ES2243018T3

ES2243018T3 - Composiciones y metodos de proteinas erizo modificadas hidrofobamente.

Info

Publication number: ES2243018T3
Application number: ES98964702T
Authority: ES
Inventors: R. Blake Pepinsky; Chenhui Zeng; Darren P. Baker; Dingyi Wen; Kevin P. Williams; Ellen A. Garber; Kathryn L. Strauch; Frederick R. Taylor; Paul H. Weinrub; Russell C. Petter; Alphonse Galdes; Jeffrey Porter
Original assignee: Curis Inc; Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Curis Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-03
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2018-12-03
Also published as: ATE295372T1; HUP0100535A2; MXPA00005494A; EE200000308A; WO1999028343A9; CA2309806A1; IS2163B; TR200001612T2; JP2001525336A; IS5499A; HK1030953A1; WO1999028343A3; CZ20002008A3; DK1036092T3; JP4289788B2; CN1294595A; WO1999028343A2; AU1996699A; BR9815142A; NZ504752A

Abstract

Una proteína aislada que comprende un aminoácido C- terminal, en el que la proteína es una forma de la proteína erizo elegida de entre: (a) una proteína con una cisteína N-terminal a la que se ha agregado al menos una porción hidrófoba. (b) una proteína con un aminoácido N-terminal que no es una cisteína al que se ha agregado al menos una porción hidrófoba, y (c) una proteína con al menos una porción hidrófoba sustituida por el aminoácido N-terminal, en la que la proteína erizo no está modificada con un esterol en el aminoácido C-terminal y en la que la porción hidrófoba se elige de un péptido que comprende al menos un aminoácido hidrófobo o una porción lipídica.

Description

Composiciones y métodos de proteínas erizo modificadas hidrófobamente.

Resumen de la invención

Se sabe que ciertas proteínas muestran una mayor actividad biológica cuando se unen a otras porciones, bien mediante la formación de complejos multiméricos, donde las proteínas tienen la oportunidad de actuar conjuntamente, o a través de otras alteraciones de las propiedades fisicoquímicas de la proteína, tales como la absorción, la biodistribución o la semivida. Por tanto, un área actual de la investigación en biotecnología conlleva el desarrollo de procedimientos para modificar las propiedades fisicoquímicas de las proteínas de modo que puedan administrarse en cantidades más pequeñas, con menos efectos secundarios, mediante nuevas vías y con menor coste.

Por ejemplo, la afinidad de unión de cualquier proteína aislada (tal como un ligando con respecto a su receptor afín) puede ser baja. Sin embargo, las células expresan normalmente de cientos a miles de copias de un receptor de superficie en particular y muchas de las interacciones entre ligando y receptor tienen lugar simultáneamente. Cuando muchas moléculas de superficie se ven involucradas en la unión, la afinidad efectiva total es mayor que la suma de las afinidades de unión de las moléculas individuales. Por el contrario, cuando las proteínas ligando se eliminan de la superficie celular y se purifican o aíslan mediante técnicas de ADN recombinante para su uso, p.ej. como agentes terapéuticos, éstas actúan como monómeros y pierden la ventaja de actuar conjuntamente con muchas otras copias de la misma proteína estrechamente asociadas sobre la superficie de una célula. Así aislada, la baja afinidad de una proteína por su receptor puede convertirse en un grave perjuicio para su eficacia como agente terapéutico para bloquear una vía de unión particular, ya que tiene que competir contra las interacciones célula-célula de alta avidez. El tratamiento eficaz puede requerir la administración constante y/o altas dosis. Estos inconvenientes podrían evitarse, sin embargo, si se pudiera encontrar una manera de proporcionar formas multiméricas de una proteína aislada.

De forma similar, sería útil modificar otras propiedades fisicoquímicas de proteínas biológicamente activas para que, por ejemplo, se induzca a una proteína para que se asocie a la membrana, situándola así en el sitio de administración y mejorando su capacidad para unirse o interaccionar de cualquier otra forma, con una diana concreta. Dichos cambios también pueden afectar a la distribución farmacológica de la proteína.

Se han desarrollado varios procedimientos para generar proteínas acopladas. Muchos de estos procedimientos no son altamente específicos, es decir, no dirigen el punto de acoplamiento hacia ningún sitio particular de la proteína. Como resultado, los agentes de acoplamiento convencionales pueden atacar sitios funcionales o bloquear de forma estérica sitios activos, haciendo que la proteína acoplada se vuelva inactiva. Además, los productos acoplados pueden orientarse para que los sitios activos no puedan actuar sinérgicamente, haciendo así que los productos no sean más eficaces que la proteína monomérica sola.

Como motivación adicional para encontrar nuevos métodos de modificación de proteínas, las proteínas con un residuo de cisteína en el extremo N-terminal son sensibles a la oxidación o a otras modificaciones químicas que pueden comprometer la actividad o la semivida. Además, ciertos tampones usados habitualmente en la purificación de proteínas tienen componentes o impurezas que pueden modificar la cisteína N-terminal. Incluso cuando estos tampones se evitan, la cisteína N-terminal se modifica con el tiempo, tal vez debido a agentes químicos presentes en los viales de almacenamiento o en el aire. En consecuencia, los tampones de formulación deben incluir un agente protector tal como el ditiotreitol, para evitar la modificación o la oxidación de la cisteína. Sin embargo, los agentes protectores tienen una actividad biológica significativa por sí mismos y pueden, por tanto, complicar los experimentos y afectar negativamente a la utilidad terapéutica de la formulación.

El documento WO-A-9740852 se refiere a un procedimiento para modificar un péptido antigénico para incrementar la afinidad de unión de un complejo MHC. Sin embargo, el documento WO-A-9740852 no hace ninguna descripción de la modificación de un péptido o una proteína para mejorar su actividad.

En PNAS vol. 94, págs: 6116-20 (junio de 1997) se describe la palmitoilación de subunidades de la proteína G en la Cys cercana al extremo N-terminal, pero no se hace ninguna descripción de la modificación de un péptido o una proteína para mejorar la actividad de los péptidos o las proteínas.

En Biochem. J., vol. 328 (1), pags: 23-31 (noviembre de 1997) se describe la unión de liposomas a subunidades de la proteína G pero no se hace ninguna descripción de la modificación de un péptido o una proteína para mejorar su actividad.

En Biochemistry, vol. 33 (51), págs: 15469-82 (1994) se describen proteínas modificadas tales como la BPTI, pero no se hace ninguna descripción de la modificación de péptidos o proteínas para mejorar su actividad.

El documento WO-A-9616668 describe las proteínas erizo pero, de nuevo, no hace ninguna descripción de la modificación de péptidos o proteínas para mejorar su actividad.

El documento WO-A-9830576 describe la unión de secuencias erizo a colesterol a través de una Cys N-terminal, pero no hace ninguna descripción de la modificación de péptidos para mejorar su actividad.

En consecuencia, hay una necesidad en la técnica de desarrollar medios más específicos para obtener productos derivatizados o formas multiméricas de los mismos con objeto de alterar las propiedades de la proteína para afectar a su estabilidad, potencia, farmacocinética y farmacodinamia.

Resumen de la invención

En un aspecto de la invención, hemos resuelto el problema de encontrar una manera de fabricar convenientemente formas modificadas de proteínas biológicamente activas. Los procedimientos de la invención pueden utilizarse para derivar formas multiméricas de las proteínas y/o pueden utilizarse para cambiar sus propiedades fisicoquímicas. Hemos encontrado que modificar una proteína erizo (es decir, añadir o agregar una porción hidrófoba a un aminoácido existente o sustituir una porción hidrófoba por un aminoácido) para introducir la porción hidrófoba sobre la proteína puede aumentar su actividad biológica y/o su estabilidad. Por ejemplo, una cisteína N-terminal puede utilizarse como una "diana" conveniente para unir una porción hidrófoba (p.ej., un lípido) y modificar así proteínas biológicamente activas.

Alternativamente, una porción hidrófoba puede unirse a un residuo C-terminal de una proteína erizo biológicamente activa para modificar la actividad de la proteína. Una porción hidrófoba también puede agregarse a un residuo aminoácido interno para mejorar la actividad de la proteína, con tal que la modificación no afecte a la actividad de la proteína, p.ej., a su capacidad para unirse a un receptor o a un correceptor, ni afecte a su estructura tridimensional. Preferiblemente, la porción hidrófoba se agrega a un residuo aminoácido interno que se encuentra en la superficie de la proteína cuando la proteína está en su forma nativa. La modificación hidrófoba de la invención proporciona un procedimiento útil genéricamente para crear proteínas con propiedades fisicoquímicas alteradas en comparación con las formas no modificadas.

Esta invención se originó a partir del descubrimiento de que cuando expresábamos proteínas erizo Sónico en células de insecto y de mamífero, la forma madura de la proteína (residuos 1-174 de la secuencia madura), además de tener colesterol en el extremo C-terminal, también está derivatizada en su extremo N-terminal con un ácido graso. Significativamente, esta forma de la erizo presentaba un aumento de la potencia de unas 30 veces en comparación con la erizo soluble no modificada en un ensayo in vitro.

Un aspecto de la invención es, por tanto, una proteína erizo aislada que comprende un aminoácido N-terminal y un aminoácido C-terminal, en la que la proteína se elige del grupo formado por una proteína con una cisteína N-terminal a la que se agrega al menos una porción hidrófoba, una proteína con un aminoácido N-terminal que no es una cisteína a la que se agrega una porción hidrófoba y una proteína con una porción hidrófoba sustituida por el aminoácido N-terminal. La porción hidrófoba puede ser un péptido hidrófobo o cualquier lípido o cualquier otra porción química que sea hidrófoba.

La proteína puede modificarse en su aminoácido N-terminal y, preferiblemente, el aminoácido N-terminal es una cisteína o un derivado funcional de la misma. La proteína puede modificarse en su aminoácido C-terminal o tanto en el aminoácido N-terminal como en el C-terminal o, al menos, en un aminoácido interno a (es decir, intermedio entre) los aminoácidos N-terminal y C-terminal, o varias combinaciones de estas configuraciones. La proteína puede ser una proteína de señalización extracelular y en las formas de realización preferidas, la proteína es una proteína erizo que puede obtenerse a partir de un vertebrado, más preferiblemente puede obtenerse de un ser humano e incluye erizo Sónico, indio y del desierto.

Otra realización es una proteína erizo aislada de la forma: A-Cys-[Sp]-B- X, en la que

A es una porción hidrófoba;

Cys es una cisteína o un equivalente funcional de la misma;

[Sp] es una secuencia peptídica espaciadora opcional;

B es una proteína erizo que comprende una pluralidad de aminoácidos que incluye al menos una secuencia peptídica espaciadora opcional y

X es, opcionalmente, otra porción hidrófoba unida a la proteína.

Esta proteína erizo puede modificarse en al menos en otro aminoácido con al menos una porción hidrófoba. En otras realizaciones, la proteína está en contacto con una vesícula elegida del grupo formado por una membrana celular, micela o liposoma.

Otro aspecto de la invención es una proteína erizo aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo tioprolina N-terminal, el grupo tioprolina formado mediante la reacción de un aldehído con una cisteína N-terminal de la proteína. Otro aspecto adicional de la invención es una proteína erizo aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo amida N-terminal, el grupo amida formado mediante la reacción de un tioéster de un ácido graso con una cisteína N-terminal de la proteína. Otro aspecto más de la invención es una proteína erizo aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo maleimida N-terminal, el grupo maleimida formado mediante la reacción de un grupo maleimida con una cisteína N-terminal de la proteína. Otro aspecto más de la invención es una proteína erizo aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo acetamida N-terminal. Otro aspecto adicional más de la invención es una proteína erizo aislada que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo tiomorfolino N-terminal.

En estas realizaciones, el aminoácido C-terminal de la proteína puede modificarse con una porción hidrófoba.

Los procedimientos de la invención incluyen un procedimiento para generar un complejo proteico multivalente que comprende el paso de unir, en presencia de una vesícula, una porción hidrófoba a una cisteína N-terminal de una proteína o a un equivalente funcional de la cisteína N-terminal. El paso de la unión puede incluir la unión de una porción lipídica que se elige de entre ácidos grasos saturados e insaturados que tienen entre 2 y 24 átomos de carbono. La proteína puede ser una proteína erizo elegida del grupo formado por erizo Sónico, indio y del desierto.

Otro procedimiento más de la invención es un procedimiento para modificar una propiedad fisicoquímica de una proteína erizo que comprende la introducción de al menos una porción hidrófoba en una cisteína N-terminal de la proteína o en un equivalente funcional de la cisteína N-terminal. La porción hidrófoba puede ser una porción lipídica elegida de entre ácidos grasos saturados e insaturados que tienen entre 2 y 24 átomos de carbono. También puede ser una proteína hidrófoba. La proteína modificada utilizando este procedimiento puede ser una proteína erizo elegida del grupo formado por erizo Sónico, indio y del desierto. Un complejo proteico producido mediante estos procedimientos también está englobado en la presente invención.

Otro procedimiento es un procedimiento para modificar una proteína erizo (tal como una proteína de señalización extracelular) que tiene una cisteína N-terminal. Este procedimiento comprende la reacción de la cisteína N-terminal con un tioéster de un ácido graso para formar una amida, en el cual dicha modificación mejora la actividad biológica de la proteína.

Otro procedimiento más es un procedimiento para modificar una proteína erizo que tiene una cisteína N-terminal, que comprende la reacción de la cisteína N-terminal con un grupo maleimida, en el cual dicha modificación mejora la actividad biológica de la proteína. Otras realizaciones de este procedimiento conllevan la reacción de la cisteína N-terminal, con un grupo aldehído, un grupo acetamida o un grupo tiomorfolino.

Otro procedimiento adicional es un procedimiento para modificar una proteína erizo que comprende la adición de un péptido hidrófobo a la proteína. La porción hidrófoba puede agregarse a un aminoácido de la proteína elegido del grupo formado por el aminoácido N-terminal, el aminoácido C-terminal, un aminoácido intermedio entre el aminoácido N-terminal y el aminoácido C-terminal y combinaciones de los anteriores. En una realización, la presente invención proporciona polipéptidos erizo que se modifican con porciones lipófilas. En ciertas realizaciones, las proteínas erizo de la presente invención son modificadas por una porción lipófila o por porciones de uno o más sitios internos del dominio extracelular maduro procesado y pueden o no derivatizarse también con porciones lipófilas en los residuos N o C terminales del polipéptido maduro. En otras realizaciones el polipéptido se modifica en el residuo C-terminal con una porción hidrófoba distinta de un esterol. En otras realizaciones más, el polipéptido se modifica en el residuo N-terminal con un grupo lipófilo cíclico (preferiblemente policíclico). También se contemplan diversas combinaciones de los anteriores. Un uso de la invención es un uso de una proteína erizo de la invención modificada hidrófobamente para la fabricación de un medicamento para tratar una alteración neurológica.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1, Caracterización de una forma palmitoilada de erizo Sónico (Shh). Una forma ligada de Shh humana se purificó mediante inmunoafinidad de células de insecto High Five^{TM} y se analizó mediante SDS-PAGE. La proteína se tiñó con azul de Coomasie (carril a, marcadores preteñidos de alto peso molecular, Life Technologies, Inc.; carril b, Shh soluble [0,6 \mug]; carril c, Shh ligada [0,6 \mug]; carril d, mezcla de Shh soluble y ligada [0,6 \mug de cada]). La capacidad de la Shh y de la Ihh (erizo indio) para modificarse con ácido palmítico se probó utilizando un sistema acelular descrito en el ejemplo 2. Se incubaron durante una hora formas solubles de proteína erizo (3 \mug/muestra) con microsomas de hígado de rata, ATP, Coenzima A y ácido palmítico tritiado, y luego se analizó la palmitoilación mediante SDS-PAGE. Las muestras que aparecen en los carriles e a i se visualizaron mediante fluorografía (carril e; Shh, carril f, des 1-10 Shh; carril g, Cys-1 a Ser Shh; carril h, Ihh; carril i, Shh con cola de His) y las de los carriles j a k, mediante tinción con azul de Coomasie (carril j, Shh; carril k, des1-10 Shh).

Fig. 2. Análisis de Shh purificada mediante ESI-MS. Se analizaron mediante ESI-MS Shh soluble humana (A) y Shh ligada humana (B) en un espectrómetro de masas Micromass Quattro II triple cuadripolar, equipado con una fuente de ionización por electrodispersión. Todos los datos del espectro de masas por electro dispersión se adquirieron y se almacenaron en modo perfil y se procesaron utilizando el sistema de análisis de datos Micromass MassLynx. Se muestran los espectros de masas moleculares (las asignaciones de las masas fueron generadas por el sistema de
datos).

Fig. 3, Análisis de la Shh ligada mediante HPLC en fase inversa. La Shh humana soluble (A), la Shh humana ligada de células de insecto High Five^{TM} (B), la Shh humana ligada de células EBNA-293 (C) y la Shh de rata asociada a células (D) se sometieron a HPLC en fase inversa en una columna Vydac C_{4} de calibre estrecho (2,1 mm de diámetro interno x 250 mm). La columna se elaboró con un gradiente de acetonitrilo de 0 a 80% en ácido trifluoroacético al 0,1% de 30 minutos, a 0,25 ml/min y el efluente se monitorizó utilizando un sistema detector de fotodiodos de
200-300 nm (datos mostrados a 214 nm). Las fracciones de los picos se recogieron y se caracterizaron posteriormente mediante SDS-PAGE y MS (datos resumidos en las tablas 3, 4 y 5).

Fig. 4, Caracterización de Shh mediante LC-MS. La Shh humana ligada (A) y la Shh soluble ligada (B) se alquilaron con 4-vinilpiridina (1 \muL/100 \mul de muestra en cloruro de guanidinio 6 M, EDTA 1 mM, Tris HCl 100 mM a pH 8.0), se precipitaron con etanol y se digirieron con endoproteinasa Lys-C en Tris HCl 50 mM a pH 7.0, urea 2 M en una proporción de enzima: proteína de 1:5, como se ha descrito previamente (27). Los productos de la digestión se analizaron mediante HPLC en fase inversa con un espectrómetro de masas de ionización por electrodispersión Micromass Quattro II triple cuadripolar. Los barridos se adquirieron a lo largo de la sesión y se procesaron utilizando el sistema de análisis de datos Micromass MassLynx (se muestran los cromatogramas totales de iones de las sesiones). Los asteriscos indican las posiciones del péptido N-terminal, que se verificaron por MALDI PSD o por secuenciación de Edman del N-terminal.

Fig. 5. Secuenciación del péptido N-terminal de la Shh mediante medición MALDI PSD. El péptido N-terminal del tratamiento de la Shh ligada humana con endoproteinasa Lys-C se sometió a una medición MALDI PSD en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo Voyager-DETM STR. El patrón de fragmentación predicho y la nomenclatura de los iones del fragmento detectado se muestran en la parte superior del panel (PA, ácido palmítico; 4vp, grupo 4-piridiletilo). El resto de la figura muestra el espectro de masas molecular producido por el análisis. Los iones relevantes se denotan utilizando la nomenclatura definida en el esquema. La masas calculadas (en Da) para b_{1}-b_{8} son 447,3, 504,3, 601,4, 658,4, 814,5, 871,5, 1018,6, y 1075,6, respectivamente. Para y_{1}-y_{8}, las masas (en Da) son 147,1, 204,1, 351,2, 408,2, 564, 3, 621,3, 718,4, y 775,4 respectivamente. La masa calculada para z_{8} es 758,4 Da. La masa observada para b_{8} contiene 18 Da más por el agua añadida.

Fig. 6. Aumento de la actividad de la Shh ligada en el experimento con C3H10T1/2. Las potencias relativas de las Shh humanas soluble y fijada solas (A) o en presencia del Ac monoclonal neutralizante antierizo Mab 5E1 (B) se evaluaron en células C3H10T1/2 midiendo la inducción de fosfatasa alcalina. Los números presentados reflejan las medias de las determinaciones duplicadas. (A) Se incubaron diluciones seriadas 1:2 de Shh soluble (6) y ligada (8) con las células durante 5 días y los niveles resultantes de actividad fosfatasa alcalina se midieron a 405 nm utilizando fosfato de p-nitrofenilo, el sustrato cromogénico de la fosfatasa alcalina. (B) Se incubaron diluciones seriadas del Mab 5E1 con Shh soluble (5 \mug/ml: barras negras) o con Shh ligada (0,25 \mug/ml: barras grises) o se añadió vehículo control sin Shh (barra blanca) durante 30 min y después se sometieron a análisis en el experimento con C3HT101/2.

Fig. 7. Análisis de Shh en un ensayo de unión al receptor. La potencia relativa de la Shh soluble (6) y ligada (8) para unirse a patched se evaluó en células EBNA-293 transfectadas con patched mediante FACS. Se incubaron diluciones seriadas de las muestras estudiadas con las células EBNA-293; se lavaron y después se midió el porcentaje de unión mediante la capacidad de las muestras para competir por la unión a las células con Ig-Shh. La Ig-Shh unida se cuantificó mediante la fluorescencia media utilizando una sonda de anticuerpo anti-Ig marcado con FITC para la lectura. Los datos se ajustaron a una curva hiperbólica mediante regresión no lineal.

Fig. 8. Alineamiento del fragmento N-terminal de las proteínas erizo humanas. Las proteínas erizo humanas de 20 kDa (erizo Sónico "Shh", del desierto "Dhh" e indio "Ihh") se alinean con respecto a su cisteína N-terminal (Cys-1 en la secuencia madura). Esta cisteína es, normalmente, la Cys 24 en la proteína precursora completa de Shh, debido a la presencia de la secuencia de señal natural que es eliminada durante la secreción. La posición real de la cisteína puede variar ligeramente debido a diferencias entre especies.

Fig. 9. Secuencia consenso del fragmento N-terminal de las proteínas erizo humanas.

Fig. 10. Efecto de la longitud de la cadena lipídica sobre la actividad de la erizo Sónico humana. Se sintetizó una serie de proteínas erizo modificadas con ácidos grasos de acuerdo con la presente invención y el efecto de la longitud de la cadena del ácido graso sobre la actividad de la proteína erizo se analizó utilizando el experimento de inducción de fosfatasa alcalina en C3H10T1/2 descrito en esta invención. Los resultados se representan en forma de gráfico de barras.

Fig. 11. Experimento de C3H10T1/2 con erizo Sónico humana palmitoilada, miristoilada, lauroilada, decanoilada y octanoilada. Se realizó un experimento en células C3H10T1/2 con erizo Sónico humana palmitoilada, lauroilada, decanoilada y octanoilada formulada en Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5.5, NaCl 150 mM, octilglucósido al 1%, DTT 0,5 mM y erizo Sónico humana miristoilada formulada en NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM, midiendo la inducción de fosfatasa alcalina. Los números representan las medias de las determinaciones duplicadas. Se incubaron diluciones seriadas 1:3 de erizo Sónico humana palmitoilada (\circ), miristoilada (\bullet), lauroilada (\boxempty) decanoilada (\ding{110}) octanoilada (\triangle) y no modificada (\ding{115} y X) con las células durante 5 días y los niveles resultantes de actividad fosfatasa alcalina se midieron a 405 nm utilizando fosfato de p-nitrofenilo, el sustrato cromogénico de la fosfatasa alcalina. Las proteínas palmitoiladas, miristoiladas, lauroiladas y decanoiladas se analizaron en un experimento con la proteína no modificada que se representa como (\ding{115}), mientras que la proteína octanoilada se analizó en otro experimento con la proteína no modificada que se representa como (X). La flecha del eje y indica el nivel de ruido de fondo de la fosfatasa alcalina en ausencia de proteína erizo añadida.

Fig. 12. Estructuras genéricas de diversas formas de erizo modificadas hidrofóbicamente. (A) Derivado amídico graso donde R= una cadena hidrocarbonada de un ácido graso; (B) derivado tiazolidínico donde R= hidrocarburo; (C) sustitución de aminoácido donde R= una cadena lateral hidrófoba del aminoácido; (D) derivado de maleimida donde R= un hidrocarburo; (E) SH= tiol libre en la cisteína N-terminal de la erizo natural; (F) derivado de yodoacetamida donde R_{1}= un hidrocarburo y R_{2}= H o un hidrocarburo y (G) derivado de tiomorfolinilo donde R= un hidrocarburo. Para todas las estructuras, HH = erizo.

Fig. 13. Potencia relativa de diversas formas de erizo modificadas hidrófobamente en el experimento con C3H10T1/2 La CE_{50} (2 \mug/ml) de erizo Sónico humana natural no modificada se designa como 1 X. La potencia de las otras proteínas se expresa como el cociente de la EC50 de la proteína natural dividida por la EC50 de la proteína no modificada. Las modificaciones son en el extremo N-terminal de la proteína, a menos que se designe de otra forma.

Fig. 14. Potencia relativa de erizo Sónico humana no modificada, miristoilada y mutante C1II en un experimento de lesión estriatal inducida por malonato en ratas. La figura muestra la reducción del volumen de la lesión inducida por malonato, que resulta de la administración de erizo Sónico no modificada, miristoilada o mutante C1II al cuerpo estriado de rata.

Fig. 15. Ilustra las actividades específicas de los polipéptidos erizo modificados con maleimida o no modificados.

Descripción detallada de la invención

Esta invención está basada, en parte, en el descubrimiento de que la erizo Sónico humana, expresada como una construcción completa tanto en células de insecto como de mamífero, tiene un grupo palmitoilo hidrófobo agregado al amino \alpha de la cisteína N-terminal. Este es el primer ejemplo, del que los inventores estén al corriente, de una proteína de señalización extracelular que esté modificada de semejante forma y, al contrario que las modificaciones de ácido palmítico unido a un tiol, cuya unión es fácilmente reversible, es probable que esta nueva porción palmitoilo unida al N sea muy estable por analogía con la modificación con ácido mirístico.

Como consecuencia directa de este descubrimiento inicial, los inventores han encontrado que el aumento de la naturaleza hidrófoba de una proteína erizo puede incrementar la actividad biológica de la proteína. En particular, los inventores han encontrado que agregar una porción hidrófoba a una proteína erizo puede mejorar la actividad de la proteína. Los inventores han encontrado que la cisteína N-terminal de las proteínas erizo biológicamente activas no sólo proporciona un sitio conveniente para agregar una porción hidrófoba y modificar así las propiedades fisicoquímicas de la proteína, sino que las modificaciones de la cisteína N-terminal también pueden aumentar la estabilidad de la proteína. Además, la adición de una porción hidrófoba a un residuo aminoácido interno en la superficie de la estructura de la proteína mejora la actividad de la proteína.

Un aspecto de la presente solicitud está dirigido al descubrimiento de que, además de aquellos efectos observados mediante la adición de colesterol al extremo C-terminal de los fragmentos extracelulares de la proteína, al menos ciertas actividades biológicas de los productos del gen erizo se potencian inesperadamente mediante la derivatización de la proteína con porciones lipófilas en otros sitios de la proteína o por otras porciones aparte del colesterol. Ciertos aspectos de la invención están dirigidos a preparaciones de polipéptidos erizo que se modifican en otros sitios distintos de los residuos N-terminal o C-terminal de la forma procesada natural de la proteína o que se modifican en esos residuos terminales con porciones lipófilas distintas de un esterol en el extremo C-terminal o de un ácido graso en el extremo N-terminal.

Como se describe en las publicaciones PCT de los documentos WO 95/18856 y WO 96/17924, los polipéptidos erizo, en general, son útiles en la reparación in vitro e in vivo o en la regulación del rendimiento funcional de una amplia gama de células, tejidos y órganos y tienen usos terapéuticos que van desde la protección y regeneración neurológicas, la mejora de la función neural, la regulación de la formación y reparación de huesos y cartílagos, la regulación de la espermatogénesis, la regulación del pulmón, el hígado y otros órganos procedentes del intestino primitivo, la regulación de la función hematopoyética, etc. Por consiguiente, los procedimientos y composiciones de la presente invención incluyen el uso de polipéptidos erizo derivatizados para todos los usos en los que se ha implicado a las proteínas erizo. Además, los procedimientos en cuestión pueden llevarse a cabo en células que se encuentran en cultivo (in vitro) o en células de un animal completo (in vivo).

En un aspecto, la presente invención proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden, como ingrediente activo, un polipéptido erizo que es derivatizado por una o más porciones lipófilas tales como las que se describen en esta invención.

Los tratamientos en cuestión con erizo son eficaces tanto en pacientes humanos como animales. Los pacientes animales a los que se puede aplicar la invención se extienden tanto a animales domésticos como al ganado, utilizados tanto como mascotas como con fines comerciales. Son ejemplos los perros, los gatos, el ganado vacuno, los caballos, las ovejas, los cerdos y las cabras.

Las proteínas erizo son una familia de proteínas de señalización extracelular que regulan diversos aspectos del desarrollo embrionario, tanto en vertebrados como en invertebrados (para consultar revisiones, véase 1, 2). La proteína erizo mejor caracterizada es la erizo Sónico (Shh), implicada en la generación del patrón anteroposterior, la formación de un pliegue ectodérmico apical, del mesodermo del tubo digestivo posterior, del desarrollo de la columna vertebral, los miembros distales, las costillas y el pulmón y en la inducción de tipos de células ventrales en la columna vertebral, el cerebro posterior y el cerebro anterior (3-8). Aunque el mecanismo de acción de las proteínas erizo no se conoce completamente, los datos bioquímicos y genéticos más recientes sugieren que el receptor de la Shh es el producto del gen supresor tumoral, patched (9,10) y que otras proteínas, smoothened (10, 11), Cirbitus interruptus (12, 13) y fused (14) están implicadas en la vía de señalización de la erizo.

La Shh humana se sintetiza como una proteína precursora de 45 kDa que se escinde autocatalíticamente para dar: (I) un fragmento N-terminal de 20 kDa responsable de toda la actividad conocida de señalización de la erizo (ID SEC Nº 1-4) y (II) un fragmento C-terminal de 25 kDa que contiene la actividad de autoprocesamiento (15-17). El segmento N-terminal está formado por los residuos aminoácidos 24-197 de la secuencia precursora completa.

El fragmento N-terminal permanece asociado a la membrana durante la adición de colesterol a su extremo C-terminal (18, 19). Este colesterol es crucial para restringir la localización tisular de la señal de la proteína erizo. La adición del colesterol está catalizada por el dominio C-terminal durante la etapa del procesamiento.

Definiciones

Ahora se describirá la invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada en la que se incluyen las siguientes definiciones:

"aminoácido": unidad monomérica de un péptido, un polipéptido o una proteína. Existen veinte aminoácidos que se encuentran en péptidos, polipéptidos y proteínas naturales, todos ellos isómeros L. El término también incluye análogos de los aminoácidos e isómeros D de los aminoácidos proteicos y de sus análogos.

"proteína": cualquier polímero formado esencialmente por cualquiera de los 20 aminoácidos. Aunque se suele usar el término "polipéptido" para referirse a polipéptidos relativamente grandes y "péptido" para polipéptidos pequeños, en esta disciplina el uso de estos términos varía y uno y otro se solapan. En la presente invención el término "proteína" se refiere a péptidos, proteínas y polipéptidos, a menos que se indique lo contrario.

"extremo N-terminal" se refiere al primer aminoácido (aminoácido número 1) de la forma madura de una proteína.

"cisteína N-terminal": se refiere al residuo de aminoácido (número 1) tal como aparece en la ID SEC Nº 1-4. También se refiere a cualquier cisteína en la posición 1 de cualquier otra proteína, o a equivalentes funcionales de esta cisteína (véase la Sección IV).

la secuencia "espaciadora" se refiere a una secuencia corta, que puede ser de tan sólo un aminoácido, que puede estar insertada entre un aminoácido para ser modificada hidrófobamente (como, por ejemplo, la cisteína N-terminal o un equivalente funcional) y el resto de la proteína. Un espaciador está diseñado para proporcionar una separación entre la modificación hidrófoba (p. ej. la cisteína N-terminal modificada) y el resto de la proteína, a fin de evitar que la modificación interfiera con la función de la proteína o facilitar que ésta (p. ej., la cisteína N-terminal) se una con un lípido, vesícula u otra porción hidrófoba. Por lo tanto, si una proteína se modifica en su cisteína N-terminal y en un aminoácido de otro sitio, puede haber dos o más secuencias espaciadoras.

proteína "ligada" se refiere a una proteína modificada hidrófobamente de acuerdo con la invención.

"complejo proteico polivalente": se refiere a un conjunto de proteínas (es decir, una o más). Un lípido u otra porción hidrófoba se une a al menos una de las proteínas del conjunto. El lípido u otra porción hidrófoba puede estar opcionalmente en contacto con una vesícula. Si una proteína carece de un lípido u otra porción hidrófoba, entonces la proteína puede unirse o formar un enlace transversal con una proteína que tenga un lípido u otra porción hidrófoba. Cada proteína pueden ser iguales o distinta y cada lípido u otra porción hidrófoba puede ser igual o distinta.

"vesícula": se refiere a cualquier agregado de moléculas lipófilas. La vesícula puede tener un origen biológico (p. ej. una bicapa lípídica, tal como una membrana celular o una preparación con detergente derivada del ácido cólico) o no biológico (p. ej. una vesícula detergente no biológica tal como se describe en la Sección VI). La forma, tipo y configuración de la vesícula no pretende limitar el alcance de esta invención.

El "equivalente funcional" de un residuo aminoácido (p. ej. de una cisteína N-terminal) es (i) un aminoácido que tiene propiedades reactivas similares a las del residuo aminoácido que ha sido reemplazado por el equivalente funcional, (ii) un aminoácido de un ligando de un polipéptido de la invención que presenta unas propiedades de unión a porciones hidrófobas (p. ej. lípidos) similares al residuo aminoácido que ha sido reemplazado por el equivalente funcional, (iii) una molécula distinta de un aminoácido que presenta unas propiedades de unión a porciones hidrófobas (p. ej. lípidos) similares al residuo aminoácido que ha sido reemplazado por el equivalente funcional.

"fusión genética" se refiere a un enlace covalente y colineal de dos o más proteínas o fragmentos de las mismas a través de sus esqueletos peptídicos individuales por medio de la expresión genética de una molécula polinucleótida que codifica estas proteínas.

Una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" es una fusión de una primera secuencia de aminoácidos que codifican un polipéptido erizo con una segunda secuencia de aminoácidos que define un dominio extraño y no homólogo sustancialmente a cualquier dominio de la proteína hh. Una proteína quimérica puede presentar un dominio extraño que se encuentre (aunque sea en otra proteína) en un organismo que también exprese la primera proteína, o puede tratarse de una fusión "interespecífica", "intergénica", etc. de estructuras proteicas, expresada por organismos de diversos tipos. En general, una proteína de fusión puede estar representada por la fórmula general (X),-(hh),-(Y)n, donde hh representa toda o una porción de la proteína erizo, X e Y representan independientemente secuencias de aminoácidos que no se encuentran de forma natural como cadenas polipeptídicas contiguas a la secuencia erizo, m es un número entero mayor o igual a 1, y cada aparición de n es, independientemente, 0 o un número entero mayor o igual a 1 (preferentemente, n y m no son mayores de 5 o 10).

"mutante": cualquier cambio en el material genético de un organismo, en particular cualquier cambio (es decir, deleción, sustitución, adición o alteración) en una secuencia polinucleotídica natural o cualquier cambio en una proteína natural.

"natural": la secuencia polinucleótida natural de un exón de una proteína o una porción del mismo, o una secuencia proteica, o una porción de la misma, respectivamente, tal como existe normalmente in vivo.

"condiciones convencionales de hibridación": condiciones de temperatura y de salinidad equivalentes sustancialmente a SSC 0,5-5 X y 65ºC tanto para la hibridación como para los lavados. El término "condiciones convencionales de hibridación", tal como se usa en esta invención, es una definición operativa que engloba una gama de condiciones de hibridación. Véase también Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, Secciones 6.3.1-6.3.6, (1989).

"secuencia de control de la expresión": una secuencia de polinucleótidos que controla y regula la expresión de genes cuando esté unida operativamente a esos genes.

"unido operativamente": una secuencia de polinucleótido (ADN; ARN) está unida operativamente a una secuencia de control de expresión cuando ésta controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de polinucleótido. El término "unido operativamente" incluye tener una señal de inicio apropiada (p. ej. ATG) al frente de la secuencia de polinucleótido que se va a expresar, y mantener el marco de lectura correcto que permita la expresión de la secuencia de polinucleótido bajo el control de la secuencia de control de expresión y la producción del polipéptido deseado codificado por la secuencia de polinucleótido.

"vector de expresión": un polinucleótido, como un ADN de plásmido o fago (entre otros ejemplos frecuentes) que permite la expresión de al menos un gen cuando el vector de expresión se introduce en una célula huésped. Este vector puede ser capaz de replicarse en una célula, o no.

"aislado" (usado indistintamente con "sustancialmente puro"): cuando se aplica a un ácido nucleico, es decir, secuencias de polinucleótido que codifican polipéptidos, significa un polinucleótido de ADN o ARN, una porción de polinucleótido genómico o un polinucleótido de ADNc o sintético que, a causa de su origen o de su manipulación: (i) no está asociado con la totalidad de un polinucléotido con el que está asociado en la naturaleza (p. ej. está presente como vector de expresión o porción del mismo en una célula huésped) o (ii) está unido a un ácido nucleico u otra porción química distinta de aquella a la que está unida en la naturaleza, o (iii) no aparece en la naturaleza. Por "aislado" se hace referencia además a una secuencia de polinucleótido que: (i) está amplificada in vitro, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se ha sintetizado químicamente, (iii) se ha producido por recombinación mediante clonación o (iv) se ha purificado, por medios como la escisión y la separación en gel.

Por lo tanto, un "ácido nucleico sustancialmente puro" es un ácido nucleico que no es inmediatamente contiguo a una o las dos secuencias codificadoras a las que suele serlo en un genoma natural del organismo del que se deriva el ácido nucleico. El ADN sustancialmente puro también incluye ADN recombinante que forma parte de un gen híbrido que codifica otras secuencias erizo.

"aislado" (usado indistintamente con "sustancialmente puro"): cuando se aplica a un polipéptido significa un polipéptido o una porción del mismo que, por su origen o por su manipulación: (i) está presente en una célula huésped como el producto de expresión de una porción de un vector de expresión, o (ii) está unido a una proteína u otra porción química distinta de aquella a la que está unido en la naturaleza, o (iii) no aparece en la naturaleza, como por ejemplo una proteína que se ha manipulado químicamente agregando o añadiendo al menos una porción hidrófoba a la proteína, de tal manera que la proteína esté en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Por "aislado" se hace referencia, además, a una proteína: (i) sintetizada químicamente o (ii) expresada en una célula huésped y purificada de sus proteínas asociadas o contaminantes. Generalmente, el término se refiere a un polipéptido que se ha separado de otras proteínas y ácidos nucleicos junto a los que suele aparecer en la naturaleza. Preferiblemente, el polipéptido también está separado de sustancias tales como anticuerpos o matrices de geles (poliacrilamida) que se usan para purificarlo.

"promotor heterólogo": tal como se usa en esta invención se trata de un promotor que no está asociado de forma natural con un gen o un ácido nucleico purificado.

"Homólogo": tal como se usa en esta invención es sinónimo del término "identidad" y se refiere a la similitud de secuencias entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición de las dos secuencias coparadas está ocupada por la misma subunidad monomérica de base o aminoácido (p. ej. si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, o una posición en cada uno de los dos polipéptidos está ocupada por una lisina), entonces las moléculas respectivas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas que se comparten dividido entre el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones de dos secuencias coinciden o son homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas en un 60%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT presentan un 50% de homología (3 de las 6 posiciones totales coinciden). Generalmente, la comparación se lleva a cabo cuando las dos secuencias están alineadas para presentar el máximo de homología. Esta alineación puede conseguirse utilizando, por ejemplo, el procedimiento de Needleman y cols., J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970), que se aplica convenientemente mediante programas informáticos como Align (DNAstar, Inc.). Las secuencias homólogas comparten residuos aminoácidos idénticos o similares, donde los residuos similares son sustituciones conservadoras o "mutaciones puntuales permitidas" de los residuos de aminoácido correspondientes en una secuencia alineada de referencia. A este respecto, una "sustitución conservadora" de un residuo en una secuencia de referencia es una sustitución física o funcionalmente similar a los residuos de referencia correspondientes, p. ej. porque tienen tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas, incluida la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno, etc. similares. Son sustituciones conservadoras particularmente preferidas aquellas que cumplen los criterios definidos para una "mutación puntual aceptada" en Dayhoff y cols., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Supl. 3, capítulo 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978).

Una "proteína erizo" o un "polipéptido erizo", ya que los dos términos se usan indistintamente, de la invención se define en términos de tener al menos una porción que esté formada por la secuencia de aminoácidos de consenso con ID SEC Nº: 4. El término también significa un polipéptido erizo, o una variante funcional de un polipéptido erizo, o un homólogo de un polipéptido erizo, o una variante funcional que tenga actividad biológica. En concreto, estos términos comprenden preparaciones de proteínas erizo y fragmentos de peptidilo de la misma, en formas tanto agonistas como antagonistas, tal como quedará claro en el contexto específico. Tal como se usa en esta invención, el término "fragmento bioactivo de una proteína erizo" se refiere a un fragmento de un polipéptido erizo completo en el que el fragmento agoniza o antagoniza específicamente de acontecimientos inductivos mediados por proteínas erizo naturales. El fragmento bioactivo de la erizo es preferentemente una porción extracelular soluble de una proteína erizo, en la que la solubilidad se refiere a las disoluciones fisiológicamente compatibles. Fragmentos bioactivos de ejemplo se describen en publicaciones PCT de los documentos WO 95/18856 y WO 96/17924. En las realizaciones preferidas, los polipéptidos erizo de la presente invención se unen a la proteína patched.

El término "corresponde a", cuando se refiere a un polipéptido o a una secuencia de ácido nucleico particular, pretende indicar que la secuencia de interés es idéntica u homóloga a la secuencia de referencia a la que se dice que corresponde.

Los términos "péptido(s)", "proteína(s)" y "polipéptido(s)" se usan indistintamente en esta invención. Los términos "secuencia de polinucleótido" y "secuencia de nucleótidos" también se usan indistintamente en esta invención. Los términos "fragmento de erizo" y "fragmento de erizo N-terminal" se usan indistintamente con "erizo".

Una molécula erizo tiene "actividad biológica" si tiene al menos una de las siguientes propiedades: (i) la molécula cumple los criterios de consenso de erizo tal como se definen en esta invención (ID SEC Nº: 4 y tiene la capacidad de unirse a su receptor, patched, o codifica, al expresarse, un polipéptido con esta característica; (ii) la molécula cumple los criterios de consenso de erizo tal como se definen en esta invención o codifica, al expresarse, un polipéptido con esta característica y (iii) puede inducir actividad fosfatasa alcalina en células C3H10T1/2. Generalmente, cualquier proteína presenta "actividad biológica" si la proteína tiene efectos, propiedades o características in vitro que cualquier experto habitual en la materia reconocería como representativas, del mismo grado o razonablemente predictivas de los efectos in vivo de la proteína.

El término "hidrófobo" se refiere a la tendencia de las porciones químicas con átomos apolares a interaccionar entre sí en lugar de con átomos de agua u otros átomos polares. Los materiales "hidrófobos" son, en su mayor parte, insolubles en agua. Los productos naturales con propiedades hidrófobas incluyen lípidos, ácidos grasos, fosfolípidos, esfingolípidos, acilgliceroles, ceras, esteroles, esteroides, terpenos, prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, isoprenoides, retinoides, biotina y aminoácidos hidrófobos como el triptófano, la fenilalanina, la isoleucina, la leucina, la valina, la metionina, la alanina, la prolina y la tirosina. Una porción química es también hidrófoba o tiene propiedades hidrófobas si sus propiedades físicas están determinadas por la presencia de átomos apolares. El término incluye a los grupos lipófilos.

El término "grupo lipófilo", en el contexto de unión a un polipéptido, se refiere a un grupo que tiene un alto contenido en hidrocarburo, lo que proporciona al grupo una alta afinidad con las fases lipídicas. Un grupo lipófilo puede ser, p. ej. una cadena relativamente larga de un grupo alquilo o cicloalquilo (preferentemente n-alquilo) que tenga, a ser posible, de 7 a 30 carbonos. El grupo alquilo puede terminar con una "cola" de hidroxiamina o amina primaria. Para ilustrar esto más, las moléculas lipófilas incluyen porciones aromáticas y no aromáticas, naturales y sintéticas como los ácidos grasos, los ésteres y los alcoholes, otras moléculas lipídicas, estructuras en forma de jaula como el adamantano y los buckminsterfulerenos, y los hidrocarburos aromáticos como el benceno, el perileno, el fentantreno, el antraceno, el naftaleno, el pireno, el criseno y el naftaceno.

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La frase "aminoácido interno" significa cualquier aminoácido en una secuencia peptídica que no es ni el aminoácido N-terminal ni el aminoácido C-terminal.

La frase "aminoácido superficial" significa cualquier aminoácido que está expuesto a un disolvente cuando una proteína esta plegada en su forma nativa.

Una "cantidad efectiva" de un polipéptido erizo, respecto a los métodos de tratamiento del paciente, se refiere a una cantidad de polipéptido contenida en una preparación que, cuando se aplica como parte de un régimen de dosificación deseado, provoca, p. ej. una modificación en el índice de proliferación celular, o en el estado de diferenciación de una célula o en el índice de supervivencia de una célula de acuerdo con los patrones clínicamente aceptables para el trastorno que se va a tratar o el propósito estético.

Un "paciente" o un "sujeto" que va a tratarse mediante el procedimiento en cuestión puede significar tanto un ser humano como a un animal no humano.

El "estado de crecimiento" de una célula se refiere al índice de proliferación de la célula y a su estado de diferenciación.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, química de proteínas e inmunología, que están dentro de la materia. Estas técnicas se describen en la bibliografía.

II. Propiedades generales de las proteínas erizo aisladas

La porción polipeptídica de las composiciones erizo del procedimiento en cuestión pueden generarse mediante cualquiera de una serie de técnicas incluyendo la purificación de proteínas naturales, proteínas producidas mediante recombinación y la síntesis química. Las formas polipeptídicas de los agentes terapéuticos erizo se derivan preferentemente de proteínas erizo de vertebrados, p. ej. que tengan secuencias que correspondan con proteínas erizo naturales, o fragmentos de las mismas, procedentes de organismos vertebrados. Sin embargo, se apreciará que el polipéptido erizo puede corresponder a una proteína erizo (o un fragmento de la misma) que aparezca en cualquier organismo metazoario.

Las proteínas erizo aisladas utilizadas en los procedimientos de esta invención son proteínas naturales o recombinantes de la familia de las erizo y pueden obtenerse de orígenes vertebrados o invertebrados (véanse las referencias más adelante). Los miembros de la familia de las proteínas erizo de vertebrados comparten homología con las proteínas codificadas por el gen erizo (hh) de Drosophila (33). Hasta la fecha, el estudio combinada de las bibliotecas genómicas y de ADNc de ratón ha identificado tres hh homólogos en mamíferos, denominados erizo Sónico (Shh), erizo indio (Ihh) y erizo del desierto (Dhh), que también existen en otros mamíferos, entre ellos los seres humanos, así como en peces y aves. Otros miembros son la erizo de rata lunar (Mhh) así como la hh Sónico de pollo y la hh Sónico de pez cebra.

Los genes Shh de ratón y de pollo y los genes Ihh de ratón codifican glucoproteínas que experimentan escisión, produciendo un fragmento amino terminal de unos 20 kDa (véase la figura 8) y un fragmento carboxi terminal de unos 25 kDa. El fragmento de 20 kDa más preferido contiene la secuencia de consenso con ID SEC Nº 4 e incluye las secuencia de aminoácidos con ID SEC Nº 1-3. Otros fragmentos diversos que engloban la porción de 20 kDa se consideran dentro de la invención actualmente reivindicada. Las publicaciones que describen estas secuencias, así como sus características químicas y físicas, incluyen (34-38); las solicitudes de patente PCT WO 95/23223 (Jessell, Dodd, Roelink y Edlund), WO 95/18856 (Ingham, McMahon y Tabin) y WO 96/17924 (Beachy y cols.).

Los miembros de la misma familia útiles para en los procedimientos de la invención incluyen cualquiera de las proteínas erizo nativas naturales, incluyendo homólogos alélicos, filogenéticos u otras variantes de las mismas, tanto de origen natural como producidas químicamente, incluyendo las muteínas o proteínas mutantes, así como las formas recombinantes y los nuevos miembros activos de la familia de las erizo. Los polipéptidos erizo especialmente útiles incluyen los de ID SEC Nº 1-4.

Los polipéptidos erizo aislados que se utilizan en el procedimiento de la invención tienen actividad biológica. Los polipéptidos incluyen una secuencia de aminoácidos homóloga en al menos un 60%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% a una secuencia aminoácido con ID SEC Nº 1-4. El polipéptido también puede incluir una secuencia de aminoácidos esencialmente igual que una secuencia de aminoácidos con ID SEC Nº 1-4. El polipéptido tiene al menos 5, 10, 20, 50, 100 o 150 aminoácidos de longitud e incluye al menos 5, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 20 y, lo más preferible, al menos 50, 100 o 150 aminoácidos contiguos de la ID SEC Nº: 1-4,

Los polipéptidos preferidos de la invención incluyen una secuencia polipeptídica erizo así como otra secuencia de aminoácidos N-terminal o C-terminal o pueden incluir la totalidad o un fragmento de una secuencia de aminoácidos erizo. El polipéptido erizo aislado también puede ser una proteína de fusión recombinante que presente una primera porción de erizo y una segunda porción de polipéptido, p. ej. una segunda porción de polipéptido con una secuencia de aminoácidos no relacionada con la erizo. La segunda porción de polipéptido puede ser, p. ej. una cola de histidina, una proteína de unión a la maltosa, glutatión-S-transferasa, un dominio de unión al ADN o un dominio de activación de polimerasa.

Los polipéptidos de la invención incluyen aquellos que surgen como resultado de la existencia de múltiples genes, de acontecimientos alternativos de transcripción, de acontecimientos alternativos de procesamiento de ARN y de acontecimientos alternativos traduccionales y postraduccionales. El polipéptido puede estar hecho enteramente por medios sintéticos o puede expresarse en sistemas, p. ej., de células cultivadas, que den lugar esencialmente las mismas modificaciones postraduccionales que se presentan cuando la proteína se expresa en una célula nativa, o en sistemas que den lugar a la omisión de las modificaciones postraduccionales presentes al expresarse en una célula nativa.

En una realización preferida, la erizo aislada es un polipéptido erizo con una o más de las siguientes características:

(i) tiene al menos una identidad de secuencia del 30, 40, 42, 50, 60, 70, 80, 90 o 95% con uno de los aminoácidos con ID SEC Nº: 1-4;

(ii) tiene una cisteína o un equivalente funcional como extremo N-terminal;

(iii) puede inducir actividad fosfatasa alcalina en células C3H10T1/2;

(iv) tiene una identidad global de secuencia de al menos el 50%, preferíblemente de al menos el 60%, más preferiblemente, de al menos el 70, 80, 90 o 95% con un polipéptido con ID SEC Nº: 1-4

(v) puede aislarse a partir de fuentes naturales como células de mamífero

(vi) puede unirse o interactuar con patched y

(vii) está modificado hidrófobamente (es decir, al polipéptido se le ha añadido al menos una porción hidrófoba) pero no está modificado en el aminoácido C-terminal con un esterol.

III. Producción de polipéptidos recombinantes

Los polipéptidos aislados que se describen en esta invención pueden producirse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Estos procedimientos van desde procedimientos directos con proteínas sintéticas hasta la construcción de una secuencia de ADN que codifica secuencias polipeptídicas aisladas y la expresión de esas secuencias en un huésped transformado adecuadamente.

En una realización de un procedimiento recombinante, se construye una secuencia de ADN aislando o sintetizando una secuencia de ADN que codifique la proteína natural de interés. Opcionalmente, la secuencia puede mutarse mediante mutagénesis específica de sitio para obtener análogos funcionales de la misma. Véase, p. ej., (40) y la Patente Estadounidense 4.588.585. Otro procedimiento para construir una secuencia de ADN que codifique un polipéptido de interés sería la síntesis química con un sintetizador de oligonucleótidos. Estos oligonucleótidos pueden diseñarse preferentemente según la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionando preferíblemente los codones favorecidos en la célula huésped en la que se producirá el polipéptido recombinante de interés.

Existen procedimientos convencionales para sintetizar una secuencia polinucleotídica aislada que codifique un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, puede utilizarse una secuencia de aminoácidos completa para construir un gen retrotraducido. Véase Maniatis y cols., supra. Además, puede sintetizarse un oligómero de ADN que contenga una secuencia de nucleótidos que codifique para el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, pueden sintetizarse varios oligonucleótidos pequeños que codifican para porciones del polipéptido deseado y ligarse después. Los oligonucleótidos individuales contienen típicamente extremos protuberantes 5' o 3' para el ensamblaje complementario.

Una vez ensambladas (mediante síntesis, mutagénesis dirigida o mediante otro procedimiento), las secuencias mutantes de ADN que codifican un polipéptido aislado particular de interés se insertarán en un vector de expresión y se unirán operativamente a una secuencia de control de expresión adecuada para la expresión de la proteína en el huésped deseado. El ensamblaje correcto puede confirmarse mediante secuenciación de nucleótidos, cartografía de restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Como es bien sabido en la técnica, para obtener niveles de expresión altos de un gen transfectado en un huésped, el gen debe estar unido operativamente a secuencias de control de expresión de la transcripción y la traducción que sean funcionales en el huésped elegido para la expresión.

La elección de la secuencia de control de expresión y del vector de expresión dependerá la elección del huésped. Puede utilizarse una amplia variedad de combinaciones huésped/vector. Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucarióticos incluyen, p. ej. vectores que engloban secuencias de control de expresión de SV40, de papilomavirus bovino, de adenovirus y de citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos de Escherichia coli, incluyendo pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados; plásmidos con una gama más amplia de huéspedes, como M13 y fagos de ADN filamentoso de cadena única. Los vectores preferidos para E. coli incluyen los vectores pL que contienen el promotor pL del fago lambda (Patente Estadounidense 4.874.702), vectores pET que contienen el promotor de la polimerasa T7 (Studier y cols., Methods in Enzymology 185: 60-89, 1990 1) y el vector pSP72 (Kaelin y cols., supra). Los vectores de expresión útiles para las células de levadura incluyen, p. ej. los plásmidos 2T y de centrómeros.

Además, cualquier secuencia de control de expresión de entre una amplia variedad puede usarse en estos vectores. Estas secuencias de control de expresión tan útiles incluyen las secuencias de control de expresión asociadas con genes estructurales de los vectores de expresión anteriores. Ejemplos de secuencias de control de expresión útiles incluyen, p. ej., los promotores tempranos y tardío de SV40 o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TCR, las regiones principales del operador y del promotor del fago lambda, por ejemplo pL, las regiones de control de la proteína de la cápsida fd, el promotor de la 3-glicerofosfato-cinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida, p. ej., Pho5, los promotores del sistema de cruzamiento alfa de la levadura y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas y sus virus, y diversas combinaciones de los mismos.

Puede utilizarse cualquier huésped adecuado para producir en cantidad los polipéptidos erizo aislados descritos aquí, incluyendo bacterias, hongos (incluyendo las levaduras), plantas, insectos, mamíferos u otras células o líneas celulares animales adecuadas, así como animales y plantas transgénicos. Más particularmente, estos huéspedes pueden incluir huéspedes eucarióticos y procarióticos bien conocidos, como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos, levaduras (p. ej. Hansenula), células de insecto como Spodoptera frugiperda (SF9) y High Five (véase el ejemplo 1), células animales como las células de ovario de hámster Chino (CHO), células de ratón como las NS/O, células COSI, COS 7, BSC 1, BSC 40 y BMT 10 de mono verde africano y células humanas, así como células de plantas.

Hay que comprender que no todos los vectores y secuencias de control de expresión funcionarán igual de bien para expresar un polipéptido aislado dado. Tampoco funcionarán igual de bien todos los huéspedes con el mismo sistema de expresión. No obstante, un experto en la técnica puede efectuar una selección entre estos vectores, sistemas de control de expresión y huéspedes sin llevar a cabo experimentos innecesarios. Por ejemplo, para producir el polipéptido aislado de interés en cultivos animales a gran escala, hay que controlar el número de copias del vector de expresión. Los vectores amplificables son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, (41) y las Patentes estadounidenses 4.470.481 y 5.122.464.

Estas uniones operativas de una secuencia de ADN a una secuencia de control de expresión, incluyen la provisión de una señal de inicio de la traducción en el marco de lectura correcto previo a la secuencia de ADN. Si la secuencia de ADN particular que se está expresando no empieza con una metionina, la señal de inicio dará lugar a la colocación de un aminoácido adicional (metionina) en el extremo N-terminal del producto. Si una porción hidrófoba va a unirse a la proteína que contiene el metionilo N-terminal la proteína puede usarse directamente en las composiciones de la invención. Sin embargo, ya que el extremo N-terminal preferido de la proteína va a estar formado por una cisteína (o un equivalente funcional de la misma), hay que eliminar la metionina antes del uso. En la técnica existen procedimientos disponibles para eliminar estas metioninas N-terminales de los polipéptidos expresados con ellas. Por ejemplo, ciertos huéspedes y condiciones de fermentación permiten la eliminación de prácticamente toda la metionina N-terminal in vivo. Otros huéspedes requieren la eliminación de la metionina N-terminal in vitro. Estos dos procedimientos, in vivo e in vitro, son bien conocidos en la técnica.

Las proteínas producidas por un huésped transformado pueden purificarse con cualquier procedimiento adecuado. Estos procedimientos convencionales incluyen la cromatografía (p. ej. de intercambio iónico, de afinidad y la cromatografía en columna de determinación de tamaño), la centrifugación, la solubilidad diferencial o cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Para la cromatografía de inmunoafinidad (véase el ejemplo 1), una proteína como la erizo Sónico puede aislarse uniéndola a una columna de afinidad compuesta de anticuerpos dirigidos contra la erizo Sónico o una proteína relacionada y se fijaron a un soporte estacionario. Alternativamente, las colas de afinidad como la hexahistidina, el dominio de unión a la maltosa, la secuencia de la cubierta de la gripe y la glutatión-S-transferasa pueden unirse a la proteína para facilitar la purificación mediante el paso por una columna de afinidad apropiada. Las proteínas aisladas también pueden caracterizarse físicamente utilizando técnicas como la proteólisis, la resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos X.

A. Producción de fragmentos y análogos

Los fragmentos de una proteína aislada (p.ej., fragmentos de las ID SEC Nº 1-4) también pueden producirse de forma eficiente mediante procedimientos de recombinación, digestión proteolítica o síntesis química con procedimientos conocidos para los expertos en esta técnica. En los procedimientos de recombinación se pueden generar fragmentos internos o terminales de un polipéptido eliminando uno o más nucleótidos de un extremo (para un fragmento terminal) o de los dos extremos (para un fragmento interno) de una secuencia de ADN que codifique el polipéptido erizo aislado. La expresión del ADN mutado genera fragmentos de polipéptido. La digestión con endonucleasas con actividad exonucleasa en los extremos también puede generar ADN que codifiquen una serie de fragmentos. Los ADN que codifican fragmentos de una proteína también se pueden generar mediante escisión aleatoria, digestión de restricción, o una combinación de ambas. Los fragmentos de proteínas se pueden generar directamente a partir de proteínas intactas. Los péptidos pueden cortarse específicamente con enzimas proteolíticas, que incluyen pero no se limitan a, la plasmina, la trombina, la tripsina, la quimotripsina o la pepsina. Cada una de estas enzimas es específica del tipo de enlace peptídico al que ataca. La tripsina cataliza la hidrólisis de los enlaces peptídicos en los que el grupo carbonilo proviene de un aminoácido básico, normalmente arginina o lisina. La pepsina y la quimotripsina catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos de aminoácidos aromáticos como el triptófano, la tirosina y la fenilalanina. Alternativamente, se generan conjuntos de fragmentos de proteína escindida impidiendo la escisión en un punto que es susceptible a una enzima proteolítica. Por ejemplo, la reacción del grupo aminoácido \varepsilon de la lisina con trifluorotioacetato de etilo en una disolución ligeramente básica genera residuos aminoácidos bloqueados cuyo enlace peptídico adyacente deja de ser susceptible a la hidrólisis por tripsina. Las proteínas pueden modificarse para crear uniones peptídicas que son susceptibles a las enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la alquilación de los residuos de cisteína con \beta-haloetilaminas produce uniones peptídicas que se hidrolizan por tripsina (51). Además, pueden utilizarse reactivos químicos que escinden las cadenas peptídicas por residuos concretos. Por ejemplo, el bromuro de cianógeno escinde los péptidos por los residuos de metionina (52). Así, tratando las proteínas con diversas combinaciones de modificadores, enzimas proteolíticas o reactivos químicos, las proteínas pueden dividirse en fragmentos de una longitud deseada sin solapamiento de los fragmentos, o dividirse en fragmentos superpuestos de una longitud deseada.

También pueden sintetizarse químicamente fragmentos químicamente mediante técnicas conocidas en la materia como los las reacciones químicas en fase sólida f-moc o t-boc de Merrifield. Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23: 451 (1967).

A continuación se comentan algunos ejemplos de procedimientos de la técnica anterior que permiten la producción y el análisis de fragmentos y análogos. Éstos, o procedimientos análogos, pueden usarse para generar y seleccionar fragmentos y análogos de un polipéptido aislado (p. ej. el erizo), del que se puede demostrar que tiene actividad biológica. Un procedimiento de ejemplo para comprobar si los fragmentos y análogos de erizo presentan actividad biológica se encuentra en el ejemplo 3.

B. Producción de secuencias peptídicas y de ADN alteradas: procedimientos aleatorios

Pueden prepararse variantes de las secuencia de aminoácidos de una proteína (como las variantes de ID SEC Nº: 1-4) mediante mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la proteína o una porción concreta de la misma. Procedimientos útiles incluyen la mutagénesis por PCR y la mutagénesis de saturación. También puede generarse una biblioteca de variantes aleatorias de secuencias de aminoácido mediante la síntesis de una serie de secuencias de oligonucleótido degeneradas. Los procedimientos para generar variantes de secuencias de aminoácidos de una proteína dada utilizando péptidos y ADN alterado son bien conocidos en la técnica. Los siguientes ejemplos de estos métodos no pretenden limitar el alcance de la presente invención, sino simplemente servir como ilustración de técnicas representativas. Las personas con experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que son igualmente útiles para este fin otros métodos.

Mutagénesis por PCR: Brevemente, se utiliza la polimerasa Taq (u otra polimerasa) para introducir mutaciones aleatorias en un fragmento de ADN clonado (42). Las condiciones de la PCR se eligen para que la fidelidad de la síntesis de ADN se vea reducida por los polímeros de ADN obtenidos con Taq utilizando, p. ej., una proporción dGTP/dATP de cinco y añadiendo Mn^{2+} a la reacción de PCR. El conjunto de fragmentos de ADN amplificados se inserta en los vectores de clonación adecuados para proporcionar bibliotecas mutantes aleatorias.

Mutagénesis de saturación: Se describe un procedimiento en términos generales en (43). Brevemente, la técnica incluye la generación de mutaciones mediante tratamiento químico o irradiación in vitro de ADN de cadena única, y la síntesis de una cadena de ADNc. La frecuencia de mutación está modulada por la intensidad del tratamiento y, en esencia, pueden obtenerse todas las sustituciones de bases posibles.

Mutagénesis por oligonucleótidos degenerados: Se puede generar una biblioteca de péptidos homólogos a partir de un conjunto de secuencias de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de secuencias degeneradas puede llevarse a cabo en un sintetizador automático de DNA, y los genes sintéticos se ligan después en un vector de expresión adecuado. Véase, por ejemplo (44, 45) e Itakura y cols., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, pp. 273-289 (A. G. Walton, ed.), Elsevier, Amsterdam, 1981.

C. Producción de secuencias peptídicas y de ADN alteradas: procedimientos dirigidos

La mutagénesis no aleatoria o dirigida proporciona secuencias o mutaciones específicas en porciones específicas de una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido aislado, con el fin de obtener variantes que incluyan eliminaciones, inserciones o sustituciones de residuos de la secuencia de aminoácidos conocida del polipéptido aislado. Los puntos de mutación pueden modificarse individualmente o en series, por ejemplo mediante: (1) la sustitución primero con aminoácidos conservados y después con opciones más radicales dependiendo de los resultados alcanzados; (2) la deleción del residuo diana o (3) la inserción de residuos de la misma o de distinta clase, adyacentes al sitio localizado; o combinaciones de las opciones 1 a 3.

Está claro que estos procedimientos dirigidos a un sitio concreto son una manera en la que una cisteína N-terminal (o un equivalente funcional) puede introducirse en una secuencia de polipéptido dada para proporcionar el punto de unión para una porción hidrófoba.

Mutagénesis de sustitución por alanina (alanine scanning mutagenesis ): Este método localiza aquellos residuos o regiones de una proteína deseada que son los sitios preferidos para mutagénesis (46). En los barridos de alanina, se selecciona un residuo o un grupo de residuos diana y se sustituyen por alanina. Esta sustitución puede afectar a la interacción del aminoácido con los aminoácidos contiguos o con el entorno acuoso o de la membrana. Aquellos que presentan sensibilidad a las sustituciones se refinan mediante la introducción de más o de otras variantes en, o para, los sitios de sustitución.

Mutagénesis mediada por oligonucleótidos: Una versión de este procedimiento puede utilizarse para preparar la sustitución, la deleción o la inserción de variantes de ADN (47). Brevemente, el ADN deseado se altera hibridando un cebador de oligonucleótido que codifica una mutación de ADN con un molde de ADN que es, típicamente, la forma de cadena única de un plásmido o fago que contiene la secuencia de ADN molde natural o sin alterar de la proteína deseada (p. ej. la proteína erizo). Después de la hibridación, se utiliza una polimerasa de ADN para generar la segunda cadena complementaria de ADN molde que incorporará al cebador de oligonucleótido, y que codificará para la alteración seleccionada en la secuencia deseada de ADN. Generalmente se utilizan oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos totalmente complementarios al molde en ambos lados de la mutación. Esto asegura que el olignucleótido hibridará correctamente con la molécula molde de ADN.

Mutagénesis por inserción de un casete: Este método (48) requiere un plásmido u otro vector que contenga el ADN de la subunidad de la proteína que se va a mutar. El codón (o los codones) del ADN de la subunidad proteica se identifican y se inserta un único sitio para una endonucleasa de restricción a cada lado del (los) punto(s) de mutación identificado(s), mediante el procedimiento de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos descrito anteriormente. Entonces, el plásmido se corta en esos puntos para linearizarlo. Se sintetiza con procedimientos convencionales un oligonucleótido de doble cadena que codifica la secuencia del ADN entre los puntos de restricción pero que contiene la mutación o las mutaciones deseadas. Las dos cadenas se sintetizan por separado y después se hibridan juntas con procedimientos convencionales. Este oligonucleótido de doble cadena es el "casete" y tiene extremos 3' y 5' compatibles con los extremos del plásmido linearizado de forma que se puede ligar directamente en ellos. El plásmido contiene ahora la subunidad proteica de ADN mutada deseada.

Mutagénesis combinatoria: En una versión de este procedimiento (Ladner y cols., documento WO 88/06630), las secuencias de aminoácidos de un grupo de homólogos u otras proteínas relacionadas se alinean, preferentemente de forma que se consiga la mayor homología posible. Todos los aminoácidos que aparecen en una posición dada de las secuencias alineadas pueden elegirse para crear un conjunto degenerado de secuencias combinatorias. La biblioteca múltiple se genera mediante mutagénesis combinatoria al nivel del ácido nucleico, y está codificada mediante una genoteca múltiple. Por ejemplo, puede ligarse enzimáticamente una mezcla de oligonucléotidos sintéticos dentro de la secuencia del gen de tal forma que el conjunto degenerado de secuencias potenciales pueda expresarse como péptidos individuales o, alternativamente, como un conjunto de proteínas que contenga el conjunto completo de secuencias degeneradas.

D. Otras variantes de polipéptidos aislados

En la invención están incluidas moléculas aisladas que son: variantes alélicas, mutantes naturales, mutantes inducidos y proteínas codificadas por ADN que se hibrida en condiciones de alto o bajo rigor a un ácido nucleido que codifiquen un polipéptido como el fragmento N-terminal de la erizo Sónico (ID SEC Nº: 1) y polipéptidos unidos específicamente a péptidos erizo mediante antisueros, especialmente mediante antisueros frente a un sitio activo o de unión de la erizo. Se espera que todas las variantes que se describen aquí: (i) conserven la función biológica de la proteína natural y (ii) mantengan la capacidad de unirse a una porción hidrófoba (p. ej. un lípido).

Los procedimientos de la invención también se caracterizan por el uso de fragmentos, preferíblemente fragmentos biológicamente activos, o análogos de un péptido aislado tal como el erizo. Específicamente, un fragmento o un análogo biológicamente activo es aquel que presenta cualquier tipo de actividad in vivo o in vitro, característica del péptido que aparece en las ID SEC Nº: 1-4 o de otro erizo aislado natural. Lo más preferible es que el fragmento modificado hidrófobamente o su análogo presente al menos un 10%, preferiblemente un 40% o más y, lo más preferible, al menos un 90% de la actividad de la erizo Sónico (véase el ejemplo 3) en cualquier ensayo in vivo o in vitro.

Los análogos pueden diferenciarse de las proteínas aisladas naturales en la secuencias de aminoácidos, o de formas que no afecten a la secuencia, o de las dos formas. Los polipéptidos más preferidos de la invención han preferido las modificaciones que no afectan a la secuencia que incluyen la derivatización química (p. ej. de su extremo N-terminal), así como posibles cambios en la acetilación, metilación, fosforilación, la amidación, la carboxilación o la glucosilación.

Otros análogos incluyen una proteína tal como la erizo Sónico o sus fragmentos biológicamente activos, cuyas secuencias difieren de la secuencia de consenso natural (por ejemplo ID SEC Nº: 4) en una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o en una o mas sustituciones de aminoácido no conservadoras, o mediante deleciones o inserciones que no anulen la actividad biológica de la proteína aislada. Las sustituciones conservadoras incluyen típicamente la sustitución de un aminoácido por otro con características similares tal como la sustitución dentro de los siguientes grupos: valina, alanina y glicina; leucina e isoleucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina, serina y treonina; lisina y arginina, y fenilalanina y tirosina. Los aminoácidos hidrófobos apolares incluyen la alanina, la leucina, la isoleucina, la valina, la prolina, la fenilalanina, el triptófano y la metionina. Los aminoácidos polares neutros incluyen la glicina, la serina, la treonina, la cisteína, la tirosina, la asparagina y la glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen la arginina, la lisina y la histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico. Los expertos habituales en la técnica conocen fácilmente otras sustituciones conservadoras. Por ejemplo, para el aminoácido alanina se puede llevar a cabo una sustitución conservadora con cualquiera de D-alanina, la glicina, la beta-alanina, la L-cisteína y la D-cisteína. Para la lisina, la sustitución puede hacerse con D-lisina, arginina, D-arginina, homoarginina, metionina, D-metionina, ornitina o D-ornitina.

Por lo general, las sustituciones que se puede esperar que induzcan cambios en las propiedades funcionales de los polipéptidos aislados son aquellas en las que: (i) un residuo polar, por ejemplo serina o treonina, es sustituido por (o mediante) un residuo hidrófobo, por ejemplo leucina, isoleucina, fenilalanina o alanina, (ii) un residuo de cisteína es sustituido por (o mediante) cualquier otro residuo (Ver Ejemplo 10), (iii) un residuo que presenta una cadena lateral electropositiva, por ejemplo la lisina, la arginina o la histidina, es sustituida por (o mediante) un residuo que tiene una cadena lateral electronegativa, p. ej., ácido glutámico o ácido aspártico, o (iv) un residuo que presenta una cadena lateral voluminosa, como la fenilalanina, es sustituida por (o mediante) otro que no tenga una cadena lateral de este tipo, como la glicina.

Otros análogos que se usan con los procedimientos de la invención son aquellas con modificaciones que aumentan la estabilidad del péptido. Estos análogos pueden contener, p. ej. uno o más enlaces no peptídicos (que sustituyen a los peptídicos) en la secuencia peptídica. También están incluidos: los análogos que incluyen residuos distintos de los L-aminoácidos naturales, tales como los D-aminoácidos, o los aminoácidos no naturales o sintéticos tales como los aminoácidos beta o gamma y los análogos cíclicos. La incorporación de D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos en el polipéptido erizo aislado puede aumentar su resistencia a las proteasas. Véase la patente estadounidense 5.219.990 supra.

El término "fragmento", tal como se aplica a un análogo de la erizo aislado, puede ser tan pequeño como un solo aminoácido, siempre que conserve actividad biológica. Puede tener al menos unos 20 residuos, más típicamente, al menos 40 y preferentemente al menos 60. Los fragmentos pueden generarse mediante métodos conocidos por los expertos habituales en la materia. La capacidad de un fragmento candidato a presentar actividad biológica de erizo aislado puede evaluarse también mediante procedimientos conocidos para los expertos habituales en la técnica tal como se describe en esta invención.

V. Fabricación de derivados hidrófobos

Los inventores han descubierto que aumentar la naturaleza hidrófoba global de una proteína erizo aumenta la actividad biológica de la proteína. La potencia de una proteína de señalización como la erizo puede aumentarse: (a) mediante modificación química, tal como la adición de una porción hidrófoba al sulfidrilo o al amino \alpha de la cisteína N-terminal (ejemplos 8 y 9); (b) sustituyendo la cisteína N-terminal por un aminoácido hidrófobo (ejemplo 10) o (c) sustituyendo la cisteína N-terminal por un aminoácido diferente y después modificando químicamente el residuo sustituido para añadir una porción hidrófoba en el punto de la sustitución.

Además, la modificación de una proteína erizo en un residuo interno de la superficie de la proteína con una porción hidrófoba (a) sustituyendo el residuo interno con un aminoácido hidrófobo o (b) sustituyendo el residuo interno con un aminoácido distinto y modificando después químicamente el residuo sustituido para añadir una porción hidrófoba en el sitio de la sustitución (véase el ejemplo 10) mantendrá o mejorará la actividad biológica de la proteína.

Además, la modificación de una proteína erizo en el extremo C-terminal con una porción hidrófoba: (a) sustituyendo el residuo interno C-terminal con un aminoácido hidrófobo o (b) sustituyendo el residuo C-terminal con un aminoácido distinto y después modificando químicamente el residuo sustituido para añadir una porción hidrófoba en el sitio de la sustitución (véase el ejemplo 10) mantendrá o mejorará la actividad biológica de la proteína.

Existe una amplia gama de porciones lipófilas con las que se pueden derivatizar polipéptidos erizo. Un grupo lipófilo puede ser, por ejemplo, un grupo alquilo o cicloalquilo (preferentemente n-alquilo) de cadena relativamente larga que tenga aproximadamente de 7 a 30 carbonos. El grupo alquilo puede terminar con un hidroxi o una "cola" de amina primaria. Para ilustrar esto más, las moléculas lipófilas incluyen porciones aromáticas y no aromáticas, naturales y sintéticas como los ácidos grasos, los ésteres y los alcoholes, otras moléculas lipídicas, estructuras en forma de jaula como el adamantano y los buckminsterfulerenos e hidrocarburos aromáticos tales como el benceno, el perileno, el fentantreno, el antraceno, el naftaleno, el pirano, el criseno y el naftaceno.

Partículas lipófilas especialmente útiles son los hidrocarburos alicíclicos, los ácidos grasos saturados e insaturados y otras porciones lipídicas y fosfolipídicas, ceras, colesterol, isoprenoides, terpenos e hidrocarburos polialicíclicos incluyendo el adamantano y los buckminsterfulerenos las vitaminas, el polietilenglicol, o el oligoetilenglicol, los diésteres de fosfato de (C1-C18)-alquilo, -O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-alquilo y en particular, los conjugados con derivados del pireno. La porción lipófila puede ser un colorante lipófilo apropiado para el uso en la invención incluyendo pero no limitado al difenilhexatrieno, Rojo Nilo, N-fenil-1-naftilamina, prodano, laurodano, pireno, perileno, rodamina, rodamina B, tetrametilrodamina, rojo Texas, sulforrodamina, 1,1'-didodecil-3,3,3',3'tetrametilindocarbocianinoperclorato de 1,1'-didodecilo, octadecilo rodamina B y los colorantes BODIPY comercializados por Molecular Probes Inc.

Otros ejemplos de porciones lipófilas son los grupos carbonilos radicales alifáticos que incluyen 1- ó 2-adamantilacetilo, 3-metiladamant-1-ilacetilo, 3-metil-3-bromo-1-adamantilacetilo, 1-decalinacetilo, canforacetilo, canfanoacetilo, noradamantilacetilo, norbomanoacetil, biciclo[2.2.2.]-oct-5-eneacetilo, 1-metoxibiciclo[2.2.2.]-oct-5-eno-2-carbon-ilo, cis-5-norbomeno-endo-2,3-dicarbonilo, 5-norbomen-2-ilacetilo, (1 R)-(-)-mirtentanoacetilo, 2-norbomanoacetilo, anti-3-oxo-triciclo[2.2.1.0<2,6> ]-heptano-7-carbonilo, decanoílo, dodecanoílo, dodecenoílo, tetradecadienoílo, decinoílo o dodecenoílo.

Las estructuras de ejemplo de modificaciones hidrófobas se muestran en la figura 12. Si un aminoácido adecuado no está disponible en una posición concreta, puede utilizarse la mutagénesis dirigida para colocar un aminoácido reactivo en ese punto. Los aminoácidos reactivos incluyen la cisteína, la lisina, la histidina, el ácido aspártico, el ácido glutámico, la serina, la treonina, la tirosina, la arginina, la metionina y el triptófano. La mutagénesis podría utilizarse para colocar el aminoácido reactivo en los extremos N-terminal o C-terminal o en una posición interna.

Por ejemplo, hemos descubierto que es posible modificar químicamente una cisteína N-terminal de una proteína erizo biológicamente activa, o eliminar completamente la cisteína N-terminal y seguir manteniendo la actividad biológica de la proteína, siempre que la porción química modificada o sustituida sea hidrófoba. Los inventores han descubierto que la mejora de la actividad biológica de la erizo se correlaciona aproximadamente con la hidrofobicidad de la modificación. Además de mejorar la actividad de la proteína, modificar o sustituir la cisteína N-terminal elimina las reacciones cruzadas indeseables o las modificaciones de la cisteína que puedan producirse durante la producción, la purificación, la formulación y el almacenamiento de la proteína. El tiol de una cisteína N-terminal es muy reactivo, debido a su proximidad al amino \alpha que baja el pKa de la cisteína y aumenta la disociación de protones y la formación del ión tiolato reactivo a pH neutro o ácido.

Hemos demostrado que la sustitución de la cisteína N-terminal de la erizo con un aminoácido hidrófobo da lugar a una proteína con mayor potencia en un ensayo celular de señalización. Sustituyendo la cisteína, este planteamiento elimina el problema de suprimir otras modificaciones no deseadas de la cisteína que pueden aparecer durante la producción, purificación, formulación y almacenamiento de la proteína. La generalidad de este enfoque se refuerza con nuestro hallazgo de que tres aminoácidos hidrófobos diferentes, la fenilalanina, la isoleucina y la metionina, generan cada uno una forma distinta de erizo más activa. Por lo tanto, la sustitución de la cisteína por cualquier otro aminoácido hidrófobo debería dar lugar a una proteína activa. Además, dado que hemos encontrado una correlación entre la hidrofobicidad de un aminoácido o de una modificación química y la potencia de la proteína modificada correspondiente en el ensayo con C3H10T1/2 (p. ej., Phe > Met, ácidos grasos de cadena larga > ácidos grasos de cadena corta), podría imaginarse que añadir más de un aminoácido hidrófobo a la secuencia erizo aumentaría la potencia de la proteína más allá de la que se consigue añadiendo un sólo aminoácido. De hecho, la adición de dos residuos consecutivos de isoleucina al extremo N-terminal de la erizo Sónico humana da lugar a un aumento en potencia en el ensayo con C3H10T1/2 en comparación con la mutante a la que sólo se ha añadido una isoleucina (véase el ejemplo 10). Así, cabría esperar que añadir aminoácidos hidrófobos en el extremo N-terminal o C-terminal de una proteína erizo, en un bucle superficial o en ciertas combinaciones de posiciones generaría una forma más activa de la proteína. No es necesario que el aminoácido sustituido sea uno de los 20 aminoácidos comunes. Se han descubierto procedimientos para sustituir aminoácidos no naturales en sitios específicos de las proteínas (78, 79) y esto sería ventajoso si el aminoácido tuviera un carácter más hidrófobo, más resistente al ataque proteolítico, o se pudiera usar para dirigir además a la proteína erizo a un sitio particular in vivo que dotara a su actividad de más especificidad o potencia. Durante la traducción in vivo se pueden incorporar aminoácidos no naturales en sitios específicos de las proteínas, según informes recientes, se está progresando en la creación de sistemas in vivo que permitirán la producción a gran escala de estas proteínas modificadas.

No se prevé que una proteína erizo, modificada de acuerdo con la invención, conserve su actividad biológica. En primer lugar, la cisteína N-terminal está conservada en todas las secuencias conocidas de proteína erizo incluidas las de pez, rana, insecto, ave y mamífero. Por lo tanto, es razonable suponer que el sulfidrilo libre de la cisteína N-terminal es importante para la estructura o la actividad de la proteína. En segundo lugar, las proteínas erizo que carecen de una cisteína N-terminal, debido a una escisión protelítica o una mutación a aminoácidos hidrófilos (p. ej. ácido aspártico o histidina), son inactivas en el ensayo con células C3H10T1/2, como el que se describen en el ejemplo 3.

Hay muchas modificaciones de la cisteína N-terminal que protegen el tiol y agregan una porción hidrófoba. Estas modificaciones se tratan más adelante con más detalle. Un experto habitual en la técnica es capaz de determinar qué modificación es la más adecuada para un uso terapéutico particular. Los factores que afectan a esta determinación incluyen el coste y la facilidad de producción, purificación y formulación, la solubilidad, la estabilidad, la potencia, la farmacodinamia y la cinética, la seguridad, la inmunogenicidad y el tropismo tisular.

A. Modificaciones químicas de la secuencia primaria de aminoácidos

La modificación química de la cisteína N-terminal para proteger el tiol, con la activación concomitante de una porción hidrófoba, puede llevarse a cabo de muchas formas por un experto habitual en la técnica. La porción de sulfidrilo, con el ion tiolato como la especie activa, es el grupo funcional más reactivo de una proteína. Hay muchos reactivos que reaccionan más deprisa con el tiol que con cualquier otro grupo. Véase Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (S. S. Wong, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991). Se espera que el tiol de una cisteína N-terminal, tal como la que se encuentra en todas las proteínas erizo, sea más reactivo que el de las cisteínas internas de la secuencia. Esto es porque la estrecha proximidad al amino \alpha hará descender el pKa del tiol, resultando en un mayor grado de disociación de protones al ion tiolato reactivo a pH neutro o ácido. Además, es más probable que esté expuesta la cisteína del extremo N-terminal de la estructura que cualquiera de las otras dos cisteínas de la secuencia erizo que se encuentran inmersas en la estructura de la proteína. Hemos demostrado que la cisteína N-terminal es el único aminoácido modificado tras 1 hora de reacción con N-etilmaleimida a pH 5.5 (véase el ejemplo 9), y después de 18 horas de reacción con N-isopropilyodoacetamida a pH 7.0 (véase el ejemplo 9). Otros ejemplos de éstos procedimientos serían la reacción con otros compuestos de \alpha-haloacetilo, compuestos organomercuriales, reactivos disulfuro y otras maleimidas N-sustituidas. Muchos derivados hidrófobos de estas especies activas están disponibles comercialmente (p. ej. yodoacetato de etilo (Aldrich, Milwaukee WI), disulfuro de fenilo (Aldrich) y N-pirenomaleimidas (Molecular Probes, Eugene OR), o podrían sintetizarse fácilmente (p. ej. los N-alquilyodoacetamidas (84), N-alquilmaleimidas (85) y organomercuriales (86). Hemos demostrado que la cisteína N-terminal de la erizo Sónico humana puede modificarse específicamente con N-isopropilyodoacetamida y que la proteína modificada hidrófobamente es dos veces más potente que la no modificada en el ensayo con C3H10T1/2 (véase el ejemplo 9). Se espera que la modificación de Shh con un derivado de alquilyodoacetamida de cadena larga de lugar a una proteína modificada con un aumento de potencia aún mayor. Un experto habitual en la técnica podrá sintetizar estas N-alquilyodoacetamidas fácilmente con materiales de partida comercializados.

Otro aspecto de la reactividad de la cisteína N-terminal es que puede tomar parte en procesos de reacción exclusivos de su configuración 1,2-aminotiol. Un ejemplo es la reacción con grupos tioéster para formar un grupo amida N-terminal mediante de un cambio rápido de S a N del tioéster. Este proceso de reacción puede acoplar péptidos sintéticos y puede usarse para añadir aminoácidos u otros grupos hidrófobos individuales o múltiples, naturales o no naturales, a través del péptido debidamente activado. Otro ejemplo, demostrado en esta invención, es la reacción con aldehídos para formar el aducto de tiazolidina. Muchos derivados hidrófobos de los tioésteres (p. ej., los ésteres acil coenzima A de ácido graso saturado e insaturado C2-C24 [Sigma Chemical Co., St. Louis MO]), los aldehídos (por ejemplo butiraldehído, n-decil aldehído, y n-miristil aldehído [Aldrich]) y cetonas (p. ej., 2-, 3- y 4-decanona) están disponibles comercialmente o podrían sintetizarse fácilmente. De forma similar, los derivados de la tiomorfolina de los que es ejemplo el proceso químico de la 1-bromo-2-butanona que se describe en el ejemplo 9 podrían prepararse a partir de una serie de materiales de partida de \alpha-halocetonas. Dada la facilidad de encontrar rutas alternativas para la modificación del tiol de la cisteína N-terminal, o de cualquier cisteína de una proteína, no deseamos extendernos con los ejemplos concretos que se demuestran aquí.

El amino \alpha de una proteína puede modificarse preferencialmente en relación con los otros aminos de una proteína porque su pKa más bajo da lugar a una mayor cantidad de la forma reactiva sin protones a pH neutro o ácido. Hemos demostrado que la modificación del amino N-terminal con un grupo amida grasa de cadena larga, aunque conserva un grupo tiol de la cisteína libre, activa la proteína erizo hasta dos órdenes de magnitud (Ver Ejemplo 8). Por lo tanto, cabría esperar que los reactivos químicos que pueden dirigirse a reaccionar preferentemente con el amino N-terminal serían útiles para aumentar la potencia de las proteínas erizo. Los haluros de arilo, los aldehídos y las cetonas, los anhídridos ácidos, los isocianatos, los isotiocianatos, los imidoésteres, los haluros ácidos el N-hidroxisucinimidilo (p. ej. sulfo-NHS-acetato), los ésteres de nitrofenilo, el acilimidazol y otros ésteres activados están entre aquellos que se sabe que reaccionan con funciones amina.

Sustituyendo la cisteína N-terminal de la erizo con otros aminoácidos concretos, se pueden utilizar otros procedimientos químicos para añadir una porción hidrófoba al extremo N-terminal. Un ejemplo es colocar una serina o una treonina en el extremo N-terminal, oxidar este aminoácido para formar un aldehído y después conjugar la proteína con una porción química que contiene una estructura 1,2 aminotiol (p. ej. una cisteína). Un segundo ejemplo sería colocar una histidina en el extremo N-terminal para acoplarlo a un ácido tiocarbolíxico C-terminal.

Modificación química de otros aminoácidos

Existen procedimientos químicos específicos para la modificación de muchos otros aminoácidos. Por tanto, otra ruta para sintetizar una forma más activa de la erizo sería unir químicamente una porción hidrófoba a un aminoácido en una erizo distinta del de la cisteína N-terminal. Si un aminoácido apropiado no está disponible en la posición deseada, puede utilizarse la mutagénesis dirigida para colocar el aminoácido reactivo en ese punto de la estructura de la erizo, ya sea en los extremos C-terminal o N-terminal o en otra posición. Los aminoácidos reactivos incluirían la cisteína, la lisina, la histidina, el ácido aspártico, el ácido glutámico, la serina, la treonina, la tirosina, la arginina, la metionina y el triptófano. Por lo tanto, el objetivo de crear una forma más hidrófoba de erizo podría conseguirse por muchos medios químicos y no deseamos limitarnos a un procedimiento químico o punto de modificación en particular ya que nuestros resultados respaldan la generalidad de este enfoque.

El polipéptido erizo puede unirse a la porción hidrófoba de diversas formas, incluidos los medios de acoplamiento químico o mediante ingeniería genética.

Para ilustrarlo, hay un gran número de agentes químicos reticulantes que son conocidos por los expertos en la técnica. Para la presente invención, los agentes reticulantes preferidos son los agentes reticulantes heterobifuncionales, que pueden usarse para unir el polipéptido erizo y la porción hidrófoba de forma progresiva. Los agentes reticulantes heterobifuncionales proporcionan la posibilidad de diseñar procedimientos de acoplamiento más específicos para la conjugación con las proteínas, reduciendo así la aparición de reacciones colaterales no deseadas tales como los polímeros de homoproteínas. En la técnica se conoce una amplia variedad de agentes reticulantes heterobifuncionales. Entre ellos están: el 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), el éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); el aminobenzoato de N-succinimidil 4-yodoacetilo (SIAB), el 4-(p-maleimidofenil) butirato de succinimidilo (SMPB), el clorhidrato de 1-étil-3-(3-dimetilaminopropil) carbiodiimida (EDC); 4-succinimidiloxicarbonil- a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT), el 3-(2-piridilditio) propionato de N-succinimidilo (SP-DP), el [propionato 6-[3-(2-piridilditio) propionato] hexanoato de succinimidilo (LC-SPDP). Estos agentes reticulantes que tienen porciones de N-hidroxisuccinimida pueden obtenerse como análogos de la N-hidroxisulfosuccinimida, que generalmente tienen mayor solubilidad en agua. Además, aquellos agentes reticulantes que presentan puentes disulfuro dentro de la cadena de unión pueden sintetizarse en lugar de los derivados de alquilo, para reducir la cantidad de escisión in vivo del elemento de unión.

Además de los agentes reticulantes heterobifuncionales, existe una serie de otros agentes reticulantes entre los que se incluyen agentes reticulantes homobifuncionales y agentes reticulantes fotorreactivos. El suberato de disuccinimidilo (DSS), el bismaleimidohexano (BMH) y el 2 HCl pimelimidato de dimetilo (DMP) son ejemplos de agentes reticulantes homobifuncionales, y el disulfuro de bis-[\beta-(4-azidosalicilamido)etilo (BASED) y el 6 (4'-azido-2'-nitrofenil-amino)hexanoato de N-succinimidilo (SANPAH) son ejemplos de agentes reticulantes fotorreactivos útiles para su uso en esta invención. Para consultar una revisión reciente de las técnicas de acoplamiento de proteínas, véase Means y cols. (1990) Bioconjugate Chemistry 1:2-12, incorporado como referencia en esta invención.

Una clase de agentes reticulantes heterobifuncionales particularmente útiles, incluida anteriormente, contiene el grupo amino primario reactivo, N-hidroxisuccinimida (NHS), o su análogo soluble en agua N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS). Los aminos primarios (grupos épsilon de la lisina) a pH alcalino están desprotonados y reaccionan mediante ataques nucleófilos sobre los ésteres NHS o sulfo-NHS. Esta reacción da lugar a la formación de un enlace amido y a la liberación de la NHS o de la sulfo-NHS como producto secundario.

Otro grupo reactivo útil como parte de un agente reticulante heterobifuncional es un grupo tiol reactivo. Los grupos tiol reactivos más comunes incluyen maleimidas, halógenos y disulfuros de piridilo. Las maleimidas reaccionan específicamente con los sulfhidrilos libres (residuos de cisteína) en minutos, en condiciones de pH ligeramente ácido o neutro (pH 6.5-7.5). Los halógenos (funciones de yodoacetilo) reaccionan con grupos -SH a pH fisiológicos. Los dos grupos reactivos dan lugar a la formación de enlaces tioéter estables.

El tercer componente del agente reticulante heterobifuncional es el brazo espaciador o puente. El puente es la estructura que conecta dos extremos reactivos. El atributo más aparente del puente es su efecto sobre el impedimento estérico. En algunos casos, un puente más largo puede cubrir con más facilidad la distancia necesaria para unir dos biomoléculas complejas. Por ejemplo, el SMPB tiene una extensión de 14,5 \ring{a}ngstroms.

Preparar conjugados proteína-proteína utilizando reactivos heterobifuncionales es un proceso de dos etapas que comprende la reacción del amino y la reacción del sulfidrilo. Para la primera etapa, la reacción del amino, la proteína seleccionada debería contener un amino primario. Puede ser el amino épsilon de la lisina o un amino alfa primario situado en el extremo N-terminal de la mayor parte de las proteínas. La proteína no debe contener grupos sulfidrilo libres. En los casos en los que las dos proteínas que se van a conjugar contengan grupos sulfidrilo libres, se puede modificar una proteína de modo que se bloqueen todos los sulfhidrilos utilizando, por ejemplo, N-etilmaleimido (ver Partis et al. (1983) J. Pro. Chem. 2:263, incorporados en esta invención como referencia). Puede usarse el reactivo de Ellman para calcular la cantidad de sulfhidrilos en una proteína en concreto (véase, por ejemplo Ellman y cols. (1958) Arch. Biochem. Biophys. 74:443 y Riddles y cols. (1979) Anal. Biochem. 94:75, incorporadas en esta invención como referencia).

El tampón de reacción debe estar libre de aminos y sulfhidrilos extraños. El pH del tampón de reacción debe ser 7.0-7.5. El rango pH impide que los grupos maleimida reaccionen con los aminos, preservando al grupo maleimida para la segunda reacción con los sulfhidrilos.

Los agentes reticulantes que contienen éster-NHS tienen una solubilidad en el agua limitada. Deben disolverse en una cantidad mínima de disolvente orgánico (DMF o DMSO) antes de introducir agente reticulante en la mezcla de reacción. El agente reticulante y el disolvente forman una emulsión que permite que se produzca la reacción.

Los análogos del éster sulfo-NHS son más solubles en agua y pueden añadirse directamente al tampón de reacción. Deben evitarse los tampones de alta fuerza iónica, porque tienen tendencia a "desalinizar" los ésteres sulfo-NHS. Para evitar la pérdida de reactividad a causa de la hidrólisis, el agente reticulante se añade a la mezcla de reacción inmediatamente después de disolver la disolución de proteína.

Las reacciones pueden ser más eficientes en disoluciones concentradas de proteína. Cuanto más alcalino sea el pH de la mezcla de reacción, más rápida será la velocidad de reacción. El ritmo de la hidrólisis de los ésteres NHS y sulfo-NHS también aumentará con el pH. Las temperaturas más elevadas aumentarán la velocidad de reacción tanto de la hidrólisis como de la acilación.

Una vez que se ha completado la reacción, la primera proteína está activada, con una porción reactiva de sulfhidrilo. La proteína activada puede aislarse de la mezcla de reacción mediante una simple filtración en gel o diálisis. Para llevar a cabo la segunda fase de la unión cruzada, la reacción de sulfidrilo, el grupo lipófilo seleccionado con maleimidos, halógenos activados o disulfuros de piridilo debe contener un sulfhidrilo libre. Alternativamente, una amina primaria puede modificarse para añadir un sulfidrilo.

En todos los casos, el tampón debe desgasearse para evitar la oxidación de los grupos sulfidrilo. Puede añadirse EDTA para quelar cualquier metal oxidante que pueda estar presente en el tampón. Los tampones deberán estar libres de cualquier compuesto que contenga sulfidrilo.

Las maleimidas reaccionan específicamente con grupos -SH en rangos pH de ligeramente ácidos a neutros. Un pH neutro es suficiente para las reacciones que implican halógenos y disulfuros de piridilo. Bajo estas condiciones, las maleimidas generalmente reaccionan con grupos -SH en cuestión de minutos. Para los halógenos y los disulfuros de piridilo se requieren tiempos de reacción más largos.

La primera proteína reactiva con sulfidrilo preparada en la etapa de la reacción del amino se mezcla con el grupo lipófilo que contiene sulfidrilo bajo las condiciones apropiadas de tamponamiento. Los conjugados pueden aislarse de la mezcla de reacción mediante procedimientos como la filtración en gel o mediante diálisis.

Los ejemplos de porciones lipófilas activadas para la conjugación son: N-(1-pireno)maleimida; 2,5-dimetoxistilbeno-4'-maleimida, eosin-5-maleimido; fluorescein-5-maleimida; N-(4-(6-dimetilamino-2-benzofuranil)fenil) maleimida; benzofenona-4-maleimida; 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-maleimida (DABMI), tetrametilrodamin-5-maleimida, tetrametilrodamin-6-maleimida, Rodamina RedTM C2 maleimida, sal del ácido trifluoroacético de N-(5-aminopentil)maleimida, sal del ácido trifluoroacético de N-(2-aminoetil)maleimida, Oregon GreenTM 488 maleimida, N-(2-((2-(((4-azido-2,3,5,6-tetrafluoro)benzoil)amino)etil)ditio)etil)maleimida (TFPAM-SS1), 2-(1-(3-dimetilaminopropil)-indol-3-il)-3-(indol-3-il) maleimida (bisindolilmaleimida; GF109203X), BODIPY® FL N-(2-aminoetil) maleimida, N-(7-dimetilamino-4-metilcumarin-3-il)maleimida (DACM), AlexaTM 488 C5 maleimida, sal sódica de AlexaTM 594 C5 maleimida, N-(1-pireno)maleimida, 2,5-dimetoxistilbeno-4'-maleimida, eosin-5-maleimida, fluorescein-5-maleimida, N-(4-(6-dimetilamino-2-benzofuranil)fenil)maleimida, benzofenona-4-maleimida, 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-maleimida, 1-(2-maleimidiletilo)-4-(5-(4-metoxifenil)oxazol-2-il)piridino metanosulfonato, tetrametilrodamina-5-maleimida, tetrametilrodamina-6-maleimida, Rodamina RedTM C2 maleimida, N-(5-aminopentil)maleimida, N-(2-aminoetil)maleimida, N-(2-((2-(((4-azido-2,3,5,6-tetrafluoro)benzoil)amino)etil)ditio)etil)maleimida, 2-(1-(3-dimetilaminopropil)-indol-3-il)-3-(indol-3-il)maleimida, N-(7-dimetilamino-4-metilcumarin-3-il)maleimida (DACM), 1 H-Benzo[a]fluoreno, Benzo[a]pireno.

En una realización, el polipéptido erizo puede derivatizarse usando pireno maleimida, que puede adquirirse en Molecular Probes (Eugene, Oreg.), p. ej. N-(1-pireno)maleimida o yodoacetato de 1-pirenometilo (éster PMIA). Como se ilustra en la figura 1, la proteína erizo derivada del pireno tenía un perfil de actividad que indicaba que era casi dos órdenes de magnitud más activa que la forma no modificada de la proteína.

B. Fabricación de derivados péptidicos hidrófobos

Según la invención, la proteína también puede modificarse utilizando un péptido hidrófobo. Tal como se usa en esta invención, el término "péptido" incluye una secuencia de al menos un residuo aminoácido. Preferiblemente, el péptido tiene una longitud entre uno y 18-26 aminoácidos, siendo esta última la longitud típica de un segmento de membrana de una proteína. Para crear un péptido con carácter hidrófobo, los aminoácidos se eligen principalmente entre los siguientes aminoácidos hidrófobos: fenilalanina, isoleucina, leucina, valina, metionina, triptófano, alanina, prolina y tirosina. El péptido hidrófobo también puede contener análogos de aminoácidos no naturales con carácter hidrófobo o D-aminoácidos, enlaces peptoides, acetilación del N-terminal u otras características que reduzcan la susceptibilidad del péptido a la proteólisis. Se conocen procedimientos para sustituir aminoácidos no naturales en sitios específicos de la proteína (78, 79).

Generalmente, un péptido hidrófobo se agrega a varios sitios de una proteína. Un sitio puede ser el residuo N-terminal. Alternativamente, se sustituye el péptido hidrófobo en lugar del residuo N-terminal. En otra forma de realización, se agrega un péptido hidrófobo al extremo C-terminal de la proteína. Alternativamente, se sustituye el péptido hidrófobo en lugar del residuo C-terminal. El extremo C-terminal puede ser el aminoácido C-terminal nativo, pero también puede ser el extremo C-terminal de una proteína truncada, de tal forma que el péptido hidrófobo se agrega al aminoácido C-terminal final de la forma truncada, al que todavía se denomina "extremo C-terminal". Una proteína erizo truncada mantendrá la actividad cuando se eliminen hasta once aminoácidos de la secuencia C-terminal nativa. El péptido hidrófobo también puede insertarse entre el residuo N-terminal y el residuo interno inmediatamente adyacente al residuo N-terminal, o entre el residuo C-terminal y el residuo inmediatamente adyacente al residuo C-terminal, o entre dos residuos internos.

En ciertas realizaciones, la porción lipófila es un polipéptido anfipático, como la magainina, la cecropina, la atacina, la melitina, la gramicidina, toxina alfa de S. aureus, la alameticina o un polipéptido anfipático sintético. Las proteínas de cubierta fusogénicas de las partículas víricas también pueden ser una fuente conveniente de secuencias anfipáticas para las proteínas erizo en cuestión.

C. Fabricación de derivados lipídicos

Otra forma de proteína erizo englobada por la invención es una proteína derivatizada con una variedad de porciones lipídicas. Generalmente, un "lípido" es un miembro de una clase heterogénea de sustancias hidrófobas caracterizado por una solubilidad variable en disolventes orgánicos y, en su mayor parte, insolubilidad en agua. Las principales clases de lípidos que están englobados dentro de la siguiente invención son los ácidos grasos y los esteroles (p. ej., el colesterol). Las proteínas derivatizadas de la invención contienen ácidos grasos que son ácidos monocarbolíxicos cíclicos, acíclicos (es decir, de cadena lineal), saturados o insaturados. Los ácidos grasos saturados de ejemplo tienen la fórmula genérica: CH_{3} (CH_{2})n COOH. La siguiente tabla enumera ejemplos de algunos ácidos grasos que pueden derivatizarse convenientemente utilizando procedimientos químicos convencionales.

TABLA 2

1

Otros lípidos que pueden unirse a la proteína incluyen los ácidos grasos de cadena ramificada y los del grupo de los fosfolípidos como los fosfatidilinositoles (es decir, el 4-monofosfato de fosfatidilinositol y el 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol), la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, la fosfatidilserina, e isoprenoides tales como el farnesilo o los grupos geranilo.

Hemos demostrado que las proteínas erizo modificadas con lípidos puede purificarse bien a partir de una fuente natural, o bien obtenerse modificando químicamente la proteína soluble no modificada. Para las proteínas purificadas a partir de una fuente natural, hemos demostrado que cuando la erizo Sónico (Shh) humana completo se expresaba en células de insecto y la Shh unida a la membrana y purificada a partir de las células tratadas con detergente mediante una combinación de cromatografía en SP-Sefarosa y cromatografía de inmunoafinidad, la proteína purificada migró en geles SDS-PAGE reductores como una sola banda nítida con una masa aparente de 20 kDa (véase el ejemplo 1). Las proteínas Shh solubles y de membrana fueron fácilmente distinguibles mediante HPLC en fase inversa en la que las formas ligadas eluyeron más tarde en el gradiente de acetonitrilo (véase el ejemplo 1 y figura 3). Entonces demostramos que la erizo Sónico humana está ligada a las membranas celulares en dos formas; una que contiene un colesterol y que, por lo tanto, es análoga a los datos publicados previamente para la erizo de Drosophila (18), y una segunda forma nueva que contiene tanto un colesterol como una modificación con ácido palmítico. Las formas solubles y ligadas de Shh se analizaron mediante espectrometría de masas por electrodispersión utilizando un espectrómetro de masas cuadripolar equipado con una fuente de ionización por electrodispersión (ejemplo 1) así como mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (véase el ejemplo 1). La identidad del péptido N-terminal a partir de la digestión mediante endoproteinasa Lys C de la Shh ligada se confirmó mediante medición espectrométrica de masas MALD-PSD en un espectrómetro de masas MALDI de tiempo de vuelo. El sitio de palmitoilación se identificó mediante una combinación de cartografía del péptido y análisis de secuencia, y está en el extremo N-terminal de la proteína (residuo 1 de la secuencia de proteína madura con ID SEC Nº: 1-4). Las dos formas ligadas fueron igualmente activas en el ensayo de C3H10T1/2 con fosfatasa alcalina pero, curiosamente las dos fueron unas 30 veces más potentes que la Shh humana soluble sin ligamiento(s). Las modificaciones con lípidos no afectaron significativamente la aparente afinidad de unión de Shh por su receptor, patched (Figura 7). A continuación comprobamos la utilidad de las formas derivatizadas analizando las potencias relativas de la Shh soluble y ligada solas o en presencia del anticuerpo neutralizante antierizo Mab 5E1 en células C3H10T1/2 que mide la inducción de la fosfatasa alcalina. Además, las potencias relativas de la Shh soluble y la ligada para unirse a patched se evaluó en células EBNA-293 transfectadas con patched mediante análisis de FACS (ejemplo 3).

Para la proteína erizo modificada con lípidos obtenidas mediante modificación química de la proteína soluble no modificada, hemos demostrado que el ácido palmítico y otros lípidos pueden añadirse a la Shh soluble para crear formas modificadas con lípidos con una mayor potencia en el ensayo con C3H10T1/2 (ejemplo 8). Hemos demostrado (ejemplos 1, 2 y 8) que el tiol y el amino \alpha de la cisteína N-terminal contribuyen a la reacción de derivatización con lípidos. Sin desear adherirnos a ninguna teoría en particular, la modificación con lípidos en proteínas empieza con la formación de un intermediario tioéster y entonces se transfiere la porción lipídica al amino \alpha del N-terminal mediante la formación de un intermediario cíclico. En general, la porción lipídica reactiva suele poder estar en forma de tioésteres de ácidos carbolíxicos saturados o insaturados tales como los tioésteres de la coenzima A. Estos materiales y sus derivados pueden incluir, por ejemplo, derivados comerciales de la coenzima A, tales como de palmitoleoílcoenzima A, araquidoilcoenzima A, araquidonoilcoenzima A, lauroilcoenzima A y similares. Estos materiales pueden conseguirse fácilmente de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) catálogo de 1998 págs. 303-306).

Se ha ensayado el efecto de las distintas porciones lipídicas sobre la actividad funcional de la proteína erizo (véanse el ejemplo 8 y las figuras 10 y 11). De forma similar, el efecto de distintas porciones lipídicas sobre la actividad funcional de otras proteínas tales como las descritas anteriormente en la Sección III, puede comprobarse convenientemente mediante procedimientos conocidos por los expertos habituales en la materia. Por ejemplo, el análisis funcional de la gelsolina (50), diversos interferones (interferón-\alpha, interferón-\beta e interferón-\gamma), las diversas interleucinas (p. ej., IL-1, -2, -3, -4 y similares), los factores de necrosis tumoral -\alpha y -\beta, y otros factores de crecimiento que están modificados con lípidos de acuerdo con la invención puede realizarse mediante procedimientos muy conocidos.

Aunque hemos establecido medios químicos mediante los cuales un ácido puede unirse a la cisteína N-terminal de las proteínas erizo, cabe esperar que se puedan unirse lípidos a los mismos o a otros sitios mediante reacciones catalizadas enzimáticamente. La palmitoilación de proteínas in vivo está catalizada por una clase de enzimas conocida como palmitoil-CoA; las proteínas S-palmitoil transferasas. Utilizando enzimas purificadas, se ha demostrado la acilación in vitro de sustratos proteicos (80, 81). Las especificidades de sustrato de las enzimas palmitoiltransferasa no están bien definidas: un análisis de los sitios de palmitoilación de proteínas celulares y víricas encuentra poco en cuanto a una secuencia consenso que rodea el residuo de cisteína modificado, pero sugiere una presencia común de un residuo de lisina o arginina entre dos aminoácidos de cisteína y de aminoácidos grandes hidrófobos cerca de la cisteína. La secuencia amino-terminal de la Shh, CGPGRGFG puede coincidir con esta secuencia consenso y servir como sitio de reconocimiento para la palmitoilación.

Como alternativa, la miristoilación del extremo amino terminal de las proteínas erizo puede llevarse a cabo utilizando una N-miristoil transferasa (NMT), varias de las cuales están bien caracterizadas tanto en mamíferos (82) como en levaduras (83). Se puede crear un sitio de reconocimiento de la N-miristoil transferasa dentro de la secuencia N-terminal de la erizo para facilitar su reconocimiento por la enzima. Estas dos estrategias requerirían el uso de derivados acilcoenzima A grasos como sustratos, igual que se utilizan para la acilación grasa no enzimática de la erizo Sónico humana descrita en el ejemplo 8. Alternativamente, una proteína con una secuencia de reconocimiento creada mediante ingeniería genética puede miristolarse durante la expresión en una línea celular adecuada. Otro procedimiento para modificar una proteína como la erizo con una porción hidrófoba es crear un sitio de reconocimiento para la adición de un grupo isoprenoide en el extremo C-terminal de la proteína. El sitio de reconocimiento para la adición de farmesilo y geranil-geranilo se conocen y la proteína puede modificarse durante su expresión en una célula eucarótica (Gelb. y cols., Cut. Opin. Chem. Biol. 2: 40-48 (1998)).

VI. Complejos proteicos multiméricos

Las proteínas erizo modificadas hidrófobamente descritas en esta invención son particularmente adecuadas para su conversión en complejos proteicos multiméricos. Los complejos proteicos multiméricos de la invención incluyen proteínas, opcionalmente unidas por medio de su porción hidrófoba (p. ej., un lípido) a una vesícula. La vesícula puede ser una membrana biológica natural, purificada de material natural, o una construcción sintética. Las vesículas preferidas son estructuras esencialmente esféricas formadas por anfífilos, p. ej., tensoactivos o fosfolípidos. Los lípidos de estas vesículas esféricas están, por lo general, organizados en forma de lípidos con una o más capas estructurales, p. ej., vesículas multilaminares (varias bicapas lipídicas dispuestas como las de una cebolla, que engloban un volumen acuoso entre ellas) o micelas.

En particular, los liposomas son vesículas pequeñas y esféricas compuestas principalmente de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y componentes lipófilos secundarios. Estos componentes están dispuestos normalmente en una formación de bicapa similar a la disposición de los lípidos en membranas biológicas.

Típicamente, el extremo polar de un componente lipídico o de una molécula similar está en contacto con la disolución que la rodea, normalmente una disolución acuosa, mientras que el extremo hidrófobo no polar de la molécula lipídica o similar está en contacto con el extremo hidrófobo no polar de otro lípido o molécula de tipo lipídico. La membrana de bicapa resultante (es decir, la vesícula) es permeable selectivamente a moléculas de un cierto tamaño, hidrofobicidad, forma y carga neta. La mayoría de las vesículas son de naturaleza lipídica o similar, aunque existen formulaciones de bicapa de de liposomas que comprenden un tensoactivo con un lípido o un colesterol.

Las vesículas de liposomas pueden ser especialmente preferidas en tanto que cuentan con muchas aplicaciones terapéuticas, diagnósticas, industriales y comerciales. Se usan para transportar moléculas que no son fácilmente solubles en agua o cuando se desea una liberación secuencial dirigida. A causa de su permeabilidad selectiva a muchos compuestos químicos, los liposomas son útiles como vehículo de transporte para fármacos y materiales biológicos. Por lo tanto, las proteínas derivatizadas con lípidos tales como la erizo pueden convertirse en multiméricas incorporándolas dentro de la bicapa lipídica de las vesículas de liposomas. Al alcanzar el lugar de su objetivo, los liposomas pueden degradarse (por ejemplo, por las enzimas del tubo digestivo) o pueden fundirse con las membranas celulares.

Se conocen varios métodos de preparar vesículas como los liposomas. La producción de vesículas de fosfolípidos es bien conocida (53). Para una revisión general de los procedimiento usados habitualmente, véase (54). Entre los más habituales están (1) el tratamiento por ultrasonidos de una disolución que contenga lípidos, a veces seguida por evaporación/liofilización y rehidratación (véase p. ej., Stryer, Biochemistry, págs. 290-291, Freeman & Co., New York, (1988), y (55); (2) la homogeneización de una disolución de lípidos, a veces a alta presión o fuerza de cizalla elevada (véase por ejemplo la Patente de EE.UU. nº 4.743.449 emitida el 10 de mayo de 1988, y la Patente de EE.UU. nº 4.753.788, emitida el 28 de junio de 1988), (3) hidratación y en algunos casos tratamiento por ultrasonidos de una película desecada de lípidos formadores de vesículas en las que la capa lipídica está preparada mediante evaporación de una disolución de lípidos disueltos en un disolvente orgánico (véase p. ej., la Patente de EE.UU. nº 4.452.747 emitida el 5 de junio de 1984, la Patente de EE.UU. nº 4.895.719 emitida el 23 de enero de 1990 y la Patente de EE.UU. nº 4.946.787 emitida el 7 de agosto de 1990), (4) liofilización o evaporación y rehidratación (véase, p. ej., la Patente de EE.UU. nº 4.897.355 emitida el 30 de enero de 1990, la Patente Europea 267.050 publicada el 5 de noviembre de 1988, la Patente de EE.UU. nº 4.776.991 emitida el 11 de octubre de 1988, la Patente Europea 172.007 publicada el 19 de febrero de 1986 y la solicitud de patente australiana AU-A-48713/85 publicada el 24 de abril de 1986), (5) inyección de un disolvente o infusión de una disolución de lípido en un medio acuoso o viceversa (véase, p. ej., (56); Patente de EE.UU. nº 4.921.757 emitida el 1 de mayo de 1990, la Patente de EE.UU. nº 4.781.871 emitida el 1 de noviembre de 1988, el documento WO 87/02396 publicado el 24 de marzo de 1988 y la Patente de EE.UU. nº 4.895.452 emitida el 23 de enero de 1990), (6) secar por aerosol (véase p. ej. la Patente australiana AU-A-48713/85 publicada el 24 de abril de 1986 y la Patente de EE.UU. nº 4.830.858 emitida el 16 de mayo de 1989), (7) filtración (véase p.ej. el documento WO 85/01161), (8) evaporación en fase inversa. Véase p. ej., (57); y (9) combinaciones de los métodos anteriores. Véase p. ej., (58) y (59).

Los componentes lipídicos y semejantes preferidos, adecuados para su uso en la preparación de vesículas incluyen los fosfolípidos, una mezcla de fosfolípidos, los lípidos polares, los lípidos neutros, los ácidos grasos y sus derivados. Un lípido preferido tiene la característica de que cuando se dispersa sólo en agua a una temperatura superior a la temperatura de transición del lípido, se encuentra en una fase de emulsión lipídica. En ciertas formas de realización, el lípido es una cadena alifática sencilla de más de unos 12 carbonos, y puede ser tanto saturada como insaturada, o sustituida de otras formas. Los lípidos adecuados incluyen las formas éster, alcohólicas y ácidas de los siguientes ácidos grasos: estearato, ácido oleico, ácido linoleico, araquidato, ácido araquidónico y otros ácidos de cadena alifática sencilla. Otros candidatos incluyen las formas éster, alcohólicas y ácidas de los retinoles, en particular, del retinol y el ácido retinoico. Otros lípidos preferidos incluyen la fosfatidilcolina (PC), el fosfatidilglicerol (PG) y sus derivados, creados sintéticamente o derivados de una variedad de fuentes naturales.

En ciertas realizaciones, la vesícula puede estabilizarse estéricamente mediante la incorporación de polietilenglicol (PEG) o mediante los grupos principales de PEG de un fosfolípido sintético (PEG conjugado con la distearil fosfatidiletanolamina (DSPE), véase p. ej., [61]). Los agentes tensoactivos preferidos son aquellos con buena miscibilidad, tales como Tween^{TM}, Triton^{TM}, dodecil-sulfato sódico (SDS), lauril sulfato sódico u octilglucósido de sodio.

Los tensioactivos preferidos forman micelas cuando se añaden en disolución acuosa por encima de la temperatura de transición de la fase del tensioactivo. Los tensioactivos pueden estar compuestos de una o más cadenas alifáticas. Estas cadenas alifáticas pueden ser saturadas, insaturadas, o sustituidas de otras formas, como por etoxilación; típicamente, las cadena alifática contiene más de unos 12 carbonos. Otros tensioactivos adecuados incluyen los siguientes: lauril-, miristil-, linoleil-, o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil, miristil-, o cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, o isostearamidopropil-betaína (p. ej., lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, o isostearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil sódico, o metil oleil-taurato disódico y la serie MONAQUAT (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.). Véase también el ejemplo 4.

Los esteroles y los ésteres de esterol preferidos adecuados para su uso en la preparación de complejos proteicos multiméricos incluyen el colesterol, el colestanol, el sulfato de colesterol, y otros análogos y derivados del colesterol. El hecho de que una vesícula pueda comprender muchos lípidos y detergentes diferentes permite una enorme flexibilidad para manipular un complejo ligado proteína-vesícula con las propiedades deseadas. Por ejemplo, se pueden producir vesículas que se unan con una serie diferente de proteínas variando la composición lipídica de los materiales de partida para crear vesículas mayores, o aumentando el porcentaje de lípidos fosfatidilinositol de la vesícula.

VII. Utilidades

Generalmente, las proteínas modificadas descritas en esta invención son útiles para tratar las mismas dolencias médicas que se pueden tratar con la forma no modificada de las proteínas erizo. No obstante, las proteínas modificadas hidrófobamente que se describen en esta invención ofrecen varias mejoras significativas respecto de las formas no modificadas. En primer lugar, su mayor potencia permite el tratamiento con cantidades menores de proteína y durante periodos de tiempo más cortos. Esto será importante tanto en aplicaciones sistémicas como en aplicaciones para el SNC. En segundo lugar, la sustitución de la cisteína N-terminal con un aminoácido menos reactivo químicamente permite una producción, formulación y almacenamiento más sencillos de una proteína para uso clínico. En tercer lugar, la farmacodinamia de una proteína se verá alterada por las modificaciones hidrófobas y esto permitirá que las proteínas se localicen en las cercanías del punto de administración, aumentando así su seguridad, al reducir al mínimo la exposición sistemática, y su eficacia, al aumentar su concentración local. Las proteínas de la invención también son útiles en composiciones para diagnóstico y en procedimientos para detectar sus correspondientes receptores.

Como ejemplo del primer punto, se ha descubierto que la semivida de la erizo después de la aplicación sistémica es muy corta y que se necesitan varias inyecciones para obtener una respuesta contundente frente a la proteína. La mayor potencia de las formas modificadas y la posibilidad de formulación en liposomas proporcionan una manera de alcanzar una respuesta con menos tratamiento. En las aplicaciones para el SNC, la mayor potencia ofrece un medio de proporcionar una cantidad adecuada de proteína en los pequeños volúmenes que se requieren para las inyecciones directas en el SNC.

La importancia del segundo punto está ilustrada por el hecho de que hemos descubierto que la cisteína N-terminal de la proteína erizo es enormemente susceptible al ataque químico, tanto para formar otros aductos químicos como para dimerizarse oxidativamente con otra proteína erizo. Para evitar que esto suceda, se usan tampones y procedimientos especiales durante la purificación, y se utiliza ditiroiterol en la formulación final. Estas precauciones exigen una evaluación cuidadosa de los efectos del tampón de formulación en los modelos animales.

Como ejemplo del tercer punto, cuanto más limitado sea el intervalo en el que una proteína difunde desde punto de administración, más alta será la concentración local. Esta mayor concentración local podrá, por lo tanto, permitir respuestas clínicas más específicas durante el tratamiento de las dolencias neurológicas tras la inyección directa en la zona deseada del cerebro o de la médula espinal.

De forma similar, las proteínas modificadas pueden administrarse localmente en el punto de fractura ósea para ayudar a curar estas fracturas, en las gónadas para tratar trastornos de fertilidad, intraocularmente para tratar dolencias oftalmológicas y de forma subcutánea para tratar afecciones dermatológicas y para estimular el crecimiento local del cabello. La localización de las proteínas modificadas hidrófobamente en el punto de administración reduce, por tanto, la posible exposición sistémica indeseable de otros órganos y tejidos.

En cuanto a su uso terapéutico, las proteínas modificadas hidrófobamente de la invención se disponen dentro de formulaciones farmacéuticamente aceptables, estériles, isotónicas y, opcionalmente, se administran por medios convencionales bien conocidos en este campo. La formulación es preferentemente líquida, aunque también puede ser polvo liofilizado. Se prevé que una administración terapéutica de, por ejemplo, un complejo proteico multimérico puede incluir liposomas que incorporan las proteínas derivatizadas descritas en esta invención.

Cualquier persona con experiencia habitual en la técnica apreciará que la administración, dosificación y aplicaciones clínicas particulares de una proteína modificada hidrófobamente de la invención variarán dependiendo de la proteína concreta y de su actividad biológica.

Como un mero ejemplo de aplicación de las proteínas de esta invención en un contexto terapéutico, las proteínas erizo modificadas hidrófobamente de aplicación terapéutica pueden administrarse a pacientes que sufran una serie de trastornos neurológicos. La capacidad de la proteína erizo para regular la diferenciación neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso y también, presumiblemente, en el estado adulto, indica que puede esperarse razonablemente que las proteínas erizo modificadas hidrófobamente faciliten el control de las neuronas adultas en cuanto al mantenimiento, capacidad funcional y envejecimiento de las células normales, a los procesos de reparación y regeneración de células dañadas, y a la prevención de la degeneración y la muerte prematura que resulta de la pérdida de la diferenciación en ciertos estados patológicos. A la luz de esto, las presentes composiciones de proteínas erizo modificadas hidrófobamente, mediante tratamiento por infusión local, pueden prevenir o reducir la gravedad de las enfermedades neurológicas que derivan de: (i) lesión aguda, subaguda o crónica del sistema nervioso, incluyendo lesiones traumáticas, lesiones químicas, lesiones vasculares y déficit (como la isquemia por accidente cerebrovascular), junto con lesiones infecciosas e inducidas por tumores, (ii) envejecimiento del sistema nervioso, incluyendo la enfermedad de Alzheimer: (iii) enfermedades crónicas neurodegenerativas del sistema nervioso, incluyendo la enfermedad de Parkinson, el corea de Hungtington, la esclerosis lateral amiotrófica y similares, y (iv) enfermedades crónicas inmunológicas del sistema nervioso, incluyendo la esclerosis múltiple. La proteína modificada hidrófobamente puede también inyectarse en el líquido cefalorraquídeo, p. ej., para tratar deficiencias de las células cerebrales, o en el sistema linfático o el torrente sanguíneo, como se requiere para abordar otros trastornos específicos de otros tejidos o sistemas de órganos.

Las composiciones de proteínas erizo pueden utilizarse para rescatar, por ejemplo, diversas neuronas de la muerte inducida por lesión así como para guiar la reproyección de estas mismas neuronas después del daño mencionado. Este daño puede atribuirse a trastornos que incluyen, pero no se limitan a, infarto por traumatismo del SNC, infección, enfermedad metabólica, deficiencia nutricional y agentes tóxicos (como el tratamiento con cisplatino). Ciertas proteínas erizo provocan que las células neoplásicas y las células hiperplásicas transformadas se vuelvan bien post-mitóticas bien apoptóticas. Estas composiciones pueden, por lo tanto, utilizarse en el tratamiento de, por ejemplo, gliomas malignos, meduloblastomas o tumores neuroectodérmicos.

Las proteínas también pueden estar unidas a marcadores detectables, como sustancias opacas a la fluoroscopia o la radiografía, y administrarse a un paciente para permitir la visualización de tejidos que expresan receptores de erizo. Las proteínas pueden también estar unidas a sustancias, como la peroxidasa de rábano picante, que pueden usarse como colorantes inmunocitoquímicos para permitir la visualización de áreas de células positivas a ligandos de erizo en secciones histológicas. Las proteínas modificadas hidrófobamente de la invención pueden usarse, solas o en complejos proteicos multivalentes, para abordar específicamente terapias médicas contra cánceres y tumores que expresen el receptor de la proteína. Dichos materiales pueden ser hacerse más eficaces como agentes terapéuticos contra el cáncer utilizándolos como vehículos de transporte de fármacos antineoplásicos, toxinas y radionúclidos citócidos, como el itrio 90.

También se puede conjugar una toxina a la erizo modificada hidrófobamente (o a complejos polivalentes de la misma que contengan vesículas) para alcanzar y matar selectivamente células respondedoras frente a la erizo, como los tumores que expresan receptores de erizo. Otras toxinas son igualmente útiles, como saben los expertos en la técnica. Estas toxinas incluyen, pero no se limitan a, la exotoxina de Pseudomonas, la toxina de la difteria y la saporina. Este enfoque debería tener éxito porque el(los) receptor(es) de la proteína erizo se expresan en un número muy limitado de tejidos. Otro enfoque de estas terapias médicas es usar una proteína modificada hidrófobamente (o un complejo multivalente de la misma) marcada con isótopos radiactivos. Estos compuestos marcados radiactivamente dirigirán la radioactividad preferentemente a los sitios celulares que expresen el(los) receptor(es) de la proteína, sin afectar a los tejidos normales. Según el isótopo radiactivo que se utilice, la radiación emitida por una proteína marcada radiactivamente y unida a una célula tumoral puede también matar a las células tumorales malignas adyacentes que no expresan el receptor de la proteína. Puede utilizarse una variedad de radionúclidos. El yodo radiactivo (por ejemplo ^{131}I) ha dado buenos resultados al utilizado con anticuerpos monoclonales contra el CD20 presente en los linfomas de células B (63).

Se formularán los compuestos proteicos de uso terapéutico y se establecerán las dosificaciones de forma coherente con la buena práctica médica, teniendo en cuenta el trastorno que va a tratarse, el estado individual del paciente, el sitio de liberación del polipéptido aislado, el procedimiento de administración y otros factores conocidos por los médicos. El agente terapéutico puede prepararse para su administración mezclando una proteína, una vesícula que contenga proteínas o un complejo derivatizado con el grado deseado de pureza y con portadores fisiológicamente aceptables (es decir, portadores que no sean tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas).

Se prevé que la liberación local en el sitio será la vía primaria para la administración terapéutica de las proteínas de esta invención. La liberación intravenosa, o la liberación mediante catéter o cualquier otra intubación quirúrgica también puede preverse. Las vías alterativas incluyen la ingestión de comprimidos y similares, los nebulizadores disponibles comercialmente para las formulaciones líquidas y la inhalación de formulaciones liofilizadas o en aerosol. Las formulaciones líquidas pueden utilizarse después de la reconstitución de las formulaciones en polvo.

La dosis administrada dependerá de las propiedades de la vesícula y la proteína utilizadas, p. ej., su actividad de unión y la semivida in vivo en plasma, la concentración de la vesícula y la proteína en la formulación, la vía de administración, el sitio y la velocidad de dosificación, la tolerancia clínica del paciente implicado, el estado patológico que padece y factores similares, como es bien sabido dentro de la experiencia del médico. Generalmente, se prefieren dosis desde alrededor de 5 x 10^{-7} a 5 x 10^{-9} molar de proteína por paciente y administración, aunque la dosificación dependerá de la naturaleza de la proteína. Pueden utilizarse dosificaciones diferentes durante una serie de administraciones secuenciales.

La invención también se dirige hacia una formulación farmacéutica que incluye una proteína erizo modificada según esta invención en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, la formulación también incluye vesículas.

Las proteínas erizo modificadas hidrófobamente de la invención son útiles en los procedimientos de terapia genética.

En los trastornos neurodegenerativos, se dispone de varios modelos animales que se cree que tienen cierto valor clínico predictivo. Para la enfermedad de Parkinson los modelos incluyen la protección o recuperación en roedores o primates en los que la vía dopaminérgica nigroestriatal está dañada, bien por la administración sistémica de MPTP o por la administración local (intracraneal) de 6-hidroxidopamina [6-OHDA], dos toxinas dopaminérgicas selectivas. Son modelos específicos: el modelo de ratón tratado con MPTP (64); el modelo de primate tratado con MPTP (tití común o Rhesus) (65), y el modelo de rata con lesión por 6-OHDA unilateral (66). Para la ELA (esclerosis lateral amiotrófica), los modelos comprenden el tratamiento de varias cepas de ratón que presentan degeneración neuronal motora espontánea, incluidas los ratones wobbler (67) y el pmn (68) y de ratones transgénicos que expresan el gen mutado de la superoxidasa dismutasa humana (SODh) que se ha relacionado con la ELA familiar (69). Para las lesiones de la médula espinal, los modelos más habituales comprenden las lesiones por contusión de ratas, bien dejando caer un peso calibrado o bien mediante una lesión por fluido (lesión hidrodinámica) (70). Para el Hungtington, los modelos incluyen protección frente a la lesión por excitoxina (NMDA, ácido quinolínico, ácido caínico, ácido 3-nitropropiónico, APMA) en el cuerpo estriatal de ratas (71, 72). Recientemente, también se ha descrito un modelo de ratón transgénico que sobreexpresa la repetición expandida humana del trinucleótido en el gen huntingin (73). Para esclerosis múltiple, la EAE en ratones y ratas se induce mediante inmunización con la proteína básica de la mielina (PBM) o mediante la transferencia pasiva de células T activadas con PBM (74). Para el Alzheimer, un modelo murino relevante es una determinación de la protección frente a la lesión de la fimbria-fórnix en ratas (lesión septal), proporcionando el haz nervioso principal la inervación colinérgica del hipocampo (75), así como el uso de ratones transgénicos que sobreexpresan el gen de la beta amiloide humana. Para las neuropatías periféricas, un modelo relevante es la protección contra la pérdida de conductancia nerviosa periférica causada por agentes quimioterápicos tales como el taxol, la vincristina y el cisplatino en ratones y ratas (76).

Esta invención se describirá ahora más detalladamente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes:

Ejemplo 1 La proteína erizo sónico humana se modifica con lípidos cuando se expresa en células de insecto A. Expresión de la proteína erizo sónico humana

El ADNc de la proteína erizo Sónico humana (Shh) completa se proporcionó en forma de un fragmento EcoRI de 1,6 kb subclonado en pBluescript SK- (20) (donación de David Bumcrot de Ontogeny, Inc., Cambridge MA). Los sitios NotI 5' y 3' inmediatamente adyacentes al marco de lectura abierto de la Shh se añadieron mediante mutagénesis por eliminación de sitio único utilizando un kit Pharmacia, según el protocolo recomendado por el fabricante. El fragmento NotI de 1,4 kb que porta el ADNc de la Shh completa se subclonó entonces en el vector de expresión de insecto, pFastBac (Life Technologies, Inc). El baculovirus recombinante se generó mediante los procedimientos proporcionados por Life Technologies, Inc. El virus resultante se utilizó para crear una reserva con alta carga vírica. Los procedimientos utilizados para la producción y purificación de la Shh se describen más adelante. La presencia de Shh asociada a membranas se examinó mediante EFA y análisis de Western blot. El pico de expresión apareció a las 48 horas después de la infección. Para el análisis Western blot, los sobrenadantes y los lisados celulares de células, infectadas y no infectadas con Shh, se sometieron a SDS-PAGE en un gradiente de gel del 10-20% en condiciones reductoras, se transfirieron mediante electroforesis a nitrocelulosa, y el Shh se detectó con un antisuero policlonal de conejo generado frente a un péptido 15-mérico N-terminal de Shh conjugado con hemocianina de lapa californiana. Los lisados celulares se generaron incubando las células durante 5 minutos a 25º en Na_{2}HPO_{4} 20 mM a pH 6.5, Nonidet P-40 al 1% y NaCl 150 mM ó Tris-HCl 20 mM a pH 8.0, NaCl 50 mM, Nonidet P-40 al 0,5% y de desoxicolato sódico al 0,5% y, después, sedimentando las partículas a 13.000 rpm durante 10 min a 4ºC en una centrífuga Eppendorf.

B. Purificación de erizo sónico humana ligada a la membrana

La forma ligada a la membrana de la Shh se produjo en células de insecto High Five^{TM} (Invitrogen) utilizando el bacilovirus recombinante que codifica la Shh completa que se ha comentado anteriormente. Las células High Five^{TM} se hicieron crecer a 28ºC en un medio sf900 II sin suero (Life Technologies Inc.) en un biorreactor de 10 l con oxígeno controlado. Las células se infectaron al final de la fase logarítmica a aproximadamente 2 x 10^{6} células/ml con virus en una MDI de 3 y se recogieron 48 horas después de la infección (la viabilidad celular en el momento de la recogida fue de > 50%). Las células se recogieron mediante centrifugación y se lavaron en Na_{2}HPO_{4} 10 mM a pH 6,5, NaCl 150 mM pH plus, FFMS (fluoruro de fenilmetil sulfonilo) 0.5 mM. El sedimento celular resultante (150 g de peso húmedo) se suspendió en 1,2 l de Na_{2}HPO_{4} 10 mM a pH 6,5, NaCl 150 mM, FFMS 0,5 mM, pepstatina A 5 \muM, 10 \mug/ml de leupeptina y 2 \mug/ml de E64, y después se añadieron 120 ml de una disolución de Triton-X-100 al 10%.

Después de 30 minutos de incubación en hielo, las partículas se eliminaron mediante centrifugación (1500 g, 10 min.). Todos los pasos posteriores se llevaron a cabo a 4-6ºC. El pH del sobrenadante se ajustó a 5,0 con una disolución de reserva de MES 0,5 M a pH 5,0 (concentración final de 50 mM) y se cargó en una columna de SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). La columna se lavó con 300 ml de Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM, FFMS 0.5 mM, Nonidet P-40 al 0,1%, después con 200 ml de Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5, NaCl, 300 mM, Nonidet P-40 al 0,1%, y la erizo ligada se eluyó con Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5, NaCl 800 mM, Nonidet P-40 al 0,1%.

A continuación se sometió la Shh a cromatografía de inmunoafinidad en 5E1-resina sefarosa que se preparó conjugando 4 mg de anticuerpo por ml de resina Sefarosa 4B activada con CNBr. La reserva de elución de SP-Sepharose se diluyó con dos volúmenes de Hepes 50mM a pH 7,5 y la porción se cargó en la resina 5E1 (1 hora). La resina se recogió en una columna, se lavó con 10 volúmenes equivalentes a la columna de PBS que contenían de Tritón X-100 hidrogenado al 0,1% (Calbiochem) y se eluyó con NaH_{2}PO_{4} 25 mM a pH 3,0, NaCl 200 mM, Tritón X-100 hidrogenado al 0,1%. Las fracciones de la elución se neutralizaron en 0,1 volúmenes de HEPES 1 M a pH 7,5, y se analizó su contenido total de proteínas mediante mediciones de la absorbancia a 240-340 nm y su pureza mediante SDS-PAGE. Las fracciones se almacenaron a -70ºC.

Las fracciones pico de las tres fases de afinidad se recogieron, se diluyeron con 1,3 volúmenes de HEPES 50 mM a pH 7,5, Triton X-100 hidrogenado al 0,02% y se volvió a cargar la porción en la resina 5E1. La resina se recogió en una columna, se lavó con tres volúmenes equivalentes a una columna de PBS a pH 7,2, de octilglucósido al 1% (US Biochemical Corp.) y se eluyó con NaH_{2}PO_{4} 25 mM a pH 3,0, NaCl 200 mM y octilglucósido al 1%. Las fracciones de elución se neutralizaron y analizaron como se ha descrito anteriormente, se recogieron, se filtraron a través de un filtro de 0,2 micras, se repartieron en alícuotas y se almacenaron a -70ºC.

Cuando la erizo Sónico (Shh) humana completa se expresó en células de insecto High Five^{TM}, más del 95% del fragmento N-terminal se detectó mediante Western blot en una forma que estaba asociada a células. Mediante SDS-PAGE, la proteína purificada migra en forma de una sola banda nítida con una masa aparente de 20 kDa (figura 1, carril c). La proteína migró unos 0,5 kDa más rápido que una versión soluble de la proteína que se había producido en E. coli (figura 1, carriles b-d), lo que coincide con datos publicados previamente (19). De forma similar a la descrita (19), las proteínas Shh soluble y unida a membranas son fácilmente distinguibles mediante HPLC en fase inversa, en la que la forma ligada eluyen más tarde en el gradiente de acetonitrilo. La concentración de acetonitrilo necesaria para la elución de la forma unida a la membrana fue del 60% frente a solo el 45% en la forma soluble, lo que indica un aumento significativo en la hidrofobicidad de la proteína.

C. Análisis por espectrometría de masas de la erizo sónico humana ligada a la membrana

Alícuotas de la Shh se sometieron a HPLC en fase inversa en una columna C_{4} (Vydac, Cat. Nº 214TP104; dimensiones de la columna: 4,6 mm de diámetro interno x 250 mm) a temperatura ambiente. Los componentes unidos se eluyeron con un gradiente de acetonitrilo de 0-80% de 30 min en ácido trifluoroacético al 0,1%, a una velocidad de flujo de 1,4 ml/min. El efluente de la columna se monitorizó a 280 nm y se recogieron fracciones de 0,5 min, las partes alícuotas de 25 \mul de fracciones que contenían proteína se secaron en un concentrador Speed-Vac, se disolvieron en tampón de muestra de electroforesis y se analizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contenían erizo se recogieron, se concentraron cuatro veces en un concentrador Speed-Vac y el contenido proteico se analizó mediante la absorbancia a 280 nm empleando un coeficiente de extinción de 1,33 para una disolución de Shh de 1mg/ml. Las muestras se sometieron a ESI-MS un espectrómetro de masas cuadripolar triple Micromass Quatro II, equipado con una fuente de ionización por electrodispersión. Se infundió un volumen de 6 \mul de erizo purificada por HPLC directamente en la fuente de ionización a una velocidad de 10 \mul/min utilizando 50% de agua, 50% de acetonitrilo y 0,1% de ácido fórmico como el disolvente contenido en la bomba de la jeringa. Los barridos se adquirieron a lo largo de la infusión de la muestra. Todos los datos del espectro de masas por electrodispersión se adquirieron y se almacenaron en modo perfil y se procesaron utilizando el sistema de datos Micromass MassLynx.

Los péptidos de una digestión de la endoproteinasa Lys-C de la Shh piridiletilada se analizaron por HPLC en fase inversa con el espectrómetro de masas Micromass Quattro II triple cuadripolar. El producto de la digestión se separó en una columna de Reliasil C_{18} utilizando un sistema Michrom^{TM} Ultrafast Microprotein Analyzer a una velocidad de flujo de 50 UR/min con un gradiente de acetonitrilo de 5-85% en ácido trifluoroacético al 0,05%. Los barridos se adquirieron del m/z 400-2000 a lo largo del análisis y se procesaron de la forma descrita anteriormente.

La secuenciación del péptido N-terminal de la Shh ligada se llevó a cabo mediante medición del decaimiento post-fuente o PSD (post source decay) en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo o TOF (time-of-flight) Voyager-DE^{TM} STR (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA), utilizando ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico como matriz (22, 23). Exactamente, 0,51 \mul de péptido de endoproteinasa Lys-C1 purificada mediante HPLC se mezcló con 0,5 \mul de la matriz en la placa diana. Para cubrir el espectro completo de iones del fragmento, los voltajes reflejados se disminuyeron de 20 a 1,2 kv en 11 etapas.

Los datos obtenidos a partir de la espectroscopía de masas con ionización por electrodispersión para las formas de Shh soluble y ligada a la membrana presentaron especies principales con masas de 19560 y 20167 Da, respectivamente (figura 2). La masa medida de 19560 Dalton coincide con la masa predicha para la Shh empezando con la Cys-1 y terminando con la Gly-174 (masa calculada de 19560,02 Da). Por el contrario, la masa de 20167 Da no coincidió con ninguna predicción disponible ni se pudo atribuir la diferencia en las masas de las formas ligada y soluble (607 Dalton) a ninguna modificación conocida ni a un procesamiento proteolítico aberrante. Anteriormente, Poder y cols. (18) demostraron que la proteína erizo de Drosophila contenía una porción de colesterol y que, por lo tanto, era posible que la diferencia de masas en el sistema humano se debiera, al menos en parte, al colesterol (la masa calculada para el colesterol esterificado es de 368,65 Dalton). La presencia de un componente menor en el espectro de masas de la Shh ligada a 19796 Da, que difiere del pico principal en 371 Da, apoya esta idea.

Se obtuvieron más pruebas para el colesterol al tratar la Shh ligada con un álcali suave en condiciones que pueden romper la unión del colesterol sin afectar a los enlaces peptídicos (18) y después volviendo a analizar los productos de la reacción mediante espectrometría de masas (EM). Brevemente, la Shh derivada de células de insecto se trató con KOH 50 mM, metanol al 95% durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se analizó mediante ESI-MS o se digirió con endoproteinasa Lys-C y se sometió a CL (cromatografía líquida)-EM en el espectrómetro de masas Micromass Quattro II triple cuadripolar. En las muestras sometidas a CL-EM, las proteínas se trataron previamente con 4-vinilpiridina. El tratamiento con una base modificó la masa en 387 Da, lo que coincide con la pérdida del colesterol más agua (véase la tabla 3). La masa de la Shh soluble no resultó afectada por el tratamiento con bases. En conjunto, estas observaciones sugerían que la Shh humana ligada a la membrana contenía dos modificaciones, un colesterol y una segunda porción con una masa de 236 Da. La similaridad entre la masa de este valor y la masa de un grupo de palmitoilo añadido (238 Da) sugería que la proteína podría estar palmitoilada. La estimación más precisa de la masa, comentada más adelante, reveló una correlación de menos de 0,1 Da con la masa prevista de una porción de palmitoilo.

TABLA 3

2

Posteriormente determinamos que la Shh ligada podía fraccionarse en subespecies mediante HPLC con un gradiente de elución modificado y desarrollamos un análisis sencillo mediante HPLC para cuantificar las diversas formas. Los resultados de estos análisis se muestran en la figura 3. En este ensayo, la Shh no modificada se eluye primero (pico 1), después se eluye la Shh modificada con colesterol (pico 2), y finalmente se eluye el producto que contiene tanto colesterol como Shh modificada con ácido palmítico (pico 3). La forma compleja del pico 3 refleja la presencia de una forma modificada del grupo palmitoilo que se identificó mediante secuenciación por medición MALDI-PSD. La variante era 2 Da más pequeña que la prevista y, por lo tanto, podía contener un enlace insaturado (datos no presentados).

D. Localización de la modificación con ácido palmítico dentro de la erizo sónico humana

El punto de la palmitoilación dentro la secuencia humana se identificó con una combinación de cartografía del péptido y análisis de la secuencia. La figura 4B muestra los resultados de un análisis de cartografía del péptido de la proteína soluble con una lectura de CL-EM. Los datos de la masa que suponen más del 98% de la Shh soluble pueden inferirse del análisis. El pico señalado con un asterisco corresponde al péptido N-terminal (residuos 1-9 más 4-vinilpiridina; masa observada, 983,50 Da; masa calculada, 983,49 Da; tabla 3). En el análisis equivalente del producto ligado (figura 4A), este péptido faltaba y en su lugar se observó un péptido más hidrófobo con una masa de 1221,79 Da (señalado con un asterisco).

La porción de 1221,79 Da coincide con la presencia de una forma modificada del péptido N-terminal, es decir, 983,49 Da para el componente peptídico más 238,23 Da. A continuación, se sometió al péptido de 1221,79 Da a análisis de secuencia mediante medición MALDI-PSD. El espectro PSD resultante se muestra en la figura 5. Se detectaron iones correspondientes a los fragmentos b1, b2, b4, b5, b8 + H_{2}O, y8, y7, y5, y4, y3, y2, e y1 que confirmaron la secuencia. Además, los iones b1 y b2 indicaban que el aducto piridietilado Cys-1 estaba palmitoilado. Sólo los iones que contenían Cys-1 contenían la masa añadida de 238,23 Da.

Dado que la cisteína es un sitio normal de palmitoilación para las proteínas in vivo, no fue una sorpresa descubrir que el aducto nuevo se unía a la cisteína N-terminal. No obstante, dos tipos de datos sugerían que el lípido estaba unido a el grupo amino de la cisteína y no al tiol. Primero, en el estudio de cartografía del péptido, utilizamos 4-vinilpiridina como etiqueta espectroscópica para monitorizar los grupos tiol libres (27). La piridiletilación es muy específica para los tioles de cisteína y añade un aducto de 105 Da que puede detectarse mediante EM. Los fragmentos con Cys-1 observados en el espectro de PSD contenían modificaciones, tanto de palmitoilo como de priridiletilo, lo que implicaba la presencia de un grupo tiol libre. Segundo, la Shh ligada se sometió a secuenciación automática del N-terminal por el método de Edman y no se obtuvo ninguna secuencia, lo sugería un bloqueo del amino \alpha del N-terminal. Por el contrario, la forma soluble correspondiente de la Shh puede secuenciarse fácilmente.

Ejemplo 2 La erizo sónico humana puede modificarse con ácido palmítico en un sistema acelular

La Shh soluble se marcó con ácido palmítico tritiado (^{3}H) en un sistema acelular mediante una versión modificada de un procedimiento publicado (24). Se preparó una fracción microsómica cruda de hígado de rata sometiendo un homogeneizado de hígado a centrifugación secuencial a 3000 g durante 10 min, 9000 g durante 20 min y 100000 g durante 30 min. El sedimento de 100000 g se suspendió en HEPES 10 mM a pH 7,4, sacarosa al 10% y se volvió a centrifugar a 100000 g durante 20 min. El sedimento final (derivado de 10 g de hígado) se suspendió en 3 ml de Tris-HCl 20 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina, Tritón X-100 al 0,15%, se repartió en alícuotas y se almacenó a -70ºC. Las reacciones con 3 \mug de Shh, 1\mul de microsomas de rata, 50 ng/ml de coenzima A (Sigma), ATP 0,3 mM, Tris-HCl 20 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina y \muCi-[9.10-3H]-ácido palmítico 0,5 (50 Ci/mmol; New England Nuclear) se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante una hora. Las reacciones se inactivaron con un tampón de muestra reductor para electroforesis, se sometieron a SDS-PAGE en un gradiente de gel de 10-20% y se visualizaron mediante fluorografía.

Como muestra la figura 1 (carril e), la Shh se marca fácilmente con el marcador radiactivo. Ninguna de las cerca de cien proteínas restantes de la mezcla de reacción estaban marcadas (ver el perfil correspondiente del gel teñido con azul Coomassie en el carril j), lo que indica un alto grado de especificidad de la reacción de palmitoilación. Como prueba adicional de la especificidad de la reacción de palmitoilación, analizamos dos variantes de la Shh en las que se había eliminado el sitio de palmitoilación. La figura 1 (carril f) muestra los resultados del análisis de una forma truncada de Shh soluble a la que le faltaban los 10 primeros residuos aminoácidos de la secuencia madura y, en el carril g, de una forma mutante de Shh que contiene, en su extremo N-terminal, una única mutación puntual de Cys-1 a Ser. Ninguna de las variantes estaba marcada.

La importancia de la cisteína N-terminal como sitio de derivatizacion con lípido está resaltada por el hecho de que la Shh soluble natural se marca fácilmente, mientras que la mutante cisteína a serina N-terminal no. La incapacidad para marcar la serina mutante N-terminal refuta la explicación de un mecanismo de reacción sencillo en el que la porción de palmitoilo se una directamente al amino \alpha N-terminal, ya que en las condiciones del ensayo la serina debería haber sustituido a la cisteína.

También analizamos la función del extremo libre N-terminal utilizando una forma soluble de Shh con una extensión N-terminal de una cola de histidina (His). La Shh soluble utilizada en estos estudios se había producido inicialmente como una proteína de fusión etiquetada con His con un sitio de escisión de la enterocinasa en la unión de la secuencia madura, y a continuación se procesó con enterocinasa para eliminar la cola de His. La Shh etiquetada con His no se palmitoiló a pesar de la presencia del grupo tiol libre de la cisteína (véase la figura 1, carril i). Aunque no podemos descartar la posibilidad de que la extensión N-terminal inhiba estéricamente el desarrollo de la palmitoilación, la Cys-1 está en la posición del sitio de escisión de la enterocinasa y es fácilmente accesible para el procesamiento enzimático. Por lo tanto, parece que tanto el tiol y como el amino \alpha de la Cys-1 contribuyen a la reacción de palmitoilación. Dado que todas las reacciones conocidas de palmitoliación tienen como objetivo las cadenas laterales de los residuos de Cys, Ser o Thr, inferimos que la modificación en la erizo empieza con la formación de un intermediario de tioéster, y que la porción de palmitoilo se transfiere entonces al extremo N-terminal a través de la formación de un intermediario cíclico. Esta hipótesis se confirmó durante los estudios sobre la modificación de la erizo Sónico humana utilizando palmitoilcoenzima A (véase el ejemplo 8).

Ejemplo 3 Demostración del aumento de potencia de la erizo sónico humana acilada con ácido graso en un ensayo con células (C3H10T/2)

Se analizó la función de la Shh en un ensayo con células midiendo la inducción de fosfatasa alcalina en células C3HIOT1/2 (25) con una lectura de 5 días. El ensayo se llevó a cabo en un formato de 96 pocillos. Las muestras se analizaron por duplicado. En el caso de la Shh ligada (100 \mug/ml), las muestras se diluyeron primero 200 veces con un medio normal de crecimiento y después, se sometieron a diluciones seriadas al doble en las placas. Los pocillos se normalizaron para los efectos potenciales del octilglucósido añadido incluyendo un 0,005% de octilglucósido en el medio de cultivo. Los estudios de bloqueo con el anticuerpo neutralizante murino mAb 5E1 (26) se llevaron a cabo mezclando Shh con diluciones seriadas del anticuerpo durante 30 minutos a temperatura ambiente en medio de cultivo antes de añadir las muestras problema a las placas.

En este ensayo, la Shh humana soluble produce una respuesta dependiente de la dosis con una CI_{50} de 1 \mug/ml y una señal máxima a los 3 \mug/ml (figura 6A). La Shh humana fijada, con un colesterol unido en el extremo C-terminal, y un grupo palmitoilo en el extremo N-terminal produjo de forma similar una respuesta dependiente de dosis en el ensayo, pero con una CI_{50} de 0,03 \mug/ml y una señal máxima a 0,1 \mug/ml, lo que indica que era unas 30 veces más potente que la Shh soluble. Para comprobar que la actividad observada era específica de erizo, analizamos si la actividad podía inhibirse con el anticuerpo neutralizante anti-erizo mAb 5E1. Tanto la Shh soluble como la ligada se inhibieron mediante el tratamiento con 5E1 (figura 6B). La inhibición de la Shh ligada precisó, como mucho, de una décima parte de 5E1, lo que coincidía con su mayor actividad en el ensayo.

La Shh ligada se analizó en un ensayo de unión a receptores monitorizando su capacidad para unirse a patched, mediante una versión modificada de un ensayo publicado recientemente (10). La Shh ligada mostró una unión a células que expresaban patched dependiente de la dosis, con un CI_{50} aparente de 400 ng/ml (figura 7). En el mismo ensayo, la Shh soluble se unió a patched con un CI_{50} aparente de 150 ng/ml, lo que indicaba que la forma fijada se unía a su receptor sólo algo menos estrechamente.

Ejemplo 4 Análisis de la erizo sónico humana ligada después de la reconstitución dentro de liposomas

Este ejemplo ilustra que los experimentos de reconstitución dentro de liposomas cargados positiva y negativamente mediante dilución en detergente en un intervalo amplio de proporciones lípido:proteína (peso/peso) desde 1:1 a 100:1 no tenían ningún efecto sobre la actividad de la Shh ligada en el ensayo con C3H10T1/2.

La reconstitución dentro de liposomas que contienen fosfolípidos proporciona una formulación útil para las proteínas que contienen lípidos porque permite que una proteína que contiene lípidos exista en un entorno prácticamente normal. Para comprobar si esta formulación era viable para la Shh ligada utilizamos una procedimiento de dilución con detergente para incorporar la proteína dentro de un liposoma (60) en el que los liposomas preformados se mezclan con el octilglucósido y la proteína de interés, y después se diluye el detergente por debajo de su concentración micelar crítica, impulsando así la reconstitución. Aunque se puede utilizar cualquiera de un gran número de mezclas lipídicas, hemos seleccionado como modelos dos mezclas disponibles comercialmente; un kit de liposomas cargados negativamente que contiene L-\alpha-fosfitidicolina de huevo, fosfato de dicetilo y colesterol (Nº de catálogo: L-4262; Sigma, St. Louis, MO) y un kit de liposomas cargados positivamente formado por fosfatidilcolina de huevo, estearilamina y colesterol (Nº de catálogo: L-4137; Sigma).

Brevemente, los lípidos se transfirieron a un tubo Pyrex, se secaron con una corriente de nitrógeno y el disolvente residual se eliminó mediante liofilización. El lípido se suspendió en HEPES 10 mM a pH 7,5, NaCl 100 mM, octilglucósido al 2,0%, se agitó con el agitador vorticial y se trató con ultrasonidos hasta que la suspensión adquirió una apariencia opalescente. El lípido se filtró entonces a través de un filtro de 0,2 micras. Las alícuotas en octilglucósido de la Shh ligada de las células de insecto High Five^{TM} infectadas con baculovirus, se trataron con un exceso de lípido (peso/peso) de 400, 1000, 5000 y 20000 veces y, tras una preincubación de 15 minutos, las muestras se diluyeron y se analizó su actividad en el ensayo con C3H10T1/2.

Ni el tratamiento con liposomas positivos ni el tratamiento con liposomas negativos tuvo ningún efecto sobre la actividad de la erizo, lo que indica que un portador lípido era una formulación viable. Para comprobar que la erizo se había reconstituido verdaderamente, se sometieron muestras paralelas a centrifugación bajo condiciones en las que la Shh ligada normalmente sedimentaría y los liposomas flotarían hacia la superficie de la muestra. En estas condiciones, la Shh ligada flotó hacia a la superficie, lo que indicaba que se había producido la reconstitución.

Ejemplo 5 Caracterización de la erizo sónico humana ligada a la membrana a partir de células de mamífero (EBNA-293)

Con objeto de valorar si la palmitoilación era una vía de modificación general para la erizo Sónico o si era específica de la producción en células de insectos, la proteína se produjo también en un sistema de mamífero, en células EBNA-293. Para la expresión de la Shh completa en células de mamífero, el fragmento NotI de 1,4 kb que contiene la Shh completa (véase el ejemplo 1) se clonó en un derivado del vector. CH269 pCEP4 (Invitrogen. San Diego, CA (21)). La construcción se transfectó a células EBNA-293 utilizando lipofectamina (Life Technologies, Inc) y las células se recogieron 48 horas después de la transfección. La expresión de la Shh superficial se comprobó mediante FACS y análisis de Western blot.

La Shh ligada de las células EBNA-293 se fraccionó mediante HPLC en fase inversa en una columna de calibre C estrecho (véase la figura 3). Los picos se analizaron mediante ESI-MS (partes a y b de la tabla 4) o mediante MALDI-TOF en un espectrómetro de masas Finnigan LaserMat utilizando ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico como matriz (parte c de la tabla 4). Mediante SDS-PAGE, la proteína migró ligeramente más rápido que la Shh soluble, estaba retrasada en la columna C_{4} del análisis de HPLC en fase inversa y, por espectrometría de masas, contenía un ión correspondiente a la modificación con ácido palmítico mas colesterol. No obstante, contrariamente al producto derivado de células de insecto en el que más del 80% del producto contenía tanto la modificación con ácido palmítico como con colesterol, el perfil de elución con HPLC y los datos de la espectrometría de masas revelaron que la mayor parte de la proteína derivada de células de mamífero carecía de la porción de palmitoilo (véanse la tabla 4 y la figura 3C). Esto es, en el pico 2 de las células EBNA-239 la proporción de proteína escindida (des-1-10) frente a proteína intacta detectada mediante señal de EM fue del 50%, mientras que para el pico 1 sólo alrededor del 10% de la Shh estaba escindida. Notablemente, los productos derivados tanto de células de insecto como de células de mamífero presentaron una actividad comparable en el ensayo con C3H10T1/2, lo que sugiere a que tanto la modificación con colesterol como la modificación con colesterol más ácido palmítico son funcionales. Todavía está por determinar si el segundo punto de unión de lípidos se usa simplemente para estabilizar más la asociación de la proteína con la membrana o si juega un papel más activo y afecta a su conformación o a los contactos proteína-
proteína.

La derivatización de proteínas con ácido graso es una modificación postraduccional habitual que ocurre hacia el final del proceso de maduración (28, 29). En cuanto a los derivados de la cisteína, el proceso es dinámico e implica a enzimas distintas que añaden y eliminan la modificación en el grupo sulfidrilo. Las funciones más habituales de esta derivatización (p. ej., la palmitoilación) alterarán las propiedades fisicoquímicas de la proteína (es decir, se dirigirán a una proteína a su sitio de funcionamiento, para promover interacciones proteína-proteína y para mediar en las interacciones proteína-membrana (30). En la erizo, aunque que la diferencia en el grado de la palmitoilación en preparaciones derivadas de células de insecto y de mamífero (80% en células de insecto frente al 30% en células de mamífero) fue sorprendente, no sabemos si es significativa desde un punto de vista biológico o si simplemente refleja las diferencias en la maquinaria celular de los dos sistemas de prueba para añadir y eliminar ácido palmítico. Es improbable que la diferencia en el grado de la modificación en las células de insecto y de mamífero esté relacionada con la especie, ya que la erizo ligada de la Drosophila y producida en células de insecto carecía de ácido palmítico (19) a pesar de tener una secuencia N-terminal idéntica.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

3

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Ejemplo 6 Modificaciones con lípidos de la erizo sónico de rata

Este ejemplo ilustra que una variedad de lípidos se unen a una versión soluble de la erizo Sónico de rata cuando el gen Shh de rata que codifica los residuos 1-174 se expresa en células de insecto High Five^{TM}, esencialmente de la misma manera que para la Shh completa humana descrita en el ejemplo 1. La modificación con lípidos hace que esta fracción se asocie a la membrana. El fragmento N-terminal (residuos 1-174 de la erizo Sónico de rata no procesada) se diferencia sólo en dos residuos aminoácidos del fragmento N-terminal de la erizo Sónico humana. En el fragmento N-terminal de la erizo Sónico de rata, la treonina sustituye a la serina en la posición 44, y el ácido aspártico sustituye a la glicina en la posición 173. Cuando la erizo Sónico de rata que carece del dominio de autoprocesamiento se expresa las células de insecto sistema de expresión células de insecto High-Five^{TM}/ baculovirus, la mayor parte de la proteína se segrega al medio de cultivo ya que carece de capacidad para unir una porción de colesterol al extremo C-terminal. La forma soluble presenta una actividad biológica específica (medida mediante el ensayo de inducción de fosfatasa alcalina con C3H10T1/2 del ejemplo 3) similar a la del fragmento N-terminal de la erizo Sónico humana soluble expresada y purificada de E. coli.

No obstante, una pequeña fracción de la proteína total permanece asociada a las células de insecto. La proteína erizo Sónico de rata asociada a células se purificó esencialmente como se describe en el ejemplo 1, y se descubrió que era significativamente más activa en el ensayo de fosfatasa alcalina (datos no presentados) que los fragmentos N-terminales de las erizos Sónicos solubles tanto humana como de rata purificadas de E. coli y del sistema de expresión de células de insecto High Five^{TM}/ baculovirus, respectivamente. Los análisis posteriores de fragmentos N-terminales de la erizo Sónico de rata mediante HPLC y espectrometría de masas por electrodispersión (como se describe en el ejemplo 1) sugieren que la proteína está modificada con lípidos y que existía más de un tipo de modificación lipídica. Los datos que respaldan esta explicación incluyen las siguientes observaciones:

1. Las formas asociadas a la célula eluyen más tarde que los fragmentos N-terminales solubles de erizo Sónico humana y de rata obtenidos de una columna C_{4} de HPLC en fase inversa (Vydac, número de catálogo 214TP104) desarrollada con un gradiente lineal de acetonitrilo 0-70% de 30 min en ácido trifluoroacético al 0,1%.

2. Las masas de las formas asociadas a células se corresponden con las esperadas para las proteínas modificadas con lípidos, tal como se muestra en la tabla 5.

TABLA 5

Masas de varias formas de erizo Sónico de rata modificada con lípidos.
Proteína	Aducto	Masa esperada	Masa observada
(MH^{+})		(MH+)
no modificada	Ninguna	19.632,08	19.632
miristoil-	CH_{3}(CH_{2})_{12}CO-	19.842,50	19.841
palmitoil-	CH_{3}(CH_{2})_{14} CO-	19.870,55	19.868
estearoil-	CH_{3}(CH_{2})_{16} CO-	19.898,60	19.896
araquidoil-	CH_{3}(CH_{2})_{18} CO-	19.626,66	19.925
*Para calcular las masas previstas se utilizaron las masas medias.

La localización de la porción lipídica se determinó mediante una combinación de análisis de la secuencia y cartografía del péptido. La secuenciación automática del N-terminal por el método de Edman de las formas modificadas con lípidos indicó que el extremo N-terminal estaba bloqueado, lo que sugería que el lípido estaba unido el amino \alpha de la cisteína N-terminal. Se utilizó la cartografía del péptido endo-lys-C, espectrometría de masas MALDI-TOF y análisis mediante MALDI PSD (como se describe en el ejemplo 1) de las formas modificadas con lípido alquiladas con 4-vinilpiridina para confirmar la localización de las modificaciones lipídicas y para determinar sus masas exactas.

Las masas de los péptidos N-terminales (residuos 1-9 incluidos más la 4-vinilpiridina unida al tiol de la cadena lateral de la cisteína N-terminal) portadoras de las modificaciones con lípido coincidían en margen de 0,1 Da con las esperadas para los péptidos modificados con lípido como se muestra en la tabla 6.

TABLA 6

Masas de los péptidos N-terminales de varias formas de erizo Sónico de rata modificadas con
lípido
Proteína	Aducto	Masa prevista	Masa observada
(MH^{+})		(MH+)
miristoil-	CH_{3}(CH_{2})_{12}CO-	1193,69	1193,76
palmitoil-	CH_{3}(CH_{2})_{14} CO	1221,72	1221,65
estearoil-	CH_{3}(CH_{2})_{16} CO-	1249,75	1249,71
*Para calcular la masas previstas se utilizaron las masas monoisotópicas.

Además de los péptidos modificados con lípido que aparecen en la tabla 6, también se detectaron péptidos con masas de 1191,74, 1219,84 y 1247,82. Estas masas coinciden con las de las formas insaturadas del miristato, el palmitato y el estearato, respectivamente, aunque no se determinó la posición del doble enlace en la cadena de alquilo. Estas observaciones indican que los ácidos grasos tanto saturados como insaturados pueden unirse covalentemente a la cisteína N-terminal. En los péptidos modificados con lípidos tanto saturados como insaturados, los análisis MALDI-PSD que se describen en el ejemplo confirmaron que los lípidos estaban unidos covalentemente al residuo de la cisteína N-terminal.

Ejemplo 7 Modificación con lípidos de la erizo indio

Para valorar si la reacción de palmitoilación era exclusiva de la Shh humana o si podría aparecer también en otras proteínas erizo, analizamos si la erizo indio humana (expresado en E. coli como una proteína de fusión con cola de His y con un sitio de escisión para la enterocinasa inmediatamente adyacente al inicio de la secuencia madura, y purificada exactamente igual que la erizo Sónico humana recombinante [véase el ejemplo 9]) podría palmitoilarse utilizando el ensayo descrito en el ejemplo 2. La erizo indio humana se modificó (véase la figura 1, carril h) lo que indica que es probable que la plamitoilación sea una característica común de las proteínas erizo. La capacidad de marcar directamente la Shh y la Ihh con ácido palmítico radioactivo en un sistema acelular proporcionó un sistema de sencillo de selección para los aminoácidos implicados en la reacción de modificación. Además, la erizo indio palmitoilada mediante el método descrito en el ejemplo 8 era significativamente más potente en el ensayo con C3H10T1/2 que la Ihh no modificada.

Ejemplo 8 Modificaciónes con lípidos de la erizo sónico utilizando acilcoenzima A

La acilación in vitro de una proteína que contenga una cisteína N-terminal puede conseguirse a través de una reacción química en dos etapas con un donante tioéster de ácido graso. En la primera etapa, el grupo acilo del donante tioéster se transfiere al sulfidrilo de la cisteína N-terminal de la proteína mediante una reacción espontánea de transesterificación. A continuación, la porción acilo experimenta un cambio de S a N del amino \alpha de la cisteína N-terminal para formar un enlace amídico estable. La acilación directa de una función amina en una proteína también puede darse con la incubación prolongada con un tioéster, pero la presencia de una cisteína en la proteína acelerará la reacción y permitirá controlar el sitio de acilación. En los presentes ejemplos se han utilizado derivados comerciales de la coenzima A (Sigma Chemical Company. St. Louis MO) pero con otros grupos tioéster también se obtendría el mismo resultado. De hecho, cabe esperar que algunos grupos salientes, tales como los ésteres de tiobencilo, reaccionen más rápido. Los residuos internos de cisteína también pueden promover la acilación de las lisinas adyacentes (es decir, como en un par cisteína-lisina interno), y esto puede analizarse convenientemente con péptidos sintéticos. Las acilaciones secundarias que se producen en una proteína durante las reacciones con tioésteres pueden evitarse controlando la composición del tampón, el pH o mediante mutagénesis dirigida de las lisinas adyacentes.

En un análisis preliminar del efecto de la acilación en la capacidad de la erizo Sónico humana para inducir la fosfatasa alcalina en células C3H10T1/2, las mezclas de reacción contenían 1 mg/ml de erizo Sónico humana (51 \muM), 500 \muM de la acilcoenzima A particular comercial (los compuestos analizados incluyen acetil-CoA (C2:O) butiril-CoA (C4;0), hexanoil-CoA (C6:0), octanoil-CoA (C8:0), decanoil-CoA (C10:0), lauroil-CoA (C12:0), miristoil-CoA (C14: 0), palmitoil-CoA (C16:0), palmitoleoil-CoA (C16:1), estearoil-CoA (C18:0), araquidoil-CoA (C20:0), behenoil-CoA (C22:0), lignoceroil-CoA (C24:0), succinil-CoA, y benzoil-CoA), DTT 25 mM, y Na_{2}HPO_{4} 50 mM a pH 7,0. Las reacciones se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas y después se analizaron inmediatamente (sin purificación) para determinar la bioactividad en el ensayo con C3H10T1/2 tal como se describe en el ejemplo 3. Las muestras para análisis mediante HPLC en fase inversa y otros procedimientos físicos se almacenaron habitualmente a -70ºC. El análisis de HPLC se llevó a cabo en una columna de fase inversa Vydac C_{4} (4,6 mm de diámetro interno x 250 mm, partículas de 5 micras) con un gradiente de acetonitrilo al 5% a acetonitrilo al 85% de 40 min en ATF acuoso al 0,1%, con una velocidad de flujo de 1 ml/min. El efluente se monitorizó a 280 mn y en algunos experimentos se recogieron fracciones y se analizaron para determinar proteína erizo mediante SDS-PAGE con detección por tinción Coomassie y Western blot.

La comparación de la actividad de las diversas mezclas de reacción (figura 10) indica que una longitud de cadena de entre 12 y 18 carbonos es óptima para inducir una alta actividad fosfatasa alcalina en comparación con la proteína no modificada. Un aumento mayor de la longitud de la cadena resultó en una aparente reducción de la actividad, y la presencia de un enlace doble en la palmitoleoil-CoA insaturada (C16:1) produjo la misma actividad que la palmitoleoil-CoA (C16:0) completamente saturada. Tras el análisis mediante HPLC en fase inversa de las mezclas de reacción, observamos que muchos de los derivados acil-CoA de menor longitud de cadena no habían reaccionado con la proteína erizo, y por lo tanto, la dependencia de la actividad biológica que se muestra en la figura 10 no era un reflejo veraz de la longitud de la cadena de acilo.

Para obtener datos sobre la verdadera actividad de las proteínas modificadas y sobre la dependencia de la actividad en relación con la longitud de la cadena de acilo, hemos desarrollado procedimientos para la síntesis y purificación de las formas aciladas individuales del N-terminal. Las proteínas erizo Sónico palmitoiladas, miristoiladas, lauroiladas, decanoiladas y octanoiladas, portadoras de una sola cadena de acilo unida al amino \alpha de la cisteína N-terminal se produjeron en mezclas de reacción que contenían 0,80 mg/ml (41 \muM) de erizo Sónico humana, palmitoil-CoA, miristoil-CoA o lauroil-CoA 410 \muM (o un exceso molar de 10 veces), o bien decanoil-CoA u octanoil-CoA 4,1 mM (exceso molar de 100-veces), DTT 25 mM (para las mezclas de reacción que contengan palmitoil-CoA, miristoil-CoA o lauroil-CoA) o DTT 0,5 mM (para las mezclas de reacción que contengan decanoil-CoA u octanoil-CoA) y Na_{2}HPO_{4} 40 mM pH 7,0. Las mezclas de reacción se incubaron a 28ºC durante 24 horas. La reacción de la cisteína N-terminal con los aciltioésteres da lugar a la transferencia del grupo acilo al sulfidrilo mediante una reacción espontánea de transesterificación, que va seguida de un cambio de S a N del amino \alpha para formar un enlace amídico estable. Entonces, el sulfidrilo libre experimenta una segunda reacción de transesterificación que produce una proteína con un grupo acilo graso unido al sulfidrilo a través de un enlace tioéster. El grupo acilo unido a un tioéster se eliminó añadiendo consecutivamente 0,11 volúmenes de Na_{2}HPO_{4} 1 M a pH 9,0 y 0,11 volúmenes de hidroxilamina 1 M (concentración final de 0,1 M) seguida de incubación a 28ºC durante 18 horas, lo que hace que sólo la acilamida quede unida a la proteína (62), a continuación se añadieron 0,25 volúmenes de de octilglucósido al 5% (concentración final al 1%) y la mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas se purificaron entonces en presencia de de octilglucósido al 1% utilizando las cromatografías de intercambio iónico de cationes SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) y Bio Scale S (Biorad). Las proteínas purificadas se dializaron contra a Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM, octilglucósido al 1% y DTT 0,5 mM, y se almacenaron a -70ºC. La presencia de octilglucósido era necesaria para mantener la total solubilidad; la eliminación del detergente mediante dilución y diálisis dio lugar a una pérdida del 75%, 41% y 15% de las proteínas palmitoiladas, miristoiladas y lauroiladas, respectivamente. La ESI-MS de las proteínas purificadas mediante HPLC confirmó su integridad: erizo Sónico palmitoilado, masa medida = 19798, masa calculada = 19798,43; erizo Sónico miristoilado, masa medida = 19770, masa calculada = 19770,33; erizo Sónico laurolado, masa medida = 19742 masa calculada = 19742,33; erizo Sónico decanoilado, masa medida = 19715, masa calculada = 19714,28; erizo Sónico octanoilado, masa medida = 19686, masa calculada =
19686,23.

El análisis de las diversas formas aciladas de erizo Sónico humana en el ensayo con C3H10T1/2 (figura 11) indicó que la actividad de las proteínas dependía de la longitud de la cadena. Las proteínas palmitoiladas, miristoiladas y lauroiladas presentaron una actividad aproximadamente equivalente, con valores de CE_{50} de 5-10 ng/ml (aumento en 100-200 veces de la potencia en comparación con la proteína no modificada). La erizo Sónico humana decanoilada, con un valor CE_{50} de 60-70 ng/ml (aumento en 15-30 veces de la potencia en comparación con la proteína no modificada) fue menos activa que las formas palmitoilada, miristoilada y lauroilada, mientras que la forma octanoilada fue la menos activa con un valor de CE_{50} de 100-200 ng/ml (aumento en 10 veces de la potencia en comparación con la proteína no modificada). Todas las formas aciladas fueron más potentes que la proteína no modificada que tuvo una CE_{50} de 1000-2000 ng/ml. Además del descenso de la CE_{50}, las proteínas palmitoiolada, miristoilada y lauroilada indujeron aproximadamente 2 veces más actividad fosfatasa alcalina que la proteína no modificada, mientras que las proteínas decanoilada y octanoilada indujeron aproximadamente 1,5 veces más.

Además del aumento de la potencia de la forma miristoilada de la erizo Sónico humana observada en el ensayo con C3H10T1/2, esta forma es significativamente más potente que la proteína no modificada para inducir neuronas del cerebro ventral anterior en explantes de telencéfalo de cerebro de rata en la fase embrionaria E11. La incubación de explantes telencefálicos E11 con diversas concentraciones de erizo Sónico no modificada, o miristoilada, y la posterior tinción de los explantes para los productos de los genes dlx e islet-1/2 (marcadores de las neuronas ventrales del cerebro anterior), indica que aunque se observa inducción por parte de la proteína no modificada por primera vez a 48 nM, la inducción por parte de la forma miristoilada se observa por primera vez a 3 nM. Además, aunque la proteína no modificada induce la expresión restringida a 3070 nM, la proteína miristoilada induce una expresión amplia a sólo 48 nM. Un aumento de potencia similar se observó cuando los explantes del presunto telencéfalo embrionario en fase E9 se incubaron, bien con la proteína no modificada o bien con la miristoilada. La tinción de los explantes del producto del gen Nkx2.1 (un marcador temprano de las neuronas ventrales del cerebro anterior) indicó que la proteína no modificada inducía Nkx2.1 por primera vez a 384 nM mientras que para la proteína miristoilada, la expresión de Nkx2.1 se observó por primera vez a 12 nM. Además, con la erizo Sónico miristoilada a 48 nM, la expresión de Nkx2.1 era amplia aunque no era detectable a esta concentración utilizando la forma no modificada.

Además, la erizo Sónico humana miristoilada ha demostrado que es significativamente más protectora que la proteína no modificada para reducir el volumen de lesión que resulta de la administración de malonato en el cuerpo estriatal del cerebro de rata (véase el ejemplo 16).

Ejemplo 9 Derivados químicos de la cisteína N-terminal de la erizo sónico humana A. Procedimientos generales

Alquilación de proteínas. Muestras que contenían unos 20 \mug de la proteína en 50 \mul de cloruro de guanidinio 6M, Na_{2}H PO_{4} 50 mM a pH 7,0, se trataron con 0,5 \mul de 4-vinilpiridina durante 2 horas a temperatura ambiente. La proteína S-piridiletilada se precipitó mediante adición de 40 volúmenes de etanol frío. La disolución se almacenó a -20ºC durante 1 hora y después se centrifugó a 14.000 g durante 8 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se desecharon y el precipitado se lavó con etanol frío. La proteína se almacenó a -20ºC.

Cartografía del péptido. La proteína alquilada (0,4 mg/ml en cloruro de guanidinio 1 M, Na_{2}HPO_{4} 20 mM a pH 6,0) se digirió con endo-lys-C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en una proporción de 1:20. La digestión se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 30 horas. La reacción se inactivó mediante acidificación con 5 \mul de ácido trifluoroacético al 25%. El producto de la digestión se analizó en un módulo de separación Waters 2690 con un detector de red de fotodiodos Modelo 996. Antes de la inyección, se añadió a la digestión cloruro de guanidinio en una concentración de 6 M para disolver el material insoluble. Para llevar a cabo la separación se utilizó una columna Vydac C_{18} (2,1 mm de diámetro interno x 250 mm) de fase inversa con un gradiente de 90 minutos de ácido trifluoroacético al 0,1%/acetonitrilo y ácido trifluoroacético al 0,1%/acetonitrilo a una velocidad de flujo de 0,2 ml/min. Los picos individuales se recogieron manualmente para el análisis de masas.

Determinación de masas. Las masas moleculares de las proteínas intactas se determinaron mediante espectroscopía de masas con ionización por electrodispersión (ESI-MS) en un espectrómetro de masas Micromass Quattro II triple cuadripolar. Las muestras se desalaron con un sistema on-line de análisis de proteínas Michrom Ultrafast microprotein Analyzer con una columna Reliasil C_{4} (1 mm de diámetro interno x 50 mm). La velocidad de flujo fue de 20 \mul/min. Todos los datos del espectro de masa obtenido por electrodispersión se procesaron con el sistema de datos Micromass Mass-Lynx. Las masas moleculares de los péptidos se determinaron mediante espectroscopia de masa láser de desorción/ionización asistida por matriz de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) en un Voyager-DETM STR (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA). La secuenciación del péptido modificado se llevó a cabo mediante medición de decaimiento post- fuente (PSD) en el mismo instrumento; para la matriz se utilizó ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico.

Secuenciación del N-terminal. Las proteínas se secuenciaron mediante degradación Edman en un secuenciador de proteínas de líquido pulsado (Pulsed-Liquid Protein Sequencer) modelo 477A de Perkin-Elmer Applied Biosystems. La PTH-tioprolina se realizó simultáneamente cargando directamente la tioprolina (ácido tiazolidino-4-carboxílico) en la bandeja de carga de muestras del secuenciador.

Expresión y purificación bacteriana del fragmento N-terminal de la erizo Sónico humana soluble natural utilizada para la modificación química. Se descongelaron sedimentos bacterianos de células que expresan Shh al 4-5% de la proteína total, se resuspendieron en tampón de lisis (Na_{2}HPO_{4} 25 mM a pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, FFMS 1 mM y DTT 0.5 mM) en una proporción de 1:4 (peso/volumen) y se lisaron mediante dos pases a través de un homogeneizador Gaulin (fabricado por APV Rannie, Copenhague, Dinamarca) a 12.0000 p.s.i. Todas las etapas posteriores de purificación se llevaron a cabo a 2-8ºC a menos que se indique lo contrario. El homogeneizado se centrifugó a 19.000 g durante 60 minutos y se añadió MES 0,5 M a pH 5 al lisado resultante en una proporción de 1:10 (volumen/volumen). El lisado (a pH 5,5) se cargó en una columna de SP Sefarosa Fast Flow (Pharmacia, Piscataway, NJ) (4 g. peso húmedo de E. coli/ml de resina) equilibrada con Na_{2}HPO_{4} 25 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM. La columna se lavó con 4 volúmenes equivalentes a la columna (VC) de tampón de equilibrado y después con tres volúmenes VC de Na_{2}HPO_{4} 25 mM a pH 5,5. NaCl 200 mM, DTT 0,5 mM. La Shh con cola de histidina se eluyó con NaCl 800 mM en el mismo tampón. Se analizó la absorbancia de las fracciones de elución a 280 nm y mediante SDS-PAGE. Se añadió imizadol (disolución de reserva 1 M a pH 7) y NaCl (disolución de reserva 5 M) al eluido total de la SP sefarosa que contenían los picos de Shh para dar concentraciones finales de 20 mM y de 1 M, respectivamente, y este material se cargó en una columna de agarosa NTA-Ni (Qiagen, Santa Clara, CA)(20 mg/ml de resina) equilibrada con Na_{2}HPO_{4} 25 mM a pH 8, NaCl 1 M, imidazol 20 mM, DTT 0,5 mM. La columna se lavó con 5 VC del mismo tampón y la Shh con cola de histidina se eluyó con 3 CV de Na_{2}HPO_{4} 25 mM pH 8, NaCl 1 M, imidazol 200 mM, DTT 0,5 mM. El contenido en proteínas del eluido total de la columna NTA-Ni se determinó mediante la absorbancia a 280 nm. El eluido total se calentó hasta la temperatura ambiente y se añadió un volumen equivalente de sulfato de sodio 2,5 M. La inactivación de la fenil sefarosa se llevó a cabo a temperatura ambiente. El material se cargó en una columna Phenyl Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Piscataway, NJ) (20 mg/ml de resina) equilibrada con Na_{2}HPO_{4} 25 mM a pH 8, NaCl 400 mM, sulfato de sodio 1,25 M, DTT 0,5 mM. La Shh con cola de histidina y eluida con Na_{2}HPO_{4} 25 mM a pH 8, NaCl 400 mM y DTT 0,5 mM. Típicamente, recuperamos 2-3 g de Shh con cola de histidina a partir de 0,5 kg de pasta bacteriana (peso húmedo). El producto se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum, se repartió en alícuotas y se almacenó a -70ºC. La Shh con cola de histidina tuvo una pureza del 95%, determinada por SDS-PAGE Como evaluación adicional de las características del producto purificado, las muestras se sometieron a evaluación mediante espectrometría de masas con ionización por electrodispersión (ESI-MS). Aproximadamente el 50% de la proteína carecía de la metionina N-terminal.

Para escindir la cola de hexahistidina, se incubó enterocinasa (Biozyme, San Diego, CA) con la Shh con la cola de histidina con una proporción enzima:Shh de 1:1000 (peso/peso) durante 2 horas a 28ºC. La Shh con cola de histidina no escindida y la cola de histidina libre se eliminaron pasando el producto de digestión a través de una segunda columna de agarosa NTA-Ni (20 mg Shh/ml de resina). Antes de cargar, se añadió imidazol (disolución de reserva 1 M a pH 7) y NaCl (disolución de reserva 5 M) al producto de digestión para obtener unas concentraciones finales de 20 mM y 600 mM, respectivamente. Este material se cargó en una columna NTA-Ni equilibrada en Na_{2}HPO_{4} 25 mM a pH 8, imidazol 20 mM, DTT 0.5 mM y se recogió tras el flujo a través de la misma. La columna se lavó con un VC del mismo tampón y se almacenó junto con el material recogido anterior. Se añadió MES (solución de reserva 0,5 M a pH 5) a la fracción no unida a NTA-Ni agarosa hasta una concentración final de 50 mM, y se agregaron dos volúmenes de agua. Este material se cargó en una segunda columna SP Sefarosa Fast Flow (20 mg/ml de resina) equilibrada con Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM y DTT 0,5 mM. La columna se lavó con tres VC de tampón de equilibrado y un CV del mismo tampón que contenía NaCl 300 mM. La Shh se eluyó con Na_{2}HPO4 5 mM a pH 5,5. NaCl 800 mM, DTT 0,5 mM. Los datos de absorción atómica revelaron que en esta fase la Shh contenía 0,5 equivalentes mol de Zn^{2}+. Se añadió una concentración equimolar de ZnCl_{2} al eluyente de Shh y la proteína se dializó contra Na_{2}HPO4 5 mM a pH 5,5. NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM. La Shh resultante tuvo una pureza > 98%, caracterizada por SDS-PAGE, cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) y ESI-MS y, mediante absorción atómica, contenía entre 0,9 y 1,1 Zn^{2+}/Shh.

Los datos obtenidos mediante ESI-MS para la Shh con cola de histidina y los productos resultantes después de la eliminación de la cola de histidina se resumen en la tabla 7.

TABLA 7

Caracterización de la Shh mediante ESI-MS
Proteína		Masa (Da)
		Calculada	Medida
Shh con cola	(-Met)	21433,82	21434
de histidina	(Intacta)	21565,01	21565
Shh escindida con enterocinasa	19560,02	19560

B. Modificaciones químicas específicas

Modificación de la erizo Sónico humana con N-etilmaleimida. La Shh purificada en Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM se trató con N-etilmaleimida 10 mM en hielo durante una hora y después se dializó en Na_{2}HPO_{4} 5mM a pH 5,5 y NaCl 150 mM. Los datos de la MALDI-TOF demostraron que la proteína modificada con N-etilmaelimida (NEM) presentaba un aumento de la masa de 126 Da, lo que indica que sólo un residuo de cisteína de la Shh fue modificado por el reactivo. Los datos de secuenciación del N-terminal demostraron que la proteína es secuencial y que en el primer ciclo se detectó un pico inusual, probablemente relacionado con PTH-NEM-Cys (datos no presentados). El análisis espectrométrico de masas de la Shh-NEM-piridiletilada en condiciones desnaturalizantes demostró que sólo dos residuos de cisteína de la proteína estaban alquilados, confirmando que sólo el grupo tiol del residuo de cisteína N-terminal se había modificado por el NEM en condiciones nativas (tabla 8). Los otros dos residuos de cisteína, que aparentemente estaban enterrados en el núcleo hidrófobo de la proteína, no pueden modificarse sin desnaturalización previa.

TABLA 8

Caracterización de la Shh modificada con NEM mediante EM
Proteína	Masa (calculada)	Masa (medida)
Shh NEM piridietilada		19895 Da
Si contiene 2 residuos Cys libres	19895 Da
Si contiene 3 residuos Cys libres	20000 Da

Cuando se analizó en el ensayo con C3H10T1/2 (véase el ejemplo 3) la erizo modificada con N-etilmaleimida presentó una actividad equivalente a la de la proteína no modificada. Esto demuestra que no es necesario que haya un sulfidrilo libre en el extremo N-terminal de la erizo para la actividad y que la porción de N-etilmaleimida es lo bastante hidrófoba para dotar a la erizo de cierta actividad en comparación con otras modificaciones más hidrófilas, como la conversión de Cys-1 a His o Asp, que producen una reducción de la actividad.

Modificación de la erizo Sónico humana con formaldehído para formar una tioprolina N-terminal, y con acetaldehído y butiraldehído para formar derivados de tioprolina N-terminales. Para la modificación con formaldehído, se trató Shh purificada a 3 mg/ml en Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5, DTT 0,5 mM con formaldehído al 0,1%, con o sin metanol al 10%, a temperatura ambiente durante 1 a 6 horas. La proteína se dializó contra Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5. NaCl 150 mM, o se purificó en una columna CM-Poros (Perspective Biosystems), tal como se describe más adelante, y se dializó contra Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM. Para la modificación con acetaldehído o butiraldehído, la Shh purificada a 3 mg/ml en Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM se trató con acetaldehído o butiraldehído al 0,1%, a temperatura ambiente durante 1 hora y después se purificó la proteína en una columna CM-Poros. Los datos obtenidos mediante ESI-MS para las formas de la proteína tratadas con formaldehído, acetaldehído y butiraldehído indicaron que sus masas eran 13 Da, 27 Da y 54 Da mayores, respectivamente, que la proteína no modificada (tabla 9).

TABLA 9

Masas previstas y observadas de la erizo Sónico humana tratada con formaldehído, acetaldehído y
butiraldehído.
Proteína	Masa esperada* (MH+)	Masa observada* (MH+)
No modificada	19560,02	19560
Tratada con formaldehído	19572,03	19573
Tratada con acetaldehído	19586,06	19587
Tratada con butiraldehído	19614,11	19614
*Para calcular las masas esperadas se utilizaron las masas medias.

Para la proteína tratada con formaldehído, la cartografía de péptidos demostró, como se ha descrito anteriormente, que el sitio de modificación aparecía en el péptido que comprendía los primeros 9 residuos N-terminales, y que el aumento exacto de masa era de 12 Da. Los resultados de los análisis de éste péptido mediante MALDI-PSD indicaron que la modificación aparecía en la Cis-1 y podía explicarse por la modificación del amino \alpha N-terminal y del tiol de la cadena lateral de la Cys-1 para formar una tioprolina (véase la figura 12). La estructura de la tioprolina se confirmó mediante secuenciación automática del N-terminal de Edman con PTH-tioprolina preparada "en línea" como patrón. Para las proteínas tratadas con acetaldehído y butiraldehído, los datos obtenidos de la ESI-MS coincidían con las modificaciones que aparecen mediante el mismo proceso químico, al igual que con la reacción con formaldehído aunque no se ha establecido el sitio exacto de la modificación. Cuando se analizaron en el ensayo con células C3H10T1/2, las proteínas modificadas con formaldehído, acetaldehído y butiraldehído fueron aproximadamente 8 veces, 2 veces y 3 veces, más potentes respectivamente que la proteína Shh no modificada.

Modificación de la erizo Sónico humana con N-isopropilyodoactamida. Este ejemplo demuestra que la modificación de la Shh humana con un derivado hidrófobo de la yodoacetamida puede aumentar la potencia de la proteína en comparación con la Shh no modificada. La Shh purificada (1 mg/ml en Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 7,0, NaCl 150 mM, DTT 0,1 mM) se incubó con N-isopropilyodoacetamida (NIPIA) a 4ºC durante 18 horas. Entonces se añadió DTT hasta una concentración final de 10 mM y la muestra se dializó exhaustivamente contra Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM. La muestra se purificó con resina SP Sefarosa Fast Flow y se volvió a dializar contra Na_{2}HPO_{4} 5 mM pH 5,5, NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM. Los datos obtenidos de la ESI-MS revelaron una conversión completa a una especie con una masa de 19660, correspondiente al valor de masa predicho (19659) para la proteína modificada individualmente. La modificación específica de la cisteína N-terminal se confirmó mediante cartografía de fragmentos proteolíticos. Cuando se analizó en el ensayo con células C3H10T1/2, la erizo humana modificada con NIPIA fue aproximadamente 2 veces más potente que la proteína no modificada. Mientras que la modificación de la proteína resultó apenas en un discreto aumento de la potencia, se espera que la modificación de la proteína con derivados de alquilyodoacetamida de cadena larga darán lugar a formas de la proteína modificadas hidrófobamente con aumentos mucho mayores de potencia, posiblemente cercanos a los aumentos de 100-200 veces observados para las proteínas Shh palmitoiladas, miristoiladas y lauroiladas (véase el ejemplo 8).

Modificación de la erizo Sónico humana con 1-bromo-2-butanona para formar un anillo hidrófobo de seis miembros en el extremo N-terminal. Se preparó un derivado de tiomorfolinilo (tetrahidrotiazinilo) de Shh mediante incubación de Shh-N humana (3 mg/ml en Na_{2}HPO_{4} a pH 5, 5 5mM, NaCl 150 mM, DTT 0,15 mM) con 1-bromo-2-butanona 11 mM a temperatura ambiente durante 60 minutos, seguida de reducción con NaCNBH_{3} 5 mM a temperatura ambiente durante 60 min. El producto de la reacción se purificó en una columna CM-Poros (Perspective Biosystems) tal como se describe más adelante, y se dializó contra Na_{2}HPO_{4} 5 mM s pH 5,5, NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM. Los datos obtenidos mediante API-ES y cartografía proteolítica del péptido indicaron que el producto era una mezcla del derivado de tiomorfolinilo esperado (masa calculada = 19615, masa observada = 19615) y dos formas de la proteína, ambas con 16 unidades de masa adicionales. Una de estas formas es posiblemente el intermediario de ceto-tioéter no ciclizado. La mezcla se analizó con el ensayo C3H10T1/2, que reveló que era aproximadamente 5 veces más potente que la proteína no modificada.

Ejemplo 10 Mutaciones de la erizo sónico humana inducidas por ingeniería genética A. Mutaciones inducidas por ingeniería genética de la cisteína N-terminal

En este ejemplo, demostramos que la sustitución específica de la cisteína N-terminal de la erizo Sónico humana (Cys-1) por uno o múltiples residuos aminoácidos hidrófobos da lugar a un aumento de potencia en comparación con la proteína natural en el ensayo con células C3H10T1/2 que se descrito en el ejemplo 3: Construcción de mutantes Shh Cys: El fragmento de restricción Ncol-Xhol de 584 pb portador del fragmento N-terminal de Shh natural con cola de histidina de p6H-SHH se subclonó en el vector de clonación pNN05 derivado del pUC para construir el plásmido pEAG649. Los mutantes Cys-1 de la Shh humana soluble se fabricaron mediante mutagénesis por eliminación de sitio único del molde de plásmido pEAG649 con un kit de Pharmacia y siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Al diseñar los cebadores mutagénicos, si una mutación deseada no producía un cambio en el sitio de restricción, se introducía una mutación silenciosa que producía un cambio en el sitio de restricción en un codón adyacente para facilitar la identificación de los clones mutantes tras la mutagénesis. Para evitar un uso aberrante de los codones, los codones sustituidos se eligieron entre los que aparecen al menos una vez en otros puntos de la secuencia de ADNc de la Shh humana. Se utilizaron los siguientes cebadores mutagénicos: (1) para C1F: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA TTC GGA CCG GGC AGG GGG TTC (ID SEC Nº:_____________), que introduce un sitio Apol para generar pEAG83; (2) para C1I: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AA A ATA GGA CCG GGC AGG GGG TTC 3' (ID SEC Nº:_____________), que pierde un sitio RsrII para generar pEAG838 y (3) para C 1M: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATG GGC CCG GGC AGG GGG TTC GGG 3' (ID SEC Nº:_______________), que pierde tanto el sitio RsrII como el AvaII para generar pEAG839 y (3) para C1M: 5`GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATG GGC CCG GGC AGG GGG TTC GGG 3'(ID SEC Nº:___________), que pierde los dos sitios RsrII y AvaII para generar PEAG839. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN a través de un fragmento de restricción de Ncol-BgIII de 180 pb que porta los extremos N-terminales de las proteínas SHH mutantes en los plásmidos pEAG837-839. Los vectores de expresión se construyeron subclonando cada fragmento de Ncol-BgIII de 180 pb mutante y el fragmento de 404 pb de BgIII-XhoI de pEAG649 en el esqueleto de 5,64 kb Xhol-Ncol del vector Ncol pET11d tratado con fosfatasa de la p6H-SHH. La presencia del cambio del sitio de restricción introducido volvió a confirmarse en el vector de expresión de cada mutante de Cys-1 (C1F en el pEAG840, C1I en el pEAG841 y C1I M en el pEAG842). Los vectores de expresión se transformaron en E. coli competentes BL21(DE3)pLysS de (Stratagene) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante, y se seleccionaron en placas de agar LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina y 30 \mug/ml de cloranfenicol. Se seleccionaron colonias individuales y las bacterias transformadas se hicieron crecer hasta una A_{600} de 0,4 a 0,6 y se indujeron durante 3 horas con IPTG 0,5 mM. Los sedimentos bacterianos se analizaron para determinar la expresión de las proteínas mutantes mediante SDS-PAGE reductora y Western blot.

Se generó una Shh mutante humana soluble con múltiples sustituciones hidrófobas en el N-terminal (CIII) mediante mutagénesis por eliminación de sitio único, utilizando un kit de Pharmacia y siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Al diseñar los cebadores mutagénicos, si una mutación deseada no producía un cambio en el sitio de restricción, se introducía una mutación silenciosa que producía un cambio en el sitio de restricción en un codón adyacente para facilitar la identificación de los clones mutantes tras la mutagénesis. Para evitar un uso aberrante de los codones, los codones sustituidos se eligieron entre los que aparecen al menos una vez en otros puntos de la secuencia de ADNc de la Shh humana. Se utilizó el siguiente cebador mutagénico en el plásmido de molde C1F pEAG937 para C1II:5' GCG GCG ATG ACG ATG ACA AAA TCA TCG GAC CGG GCA GGG GGT TCG GG 3' (ID SEC Nº: ___________), lo que elimina un sitio Apol para generar pEAG872. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN a través de un fragmento de restricción Ncol-Xhol de 0,59 kb que portaba la Shh mutante C1II. Se construyó un vector de expresión subclonando el fragmento Ncol-Xhol del plásmido mutante en el esqueleto de 5,64 kb Xhol-Ncol del vector Ncol pET11d tratado con fosfatasa de la p6H-SHH. La presencia del cambio del sitio de restricción introducido volvió a confirmarse en el vector de expresión para la C1II mutante, pEAG875. El vector de expresión se transformó en E. coli competentes BL21(DE3)pLysS de (Stratagene) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante, y se seleccionaron en placas de agar LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina y 30 \mug/ml de cloranfenicol. Se seleccionaron colonias individuales y las bacterias transformadas se hicieron crecer hasta una A_{600} de 0,4 a 0,6 y se indujeron durante 3 horas con IPTG 0,5 mM. Los sedimentos bacterianos se analizaron como se ha descrito anteriormente para confirmar la expresión de la Shh mutante.

Purificación de los mutantes Cys-1 de la erizo Sónico humana: Las proteínas erizo mutantes con cola de histidina se purificaron de los sedimentos bacterianos tal como se describe para la proteína original, excepto por dos modificaciones. (1) La etapa de la fenil sefarosa se eliminó y en su lugar se dializó el conjunto de proteínas de la primera columna de agarosa NTA-Ni en Na_{2}HPO_{4} 25 mM a pH 8, NaCl 400 mM y DTT 0,5 mM en preparación para la etapa de la escisión con enterocinasa. (2) La etapa final de intercambio iónico cambió de la elución en SP Sefarosa Fast Flow a elución en gradiente de de una columna CM-Poros (Perseptive Biosystems). Ésta se llevó a cabo en Na_{2}HPO_{4} 50 mM pH 6., con un gradiente de NaCl 0-800 mM en tres volúmenes equivalentes a la columna. Las fracciones pico almacenadas de esta etapa se dializaron en Na_{2}HPO_{4} 5 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM y se almacenaron a -80ºC. La espectrometría de masas de las proteínas purificadas dio las masas iónicas predichas para cada forma purificada.

Actividad de los mutantes de Cys-1 de la erizo Sónico humana: Tal como se muestra en la tabla 10, la mutación de la cisteína N-terminal tiene un efecto significativo sobre la potencia de la proteína erizo resultante en el ensayo con C3H10T1/2. En los cambios individuales, la potencia se correlaciona, por lo general, con la hidrofobicidad del aminoácido sustituido, es decir, la fenilalanina y la isoleucina generan la mayor actividad, la metionina es menos activamente, mientras que la histidina y el ácido aspártico reducen la actividad en comparación con la cisteína natural. La sustitución de la cisteína con dos isoleucinas da un aumento adicional de la actividad superior a la sustitución con una sola isoleucina. Dado que nueve aminoácidos están categorizados como más hidrófobos que la cisteína (Proteins: structures and molecular properties, ^{2nd}ed. 1993, T. E. Creighton, W. H. Freeman Co. pág. 154), las sustituciones analizadas anteriormente claramente no constituyen un seguimiento exhaustivo de las mutaciones posibles en el extremo N-terminal que pueden dar lugar a formas más activas de la erizo. No obstante, los resultados demuestran que la activación no está limitada a una única estructura de aminoácido y que la sustitución de más de un aminoácido puede producir un aumento de potencia aún mayor. Por lo tanto, un experto en la técnica puede crear formas de erizo con otras sustituciones de aminoácido en el extremo N-terminal que cabe esperar que tengan más potencia que la proteína natural.

TABLA 10

Potencia relativa de las modificaciones de aminoácido de la erizo Sónico
humana en C3H10T1/2
EXTREMO N-TERMINAL	POTENCIA RELATIVA
C(natural)	1X
M	2X
F	4X
I	4X
II	10X

B. Mutaciones inducidas por ingeniería genética de residuos internos

Construcción del la C1 II/A 169C mutante. La Shh mutante humana soluble C1 II/A169C (con la cisteína sustituida para el residuo C-terminal A169 dispensable del que se prevé que tenga una accesibilidad fraccional del disolvente alta) se generó mediante mutagénesis por eliminación de sitio único utilizando un kit de Pharmacia, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y empleando los principios de diseño de oligos mutagénicos descritos anteriormente. El siguiente cebador mutagénico 5' GAG TCA TCA GCC TCC CGA TTT TGC GCA CAC CGA GTT CTC TGC TTT CAC C 3' (ID SEC Nº:_____________) se usó en el molde de pEAG872 con Shh C1II para añadir un sitio Fspl para generar pSYS049. Las mutaciones de la C1 II/A169C se confirmaron mediante secuenciación de ADN a través de un fragmento de restricción Ncol-Xhol de 0,59 kb. El vector de expresión pSYS050 se construyó subclonando el fragmento Ncol-Xhol en el esqueleto de 5,64 kb del vector Xhol-Ncol del vector pET11 tratado con fosfatasa de la p6H-SHH. La presencia del cambio del sitio de restricción introducido volvió a confirmarse en el vector de expresión. El vector de expresión se transformó en E. coli competentes BL21(DE3)pLysS las colonias se seleccionaron, se indujeron y se examinaron para determinar la expresión de la Shh tal como se ha descrito anteriormente.

Purificación de la C1II/A169C mutante: La C1l1/A169C mutante se purificó como se describe en el ejemplo 9 para la Shh natural, a excepción de las siguientes modificaciones: (1) no se añadió EDTA al tampón de lisis (2) el orden de las etapas de la NTA-Ni y la SP Sefarosa se intercambió y se omitió la etapa de la fenil sefarosa (3) tras la clarificación por centrifugación de las bacterias lisadas, se añadió más NaCl al sobrenadante hasta una concentración final de 300 mM, (4) el tampón de elución de la columna de NTA-Ni contenía Na_{2}HPO_{4} 25 mM a pH 8,0, imidazol 200 mM, NaCl 400 mM; (5) el conjunto de la elución de la columna de NTA-Ni se diluyó con 3 volúmenes de MES 100 mM a pH 5,0 antes de cargarlo en la columna de SP Sefarosa, (6) antes de añadir la enterocinasa, el conjunto de la elución de la SP Sefarosa se diluyó con medio volumen de Na_{2}HPO_{4} 50 mM a pH 8,0, y (7) el DTT del tampón de elución de la columna de SP sefarosa final contenía DTT 0,2 mM y el conjunto de la elución de esta etapa se dividió en alícuotas y se almacenó a -70ºC.

Modificación hidrófoba y actividad de la C1II/A169C mutante: Para la modificación con N-(1-pireno)maleimida (Sigma), el C1II/A169C purificado a 4,6 mg/ml en Na_{2}HPO_{4} 5 mM pH 5,5, NaCl 800 mM, DTT 0,2 mM se diluyó en un volumen equivalente de MES 50 mM a pH 6,5, y a éste se añadió la veinteava parte de un volumen de pirenomaleimida de una reserva de 2,5 mg/ml en DMSO. La muestra se incubó durante una hora a temperatura ambiente y en oscuridad. En este momento se añadió más DTT hasta 0,5 mM y la muestra se incubó otra hora a temperatura ambiente. La actividad de la proteína modificada se analizó directamente con el ensayo con C3H10T1/2 que se describe en el ejemplo 3. Antes de la modificación, la actividad específica de la proteína era de CE_{50}= 0,22 \mug/ml, mientras que después del tratamiento con pirenomaleimida la actividad específica había aumentado hasta una CE_{50} = 0,08 \mug/ml. Con frecuencia se observaron aumentos de hasta el triple de la actividad específica del producto modificado, lo que indica que la adición del grupo hidrófobo cerca del extremo C-terminal de la Shh daba lugar a un aumento mayor de la actividad en comparación con el material de partida de C1II. En comparación con la proteína erizo Sónico original no modificada, la proteína C1II modificada con N-(1-pireno)maleimida era aproximadamente 30 veces más potente. Aunque que la pirenomaleimida proporciona un sistema de análisis simple para evaluar la modificación de este sitio, también se pueden usar otras maleimidas hidrófobas u otras reacciones químicas dirigidas a la cisteína.

Ejemplo 11 Comparación de la potencia de diversas formas de erizo sónico humana modificada hidrófobamente en el ensayo con C3H10T1/2

La actividad de diversas formas de erizo Sónico humana modificada hidrófobamente (preparadas con las reacciones químicas y los procedimientos de ingeniería genética descritos en la sección V) se analizó en el ensayo con C3H10T1/2 tal como se describe en el ejemplo 3.

Los derivados se analizaron en un rango de concentración como el descrito en el ejemplo 3. La concentración del derivado de la erizo que dio lugar un 50% de la respuesta máxima en el ensayo se comparó con la concentración de la proteína natural. Las actividades relativas se muestran en la tabla 11, más adelante, y en la figura 13.

TABLA 11

Potencia relativa de derivados de la erizo en el ensayo con C3H10T1/2
Modificación	CE_{50} (X veces más potente que la Shh natural)
C:16 palmitoilo	100
C:14 miristoilo	100
C:12 lauroilo	100
C:10 decanoilo	33
Isoleucil-isoleucilo con A169C pirenilo	30
C:8 octanoilo	10
Isoleucil-isoleucilo	10
C:0 tiaprolilo	8
Tiomorfolinilo	5
Fenilalanililo	4
Isoleucilo	4
N-isopropilacetamidilo	2
Metionilo	2
N-etilmaleimidilo	1
Cisteinilo (natural)	1
Aspartilo	<1

El ensayo con C3H10T1/2 demuestra que una amplia variedad de modificaciones hidrófobas a la erizo hacen aumentar la actividad de la proteína en comparación con la proteína original. Las modificaciones hidrófilas (ácido aspártico e histidina) no tienen este efecto.

Ejemplo 12 Evaluación de la eficacia de la erizo sónico humana modificada hidrófobamente en un ensayo de lesión estriatal inducida por malonato en ratas

La inyección de malonato, un inhibidor de la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa en el cuerpo estriatal de rata (el equivalente en roedores del núcleo caudado y el putamen de los primates) causa la degeneración de las neuronas espinales estriatales medias. En los seres humanos, la degeneración de las neuronas espinales medias en el núcleo caudado y el putamen es la principal característica patológica de la enfermedad de Huntington. Por lo tanto, la lesión estriatal inducida por malonato en ratas puede usarse como modelo para comprobar si las proteínas erizo modificadas hidrófobamente pueden evitar la muerte de las neuronas que degeneran en la enfermedad de Huntington.

En el cuerpo estriado de ratas Sprague-Dawley se inyectaron diversas concentraciones de erizo Sónico humana modificada hidrófobamente en utilizando técnicas estereotáxicas. Se administraron inyecciones estereotáxicas (2 \mul) bajo anestesia con pentobarbital sódico (40 mg/kg) y se situaron en las siguientes coordenadas: 0,7 mm anterior al bregma, 2,8 mm lateral a la línea media y 5,5 mm ventral a la superficie craneal, en el bregma. En varios momentos (normalmente a las 48 horas) después de la inyección de la proteína modificada hidrófobamente, se anestesió a las ratas con isoflurano y se les administró una inyección estereotáxica de malonato (2 moles en 2 \mul) en las mismas coordinadas del cuerpo estriatal. Cuatro días después de la inyección de malonato se sacrificó a las ratas y sus cerebros se extrajeron para el análisis histológico. Se cortaron secciones coronales a través del cuerpo estriatal con un grosor de 25 \mum y se tiñeron para determinar la actividad de la citocromo oxidasa, con el fin de distinguir el tejido lesionado del no lesionado. El volumen de la lesión estriatal se mide utilizando un sistema de análisis de imagen.

El efecto de la proteína erizo Sónico humana modificada hidrófobamente en el modelo de lesión estriatal inducida por malonato en ratas se muestra en la figura 14. Tanto la erizo Sónico no modificada (preparada como se describe en el ejemplo 9) como la Shh miristoilada (preparada como se describe en el ejemplo 8) y la mutante C1II de la Shh (preparada como se describe en el ejemplo 10) redujeron el volumen de la lesión en un grado similar en este modelo. Sin embargo, las proteínas modificadas hidrófobamente (Shh miristoilada y Shh C1II) mostraron un aumento de la potencia con respecto a la erizo Sónico no modificada.

Ejemplo 13 Derivatización de la SHH-N con N-octilmaleimida Para una concentración final de 1 mg/ml

1): Preparar una disolución 20 mM de octilmaleimida (p.m.= 209) en DMSO (\sim4,2 mg/ml).

2): Diluir una reserva de 10 mg/ml de sHh-N (en NaPO4 5 mM a pH 5,5 NaCl 150 mM DTT 0,5 mM) 10 veces con PBS (producto Gibco nº 20012-027 pH 7,2) para obtener una disolución de sHh-N de 1 mg/ml (ó 50 \muM). [NOTA: El DTT; que compite con la sHh-N por la maleimida en la reacción siguiente, también está a 50 \muM en esta disolución.

3): Añadir inmediatamente 1/200 volúmenes de octilmaleimida la sHh-N a 1 (es decir, 5 \mul/1 ml). Esto da una fracción molar de 2:1 (100 \muM:50 \muM) de octilmaleimida a sHh-N.

4): Mezclar esta disolución mediante inversión suave del tubo e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.

5): Finalmente, añadir 1/1000 de volumen de DTT 0,35 M a cada tubo para limpiar la octilmaleimida restante y para que sirva como reductor.

6): Para el control del vehículo, combinar una disolución de vehículo (NaPO4 5 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM) con PBS (producto Gibco nº 20012-027, pH 7,2) en una proporción de 1:10. Añadir 1/400 vol. de octilmaleimida 20 mM en DMSO y 1/400 vol. de DMSO para obtener una concentración final de 50 \muM de octilmaleimida y de 0,5% de DMSO. Finalmente, añadir 1:1000 vol. de DTT 0,35 M.

Composición aproximada de la disolución de N-octilmaleimida sHh-N a 1 mg/ml

: PBS (-pH 7,2)

: sHh-N 50 \muM conjugada con N-octilmaleimida

: DTT 50 \muM conjugado con N-octilmaleimida

: DTT 350 \muM

: DMSO al 0,5%

Composición aproximada de la disolución del vehículo de N-octilmaleimida

: PBS (-pH 7.,2)

: DTT 50 \muM conjugado con N-octilmaleimida

: DTT 350 \muM

: DMSO al 0,5%

Para una concentración final de 3 mg/ml

1) Preparar una disolución 60 mM de octilmaleimida (p.m.= 209) en DMSO (\sim12,6 mg/ml).

2) Diluir una reserva de 10 mg/ml de sHh (en NaPO4 5 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM) 10 veces con PBS (producto Gibco nº 20012-027, pH 7,2) para obtener una disolución de sHh-N de 3 mg/ml (o 150 \muM). [NOTA: el DTT; que compite con la sHh-N por la maleimida en la reacción siguiente, también está a 150 \muM en esta disolución.]

3) Añadir inmediatamente 1/200 vol. de octilmaleimida a la sHh-N a 3 mg/ml (es decir, 5 \mul/1 ml). Esto da una fracción molar de 2:1 (300 \muM:150 \muM) de octilmaleimida a sHh-N._{E}

4) Mezclar esta disolución mediante inversión suave del tubo e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.

5) Finalmente, añadir 1/1000 vol. de DTT 0,35 M a cada tubo para limpiar la octilmaleimida restante y para que sirva de reductor.

6) Para el control de vehículo, combinar una disolución de vehículo (NaPO_{4} 5 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM) con PBS (producto Gibco nº 20012-027, pH 7,2) en una proporción de 1:10. Añadir 1/400 vol. de octilmaleimida 60 mM en DMSO y 1/400 vol. de DMSO para obtener una concentración final de 150 \muM de octilmaleimida y 0,5% de DMSO. Finalmente, añadir 1:1000 vol. de DTT 0,5 M.

Composición aproximada de la disolución de sHh-N N-octilmaleimida 3mg/ml

: PBS (-pH 7,2)

: sHh-N 150 \muM conjugado con N-octilmaleimida

: DTT 150 \muM conjugado con N-octilmaleimida

: DTT 500 \muM. DMSO al 0,5%

Composición aproximada de la disolución de vehículo de N-octilmaleimida

: PBS (-pH 7,2)

: DTT 150 \muM conjugado con N-octilmaleimida

: DTT 500 \muM

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<400> 1

4

400

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<210> 2

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<211> 174

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 176

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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<210> 4

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<222> (6)

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<220>

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\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Val, Phe o Pro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Gly o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Ser o Gly

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Arg o Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Pro, His o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Pro o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Arg o Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Val o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Ala o Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Ser, Ile o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Asn o Gly

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Pro o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (41)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Tyr o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (45)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Ile o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (46)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Ala o Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Ser, Asn o Gly

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (54)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (56)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Thr o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (71)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Thr o Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (79)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Gln o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (83)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Asp o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (84)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Arg o Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Leu o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (91)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Ser o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (95)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Gln o Met

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222>(114)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Ser o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (115)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Glu o Gin

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (116)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (135)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Asn o Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (139)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Leu o Met

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (157)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Lys o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (158)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Ala o Asn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (160)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Val o Ile

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (162)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Cys o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (166)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Ser o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (167)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (168)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=His o Asn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (170)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Ala, Val o Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (173)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Lys o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (174)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa= Thr, Ser o Ala

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgatgacg atgacaaatt aggaccgggc agggggttc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgatgacg atgacaaaat aggaccgggc agggggttc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgatgacg atgacaaaat gggcccgggc agggggttcg gg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggcgatga cgatgacaaa atcatcggac cgggcagggg gttcggg

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtcatcag cctcccgatt ttgcgcacac cgagttctct gctttcacc

\hfill

49

Claims

1. Una proteína aislada que comprende un aminoácido C-terminal, en el que la proteína es una forma de la proteína erizo elegida de entre:

(a) una proteína con una cisteína N-terminal a la que se ha agregado al menos una porción hidrófoba.

(b) una proteína con un aminoácido N-terminal que no es una cisteína al que se ha agregado al menos una porción hidrófoba, y

(c) una proteína con al menos una porción hidrófoba sustituida por el aminoácido N-terminal,

en la que la proteína erizo no está modificada con un esterol en el aminoácido C-terminal y en la que la porción hidrófoba se elige de un péptido que comprende al menos un aminoácido hidrófobo o una porción lipídica.

2. La proteína de la reivindicación 1, en la que la porción hidrófoba es un péptido que comprende al menos un aminoácido hidrófobo.

3. La proteína de la reivindicación 1, en la que la porción hidrófoba es un lípido.

4. La proteína de la reivindicación 1, en la que la proteína contiene además una porción hidrófoba sustituida por, o agregada al aminoácido C-terminal.

5. La proteína de la reivindicación 1, en la que la proteína erizo comprende un fragmento bioactivo de una proteína erizo.

6. La proteína de la reivindicación 1, en la que el aminoácido N-terminal es un derivado funcional de una cisteína.

7. La proteína de la reivindicación 1, en la que la proteína está modificada tanto en el aminoácido N-terminal como en el aminoácido C-terminal.

8. La proteína de las reivindicaciones 4 o 7, en las que la proteína tiene una porción hidrófoba sustituyendo, o agregada a al menos un aminoácido intermedio entre los aminoácidos N-terminal y C-terminal.

9. La proteína de la reivindicación 1, en la que la proteína tiene una porción hidrófoba sustituyendo, o agregada a al menos un aminoácido intermedio entre los aminoácidos N-terminal y C-terminal.

10. La proteína de la reivindicación 3, en la que la porción lipídica es un ácido graso elegido de entre ácidos grasos saturados e insaturados que tengan entre 2 y 24 átomos de carbono.

11. La proteína de la reivindicación 1, en la que la proteína es una proteína erizo que se puede obtener de un origen vertebrado.

12. La proteína de la reivindicación 11, en la que la proteína erizo se puede obtener de un ser humano o una rata.

13. La proteína de la reivindicación 11, en la que la proteína erizo de vertebrado se elige de entre erizo Sónico, indio o del desierto o de un fragmento bioactivo de las mismas.

14. La proteína de la reivindicación 1, que comprende además una vesícula en contacto con la porción hidrófoba.

15. La proteína de la reivindicación 14, en la que la vesícula se elige de una membrana celular, una micela y un liposoma.

16. La proteína de la reivindicación 13, en la que la proteína erizo tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con alguna de las de ID SEC Nº: 1-4.

17. La proteína de la reivindicación 13, en la que la proteína erizo ha perdido entre 1 y alrededor de 10 aminoácidos del extremo C-terminal de la misma, cuando se compara con una proteína erizo original.

18. La proteína de la reivindicación 13, en la que la proteína tiene al menos un 60% de identidad de los aminoácidos con la erizo Sónico, indio o del desierto, y en la cual se une a una proteína patched.

19. Una proteína según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 18 para su uso como medicamento.

20. La utilización de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurológico.

21. Una proteína aislada según la reivindicación 1 que tenga un aminoácido C-terminal y un grupo N-terminal tioprolina, dicho grupo tioprolina formado mediante la reacción de un aldehído con una cisteína N-terminal de la proteína.

22. Una proteína aislada según la reivindicación 1 que tenga un aminoácido C-terminal y un grupo amida N-terminal, dicho grupo amida formado mediante la reacción de un tioéster de ácido graso con una cisteína N-terminal de la proteína.

23. Una proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que presente un aminoácido C-terminal y un grupo maleimida N-terminal, dicho grupo maleimida N-terminal formado mediante la reacción de un grupo maleimida con una cisteína N-terminal de la proteína.

24. La proteína aislada de cualquiera de las reivindicaciones de 21 a 23, en las que el aminoácido C-terminal está modificado con una porción hidrófoba.

25. Un procedimiento para generar un complejo proteico multivalente según la reivindicación 1 que comprende la etapa de la unión, en presencia de una vesícula, de una porción hidrófoba de la cisteína N-terminal de una proteína a un equivalente funcional de la cisteína N-terminal, en la que el complejo proteico multivalente es un complejo proteico erizo multivalente.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la fase de unión comprende la unión de una porción lipídica que se elige de entre ácidos grasos saturados e insaturados que tengan entre 2 y 24 átomos de carbono.

27. La proteína de la reivindicación 25, en el que la proteína es una proteína erizo o un fragmento bioactivo de la misma.

28. La proteína de la reivindicación 27, en el que la proteína erizo se elige de entre una erizo Sónico, indio o del desierto o un fragmento bioactivo de las mismas.

29. La proteína de la reivindicación 27, en la que la proteína erizo presenta una secuencia de aminoácidos de acuerdo con alguna de las de ID SEC Nº: 1-4.

30. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la fase de unión comprende la unión con una vesícula elegida de entre una membrana celular, un liposoma y una micela.

31. Un método para modificar una proteína erizo, que comprende la introducción de al menos una porción hidrófoba en una cisteína N-terminal de la proteína erizo en un equivalente funcional de la cisteína N-terminal para formar una proteína de acuerdo con la reivindicación 1.

32. El procedimiento de la reivindicación 31, que comprende, además, la puesta en contacto de la porción hidrófoba con una vesícula.

33. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que la porción hidrófoba es, bien una porción lipídica elegida de entre ácidos grasos saturados e insaturados que tienen entre 2 y 24 átomos de carbono, o bien una proteína hidrófoba.

34. La proteína de la reivindicación 31, en la que la proteína es una proteína erizo o un fragmento bioactivo de la misma.

35. La proteína de la reivindicación 34, en la que la proteína erizo de vertebrado se elige de entre una erizo Sónico, indio o del desierto o un fragmento bioactivo de las mismas.

36. La proteína de la reivindicación 34, en la que la proteína erizo tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con alguna de las de ID SEC Nº: 1-4.

37. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que la etapa de contacto comprende la puesta en contacto con una vesícula elegida de entre una membrana celular, un liposoma y una micela.

38. Un complejo proteico, producido mediante el procedimiento de la reivindicación 25.

39. Una proteína modificada, producida mediante el procedimiento de la reivindicación 31.

40. Un procedimiento para modificar una proteína erizo que contiene una cisteína N-terminal que comprende la reacción de la cisteína N-terminal con un tioéster de ácido graso para formar una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 con una amida, en la que dicha modificación mejora la actividad biológica de la proteína.

41. El procedimiento de la reivindicación 52, en el que la proteína es una proteína erizo o un fragmento bioactivo de la misma.

42. El procedimiento de la reivindicación 41, en el que la proteína erizo se elige de entre una erizo Sónico, indio o del desierto o un fragmento bioactivo de las mismas.

43. Un procedimiento para modificar una proteína erizo que contiene una cisteína N-terminal que comprende la reacción de la cisteína N-terminal con un grupo maleimida para formar una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha modificación mejora la actividad biológica de la proteína.

44. El procedimiento de la reivindicación 43, en el que la proteína es una proteína erizo o un fragmento bioactivo de la misma.

45. El procedimiento de la reivindicación 44, en el que la proteína erizo se elige de entre una erizo Sónico, indio o del desierto o de un fragmento bioactivo de la misma.

46. Una proteína erizo aislada según la reivindicación 1 que presente un aminoácido C-terminal y un grupo acetamida N-terminal, dicho grupo acetamida formado mediante la reacción de una acetamida sustituida con una cisteína N-terminal de la proteína.

47. Una proteína aislada según la reivindicación 1 que tiene un aminoácido C-terminal y un grupo tiomorfolino N-terminal, dicho grupo tiomorfolino formado mediante la reacción de de un grupo halocetona con una cisteína N-terminal de la proteína.

48. Un procedimiento para modificar una proteína erizo que contiene una cisteína N-terminal que comprende la reacción de la cisteína N-terminal con un grupo acetamida sustituido para formar una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha modificación mejora la actividad biológica de la proteína.

49. El procedimiento de la reivindicación 48, en el que la proteína es una proteína erizo o un fragmento bioactivo de la misma.

50. El procedimiento de la reivindicación 49, en el que la proteína erizo se elige de entre una erizo Sónico, indio o del desierto o de un fragmento bioactivo de las mismas.

51. Un procedimiento para modificar una proteína erizo que contiene una cisteína N-terminal que comprende la reacción de la cisteína N-terminal con un grupo halocetona para formar una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha modificación mejore la actividad biológica de la proteína.

52. El procedimiento de la reivindicación 51, en el que la proteína es una proteína erizo o un fragmento bioactivo de la misma.

53. El procedimiento de la reivindicación 52, en el que la proteína erizo se elige de entre una erizo Sónico, indio o del desierto o un fragmento bioactivo de las mismas.

54. Un polipéptido erizo recombinante modificado con una o más porciones lipófilas, en las que una o más de las dichas porciones lipófilas mejora la actividad biológica del polipéptido.

55. El polipéptido erizo de la reivindicación 54, en el que dicho polipéptido erizo se elige de entre una erizo Sónico, indio o del desierto o un fragmento bioactivo de las mismas.

56. La proteína de la reivindicación 54 o 55, en la que los polipéptidos erizo presentan una secuencia de aminoácidos que de acuerdo con alguna de las de ID SEC Nº: 1-4.

57. La proteína de la reivindicación 55, en la que el polipéptido erizo tiene al menos un 60 por ciento de identidad con el erizo Sónico, indio o del desierto, y la que la proteína se une a una proteína patched.

58. Una proteína según la reivindicación 1, en la que la proteína es un polipéptido erizo modificado con una o más porciones lipófilas en residuos aminoácidos internos.

59. Una proteína según la reivindicación 1, en la que la proteína es un polipéptido erizo modificado con uno o más hidrocarburos aromáticos lipófilos.

60. El polipéptido erizo de cualquiera de las reivindicaciones 54 a 59, cuyo polipéptido se proporciona como una preparación purificada de la proteína.

61. El polipéptido erizo de cualquiera de las reivindicaciones de 54 a 59, en el que el polipéptido se proporciona como una preparación farmacéutica.

62. El polipéptido erizo de cualquiera de las reivindicaciones de 54 a 59, en el que las porciones lipófilas se eligen de entre ácidos grasos, lípidos, ésteres, alcoholes, estructuras en forma de jaula e hidrocarburos aromáticos.

63. El polipéptido erizo de la reivindicación 59 a 62, en el que el hidrocarburo aromático se elige de entre de benceno, perileno, fenantreno, antraceno, naftaleno, pireno, criseno y naftaceno.

64. El polipéptido erizo de la reivindicación 63, en el que el hidrocarburo aromático es un pireno.

65. El polipéptido erizo de cualquiera de las reivindicaciones de 54 a 59, en el que las porciones lipófilas se eligen de entre isoprenoides, terpenos e hidrocarburos polialicíclicos.

66. El polipéptido erizo de la reivindicación 65, en el que las porciones lipófilas se eligen de entre adamantano, buckminsterfulerenos, vitaminas, polietilenglicol, oligoetilenglicol, fosfodiésteres de (C1-C18)-alquilo, -O-CH_{2}-CH (OH)-O-(C12-C18)-alquilo.

67. El polipéptido erizo de la reivindicación 66, en el que las porciones lipófilas se eligen de entre 1- o 2-adamantilacetilo, 3-metiladamant-1-ilacetilo, 3-metil-3-bromo-1-adamantilacetilo, 1-decalinacetilo, canforacetilo, canfanoacetilo, noradamantilacetilo, norbomanoacetilo, biciclo[2,2,2]-oct-5-enoacetilo, 1-metoxibiciclo[2,2,2]-oct-5-eno-2-carbonilo, cis-5-norbomeno-endo-2,3-dicarbonilo, 5-norbomen-2-ilacetilo, (1 R)-(-)-mirtentanoacetilo, 2-norbomanoacetilo, anti-3-oxo-triciclo[2,2,1,0<2,6> ]-heptano-7-carbonilo, decanoilo, dodecanoilo dodecenoilo, tetradecadienoilo, decinoilo y dodecinoilo.

68. El polipéptido erizo de cualquiera de las reivindicaciones de 54 a 59, en la porción lipófila se elige de porciones que potencian la actividad biológica del polipéptido respecto al polipéptido erizo no modificado.

69. Una proteína modificada lipofílicamente según cualquiera de las reivindicaciones de 54 a 59 para su uso como medicamento.

70. La utilización de un polipéptido modificado lipofílicamente según cualquiera de las reivindicaciones de 54 a 59 para la fabricación de un medicamento para alterar el estado de crecimiento de una célula respondedora a la señalización de la erizo.