el contenido total de proteína a partir de mediciones de absorbancia a 240-340 nm y para pureza a través de SDS-PAGE. Las fracciones se almacenaron a -70°C. Las fracciones pico de 3 pasos de afinidad se combinaron, se diluyeron con 1.3 volúmenes de 50 mM HEPES pH 7.5, Tritón X-100 0.2% hidrogenado y contra cargas intermitentes sobre la resina 5E1. La resina se recogió en una columna, se lavó con 3 volúmenes de PBS, pH 7.2, octilglucósido al 1% (US Biochemical Corp.), y se eluyó con 25 mM Na2HPO4 pH 3.0, 200 mM NaCI, octilglucósido al 1%. Las fracciones de elusión fueron neutralizadas y analizadas como se describió anteriormente, se combinaron, se filtraron a través de un filtro de 0.2 mieras, se formaron alícuotas y se almacenaron a -70°C. Cuando la proteína de erizo Sonic humana de longitud completa (Shh) se expresó en células de insecto High Five™, más del 95% del fragmento N-terminal se detectó a través de tinción Western en una forma que fue asociada a la célula. A través de SDS-PAGE, la proteína purificada emigró como una banda aguda individual con masa aparente con 20 kDa (Figura 1, carril c). La proteína emigró más rápido en aproximadamente 0.5 kDa que una versión soluble de la proteína que ha sido producida en E. coli (Figura 1, carriles b-d), consistente con los datos publicados previamente (19). Similarmente como se describió (19), las proteínas de Shh unidas a membrana y solubles también fueron fácilmente distinguibles a través de HPLC de gas inversa, en donde la forma unida se eluyó después en el gradiente de acetonitrilo. La concentración de acetonitrilo necesaria para la elusión de la forma unida a membrana fue de 60% contra solamente 45% con la forma soluble indicando un incremento significativo en el carácter hidrofóbico de la proteína.

C. Análisis de espectroscopia de Masa de la Proteína de Erizo Sonic Humana Unida de Membrana T. Se sometieron alícuotas de Shh a HPLC de fase inversa en una columna C (Vydac, Cat. No. 214TP104, dimensiones de columna 4.6 mm, diámetro interno x 250 mm) a temperatura ambiente. Los componentes unidos fueron eluídos con un gradiente de 0-80% de acetonitrilo en 30 minutos y 0.1% de ácido trifluoroacético a una velocidad de flujo de 1.4 ml/minuto. El efluente de columna se verificó a 280 nm y se recogieron cada 0.5 minutos. Se secaron alícuotas de 25 µl de fracciones conteniendo proteína, en un concentrador de Speed Vac, se disolvió en regulador de pH de muestra de electroforesis y se analizó a través de SDS-PAGE. Las fracciones conteniendo la proteína de erizo se combinaron, se concentraron 4 veces en un concentrador Speed Vac y el contenido de proteína se analizó a través de absorbancia a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción de 1.33 para una solución de 1 mg/ml de Shh. Las muestras se sometieron a ESI-MS en un espectrómetro de masa de 4 polos triple Micromass Quattro II, equipado con una fuente iónica de electroaspersión. Un volumen de 6 µl de proteína de erizo purificada con HPLC fue infundido directamente en la fuente de iones a una velocidad de 10 µl/minuto utilizando 50% de agua, 50% de acetonitrilo, 0.1% de ácido fórmico como el solvente en la bomba de jeringa. Se adquirieron exploraciones a través de la infusión de muestra. Todos los datos de espectro de masa de electroaspersión fueron adquiridos y almacenados en un modo de perfil y fueron procesados utilizando el sistema de datos Micromass MassLynx. Los péptidos de la digestión de endoproteínasa Lys-C de Shh piridiletilada fueron analizados a través de HPLC de fase inversa en línea con el espectrómetro de masa de 4 polos, triple Micromass Quattro II. La digestión se separó en una columna de Reliasil Cíe utilizando un sistema de analizador de microproteína ultra-rápido Michrom™ a una velocidad de flujo de 50 µl/minuto con un gradiente de acetonitrilo al 5-85%, en 0.05% de ácido trifluoroacético. Las exploraciones fueron adquiridas de m/z 400-2000 a través de la operación y se procesaron como se describió anteriormente. La secuenciación del péptido N-terminal de Shh unido se realizó a través de una medición de decaimiento de fuente posterior (PSD) en un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo (TOF) Voyager-DE™ STR (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA), utilizando ácido a-ciano-4-hidroxicinámico como la matriz (22, 23). Exactamente 0.5 µl de péptido de endoproteínasa Lys-C purificado con HPLC se mezcló con 0.5 µl de matriz sobre la placa objetivo. Para cubrir todo el espectro de iones de fragmento, los voltajes de espejo fueron reducidos de 20 a 1.2 kb en 11 pasos. Los datos de espectroscopia de masa de ionización de electroaspersión para las formas solubles y unida a membrana de Shh mostraron especies primarias con las masas de 19560 y 20167 Da, respectivamente (Figura 2). La masa medida de 19560 Da coincide con la masa predicha para Shh empezando con Cys-1 y terminando con Gly-174 (masa calculada de 19560.01 Da). En contraste, la masa de 20167 Da no estuvo de acuerdo con ninguna predicción disponible ni la diferencia en las masas de las formas unidas y solubles, 607 Da) va a ser representada por alguna modificación conocida o a través de procesamiento proteolítico aberrante. Previamente, Porter y otros (18) demostraron que la proteína de erizo Drosophila contenía una porción de colesterol y de esta manera era posible que la diferencia de masa en el sistema humano se indujera, por lo menos en parte, al componente menor en el espectro de masa de Shh unido a 19796 Da que difiere del pico primario por 371 Da apoyado en esta noción. Una evidencia adicional para el colesterol se obtuvo tratando el Shh unido con álcali moderado bajo condiciones que pueden romper el enlace de colesterol sin romper los enlaces peptídicos (18), y después volver a analizar los productos de reacción a través de espectroscopia de masa (MS). En resumen, la Shh derivada de célula de insecto se trató con 50 mm de KOH, 95% de metanol durante 1 hora a temperatura ambiente y después se analizó a través de ESI-MS o se fue digerida con endoproteinasa Lys-C y sometida a LC (cromatografía líquida)-MS en el espectrómetro de masa de 4 polos, triple Micromass Quattro II. Para las muestras sometidas a LC-MS, las proteínas primero fueron tratadas con 4-vinilpiridina. El tratamiento base desplazó la masa por 387 Da, lo cual es consistente con la pérdida de colesterol más agua (ver Cuadro 3). La masa de Shh soluble no fue afectada por el tratamiento de base. Conjuntamente, estas observaciones sugieren que el Shh humano unido por membrana contuvo dos modificaciones, un colesterol y una segunda porción con una masa de 2036 Da. La similitud es la masa entre este valor y la masa de un grupo palmitoilo agregado (238 Da) sugirió que la proteína puede ser palmitoilada. Más valores exactos de la masa (discutido más adelante) revelaron una correlación de la masa predicha de una porción de palmitoilo.

CUADRO 3 Caracterización de Shh unido a través de MS. Los valores de masa calculados fueron determinados utilizando masad de residuo promedio en la parte a v masas protonadas monoisotópicas en la parte b Proteína Masa (Da) a. Shh tratado con KOH Calculado Medida Sin unión (-tratamiento) 19560.02 19560 Sin unión (+tratamiento) 19560.02 19561 En unión (-tratamiento) 20167.14 20167 En unión ( + tratamiento) 19798.49 19780 b. Péptido Lys-C de endoproteinasa N-terminal (MH*)* Sin unión 983-49 983.50 En unión 1221.72 1221.79 * Todos los valores de masa para péptidos aquí descritos son masas protonadas.

Subsecuentemente, se determinó que Shh unido puede ser fraccionado en subespecies a través de HPLC con un gradiente de elusión modificado y desarrolló un ensayo HPLC simple para cuantificar las varias formas. Los resultados de estos análisis se muestran en la Figura 3. En este ensayo, el Shh no modificado se eluye primero (pico 1), después el Shh modificado con colesterol se eluye (pico 2), y finalmente, el producto que contiene tanto colesterol como Shh modificado con ácido palmítico se eluye (pico 3). La forma de complejo de pico 3 refleja la presencia de una forma modificada del grupo palmitoilo que se identificó a través de la secuenciación mediante la medición de MALDI PSD. La variante fue 2 Da menor que la pronosticada y, por lo tanto, contiene un enlace insaturado (datos no mostrados).

D. Locaiización de la Modificación por Ácido Palmítico Dentro de la Secuencia de Erizo Sonic Humana. El sitio de palmitoilación dentro de la secuencia humana se identificó utilizando una combinación de mapeo de péptido y análisis de secuencia. La Figura 4B muestra los resultados de un análisis de mapeo de péptido de la proteína soluble con una lectura LC-MS. Los datos de masa representando más del 98% de la secuencia Shh soluble pueden ser representados a partir del análisis. El pico observado con un asterisco corresponde al péptido N-terminal (residuos 1-9 más 4-vinilpiridina, masa observada 983.50 Da, masa calculada 983.49 Da; Cuadro 3). En el análisis correspondiente del producto unido (Figura 4A), este péptido estuvo ausente y más bien se observó un péptido más hidrofóbico con una masa de 1221.79 Da (observado con un asterisco). La porción de 1221.79 Da es consistente con la presencia de una forma modificada del péptido N-terminal, es decir 983.49 Da para el componente de péptido más 238.23 Da. El péptido de 1221.79 Da después se sometió a análisis de secuencia a través de la medición de MALDI PSD. El espectro PSD resultante se muestra en la Figura 5. Los iones que corresponden a b1, b2, b4, b5, b8 + H20, y8, y7, y5, y4, y3, y2 e y1 y fragmentos fueron detectados, los cuales confirmaron la secuencia. Además, los iones b1 y b2 indicaron que el aducto Cys-1 piridiletilado fue palmitoilado. Los iones que solamente contienen Cys-1, contuvieron la masa adicional de 238.23 Da. Ya que la cisteína es un sitio normal de palmitoilación para proteínas in vivo, no fue sorprendente encontrar el aducto novedoso anexado a la cisteína N-terminal. Sin embargo, dos piezas de evidencias sugieren que el lípido se anexó al grupo amino sobre la cisteína y no al tiol. Primero, en el estudio de mapeo de mapeo de péptido, se utilizó 4-vini Ipi ridi na como una etiqueta espectroscópica para verificar los grupos tiol libres (27). La piridiletilación es altamente específica para tioles de cisteína y agrega un aducto de 105 Da que puede ser detectado por MS. Los fragmentos conteniendo Cys-1 observados en el espectro PSD contuvieron modificaciones tanto mediante palmitoilo como piridiletilo implicando la presencia de un grupo tiol libre. En segundo lugar, el Shh unido se sometió a secuenciación de Edman N-terminal, automática, y no se obtuvo ninguna secuencia, sugiriendo el bloqueo en la a-amina N-terminal. En contraste, la forma soluble correspondiente de Shh fue secuenciada fácilmente.

EJEMPLO 2 Proteína de Erizo Sonic Humana puede ser Modificada con Ácido Palmítico en un Sistema Libre de Célula La Shh soluble se marcó con ácido 3H-palmítico en un sistema libre de célula utilizando una versión modificada de un procedimiento publicado (24). Una fracción microsomal cruda de hígado de rata se preparó sometiendo un homogenato de hígado a centrifugación secuencial a 3000 x g durante 10 min, 9000 x g durante 20 min, y 100,000 x g durante 30 min. La pella de 100,000 x g se sometió en 10 mM de HEPES pH 7.4, sacarosa al 10% y otra vez se centrifugó a 100,000 x g durante 20 minutos. La pella final (derivada de 10 g de hígado) se suspendió en 3 mL de 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 10 µg/ml leupeptina, 0.15% Tritón X-100, se formó en alícuotas y se almacenó a -70°C. Las reacciones conteniendo 3 µg Shh, 1 µL de microsomas de rata, 50 ng/ml de coenzima A (Sigma), 0.3 mM ATP, 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 M NaCI, 1 mM EDTA, 10 µg/ml leupeptina, y 0.5 µCi-[9, 10-3H]-ácido palmítico (50 Ci/mmoles; New England Nuclear), se realizaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las reacciones se detuvieron con un regulador de pH de muestra de electroforesis de reducción, sometido a SDS-PAGE en un gel de gradiente al 10-20%, y se visualizaron a través de fluorografía. Como se muestra en la Figura 1 (carril e), la Shh es fácilmente marcada con el rastreador radioactivo. Ninguno se los otros cientos de proteína en la mezcla de reacción fueron marcadas (ver el perfil de gel teñido con azul de Coomassie correspondiente en el carril j), indicando un alto grado de carácter específico de la reacción de palmitoilación. Como una evidencia adicional para el carácter específico de la reacción de palmitoilación, se probaron dos variantes Shh en donde el sitio de palmítoilación había sido eliminado. La Figura 1, (carril f), muestra resultados del análisis de una forma truncada de Shh soluble que careció de los 10 primeros residuos de aminoácido de la secuencia madura y carril g, de una forma mutante de Shh conteniendo, en su extremo N-terminal, una mutación de punto Cys-1 a Ser individual. Ninguna de las variantes fueron marcadas. La importancia de la cisteína N-terminal como el sitio de derivatización de lípido es realzada por el hecho de que el Shh soluble de tipo silvestre fácilmente es marcado, mientras que la cisteína N-terminal a mutante de serina no lo es. La incapacidad de marcar o etiquetar el mutante de serina N-terminal discute contra un mecanismo de reacción simple, en donde la porción de palmitoilo está directamente anexada a la a-amina N-terminal, ya que bajo las condiciones de prueba, la serina debe tener substitución para la cisteína. También se probó el papel del término N libre utilizando una forma de Shh soluble con una extensión de etiqueta de histidina (His) N-terminal. La Shh humana soluble utilizada en estos estudios fue producida inicialmente como una proteína de fusión etiquetada con His con un sitio de escisión de enterocinasa en la unión de la secuencia madura y después se procesó con enterocinasa para remover la etiqueta de His. La Shh etiquetada con His no fue palmitoilada a pesar de la presencia del grupo tiol libre de la cisteína (ver Figura 1, carril i). Aunque no se puede establecer la posibilidad de que la extensión N-terminal estéricamente inhiba la palmitoilación, Cys-1 está en la posición P1' del sitio de escisión de enterocinasa y es fácilmente accesible a procesamiento enzimático. De esta manera, parece que tanto el tiol como la a-amina de Cys-1 contribuyen a la reacción de palmitoilación. Ya que todas las reacciones de palmitoilación conocidas activan las cadenas laterales de residuos Cys, Ser, o Thr, se infiere que la modificación en proteína de erizo empieza con la información de un intermediario tioéster, y que la porción de palmitoilo después es transferida al término N a través de la formación de un intermediario cíclico. Esta hipótesis se confirmó durante los estudios de la modificación de proteína de erizo Sonic humana utilizando la coenzima A de palmitoilo (ver Ejemplo 8).

EJEMPLO 3 Demostración de Potencia Incrementada de Proteína de Erizo Sonic Humana Acetilada en Forma Grasa de Existencia Natural en un Ensavo a Base de Célula (C3H10T1/2) Se trató Shh para función en un ensayo a base de célula midiendo la inducción de fosfatasa alcalina en células C3H10T1/2 (25) en una lectura de 5 días. El análisis se realizó en un formato de 96 cavidades. Las muestras se operaron por duplicado. Para Shh unido (100 µg/ml), las muestras primero fueron diluidas 200 veces con un medio de crecimiento anormal, después se sometieron a diluciones en serie de dos veces por debajo de las placas. Las cavidades se normalizaron para efectos potenciales del octil glucósido agregado incluyendo 0.005% de octilglucósido en el medio de cultivo. Los estudios de bloqueo utilizando mAb 5E1 (26) de murino neutralizante se realizaron mezclando Shh con diluciones en serie del anticuerpo durante 30 minutos a temperatura ambiente en un medio de cultivo antes de agregar las muestras de prueba a las placas. En este ensayo, la Shh humana soluble produce una respuesta dependiente de dosis con una IC50 de 1 µg/ml y una señal máxima a 3 µg/ml (Figura 6A). La Shh humana unida, con un colesterol anexado en el término C y un grupo palmitoilo en el término N, similarmente produjeron una respuesta dependiente de dosis en el ensayo, pero con una IC50 de 0.03 µg/ml y una señal máxima a 0.1 µg/ml, indicando que fue aproximadamente 30 veces tan potente como Shh soluble. Para verificar que la actividad observada fue una proteína de erizo específica, se probó si la actividad puede ser inhibida con mAb 5E1 de neutralización anti-erizo. Tanto el Shh soluble como unido se inhibieron a través del tratamiento de 5E1 (Figura 6B). La inhibición de Shh unido requirió un décimo de 5E1 consistente con su actividad incrementada en el ensayo. La Shh unida se probó en un ensayo de unión de receptor, verificando su habilidad para unir patched, utilizando una versión modificada de un ensayo recientemente publicado (10). La Shh unida mostró unión dependiente de dosis a células que expresan patched con una IC50 aparente de 400 ng/ml (Figura 7). En el mismo ensayo, la Shh soluble se unió a patched con una IC50 aparente de 150 ng/ml, indicando que la forma unida se unió solo ligeramente menos herméticamente al receptor.

EJEMPLO 4 Análisis de Proteína de Erizo Sonic Humana Unida Después de la Reconstitución en Liposomas Este ejemplo ilustra que los requerimientos de reconstitución a liposomas positiva y negativamente cargados a través de dilución de detergente durante una amplia escala de relaciones de lípido: proteína (p/p) de 1:1 a 100:1 no tuvo ningún efecto en la actividad de Shh unido en el ensayo C3H10T1/2. La reconstitución en los liposomas que contienen fosfolípido proporciona una formulación útil para proteína que contienen lípido, ya que permite que una proteína que contiene lípido salga en una fijación normal cercana. Para probar si dicha formulación fue viable para Shh unido, se utilizó un método de dilución detergente para incorporar la proteína a un liposoma (60), en donde los liposomas realizaron se mezclaron con octilglucósido y la proteína de interés, y después el detergente se diluyó por debajo de su concentración crítica de micelas activando así la reconstitución. Aunque cualquier número grande de mezclas puras o de lípido puede ser utilizado, se seleccionaron dos mezclas comercialmente disponibles como modelos; un equipo de liposoma negativamente cargado conteniendo L-a-fosfatidilcolina de huevo, fosfato de dicetilo y colesterol (Cat. No. L-4262; Sigma, St. Louis, MO), y un equipo de liposoma positivamente cargado consistiendo de fosfatidilcolina de huevo, estearilamida y colesterol (Cat. No. L-4137, Sigma). En resumen, los lípidos se transfirieron a un tubo Pyrex, se secaron sobre una corriente de nitrógeno y el solvente residual se removió a través de liofilización. El lípido se suspendió en 10 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCI, octilglucósido al 2.0%, se arremolinó y se le aplicó sonido hasta que la suspensión quedó con una apariencia opalescente. El lípido después se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras. Las alícuotas de la Shh unida de células de insecto High Five™ infectadas con baculovirus, en octilglucósido se trataron con un exceso de 400-1000-5000 y 20000 veces de lípido (p/p) y después de una preincubación de 15 minutos, las muestras fueron diluidas y analizadas para actividad en el ensayo C3H10T1/2.

Ni el tratamiento de liposoma positivo ni el negativo tuvieron ningún efecto en la actividad de la proteína de erizo, indicando que un portador de lípido fue una formulación viable. Para verificar que la proteína de erizo en realidad quedo reconstituida, se sometieron muestras en paralelo a centrifugación bajo condiciones en donde la Shh unida normalmente puede formar pellas y los liposomas pueden flotar en la superficie de la muestra. Bajo estas condiciones, la Shh unida flotó en la superficie, indicando que ocurrió la reconstitución.

EJEMPLO 5 Caracterización de Proteína de Erizo Sonic Humana Unida de Membrana de Células de Mamífero (EBNA-293) Con el fin de analizar si la palmitoilación fue una trayectoria de modificación general para la proteína de erizo Sonic o si fue específica a la producción de célula insecto, la proteína también se produjo en un sistema de mamífero en células EBNA-293. Para la expresión de Shh de longitud completa en células de mamífero, el fragmento Notl de 1.4 kb conteniendo Shh de longitud completa (ver Ejemplo 1) se clonó a un derivado del vector, CH269 pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA (21)). La construcción fue transfectada a células EBNA-293 utilizando lipofectamina (Life Technologies, Inc.) y las células se cosecharon 48 horas después de la transfección. La expresión de Shh en la superficie se verificó a través de FACS y a través de análisis de tinción Western. La Shh unida de células EBNA-293 se fraccionó a través de HPLC de fase inversa sobre una columna C4 de agujero estrecho (ver Figura 3). Los picos fueron analizados a través de ESI-MS (partes a y b del Cuadro 4) o a través de MALDI-TOF MS en un espectrómetro de masa Finnigan LaserMat utilizando un ácido a-ciano-4-hidroxicinámico como la matriz (parte c del Cuadro 4). A través de SDS-PAGE, la proteína emigró ligeramente más rápido que Shh soluble, se retrazó en la columna C en el análisis de HPLC de fase inversa, y, a través de espectrometría, contuvo un ¡on correspondiente al ácido palmítico más la modificación de colesterol. Sin embargo, a diferencia del producto derivado de célula de insecto en donde más del 80% del producto contuvo la modificación tanto de ácido palmítico como de colesterol, el perfil de elusión de HPLC y datos de la espectrometría de masa revelaron que la mayoría de la proteína derivada de célula de mamífero careció de la proteína de palmitoilo (ver Cuadro 4 y Figura 13). Es decir, en el pico 2 de células EBNA-293, la relación de proteína enganchada (des-1-10) contra la proteína intacta a través de la señal MS fue de 50%, mientras que para el pico 1 solo se sujetó aproximadamente 105 de Shh. En forma interesante, los productos tanto de célula de insecto como derivada de célula de mamífero mostraron actividad comparable en el ensayo C3II10T1/2 sugiriendo que las modificaciones tanto de colesterol como de colesterol más ácido palmítico son funcionales. Si el segundo sitio de unión de lípido se utiliza simplemente para estabilizar adicionalmente la asociación de la proteína con la membrana o si juega un papel más activo y afecta su conformación o hace contacto con proteína-proteína, permanece siendo determinado. La derivatización de ácido graso de proteínas es una modificación de traducción posterior común que ocurre después en los procesos de maduración (28, 29). Para derivados de cisteína, el proceso es dinámico implicando enzimas separadas que se agregan y remueven de la modificación en el grupo sulfhidrilo. Las fracciones más comunes de dicha derivatización (por ejemplo palmitoilación) son para alterar las propiedades fisicoquímicas de la proteína, es decir, para activar una proteína en su sitio de función, para promover interacciones de proteína-proteína y para mediar interacciones de proteína-membrana (30). Para la proteína de erizo, aunque la diferencia en el contexto de palmitoilación en las preparaciones derivadas de célula de insecto y de mamífero (80% en células de insecto contra 30% en células de mamífero) fue sorprendente, no se sabe si es biológicamente significativa o si simplemente refleja diferencias en la maquinaria celular de los dos sistemas de prueba para agregar y remover ácido palmítico. La diferencia en el contexto de modificación en las células de insecto y de mamífero probablemente sea la especie relacionada ya que la proteína de erizo Drosophila unida que se produjo en células de insecto careció de ácido palmítico (19) a pesar de tener la secuencia N-terminal idéntica.

CUADRO 4 Análisis de espectroscopia de Masa de Proteína de Erizo Sonic Humana Unida Derivada de EBNA-293 Proteína Masa (Da) Calculada Medida a. bacteriana expresada (no unida) 19560.02 19560 b. expresada por baculovirus (no unida) + ácido palmítico 19798.49 19796 + ácido palmítico/colesterol 20167.14 20168 c. La célula EBNA-293 expresó (unida) pico 1 (9% de la proteína de erizo total) sin unión 19569.02 19581 sin unión (des 1-9) 18700.02 18712 pico 2 (61% de la proteína de erizo total) + colesterol 19928.67 19934 + colesterol (des 1-10) 18912.48 18889 pico 3 (30% de la proteína de erizo total) + palmitoilo/colesterol 20167.14 20174 EJEMPLO 6 Modificaciones de Lípido de Proteína de Erizo Sonic de Rata Este ejemplo ilustra que una variedad de lípidos queda enlazada a una versión soluble de erizo Sonic de rata cuando el gen Shh de rata que codifica los residuos 1-174 es expresado en células de insecto High Five™, esencialmente como para el Shh humano de longitud completa descrito en el Ejemplo 1. La modificación de lípido hace que esta membrana de fracción quede asociada. El fragmento N-terminal (residuos 1-174 de proteína de erizo Sonic de rata no expresada) difiere solamente por dos residuos de aminoácido de aquel del fragmento N-terminal de proteína de erizo Sonic humana. En el fragmento N-terminal de erizo Sonic de rata, la treonina reemplaza la serina en la posición 44, y el ácido aspártico reemplaza la serina en la posición 173. Cundo la proteína de erizo Sonic de rata que carece del dominio de autoexpresión, se expresa en el sistema de expresión de célula de insecto/baculovirus High Five™, la mayor parte de la proteína es secretada al medio de cultivo, ya que carece de la habilidad para unir una porción del colesterol al término C. Esta forma soluble tiene una actividad biológica específica (medida a través del ensayo de inducción de fosfatasa alcalina C3H10T1/2 del Ejemplo 3) que fue similar a aquel fragmento N-terminal soluble de proteína de erizo Sonic humana expresada y purificada a partir de E. coli. Sin embargo, una pequeña fracción de la proteína total permanece asociada con las células de insecto. La proteína de erizo Sonic de rata asociada a célula se purificó esencialmente como se describió en el Ejemplo 1, y se encontró que es significativamente más activa en el ensayo de fosfatasa alcalina (datos no presentados) que los fragmentos N-terminales solubles tanto de proteína de erizo Sonic humana o de rata purificada a partir de E. coli y el sistema de expresión de célula de insecto/baculovirus High Five™ respectivamente. Análisis subsecuentes de los fragmentos N-terminales de erizo Sonic de rata a través de HPLC y espectroscopia de masa de electroaspersión (como se describió en el Ejemplo 1) sugieren que la proteína es modificada en el lípido y que existe más de un tipo de modificación del lípido. La evidencia de soporte incluye las siguientes observaciones: 1.- Las formas asociadas con células se eluyen más tarde que los fragmentos N-terminales, solubles de proteína de erizo Sonic humana y de rata a partir de una columna de HPLC de fase inversa de C4 desarrollada con un gradiente de 0-70% de acetonitrilo durante 30 minutos, lineal en ácido trifluoroacético al 0.1%; 2 - Las masas de las formas asociadas con las células son consistentes con aquellas esperadas para las proteínas modificadas con lípido, como se muestra en el Cuadro 5.

CUADRO 5 Masas de Varias Formas Modificadas con Lípido de Proteína de Erizo Sonic de Rata Proteína Aducto Masa Esperada1 Masa Observada (MH + ) (MH + ) No modificada Ninguna 19,632.08 19,632 Miristoil CH3(CH2)12CO- 19,842.50 19,841 Palmitoil CH3(CH2)14CO- 19,870.55 19,868 Estearol CH3(CH2)16CO- 19,898.60 19,896 Araquidoil CH3(CH2)18CO- 19,926.66 19,925 * Se utilizaron masas promedio para calcular las masas esperadas.

La ubicación de la porción de lípidos se determinó utilizando una combinación de análisis de secuencia y mapeo de péptido. Se bloqueó la secuenciación de Edman N-terminal automática de las formas modificadas por lípido indicando que el término N se bloqueó, sugiriendo que el lípido se anexó a la a-amina de la cisteína N-terminal. El mapeo del péptido Endo-Lys-C, espectroscopia de masa MALDI-TOF y análisis MALDI PSD (como se describió en el Ejemplo 1) de las formas modificadas con lípido alquiladas de 4-vi n i I pi ridi na , se utilizaron para confirmar la ubicación de las modificaciones de lípido y para determinar sus masas exactas. Las masas de los péptidos N-terminales (residuos 1-9, inclusive, más 4-vinilpiridina anexados a la cadena lateral tiol de la cisteína N-terminal) llevando las modificaciones de lípido fueron consistentes con un 0.1 Da con aquella esperada para los péptidos modificados en lípido como se muestra en el Cuadro 6.

CUADRO 6 Masas de los Péptidos N-terminales Aislados de Varias Formas Modificadas por Lípido de la Proteína de Erizo Sonic de Rata Proteína Aducto Masa Esperada' Masa Observada (MH*) (MH+) Miristoil CH3(CH2)12CO- 1193.69 1193.76 Palmitoil CH3(CH2)14CO- 1221.72 1221.65 Estearol CH3(CH2)16CO- 1249.75 1249.71 * Se utilizaron masas monoisotópicas para calcular las masas esperadas.

Además de los péptidos modificados por lípido mostrados en el Cuadro 6, también se detectaron péptidos con masas de 1191.74, 1219.84 y 1247.82. Estas masas fueron consistentes con formas insaturadas de miristato, palmitato y estearato respectivamente, aunque no se determinó la posición del doble enlace en la cadena alquilo. Estas observaciones indican que tanto los ácidos grasos saturados como insaturados pueden ser anexados covalentemente a la cisteína N-terminal. Tanto para los péptidos modificados con lípidos saturado e insaturado, el análisis de MALDI PSD, como se describió en el Ejemplo 1, confirmó que los lípidos fueron anexados covalentemente al residuo de cisteína N-terminal.

EJEMPLO 7 Modificación de Lípido de la Proteína de Erizo Indian Para determinar si la reacción de palmitoilación es única al Shh humano o si puede ocurrir en otras proteínas de erizo, se probó si la proteína de erizo Indian humana (expresada en E. coli como una proteína de fusión marcada con His con un sitio de escisión de enterocinasa inmediatamente adyacente al inicio de la secuencia madura y purificada exactamente como para la proteína de erizo Sonic humana recombinante (ver Ejemplo 9)) puede ser palmitoilada utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 2. La proteína de erizo Indian humana fue modificada (ver Figura 1, carril h), indicando que la palmitoilación probablemente es un aspecto común de proteínas de erizo. La habilidad para marcar directamente Shh e Ihh con ácido palmítico radioactivo en un sistema libre de célula proporcionó una clasificación simple para aminoácidos implicados en la reacción de modificación. Además, la proteína de erizo Indian palmitoilada a través del método descrito en el Ejemplo 8, fue significativamente más potente en el ensayo de C3H10T1/2 que Ihh no modificado.

EJEMPLO 8 Modificaciones de Lípido de la Proteína de Erizo Sonic Utilizando Acil-Coenzima A La acilación in vitro de una proteína conteniendo una cisteína N-terminal puede lograrse a través de una reacción química de dos pasos, con un donador de ácido graso-tioéster. En el primer paso, el grupo acilo del donador de tioéster se trasfiere al sulfhidrilo de la cisteína N-terminal en la proteína a través de una reacción de transesferificación espontánea. Subsecuentemente, la porción acilo experimenta un experimento de S a N hacia la a-amina de la cisteína N-terminal para formar un enlace de amida estable. La acilación directa de una función amina sobre una proteína también puede ocurrir con incubación prolongada con un tioéster, pero la presencia de una cisteína sobre la proteína acelerará la reacción y permitirá el control sobre el sitio de acilación. En los ejemplos de la presente, se utilizaron derivados de coenzima A comercialmente disponibles (Sigma Chemical Company, St. Louis MO), pero también otros grupos de tioéster podrían lograr el mismo resultado. En realidad, ciertos grupos salientes de tioéster, tales como esteres tiobencílicos, se espera que reaccionen más rápidamente. Los residuos de cisteína interna también pueden promover la acilación a usinas circundantes (es decir, como en un par de cisteína-lisina interno) y esto puede ser convenientemente probado utilizando péptidos sintéticos. Las acilaciones secundarias que ocurren en una proteína durante la reacción con tioésteres se pueden evitar controlando la composición de regulador del pH, o a través de mutagénesis dirigida en el sitio de las usinas circundantes. En análisis preliminares del efecto de acilación sobre la habilidad de la proteína de erizo Sonic humana para inducir la fosfatasa alcalina en células C3H10T1/2, las mezclas de reacción contuvieron 1 mg/ml de proteína de erizo Sonic humana (51 µM), 500 µM de la acil-coenzima A particular, comercialmente disponible (compuestos probados incluidos acetil-CoA (C2:0), butiril-CoA (C4:0), hexanoil-CoA (C6:0), octanoil-CoA (C8:0), decanoil-CoA (C10:0), lauroil-CoA (C12:0), miristoil-CoA (C14:0), palmitoil-CoA (C16:0), palmitoleoil-CoA (C16:1), estearoil-CoA (C18:0), araquidoil-CoA (C20:0), behenoil-CoA (C22:0), lignoceroil-CoA (24:0), succinil-CoA, y benzoil-CoA), 25 mM DTT, y 50 mM Na2HPO4 pH 7.0). Las reacciones fueron incubadas a temperatura ambiente durante 3 horas y después se analizaron inmediatamente (sin purificación) para bioactividad en el ensayo C3H10T1/2 como se describió en el Ejemplo 3. Las muestras para análisis a través de HPLC de fase inversa y otros métodos físicos fueron usualmente almacenadas a -70°C. El análisis de HPLC se realizó sobre una columna de fase inversa Vydac C4 (diámetro interno de 4.6 mm x 250 mm, partícula de 5 mieras) con un gradiente de 40 minutos de 5% de acetonitrilo a 85% de acetonitrilo en 0.1% de TFA acuoso, a una velocidad de flujo de 1 mL/min. El efluente se verificó a 280 nm, y las fracciones fueron recogidas en algunos experimentos y analizadas para proteína de erizo en SDS-PAGE con detección a través de tinción con Coomassie y mediante tinción Western. La comparación de la actividad de las varias mezclas de reacción (Figura 10) indica que una longitud de cadena de entre 12 y 18 carbonos es óptima para inducir una alta actividad de fosfatasa alcalina según comparado con la proteína no modificada. El incremento de la longitud de cadena además dio como resultado una reducción aparente en la actividad, y la presencia en un doble enlace en palmitoleoil-CoA (C16:0) dio la misma actividad como el palmitoilo-CoA totalmente saturado (C16:0). Después del análisis de HPLC de fase inversa de las mezclas de reacción, se observó que muchos de los derivados acil-CoA de longitud de cadena más corta no reaccionaron con la proteína de erizo, y, por lo tanto, la dependencia de la actividad biológica mostrada en la Figura 10 no fue una reflexión verdadera de la longitud de cadena de acilo. Con el fin de obtener datos sobre la verdadera actividad de las proteínas modificadas, y sobre la dependencia de actividad en la longitud de cadena de acilo, se desarrollaron métodos para la síntesis y modificación de las formas aciladas N-terminales individuales. Las proteínas de erizo Sonic humanas palmitoiladas, miristoiladas, lauroiladas, decanoiladas y octanoiladas, que llevan una cadena acilo individual unida a la a-amina de la cisteína N-terminal, fueron producidas en mezclas de reacción conteniendo 0.80 mg/ml (41 µM) de proteína de erizo Sonic humana, 410 µM (exceso molar de 10 veces) ya sea de palmitoil-CoA, miristoil-CoA, o lauroil-CoA, o 4.1 mM (exceso molar de 100 veces) ya sea de decanoil-CoA u octanoil-CoA, 25 mM DTT (para mezclas de reacción conteniendo palmitoil-CoA, miristoil-CoA, o lauroil-CoA) o 0.5 mM DTT (para mezclas de reacción conteniendo decanoil-CoA, u octanoil-CoA), y 40 mM Na2HPO pH 7.0. Las mezclas de reacción se incubaron a 28°C durante 24 h. La mezcla de la cisteína N-terminal con tioésteres de acilo da como resultado la transferencia del grupo acilo al sulfhidrilo a través de una reacción de transesterificación espontánea, la cual es seguida por un desplazamiento de S a N hacia la a-amina para formar un enlace de amida estable. El sulfhidrilo libre después experimenta una segunda reacción de transesterificación, produciendo una proteína con un grupo acilo graso anexo a través de un enlace tioéster al sulfhidrilo. El grupo acilo enlazado a tioéster se removió agregando un volumen consecutivo de 0.11 de 1 M Na2HPO pH 9.0, y un volumen de 0.11 de 1 M hidroxilamina (concentración final 0.1 M) seguido por incubación a 28°C durante 18 h., lo cual deja solamente la amida de acilo unida a la proteína (62). Después se agregó un volumen de 0.25 de octilglucósido al 5% (concentración final de 1%) y la mezcla se incubó durante 1 h. a temperatura ambiente. Las proteínas después se purificaron en presencia de octilglucósido al 1% utilizando cromatografías de intercambio de ion catiónico de flujo rápido SP-Sepharose (Pharmacia) y Bio Scale S (Biorad). Las proteínas purificadas fueron dializadas utilizando 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, octilglucósido al 1%, 0.5 mM DTT, y se almacenaron a -70°C. La presencia del octilglucósido fue requerida para mantener una solubilidad completa; la remoción del detergente a través de dilución y diálisis dio como resultado una perdida del 75%, 41%, y 15% de las proteínas palmitoiladas, miristoiladas, y lauroiladas, respectivamente. La ESI-MS de las proteínas modificadas mediante HPLC confirmó su integridad: proteína de erizo Sonic palmitoilada, masa medida = 19798, masa calculada = 19798.43; proteína de erizo Sonic miristoilada, masa medida = 19770, masa calculada = 19770.33; proteína de erizo Sonic lauroilada, masa medida = 19742, masa calculada = 19742.33; proteína de erizo Sonic decanoilada, masa medida = 19715, masa calculada = 19714.28; proteína de erizo Sonic octanoilada, masa calculada = 19686, masa calculada = 19686.23. El análisis de las varias formas aciladas de proteína humana Sonic en el ensayo C3H10T1/2 (Figura 11) indicó que la actividad de las proteínas fue dependiente de la longitud de cadena. Las proteínas palmitoiladas, miristoiladas, y lauroiladas mostraron aproximadamente una actividad igual con valores de EC50 de 5-10 ng/ml (incremento de 100-200 veces en potencia según comparado con la proteína no modificada). La proteína de erizo Sonic humana decanoilada, con un valor EC50 de 60-70 ng/ml (incremento de 15-30 veces en potencia según comparado con la proteína no modificada), fue menos activa que las formas palmitoilada, miristoilada, y lauroilada, mientras que la forma octanoilada fue la última activa con un EC50 de 100-200 ng/ml (incremento de 10 veces en potencia según comparado con la proteína no modificada). Todas las formas asiladas fueron más potentes que la proteína no modificada, la cual tuvo una EC50 de 1000-2000 ng/ml. Además de la reducción en el valor de EC50, las proteínas palmitoiladas, miristoiladas, y lauroiladas indujeron aproximadamente 2 veces más actividad de fosfata alcalina que la proteína no modificada, mientras que las proteínas decanoiladas y octanoiladas indujeron aproximadamente 1.5 veces más. Además de incrementar la potencia de la forma miristoilada de proteína de erizo Sonic humana observada en el ensayo C3H10T1/2, esta forma es significativamente más potente que la proteína no modificada para inducir neuronas de cerebro anterior ventral en explantes de telencéfalo de cerebro de rata E11 de etapa embriónica. La incubación de explantes telencefálicos E 11 con varias concentraciones de proteína de erizo Sonic no modificada o miristoilada, y la subsecuente tinción de los explantes para productos de los genes dlx y islet-1/2 (marcadores de neuronas de cerebro anterior ventral), indica que la inducción a través de la proteína no modificada se observó primero a 48 nM, la inducción por la forma miristoilada se observó primero a 3 nM. Además, mientras que la proteína no modificada induce expresión restringida a 3070 nM, la proteína miristoilada induce una expresión amplia solamente a 48 nM. Se observó un incremento similar en potencia cuando los explantes de telencéfalo probable de E9 de etapa embriónica se incubaron ya sea en las proteínas no modificadas o miristoiladas. La tinción de los explantes para el producto del gen Nkx2.1 (un marcador temprano de las neuronas de cerebro anterior ventral), indicó que la proteína no modificada indujo a Nkx2.1, primero a 384 nM, mientras que para la expresión de proteína miristoilada de Nkx2.1 se observó primero a 12 nM. Además, a 48 nM de proteína de erizo Sonic miristoilada, la expresión de Nkx2.1 fue esparcida, mientras que fue no detectable a esta concentración utilizando la forma no modificada. Además, la proteína de erizo Sonic humana miristoilada ha mostrado ser significativamente mas protectora que la proteína no modificada para reducir el volumen de lesión, que resulta de la administración de malonato al estrato de cerebro de rata (Ver Ejemplo 16).

EJEMPLO 9 Derivados Químicos de la Cisteína N-terminal de Proteína de Erizo Sonic Humana A. Métodos Generales Alguilación de Proteínas. Las muestras conteniendo aproximadamente 20 µg de la proteína en 50 µL de 6 M de clorhidrato de guanidina, 50 mM Na2HPO pH 7.0, fueron tratadas con 0.5 µL de 4-vinilpiridina durante 2 h. a temperatura ambiente. La proteína S- p i rid i let i I ad a fue precipitada a través de la adición de 40 volúmenes de etanol frío. La solución se almacenó a -20°C durante 1 h. y después se centrifugó a 14,000 x g durante 8 min. a 4°C. Los sobrenadantes se desecharon y el precipitado se lavó con etanol frío. La proteína se almacenó a -20°C.

Mapeo de Péptido. La proteína alquilada (0.4 mg/ml en 1 M en clorhidrato de guanidina, 20 mM Na2HPO4 pH 6.0) fue digerida con endo Lys-C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd) a una relación de 1: 20. La digestión fue dirigida a temperatura ambiente durante 30 h. La reacción se detuvo a través de la acidificación con 5 µL de ácido trifluoroacético al 25%. La digestión fue analizada en un Módulo de Separación Waters 2690 con un detector de disposición de fotodiodo Modelo 996. Antes de la inyección se añadió clorhidrato de guanidina sólido a la digestión a una concentración de 6 M para disolver el material insoluble. Se utilizó una columna Vydac C18 de fase inversa (diámetro interno de 2.1 mm x 250 mm) para la separación, con un gradiente de 90 min. de ácido trifluoroacético al 0.1% / acetonitrilo y ácido trifluoroacético al 0.1% / acetonitrilo a una velocidad de flujo de 0.2 mL/min. Se recolectaron los picos individuales manualmente para análisis de masa.

Determinación de Masa. Las masas moleculares de proteínas intactas fueron determinadas a través de espectroscopia de masa de ionización de electroaspersión (ESI-MS) en un espectrómetro de masa de cuatro polos, triple Micromass Quattro II. Las muestras fueron desaladas utilizando un Sistema Analizador de Micro Proteína Ultra Rápido Michrom en línea con una columna Reliasil C (diámetro interno de 1 mm x 50 mm). La velocidad de flujo fue de 20 µL/min. Todos los datos de espectro de masa de electroaspersión fueron procesados utilizando el sistema de datos Micromass MassLynx. Las masas moleculares de los péptidos fueron determinadas a través de espectroscopia de masa de tiempo de vuelo de ionización de desabsorción de matriz ayudada con láser (MALDI-TOF-MS) en un aparato Voyager-DE™ STR (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA). La secuenciación del péptido modificado se realizó a través de una medición de decaída post-fuente (PSD) en el mismo instrumento. Como matriz se utilizó ácido a-Ciano-4-hidroxicinámico.

Secuenciación N-terminal. Las proteínas fueron secuenciadas a través de degradación de Edman en un Secuenciador de Proteína de Líquido Pulsada modelo 477 A Perkin-Elmer Applied Biosystems. Se hizo PTH-tiaprolina en línea cargando directamente tiaprolina (ácido tiazolidin-4-carboxílico) al cartucho de carga de muestra del secuenciador.

Expresión y purificación bacteriana de fragmento N-terminal de Erizo Sonic Humano soluble de tipo silvestre utilizado para modificación química. Pellas bacterianas de células expresando Shh a 4-5% de la proteína total fueron descongeladas, se volvieron a suspender en regulador de pH de lisis, (25 mM Na2HPO4 pH 8, 150 mM NaCI, 1mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT) a una relación de 1 : 4 (p/v) y se usaron a través de dos pasos a través de una prensa de Gaulin (mfg. Por APV Rannie, Copenhague, Dinamarca) a 843.6 kg/cm2. Todos los pasos de purificación subsecuentes fueron realizados a 2-8°C a menos que se indique otra cosa. El homogenato se centrifugó a 19,000 x g durante 60 min. y MES 0.5 M pH 5, se agregó al lisato resultante a una relación de 1 : 10 (v/v). El lisato (a un pH por 5.5) se cargó sobre una columna de flujo rápido SP Sepharose (Farmacia, Piscataway, NJ), (4 g E. coli de peso humedo/mL de resina) equilibrada con 25mM Na2HPO pH 5.5 mM NaCl. La columna se lavó con 4 volúmenes de columna (CV) de anulador de pH de equilibrio, después con 3 CV de 25 mM Na2HPO4 pH 5.5, 200 mM NaCI, 0.5 mM DTT, y His-etiqueta-Shh se eluyó con 800 mM de NaCI en el mismo regulador de pH. Las fracciones de elusión fueron analizadas para absorbancia de 280 nm y a través de SDS-PAGE. Se agregaron imidazol (solución de banco 1M a un pH de 7) y NaCI (solución de banco 5 M) a una combinación de las fracciones conteniendo Shh pico del producto eluído de SP Sepharose para dar concentraciones finales de 20 mM y 1 M respectivamente, y este material se cargó a una columna de NTA-Ni agarosa (Qiagen, Santa Clara, CA) (20 mg/ml de resina) equilibrada con 25 mM Na2HPO4 pH 8, 1 M NaCI, 20 mM imidazol, 0.5 mM DTT. La columna se lavó con 5 CV del mismo regulador de pH y His-etiqueta-Shh se eluyó con 3 CV de 25 mM Na2HPO4 pH 8, 1 M NaCI, 200 mM imidazol, 0.5 mM DTT. El contenido de proteína en la combinación eluída de la columna NTA-Ni se determino a través de absorbancia a 280 nm. La combinación se calentó a temperatura ambiente y se agregó un volumen igual de 2.5 M de sulfato de sodio. El paso de fenil-Sepharose se realizó a temperatura ambiente. El material se cargó sobre una columna de Flujo Rápido fenil-Sepharose (Farmacia, Piscataway, NJ), (20 mg/ml de resina) equilibrada en 25 mM Na2HPO4 pH 8, 400 mM NaCI, 1.25 de sulfato de sodio, 0.5 mM DTT. La His-etiqueta-Shh se eluyó con 25 mM Na2HPO4 pH 8, 400 mM NaCI, 0.5 mM DTT. Típicamente, se recuperaron 2-3 g de Shh-etiquetada con His a partir de 0.5 kg de pasta bacteriana (peso húmedo). El producto se filtro a través de un filtro de 0.2 µm, se formó alícuota y se almacenó a -70°C. El Shh etiquetada con His fue aproximadamente 95% pura según determinada a través de SDS-PAGE. Como una determinación adicional de las características del producto purificado, las muestras se sometieron a evaluación través de espectrometría de masa de ionización de electroaspersión (ESI-MS). Aproximadamente 50% de la proteína fue un carente de la metionina N-terminal. Para separar la etiqueta de hexahistidina, se incubó en enterocinasa (Biozyme, San Diego, CA) con la Shh etiquetada con His en una relación de enzima: Shh de 1 : 1000 (p/p) durante 2 h. a 28°C. La Shh etiquetada con His no separada y la etiqueta His se removieron haciendo pasar la digestión a través de la segunda columna de NTA-Ni agarosa (20 mg de Shh/mL de resina). Antes de la carga, se agregaron imidazol (solución de abastecimiento 1 M a un pH de 7) y NaCI (solución de abastecimiento de 5 M) a la digestión para dar concentraciones finales de 20 mM y 600 mM, respectivamente. Este material se cargó sobre una columna de NTA-Ni equilibrada en Na2HPO4 pH 8 600 mM NaCI, 20 mM imidazol, 0.5 mM DTT y se hizo fluir a través de lo recogido. La columna se lavó con 1 CV del mismo regulador de pH y se combino con el flujo pasado. Se agrego MES (solución de abastecimiento de 0.5 M a un pH de 5) a la fracción no unida de NTA-Ni agarosa a una concentración unida de 50 mM y se agregaron 2 volúmenes de agua. Este material se cargó sobre una segunda columna de Flujo Rápido SP Sepharose (20 mg/ml de resina), se equilibro con 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT. La columna se lavo con 3 CV de regulador de pH de equilibrio y 1 CV del mismo regulador de pH conteniendo 300 mM de NaCl. La Shh se eluyó con 5mM Na2HPO4 pH 5.5, 800 mM NaCI, 0.5 mM DTT. Los datos de absorción atómica revelaron que Shh en esta etapa contuvo 0.5 equivalentes molares de Zn2 + . Una concentración equimolar de ZnCI2 se agregó al producto eluído de Shh y la proteína se dializó contra 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT. La Shh resultante fue >98% pura según caracterizado a través de SDS-PAGE, cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), y ESI-MS, y a través de absorción anatómica, contuvo de entre 0.9 y 1.1 de Zn2 + /Shh. Los datos de ESI-MS para Shh etiquetada con His y productos que resultan después de la remoción de la etiqueta de His se resumen en el Cuadro 7.

CUADRO 7 Caracterización de Shh para ESI-MS Masa Proteína Calculada Medida Shh etiquetada con His (-Met) 21433.82 21434 (Intacta) 21565.01 21565 Shh separada mediante 19560.02 19560 enterocinasa B. Modificaciones Químicas Específicas Modificación de proteína de Erizo Sonic Humana con N-etilmaleimida.

La Shh purificada en 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT se trató con 10 mM de N-etilmaleimida durante 1 h y después se dializó a 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCl. Los datos de MALDI- TOF-MS mostraron que la proteína modificada con N-etilmaleimida (NEM) tuvo un incremento en masa de 126 Da, lo cuál indica que solamente un residuo de cisteína en Shh fue modificado por el reactivo. Los datos de secuenciación N-terminales mostraron que la proteína es capas de secuenciación y que un pico inusual, probablemente PTH-NEM-Cys relacionado, fue detectado en el primer ciclo (datos no mostrados). El análisis espectrométrico de masa de la Shh piridiletilada con NEM bajo condiciones de desnaturalización mostró que solamente dos residuos de cisteína en la proteína fueron alquilados, confirmando que solamente el grupo tiol del residuo de cisteína N-terminal fue modificado a través de NEM bajo condiciones nativas (Cuadro 8). Los otros dos residuos de cisteína los cuales son aparentemente enterrados en el núcleo hidrofóbico de la proteína, no pueden ser modificados sin desnaturalización anterior.

CUADRO 8 Caracterización de la Shh modificada por NEM a través de MS Cuando sé probo en el ensayo de C3H10T1/2 (ver ejemplo 3) la proteína de erizo modificada con N-etilmaleimida fue igual a la proteína no modificada. Esto demuestra que un sulfhidrilo libre en el término N de la proteína de erizo no es requerido para la actividad y que la porción N-etilmaleimida es suficientemente hidrofóbica para conferir alguna actividad a la proteína de erizo comparado con otras modificaciones mas hidrofílicas, tales como conversión de Cys-1 a His o Asp, que produce una reducción en la actividad.

Modificación de Proteína de Erizo Sonic Humana con formaldehído para formar una tiaprolina N-terminal, y con acetiladehído v butiraldehído para formar derivados de tiaprolina N-terminal. Para modificación con formaldehído, Shh purificada a 3 mg/ml en 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT se trató con formaldehído al 0.1%, con o sin 10% de metanol a temperatura ambiente durante 1 a 6 h. La proteína tanto se dializó contra 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, como se purifico en una columna CM-Poros (Perseptive Biosystems) como se describe mas adelante, y después se dializó contra 5 mM Na2HPO pH 5.5, 150 mM NaCl. Para la modificación con acetaldehído o butiraldehído, la Shh purificada a 3 mg/ml en 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT se trató con acetaldehído o butiraldehído al 0.1% a temperatura ambiente durante 1 h, después la proteína se purificó en una columna CM-Poros. Los datos de ESI-MS para las formas tratadas con formaldehído, acetaldehído, y butiraldehído de la proteína indicaron que sus masas fueron de 13 Da. 27 Da, y 54 Da mas altas, respectivamente, que la proteína no modificada (Cuadro 9).

CUADRO 9 Masas esperadas y observadas de la proteína de Erizo Sonic Humana tratada con formaldehído, acetaldehído, y butiraldehído Proteína Masa esperada* (MH + ) Masa observada*(MH + ) No modificada 19560.02 19560 Tratada con formaldehído 19572.03 19573 Tratada con acetaldehído 19586.06 19587 Tratada con butíraldehído 19614.11 19614 «Las masas promedio fueron utilizadas para calcular las masas esperadas Para la proteína tratada con formaldehído, el mapeo de péptido, como se describe anteriormente, demostró que el sitio de la modificación ocurrió en el péptido extendiendo los primeros 9 residuos N-terminales, y que el incremento de masa exacto fue de 12 Da. Los resultados de los estudios de MALDI-PSD MS de este péptido indicaron que la modificación ocurrió en Cys-1, y puede explicarse a través de una modificación de la a-amina N-terminal y la cadena lateral tiol del Cys-1 para formar una tiaprolina (Ver Figura 12). La estructura de la tiaprolina se confirmó a través de secuenciación automática de Edman N-terminal utilizando PTH-tiaprolina preparada "en línea" como un estándar. Para las proteínas tratadas con acetaldehído y butiraldehído, los datos de ESI-MS fueron consistentes con las modificaciones ocurriendo a través de la misma química como para la reacción con formaldehído, aunque el sitio exacto de modificación no ha sido establecido. Cuando se probó en el ensayo basado en la célula C3H10T1/2, las proteínas modificadas con formaldehído, acetaldehído y butiraldehído fueron aproximadamente 8 veces, 2 veces y 3 veces, respectivamente, más potentes que la Shh no modificada.

Modificación de Proteína de Erizo Sonic Humana con N-isopropilyodoacetamida. Este ejemplo muestra que la modificación de Shh humana con un derivado hidrofóbico de yodo acetamida puede mejorar la potencia de la proteína comparado la Shh no modificada. La Shh purificada (1 mg/ml en 5 mM Na2HPO4 pH 7.0, 150 mM NaCI, 0.1 mM DTT) se incubo con 1 mM de N-isopropilyodoacetamida (NIPIA) a 4°C durante 18 h. Después, se agregó DTT, a una concentración final de 10 mM y la muestra se dializó de forma extensa contra 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT. La muestra se purificó en una resina de Flujo Rápido SP Sepharose y se dializó otra vez contra 5 mM Na2HPO pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT. Los datos de ESI-MS indicaron una conversión completa a una especie con una masa de 19660, correspondiendo al valor de masa pronosticado (19659) para la proteína individualmente modificada. La modificación específica de la cisteína N-terminal se confirmó a través de mapeo de péptido de fragmentos proteolíticos. Cuando se probó en el ensayo basado en la célula C3H10T1/2, la Shh humana modificada con NIPIA fue aproximadamente dos veces más potente que la proteína no modificada. Aunque la modificación de la proteína dio como resultado solamente un incremento modesto en la potencia, se espera que la modificación de la proteína con derivados de alquil yodo acetamida de cadena larga dará como resultado formas hidrofóbicamente modificadas de la proteína con incrementos mayores en potencia, posiblemente hasta de 100-200 veces el incremento observado para las proteínas Shh palmitoiladas, miristoiladas, y lauroiladas (Ver Ejemplo 8).

Modificación de proteína de Erizo Sonic Humana con 1-bromo-2-butanona para formar un anillo hidrofóbico de 6 miembros en el término N. Un derivado de tiomorfolin-(tetrahidrotiazinilo-) del Shh se preparó incubando Shh-N humano (3 mg/ml en 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.15 mM DTT) con 11 mM de 1 -bromo-2-butanona a temperatura ambiente durante 60 min., seguido por la reducción con 5 mM NaCNBH3 a temperatura ambiente durante 60 min. El producto de reacción se purificó en una columna CM-Poros (Perseptive Biosystems) como se describe mas adelante, y se dializó contra 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT. Los datos de mapeo de péptido proteolítico y de ESI-MS indicaron que el producto fue una mezcla del derivado de tiomorfolino esperado (masa calculada = 19615, masa observada = 19615) y dos formas de la proteína ambas con 6 unidades de masas adicionales. Una de estas formas presumiblemente es el intermediario ceto-tioéter no ciclizado. La mezcla se probó en el ensayo de C3H10T1/2 el cuál indicó que fue aproximadamente 7 veces más potente que la proteína no modificada.

Ejemplo 10 Mutaciones Genéticamente Diseñadas por Ingeniería de Proteína de Erizo Sonic Humana A. Mutaciones Genéticamente Diseñadas por Ingeniería de la Cisteína N-terminal En este ejemplo, se muestra que el reemplazo específico de la cisteína N-terminal de proteína de Erizo Sonic Humana (Cys-1) a través de residuos de aminoácido hidrofóbicos individuales y múltiples da como resultado una potencia incrementada según comparado con la proteína de tipo silvestre en el ensayo basado en la célula C3H10T1/2 descrito en el Ejemplo 3.

Construcción de Mutantes Shh Cvs-1. El fragmento de restricción Ncol-Xhol de 584 bp llevando el fragmento N-terminal de Shh de tipo silvestre etiquetado con His de p6H-SHH se subclonó en el sector de clonación derivado pUC, pNN05, para construir el plásmido pEAG649. Los mutantes de Cys-1 de Shh humanos soluble se hicieron a través de mutagénesis de eliminación de sitio único de la plantilla de plásmido pEAG649 utilizando un equipo de Pharmacia siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para diseñar los iniciadores mutagénicos, si una mutación deseada no produjo un cambio de sitio de restricción, se introdujo una mutación silenciosa produciendo un cambio de sitio de restricción a un color adyacente para facilitar la identificación de clones mutantes después de la mutagénesis. Para evitar el uso de codón aberrante se seleccionaron codones substituidos a partir de aquellos que ocurren por lo menos una vez en cualquier parte en la secuencia de ADNc de Shh humano. Se utilizaron los siguientes iniciadores mutagénicos: (1) para C1F: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA TTC GGA CCG GGC AGG GGG TTC 3'(SEC ID NO: _), el cual introduce un sitio Apol para hacer PEAG837; (2) para CU: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATA GGA CCG GGC AGG GGG TTC 3' (SEC ID NO:_), el cual pierde un sitio Rsrll para hacer Peag838; y (3) para C1M: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATG GGC CCG GGC AGG GGG TTC GGG 3' (SEC ID NO:_), el cual pierde los sitios Rsrll como Avall para hacer pEAG839. Las mutaciones fueron confirmadas a través de secuenciación de ADN a través de un fragmento de restricción Ncol-Bglll de 180 bp llevando los términos N de las proteínas SHH mutantes en los plásmidos pEAG837-839. Los vectores de expresión fueron construidos subclonando cada fragmento de Ncol-Bg 111 de 180 bp de plásmido mutante y el fragmento de Bglll -Xhol de 404 bp de pEAG649 en la estructura de base del vector Xhol-Ncol pET11d de 5.64 kb tratado con fosfatasa de p6H-SHH. La presencia del cambio de sitio de restricción introducidos se volvió a confirmar en el vector de expresión para cada mutante Cys-1 (C1F en pEAG840, C1I en pEAG841, y C1M en pEAG842). Los vectores de expresión fueron transformados en E. coli BL21 (DE3)pLysS (Stratagene) competente siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y se seleccionaron en placas de agar LB conteniendo 100 µg/ml de ampicilina y 30 µg/ml de cloramfenicol. Se seleccionaron colonias individuales y las bacterias transformadas se desarrollaron A600 de 0.4-0.6 y se indujeron durante 3 h. con 0.5 mM de IPTG. Las pellas bacterianas fueron analizadas para expresión de las proteínas mutantes reduciendo SDS-PAGE y a través de tinción Western. Un mutante de Shh humano soluble con múltiples sustituciones hidrofóbicas N-terminales (C1II) se hizo a través de mutagénesis de eliminación de sitio único utilizando un equipo de Farmacia siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para diseñar los iniciadores mutagénicos, si una mutación deseada no produjo un cambio de sitio de restricción, se introdujo una mutación silenciosa produciendo un sitio de restricción en un codón adyacente para facilitar la identificación de clones mutantes después de mutagénesis. Para evitar el uso aberrante del codón, se seleccionaron codones substituidos de aquellos que ocurren por lo menos una vez en cualquier parte de la secuencia de ADNc de SHH humano. Se utilizo el siguiente iniciador mutagénico en el plásmido de la plantilla C1F pEAG837 para C1II: 5' GCG GCG ATG ACG ATG ACÁ AA TCA TCG GAC CGG GCA GGG GGT TCG GG 3'(SEC ID NO:_), que remueve un sitio Apol para hacer pEAG872. Se confirmaron las mutaciones a través de secuenciación de ADN a través de un fragmento de restricción de Ncol-Xhol de 0.59 kb llevando el mutante C1II Shh. Un vector de expresión se construye subclonando el fragmento Xhol-Ncol del plásmido mutante en la estructura de base del vector Xhol-Ncol pET11d de 5.64 kb tratado con fosfatasa de p6H-SHH. La presencia del cambio de sitio de restricción introducido se volvió a confirmar en el vector de expresión para el mutante C1II, pEAG875. El vector de expresión se transformó a E. coli BL21 (DE3)pLysS (Stratagene) competente siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y se seleccionó sobre placas de agar LB conteniendo 100 µg/ml de ampicilina y 30 µg/ml de cloranfenicol. Las colonias individuales fueron bacterias seleccionadas y transformadas desarrolladas a u n A6oo de 0.4-0.6 y se indujeron durante 3 horas con 0.5 mM de IPTG. Las pellas bacterianas fueron analizadas como se describió anteriormente para confirmar la expresión de la proteína Shh mutante.

Purificación de los mutantes Cys-1 de proteína de erizo Sonic humana. Las proteínas de erizo mutantes etiquetadas con His fueron purificadas a partir de las pellas bacterianas como se describió para la proteína de tipo silvestre anterior, excepto para dos modificaciones. (1) El paso de fenil Sepharose se eliminó y más bien la combinación de proteína a partir de la primera columna de NTA-Ni agarosa se dializó a 25 mM Na2HPO4 pH 8, 400 mM NaCI, 0.5 mM DTT en la preparación para el paso de escisión de enterocinasa. (2) El paso de intercambio de iones final se cambió del paso de elusión sobre el flujo rápido de SP-Sepharose a la elusión de gradiente a partir de una columna CM-Poros (Perseptive Biosystems). Esto se realizó en 50 mM Na2HPO4 pH 6.0 con un gradiente de 0-800 mM de NaCI sobre 30 volúmenes de columna. Las fracciones pico combinadas de este paso fueron dializadas en 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI y fueron almacenadas a -80°C. La espectrometría de masa de las proteínas purificadas dio los iones de masa predichos para cada forma purificada.

Actividad de los mutantes Cys-1 de proteína de erizo Sonic humana. Como se muestra en el Cuadro 10, la mutación de la cisteína N-terminal tiene un efecto importante sobre la potencia de la proteína de erizo resultante en el ensayo de C3H10T1/2. Para cambios individuales, la potencia generalmente se correlaciona con el carácter hidrofóbico del aminoácido substituido, es decir fenilalanina e isoleucina dan la activación mayor, la metionina es de activación menor, mientras que la histidina y ácido aspártico disminuyen la actividad comparada con la cisteína de tipo silvestre. El reemplazo de la cisteína con dos isoleucinas da un incremento adicional en la actividad sobre la substitución de isoleucina individual. Dado que se categoriza 9 aminoácidos como más hidrofóbicos que la cisteína (Proteins: structures and molecular properties. 2o. edición, 1993, T. E. Creighton, W. H. Freeman Co. Pag. 154), las substituciones probadas anteriormente claramente no son una supervivencia exhausta de las posibles mutaciones del término N que pueden dar surgimiento a formas activas de la proteína de erizo. Sin embargo, los resultados demuestran que la activación no está restringida a una estructura de aminoácido individual y que la substitución de más de un aminoácido puede dar un incremento adicional en la potencia. Por lo tanto, un experto en la técnica puede crear formas de proteína de erizo con otras substituciones de aminoácido en el término N que podría esperarse que tenga una potencia mayor que la proteína de tipo silvestre.

CUADRO 10 Potencia relativa de modificaciones de aminoácido de proteína de erizo Sonic Humana en el ensavo C3H10T1/2 B. Mutaciones Genéticamente Diseñadas por Ingeniería de Residuos Internos Construcción del mutante C1II/A169C. El mutante de Shh humano soluble C1II/A169C (con cisteína substituida para el residuo A169 C- terminal dispensable, el cual se cree que tiene una capacidad de acceso de solvente altamente fraccional) se hizo a través de mutagénesis de eliminación de sitio único utilizando un equipo de Pharmacia, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y empleando los principios de diseño de oligo mutagénico descritos anteriormente. Se utilizó el siguiente iniciador mutagénico 5' GAG TCA TCA GCC TCC CGA TTT TGC GCA CAC CGA GTT CTC TGC TTT CAC C3' (SEC ID NO: _) en la plantilla de plantilla de Shh de C1II pEAG872 para agregar un sito Fspl para hacer pSYS049. Las mutaciones de C1II/A169C se confirmaron a través de secuenciación de ADN a través de un fragmento de restricción kb Ncol-Xhol de 0.59 kb. El vector de expresión pSYS050 se construyó subclonando el fragmento Ncol-Xhol en la estructura de base del vector pET11d de 5.64 kb tratado con fosfatasa de p6H-SHH. La presencia del cambio de sitio de restricción introducido se volvió a confirmar en el vector de expresión. El vector de expresión se transformó en E. coli BL21 (DE3)pLysS competente, se seleccionaron colonias, se indujeron y se clasificaron para expresión de Shh como se describió anteriormente.

Purificación del mutante C1II/A169C. El mutante C1II/A169C se purificó como se describió en el Ejemplo 9 para Shh de tipo silvestre, excepto con las siguientes modificaciones. (1) Se dejó EDTA fuera del regulador de lisis, (2) el orden de los pasos de NTA-Ni y SP Sepharose fue conmutado y el paso de Fenil Sepharose fue omitido, (3) después de aclarar las bacterias usadas a través de centrifugación, se agregó a una concentración final de 300 mM, (4) el regulador de pH de elusión de la columna NTA-Ni contuvo 25 mM Na2HPO4 pH 8.0, 200 mM imidazol, 400 mM NaCI, (5) la combinación de elusión de la columna NTA-Ni se diluyó con tres volúmenes de 100 mM MES pH 5.0 antes de cargarse a la columna de SP Sepharose, (6) antes de la adición de enterocinasa, la combinación de elusión de SP Sepharose se diluyó con la mitad de un volumen de 50 mM Na2HPO4 pH 8.0, y (7) el DTT en el regulador de pH de elusión de la columna final de SP Sepharose contuvo 0.2 mM de DTT y la combinación de elusión de este paso se formó en alícuotas y se almacenó a -70°C.

Modificación hidrofóbica y actividad del mutante C1II/A169C. Para la modificación con N-(l-piren) maleimida (Sigma), se diluyó C1II/A169C purificado a 4.6 mg/ml en 5 mM Na2HPO4 pH 5.5, 800 mM NaCI, 0.2 mM DTT con un volumen igual de 50 mM MES pH 6.5 y a esto se agregó un veinteavo de un volumen de la piren-maleimida a partir de un banco de 2.5 mg/ml en DMSO. La muestra se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente a la oscuridad. En este momento, se agregó DTT adicional a 0.5 mm y la muestra se incubó adicionalmente durante 1 h más a temperatura ambiente. La proteína modificada se probó directamente para actividad en el ensayo de C3H10T1/2 como se describió en el Ejemplo 3. Antes de la modificación, la actividad específica de la proteína fue de EC50 = 0.22 µg/ml, mientras que después del tratamiento con piren maleimida, la actividad específica se incrementó a EC 0 = 0.08 µg/ml. Los incrementos en la actividad específica del producto modificado de hasta tres veces se observaron frecuentemente, indicando que la adición del grupo hidrofóbico cerca del término C de Shh dio como resultado un incremento adicional en la actividad según comparado con la actividad de partida 0111. Cuando se comparó con la proteína de erizo Sonic no modificada de tipo silvestre, la proteína C1II modificada con N-(l-piren) maleimida fue aproximadamente 30 veces más potente. Mientras que la piren-maleimida proporcionó un sistema de prueba simple para evaluar la modificación en este sitio, también se pueden utilizar otras maleimidas hidrofóbicas u otras químicas cuyo objetivo es cisteína.

EJEMPLO II Comparación de la Potencia de Varias Formas Hidrofóbicamente Modificadas de Proteína de Erizo Sonic Humana en el Ensavo C3H10T1/2 La actividad de varias formas hidrofóbicamente modificadas de proteína de erizo Sonic humana (preparada utilizando la química y los métodos de ingeniería genética descritos en la sección V) se probó en el ensayo C3H10T1/2 como se describió en el Ejemplo 3. Los derivados fueron analizados sobre una escala de concentración como se describió en el Ejemplo 3. La concentración del derivado de erizo que dio como resultado un 50% de la respuesta máxima en el ensayo se comparó con la concentración de tipo silvestre. Las actividades relativas se muestran en el Cuadro 11 a continuación, y en la Figura 13.

CUADRO 11 Potencia Relativa de Derivados de Erizo en el Ensayo C3H10T1/2 Modificación ECs x-veces más potente que Shh De tipo silvestre C: 16 palmitoilo 100 C:14 miristoilo 100 C:12 lauroilo 100 C:10 decanoilo 33 Isoleucilo-isoleucilo con A169C pirenilo 30 C:8 octanoilo 10 Isoleucilo-isoleucilo 10 C:0 tiaprolilo 8 Tiomorfolinilo 5 Fenilalanilo 4 Isoleucilo 4 N-isopropilacetamidilo 2 Metionilo 2 N-etilmaleimidilo 1 Cisteinilo (tipo silvestre) 1 Aspartilo <1 Histidilo <1 El ensayo de C3H10T1/2 demuestra que una amplia variedad de modificaciones hidrofóbicas a la proteína de erizo incrementa la actividad de la proteína cuando se compara con la proteína no modificada de tipo silvestre. Las modificaciones hidrofílicas (ácido aspártico e histidina) no tienen este efecto.

EJEMPLO 12 Evaluación de la Eficacia de Proteína de Erizo Sonic Humana Modificada Hidrofóbicamente en un Ensavo de Lesión Estrial Inducido por Malonato en Ratas La inyección de malonato, un inhibidor de deshidrogenasa de succinato de enzima mitocondrial, en el estrato de rata (equivalente roedor de primate caudado y putamen) ocasiona la degeneración de neuronas puntiagudas del medio de estrato. En seres humanos, la degeneración de neuronas puntiagudas del medio en el caudado y putamen es el aspecto patológico primario de la enfermedad de Huntington. De esta manera, la lesión de estrato inducida por malonato en ratas puede ser utilizada como modelo para probar si las proteínas de erizo hidrofóbicamente modificadas pueden evitar la muerte de las neuronas que se degeneran en la enfermedad de Huntington. Se inyectaron ratas Sprague Dawley con varias concentraciones de proteína de erizo Sonic Humana hidrofóbicamente modificada en el estrato utilizando técnicas estereotáxicas. Se realizaron inyecciones estereotáxicas (2 µL) bajo anestesia con pentobarbital de sodio (40 mg/kg) y se colocaron en las siguientes coordenadas: 0.7 mm anterior a la bregma, 2.8 mm lateral a la línea media y 5.5 mm ventral a la superficie del cráneo en la bregma. En varios tiempos (usualmente 48 h) después de la inyección de la proteína hidrofóbicamente modificada, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano y se les proporcionó una inyección estereotáxica de malonato (2 µmol en 2 µL) en las mismas coordenadas en el estrato. Cuatro días después de la inyección de malonato, las ratas fueron sacrificadas y sus cerebros removidos para análisis histológico. Se cortaron secciones coronales a través del estrato a un espesor de 25 µm y se tiñeron para actividad de oxidasa de citocromo para distinguir el tejido lesionado del no lesionado. El volumen de la lesión en el estrato se midió utilizando un sistema de análisis de imagen. El efecto de la proteína de erizo Sonic humana hidrofóbicamente modificada en el modelo de lesión de estrato de rata inducido por malonato se muestra en la Figura 14. La proteína de erizo Sonic no modificada (preparada como se describió en el Ejemplo 9), Shh miristoilada (preparada como se describió en el Ejemplo 8), y en mutantes C1II de Shh (preparado como se describió en el Ejemplo 10), todo redujeron en volumen de lesión a un grado similar en este modelo. Sin embargo, Las proteínas hidrofóbicamente modificadas (Shh miristoilada y Shh de C1II) mostraron un incremento en la potencia con relación a la proteína de erizo Sonic no modificada.

EJEMPLO 13 Derivatización de N-Qctilmaleimida de sHh-N Para una concentración final de 1 mq/ml 1) Hacer una solución de 20 mM de octilmaleimida (p. m. = 209) en DMSO (-4.2 mg/ml). 2) Diluir la solución de 10 mg/ml sHh-N (en 5 mM NaPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT 10 veces con PBS (Gibco producto # 20012-027, pH 7.2) para dar 1 mg/ml (o 50 uM) de la solución sHh-N. [NOTA: DTT, el cual compite con sHh-N para maleimida en la reacción subsecuente, es también 50 µM en esta solución]. 3) Inmediatamente agregar 1/200 de volumen de octilmaleimida a 1 mg/ml sHh-N (es decir, 5 µl/ 1ml). Esto da una relación molar de 2:1 (100 µM:50 µM) de octilmaleimida a sHh-N. 4) Mezclar esta solución con inversión moderada del tubo e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. 5) finalmente, se agregó 1/1000 vol. de 0.35 M DTT a cada tubo para barrer cualquier octilmaleimida restante y para servir como un reductor. 6) Para un control de vehículo, combinar una solución del vehículo (5 mM NaPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT) con PBS (Gibco producto # 20012-027, pH 7.2), en una relación de 1:10.

Agregar 1/400 vol. De 20 mM octilmaleimida en DMSO y 1/400 vol.

De DMSO para dar una concentración final de 50 µM de N-octilmaleimida y DMSO al 0.5%. Finalmente, agregar 1:1000 vol. De 0.35 M DTT.

Composición aproximada de la solución de 1 mq/ml de N-octilmaleimida sHh-N PBS (~pH 7.2) 50 µM sHh-N conjugado a N-octilmaleimida 50 µM DTT conjugado a N-octilmaleimida 350 µM DTT 0.5% DMSO Composición aproximada de la solución de N-octilmaleimida-vehículo PBS (~pH 7.2) 50 µM DTT conjugado a N-octilmaleimida 350 µM DTT 0.5% DMSO Para una concentración final de 3 mg/ml 1) Hacer una solución de 60 mM de octilmaleimida (p. m. = 209) en DMSO (-12.6 mg/ml). 2) Diluir el material de abastecimiento de 10 mg/ml sHh-N (en 5 mM NaPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT 10 veces con PBS (Gibco producto # 20012-027, pH 7.2) para dar una solución de 3 mg/ml (o 150 uM) de sHh-N. [NOTA: DTT, el cual compite con SHh-N para maleimida en la reacción subsecuente, también es de 150 µM en esta solución]. 3) Inmediatamente agregar 1/200 de volumen de octilmaleimida a 3 mg/ml sHh-N (es decir, 5 µl/1 m I) . Esto da una relación molar de 2:1 (300 µM:150 µ.M) de octilmaleimida a sHh-N. 4) Mezclar esta solución a través de inversión moderada del tubo e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. 5) finalmente, agregar 1/1000 vol. De 0.35 M DTT a cada tubo para barrer cualquier octilmaleimida restante y para servir como un reductor. 6) Para un control de vehículo, combinar una solución del vehículo (5 mM NaPO4 pH 5.5, 150 mM NaCI, 0.5 mM DTT) con PBS (Gibco producto # 20012-027, pH 7.2), en una relación de 3:7. Agregar 1/400 vol. de 60 mM de octilmaleimida en DMSO y 1/400 vol. de DMSO para dar una concentración final de 150 µM de N-octilmaleimida y DMSO al 0.5%. Finalmente, agregar 1:1000 vol. de 0.5 M DTT.

Composición aproximada de la solución de 3 mq/ml de N-octilmaleimida-sHh-N PBS (~pH 7.2) 150 µM sHh-N conjugado a N-octilmaleimida 150 µM DTT conjugado a N-octilmaleimida 500 µM DTT 0.5% DMSO Composición aproximada de la solución de N-octilmaleimida-vehículo PBS (~pH 7.2) 150 µM DTT conjugado a N-octilmaleimida 500 µM DTT 0.5% DMSO 0.5% DMSO REFERENCIAS I. Perrimon, N. (1995) Cell 80, 517-520 2. Johnson, R.L., y Tabin, C. (1995) Cell 81, 3 13-316 3. Riddle, R.D. et al. (1993) Cell 75, 1401-1416 4. Niswander, L., et al. (1994) Nature 3 71, 609-612 5. Laufter, E., et al. (1994) Cell 79. 993-1003 6. Roberts, D.J., et al. (1995) Development 121, 3163-3174 7. Chiang, C, et al. (1996) Nature 382, 407-413 8. Bellusci, S., et al. (1997) Development 124, 53-63 9. Marigo, V., et al. (1996) Nature 384, 176-179 10. Stone, D.M.,et al. (1996) Nature 384,129-134 II. Alcedo, J., et al. (1996) Cell 86, 221-232. 12. Domínguez, M., et al. (1996) Science 272, 1621-1625 13. Alexandre, C, et al. 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Todas las referencias citadas anteriormente y publicaciones se incorporan aquí por referencia.

Equivalentes Aunque se ha descrito un número de modalidades de esta invención, es evidente para aquellos expertos en la técnica que estas modalidades básicas pueden ser alteradas para proporcionar otras modalidades que utilicen las composiciones y procesos de esta invención. Por lo tanto, se apreciará que el alcance de esta invención incluye todas las modalidades y variaciones alternativas que sean definidas en la especificación anterior y por las reivindicaciones anexas a la misma; y la invención no está limitada por las modalidades específicas presentadas en los ejemplos.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Una proteína aislada que comprende una aminoácido N-terminal y un aminoácido C-terminal, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste de: (a) una proteína con una cisteína N-terminal que está anexa con por lo menos una porción hidrofóbica; (b) una proteína con un aminoácido N-terminal que no es una cisteína anexa o por lo menos una porción hidrofóbica; y (c) una proteína con por lo menos una porción hidrofóbica substituida para el aminoácido N-terminal.

2.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la porción hidrofóbica es un péptido que comprende al menos un aminoácido hidrofóbico.

3.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la porción hidrofóbica es un lípido.

4.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína además comprende una porción hidrofóbica substituida para, o anexa al aminoácido C-terminal.

5.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína es una proteína de señalización extracelular.

6.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el aminoácido N-terminal es un derivado funcional de una cisteína.

7.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína es modificada tanto en el aminoácido N-terminal como en el aminoácido C-terminal.

8.- La proteína de acuerdo con las reivindicaciones 4 ó 7, en donde la proteína tiene una porción hidrofóbica substituida para, o anexa a, por lo menos un intermediario de aminoácido a los aminoácidos N-terminal y C-terminal.

9.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína tiene una porción hidrofóbica substituida para, o anexa a, por lo menos un intermediario de aminoácido a los aminoácidos N-terminal y C-terminal.

10.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la porción de lípido es un ácido graso seleccionado de ácidos grasos saturados e insaturados que tienen de entre 2 y 24 átomos de carbono.

11.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína es una proteína de erizo que se obtiene de una fuente de un vertebrado.

12.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la proteína de erizo se obtiene de un ser humano o rata.

13.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el erizo vertebrado se selecciona del grupo que consiste de erizo Sonic, Indian y Desert.

14.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una vesícula en contacto con la porción hidrofóbica.

15.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la vesícula se selecciona del grupo que consiste de una membrana de célula, una micela y un liposoma.

16.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la proteína de erizo tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con cualquiera de SEC ID NO:1-4.

17.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la proteína de erizo está ausente entre 1 y aproximadamente 10 aminoácidos de su término C, cuando se compara con una proteína » de erizo de tipo silvestre.

18.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la proteína tiene por lo menos 60% de identidad de aminoácido a la proteína de erizo Sonic, Indian o Desert.

19.- Una proteína aislada de la forma: A-Cys-[Sp]-B-[Sp]-X, en donde: A es una porción hidrofóbica; Cys es una cisteína o su equivalente funcional; [Sp] es una secuencia de péptido separadora opcional; B es una proteína que comprende una pluralidad de aminoácidos y, opcionalmente, otra secuencia de péptido separadora; y X es opcionalmente otra porción hidrofóbica enlazada a un aminoácido de la proteína B.

20.- La proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la proteína aislada es una proteína de erizo.

21.- La proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 20, en donde, si X está presente, entonces es colesterol.

22.- La proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la proteína B es modificada en por lo menos otro aminoácido con al menos una porción hidrofóbica.

23.- La proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el enlace A-Cys es a través de un grupo amino de cisteína.

24.- La proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende además una vesícula en contacto con la misma.

25.- La proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la vesícula que está en contacto con la misma se selecciona del grupo que consiste de una membrana de célula, micela y liposoma.

26.- Una vesícula a la cual se anexa una pluralidad de moléculas, por lo menos dos de la pluralidad teniendo la forma de la reivindicación 19.

27.- La vesícula de acuerdo con la reivindicación 26, en donde la vesícula se selecciona del grupo que consiste de una membrana de célula, liposoma y micela.

28.- Una proteína aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo tioprolina N-terminal, dicho grupo formado haciendo reaccionar un aldehido con una cisteína N-terminal de la proteína.

29.- Una proteína aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo amida N-terminal, el grupo formado haciendo reaccionar un tioéster de ácido graso con una cisteína N-terminal de la proteína.

30.- Una proteína aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo maleimida N-terminal, el grupo maleimida N-terminal formado haciendo reaccionar un grupo maleimida con una cisteína N-terminal de la proteína.

31.- La proteína aislada de acuerdo con las reivindicaciones 28, 29 ó 30, en donde el aminoácido C-terminal de la proteína es modificado con una porción hidrofóbica.

32.- La proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la proteína es una proteína de erizo.

33.- La proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la porción hidrofóbica C-terminal es colesterol.

34.- Un método para generar un complejo de proteína multivalente que comprende el paso de enlazar, en presencia de una vesícula, una porción hidrofóbica a una cisteína N-terminal de una proteína, o un derivado funcional de la cisteína N-terminal.

35.- El método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el paso de enlazar comprende enlazar una porción de lípido, la cual se selecciona de ácidos grasos saturados e ¡nsaturados teniendo de entre 2 y 24 átomos de carbono.

36.- El método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde la proteína es una proteína de erizo.

37.- El método de acuerdo con la reivindicación 36, en donde la proteína de erizo se selecciona del grupo que consiste de erizo Sonic, Indian y Desert.

38.- El método de acuerdo con la reivindicación 36, en donde la proteína de erizo tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con cualquiera de SEC ID NOS:1-4.

39.- El método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el paso de enlazar comprende enlazar con una vesícula seleccionada del grupo que consiste de una membrana de célula, liposoma y micela.

40.- Un método para modificar una propiedad físico-química de una proteína, que comprende introducir por lo menos una porción hidrofóbica a una cisteína N-terminal de la proteína o a un equivalente funcional de la cisteína N-terminal.

41.- El método de acuerdo con la reivindicación 40, que comprende además poner en contacto la porción hidrofóbica con una vesícula.

42.- El método de acuerdo con la reivindicación 40, en donde la porción hidrofóbica es ya sea una porción de lípido seleccionada de ácidos grasos saturados e ínsaturados teniendo de entre 2 y 24 átomos de carbono o es una proteína hidrofóbica.

43.- El método de acuerdo con la reivindicación 40, en donde la proteína es una proteína de erizo.

44.- El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde la proteína de erizo se selecciona del grupo que consiste de erizo Sonic, Indian y Desert.

45.- El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde la proteína de erizo tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con cualquiera de SEC ID NOS:1-4.

46.- El método de acuerdo con la reivindicación 41, en donde el paso de poner en contacto comprende poner en contacto una vesícula seleccionada del grupo que consiste de una membrana de célula, liposoma y micela.

47.- Un complejo de proteína, producido a través del método de la reivindicación 34.

48.- Una proteína modificada, producida a través del método de la reivindicación 40.

49.- El complejo de acuerdo con la reivindicación 47, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste de gelsolina; un interferón, una interleucina, factor de necrosis tumoral, factor de estimulación de colonia de monocito, factor de estimulación de colonia de granulocito, factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago, eritropoyetina, factor de crecimiento derivado de plaqueta, hormona de crecimiento e insulina.

50.- Un método para modificar una proteína teniendo una actividad biológica y conteniendo una cisteína N-terminal, que comprende hacer reaccionar la cisteína N-terminal con un tioéster de ácido graso para formar una amida, en donde dicha modificación mejora la actividad biológica de la proteína.

51.- El método de acuerdo con la reivindicación 50, en donde la proteína es una proteína de erizo.

52.- El método de acuerdo con la reivindicación 51, en donde la proteína de erizo se selecciona del grupo que consiste de erizo Sonic, Indian, Desert y sus variantes funcionales.

53.- Un método para modificar una proteína que tiene una actividad biológica y que contiene una cisteína N-terminal, que comprende hacer reaccionar la cisteína N-terminal con un grupo maleimida, en donde dicha modificación mejora la actividad biológica de la proteína.

54.- El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde la proteína es una proteína de erizo.

55.- El método de acuerdo con la reivindicación 54, en donde la proteína de erizo se selecciona del grupo que consiste de erizo Sonic, Indian, Desert y sus variantes funcionales.

56.- Un método para modificar una proteína que tiene una actividad biológica que comprende anexar un péptido hidrofóbico a la proteína.

57.- El método de acuerdo con la reivindicación 56, en donde el péptido hidrofóbico se anexa a un aminoácido de la proteína seleccionada del grupo que consiste del aminoácido N-terminal, el aminoácido C-terminal, un intermediario de aminoácido entre el aminoácido N-terminal y el aminoácido C-terminal, y combinaciones de los anteriores.

58.- El método de acuerdo con la reivindicación 56, en donde la proteína es una proteína de erizo.

59.- El método de acuerdo con la reivindicación 58, en donde la proteína de erizo se selecciona del grupo que consiste de erizo Sonic, Indian y Desert.

60.- Un uso terapéutico de la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 20, que comprende administrar la proteína a un sujeto.

61.- Un método para tratar un trastorno neurológico en un paciente, que comprende administrar al paciente una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 20.

62.- La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína es una proteína de señalización extracelular.

63.- El método de acuerdo con la reivindicación 57, en donde el paso de anexar comprende reemplazar en por lo menos el aminoácido N-terminal de la proteína con por lo menos un aminoácido hidrofóbico.

64.- El método de acuerdo con la reivindicación 63, en donde por lo menos un aminoácido hidrofóbico es una pluralidad de residuos de isoleucina.

65.- El método de acuerdo con la reivindicación 63, que comprende además modificar químicamente por lo menos uno de los residuos de isoleucina.

66.- Una proteína aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo acetamida N-terminal, dicho grupo formado haciendo reaccionar una acetamida substituida con una cisteína N-terminal de la proteína.

67.- Una proteína aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo tiomorfolina N-terminal, dicho grupo formado haciendo reaccionar un grupo halocetona con una cisteína N-terminal de la proteína.

68.- Un método para modificar una proteína que tiene una actividad biológica y que contiene una cisteína N-terminal, que comprende hacer reaccionar la cisteína N-terminal con un grupo acetamida substituida, en donde dicha modificación mejora la actividad biológica de la proteína.

69.- El método de acuerdo con la reivindicación 68, en donde la proteína es una proteína de erizo.

70.- El método de acuerdo con la reivindicación 69, en donde la proteína de erizo se selecciona del grupo que consiste de erizo Sonic, Indian, Desert y sus variantes funcionales.

71.- Un método para modificar una proteína que tiene una actividad biológica y que contiene una cisteína N-termínal, que comprende hacer reaccionar la cisteína N-terminal con un grupo halocetona, en donde dicha modificación mejora la actividad biológica de la proteína.

72.- El método de acuerdo con la reivindicación 71, en donde la proteína es una proteína de erizo.

73.- El método de acuerdo con la reivindicación 72, en donde la proteína de erizo se selecciona del grupo que consiste de erizo Sonic, Indian, Desert y sus variantes funcionales.

74.- Un polipéptido de erizo modificado con una o más porciones lipofílicas siempre que, en el caso en donde el polipéptido de erizo sea el fragmento proteolítico N-terminal maduro de una proteína de erizo, la porción lipofílica es distinta a un esterol en residuo C-terminal.

75.- Un polipéptido de erizo modificado con una o más porciones lipofílicas en los residuos de aminoácido internos.

76.- Un polipéptido de erizo modificado con uno o más hidrocarburos aromáticos lipofílicos.

77.- El polipéptido de erizo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 74-76, en donde el polipéptido está provisto como una preparación de proteína purificada.

78.- El polipéptido de rizo de erizo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 74-76, en donde el polipéptido está provisto como una preparación farmacéutica.

79.- El polipéptido de erizo de acuerdo con la reivindicación 74 ó 75, en donde las porciones lipofílicas se seleccionan del grupo que consiste de ácidos grasos, lípidos, esteres, alcoholes, estructuras de caja o jaula e hidrocarburos aromáticos.

80.- El polipéptido de erizo de acuerdo con la reivindicación 76 ó 79, en donde el hidrocarburo aromático se selecciona del grupo que consiste de benceno, perileno, fenantreno, antraceno, naftaleno, pireno, criseno y naftaceno.

81.- El polipéptido de erizo de acuerdo con la reivindicación 80, en donde el hidrocarburo aromático es un pireno.

82.- El polipéptido de erizo de acuerdo con la reivindicación 74 ó 75, en donde las porciones lipofílicas se seleccionan del grupo que consiste de isoprenoides, terpenos e hidrocarburos pol ial icíclicos .

83.- El polipéptido de erizo de acuerdo con la reivindicación 82, en donde las porciones lipofílicas se seleccionan del grupo que consiste de adamantanos, bola de Bucky, vitaminas, glicol polietilénico, glicol oligoetilénico, diésteres de alquil fosfato (ClCl 8), -O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-alquilo.

84.- El polipéptido de erizo de acuerdo con la reivindicación 83, en donde las porciones lipofílicas se seleccionan del grupo que consiste de 1- o 2-adamantilacetilo, 3-metiladamant-1 -acetilo, 3-metil-3-bromo-1-adamantilacetilo, 1-decalinacetilo, alcanforacetilo, alcanfanacetilo, noradamantilacetilo, norbornanacetilo, biciclo[2.2.2]-oct-5-enacetilo, 1 -metoxibiciclo[2.2.2]-oct-en-2-carbonilo, cis-5-norbornen-endo-2,3-dicarbonilo, 5-norbornen-2-ilacetilo, (1 R)-(-)-mirtentanacetilo, 2-norbornanacetilo, anti-3-oxo-triciclo[2.2.1.0<2,6>]-heptan-7-carbonilo, decanoilo, dodecanoilo, dodecenoilo, tetradecadienoilo, decinoilo y dodecinoilo.

85.- El polipéptido de erizo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 74-76, en donde la porción lipofílica o porciones potencian la actividad biológica del polipéptido con relación al polipéptido de erizo modificado.

86.- Un método para alterar el estado de crecimiento de una célula sensible a señalización de erizo, que comprende poner en contacto la célula con un polipéptido de erizo modificado lipofílico de cualquiera de las reivindicaciones 74-76.