KR20010032753A - 소수적으로 개질된 단백질 조성물 및 방법 - Google Patents

소수적으로 개질된 단백질 조성물 및 방법 Download PDF

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다렌 피. 바커
딩가이 웬
케빈 피. 윌리암스
엘렌 에이. 가버
프레더릭 알. 테일러
알폰스 갈데스
제프리 포터
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온토제니, 인코오포레이티드
아스트루 마이클 제이
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Abstract

본 발명은 소수적으로 개질된 단백질 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 수소성 부분은 단백질의 표면 아미노산 잔기에 부착된다. 소수성 부분은 지질 또는 펩티드일 수 있다. 대안적으로, 단백질은 단백질에 소수성 부분을 부착시키는 다양한 화학 반응으로 유도될 수 있다. 바람직한 단백질은 포유류 기원이며 소닉, 인디언 및 데저트 헤지호그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소수성 부분은 세포막, 리포솜 또는 미셀과 같은 소포에 부착할 수 있는 편리한 테터르로서 사용된다.

Description

소수적으로 개질된 단백질 조성물 및 방법 {HYDROPHOBICALLY-MODIFIED PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS}
배경기술
단백질은 다량체성 복합체(여기에서, 단백질은 일제히 작용하는 능력을 갖는다)의 형성에 의해, 또는 단백질의 물리화학적 성질, 예컨대 단백질의 흡수, 생물학적 분포 및 반감기에서의 다른 변화를 통해, 다른 부분에 부착되는 경우에 더 큰 생물학적 활성도를 나타내는 것으로 공지되어 있다. 이와 같이, 생물 공학에서 이루어지고 있는 연구 중 하나는 단백질이 새로운 방식 및 저렴한 비용으로 부작용을 거의 없게 하여 소량으로 투여될 수 있도록 단백질의 물리화학적 성질을 개질시키는 방법의 개발이다.
예를 들어, 어떠한 단일 단백질(예컨대 동족 수용체에 대한 리간드)의 결합 친화도가 낮을 수 있다. 그러나, 세포는 정상적으로 특정 표면 수용체의 수천개의 복사체로 발현되며, 많은 수용체-리간드 상호작용이 동시에 일어난다. 많은 표면 분자가 결합에 참여하게 되는 경우, 전체 유효 친화도는 개개 분자들의 결합 친화도의 합 보다 크다. 반대로, 리간드 단백질이 사용 목적, 예를 들어 치료학적 사용을 위해서 재조합 DNA 기술에 의해 세포 표면으로부터 제거되거나, 정제되거나 단리되는 경우에, 이들은 단량체로서 작용하고 세포의 표면상에 밀접하게 관련된 동일한 단백질의 많은 다른 복사체와 함께 작용하는 장점을 잃게 된다. 이와 같이 단리되는 경우에, 수용체에 대한 단백질의 낮은 친화도는 치료상의 유효성에 있어서 심각한 결점이 되어 특정 결합 경로를 차단할 수 있으며, 이것은 높은 결합력의 세포-세포 상호작용에 대해서 경쟁하기 때문이다. 효과적인 치료는 일정한 투여 및/또는 높은 투여량을 요구할 수 있다. 그러나, 이러한 결점은 단리된 단백질의 다량체 형태를 제공하는 수단이 발견될 수 있는 경우에 해소될 수 있다.
유사하게, 예를 들어 단백질을 막과 관련되도록 유도하여 투여 부위에서 국소화시키고 특정 표적물에 결합하거나, 다른 방식으로 상호작용하는 능력을 증가시키도록 생물학적으로 활성도인 단백질의 다른 물리화학적 성질을 개질시키는 것이 유용하다.
커플링된 단백질을 형성시키는 여러가지 방법들이 개발되어 있다. 이들 방법들 중 대부분은 그다지 구체적이지 않다. 즉, 이들 방법들은 단백질상에서 특정 부위에의 커플링 지점을 유도하지 않는다. 결과적으로, 통상적인 커플링 제제는 작용 부위를 공격하거나 활성 부위를 입체적으로 차단하여, 커플링된 단백질을 불활성으로 만들 수 있다. 또한, 커플링된 생성물은 활성 부위가 상승 효과적으로 작용할 수 없도록 배향됨으로써, 생성물을 단독의 단량체성 단백질 보다 효과적이지 않게 할 수 있다.
단백질 개질을 위한 신규 방법을 개발하고자 하는 또 다른 계기는, N 말단 시스테인 잔기를 갖는 단백질이 산화 또는 활성도 또는 반감기를 감소시킬 수 있는 다른 화학적 개질에 민감하기 때문이다. 부가적으로, 단백질 정제에서 공통적으로 사용되는 일부 완충액은 N 말단 시스테인을 개질시킬 수 있는 성분 또는 불순물을 포함한다. 심지어 이러한 완충액을 사용하지 않는 경우에도, N 말단 시스테인은 아마도 저장 유리병 또는 공기중의 화학 물지로 인해 일정 시간이 지나면 개질된다. 결과적으로, 완충액 제형은 보호제, 예컨대 디티오트레이톨을 포함하여 시스테인 개질 및/또는 산화를 방지하여야 한다. 그러나, 보호제는 자체의 생물학적 활성도가 상당히 크기 때문에 실험을 복잡하게 할 수 있으며 제형의 치료학적 이용을 불리하게 할 수 있다.
따라서, 당해 분야에서는 단백질의 성질을 변화시켜 단백질의 안정성, 효능, 약력학 및 약동학에 영향을 주는 유도된 생성물 또는 이것의 다량체 형태를 수득하기 위한 더욱 구체적인 수단의 개발이 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 한 가지 일면에서, 본 발명자들은 생물학적으로 활성인 단백질의 개질된 형태를 용이하게 제조하는 방법을 찾는 문제를 해결하였다. 본 발명의 방법들은 단백질의 다량체 형태를 유도하는데 사용될 수 있고/거나 이들의 물리화학적 성질을 변화시키는데 사용될 수 있다. 본 발명자들은 단백질상에 소수성 부분을 도입시키기 위한 단백질의 개질(즉, 기존의 아미노산에 소수성 부분을 첨가 또는 부가하거나 아미노산을 소수성 부분으로 치환시킴)이 단백질의 생물학적 활성도 및/또는 안정성을 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, N 말단 시스테인은 간편한 "표적물"로서 사용되어 소수성 부분(예를 들어, 지질)을 부착함으로써 생물학적으로 활성인 단백질을 개질시킬 수 있다.
대안적으로, 소수성 부분은 생물학적으로 활성인 단백질, 예를 들어 헤지호그(hedgehog) 단백질의 C 말단 잔기에 부착되어 단백질의 활성도를 개질시킬 수 있다. 소수성 부분은 또한 내부 아미노산 잔기에 부착되어 단백질의 활성도를 증가시킬 수 있으며, 단 이러한 개질은 단백질의 활성, 예를 들어 수용체 또는 조수용체에 결합하려는 단백질의 능력 또는 단백질의 3차원 구조는 영향받지 않는다. 바람직하게, 소수성 부분은 단백질이 천연 형태인 경우 단백질의 표면상에 있는 내부 아미노산 잔기에 부착된다. 본 발명의 소수성 변형은 개질되지 않은 형태에 비해 변형된 물리화학적 성질을 갖는 단백질을 형성시키는 일반적으로 유용한 방법을 제공한다.
본 발명은 곤충 및 포유류 세포중의 완전 길이의 소닉 헤지호그 단백질 (Sonic hedgehog protein)을 발현시키는 경우, C 말단에서 콜레스테롤을 갖는 단백질의 성숙 형태(성숙 서열에서의 잔기 1-174)가 또한 지방산을 갖는 N 말단부에서 유도되는 발견을 기초로 한다. 실질적으로, 이러한 헤지호그 형태는 가용성의 생체내 검중에서 개질되지 않은 헤지호그에 비해 효능에 있어서 약 30배의 증가를 나타냈다.
그러므로, 본 발명의 한 가지 일면은 N 말단의 아미노산 및 C 말단의 아미노산을 포함하는 단리된 단백질에 관한 것이며, 여기에서, 단백질은 하나 이상의 소수성 부분이 부착되는 N 말단의 시스테인을 갖는 단백질, 소수성 부분이 부착된 시스테인이 아닌 N 말단의 아미노산을 갖는 단백질, 및 N 말단의 아미노산 대신 치환된 소수성 부분을 갖는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소수성 부분은 소수성 펩티드, 지질 또는 소수성인 다른 화학 부분일 수 있다.
단백질은 N 말단의 아미노산에서 개질될 수 있으며, 바람직하게 N 말단의 아미노산은 시스테인 또는 이것의 작용성 유도체이다. 단백질은 C 말단의 아미노산에서, N 말단의 아미노산과 C 말단의 아미노산 모두에서, N 말단과 C 말단의 아미노산 내부의 하나 이상의 아미노산(즉, N 말단과 C 말단의 아미노산 사이의 중간체) 또는 이들 배열의 다양한 조합체에서 개질될 수 있다. 단백질은 세포외 시그날링 단백질일 수 있으며, 바람직한 구체예에서는 단백질은 척추 동물, 가장 바람직하게는 사람로부터 수득될 수 있는 헤지호그 단백질이며, 소닉(Sonic), 인디안 (Indian) 및 데저트(Desert) 헤지호그를 포함한다.
또 다른 구체예는 A-Cys-[Sp]-B-X 형태의 단리된 단백질이며, 여기에서
A는 소수성 부분이고;
Cys는 시스테인 또는 이들의 작용성 균등물이고;
[Sp]는 임의의 스페이서 펩티드 서열이고;
B는 하나 이상의 임의의 스페이서 펩티드 서열을 포함하는 다수의 아미노산을 포함하는 단백질이며;
X는 단백질에 결합되는 임의의 또 다른 소수성 부분이다.
단리된 단백질은 세포외 시그날링 단백질, 바람직하게는 헤지호그 단백질일 수 있다. 이 단백질은 하나 이상의 소수성 부분을 갖는 하나 이상의 다른 아미노산에서 개질될 수 있다. 다른 구체예에서, 단백질은 세포막, 미셀 및 리포솜으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소포와 접촉한다.
본 발명의 또 다른 일면은 C 말단의 아미노산 및 N 말단의 티아프롤린기를 갖는 단리된 단백질에 관한 것이며, 티아프롤린기는 단백질의 N 말단 시스테인과 알데히드의 반응에 의해 형성된다. 본 발명의 또 다른 일면은 C 말단의 아미노산 및 N 말단의 아미드기를 갖는 단리된 단백질에 관한 것이며, 아미드기는 단백질의 N 말단 시스테인과 지방산 티오에스테르의 반응에 의해 형성된다. 본 발명의 또 다른 일면은 C 말단의 아미노산 및 N 말단의 말레이미드를 갖는 단리된 단백질에 관한 것이며, N 말단의 말레이미드기는 단백질의 N 말단 시스테인과 말레이미드기의 반응에 의해 형성된다. 본 발명의 또 다른 일면은 C 말단의 아미노산 및 N 말단의 아세트아미드기를 갖는 단리된 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 일면은 C 말단의 아미노산 및 N 말단의 티오모르폴린기를 갖는 단리된 단백질에 관한 것이다.
이러한 구체예에서, 단백질의 C 말단 아미노산은 소수성 부분으로 개질될 수 있다. 단리된 단백질은 세포외 시그날링 단백질, 가장 바람직하게는 헤지호그 단백질일 수 있다.
본 발명의 방법은 소포의 존재하에, 단백질의 N 말단 시스테인 또는 N 말단 시스테인의 작용성 균등물에의 소수성 부분의 결합 단계를 포함하는 다가 (multivalent) 단백질 복합체를 형성시키는 방법을 포함한다. 결합 단계는 탄소수가 2 내지 24개인 포화 및 불포화된 지방산으로부터 선택되는 지질 부분의 결합을 포함할 수 있다. 단백질은 세포외 시그날링 단백질, 바람직하게는 소닉, 인디언 및 데저트 헤지호그로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤지호그 단백질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 방법은 하나 이상의 소수성 부분을 단백질의 N 말단 시스테인 또는 이것의 균등물에 유도하는 단계를 포함하는, 단백질의 물리화학적 성질을 개질시키는 방법이다. 소수성 부분은 탄소수가 2 내지 24개인 포화 및 불포화 지방산으로부터 선택되는 지질 부분일 수 있다. 또한, 이것은 소수성 단백질일 수 있다. 이 방법을 사용하여 개질된 단백질은 세포외 시그날링 단백질, 바람직하게는 소닉, 인디언 및 데저트 헤지호그로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤지호그 단백질일 수 있다. 이러한 방법에 의해 생성된 단백질 복합체는 또한 본 발명에 포함된다.
헤지호그 외에 다른 세포외 시그날링 단백질로는 겔솔린(gelsolin); 인터페론, 인터루킨, 종양 회사 인자, 단핵구 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 혈소판 유도된 성장 인자, 성장 호르몬 및 인슐린이 포함된다.
또 다른 방법은 N 말단 시스테인을 갖는 단백질(예컨대, 세포외 시그날링 단백질)을 개질시키는 방법이다. 이러한 방법은 N 말단 시스텐을 지방산 티오에스테르와 반응시켜 아미드를 형성하는 단계를 포함하며, 이러한 개질 방법은 단백질의 생물학적 활성도를 증가시킨다.
또 다른 방법은 N 말단 시스테인을 말레이미드기와 반응시키는 것을 포함하는, N 말단 시스테인을 갖는 단백질(예컨대, 세포외 시그날링 단백질)을 개질시키는 방법이며, 이러한 개질 방법은 단백질의 생물학적 활성도를 증가시킨다. 보 ㄴ발명의 다른 구체예는 N 말단 시스테인을 알데히드기, 아세트아미드기 또는 티오모르폴린기와 반응시키는 것을 포함한다.
또 다른 방법은 단백질에 소수성 펩티드를 부착시키는 단계를 포함하는 단백질(예컨대, 세포외 시그날링 단백질)을 개질시키는 방법이다. 소수성 부분은 N 말단 아미노산, C 말단 아미노산, N 말단 아미노산과 C 말단 아미노산 사이의 아미노산 중간체, 및 이들의 조합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 아미노산에 부착될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 본 발명은 친유성 부분으로 개질되는 헤지호그 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 헤지호그 단백질은 처리된 세포외 영역인, 성숙 형태의 하나 이상의 내부 부위에서 친유성 부분(들)에 의해 개질되며, 또한 성숙 폴리펩티드의 N 또는 C 말단 잔기에서 친유성 부분으로 유도되거나 유도되지 않을 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 C 말단 잔기에서 스테롤과는 다른 소수성 부분으로 개질된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 N 말단에서 고리형(바람직하게는 다고리형) 친유성 기로 개질된다. 상기의 다양한 조합체가 또한 숙고된다. 본 발명의 치료학적 방법은 환자에게 본 발명의 소수적으로 개질된 단백질을 투여하는 것을 포함하여, 환자에게서 신경 질환을 치료하기 위한 방법이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 Shh의 팔미토일화된 형태의 특징에 관한 것이다. 사람 Shh의 테터링된(tethered) 형태를 하이 파이브TM(High FiveTM) 곤충 세포로부터 면역친화성 정제시키고 SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질을 쿠마지 블루[레인 a, 라이프 테크놀로지스, 인코포레이티드(Life Technologies, Inc.) 제품, 고분자량 마커로 사전 착색됨; 레인 b, 가용성 Shh(0.6㎍); 레인 c, 테터링된 Shh(0.6㎍); 레인 d, 가용성 및 테터링된 Shh(각각 0.6㎍)의 혼합물]. 팔미트산으로 개질하려는 Shh 및 Ihh(레인 h 참조)의 능력을 실시예 2에 기술된 세포 비함유 시스템을 사용하여 검정하였다. 헤지호그 단백질(3㎍/샘플)의 가용성 형태를 쥐의 간 마이크로솜, ATP, 조효소 A 및3H-팔미트산을 사용하여 1시간 동안 인큐베이트시킨 후 SDS-PAGE로 팔미토일화에 대해서 검정하였다. 레인 e 내지 i로 제시되는 샘플은 형광촬영에 의해 가시화되었으며(레인 e, Shh; 레인 f, des 1-10 Shh; 레인 g, Cys-1 내지 Ser Shh; 레인 h, Ihh; 레인 i, His 표지된 Shh), 레인 j 및 k는 쿠마지 착색에 의해 가시화되었다(레인 j, Shh; 레인 k des 1-10 Shh).
도 2는 ESI-MS에 의해 정제된 Shh의 분석에 관한 것이다. 가용성 사람 Shh(A) 및 테터링된 사람 Shh(B)를 전기스프레이 이온 공급원이 장착된 마이크로매스 쿼트로 II 트리플 쿼드로폴 질량 분광계(Micromass Quattro II triple quadrupole mass spectrometer)상에서 ESI-MS로 분석하였다. 모든 전기스프레이 매스 스펙트럼 데이타를 얻어서 프로필 모드에 저장하였으며 마이크로매스 매스링스(MassLynx) 데이타 시스템을 사용하여 처리하였다. 분자 질량 스펙트럼을 제시하였다(질량 정렬은 데이타 시스템으로 이루어졌다).
도 3은 가역상 HPLC에 의한 테터링된 Shh의 분석에 관한 것이다. 가용성 사람 Shh(A), 하이 파이브TM곤충 세포(B)로부터의 테터링된 사람 Shh, 세포 관련된 쥐의 Shh(D)를 작은 구멍의 "Vydac C4" 칼럼(2.1mm의 내경×250mm)상에서 가역상 HPLC로 분석하였다. 칼럼을 30분, 0.25ml/분에서 0.1% 트리플루오로아세트산중의 0 내지 80% 아세토니트릴 구배 및 200 내지 300nm(데이타는 214nm에서 제시되어 있다)에서의 포토다이오드 어레이 검출기를 사용하여 측정된 유출물을 이용하여 전개시켰다. 피크 분획을 모으고 추가로 SDS-PAGE 및 MS(데이타를 표 3, 4 및 5에 요약하였다)로 특징을 나타내었다.
도 4는 LC-MS에 의한 Shh의 특징화에 관한 것이다. 테터링된 사람 Shh(A) 및 가용성 사람 Shh(B)를 4-비닐피리딘(6M 구아니딘 HCl, 1mM EDTA, 100mM 트리스 HCl(pH 8.0)중의 1㎕/100㎕ 샘플)로 알킬화시키고, 에탄올로 침전시키고 이전에 기술된 바와 같이(27) 1:5의 효소:단백질 비에서 50mM 트리스 HCl(pH 7.0), 2M 우레아중의 엔도프로테나아제 Lys-C로 분해시켰다. 분해물을 전기스프레이 마이크로매스 쿼트로 II 트리플 쿼드로폴 질량 분광계를 이용하여 라인에서 가역상 HPLC로 분석하였다. 마이크로매스 매스링스 데이타 시스템(조작으로부터 전체 이온 크로마토그램을 제시하였다)을 사용하는 조작 및 처리과정을 통해 스캐닝하였다. 별표(*)는 N 말단 펩티드의 위치를 나타내는 것이며, 이것은 MALDI PSD 또는 N-말단 에드만 서열화에 의해 증명되었다.
도 5는 MALDI PSD 측정에 의한 N 말단 Shh 펩티드의 서열화에 관한 것이다. 테터링된 사람 Shh로부터의 N 말단 엔도프로테나아제 Lys-C 펩티드를 플라이트 질량 분광계의 Voyager-DETMSTR 시간에 대한 MALDI PSD 측정을 수행하였다. 검출된 분획 이온에 있어서의 예상된 분획화 패턴 및 명명을 패널의 상부에 제시하였다(PA, 팔미토일산; 4vp, 4-피리딜에틸기). 도면의 나머지는 조작에 의해 ㅅ애성된 분자 질량 스펙트럼을 보여주고 있다. 관련된 이온은 개략도에서 정으된 명명을 사용하여 지정하였다. b1-b8에 대해서 계산된 질량(Da)은 각각 447.3, 504.3, 601.4, 658.4, 814.5, 871.5, 1018.6 및 1075.6 이다. y1-y8에 대한 질량(Da)은 각각 147.1, 204.1, 351.2, 408.2, 564.3, 621.3, 718.4 및 775.4 이다. z8에 대해서 계산된 질량은 758.4Da 이다. b8에 대해서 관찰된 질량은 첨가된 물로 인해 부가의 18Da을 함유한다.
도 6은 C3H10T1/2 검정에서 테터링된 Shh의 증가된 활성도에 관한 것이다. 가용성 및 테터링된 사람 Shh 단독(A) 또는 Mab 5E1 (B)를 중화시키는 항-헤지호그의 존재하에 가용성 및 테터링된 사람 Shh의 상대적인 효능을 알칼리성 포스파타제 유도를 측정하는 C3H10T1/2 세포상에서 검정하였다. 수치는 2회 결정한 값의 평균치를 반영한 것이다. (A): 가용성 Shh(6) 및 테터링된 Shh(8)의 연속 2배 희석액을 5일 동안 세포로 인큐베이팅시키고, 수득된 알킬리성 포스파타제 활성의 수준을 알칼리성 포스파타제 색소 형성 기질 p-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 405nm에서 측정하였다. (B): Mab 5E1의 연속 희석액을 가용성 Shh(5㎍/ml: 검정 막대), 테터링된 Shh(0.25㎍/ml: 회색 막대) 또는 Shh를 첨가하지 않은 소포 대조군(백색 막대)를 이용하여 30분 동안 인큐베이트 시킨 후, C3H10T1/2 검정으로 분석하였다.
도 7은 수용체 결합 검정의 분석에 관한 것이다. 패치화된(patched) 것에 결합하려는 가용성 Shh(6) 및 테터링된 Shh(8)의 상대적인 효능을 FACS 분석에 의해 패치화-트랜스펙션된 EBNA-293 세포상에서 검정하였다. 시험 샘플의 연속 희석액을 EBNA-293으로 인큐베이션시키고, 세척한 후 결합도(%)를 세포에 결합하려는 Shh-Ig와 경쟁하는 샘플의 능력으로서 측정하였다. 결합된 Shh-Ig를 판독으로서 FITC 표지된 항-Ig 항체 프로브를 사용하는 형광 방법으로 정량화하였다. 데이타를 비선형 복구에 의해 쌍곡선으로 나타냈다.
도 8은 사람 헤지호그 단백질의 N 말단 단편의 정렬에 관한 것이다. 20kDa의 사람 헤지호그 단백질(소닉 "Shh", 데저트 "Dhh" 및 인디안 "Ihh")을 N 말단 시스테인(성숙 서열에서 Cys-1)과 관련하여 정렬된다. 이러한 시스테인은 정상적으로 분비 과정에서 제거되는 천연 시그날 서열의 존재로 인해 완전 길이의 Shh 전구체 단백질중의 Cys-24 이다. 시스테인의 실제 위치는 종 차이로 인하여 다소 변할 수 있다.
도 9는 사람 헤지호그의 N 말단 단편의 교감 서열에 관한 것이다.
도 10은 사람 소닉 헤지호그의 활성에 미치는 지질 사슬 길이의 영향에 관한 것이다. 일련의 지방산 개질된 헤지호그 단백질을 본 발명에 따라 합성하였고, 헤지호그 활성에 미치는 지방산 사슬 길이의 영향을 본원에 기술된 C3H10T1/2 알칼리성 포스파타제 유도 검정을 사용하여 시험하였다. 그 결과를 막대 그래프로 도시하였다.
도 11은 팔미토일화된 사람 소닉 헤지호그, 미리스토일화된 사람 소닉 헤지호그, 라우로일화된 사람 소닉 헤지호그, 데카노일화된 사람 소닉 헤지호그 및 옥타노일화된 사람 소닉 헤지호그의 C3H10T1/2 검정에 관한 것이다. 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 1% 옥틸글루코시드, 0.5mM DTT중에 제형화된 팔미토일화된 사람 소닉 헤지호그, 라우로일화된 사람 소닉 헤지호그, 데카노일화된 사람 소닉 헤지호그 및 옥타노일화된 사람 소닉 헤지호그 및 150mM NaCl, 0.5mM DTT 중에 제형화된 미리스토일화된 사람 소닉 헤지호그을 알칼리성 포스파타제 유도를 측정하는 C3H10T1/2 세포상에서 검정하였다. 수치는 2회 측정치의 평균값을 나타내는 것이다. 팔미토일화된 사람 소닉 헤지호그(○), 미리스토일화된 사람 소닉 헤지호그(●), 라우로일화된 사람 소닉 헤지호그(□), 데카노일화된 사람 소닉 헤지호그 (■), 옥타노일화된 사람 소닉 헤지호그(△), 및 개질되지 않은 사람 소닉 헤지호그 (▲ 및 ×)를 5일 동안 상기 세포로 인큐베이트시키고 알칼리성 포스파타제의 수득된 수준을 색소 형성 기질 p-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 405nm에서 측정하였다. 팔미토일화된 단백질, 미리스토일하된 단백질, 라우로일화된 단백질 및 데카노일화된 단백질을 (▲)로 도시된 개질되지 않은 단백질을 이용하는 실험으로 검정하는 한편, 옥타농리화된 단백질을 (×)로 도시된 개질되지 않은 단백질을 이용한 또 다른 실험으로 검정하였다. y축상의 화살표는 첨가된 헤지호그 단백질의 부재시에 알칼리성 포스파타제의 바탕 수준을 나타내는 것이다.
도 12는 헤지호그의 다양한 소수적으로 개질된 형태의 일반적인 구조에 관한 것이다. (A) 지방산 유도체(여기에서, R은 지방산의 탄화수소 쇄이다); (B) 티아졸리딘 유도체(여기에서, R은 탄화수소 이다); (C) 아미노산 치환체(여기에서, R은 소수성 아미노산 측쇄이다); (D) 말레이미드 유도체(여기에서, R은 탄화수소이다); (E) SH = 와일드형 헤지호그의 N 말단 시스테인상의 유리된 티올; (F) 요도아세트아미드 유도체(여기에서, R1은 탄화수소이고, R2는 H 또는 탄화수소이다); 및 (G) 티오모르폴리닐 유도체(여기에서, R은 탄화수소이다). 모든 구조에서, HH는 헤지호그이다.
도 13은 C3H10T1/2 검정에서 헤지호그의 다양한 소수적으로 개질된 형태들의 상대적인 효능에 관한 것이다. 개질되지 않은 와일드형 사람 소닉 헤지호그의 EC50(2㎍/ml)은 1×로서 도시되어 있다. 다른 단백질을 효능은 개질된 단백질의 EC50으로 나누어지는 와일드형 단백질의 EC50의 비율로 나타냈다. 개질은 다르게 나타내지 않는 한 단백질의 N 말단에서 이루어지는 것이다.
도 14는 말로네이트 유도된 쥐의 선조체 병소 검정에서의 개질되지 않은 사람 헤지호그, 미리스토이로화된 사람 헤지호그 및 CIII 변이 사람 헤지호그의 상대적인 효능에 관한 것이다. 이 도면에는 쥐 선조체에의 개질되지 않은 사람 헤지호그, 미리스토이로화된 사람 헤지호그 및 CIII 변이 사람 헤지호그의 투여로부터 수득되는 말로네이트 유도된 병소 부피의 감소가 도시되어 있다.
도 15는 말레이미드 개질된 헤지호그 폴리펩티드 및 개질되지 않은 헤지호그 폴리펩티드의 특이적인 활성도를 도시한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 부분적으로 곤충 또는 포유류 세포에서 완전 길이 구조물로서 발현된 사람 소닉 헤지호그가 N 말단 시스테인의 α-아민에 부착된 소수성 팔미토일기를 갖는 발견을 기초로 한 것이다. 이것은 본 발명자들이 상기 방식으로 및 부착이 바로 가역되는 티올 결합된 팔미트산 개질과는 대조적으로 개질되는 단백질의 세포외 시그날링을 알고 있는 첫번째 보기이며, 이러한 N 결합된 팔미토일 부분은 미리스트산 개질된 유사체에 의해 매우 안정한 것으로 보인다.
이러한 초기 발견의 직접적인 결과로서, 본 발명자들은 시그날링 단백질의 소수성이 증가하는 경우 단백질의 생물학적 활성도가 증가할 수 있음을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 시그날링 단백질, 예컨대 헤지호그 단백질에의 소수성 부분의 부착이 단백질의 활성도를 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 생물학적으로 활성인 단백질의 N 말단 시스테인은 소수성 부분의 부착에 간편한 부위를 제공함으로써 단백질의 물리화학적 성질을 개질시킬 뿐만 아니라, N 말단 시스테인에 대한 개질이 또한 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 부가적으로, 단백질 구조의 표면상에서 내부 아미노산 잔기에의 소수성 부분의 첨가는 단백질의 활성도를 증가시킨다. 본 발명자들은 일례로서 헤지호그 단백질의 소수성(예를 들어, 지질 및 소수성 아미노산) 개질의 발견을 이용하였다.
본 발명의 한 가지 일면은 단배질의 세포외 단편의 C 말단에의 콜레스테롤 첨가에 의해 수득되는 효과외에, 최소한 유전자 생성물의 생물학적 활성도의 일부가 단백질상의 다른 부위에서의 친유성 부분을 이용한 단백질의 유도화에 의해 및/또는 콜레스테롤과는 다른 부분에 의해 예상외로 증가하였다. 본 발명의 특정 일면은 단백질의 천연 처리된 형태의 N 말단 또는 C 말단 잔기와 다른 부위에서의 개질 및/또는 N 말단에서의 지방산 또는 C 말단에서의 스테롤과 다른 친유성 부분을 이용한 상기 말단에서의 개질이 이루어지는 헤지호그 폴리펩티드의 제형에 관한 것이다.
PCT 공보 WO 95/18856호 및 WO 96/17924호(이들 모두는 본원에 참고문헌으로서 인용되고 있다)에 기술된 바와 같이, 일반적으로 헤지호그 폴리펩티드는 세포,조직 및 기관의 광범위한 범위의 작용적 성능을 생체내 및 생체외에서 치유 및/또는 조절하는데 유용하며, 신경 보호, 신경 재생, 신경 작용의 증가, 뼈 및 연골 형성 및 치유의 조절, 정자 형성의 조절, 폐, 간 및 영장류의 소화관으로부터 유래된 다른 기관의 조절, 조혈 작용의 조절 등의 치료학적 용도를 갖는다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 헤지호그 단백질이 포함됨에 따라 상기 용도 모두에 있어서 유도된 헤지호그 폴리펩티드의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 배양액중에 제공되는 세포(생체외) 또는 전체 동물중의 세포(생체내)상에서 수행될 수 있다.
한 가지 일면에서, 본 발명은 활성 성분으로서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 친유성 부분에 의해 유도된 헤지호그 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다.
본 발명의 헤지호그 처리는 사람 및 동물 피검체 모두에 있어서 효과적이다. 본 발명이 적용될 수 있는 동물 피검체는 애완 동물 및 상업적 목적용에 이르는 가축에까지 확장된다. 그 예로는 개, 고양이, 소, 양, 말, 돼지 및 염소가 있다.
헤지호그 단백질은 척추동물 및 무척추동물 모두에게서 다양한 배아 발달을 조절하는 세포외 시그날링 단백질류이다(참조문헌 1, 2 참조). 가장 잘 특징화된 헤지호그 단백질은 소닉 헤지호그(Shh)이며, 이것은 전방-후방 패턴화, 선단 외배엽 융기, 후장 중배엽, 척추 칼럼, 원위 사지의 형성, 늑골 발달, 폐 발달, 및 척추 코드, 후뇌 및 전뇌(3-8)에서 앞쪽 세포 유형의 유도에 관련된다. 헤지호그 단백질 작용의 메카니즘이 완전하게 이해되지 않은 반면에, 가장 최근의 생화학 및 유전학 데이타에서는 Shh에 대한 수용체가 종양 억제인자 유전자인 패치화된 단백질(9,10)이고, 다른 단백질인 연화된(smoothened) 단백질(10,11), 팔꿈치 개입된 (Cubitus, interruptus) 단백질(12,13) 및 융합된(fused) 단백질(14)이 헤지호그 시그날링 경로에 관련됨을 제시하고 있다.
사람 Shh는 자가촉매작용으로 분할되는 45kDa 전구체 단백질로서 합성되어 (I) 모든 공지된 헤지호그 시그날링 활성도를 나내는 20kDa의 N 말단 단편(서열 번호 1 내지 4) 및 (II) 자가 처리 활성도를 함유하는 25kDa의 C 말단 단편(15-17)을 수득한다. N 말단 단편은 완전 길이 전구체 서열의 아미노산 잔기 24-197로 구성된다.
N 말단 단편은 C 말단에서의 콜레스테롤의 첨가를 통해 막과의 연관성이 유지된다(18,19). 이러한 콜레스테롤은 헤지호그 시그날의 조직 국소화를 제한하는데 중요하다. 콜레스테롤의 첨가는 처리 단계 과정에서 C 말단의 영역에 의해 촉매화된다.
발명의 상세한 설명에 인용된 모든 참고문헌은 다르게 명기되지 않는 한, 참조적으로 본원에 인용된다.
I. 정의
본 발명은 이제 하기 정의가 포함되는 상세한 설명을 참조로 하여 설명될 것이다.
용어 "아미노산"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 단량체성 유닛을 의미한다. 천연 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질중에는 20개의 아미노산이 있으며, 이들은 모두 L-이성질체이다. 이 용어는 또한 아미노산의 유사체 및 단백질 아미노산과 이들의 유사체의 D-이성질체를 포함한다.
용어 "단백질"은 본질적으로 20개의 아미노산으로 이루어진 중합체이다. "폴리펩티드"가 종종 참고문헌에서 비교적 큰 폴리펩티드로 사용되고, "펩티드"는 작은 폴리펩티드로 사용될지라도, 당해 분야에서 이들 용어의 사용은 중복되고 변할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 다르게 언급되지 않는 한, 펩티드, 단백질 및 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "N-말단기"는 단백질의 성숙 형태의 첫번째 아미노산(아미노산 번호 1)을 의미한다.
용어 "N-말단 시스테인"은 서열 번호 1 내지 4에 도시된 바와 같이 아미노산 잔기(번호 1)를 의미한다. 이것은 또한 다른 단백질의 위치 1에서의 시스테인 또는 이러한 시스테인의 작용적 균등물을 의미한다(섹션 IV 참조).
용어 "스페이서" 서열은 소수적으로 개질되는 아미노산(예컨대, N 말단 시스테인 또는 작용성 균등물)과 단백질의 잔여물 사이에 삽입될 수 있는 단일 아미노산 만큼 작을 수 있는 짧은 서열을 의미한다. 스페이서는 소수적 개질과 단백질의 나머지 사이에 분리부분을 제공하여 개질이 단백질 작용을 간섭하는 것을 방지하고/거나 개질이 (예를 들어, N 말단 시스테인)이 지질, 소포 또는 다른 소수성 부분에 결합하는 것을 더 용이하게 하도록 고안된다. 이와 같이, 단백질이 N 말단 시스테인 및 또 다른 부위에서의 아미노산에서 개질되는 경우에, 2개 이상의 스페이서 서열이 존재할 수 있다.
용어 "테터링된" 단백질은 본 발명에 따라 소수적으로 개질된 단백질을 의미한다.
용어 "다가 단백질 복합체"는 다수의(즉, 하나 이상의) 단백질을 의미한다. 지질 또는 다른 소수성 부분은 다수의 단백질 중 하나 이상에 부착된다. 지질 또는 다른 소수성 부분은 임의로 소포와 접촉할 수 있다. 단백질이 지질 또는 다른 소수성 부분이 결핍된 경우에는, 지질 또는 다른 소수성 부분을 갖지 않는 단백질에 가교되거나 결합될 수 있다. 각각의 단백질은 동일하거나 상이할 수 있으며, 각각의 지질 및 다른 소수성 부분은 동일하거나 상이할 수 있다.
용어 "소포"는 친유성 분자의 응집체를 의미한다. 소포는 생물학적 공급원(예를 들어, 세포막과 같은 지질 이중층 또는 콜산 유도된 세정제 제형) 또는 비생물학적 공급원(예를 들어, 섹션 VI에 기술된 바와 같은 비생물학적 세정제 소포)로부터 수득될 수 있다. 소포의 형태, 유형 및 배열은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
용어 아미노산 잔기(예를 들어 N-말단 시스테인)의 "작용성 균등물"은 (i) 작용성 균등물로 대체된 아미노산 잔기로서 유사한 반응성을 갖는 아미노산; (ii) 본 발명의 폴리펩티드의 리간드의 아미노산, 작용성 균등물로 대체된 아미노산 잔기로서 유사한 소수성 부분(예를 들어, 지질) 결합성을 갖는 아미노산; (iii) 작용성 균등물로서 대체된 아미노산 잔기로서 유사한 소수성 부분(예를 들어, 지질) 결합성을 갖는 비아미노산 부분이다.
용어 "유전적 융합"은 2개 이상의 단백질 또는 이들의 단편의 공동 선형, 공유 결합을 의미하며, 이것은 상기 단백질을 코드화시키는 폴리누클레오티드 분자의 유전적 발현에 의해 개개의 펩티드 본쇄를 통해서 이루어진다.
용어 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 헤지호그 폴리펩티드를 코드화하는 제 1 아미노산 서열과 hh 단백질의 모든 영역과 실질적으로 상동이 아니며 상기 영역의 외부 영역을 한정하는 제 2 아미노산 서열의 융합을 의미한다. 키메라 단백질은 또한 제 1 단백질을 발현시키는 유기체에서 발견되는 외부 영역(상이한 단백질에서 발견될 수 있음)을 포함할 수 있거나, 상이한 유형의 유기체에 의해 발현되는 단백질 구조물의 "종간", "유전자간" 등의 융합일 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질은 화학식 (X)n-(hh)m-(Y)n(여기에서, hh는 헤지호그 단백질의 일부 또는 전체를 나타내고, X 및 Y는 각각 독립적으로 헤지호그 서열과 인접하지 않는 폴리펩티드 사슬로서 천연에서 발견되지 않는 아미노산 서열이고, m은 1 이상의 정수이며, n은 각각 독립적으로 0 또는 1 이상의 정수(n 및 m은 바람직하게 5 또는 10 이하이다)이다)으로 표현될 수 있다.
용어 "변이"은 유기체의 유전적 물질중의 변화, 특히 와일드형 폴리누클레오티드 서열중의 변화(즉, 삭제, 치환, 첨가 또는 변형) 또는 와일드형 단백질중의 변화를 의미한다.
용어 "와일드형"은 정상적으로 생체내에 존재하는 단백질 또는 이것의 일부, 단백질 서열 또는 이것의 일부의 엑손의 천연 폴리누클레오티드 서열을 의미한다.
용어 "표준 혼성화 조건"은 혼성화 및 세척 2가지 모두에 있어서 0.5 X SSC 내지 약 5 X SSC 및 65℃와 실질적으로 균등한 염 및 온도 조건을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "표준 혼성화 조건"은 조작적 정의이며 광범위한 혼성화 조건을 포함한다 [참조: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc. New York, Sections 6.3.1-6.3.6 (1989)].
용어 "발현 조절 서열"은 유전자에 조작적으로 결합하는 경우에 유전자의 발현을 조절하고 제한하는 폴리누클레오티드 서열의 의미한다.
용어 "조작적으로 결합"은 발현 조절 서열이 폴리누클레오티드 서열(DNA, RNA)의 전사 및 번역을 조절하고 제한하는 경우에 폴리누클레오티드 서열이 발현 조절 서열에 조작적으로 결합되는 것을 의미한다. 용어 "조작적으로 결합"은 발현시키려는 폴리누클레오티드 서열의 전방에 적당한 출발 시그날(예를 들어, ATG)를 포함시키는 것, 발현 조절 서열의 조절하에서 폴리누클레오티드 서열의 발현을 제한하기 위해 정확한 판독 프레임을 유지시키는 것, 및 폴리누클레오티드 서열에 의해 코드화되는 원하는 폴리펩티드를 생성시키는 것을 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 폴리누클레오티드, 예컨대 DNA 플라스미드 또는 파지(다른 공통적인 예중의 것)를 의미하며, 이들은 숙주 세포내로 도입되는 경우에 하나 이상의 유전자의 발현을 허용한다. 상기 벡터는 세포중에서 복제되거나 복제되지 않을 수 있다.
용어 "단리"("실질적으로 순수"와 교대로 사용됨)는 핵산, 즉 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드 서열에 적용되는 경우, 기원 또는 조작에 의해 (i) 사실상 관련되는 폴리누클레오티드 전부와 관련되지 않거나 (예를 들어 발현 벡터 또는 이것의 일부로서 숙주 세포중에 존재하거나); (ii) 사실상 관련되는 것과 다은 화학적 부분 또는 핵산과 결합되거나; (iii) 사실상 형성되지 않는 RNA 또는 DNA 폴리누클레오티드, 지놈성 폴리누클레오티드의 일부, cDNA 또는 합성 폴리누클레오티드를 의미한다. 용어 "단리"는 추가로 (i) 예를 들어 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해 생체외에서 증폭되거나; (ii) 화학적으로 합성되거나; (iii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생성되거나; (iv) 분할 및 겔 분리에 의해 정제되는 폴리누클레오티드 서열을 의미한다.
이와 같이 "실질적으로 순수한 핵산"은 핵산이 유도되는 유기체의 천연 지놈중에서 일반적으로 인접하는 코딩 서열 하나 또는 둘 모두와 바로 인접하지 않는 핵산을 의미한다. 실질적으로 순수한 DNA는 또한 부가 헤지호그 서열을 코드화하는 혼성 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
용어 "단리"("실질적으로 순수한"과 교대로 사용됨)는 폴리펩티드에 적용되는 경우에, 기원 또는 조작에 의해 (i) 발현 벡터의 일부의 발현 생성물로서 숙주 세포중에 존재하거나; (ii) 사실상 결합되는 것과 다른 화학 부분 또는 단백질에 결합되거나; (iii) 사실상 단백질이 존재하지 않는 형태가 되도록 단백질에의 하나 이상의 소수성 부분의 부착 또는 첨가에 의해 화학적으로 조작되는 단백질과 같이 사실상 형성되지 않는 폴리펩티드 또는 이것의 일부를 의미한다. 용어 "단리"는 추가로 (i) 화학적으로 합성되거나; (ii) 숙주 세포중에 발현되고 관련되고 오염된 단백질로부터 분리하여 정제된 단백질을 의미한다. 상기 용어는 일반적으로 천연단백질 및 핵산과 분리되는 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게, 폴리펩티드는 또한 이것을 정제하는데 사용되는 항체 또는 겔 메트릭스 (폴리아크릴아미드)와 같은 물질로부터 분리된다.
본원에 사용된 용어 "이형 프로모터"는 유전자 또는 정제된 핵산과 자연적으로 관련이 없는 프로모터를 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "상동"은 용어 "동일성"과 같은 의미이며, 2개의 폴리펩티드, 분자 사이, 또는 2개의 핵산 사이의 서열 유사성을 의미한다. 2가지 비교된 서열 모두에서 일정 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브 유닛에 의해 점유되는 경우(예를 들어, 2개의 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되거나, 2개의 폴리펩티드 각각의 위치가 리신에 의해 점유되는 경우), 각각의 분자들은 해당 위치에서 상동이다. 2개 서열간의 상동 비율은 비교되는 위치의 수로 나눈 2개의 서열에 의해 공유되는 결합 또는 상동 위치의 수에 100을 곱한 값이다. 예를 들어, 2개 서열중의 위치 10 중 6이 결합되거나 상동이므로 2개의 서열의 상동성은 60%이다. 예를 들어, DNA 서열 CTGACT 및 CAGGTT는 상동성이 50% 이다(6개의 전체 위치중 3 부분이 결합됨). 일반적으로, 2개의 서열이 최대 상동성을 제공하도록 정렬되는 경우에 비교된다. 상기 정렬은 얼라인(Align) 프로그램(DNAstar, Inc.)와 같은 컴퓨터 프로그램에 의해 편리하게 수행되는 예를 들어 문헌[Needleman et al., J. Mol Biol. 48:443-453 (1970)]의 방법을 이용하여 제공될 수 있다. 상동인 서열은 동일하거나 유사한 아미노산 잔기를 공유하며, 여기에서 유사한 잔기는 정렬된 기준 서열중의 상응하는 아미노산 서열에 대한 보존적 서열이거나 "허용된 지점 변이"이다. 이와 관련하여, 기준 서열에서 잔기의 "보존적 치환체"는 상응하는 기준 잔기와 물리적 또는 작용적으로 유사한, 예를 들어 공유 결합 또는 수소 결합등을 형성하는 능력을 포함하여, 유사한 크기, 모양, 전하, 화학적 성질을 갖는 치환체이다. 특히 바람직한 보존적 치환체는 문헌["accepted point mutation" in Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, chapter 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978)]에서 정의된 기준을 충족시키는 것들이다.
본원에서 교대로 사용되는 용어 "헤지호그 단백질" 또는 "헤지호그 폴리펩티드"는 서열 번호 4의 교감 아미노산 서열로 이루어진 일부 이상을 갖는 것으로 정의된다. 이 용어는 또한 헤지호그 폴리펩티드, 헤지호그 폴리펩티드의 작용성 변이체, 헤지호그 폴리펩티드의 상동체 또는 생물학적 활성도를 갖는 작용성 변이체를 의미한다. 특히, 상기 용어는 헤지호그 단백질 및 이것의 펩티딜 단편의 제형을 포함하며, 특정 문맥에 따라 효능제 및 길항제 모두는 자명해질 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "헤지호그 단백질의 생물학적 활성 단편"은 완전 길이의 헤지호그 폴리펩티드의 단편을 의미하며, 상기 단편은 와일드형 헤지호그 단백질에 의해 매개되는 유도적 상황을 구체적으로 효능 또는 길항 작용한다. 헤지호그 이중활성 단편은 바람직하게 헤지호그 단백질의 가용성 세포외 부분이며, 여기에서 용해도는 생리학적으로 혼화가능한 용액과 관련된다. 생물학적 활성인 단편의 예가 PCT 공보 WO 95/18856호 및 WO 96/17924호에 기술되어 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 헤지호그 폴리펩티드는 패치화된 단백질에 결합한다.
용어 "상응하는"은 특정 폴리펩티드 또는 핵산 서열에 관한 경우, 관심 서열이 상응하는 것으로 여겨지는 기준 서열에 동일하거나 상동인 서열을 나타내는 것을 의미한다.
용어 "펩티드(들)", "단백질(들)" 및 "폴리펩티드(들)"은 본원에서 교대로 사용된다. 용어 "폴리누클레오티드 서열" 및 "누클레오티드 서열"은 또한 본원에서 교대로 사용된다. 용어 "헤지호그 단편" 및 "헤지호그 N-말단 단편"은 "헤지호그"와 교대로 사용된다.
헤지호그 분자는 하기 성질 중 하나 이상을 갖는 경우에 "생물학적 활성도"를 갖는다: (i) 상기 분자는 본원에 정의된 헤지호그 교감 기준을 충족시키고(서열 번호 4), 수용체 패치화된 것에 결합하는 능력을 갖거나, 발현시에 상기 특징들을 갖는 폴리펩티드를 코드화시키고; (ii) 상기 분자는 본원에 정의된 바와 같이 헤지호그 교감 기준을 충족시키거나, 발현시에 상기 특징으로 갖는 폴리펩티드를 코드화시키며, (iii) 상기 분자는 C3H10T1/2 세포중의 알칼리성 포스파타제 활성도를 유도할 수 있다. 일반적으로, 단백질은 당업자들이 단백질의 생체내 효과를 나타내거나, 상기 효과에 적합하거나, 상기 효과를 합당하게 예상되는 것으로서 인식하는 생체외 효과, 성질 또는 특징을 갖는 경우에 "생물학적 활성도"를 갖는다.
용어 "소수성"은 화학 부분이 물 또는 다른 극성 원자 보다는 다른 것과 상호작용하는 무극성 원자를 갖는 경향을 의미한다. 대부분 "소수성"인 물질은 물에 불용성이다. 소수성 부분을 갖는 천연 생성물은 지질, 지방산, 인지질, 스핑고지질, 아크릴글리세롤, 왁스, 스테롤, 스테로이드, 테르펜, 프로스탕글란딘, 트롬복산, 류코트리엔, 이소프레노이드, 레테노이드, 비오틴 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산, 페닐알라닌, 이소루신, 루신, 발린, 메티오닌, 알라닌, 프롤린 및 티로신을 포함한다. 또한, 화학 부분은 소수성이거나, 물리적 성질이 비극성 원자의 존재로 측정되는 경우에 소수성을 갖는다. 상기 용어는 친유성 기를 포함한다.
용어 "친유성 기"는 폴리펩티드에 부착되는 경우, 높은 탄화수소 함량을 가짐으로써 지질 상에 대한 높은 친화성을 제공하는 기를 의미한다. 친유성 기는 예를 들어, 탄소수가 약 7 내지 30개인 비교적 장쇄의 알킬 또는 시클로알킬(바람직하게는 n-알킬)기일 수 있다. 알킬기는 히드록시 또는 1차 아민 "꼬리"로 종결될 수 있다. 추가로 예시하기 위해서, 친유성 분자는 지방산, 에스테르 및 알코올, 다른 지질 분자와 같은 천연 및 합성의 비방향족 및 방향족 부분, 아다만탄 및 부크민스터풀러렌과 같은 케이지 구조, 및 벤젠, 퍼릴렌, 페난트렌, 안트라센, 나프탈렌, 피렌, 크리센 및 나프타센과 같은 방향족 탄화수소를 포함한다.
용어 "내부 아미노산"은 N-말단 아미노산도 아니고 C-말단 아미노산도 아닌 펩티드 서열중의 아미노산을 의미한다.
용어 "표면 아미노산"은 단백질이 자연 형태로 주름지는 경우에 용매에 노출되는 아미노산을 의미한다.
용어 "세포외 시그날링 단백질"은 세포로부터 선택되거나 세포의 외부에 테터링되고, 수용체에의 결합시에 표적 세포상의 단백질이 표적 세포중의 반응을 일으키는 단백질을 의미한다.
본원의 처리 방법과 관련된 예를 들어 헤지호그 폴리펩티드의 "유효량"은 원하는 투여량의 일부가 투여되는 경우에, 투여법이 치료하려는 질환 또는 향장 목적에 있어서 임상적으로 허용되는 표준치에 따른 세포 증식율 및/또는 세포의 분화 상태 및/또는 세포의 생존율에서의 변화를 초래하는 제형중의 폴리펩티드의 양을 의미한다.
본 발명으로 치료하려는 "환자" 또는 "피검체"는 사람 또는 사람이 아닌 동물을 의미할 수 있다.
세포의 "성장 상태"는 세포의 증식율 및 세포의 분화 상태를 의미한다.
본 발명의 실시는 다르게 언급되지 않는한, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 단백질 화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용하며, 이 기술은 당해 분야에 속한다. 상기 기술은 기존 문헌에 기술되어 있다.
II. 단리된 헤지호그 단백질의 일반적인 성질
본 방법의 조성물의 폴리펩티드 부분은 천연 단백질, 재조합 단백질 및 합성 화학 물질의 정제를 포함하는 여러 기법에 의해 생성될 수 있다. 헤지호그 치료 물질의 폴리펩티드 형태는 바람직하게는 척추 동물의 헤지호그 단백질로부터 유도되며, 예를 들어, 척추 동물 유기체로부터의 천연 헤지호그 단백질 또는 이의 단편에 상응하는 서열을 갖는다. 그러나, 헤지호그 폴리펩티드가 후생 동물 유기체에서 발생하는 헤지호그 단백질(또는 이의 단편)에 상응할 수 있는 것으로 인지되어야 할 것이다.
본 발명의 방법에 사용되는 분리된 헤지호그 단백질은 헤지호그 류의 천연 또는 재조합 단백질이며, 무척추 동물 또는 척추 동물원(하기 참고 문헌 참조)중 어느 하나로부터 얻을 수 있다. 척추 동물 헤지호그 단백질 류의 구성 요소는 드로소필라(Drosophila) 헤지호그(hh) 유전자에 의해 코드화된 단백질과 상동성을 공유한다(33). 지금까지, 마우스 게놈과 cDNA 라이브러리의 결합 스크리닝으로, 사람을 포함하는 다른 포유 동물 뿐만 아니라 어류 및 조류에 존재하는 소닉 헤지호그(Sonic hedgehog)(Shh), 인디안 헤지호그(Indian hedgehog)(Ihh), 및 데저트 헤지호그(Desert hedgehog)(Dhh)로 언급되는 대응되는 세개의 포유 동물 hh가 확인되었다. 다른 구성 요소에는 문래트 헤지호그(Moonrat hedgehog)(Mhh) 뿐만 아니라 닭 소닉 hh 및 제브라피시 소닉 hh를 포함한다.
쥐 및 닭 Shh 및 쥐 Ihh 유전자는 분해가 진행되는 글리코단백질을 코드화하여 약 20kDa의 아미노 말단 단편(도 8 참조) 및 약 25kDa의 카르복시 말단 단편을 얻는다. 가장 바람직한 20kDa 단편은 서열 번호 4의 컨센서스 서열을 가지며 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함한다. 20kDa 부분을 포함하는 여러 그 밖의 단편은 본원 발명내에 포함되는 것으로 간주된다. 이러한 서열 뿐만 아니라 이의 화학적 및 물리적 특성을 기술하고 있는 공보는 34-38을 포함한다: PCT 특허 공개 제 WO 95/23223호(Jessell, Dodd, Roelink and Edlund), WO 95/18856호(Ingham, McMahon and Tabin) 및 WO 96/17924(Beachy et al.).
본 발명의 방법에 유용한 구성 요소는 뮤테인 또는 변이 단백질을 포함하여 천연이거나 화학적으로 생성되던가 간에, 대립 형질, 계통 발생적 대응물 또는 이들의 다른 변이체 뿐만 아니라 헤지호그 류의 재조합 형태 및 신규 활성 구성 요소를 포함한다. 특히 유용한 헤지호그 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 4를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용되는 분리된 헤지호그 폴리펩티드는 생물학적 활성을 갖는다. 이러한 폴리펩티드는 아미노산 서열 번호 1 내지 4에 대해 적어도 60%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동인 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 또한 서열 번호 1 내지 4의 아미노산과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 길이가 적어도 5, 10, 20, 50, 100 또는 150개의 아미노산이며, 서열 번호 1 내지 4로부터의 5이상, 바람직하게는 10이상, 보다 바람직하게는 20 이상, 매우 바람직하게는 50, 100 또는 150개의 연속 아미노산을 포함한다.
본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 헤지호그 폴리펩티드 서열 뿐만 아니라 다른 N-말단 및/또는 C 말단 아미노 서열을 포함하거나, 헤지호그 아미노산 서열 전부 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 분리된 헤지호그 폴리펩티드는 또한 제 1 헤지호그 부분 및 제 2 폴리펩티드 부분, 예를 들어 헤지호그와 관련되지 않은 아미노산 서열을 갖는 제 2 폴리펩티드 부분을 갖는 재조합 융합 단백질일 수 있다. 제 2 폴리펩티드 부분은 예를 들어, 히스티딘 tag, 말토오스 결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, DNA 결합 도메인 또는 폴리머라제 활성화 도메인일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 다중 유전자, 선택적 전사 이벤트, 선택적 RNA 스플라이싱 이벤트 및 선택적 번역 및 후번역 이벤트가 존재하므로써 발생하는 것들을 포함한다. 폴리펩티드는 전체가 인공 수단에 의해 이루어지거나 예를 들어 배양된 세포와 같은, 단백질이 원래 세포에서 발현되는 경우에 존재하는 사실상 동일한 후번역 변형을 초래하는 여러 계 또는 원래 세포에서 발현되는 경우에 존재하는 후번역 변형의 탈락을 초래하는 여러 계에서 발현될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 분리된 헤지호그는 하나 이상의 하기 특징을 갖는 헤지호그 폴리펩티드이다:
(i) 서열 번호 1 내지 4의 아미노산과 적어도 30, 40, 42, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖는다;
(ii) N-말단 단부로서 시스틴 또는 작용성 균등물을 갖는다;
(iii) C3H10T1/2 세포에서 알칼리 포스파타아제 활성을 유도할 수 있다;
(iv) 서열 번호 1 내지 4의 폴리펩티드와 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는, 적어도 70, 80, 90 또는 95%의 전체 서열 동일성을 갖는다;
(v) 포유 동물 세포와 같은 천연 공급원으로부터 분리될 수 있다.
(vi) patched와 결합하거나 상호작용할 수 있다.
(vii) 소수성 개질된다(즉, 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 소수성 부분을 갖는다).
III. 그 밖의 단백질
폴리펩티드의 기본 서열로 시스테인 잔기(또는 이의 작용성 균등물)를 조작하는 기술이 존재하기 때문에, 사실상 단백질은 본원에 기술된 방법을 사용하여 소수성 개질된 형태로 전환될 수 있다.
바이러스 수용체, 세포 수용체 및 세포 리간드는, 이들이 일반적으로 수용체의 많은 복사체를 나타내는 세포 또는 조직과 결합하기 때문에 유용하다. 본 발명의 방법을 사용하여 함께 착화될 수 있는 유용한 바이러스 세포-단백질 수용체에는 리노바이러스 수용체인 ICAM1, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 수용체인 CD 2 및 사람 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 수용체인 CD4가 포함된다. 그 밖의 단백질에는 ELAM-1 및 VCAM-1 및 VCAM-1b와 같은 세포 부착 분자류의 구성 요소 및 이들의 림프구 상응물(리간드); 림프구 관련 항원 LFA1, LFA2(CD2) 및 LFA3(CD58), CD59(CD2의 제 2 리간드), CD11/CD18 류의 구성 요소 및 VLA4와 같은 매우 후기인 항원과 이들의 리간드가 포함된다.
여러 병원체부터(즉, 박테리아, 진균, 바이러스 및 그 밖의 진핵세포 기생충으로부터)의 면역원은 또한 본 발명의 방법에서 폴리펩티드와 같이 사용될 수 있다. 박테리아 면역원에는 박테리아 폐렴 및 뉴모시스티스 폐렴의 원인이 되는 박테리아원이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다. 기생충원에는 플라스모디움(Plasmodium) 말리리아 기생충이 포함된다. 바이러스원에는 수두바이러스(예를 들어, 우두, 단순 포진, 시토메갈로바이러스); 아데노바이러스; 파포바이러스(예를 들어, 유두종 바이러스); 파보바이러스(예를 들어, 아데노 관련 바이러스); 레트로바이러스(예를 들어, HTLV I, HTLV II, HIV I 및 HIV II) 등이 포함된다. 면역글로블린 또는 이들의 단편은 또한 본 발명에 따라 개질될 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 통상의 방법(49)을 사용하여 특이적 항원을 인식하는 단일클론성 Fab 단편을 생성시키고, 본 발명에 따르는 다중 구성물 중에 작용성 부분으로서 개개의 Fab 도메인을 사용할 수 있다. 그 밖의 유용한 단백질에는 겔솔린(50); 다양한 인터페론(인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ)를 포함하는 시토킨; 다양한 인터류킨(예를 들어, IL-1, -2, -3, -4 등); 종양 괴저 인자-α 및 -β ; 단핵세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 에리트로포이에틴, 혈소판 유도 성장 인자(PDGF) 및 성장 호르몬 및 인슐린을 포함하는 사람 및 동물 호르몬이 포함된다.
일반적으로, 본 발명의 개질된 단백질의 구조는 일반식, A-Cys-[Sp]-B-[Sp]-X를 가지며, A는 소수성 부분이고, Cys는 시스테인 또는 이의 작용성 균등물이며, [Sp]는 임의의 스페이서 펩티드 서열이고, B는 단백질이고(이는 임의로 기재된 바와 같은 또 다른 스페이서 펩티드 서열을 가질 수 있다); X는 단백질의 C-말단 또는 단백질의 또 다른 표면 부위에 결합된(임의로 스페이서 펩티드에 의해) 소수성 부분이고, 여기에서 유도된 단백질는 하나 이상의 A 또는 X를 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 스페이서의 목적은 소수성 부분과 단백질의 나머지 부분 사이를 분리시켜 소수성 부분(예를 들어, 개질된 N-말단 시스테인)이 지질 또는 소낭일 수 있는 또 다른 부분과 보다 쉽게 연결되도록 하는 것이다. 스페이서는 또한 단백질 기능을 방해하는 개질이 보다 어려워지게 하도록 의도된다. 스페이서는 하나의 아미노산 길이만큼 작을 수 있다. 일반적으로, 프롤린 및 글리신이 바람직하다. 특히 바람직한 스페이서 서열은 소닉 헤지호그로부터 유도된 것이며, G-P-G-R의 아미노산 서열로 이루어진다.
IV. 재조합 폴리펩티드의 생성
본원에서 기술된 분리된 폴리펩티드는 당해 공지된 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법에는 직접적인 단백질 합성 방법에서 분리된 폴리펩티드 서열을 코드화하는 DNA 서열을 구성하고, 이러한 서열을 적합한 변형된 숙주에서 발현시키는 방법까지 다양하다.
재조합 방법의 일 구체예에서, DNA 서열은 가치 있는 야생형 단백질을 코드화하는 DNA 서열을 분리시키거나 합성시키므로써 구성된다. 임의로, 이 서열은 부위 특이적 변이 유발에 의해 변이되어 이의 작용성 유사체를 제공한다(참조 40 및 미국 특허 제 4,588,585호). 또 다른 가치 있는 폴리펩티드를 코드화하는 DNN 서열을 구성하는 방법은 올리고누클레오티드 합성제를 사용하여 화학적으로 합성시키는 것이다. 이러한 올리고누클레오티드는 바람직하게는 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하고, 바람직하게는 가치 있는 재조합 폴리펩티드가 생성될 숙주 세포에서 특성을 갖는 이러한 코돈을 선택하여 구성될 수 있다.
표준 방법은 가치있는 분리된 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 폴리누클레오티드 서열을 합성하는데 적용될 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열은 역번역 유전사를 구성하는데 사용될 수 있다(참조: 상기 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌). 또한, 특정 분리된 폴리펩티드를 코딩하는 누클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 부분을 위한 수개의 작은 올리고누클레오티드가 합성되고, 이후 결찰될 수 있다. 개개의 올리고누클레오티드는 상보 조합체에 대해 일반적으로 5' 또는 3' 돌출부를 갖는다.
일단 (합성, 부위 유도 변이생성에 의해 또는 또 다른 방법에 의해) 조합되면, 가치 있는 특정 분리된 폴리펩티드를 코드화하는 변이 DNA 서열은 발현 벡터에 삽입되어 조작에 의해 목적하는 숙주내의 단백질을 발현시키는 데 적합한 발현 조절 서열에 연결될 것이다. 적합한 조합체는 누클레오티드 서열화, 제한 맵핑 및 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 당해 널리 공지되어 있는 바와 같이, 숙주에서 트랜스펙션된 유전자를 고발현 수준으로 얻기 위해서는, 유전자를 선택된 발현 숙주에서 작용하는 전사 및 번역 발현 조절 서열에 조작에 의해 연결시켜야 한다.
발현 조절 서열 및 발현 벡터의 선택은 선택되는 숙주에 좌우될 것이다. 광범위하게 다양한 발현 숙주/벡터 조합물이 사용될 수 있다. 진핵 세포 숙주에 대해 유용한 발현 벡터에는 예를 들어, SV40, 우두종 바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스로부터의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터가 포함된다. 박테리아 숙주에 대한 유용한 발현 벡터에는 pCR1, pBR322, pMb9 및 이들의 유도체를 포함하는 대장균으로부터의 플라즈미드와 같은 공지된 박테리아 플라즈미드, M13 및 섬유질 단일 가닥 DNA 파지와 같은 보다 광범위한 숙주 플라즈미드가 포함된다. 바람직한 대장균 벡터에는 람다 파지 pL 프로모터를 함유하는 pL 벡터(미국 특허 제 4,874,702호), T7 폴리머라제 프로모터를 함유하는 pET 벡터(Studier et al., Methods in Enzymology 185: 60-89, 1990 1) 및 pSP72 벡터(상기 Kaelin 등)가 포함된다. 예를 들어, 이스트 세포에 유용한 발현 벡터에는 2 T 및 동원체 플라즈미드가 포함된다.
또한, 매우 다양한 발현 조절 서열이 이러한 벡터에 사용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 조절 서열에는 상기 발현 벡터의 구조 유전자와 관련된 발현 제어 서열이 포함된다. 유용한 발현 조절 서열의 예로는 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 조기 및 후기 프로모우터, lac 계, trp 계, TAC 또는 TRC계, 파지 람다의 주 작용제 및 프로모우터 영역, 예를 들어, pL, fd 코우트 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 글리콜 효소에 대한 프로모우터, 산 포스파타제의 프로모우터, 예를 들어, Pho5, 이스트 α-메이팅 계 및 원핵 또는 진핵 세포 유전자 및 이들의 바이러스의 발현을 조절하는 것으로 공지된 그 밖의 서열의 프로모우터, 및 이들의 다양한 조합체가 포함된다.
박테리아, 진균(이스트 포함), 식물, 곤충, 포유동물 또는 기타 적합한 동물 세포 또는 세포주 뿐만 아니라 형질전환된 동물 또는 식물을 포함하여 본 발명에서 기술된 분리된 헤지호그 폴리펩티드를 다량 생성하는데는 적합한 숙주가 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 이러한 숙주는 널리 공지된 진핵 또는 원핵세포 숙주, 예를 들어, 대장균, 슈도모나스(Psudomonas), 바실루스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 진균, 이스트)(예를 들어, Hansenula), 곤충 세포, 예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(SF9) 및 하이 파이브™(참조 실시예 1), 동물 세포, 예를 들어, 중국산 햄스터 오베리(CHO), 쥐 세포, 예를 들어, NS/O 세포, 아프리카산 사바나원숭이 세포, CO21, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10 및 사람 세포 뿐만 아니라 식물 세포를 포함할 수 있다.
모든 벡터 및 발현 조절 서열이 주어진 분리된 폴리펩티드를 발현시키는데 동등하게 잘 기능하는 것은 아닌 것으로 이해해야 한다. 또한, 모든 숙주가 동일한 발현계로 동등하게 작용하지 않을 것이다. 그러나, 당해 기술자들은 이러한 벡터, 발현 조절계 및 숙주 중에서 과도한 실험을 거치지 않고 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, 대규모 동물 배양물 중에 가치있는 분리된 폴리펩티드를 생성하기 위해서, 발현 벡터의 복사 수는 제한되어야 한다. 증폭가능한 벡터는 당해 널리 공지되어 있다[참조예:(41) 및 미국 특허 제 4,470,461호 및 제 5,122,464호].
이러한 DNA 서열의 발현 조절 서열로의 조작 연결에는 DNA 서열의 올바른 판독 프레임 업스트림에서 번역 개시 시그날의 제공을 포함한다. 발현되는 특정 DNA 서열이 메티오닌으로 시작하지 않는 경우, 개시 시그날은 생성물의 N-말단에 위치한 추가의 아미노산(메티오닌)에 나타날 것이다. 소수성 부분이 N-말단 메티오닐 함유 단백질에 연결되어야 하는 경우, 단백질이 본 발명의 조성물에 직접 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 바람직한 단백질의 N-말단 단부는 시스테인(또는 이의 기능 등가물)로 이루어져야 하기 때무에, 메티오닌은 사용전에 제거되어야 한다. 이와 같이 N-말단 메티오닌을 이들로 발현된 폴리펩티드로부터 제거하기 위한 방법은 당해 공지되어 있다. 예를 들어, 특정 숙주 및 발효 조건은 실질적으로 모든 N-말단 메틴오닌을 생체내에서 제거가능하게 한다. 그 밖의 숙주는 N-말단 메티오닌의시험관내 제거를 필요로 한다. 이러한 시험관내 및 생체내 방법은 당해 널리 공지되어 있다.
형질변형된 숙주에 의해 생성된 단백질은 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 이러한 표준 방법에는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도, 또는 기타 그 밖의 단백질 정제를 위한 표준 기법이 포함된다. 면역친화성 크로마토그래피(참조 1)와 관련하면, 소닉 헤지호그와 같은 단백질은 소닉 헤지호그 또는 관련 단백질에 제기되어, 고정 지지체에 고정된 항체를 포함하는 친화성 칼럼에 결합시키므로써 분리될 수 있다. 다르게는, 헥사히스티딘, 말토오스 결합 도메인, 인플루엔자 코우트 서열, 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제와 같은 친화성 태그가 상기 단백질에 결합되어 적합한 친화성 칼럼을 통과하므로써 정제를 용이하게 하도록 한다. 분리된 단백질은 또한 단백질 가수분해, 핵자기 공명 및 X선 결정학과 같은 기술을 사용하여 물리적으로 특징화될 수 있다.
A. 단편 및 유사체의 생성
분리된 단백질의 단편(예를 들어, 서열 번호 1 내지 4의 단편)은 당해 기술자들에게 공지된 방법을 사용하여 재조합 방법에 의해, 단백질 가수 분해법에 의해, 또는 화학적 합성법에 의해 효과적으로 생성될 수 있다. 재조합 방법에서, 폴리펩티드의 내부 또는 말단 단편은 분리된 헤지호그 폴리펩티드에 대해 코드화하는 DNA 서열의 한 단부(말단 단편에 대해) 또는 양단부(내부 단편에 대해)로부터 하나 이상의 누클레오티드를 제거하므로써 생성될 수 있다. "말단 니블링(end nibbling)" 엔도누클레아제로의 분해는 또한 단편의 배열을 코드화시키는 DNA를 생성시킬 수 있다. 단백질의 단편을 코드화하는 DNA는 무작위 시어링(shearing), 제한 분해, 또는 이들의 조합 또는 둘 모두에 의해 생성될 수 있다. 단백질 단편은 손상되지 않은 단백질로부터 직접 생성될 수 있다. 펩티드는 플라스민, 트롬빈, 트립신, 크로모트립신, 또는 펩신을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 단백질 가수 분해 효소에 의해 특이적으로 분해될 수 있다. 각각의 이러한 효소는 공격하는 유형의 펩티드 결합에 대해 특이적이다. 트립신은 카르보닐기가 염기성 아미노산, 보통 아르기닌 또는 리신으로부터 유래된 펩티드 결합의 가수분해에 촉매 작용을 한다. 펩신 및 크로모트립신은 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌과 같은 방향족 아미노산으로부터의 펩티드 결합 가수분해에 촉매 작용을 한다. 또 다른 셋트의 분해된 단백질 단편은 단백질 가수분해 효소에 민감한 부위에서 분해를 억제하므로써 생성된다. 예를 들어, 약한 염기성 용액 중에서의 리신의 ε-아미노산기와 에틸트리플루오로티오아세테이트와의 반응은, 인접하는 펩티드 결합이 트립신에 의한 가수분해에 더 이상 민감하지 않은 블록킹된 아미노산 잔기를 산출한다. 단백질은 단백질 가수 분해 효소에 민감한 펩티드 연결을 생성시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기의 β-할로에틸아민으로의 알킬화는 트립신에 의해 가수분해되는 펩티드 결합을 생성시킨다(51). 또한, 특이적 잔기에서 펩티드 사슬을 분해시키는 화학 시제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 브롬화시안은 메티오닌 잔기에서 펩티드를 분해시킨다(52). 따라서, 단백질을 개질제, 단백질 가수분해 효소 및/또는 화학 시제의 다양한 조합으로 처리하므로써, 단편의 중복이 전혀 없는 목적하는 길이의 단편으로 분할시키거나, 목적하는 길이의 중복 단편으로 분할시킬 수 있다.
단편은 또한 당해 공지된 기법(Merrifield solid phase F moc or t-Boc chemistry)을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다[참조: Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23:451 (1967)].
단편 및 유사체의 생성 및 시험을 기재한 종래 기술의 방법의 예가 하기 논의된다. 이들 또는 유사한 방법은 생물학적 활성을 가지는 것으로 나타낼 수 있는 분리된 폴리펩티드(예를 들어, 헤지호그)의 단편 및 유사체를 제조하고 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 헤지호그의 단편 및 유사체가 생물학적 활성을 가지는 가에 대해 시험하는 예시적 방법은 실시예 3에 기술된다.
B. 변형된 DNA 및 펩티드 서열의 생성: 무작위 방법
단백질의 아미노산 서열 변형체(서열 번호 1 내지 4의 변형체와 같은)는 단백질 또는 이의 특정 부분을 코드화하는 DNA의 무작위 변이생성에 의해 제조될 수 있다. 유용한 방법은 PCR 변이생성 및 침윤 변이생성이 포함된다. 임의의 아미노산 서열 변형체의 라이브러리는 또한 한 셋트의 변성 올리고누클레오티드 서열을 합성하므로써 생성될 수 있다. 변형된 DNA 및 펩티드를 사용하여 주어진 단백질의 아미노산 서열 변형체를 생성시키는 방법은 당해 널리 공지되어 있다. 이러한 방법의 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하고자 의도되는 것은 아니며, 단지 대표적인 방법을 예시하고자 제시되는 것이다. 당해 통상의 기술자들은 이와 관련하여 다른 방법 또한 유용할 수 있음을 인지할 것이다.
PCR 변이생성: 요약하면, Taq 폴리머라제(또는 그 밖의 폴리머라제)가 클로닝된 DNA의 단편으로 무작위 변이물을 도입시키는 데 사용된다(42). PCT 조건은 DNA 합성 성능이 예를 들어, 5의 dGTP/dATP 비를 사용하고, Mn2+를 PCR 반응에 첨가하여 Taq DNA 중합체에 의해 감소되도록 선택된다. 증폭된 DNA 단편의 푸울은 적합한 클로닝 벡터로 삽입되어 무작위 변이 라이브러리를 제공한다.
침윤 변이생성: 이중 한 방법이 문헌(43)에 전반적으로 기술되어 있다. 요약하면, 이 방법은 시험관내에서의 단일 가닥의 DNA의 화학적 처리 및 조사 및 cDNA 가닥의 합성에 의해 변이를 생성시키는 방법을 포함한다. 변이 주파수는 처리의 심각도에 의해 조절되며, 실질적으로 모든 가능한 염기 치환이 얻어질 수 있다.
변성 올리고누클레오티드 변이생성: 동종 펩티드의 라이브러리는 한 셋트의 변성 올리고누클레오티드 서열로부터 생성될 수 있다. 변성 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있으며, 합성 유전자는 이후 적합한 발현 벡터에 의해 결찰된다[참조예: (44, 45), and Itakura et al., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, pp. 273-289(A.G. Walton. ed.), Elsevier, Amsterdam, 1981].
C. 변형된 DNA 및 펩티드 서열의 생성: 직접식 방법
비무작위이거나 직접적인 변이 유발은 분리된 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드 서열의 특이적 부분에서 특이적 서열 또는 변이를 제공하여, 분리된 폴리펩티드의 공지된 아미노산 서열의 잔기의 삭제, 삽입 또는 치환을 포함하는 변형체를 제공한다. 이러한 변이 부위는 예를 들어 (1) 먼저 보존된 아미노산으로 치환하고 달성된 결과에 좌우되는 보다 많은 라디칼 선택하므로써; (2) 표적 잔기를 삭제하므로써, 또는 (3) 위치하는 부위에 인접하는 동일하거나 상이한 류의 잔기를 삽입하므로써, 또는 이들의 조합에 의해 개별적으로 또는 연속적으로 개질될 수 있다.
분명히, 이러한 부위 유도 방법은 N-말단 시스테인(또는 기능 등가물)이 주어진 폴리펩티드 서열에 도입되어 소수성 부분에 대한 결합 부위를 제공할 수 있는 방법중 하나이다.
알라닌 스캐닝 변이 유발: 이 방법은 변이 유발에 바람직한 위치인 목적하는 단백질의 잔기 또는 영역에 위치한다(46). 알라닌 스크리닝에서, 표적 잔기의 잔기 또는 기는 알라닌에 의해 선택되고 치환된다. 이러한 치환은 아미노산과 이웃하는 아미노산과의 상호작용 및/또는 둘러싸는 수성 또는 막 환경에 영향을 미칠 수 있다. 치환기에 작용 민감성을 갖는 것들은 이후 추가로 또는 다른 변형체를 치환 부위에 또는 이를 위해 도입시키므로써 개량된다.
올리고누클레오티드 매개된 변이생성: 이 방법의 한 변형이 DNA의 치환, 삭제 및 삽입 변형체를 제조하는데 사용될 수 있다(47). 요약하면, 목적하는 DNA는 일반적으로 목적하는 단백질(예를 들어, 헤지호그 단백질)의 변형되지 않았거나 야생형의 DNA 서열 템플레이트를 함유하는 플라즈미드 또는 파지의 단일 가닥 형태인 DNA 템플레이트로 DNA 변이물을 코드화시키는 올리고누클레오티드 프라이머를 혼성화시키므로써 변형된다. 혼성화후, DNA 폴리머라제는 올리고누클레오티드 프라이머를 혼입시키고, 목적하는 DNA 서열에서 선택된 변형을 위해 코딩할 템플레이트의 DNA 제 2 및 상보 가닥을 제조하는 데 사용된다. 일반적으로, 그 길이가 25개 이상의 누클레오티드인 올리고누클레오티드가 사용된다. 최적의 올리고누클레오티드는 변이물의 어느 한면에 템플레이트에 완전히 상보적인 12 내지 15개의 누클레오티드를 가질 것이다. 이는 올리고누클레오티드가 단일 가닥의 DNA 템플레이트 분자로 적합하게 혼성화시키도록 보장한다.
카셋트 변이생성: 이 방법(48)은 변이되어야 하는 단백질 서브 유닛 DNA를 포함하는 플라즈미드 또는 다른 벡터를 필요로 한다. 단백질 서브유닛 DNA에서 코돈이 확인되며, 상기 기술된 올리고누클레오티드 유도 변이 유발 방법을 사용하여 확인 변이 부위(들)의 각각의 측면 상에 독특한 제한 엔도누클레아제 부위가 삽입된다. 그 후, 플라스미드는 이들 부위에서 절단되어 선형화된다. 제한 부위들 사이의 DNA의 서열을 코딩하지만 원하는 변이부를 함유하는 이중 가닥 올리고누클레오티드는 표준 방법을 사용하여 합성된다. 두 가닥은 별도로 합성된 후, 표준 방법을 사용하여 함께 혼성된다. 이러한 이중 가닥 올리고누클레오티드는 "카세트"이며, 그 안에서 직접 결찰될 수 있는 선형화된 플라스미드의 말단과 양립할 수 있는 3' 및 5' 말단을 갖는다. 플라스미드는 현재 변이된 원하는 단백질 서브유니트 DNA 서열을 함유한다.
조합식 변이 유발 : 이 방법의 한 변형[참조예: Ladner et al., WO 88/06630]으로서, 바람직하게는 동족성을 가능한 한 가장 높아지도록 촉진하기 위해, 일단의 동족체 또는 그 밖의 관련된 단백질에 대한 아미노산 서열이 정렬된다. 정렬된 서열의 제시된 부분에서 나타나는 모든 아미노산은 조합식 서열의 축중 세트를 생성시키도록 선택될 수 있다. 변화된 라이브러리는 핵산 수준에서 조합식 변이 유발작용에 의해 발생되며, 변화된 유전자 라이브러리에 의해 코딩된다. 예를 들어, 합성 올리고누클레오티드들의 혼합물은 효소적으로 유전자 서열로 결찰되어 축중 세트의 가능한 서열이 개별적인 펩티드로서, 또는 대안적으로 전체 세트의 축중 서열을 함유하는 한 세트의 단백질로서 발현될 수 있다.
D. 그 밖의 단리된 폴리펩티드의 변이체
대립유전성 변이체, 천연 변이체, 유도 변이체, 및 헤지호그 펩티드에 항혈청에 의해, 특히, 헤지호그의 활성 부위 또는 결합 부위에 항혈청에 의해 특이적으로 결합된 폴리펩티드 및 소닉 헤지호그의 N-말단 단편과 같은 폴리펩티드(서열번호:1)를 코딩하는 핵산에 엄격하거나 엄격하지 않은 조건하에서 혼성되는 DNA에 의해 코딩된 단백질인 단리된 분자는 본 발명에 포함된다. 본원에 기술된 모든 변이체는 (i) 원형 단백질의 생물학적인 기능을 유지하고; (ii) 소수성 부분(예, 지질)에 결합하는 능력을 유지하는 것으로 예기된다.
본 발명의 방법은 또한 단편, 바람직하게는 생물학적 활성 단편, 또는 헤지호그와 같은 단리된 펩티드의 유사체의 용도를 특징으로 한다. 특히, 생물학적 활성 단편 또는 유사체는 서열번호: 1-4에 나타내어진 펩티드에 또는 그 밖의 천연 단리된 헤지호그에 특성적인 생체내 또는 시험관내 활성을 갖는 단편 또는 유사체이다. 가장 바람직하게는, 소수성으로 변형된 단편 또는 유사체는 생체내 또는 시험관내 검정에서 소닉 헤지호그의 활성의 10% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 또는 가장 바람직하게는 90% 이상을 갖는다(실시예 3 참조).
유사체는 아미노산 서열에 있어, 또는 서열을 포함하지 않는 방식에 있어, 또는 이 둘 모두에 있어 천연 단리된 단백질과는 다를 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 폴리펩티드는 아세틸화 반응, 메틸화 반응, 포스포릴화 반응, 아미드화 반응, 카르복실화 반응 또는 글리코실화 반응에서 가능한 변화에서의 가능한 변화 뿐만 아니라 생체내 또는 시험관내 화학적 유도 반응을 포함하는 바람직한 비서열 변형부(예, 이들의 N-종결 말단을 갖는)를 갖는다.
다른 유사체들은 소닉 헤지호그와 같은 단백질, 또는 서열이 하나 이상의 보존성 아미노산 치환부 또는 하나 이상의 비보존성 아미노산 치환부, 또는 단리된 단백질의 생물학적 활성을 없애지 못하는 삭제부 또는 삽입부에 의해 야생형 표준 서열(예, 서열번호:4)과는 다른 이의 생물학적 활성 단편을 포함한다. 보존성 치환부는 전형적으로 하기 그룹내에서 치환부와 같은 유사한 특성을 갖는 또 다른 치환부에 대한 하나의 아미노산의 치환을 포함한다: 발린, 알라닌 및 글리신; 루신 및 이소루신; 아스파트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린 및 트레오닌; 라이신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 비극성의 소수성 아미노산은 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성의 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아르파트산 및 글루탐산을 포함한다. 그 밖의 보존성 치환체는 당업자라면 용이하게 알 수 있다. 예를 들어, 아미노산 알라닌에 대해, 보존성 치환체는 D-알라닌, 글리신, 베타-알라닌, L-시스테인, 및 D-시스테인 중의 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 라이신에 대한 치환체는 D-라이신, 아르기닌, D-아르기닌, 호모-아르기닌, 메티오닌, D-메티오닌, 오르니틴, 또는 D-오르니틴 중의 어느 하나일 수 있다.
일반적으로, 단리된 폴리펩티드의 기능적 특성에의 변화를 야기하는 것으로 기대될 수 있는 치환체는 (i) 극성 잔기, 예를 들어 세린 또는 트레오닌이 소수성 잔기, 예를 들어 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 또는 알라닌 대용으로 (또는 이에 의해) 치환되거나; (ii) 시스테인 잔기가 어떠한 다른 잔기 대용으로 (또는 이에 의해) 치환되거나(실시예 10 참조); (iii) 전기양성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘이 전기음성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 글루타민산 또는 아스파트산 대용으로 (또는 이에 의해) 치환되거나; (iv) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 페닐알라닌이 부피가 큰 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예를 들어 글리신 대용으로 (또는 이에 의해) 치환되는 치환체를 갖는다.
본 발명의 방법 범위내에서 사용되는 다른 유사체들은 펩티드 안정성을 증가시키는 변형부를 갖는 유사체들이다. 이러한 유사체들은 예를 들어 펩티드 서열에서 하나 이상의 비펩티드 결합(펩티드 결합을 대체하는)을 함유할 수 있다. 또한, D-아미노산과 같은 천연 L-아미노산, 또는 베타 또는 감마 아미노산 및 고리형 유사체와 같은 비천연 또는 합성 아미노산 이외의 잔기를 포함하는 유사체들이 포함된다. L-아미노산 대신에 D-아미노산의 단리된 헤지호그 폴리펩티드내로의 혼입은 프로타아제에 대한 이의 내성을 증가시킬 수 있다[참조: 미국특허 제 5,219,990호, 서두].
단리된 헤지호그 유사체에 사용되는 용어 "단편"은 생물학적 활성을 보유한다면 하나의 단일 아미노산과 같이 작을 수 있다. 단편의 길이는 약 20개 이상의 잔기, 보다 전형적으로는 약 40개 이상의 잔기, 바람직하게는 약 60개 이상의 잔기일 수 있다. 단편은 당업자에게는 공지되어 있는 방법에 의해 발생될 수 있다. 단리된 헤지호그 생물 활성을 나타내는 후보체의 능력은 또한 본원에 기술된 바와 같이 당업자에게는 공지되어 있는 방법에 의해 평가될 수 있다.
V. 소수성 유도체의 제조
본 발명자들은 헤지호그 단백질과 같은 시그날링 단백질의 전체 소수성 성질의 증가가 단백질의 생물학적 활성을 증가시키는 것을 발견하였다. 헤지호그 단백질과 같은 시그날링 단백질의 능력은 (a) 술프히드릴 및/또는 N-말단 시스테인의 α-아민에 소수성 부분을 첨가하는 것과 같이 화학적으로 개질시키거나(실시예 8 및 9); (b) N-말단 시스테인을 소수성 아미노산(실시예 10)으로 치환하거나; (c) N-말단 시스테인을 여러 아미노산으로 대체시킨 후 치환된 잔기를 화학적으로 개질시켜서 치환 부위에 소수성 부분을 첨가함으로써 증가될 수 있다.
또한, (a) 내부 잔기를 소수성 아미노산으로 대체시키거나; (b) 내부 잔기를 여러 아미노산으로 대체시킨 후, 치환된 잔기를 화학적으로 개질시켜 치환 부위에 소수성 부분을 첨가함으로써(실시예 10 참조) 소수성 부분을 갖는 단백질의 표면상에서 내부 잔기에 헤지호그 단백질과 같은 단백질의 개질은 단백질의 생물학적 활성을 유지시키거나 증대시킬 것이다.
또한, (a) C-말단 잔기를 소수성 아미노산으로 대체시키거나; (b) C-말단 잔기를 여러 아미노산으로 대체시킨 후, 치환된 잔기를 화학적으로 개질시켜 치환 부위에 소수성 부분을 첨가함으로써 소수성 부분을 갖는 C-말단에서 헤지호그 단백질과 같은 단백질의 개질은 단백질의 생물학적 활성을 유지시키거나 증대시킬 것이다.
헤지호그 폴리펩티드가 유도될 수 있는 친유성 부분은 광범위하게 존재한다. 친유성 그룹은 예를 들어 탄소수가 약 7 내지 30개인 비교적 긴 사슬의 알킬 또는 시클로알킬(바람직하게는 n-알킬)기일 수 있다. 알킬기는 히드록시 또는 1차 아민 "테일"로 종결될 수 있다. 보다 구체적으로 설명하면, 친유성 분자는 지방산, 에스테르 및 알코올, 그 밖의 지질 분자, 아다만탄 및 부크민스터풀러렌(buckminsterfullerenes)과 같은 케이지 구조, 및 벤젠, 페릴렌, 페난트렌, 안트라센, 나프탈렌, 피렌, 크리센 및 나프타센과 같은 방향족 탄화수소와 같은 천연 및 합성 방향족 및 비방향족 부분을 포함한다.
지환족 탄화수소, 포화 및 불포화 지방산 및 그 밖의 지질 및 포스포리피드 부분, 왁스, 콜레스테롤, 이소프레노이드, 테르펜, 및 아다만탄 및 부크민스터풀러렌을 포함하는 다지환족 탄화수소, 비타민, 폴리에틸렌 글리콜 또는 올리고에틸렌 글리콜, (C1-C18)-알킬 포스페이트 디에스테르, -O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-알킬, 및 특히 피렌 유도체와의 컨쥬케이트가 친유성 분자로서 특히 유용하다. 친유성 부분은 디페닐헥사트리엔, 나일 레드(Nile Red), N-페닐-1-나프틸아민, 프로단, 라우로단, 피렌, 퍼릴렌, 로다민, 로다민 B, 테트라메틸로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 술포로다민, 1,1'-디도데실-3,3,3',3'-테트라에틸린도카르보시아닌 퍼클로레이트, 옥타데실 로다민 B 및 몰리큘라 프로브즈 인코포레이티드(Molecular Probes Inc.)에서 시판하는 BODIPY 염료를 포함하지만 이에 국한되지 않는 본 발명에서 사용하기에 적합한 친유성 염료일 수 있다.
친유성 부분의 다른 예로는 지방족 카르보닐 라디칼, 예로서 1- 또는 2-아다만틸아세틸, 3-메틸아다만트-1-일아세틸, 3-메틸-3-브로모-1-아다만틸아세틸, 1-데칼린아세틸, 캄포르아세틸, 캄판아세틸, 노르아다만틸아세틸, 노르보난아세틸, 비시클로[2.2.2]-옥트-5-엔아세틸, 1-메톡시비시클로[2.2.2]-옥트-5-엔-2-카르보닐, 시스-5-노르보넨-엔도-2,3-디카르보닐, 5-노르보넨-2-일아세틸, (1R)-(-)-미르텐탄아세틸, 2-노르보난아세틸, 안티-3-옥소-트리시클로[2.2.1.0〈2,6〉]-헵탄-7-카르보닐, 데카노일, 도데카노일, 도데세노일, 테트라데카디에노일, 데시노일 또는 도데시노일을 포함한다.
소수성 개질부의 구조의 예는 도 12에 도시되어 있다. 적합한 아미노산이 특정 위치에서 이용될 수 없다면, 부위 지향 변이 유발을 사용하여 반응성 아미노산을 특정 부위에 배치할 수 있다. 반응성 아미노산으로는 시스테인, 라이신, 히스티딘, 아스파트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 티로신, 아르기닌, 메티오닌 및 트립토판이 있다. 변이 유발을 사용하여 N- 또는 C-말단에서 또는 내부 위치에 반응성 아미노산을 배치할 수 있다.
예를 들어, 본 발명자들은 헤지호그와 같은 생물학적 활성 단백질의 N-말단 시스테인을 화학적으로 개질시키거나 N-말단 시스테인을 모두 제거하면서 여전히 단백질의 생물학적 활성을 유지시키는 것이 가능한데, 단, 개질되거나 치환된 화학적 부분이 소수성인 경우에 한해서 가능하다는 것을 밝혀냈다. 본 발명자들은 헤지호그의 생물학적 활성의 증대가 대략적으로 개질부의 소수성도와 서로 관련되어 있다는 것을 발견하였다. 단백질 활성의 증대 이외에, N-말단 시스테인의 개질 또는 대체가 제조, 정제, 제형화 및 단백질의 저장 동안 일어날 수 있는 시스테인의 원하지 않는 교차 반응 및/또는 개질을 제거한다. N-말단 시스테인의 티올은 시스테인의 pKa를 저하시키고 중성 또는 산 pH에서 반응성 티올레이트 이온의 형성 및 양자 해리도를 증가시키는 α-아민에 근접하기 때문에 반응성이 매우 크다.
본 발명자들은 헤지호그의 N-말단 시스테인의 소수성 아미노산으로의 대체가 세포를 기본으로 하는 시그날링 검정에서 단백질의 효능을 증가시킨다는 것을 입증하였다. 시스테인을 대체함으로써, 이러한 접근 방법은 제조, 정제, 제형화 및 단백질의 저장 동안 일어날 수 있는 그 밖의 시스테인의 원하지 않는 개질을 방해하는 문제를 없앤다. 대부분의 접근 방법은 세가지 다른 소수성 아미노산, 페닐알라닌, 이소루신, 및 메티오닌 각각이 보다 큰 활성 형태의 헤지호그를 제공한다는 본 발명자들의 발견에 의해 지지된다. 따라서, 시스테인의 어떠한 다른 소수성 아미노산으로의 대체는 활성 단백질을 생성시켜야 한다. 더욱이, 본 발명자들이 C3H10T1/2 검정에서 아미노산 또는 화학 개질부의 소수성도와 상응하는 개질된 단백질의 효능 사이의 상관관계(예, Phe〉Met, 긴 사슬의 지방산〉짧은 사슬 길이)를 밝혔기 때문에, 하나 이상의 소수성 아미노산의 헤지호그 서열에의 첨가가 단일 아미노산 첨가에 의해 달성되는 효능 이상으로 단백질의 효능을 증가시킨다고 간주될 수 있다. 사실상, 사람의 소닉 헤지호그의 N-말단에 두 개의 연속적인 이소루신 잔기의 첨가가 단지 하나의 단일 이소루신만이 첨가된 변이체와 비교할 때 C3H10T1/2 검정에 효능을 증가시킨다(실시예 10). 이와 같이, 표면 루프 형태로 또는 위치 조합식으로 헤지호그 단백질의 N- 또는 C-말단에 소수성 아미노산을 첨가하면 활성이 보다 큰 단백질이 생성된다. 치환된 아미노산은 20개의 보통 아미노산 중의 하나일 필요는 없다. 방법은 단백질의 특정 부위(78, 79)에서 비천연 아미노산을 치환하는 것으로 보고되었으며, 이는 단백질 가수분해 공격에 안정한 보다 큰 소수성이거나 헤지호그 단백질을 이의 활성을 보다 특이적이게 할 수 있는 생체내 특정 부위로 지향시키는데 사용될 수 있는 경우에 유리할 것이다. 비천연 아미노산은 시험관내 번역동안 단백질내 특정 부위에 혼입될 수 있으며, 진행과정은 상기 개질된 단백질을 대규모로 생성시킬 생체내 시스템에서 생성시키는 것으로 보고되고 있다.
본 발명에 따라 개질된 헤지호그 단백질과 같은 단백질이 생물학적 활성을 보유할 것으로는 예기되지 않는다. 먼저, N-말단 시스테인은 어류, 개구리, 곤충, 새 및 포유동물을 포함하여, 모든 공지된 헤지호그 단백질 서열에 유지된다. 따라서, N-말단 시스테인의 유리된 술프히드릴이 단백질의 구조 또는 활성에 중요한 것으로 생각하는 것이 온당하다. 두 번째로, 소수성 아미노산(예, 아스파트산 또는 히스티딘)으로의 변이화 또는 단백질 가수분해적 분열로 인해, n-말단 시스테인이 결여된 헤지호그 단백질은 실시예 3에 기술된 바와 같이, 세포를 기본으로 하는 C3H10T1/2 검정에서 비활성적이다.
티올을 보호하고 소수성 부분을 부가하는 N-말단 시스테인의 많은 개질부가 있다. 이들 개질부는 하기에 보다 상세하게 기술된다. 당업자라면 개질이 특정의 치료 목적에 가장 적합하다고 결정을 내릴 수 있다. 이러한 결정에 영향을 미치는 인자는 제조 비용 및 용이성, 정제 및 제형화, 용해도, 안정도, 효능, 약물동력학 및 반응속도, 안전성, 면역원성, 및 조직 표적화를 포함한다.
A. 1차 아미노산 서열의 화학적인 개질
소수성 부분에 의한 활성화와 아울러 티올을 보호하기 위한 N-말단 시스테인의 화학적인 개질은 당업자에 의해 다수의 방식으로 수행될 수 있다. 활성종으로서 티올레이트 이온을 갖는 술프히드릴 부분은 단백질에서 반응성이 가장 큰 작용 그룹이다. 다른 어떠한 그룹보다 더 빠르게 반응하는 많은 시약이 있다. [참고문헌: Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (S.S. Wong, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991]. 모든 헤지호그 단백질에서 발견되는 N-말단 시스테인의 티올은 서열내에서 내부 시스테인 보다 반응성인 것으로 예견된다. 이것은 α-아민의 매우 근접이 중성 또는 산 pH에서 반응성 티올레이트 이온으로의 해리도를 보다 크게 하는 티올의 pKa를 감소시킬 것이기 때문이다. 또한, 구조의 N-말단에 있는 시스테인은 단백질 구조 속에서 발견되는 헤지호그 서열에서 다른 두 개의 시스테인 보다 더 노출되어 있는 것으로 여겨진다. 본 발명자들은 N-말단 시스테인이 pH 5.5에서 N-에틸말레이미드와의 1시간 반응후에(실시예 9 참조) 및 pH 7.0에서 N-이소프로필요오도아세트아미드와의 18시간 반응후에 개질된 유일한 아미노산임을 밝혀냈다. 상기 방법의다른 예는 α-할로아세틸 화합물, 유기 수은, 디술파이드 시약 및 그 밖의 N-치환된 말레이미드와의 반응일 것이다. 이들 활성종의 다수의 소수성 유도체는 구입가능하거나(예, 에틸 요오도아세테이트(위스콘신 밀워키에 소재하는 알드리치), 페닐 디술파이드(알드리치) 및 N-피렌말레이미드(오리건 주진에 소재하는 몰리큘라 프로브즈), 용이하게 합성될 수 있다(예, N-알킬요오도아세트아미드(84), N-알킬말레이미드(85) 및 유기수은(86)). 본 발명자들은 사람의 소닉 헤지호그의 N-말단 시스테인이 N-이소프로필요오도아세트아미드에 의해 특이적으로 개질될 수 있다는 것과 소수성으로 개질된 단백질이 비개질된 단백질 보다 C3H10T1/2 검정에서 2배 더 효능적이라는 것을 입증하였다(실시예 9 참조). 사슬이 긴 알킬요오도아세트아미드 유도체에 의한 Shh의 개질은 효능이 훨씬 더 증대된 개질된 단백질을 생성시킬 것으로 예견된다. 이러한 N-알킬요오도아세트아미드는 시판되는 출발 물질을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 합성될 수 있다.
N-말단 시스테인의 반응성에 대한 또 다른 일면은 이것이 이의 1,2-아미노티올 형태에 유일한 반응 화학에 참여할 수 있다는 것이다. 일례로 티올에스테르의 S에서 N으로의 빠른 이동을 통해 N-말단 아미드기를 형성시키는 티올에스테르기와의 반응이 있다. 이러한 반응 화학은 합성 펩티드와 함께 커플링할 수 있으며, 적당하게 활성화된 펩티드를 통해 단일 또는 다중의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 밖의 소수성기를 첨가하는데 사용될 수 있다. 여기에서 입증된 또 다른 예는 티아졸리딘 부가생성물을 형성하는 알데히드와의 반응이다. 티올 에스테르(예, C2-C24 포화 및 불포화 지방 아실 조효소 A 에스테르(미주리 세인트 루인스에 소재하는 시그마 케미칼 컴패니)), 알데히드(예, 부티르알데히드, n-데실 알데히드, 및 n-미리스틸 알데히드(알드리치)) 및 케톤(예, 2-, 3- 및 4-데칸온(알드리치))의 다수의 소수성 유도체는 구입 가능하거나 용이하게 합성될 수 있다(87, 88). 유사한 방식으로, 실시예 9에 기술된 1-브로모-2-부탄온 화학에 의해 예시된 티오모르폴린 유도체는 다양한 α-할로케톤 출발 물질로부터 제조될 수 있다(88). N-말단 시스테인 또는 단백질의 어떠한 시스테인의 티올을 개질시키는 대안적인 방법을 발견하기가 용이하기 때문에, 본 발명자들은 여기에서 설명된 특정예에 의해 한정되기를 희망하지 않는다.
단백질의 α-아민은 단백질의 다른 아민에 대하여 우선적으로 개질될 수 있는데, 그 이유는 이의 낮은 pKa가 중성 또는 산성 pH에서 다량의 반응성 비양자화 형태를 생성시키기 때문이다. 본 발명자들은 유리된 시스테인 티올 그룹을 유지시키면서 사슬이 긴 지방 아미드 그룹을 갖는 N-말단 아민의 개질이 두배 정도의 크기 만큼 헤지호그 단백질을 활성화시키는 것을 입증하였다(실시예 8). 따라서, N-말단 아민과 우선적으로 반응하도록 지향될 수 있는 화학은 헤지호그 단백질의 효능을 증가시키는데 사용될 것으로 기대된다. 이들 중에서도, 아릴 할로겐화물, 알데히드 및 케톤, 산 무수물, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 이미도에스테르, 산 할로겐화물, N-히드록시숙신이미딜(예, 술포-NHS-아세테이트), 니트로페닐 에스테르, 아실이미다졸 및 그 밖의 활성화된 에스테르가 아민 작용기와 반응하는 것으로 공지되어 있다.
헤지호그의 N-말단 시스테인을 특정의 다른 아미노산으로 대체시킴으로써, 다른 화학적 방법이 소수성 부분을 N-말단에 첨가하는데 사용될 수 있다. 하나의 예는 N-말단에 세린 또는 트레오닌을 배치시키고, 이러한 아미노산을 산화시켜 알데히드를 형성시킨 후, 1,2-아미노 티올 구조(예, 시스테인)를 함유하는 화학 부분과 상기 단백질을 컨쥬게이션시키는 것이다. 두 번째 예는 N-말단에 히스티딘을 배치하여 C-말단 티오카르복실산에 커플링시키는 것일 것이다.
그 밖의 아미노산의 화학적인 개질:
그 밖의 많은 아미노산의 개질을 위한 특정의 화학 방법이 있다. 따라서, 보다 활성형의 헤지호그를 합성하기 위한 또 다른 방법은 N-말단 시스테인 이외에 헤지호그의 아미노산에 소수성 부분을 화학적으로 부착시키는 것일 것이다. 적절한 아미노산이 원하는 위치에서 유용하지 않은 경우, 부위 지향성 변이 유발을 사용하여, N- 또는 C-말단이든 헤지호그 구조내 그 부위에, 또는 또 다른 위치에 반응성 아미노산을 배치시킬 수 있다. 반응성 아미노산은 시스테인, 라이신, 히스티딘, 아스파트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 티로신, 아르기닌, 메티오닌, 및 트립토판을 포함할 것이다. 이와 같이, 보다 소수성 형태의 헤지호그를 생성시키려는 목표는 많은 화학적 방법에 의해 달성될 수 있으며, 본 발명자들은 본 발명자들의 결과가 대다수의 이러한 접근법을 지지하고 있기 때문에 개질 부위 또는 특정 화학에 의해 제한되기를 희망하지 않는다.
헤지호그 폴리펩티드는 화학적 커플링 방법 또는 유전공학적 방법을 포함하는 여러가지 방법으로 소수성 부분에 결합될 수 있다.
설명 목적으로, 당업자에게는 공지되어 있는 화학적 가교제는 많이 있다. 본 발명에 대해서는, 바람직한 가교제는 헤지호그 폴리펩티드와 소수성 부분을 단계적인 방식으로 결합시키는데 사용될 수 있는 이종의 이작용성 가교제이다. 이종의 이작용성 가교제는 단백질에 컨쥬게이션하기 위한 보다 특이적인 커플링 방법을 디자인할 수 있는 능력을 제공하여, 호모-단백질 중합체와 같은 원하지 않는 부반응의 발생을 감소시킨다. 광범위한 이종의 이작용성 가교제는 당해기술분야에 공지되어 있다. 이들의 예로는 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS); N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐) 부티레이트(SMPB), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC); 4-숙신이미딜옥시카르보닐-a-메틸-a-(2-피리딜디티오)-톨루엔 (SMPT), N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트] 헥사노에이트 (LC-SPDP)가 있다. N-히드록시숙신이미드 부분을 갖는 이들 가교제는 일반적으로 보다 큰 수용해도를 갖는 N-히드록시술포숙신이미드 유사체로서 수득될 수 있다. 또한, 연결 사슬에 디술파이드 브릿지를 갖는 이들 가교제는 생체내 링커 분열의 양을 감소시키기 위해 알킬 유도체로서 그 대신에 합성될 수 있다.
이종의 이작용성 가교제 이외에도, 동종 이작용성 및 광반응성 가교제를 포함하는 다수의 다른 가교제가 존재한다. 디숙신이미딜 기질(DSS), 비스말레이미도헥산(BMH) 및 디메틸피멜이미데이트 2HCl (DMP)이 유용한 동종 이작용성 가교제의 예이고, 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디술파이드(BASED) 및 N-숙신이미딜-6(4'-아지도-2'-니트로페닐-아미노)헥사노에이트(SANPAH)가 본 발명에서 사용하는데 유용한 광반응성 가교제의 예이다. 단백질 커플링에 관한 최신 기술은 문헌[Means et al. (1990) Bioconjugate Chemistry 1:2-12]에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
상기에서 포함된, 하나의 특히 유용한 부류의 이종 이작용성 가교제는 1차 아민 반응성 그룹, N-히드록시숙신이미드(NHS), 또는 이의 수용성 유사체 N-히드록시술포숙신이미드(술포-NHS)를 함유한다. 알칼리성 pH에서 1차 아민(라이신 입실론 그룹)은 NHS 또는 술포-NHS 에스테르상에의 친핵성 공격에 의해 비양자화된 상태로 반응한다. 이러한 반응은 아미드 결합을 형성시키며, 부산물로서 NHS 또는 술포-NHS를 방출한다.
이종 이작용성 가교제의 부분으로서 유용한 또 다른 반응성 그룹은 티올 반응성 그룹이다. 보통의 티올 반응성 그룹은 말레이미드, 할로겐 및 피리딜 디술파이드를 포함한다. 말레이미드는 약산성 내지 중성(pH 6.5-7.5) 조건하에서 수분내에 술프히드릴(시스테인 잔기)과 특이적으로 반응한다. 할로겐(요오도아세틸 작용기)은 생리적 pH에서 -SH 그룹과 반응한다. 이들 반응성 그룹 둘 모두 안정한 티오에테르 결합을 형성시킨다.
이종 이작용성 가교제의 제 3 성분은 스페이서 아암 또는 브릿지이다. 브릿지는 두 반응성 말단을 연결하는 구조이다. 브릿지의 가장 분명한 속성은 입체장애에 대한 효과이다. 일부 경우에, 보다 긴 브릿지가 두 개의 복잡한 생체분자를 연결하는데 필요한 거리를 보다 용이하게 스패닝시킬 수 있다. 예를 들어, SMPB는 14.5Å의 전장을 갖는다.
이종 이작용성 시약을 사용하여 단백질-단백질 컨쥬게이트를 제조하는 것은 아민 반응과 술프히드릴 반응을 포함하는 2 단계 과정이다. 제 1 단계로서, 아민 반응인데, 선택된 단백질은 1차 아민을 함유해야 한다. 이것은 리신 엡실론 아민 또는 대부분의 단백질의 N-말단에서 발견되는 1급 알파 아민일 수 있다. 단백질은 유리 술프히드릴기를 포함해서는 안된다. 콘쥬게이셔닝되기 위하여 양 단백질이 유리 술프히드릴기를 포함하는 경우에, 한 단백질은 모든 술프히드릴이 예컨대, N-에틸말레이미드를 사용하여 차단되도록 변형될 수 있다(여기서 참고문헌으로 통합되는 Partis et al. (1983) J. Pro. Chem. 2:263 참조). 특정한 단백질에서 술프히드릴의 양을 계산하기 위하여 엘만 시약(Ellman's Reagent)이 사용될 수 있다(예컨대, 여기서 참고문헌으로 통합되는 Ellman et al.(1958) Arch. Biochem. Biophys. 74:443 및 Riddles et al.(1979) Anal. Biochem. 94:75 참조).
반응 완충제는 외인성 아민 및 술프히드릴이 없어야 한다. 반응 완충제의 pH는 7.0 내지 7.5이어야 한다. 이 pH 범위는 말레이미드기가 아민과 반응하는 것을 방지하여, 술프히드릴과의 제 2의 반응을 위해 말레이미드기를 보존한다.
NHS-에스테르 함유 가교제는 수용성으로 제한되었다. 가교제는 가교제를 반응 혼합물에 도입하기 전에 최소량의 유기 용매(DMF 또는 DMSO)에 용해되어야 한다. 가교제/용매는 반응이 일어나도록 허용할 에멀젼을 형성한다.
설포-NHS 에스테르 아날로그는 보다 더 수용성이고, 반응 완충제에 직접적으로 첨가될 수 있다. 높은 이온 강도의 완충제는 설포-NHS 에스테르를 "염석"하는 경향이 있기 때문에, 피하여야 한다. 가수분해에 기인한 반응성을 상실을 피하기 위하여, 가교제는 단백질 용액을 용해한 직후에 반응 혼합물에 첨가된다.
반응은 농후한 단백질 용액에서 보다 더 효율적일 수 있다. 반응 혼합물의 알칼리성 pH가 클수록, 반응속도는 더 빨라진다. NHS 및 설포-NHS의 가수분해 속도도 pH를 증가시킴에 따라 증가할 것이다. 보다 더 높은 온도는 가수분해 및 아실화 모두에 대한 반응 속도를 증가시킬 것이다.
반응이 완료되면, 술프히드릴 반응성 부분을 가진 최초의 단백질이 이제 활성화된다. 활성화된 단백질은 간단한 겔 여과 또는 투석에 의하여 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 가교의 제 2단계를 수행하기 위하여, 말레이미드, 활성화된 할로겐, 또는 피리딜 디설파이드와의 반응을 위해 선택된 친유성기는 유리 술프히드릴기를 포함하여야 한다. 대안적으로, 1급 아민이 술프히드릴을 첨가하기 위하여 변형될 수 있다.
모든 경우에, 완충제는 술프히드릴기의 산화를 방지하기 위하여 탈기되어야 한다. EDTA는 완충제에서 존재할 수 있는 어떠한 산화성 금속을 킬레이팅하기 위하여 첨가될 수 있다. 완충제는 어떠한 술프히드릴 포함 화합물도 없어야 한다.
말레이미드는 약간 산성 pH 내지 중성 pH 범위(6.5 내지 7.5)에서 SH기와 특이적으로 반응한다. 중성 pH는 할로겐 및 피리딜 디설파이드 관련 반응에 적합하다. 이러한 조건 하에서, 말레이미드는 일반적으로 수분 내에 SH기와 반응한다. 할로겐 및 피리딜 디설파이드에 대해서는 보다 더 긴 반응 시간이 필요하다.
아민 반응 단계에서 제조되는 최초의 술프히드릴 반응성 단백질은 적당한 완충 조건 하에서 술프히드릴 포함 친유성기와 혼합된다. 그 콘쥬게이트는 겔 여과와 같은 방법 또는 투석에 의하여 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다.
콘쥬게이션을 위한 활성화된 친유성 부분의 예로서: N-(1-피렌)말레이미드; 2,5-디메톡시스틸벤-4'-말레이미드, 에오신-5-말레이미드; 프루오레신-5-말레이미드; N-(4-(6-디메틸아미노-2-벤조퓨라닐)페닐)말레이미드; 벤조페논-4-말레이미드; 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드(DABMI), 테트라메틸로다민-5-말레이미드, 테트라메틸로다민-6-말레이미드, Rhodamine RedTM C2 말레이미드, N-(5-아미노펜틸)말레이미드, 트리플루오로아세트산 염, N-(2-아미노에틸)말레이미드, 트리플루오로아세트산염, Oregon GreenTM 488 말리이미드, N-(2-((2-(((4-아지도-2,3,5,6-테트라플루오로)벤조일)아미노)에틸)디티오)에틸)말레이미드(TFPAM-SS1), 2-(1-(3-디메틸아미노프로필)-인돌-3-일)-3-(인돌-3-일)말레이미드(비스인돌릴말레이미드; GF 109203X), BODIPYFL, N-(2-아미노에틸)말레이미드, N-(7-디메틸아미노-4-메틸쿠마린-3-일)말레이미드(DACM), AlexaTM 488 C5 말레이미드, AlexaTM 594C5 말레이미드, 나트륨 염 N-(1-피렌)말레이미드, 2,5-디메톡시스틸벤-4'-말레이미드, 에오신-5-말레이미드, 플루오레신-5-말레이미드, N-(4-(6-디메틸아미노-2-벤조퓨라닐)페닐)말레이미드, 벤조페논-4-말레이미드, 4-디메틸아미노페닐아조페닐 -4'-말레이미드, 1-(2-말레이미딜에틸)-4-(5-(4-메톡시페닐)옥사졸-2-일)피리디늄 메탄설포네이트, 테트라메틸로다민-5-말레이미드, 테트라메틸로다민-6-말레이미드, Rhodamine RedTM C2 말레이미드, N-(5-아미노펜틸)말레이미드, N-(2-아미노에틸)말레이미드, N-(2-((2-(((4-아조-2,3,5,6-테트라플루오로)벤조일)아미노)에틸)디티오)에틸)말레이미드, 2-(1-(3-디메틸아미노프로필)-인돌-3-일)-3-(인돌-3-일)말레이미드, N-(7-디메틸아미노-4-메틸쿠마린-3-일)말레이미드(DACM), 11H-벤조[a]플루오렌, 벤조[a]피렌을 포함한다.
한 구현예에서, 헤지호그 폴리펩티드는 Molecular Probes(Eugene, Oreg.)로부터 구입될 수 있는 피렌 말레이미드, 예컨대 N-(1-피렌)말레이미드 또는 1-피렌메틸 요오도아세테이트(PMIA 에스테르)를 사용하여 유도될 수 있다. 도 1에 에시된 바와 같이, 피렌-유도 헤지호그 단백질은 변형되지 않은 단백질 형태 보다 거의 20배의 활성을 나타내는 활성 프로필을 나타냈다.
B. 소수성 펩티드 유도체의 제조
본 발명에 따라, 단백질은 소수성 펩티드를 사용하여 변형될 수도 있다. 여기서 사용된 바와 같이, "펩티드"라는 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기의 서열을 포함한다. 바람직하게는, 펩티드는 1개의 아미노산 내지 한 단백질의 막 스패닝 세그멘트의 전형적인 길이인 18 내지 26개 아미노산의 길이를 갖는다. 소수성을 갖는 펩티드를 만들기 위하여, 아미노산은 하기 소수성 아미노산으로부터 주로 선택된다: 페닐알라닌, 이소로이신, 로이신, 발린, 메티오닌, 트립토판, 알라닌, 프롤린, 및 티로신. 소수성 펩티드는 소수성을 갖는 비천연 아미노산 아날로그 또는 D-아미노산, 펩토이드 결합, N-말단 아세틸화 또는 펩티드의 단백분해에 대한 감수성을 감소시키는 다른 특징을 포함할 수도 있다. 단백질의 특정한 위치에서 비천연 아미노산을 치환하는 방법이 공지되어 있다(78, 79).
일반적으로, 소수성 펩티드는 단백질에서 여러 가지 자리에 부가된다. 한 자리는 N-말단 잔기일 수 있다. 대안적으로, 소수성 펩티드가 N-말단 잔기 대신에 치환된다. 다른 구현예에서는, 소수성 펩티드는 단백질의 C-말단에 부가된다. 대안적으로, 소수성 펩티드가 C-말단 잔기 대신에 치환된다. C-말단은 자연산 C-말단 아미노산일 수 있으나, 소수성 펩티드가 절단된 형태의 최후의 C-말단 아미노산에 부가되도록 절단된 단백질의 C-말단일 수도 있고, 이것은 여전히 "C-말단"으로서 언급된다. 절단된 헤지호그 단백질은 자연산 C-말단 서열로부터 11개의 아미노산이 제거될 때까지, 활성을 보유할 것이다. 소수성 펩티드는 N-말단 잔기 및 N-말단 잔기에 바로 근접한 내부 잔기 사이에, 또는 C-말단 잔기 및 C-말단 잔기에 바로 근접한 잔기 사이에 또는 2개의 내부 잔기 사이에 삽입될 수도 있다.
어떤 구현예에서, 친유성 부분은 마가이닌, 세크로핀, 아타신, 멜리틴, 그라미시딘 S, 황색 포도상 구균의 알파-톡신, 알라메티신과 같은 양쪽성 폴리펩티드 또는 합성 양쪽성 폴리펩티드이다. 바이러스 입자 유래의 푸소게닉 피막 단백질은 피검 헤지호그 단백질에 대한 양쪽성 서열의 적합한 공급원이 될 수도 있다.
C. 지질 유도체의 제조
본 발명에 포함되는 다른 형태의 단백질은 다양한 지질 부분을 가지는 유도 단백질이다. 일반적으로, "지질"은 유기 용매 중에서 가변적인 용해성 및 물에서 대부분 불용성을 특징으로 하는 비균질류의 소수성 물질중의 하나이다. 본 발명 내에 포함되는 지질의 주된 부류는 지방산 및 스테롤(예컨대, 콜레스테롤)이다. 본 발명의 유도 단백질은 고리형, 비고리형(즉, 직쇄), 포화 또는 불포화된 모노-카르복시산인 지방산을 포함한다. 전형적인 지방산은 일반식: CH3(CH2)nCOOH를 가진다. 하기 표에 종래의 화학적 방법을 사용하여 편리하게 유도체화될 수 있는 몇가지 지방산의 예를 수록한다.
전형적인 포화 및 불포화 지방산 [포화 산 : CH3(CH2)nCOOH]
n 값 일반명2 부티르산4 카프로산8 카프릴산10 라우르산12 미리스트산*14 팔미트산*16 스테아르산*18 아라키드산*20 비헨산22 리그노세르산불포화 산CH3CH=CHCOOH 크로톤산CH3(CH2)3CH=CH(CH2)7COOH 미리스톨레산*CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH 팔미톨레산*CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH 올레산*CH3(CH2)3(CH2CH=CH)2(CH2)7COOH 리놀레산CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7COOH 리놀렌산CH3(CH2)3(CH2CH=CH)4(CH2)3COOH 아라키돈산
* 표는 용해성 구성물로부터 분비되는 재조합 헤지호그 단백질에서 발견되는 지방산을 나타낸다.
단백질에 결합될 수 있는 다른 지질은 측쇄 지방산 및 포스파티딜이노시톨(즉, 포스파티딜이노시톨 4- 모노포스페이트 및 포스파티딜이노시톨 4,5-비포스페이트), 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린과 같은 인지질 군의 지질, 및 파네실 또는 제라닐기와 같은 이소프레노이드를 포함한다.
지질-변형 헤지호그 단백질은 자연산 공급원으로부터 정제될 수 있거나, 용해성 비변형 단백질을 화학적으로 변형시킴으로써 수득할 수 있음을 설명하였다. 자연산 공급원으로부터 정제된 단백질에 대하여, 완전한 길이의 인간 소닉 헤지호그(Shh)가 곤충 세포에서 발현되고, 막 결합 Shh가 SP-세파로즈 크로마토그래피 및 면역친화성 크로마토그래피를 함께 사용하여 세제 처리된 세포로부터 정제 될 때, 정제된 단백질은 SDS-PAGE 겔을 감소시키면서 20kDa의 겉보기 질량을 가진 하나의 단일 샤프 밴드로서 이동하였음을 제시하였다(실시예 1 참조). 용해성 막 결합 Shh 단백질은 역상 HPLC에 의해 쉽게 구별가능하였고, 테더링된 형태는 아세토니트릴 구배에서, 더 나중에 용리되었다(실시예 1 및 도 3 참조). 그 후, 인간 소닉 헤지호그는, 콜레스테롤을 포함하고, 따라서 Drosophila 헤지호그에 대하여 이전에 보고된 데이타와 유사한 한 형태(18), 및 콜레스테롤 및 팔미트산 변형물을 모두 포함하는 제 2의 신규 형태인 2개의 형태로 세포막에 테더링됨을 설명하였다. 용해성인 테더링된 형태의 Shh는 액체 크로마토그래피-질량 분석에 의해서 뿐만 아니라 전기 스프레이 이온 소오스가 장착된 삼중의 사중극자 질량 분석기를 사용하여 전기분무 질량 분석에 의해 분석되었다(실시예 1 참조). 엔도프로테이나제 Lys-C로 소화된 결합된 Shh로부터 N-말단 펩티드의 동일성은 MALDI 비행시간형 질량분석계에서 MALDI PSD 질량분석 측정법에 의해 확인되었다. 팔미토일레이션의 위치는 펩티드 맵핑 및 서열 분석을 함께 함으로써 확인되었고, 단백질의 N-말단에 존재한다(서열 번호: 1 내지 4에서 성숙 단백질 서열의 잔기 1). 테더링된 형태 모두는 C3H10T1/2 알칼리성 포스파타제 검정에서 동등하게 활성이었으나, 흥미롭게도 양자는 테더가 없는 용해성 인간 Shh보다 약 30배의 효능이 있었다. 지질 변형은 Shh의 그 수용체, patched에 대한 겉보기 결합 친화성에 큰 영향을 주지 못하였다(도 7).
그 다음에, 용해성인 테더링된 Shh의 상대적 효능을, 단독으로 또는 알칼리 포스파타제 유도를 측정하는 C3H10T1/2 세포에서 안티-헤지호그 중화 Mab 5E1의 존재하에, 검정함으로써 유도 형태의 유용성을 시험하였다. 또한, 용해성인 테더링된 Shh의 patched에 대한 상대적 결합 효능은 patched-트랜스펙팅된 EBNA-293 세포에서 FACS 분석에 의해 평가되었다(실시예 3).
용해성의 비변형 단백질을 화학적으로 변형함으로써 얻어진 지질-변형 헤지호그에 대하여, 팔미트산 및 다른 지질이 C3H10T1/2 분석에서 증가된 효능을 가진 지질-변형 형태를 만들기 위하여 용해성 Shh에 첨가될 수 있음이 제시되었다(실시예 8). N-말단 시스테인에 대한 티올 및 α-아민이 지질 유도화 반응에 기여함이 제시되었다(실시예 1, 2 및 8). 어떠한 특정 이론에 의하여 구속되기를 바라지 않지만, 단백질에 있어서 지질 변형은 티오에스테르 중간체의 형성으로 시작하며, 지질 부분은 그후 고리형 중간체의 형성을 거쳐 N-말단의 α-아민으로 이전된다. 일반적으로, 따라서 반응성 지질 부분은 조효소 A 티오에스테르와 같은 포화 또는 불포화 카르복시산의 티오에스테르 형태일 수 있다. 이러한 물질 및 그의 유도체는 예컨대, 상업적으로 구입가능한 조효소 A, 팔미토레오일 조효소 A, 아라키도닐 조효소 A, 아라키도노일 조효소 A, 라우로일 조효소 A 등을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 Sigma Chemical Company로부터 쉽게 구입가능하다(St. Louis, MO., 1998 catalog pp.303-306).
헤지호그 단백질의 기능적 활성에 대한 여러 가지 지질 부분의 효과가 검정되었다(실시예 8 및 도 10 및 11). 유사하게, 섹션 Ⅲ에서 상기한 바와 같은 다른 단백질의 기능적 활성에 대한 여러 가지 지질 부분의 효과는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 쉽게 시험될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따라 지질-변형된, 겔솔린(50), 다양한 인터페론(인테페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ), 다양한 인터류킨(예컨대, IL-1, -2, -3, -4 등), 종양 괴사 인자-α 및 -β, 및 다른 성장 인자들의 기능 시험이 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다.
지방산이 헤지호그 단백질의 N-말단 시스테인에 결합될 수 있는 화학적 수단이 확립되었지만, 지질이 효소 촉매 반응을 사용하여 동일한 위치 또는 다른 위체에 결합될 수 있을 것으로 기대될 수 있다. 생체내에서 단백질의 팔미토일레이션은 팔미토일-CoA: 단백질 S-팔미토일트랜스퍼라제로 알려진 효소류에 의해 촉매된다. 정제된 효소를 사용하여, 시험관 내에서 단백질 기질의 아실화가 증명되었다 (80, 81). 팔미토일트랜스퍼라제 효소의 기질 특이성은 잘 정의되어 있지 않다; 새포 및 바이러스 단백질의 팔미토일레이션 위치 분석으로 변형된 시스테인 잔기 주위의 일치 서열의 방식에서 발견된 것은 거의 없지만, 시스테인의 2개 아미노산내에 라이신 또는 아르기닌 잔기, 및 시스테인 부근에 거대한 소수성의 아미노산이 공통적으로 존재함을 암시한다. Shh의 아미노 말단 서열, CGPGRGFG는 이러한 일치 서열에 적합할 수 있고 팔미토일레이션에 대한 인식 위치로서 공헌한다.
대체물로서, 헤지호그 단백질의 아미노 말단의 미리스토일레이션은 N-미리스토일 트랜스퍼라제(NMT)를 사용하여 수행될 수 있었고, 많은 NMT는 포유동물(82) 및 효모(83) 양자에서 특색을 이루어 왔다. N-미리스토일트랜스퍼라제의 인식 위치는 효소에 의한 인지를 촉진하기 위하여 헤지호그 N-말단 서열에 엔지니어리될 수 있었다. 이러한 전략 모두는 실시예 8에서 기술된 인간 소닉 헤지호그의 비효소적 지방 아실화에 사용되는 바과 같이, 기질로서 지방 아실-조효소 A 유도체의 사용을 필요로 한다. 대안적으로, 엔지니어링된 인식 서열을 가진 단백질은 적당한 세포 라인에서 발현 중에 미리스토일화될 수 있다. 헤지호그와 같은 단백질을 소수성 부분으로 변형시키는 다른 방법은 단백질의 C-말단에서 이소프레노이드 기의 첨가를 위한 인식 위치를 만즐어내는 것이다. 파네실 및 제라닐-제라닐 첨가를 위한 인식 위치는 공지되어 있고, 진핵 세포에서의 발현 중에 변형될 수 있다(Gelg et al., Cur.Opin. Chem. Biol. 2: 40-48(1998)).
Ⅵ. 다합체성 단백 복합체
여기서 기술된 소수성으로 변형된 단백질은 특히 다합체성 단백질 복합체로 되기 쉽다. 본 발명의 다합체성 단백질 복합체는 그의 소수성 (예컨대 지질) 부분을 통하여 소포에 임의적으로 결합된 단백질을 포함한다. 소포는 천연 물질로부터 정제된 천연의 생체막일 수 있거나, 소포는 합성 구조물일 수 있다. 바람직한 소포는 친양쪽성 물질, 예컨대 계면활성제 또는 인지질로 된 실질적으로 구형인 구조이다. 이 구형 소포의 지질은 일반적으로 하나 이상의 구조적 층, 예컨대 다중라멜라 소포(이중층 사이에 수성 용적을 포함하는 지질 이중층의 다중 양파 모양의 껍질) 또는 미셀을 가진 지질의 형태로 구성된다.
특히, 리포좀은 다양한 타입의 지질, 인지질, 및 제 2의 친유성 성분으로 주로 구성된 작은 구형의 소포이다. 이러한 성분은 생체막의 지질 배열과 유사하게, 정상적으로는 이중층을 형성하여 배열된다.
일반적으로, 지질 성분 또는 지질 유사 분자의 극성 말단은 주위 용액, 대개 수용액과 접촉해 있고, 반면에 지질 또는 지질 유사 분자의 비극성, 소수성 말단은 다른 지질 또는 지질 유사 분자의 비극성, 소수성 말단과 접촉해 있다. 결과적으로 이중층 막(즉, 소포)은 특정한 크기, 소수성, 형태, 및 네트 전하의 분자를 선택적으로 투과할 수 있다. 지질 또는 콜레스테롤을 가진 계면활성제를 포함하는 대체 리포좀 이중층 포뮬레이션이 존재하지만, 대부분의 소포는 천연 지질 또는 지질 유사물이다.
리포좀 소포는 많은 치료적, 진단적, 산업적, 및 상업적인 용도를 얻는다 점에서 특히 바람직할 수 있다. 리포좀 소포는 물에 쉽게 용해되지 않는 분자를 전달하거나, 지시된 시간에 방출하는 것이 바람직할 때 사용된다. 많은 화학물질에 대한 선택적인 투과성 때문에, 리포좀은 약물 및 생물학적 물질에 대한 전달 매체로서 유용하다. 따라서, 헤지호그와 같은 지질-유도 단백질은 리포좀 소포의 지질 이중층으로 결합됨으로써 다합체로 될 수 있다. 표적 위지체 도달할 때, 리포좀은 분해될 수 있거나(예컨대, 위장관에서 효소에 의하여) 세포막과 융합할 수 있다.
리포좀과 같은 소포를 제조하는 여러가지 방법이 공지되어 있다. 인지질 소포의 생성은 잘 알려져 있다(53). 통상적으로 사용되는 방법에 대한 일반적인 고찰은 (54)를 참조한다. 이들중 보다 더 일반적인 것은 때때로 증발/동결 및 재수화가 후속하는, 지질을 함유한 용액에 대한 (1) 음파처리(예를 들어, Stryer, Biochemistry, pp.290-291, Freeman ＆ Co., New York, (1988), and (55) 참조), (2) 때때로 고압 또는 고전단력에서의 지질 용액의 균질화(1988년 5월 10일자 미국 특허 제 4,743,449호, 및 1988년 6월 28일자 미국 특허 제 4,753,788호), (3) 수화 및 때때로 유기 용매에 용해된 지질 용액의 증발에 의해 제조된 소포 형성 지질의 건조 필름 음파처리(1984년 6월 5일자 미국 특허 제 4,452,747호, 1990년 1월 23일자 미국 특허 제 4,895,719호, 및 1990년 8월 7일자 미국 특허 제 4,946,787호 참조), (4) 동결 또는 증발 및 재수화(1990년 1월 30일자 미국 특허 제 4,897,355호, 1988년 11월 5일자 EP 제 267,050호, 1988년 10월 11일자 미국 특허 제 4,776,991호, 1986년 2월 19일자 EP 제 172,007호, 및 1986년 4월 24일자 AU-A-48713/85호 참조), (5) 수성 매질에 대한 용매 주입 또는 지질 용액의 주입 또는 그 반대(예를 들어, (56); 1990년 5월 1일자 미국 특허 제 4,921,757호, 1988년 11월 1일자 미국 특허 제 4,781,871호, 1988년 3월 24일자 WO 제 87/02396호, 및 1990년 1월 23일자 미국 특허 제 4,895,452호 참조), (6) 분무 건조(예를 들어, 1986년 4월 24일자 호주 특허 출원 제 AU-A-48713/85호 및 1989년 5월 16일자 미국 특허 제 4,830,858호), (7) 여과(예를 들어, WO 85/01161호 참조), (8) 역상 증발. 예를 들어, (57); 및 (9) 상기 방법들의 조합을 참조한다. 예를 들어, (58) 및 (59)를 참조한다.
소포의 제조에 적합한 바람직한 지질 또는 지질계 성분으로는 인지질, 인지질 혼합물, 극성 지질, 천연지질, 지방산, 및 이들의 유도체가 포함된다. 바람직한 지질은, 지질 전이 온도 초과에서 수중에 단독으로 분산된 경우에, 지질 유제상으로 존재한다. 특정의 바람직한 구체예에서, 지질은 약 12개 탄소 초과의 단일 지방족 사슬이고, 포화되거나 비포화되며, 또는 다른 방법으로 치환된다. 적합힌 지질은 에스테르, 알콜, 하기 지방산의 산 형태: 스테아레이트, 오레인산, 리놀레인산, 아라키데이트, 아라키돈산, 및 다른 단일 지방족 사슬 산. 추가적인 후보는 에스테르, 알콜, 및 레티놀 형태, 특히 레티놀 및 레티논산의 산 형태를 포함한다. 다른 바람직한 지질은 합성되거나 다양한 천연 자원으로부터 유도된 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜글리세롤(PG), 및 이들의 유도체를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 소포는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 합성 인지질의 PEG 헤드군(디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(DSPE)과 컨쥬게이션된 PEG 예를 들어, (61) 참조). 바람직한 계면활성제는, Tween™, Triton™, 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 나트륨 라우렐 설페이트, 또는 나트륨 옥틸 글리코시드와 같은 우수한 혼화성을 가지는 것들이다.
바람직한 계면활성제는 상기 계면활성제의 상 전이 온도 초과에서 수성용액에 첨가될 경우에 마이셀을 형성한다. 상기 계면활성제는 하나 이상의 지방족 사슬을 구성할 수 있다. 이들 지방족 사슬은 포화되거나, 비포화되거나, 다른 방법으로 치환 예를 들어, 에톡실화된다; 일반적으로 지방족 사슬은 12개 초과의 탄소를 함유한다. 추가의 적합한 계면활성제는 하기를 포함한다: 라우릴-설포베타인, 미리스틸-설포베타인, 리놀레일-설포베타인, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-사크로신, 미리스틸-사크로신, 리놀레일-사크로신, 또는 스테아릴 사크로신; 라우로아미도프로필-베타인, 코카미도프로필-베타인, 리놀레아미도프로필-베타인, 미리스트아미도프로필-베타인, 팔미도프로필-베타인, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인(예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-타우레이트, 또는 디나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUAT 계열(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.). 예를 들어, 실시예 4 참조.
다량의 단백질 착체의 제조용으로 적합한 바람직한 스테롤 및 스테롤 에스테르는 콜레스테롤, 콜레스탄올, 콜레스테롤 설페이트, 및 다른 콜레스테롤 유사체 및 이들의 유도체를 포함한다. 소포가 많은 다른 지질과 세정제를 포함할 수 있다는 사실은 바람직한 특성을 지닌 결합된 단백질-소포 착체의 조작에 커다란 유연성을 부여한다. 예를 들어, 당업자는 커다란 소포를 생성시키기 위해 초기 물질의 지질 조성을 변화시킴에 의해, 또는 소포중의 포스파티딜이노시톨 지질의 백분율을 증가시킴에 의해 다른 수의 단백질을 결합시키는 소포를 생성시킬 수 있다.
Ⅶ. 용도
일반적으로, 본원에 기술된 변형된 단백질은 변형되지 않은 형태의 단백질로 치료할 수 있는 병변과 동일한 병변의 치료를 위해 유용하다. 그러나, 본원에서 제공된 소수성으로 변형된 단백질은 변형되지 않은 형태에 비해 수가지의 현저한 개선을 제공한다. 첫째로, 이들의 증가된 효능은 보다 더 적은 양의 단백질로 보다 더 짧은 시간 동안의 치료를 가능하게한다. 이는 전신 및 CNS 적용 양자 모두에 대해 중요하다. 둘째로, N-말단 시스테인을 보다 덜 화학적 활성인 아미노산으로 치환시키는 것은 임상적 사용을 위한 단백질의 보다 더 용이한 생성, 제형화, 및 저장을 허락한다. 셋째로, 단백질의 약제역학은 소수성 변형에 의해 변경될 수 있으며, 이는 단백질이 투여 부위의 부근에서 국소화될수 있도록 하므로써, 단백질의 시스티매틱 노출을 최소화시킴에 의해 그의 안정성을 높이고, 단백질의 국소 농도를 증가시킴에 의해 그의 효율을 증가시킨다. 본 발명의 단백질은 또한 단백질의 대응하는 수용체의 탐지를 위한 진단 조성물 및 방법에 유용하다.
제 1의 관점의 한 실시예로서, 헤지호그의 반감기가 전신적용 후에 매우 짧음을 발견하였으며, 단백질에 대한 강력한 반응을 달성하기 위해서는 복수 주입이 필요함을 발견하였다. 변형된 형태의 보다 더 높은 효능 및 리포좀에서의 제형화 가능성이 보다 더 적은 치료 횟수로 반응을 달성할 수 있는 방법을 제공한다. CNS 적용에서, 보다 더 높은 효능이 CNS로의 직접적인 주입을 위해 요구되는, 작은 용적내에 적절한 양의 단백질을 제공하는 방법을 제공한다.
제 2관점의 중요성은, 헤지호그의 N-말단 시스테인이 화학적인 공격, 다른 화학적 부산물의 형성 또는 다른 헤지호그 단백질과 함께 산화적 이량체의 형성에 고도로 민감하다는 발명자들의 발견에 의해 예시된다. 이를 방지하기 위해, 정제과정중에 특별한 완충제 및 방법이 사용되며, 디티오트레이톨이 최종적인 제형화에 사용된다. 이러한 예방 조치는 동물 모델에서 제형화 완충제의 효과의 조심스런 평가를 필요로한다.
제 3의 관점에 대한 실시예로서, 투여 부위로부터 단백질이 확산하는 범위를 보다 더 제한할 수록, 국소 농도는 보다 더 높아진다. 따라서, 상기 보다 더 높은 국소 농도는 뇌 또는 척수의 목적하는 부위에 직접 주입시킨 후 신경 질환의 치료중에 보다 더 특이적인 임상 반응을 허락한다.
유사하게, 상기 변형된 단백질은 골절 부위의 치료을 위해 골절 부위에, 임신 질환을 치료하기 위해 생식선에, 안 질환의 치료를 위해 눈에, 및 피부 질환의 치료 및 국부적인 증모를 위해 피하 부위에 국소적으로 투여될 수 있다. 따라서, 소수성으로 변형시킨 단백질을 투여 부위로 국소화시키는 것은 다른 조직 및 기관으로의 바람직하지 못한 가능한 전신 노출을 감소시킨다.
치료적 용도를 위해, 소수성으로 변형시킨 본 발명의 단백질을 약제학적으로 수용가능한 멸균의 등장 제형에 두며, 선택적으로는 본 발명의 분야에 잘 알려진 표준 방법으로 투여한다. 상기 제형은 바람직하게는 액상이거나 동결된 분말이다. 다량의 단백질 착체의 치료적 투여가 본원에서 기술된 유도 단백질을 통합하는 리포좀을 포함할 수 있음이 고안된다.
본 발명의 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 소수성으로 변형시킨 단백질의 특정 투여, 용량, 및 치료적 적용이 특정 단백질 및 그의 생물학적 활성에 따라 변할 수 있음을 인식할 것이다.
치료중에 발명의 단백질을 적용하는 한 실시예로서, 치료적인 소수성으로 변형시킨 헤지호그 단백질이 다양한 신경 질환을 겪고 있는 환자에게 투여될 수 있다. 신경계의 발생중 및 추정하기로는 성숙된 상태에서 신경 분화를 조절하는 헤지호그 단백질의 이러한 능력은 소수성으로 변형시킨 헤지호그 단백질이 유지, 기능적 수행, 및 정상 세포의 노화; 병변 세포의 수선과 재생성 과정; 및 특정 병적 질환에서 분화의 손실의 결과인 퇴화 및 조숙 사멸과 관련하여 성숙한 뉴런을 조절할 수 있음이 합리적으로 예상된다. 이러한 견지에서, 본 소수성으로 변형시킨 헤지호그 조성물은 국소 확산으로 치료함에 의해 하기로부터 유도되는 신경 질환의 심각성을 방지 및/또는 감소시킬 수 있다: (ⅰ) 외상, 화학적 상처, 혈관 상처, 및 결손(예를 들어, 발작에 의한 국소 빈혈); 및 감염성 상처 및 종양 유도된 상처를 포함하는 신경계에 대한 급성의, 아급성의, 또는 만성의 질환; (ⅱ) 알츠하이머 질환을 포함하는 신경계의 노화; (ⅲ) 파킨슨씨 질환을 포함하는 신경계의 만성 신경 퇴화 질환; 및 (ⅳ) 다수 경화를 포함하는 신경계의 만성 면역 질환. 상기 소수성으로 변형된 단백질은 예를 들어, 뇌 세포의 손상을 다루기 위해 뇌척수 액으로 주입되거나, 다른 조직 또는 기관계 특이적 질환을 표적화시킬 필요에 따라 림프계 또는 혈액계로 주입될 수 있다.
본원의 헤지호그 조성물은 예를 들어, 뉴런의 병변 유도된 사멸로부터 다양한 뉴런을 구제하는 것은 물론, 이러한 손상 후에 이들 뉴런의 재생을 유도하는데 사용될 수 있다. 이러한 손상은 CNS 충격 경색, 감염, 대사 질환, 영양 결핍, 및 독성제(예컨데, 시스플라틴 처리)를 포함하는 질환에 관여하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 헤지호그 단백질이 네오플라스틱 또는 하이퍼 플라스틱 변형 세포를 후-유사분열이거나 아포프토틱하게 되도록 한다. 이와 같이, 이러한 조성물은 예를 들어, 악성신경 교종, 메듈로블라스토마스 및 뉴로엑토더멀 종양에 사용될 수 있다.
상기 단백질은 또한 예를 들어, 형광적으로 또는 방사선적으로 둔감한 물질과 같은 탐지할 수 있는 마커와 결합될 수 있으며, 헤지호그 수용체를 발현하는 조직의 영상화를 허용하는 대상으로 투여된다. 상기 단백질은 또한 양고추냉이 과산화효소와 같은 물질과 결합될 수 있으며, 이는 면역세포화학적 염색으로서 조직학적 단편상의 헤지호그 리간드 양성 세포의 부위의 영상화에 사용될 수 있다. 본 발명의 소수성으로 변형된 단백질은 단독이거나 다가의 단백질 착체이며, 단백질에 대한 수용체를 발현하는 암 또는 종양에 대한 의료적 치료를 특이적으로 표적화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 물질은 이들을 항종양성 약제, 독소, 및 예컨데 이트륨 90과 같은 세포 사멸 방사성 핵종에 대한 운반 담체로서 사용함에 의해 암의 치료제로서 보다 더 효과적으로 제조될 수 있다.
독소는 선택적으로 표적화하고 예를 들어, 종양 발현 헤지호그 수용체와 같은 헤지호그 반응성 세포를 소수성으로 변형된 헤지호그(또는 이들의 다가 착체를 함유하는 소포)와 컨쥬게이션될 수 있다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 다른 독소가 동등하게 유용하다. 이러한 독소는 슈도모나스(Psudomonas) 외독소, 디프테리아(Dipnteria) 독소, 및 사포린을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 접근은, 헤지호그 수용체가 매우 제한된 수의 조직에서 발현되기 때문에 성공적임을 입증할 것이다. 이러한 의료 치료에 대한 다른 접근은 방사성 동위원소 표지된, 소수성으로 변형된 단백질 (또는 이들의 다가 착체)을 사용하는 것이다. 이러한 방사성 표지된 화합물은 바람직하게는, 정상적인 조직은 그대로 두고, 방사활성을 단백질 수용체를 발현하는 세포의 부위에 표적화시킨다. 사용된 방사성 동위원소에 따라서는, 종양세포와 결합된 방사성 표지된 단백질로부터 방출된 방사선이 다백질 수용체를 발현하지 않는 주변의 악성 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 다양한 방사성 핵종이 사용될 수 있다. 방사-요오드(예를 들어,131I)는 B세포 림포마스에 존재하는 CD20에 대한 모노클로날 항체와 함께 사용되는 경우에 성공적이었다.
치료에 사용된 상기 단백질 조성물은 제형화된다. 용량은 치료될 질환, 개개 환자의 상태, 단리된 폴리펩티드의 운반 부위, 투여 방법, 및 실무자에게 알려진 다른 요소를 고려하는 우수한 의료 실험과 일치하도록 확립된다. 상기 치료제는 단백질, 단백질 함유 소포, 또는 유도된 착체를 생리적으로 수용가능한 담체(즉, 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 담체)와 함께 원하는 순도로 혼합시킴에 의해 제조될 수 있다.
부위로의 국소적 전달이 본 발명의 치료적 투여의 주요 경로일 것이라고 예상된다. 정맥내 전달, 또는 카테테르 또는 다른 외과적 관을 통한 전달이 또한 예상될 수 있다. 다른 경로는 정제 등, 시판 중인 액상 제형용 네뷸라이저, 및 동결되거나 에어로졸화된 제형의 흡입을 포함한다. 액상 제형은 분말제형으로부터 재구성된 후에 사용될 수 있다.
상기 투여 용량은 사용된 소포 및 단백질의 특성에 의존한다. 즉, 내과의사에 잘 알려진 바와 같이, 그의 결합 활성 및 생체내 플라즈마 반감기, 제형중의 소포 및 단백질의 농도, 투여 경로, 부위 및 용량율, 관련된 환자의 임상적 내성. 환자를 괴롭히는 독성학적 상태 등에 의존한다. 일반적으로, 환자당 약 5×10-7내지 5×10-9몰의 단백질 용량이 바람직하나, 상기 용량은 단백질의 특성에 의존한다. 일련의 연속적인 투여중에 다른 용량이 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 약제학적으로 수용가능한 담체와 조합된 본 발명에 따라 변형된 고습도치 단백질을 포함하는 약제학적 제형에 관한 것이다. 한 구체예에서, 상기 제형이 또한 소포를 포함한다.
소수성으로 변형된 본 발명의 단백질은 또한 유전자 치료 방법에 유용하다.
신경 퇴화성 질환에서, 어떤 임상적인 예측값은 가지는 것으로 믿어지는 수개의 동물 모델이 유용하다. 파킨슨씨 병에 있어서, 모델은 6-히드록시도파민[6-OHDA], 두개의 택일적인 도파민 작용성 독소의 국소(두개골내) 투여 또는 MPTP의 전신 투여에 의해 니그랄-스트리아탈 도파민 작용성 경로가 손상된 투여설치류 또는 영장류에서의 보호, 또는 회복을 포함한다. 구체적인 모델은 하기와 같다: MPTP-처리된 마우스 모델(64); MPTP-처리된 영장류(명주 원숭이 또는 리수스 원숭이) 모델(65), 및 일측성 6-OHDA 병변 쥐 모델(66). ALS에 대해, (아미오트로픽 측면 경화증) 모델은 Wobbler(67) 및 pmn(68) 마우스를 포함하는 자발적인 구동 뉴런 퇴화를 보여주는 수개의 마우스 종의 치료, 및 가족성의 ALS(69)와 결합된 사람의 변형된 수퍼옥시다제 디스뮤타아제(hSOD) 유전자를 발현하는 유전자 변이 마우스의 치료를 포함한다. 척수 상해에 대해, 가장 일반적인 모델은 계측된 추의 투하 및 유체 (유체 동력학) 상해(70)를 통한 쥐에 대한 타박상을 포함한다. 헌팅턴씨 질환에 대해, 모델은 쥐의 스트리아툼에 대한 세포외 독소(NMDA, 퀴놀린산, 카이닉산, 3-니트로-프로피온산, APMA) 병변으로부터의 보호를 포함한다(71,72). 최근에, 헌팅ㅌ틴 유전자중에 사람의 트리누클레오티드 확장된 반복부를 과발현하는 유전자 전이 마우스 모델이 또한 기술되었다(73). 다중 경색의 경우, 마우스 및 쥐중에 EAE가 MBP(마이엘린 기재 단백질)를 사용한 면역화에 의해 도입되거나, MBP와 함께 활성화된 T-세포의 수동적인 전달에 의해 유도된다. 알츠하이머의 경우에, 과련된 쥐 모델은 사람의 베타-아밀로이드 유전자를 과발현하는 유전자 전이 마우스의 용도는 물론, 쥐의 핌브리아-포르닉스의 병변(격막 병변), 히포캠퍼스의 콜린성 신경 감응을 제공하는 주요 신경 다발의 병번(75)에 대한 보호의 결정이다. 말초신경 장애의 경우, 관련 모델은 마우스 및 쥐에서 택솔, 빈크리스틴, 및 시스플라틴과 같은 화학 치료제에 의해 야기된 말초 신경 컨덕턴스의 손실에 대한 보호이다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 참조하여 보다 더 상세히 기술된다.
실시예 1: 사람 소닉 헤지호그는 곤충세포중 과발현시에 지질-변형된다.
A. 사람 소닉 헤지호그의 발현
완전한 길이의 사람 소닉 헤지호그(Shh)에 대한 cDNA를 pBluescript SK+(20)으로 서브클로닝시킨 1.6kb의 EcorI 단편으로서 제공했다(Ontogeny, Inc., Cambridge MA의 David Bumcrot가 제공함). Shh의 오픈 리딩 프레임을 즉시 플랭킹하는 5' 및 3' NotI 부위를 특정 부위 제거 변이제를 제조자의 지침에 따르는 Pharmacia 키트를 사용함에 의해 부가시켰다. 다음, 완전한 길이의 Shh cDNA를 운반하는 1.4kb NotI 단편을 곤충 발현 벡터로 서브클로닝시켰다(Life Techonologies, Inc). 재조합 바쿨로바이러스를 Life Techonologies, Inc에 의해 제공된 방법을 사용하여 생성시켰다. 그 결과인 바이러스를 보다 더 높은 역가의 바이러스 스톡을 생성시키는데 사용했다. Shh늬 제조 및 정제에 사용한 방법을 하기에 기술했다. 막 결합 Shh의 존재를 FACS 및 위스턴 블롯 분석으로 조사했다. 피크 발현은 감염 후 48 시간 후에 있었다. 웨스턴 블롯 분석의 경우, Shh 감염시킨 또는 감염시키지 않은 세포로부터의 상등액 및 세포 분해물을, 니트로셀룰로스로 전기영동으로 전달되는, 10 내지 20%의 감소 조건하의 농도 구배 겔상의 SDS-PAGE에 적용시켰으며, Shh를 N-말단 Shh 15-mer 펩티드-키홀 림핏 헤모시아닌 컨주게이트에 대해 배양시킨 토끼 폴리클로날 항혈청으로 검출했다. 세포 분해물은 세포를 20mM Na2HPO4pH6.5, 1% 논이데트 P-40 및 150mM NaCl 또는 20mM 트리스-HCl pH8.0, 50mM NaCl, 0.5% 논이데트 P-40 및 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트중 25℃에서 5분 동안 반응시키고, 미입자를 4℃에서 13,000rpm으로 10분간 에펜도르프 원심분리기에서 펠릿화시켰다.
B. 막-결합 사람 소닉 헤지호그의 정제
막 결합된 형태의 Shh를 상기한 완전한 길이의 Shh를 엔코딩하는 재조합된 바쿨로바이러스를 사용하는 High Five™ 곤충세포(인비트로젠)중에서 생성시켰다. High Five™ 세포를 산소가 조절되는 10L 생물반응기에서 sf900 Ⅱ 혈청 부재 배지(Life Techonologies, Inc.)중에 28℃에서 배양시켰다. 상기 세포를 MOI가 3인 바이러스로 2×106세포/mL에서 후기 로그성장 단계에서 감염시키고, 감염 후 48시간후에 채집했다(채집시에 세포의 생존력은 505 초과 였다). 상기 세포를 원심분리시켜 수집하고, 10mM Na2HPO4pH6.5, 150mM pH 추가 0.5mM PMSF에서 세척했다. 그 결과인 세포 펠릿(150g wet 중량)을 10mM Na2HPO4pH6.5, 150mM NaCl, 0.5mM PMSF, 5μM 펩스타틴 A 1.2L, 류펩틴 10㎍/mL, 및 E64㎍/mL중에 부유시킨 다음, 트리톤 X-100의 10% 용액 120m을 첨가했다.
얼음에서 30분 동안의 인큐베이션 후에, 미립자를 원심분리하여 제거했다 (1500×g, 10분). 후속하는 모든 단계를 4 내지 6℃에서 수행했다. 상등액의 pH를 0.5M MES pH 5.0(50mM 최종)의 스톡 용액으로 5.0으로 조절했으며, 150ml SP-세파로오스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow) 컬럼(Pharmacia)에 로딩시켰다. 칼럼을 300mL의 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM의 NaCl, 0.5mM의 PMSF, 0.1%의 노니데트 P-40으로 세척하고, 200ml의 5mM Na2HPO4(pH5.5), 300mM의 NaCl, 0.1%의 노니데트 P-40으로 세척하고, 5mM의 Na2HPO4(pH 5.5), 800mM의 NaCl, 0.1%의 노니데트 P-40으로 희석된 헤지호그(hedghog)를 결합시켰다.
그 후, Shh를, CNBr 활성화된 세파로오스 4B 수지의 ml당 4mg의 항체를 콘쥬게이팅함으로써 제조된 5E1-세파로오스 수지상에서 면역친화도 크로마토그래피 처리하였다. SP-세파로오스 용리 풀을 두배 용량의 50mM HEPES(pH 7.5)로 희석하고, 240-340nm에서의 흡광도 측정으로부터 총 단백질 함량을 분석하고, SDS-PAGE에 의해 순도를 분석하였다. 분획물을 -70℃에서 저장하였다.
세가지 친화도 단계로부터의 피크 분획을 풀링하고, 1.3배 부피의 50mM HEPES(pH7.5), 0.2%의 수소화된 트리톤 X-100으로 희석하고, 5E1 수지상으로 다시 배치식 로딩시켰다. 수지를 칼럼에 모으고, 세 칼럼 부피의 PBS(pH7.2), 1% 옥틸글루코시드(US Biochemical Corp.)로 세척하고, 25mM NaH2PO4(pH3.0), 200mM NaCl, 1% 옥틸글루코시드로 희석하였다. 희석 분획을 중화시키고, 상기 설명된 바와 같이 분석하고, 풀링시키고, 0.2마이크론 필터로 여과시키고, 분취하고, -70℃에서 저장하였다.
완전한 길이의 사람 소닉 헤지호그(Shh)를 하이 파이브(등록상표명: Hight Five) 곤충 세포에 발현시킬 경우, 95%가 넘는 N-말단 단편이 세포 결합된 형태로 웨스턴 브롯에 의해 검출되었다. SDS-PAGE에 의해, 정제된 단백질을 분명한 20kDa(도1, 레인 c) 질량을 갖는 단일형 밴드로서 이동하였다. 상기 단백질은 이전에 공개된 데이타(19)와 일치하는, 대장균중에서 생성된 단백질(도 1, 레인 b-d)의 가용성 변형체보다 약 0.5kDa에 의해 더욱 빠르게 이동하였다. 설명된 바와 유사하게(19), 가용성 및 막결합된 Shh 단백질은 또한, 테터링된 형태가 후에 아세토니트릴 구배에 의해 희석되는 가역상 HPLC에 의해 용이하게 구별되었다. 막결합된 형태의 희석에 요구되는 아세토니트릴의 농도는 60% 대 약 45%의 가용성 형태이며, 이는 단백질의 소수성의 현저한 증가를 나타낸다.
C. 막 테터링된 사람 소닉 헤지호그의 질량 스펙트럼 분석
Shh의 분취량을 주위 온도에서 C4칼럼(Vydac, Cat. No. 214TP104, 칼럼 치수 4.6mm 내부 직경 x 250mm)상에서 가역상 HPLC로 처리하였다. 결합된 성분을 1.4mL/분의 유속으로 0.1% 트리플루오로아세트산중의 0-80%의 구배 아세토니트릴로 30분 동안 용리시켰다. 칼럼 유출물을 280nm에서 0.5분 동안 모니터링하고, 분획을 모았다. 단백질을 함유하는 분획의 25μL의 분취량을 스피드 Vac 농축기에서 건조시키고, 담백질 함량을 Shh의 1mg/mL 용액에 대해 1.33의 흡광 계수를 이용하여 280nm에서 흡광에 의해 분석하였다. 샘플을 일렉트로스프레이 이온 공급원이 구비된 마이크로매스 쿼트로 Ⅱ 트리플 사중극 질량 스펙트로미터(Micromass Quattro Ⅱ triple quadrupole mass spectrometer)상에서 ESI-MS로 처리하였다. 6μL의 HPLC-정제된 헤지호그를 시링 펌프중에 용매로서 50% 물, 50% 아세토니트릴, 0.1% 포름산을 사용하여 10μL/분으로 이온 공급원으로 직접 부었다. 샘플 주입물을 통해 스캔을 수득하였다. 모든 일렉트로스프레이 질랭 스펙트럼 데이타를 수득하고, 프로파일 모드에 저장하고, 마이크로매스 매스링스 데이타 시스템(Micromass MassLynx date system)을 사용하여 진행하였다.
피리디닐에틸화된 Shh의 엔도프로테이나아제 Lys-C 분해물로부터의 펩티드를 마이크로매스 쿼트로 Ⅱ 트리플 사중극 질량 스펙트로미터로 라인에서 가역상 HPLC에 의해 분석하였다. 분해물을 0.05% 트리플루오로아세트산중의 5-85% 아세토니트릴 구배로 50μL/분의 유속으로 마이크롬(등록상표명: Michrom) 울트라패스트 마이크로프로테인 아날라이저 시스템(Michrom ultrafast Microportein Analyzer system)을 사용하여 렐리아실(Reliasil) C18칼럼상에서 분리하였다. 상기 설명된 바와 같은 수행 및 처리를 통해 스캔을 m/z 400-2000으로부터 수득하였다.
테터링된 Shh로부터의 N-말단 펩티드의 시퀀싱을, 매트릭스(22,23)으로서 α-시아노-4-히드록시신나믹산을 사용하여 보이져-DE(등록상표명: Voyager-DE) STR(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)상에서 포스트 소스 데케이(PSD)-측정에 의해 수행하였다. 정확히 0.5μL의 HPLC 정제된 엔도프로테이나아제 Lys-C 펩티드를 표적 플레이트상에서 0.5μL의 매트릭스와 혼합하였다. 단편 이온의 전체 스펙트럼을 커버하기 위해, 미러 볼트를 11 단계로 20에서 1.2kv로 감소시켰다.
가용성 및 막결합된 형태의 Shh에 대한 일렉트로스프레이 이온화 스펙트로머트리는 각각 19560 및 20167Da의 질량을 갖는 일차 부류를 나타내었다(도 2). 측정된 19560 Da의 질량은 Cys-1로 개시되고, Gly-174로 종료되는 소정의 질량과 매칭된다(이론상 질량은 19560.02Da). 이와 반대로, 20167Da 질량은 임의의 이용가능한 소정값과 일치하지 않으며, 임의의 공지된 변형 또는 이상 가수분해 공정에 의해 설명되는 테터링된 및 가용성 형태의 상이한 질량, 즉 607Da일 수 없다. 이전에는, 포터(Porter) 등은(18)은 드로소필라 헤지호그가 콜레스테롤 부분을 함유하며, 따라서, 사람 시스템에서의 상이한 질량이 적어도 부분적으로 콜레스테롤(에스테르화된 콜레스테롤의 이론상 질량은 368.65Da임)로 인한 것이라 것이 가능할 수 있다는 것을 입증하였다. 371Da에 의한 일차 피크와 상이한 19796Da에서의 테터링된 Shh의 질량 스펙트럼에서의 소량 성분의 존재는 이러한 설을 입증하였다.
콜레스테롤에 대한 추기의 증거는 펩티드 결합(18)을 절단시키지 않으면서 콜레스테롤 결합을 절단시키는 조건하에 테터링된 Shh를 온화한 알칼리로 처리하고, 질량 스펙트로미터리(MS)에 의해 반응 생성물을 재어닐링하므로써 수득되었다. 간단하게는, 곤충 세포 유도된 Shh를 50mM KOH, 95% 메탄올로 1시간 동안 주위 온도로 처리하고, 마이크로매스 쿼트로 Ⅱ 트리플 사중극 질량 스펙트로미터상에 LC(액체 크로마토그래피)-MS로 처리하였다. LC-MS로 처리된 샘플에 있어서, 단백질을 4-비닐피리딘으로 우선 처리하였다. 염기성 처리는 콜레스테롤과 물의 손실과 일치하는 387Da에 의한 질량을 이동시켰다(표 3 참조). 가용성 Shh의 질량은 염기성 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 동시에, 이러한 고나찰은, 막 테터링된 사람 Shh가 두개의 변형물, 즉 236Da의 질량을 갖는 이차 부분과 콜레스테롤을 함유한다는것을 암시하였다. 이러한 값 사이에서의 질량과 첨가된 팔미토일기(238Da)의 질량에서의 유사성은, 단백질이 팔미토일화될 수 있다는 것을 암시한다. 하기에 설명될 더욱 정확한 질량 평가는, 팔미토일 부분의 0.1Da의 소정의 질량내에 상호관계를 나타내었다.
MS에 의한 테터링된 Shh의 특성결정화. 이론 질량 값을, a 부분에서의 평균 잔여 질량 및 b 부분에서의 모노이소토픽 양자화된 질량을 이용하여 측정하였다.
단백질 질량(Da)
a. KOH-처리된 Shh 이론값 측정값
비테터링된 (-처리) 19560.02 19560
비테터링된 (+처리) 19560.02 19561
테터링된 (-처리) 20167.14 20167
테터링된 (+처리) 19798.49 19780
b. N-말단 엔도프로테이나아제 Lys-C 펩티드(MH+)*
비테터링된 983.49 983.50
테터링된 1221.72 1221.79
* 본원에 설명된 펩티드에 대한 모든 질량 값은 양자화된 질량값이다.
그 후, 본 발명자는 테터링된 Shh가 변형된 용리 구배로 HPLC에 의해 하위부류(subspecies)로 분획화될 수 있다는 것을 측정하였으며, 본 발명자는 다양한 형태를 정량분석하기 위한 단순한 HPLC 분석을 전개하였다. 이러한 분석으로부터의 결과는 도 3에 도시되어 있다. 이러한 분석에서, 비변형된 Shh는 처음(피크 1)으로 용리되고, 콜레스테롤 변형된 Shh는 (피크 2)로 용리되며, 최종적으로, 콜레스테롤 및 팔미트산 변형된 Shh 용리제(피크 3)를 함유하는 생성물을 생성시켰다. 피크 3의 복합형은 MALDI PSD 측정에 의해 시퀀싱을 통해 확인된 팔미토일기의 변형된 형태가 존재한다는것을 반영한다. 변형물은 소정의 값보다 2Da 작았으며, 따라서, 비포화된 결합을 함유할 수 있다(데이타는 미도시함).
D. 사람 소닉 헤지호그 서열내의 팔미트산 변형물의 국소화
사람 서열내의 팔미토일화 부위를 펩티드 맵핑과 서열 분석을 조합하여 확인하였다. 도 4B는 LC-MS 해독으로 가용성 단백질의 펩티드 맵핑 분석으로부터의 결과를 도시한 것이다. 98%가 넘는 가용성 Shh 서열을 설명하는 질량 데이타는 분석으로부터 설명될 수 있다. 별표 표시된 피크는 N-말단 펩티드에 상응한다(잔기 1-9 플러스 4-비닐피리딘, 측정된 질량 983.50Da, 이론상 질량 983.49Da; 표 3). 테터링된 단백질의 상응하는 분석에서(도 4A), 이러한 펩티드는 관찰되지 않았으며, 대신 1221.79Da의 질량을 갖는 더욱 소수성을 띠는 펩티드가 관찰되었다(별표 표시함).
1221.79Da 부분은 N-말단 펩티드의 변형된 형태, 즉 펩티드 성분에 대한 983.49Da 플러스 238.23Da로 구성되어 있다. 1221.79Da 펩티드를 그 후, MALDI PSD 측정에 의해 서열 분석 처리하였다. 생성된 PSD 스펙트럼은 도 5에 도시되어 있다. 서열을 확인하는 b1, b2, b4, b5, b8 + H2O, y8, y7, y5, y4, y3, y2 단편에 상응하는 이온을 검출하였다. 또한, b1 및 b2 이온은, 피리디에틸화된 Cys-1 부가생성물이 팔미토이로하됨을 확인시켜주었다. 단지 Cys-1를 함유하는 이온이 첨가된 238.23Da 질량을 함유하였다.
시스테인이 생체내에서 단백질에 대한 팔미토일화의 일반적인 부위이기 때문에, N-말단 시스테인에 부착된 신규한 부가생성물을 발견하는 것은 놀랍지 않았다. 그러나, 두 종류의 증거는, 리피드가 티올이 아닌, 시스테인상의 아미노기에 부착되어 있음을 암시한다. 첫 째로, 펩티드 맵핑 연구에서, 본 발명자는 자유 티올기(27)를 모니터링하기 위해 스텍트로스코프 tag로서 4-비닐피리딘을 사용하였다. 피리딜에틸화는 시스테인 티올에 대해 매우 특이적이며, MS에 의해 검출될 수있는 105Da 부가생성물을 첨가하였다. PSD 스펙트럼에서 관찰된 Cys-1 함유 단편은 팔미티올 및 피리딜에틸 변형물 둘 모두를 함유하며, 이는 자유 티올기가 존재한다는 것을 의미한다. 두 번째로, 테터링된 Shh를 자동화된 N-말단 에드만 시퀀싱으로 처리하였고, 서열은 수득되지 않았으며, 이는 N-말단 α아민에서 방해물이 있음을 암시한다. 반대로, Shh의 상응하는 가용성 생성물은 용이하게 시퀀싱될 수 있다.
실시예 2: 세포 유리 시스템에서 사람 소닉 헤지호그는 팔미트산으로 변형될 수 있다.
가용성 Shh를 공개된 공정의 변형된 변형체(24)를 사용하여 세포 유리 시스템에서3H-팔미트산으로 라벨링시켰다. 쥐 간으로부터의 미정제 마이크로좀 분획을, 간 동종물을 3000xg에서 10분, 9000xg에서 20분, 및 100,000xg에서 30분 동안 연속 원심분리하므로써 제조하였다. 100,000xg 펠렛을 10mM HEPES(pH7.4), 10% 스쿠로오스에서 현탁시키고, 100,000xg에서 20분 동안 다시 원심분리시켰다. 최종 펠렛(10g의 간으로부터 유도됨)을 3mL의 20mM 트리스-HCl(pH7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 10㎍/mL 루페프틴(leupeptin), 0.15% 트리톤 X-100에 현탁시키고, 분취하고, -70℃에서 저장하였다. 3㎍의 Shh, 1μL의 쥐 마이크로좀, 50ng/mL의 조효소 A(시그마), 0.3mM의 ATP, 20mM의 트리스-HCl(pH7.4), 150mM의 NaCl, 1mM의 EDTA, 10㎍/mL의 루페프틴 및 0.5μCi-[9.10-3H]-팔미트산(50Ci/mmol; New England Nuclear)을 함유하는 반응을 실온에서 1시간 동안 수행하였다. 전기 영동 샘플 완충액을 감소시키면서 반응을 중단시키고, 10-20% 구배 겔상에서 SDS-PAGE로 처리하고, 플루오로그라피에 의해 시각화하였다.
도 1(레인 e)에 도시된 바와 같이, Shh는 방사선 트레이서로 용이하게 라벨링된다. 반응 혼합물중의 약 100개의 다른 단백질은 어느 것도 라벨링되지 않았으며(레인 j에서 상응하는 코마시에 블루 염색된 겔 프로파일 참조), 이는 팔미토일화 반응의 고도의 선택성을 나타낸다. 팔미토일화 반응의 특이성에 대한 추가의 증거로서, 본 발명자는 팔미토일화 부위를 결실시킨 두가지 Shh 변형물을 시험하였다. 도 1(레인 f)은, 성숙한 서열의 처음 10개 아미노산 잔기가 결핍된 가용성 Shh의 절단된 형태의 분석으로부터 유도되며, Shh의 변이 형태의 레인 g는 N-말단에서 단일 Cys-1에서 Ser로의 점변이를 함유한다. 변형물 둘 모두는 라벨링되지 않았다.
리피드 유도 부위로서 중요한 N-말단 시스테인은, 가용성 Shh 와일드형이 용이하게 라벨링되는 반면, N-말단 시스테인에서 세린으로의 변이가 발생하지 않는다는 사실에 의해 흥미가 집중되었다. N-말단 세린 변이를 라벨링할 수 없는 능력은 시스테인이 세린으로 치환되어야 하는 시험 조건하에 팔미토 부분이 N-말단 α-아민으로 직접적으로 부착되는 간단한 반응 메카니즘에 반한다.
본 발명자는 또한, N-말단 히스티딘(His)-tag 신장성을 갖는 가용성 Shh 형태를 이용한 자유 N-말단의 역할을 시험하였다. 본 연구에 사용된 가용성 사람 Shh는 성숙한 서열의 접합에서 엔터키나아제 절단부위를 갖는 His-tag된 융합 단백질로서 초기에는 생성되었으며, 그 후, 엔터키나아제로 처리되어 His tag를 제거하였다. His-tag된 Shh는 시스테인의 자유 티올기의 존재에도 불구하고 팔미토화되지 않았다(도 1참조, 레인 i). 본 발명자는, N-말단 신장성이 원자 입체적으로 팔밀토일화를 억제한다는 가능성을 배제할 수 없는 반면, Cys-1은 엔테로키나아제 절단 부위의 P1' 위치에 위치하며, 효소 처리에 용이하게 접근가능하다. 따라서, Cys-1의 α-아민 및 티올 둘 모두는 팔미토일화 반응에 기여하는 것으로 여겨진다. 모든 공지된 팔미토화 반응이 Cys, Ser 또는 Thr 잔기의 측쇄를 타겟으로 하기 때문에, 본 발명자는 헤지호그상의 변형이 티오에스테르 매개체의 형성으로 시작되며, 그 후, 팔리토일 부분은 환형 매개체의 형성을 통해 N-말단으로 이동된다고 추축하였다. 이러한 가설은, 팔미토일 조효소 A를 사용하여 사람 소닉 헤지호그의 변형을 연구하는 동안 확인하였다(실시예 8 참조).
실시예 3: 세포 기재(C3H10T1/2) 분석에서 자연적으로 발생하는 지방-아실화된 사람 소닉 헤지호그의 증가된 잠재력의 증명
5일 해독으로 C3H10T1/2 세포(25)에서 알칼린 포스파타아제 유도를 측정하므로써 세포 기재 분석으로 Shh에 대한 작용을 시험하였다. 상기 분석을 96 웰 포맷에서 수행하였다. 샘플을 이중으로 수행하였다. 테터링된 Shh(100㎍/mL)에 있어서, 샘플을 정상적인 성장 배지에서 200배 희석시킨 후, 연속적으로 플레이트로 2배 희석 처리하였다. 배양 배지중에 0.005% 옥틸글루코시드를 포함하므로써 첨가된 옥틸글루코시드의 잠재적인 영향으로 웰을 중화시켰다. 중화 쥐과 mAb 5E1(26)를 사용한 블로킹 연구를 시험 샘플을 플레이트에 첨가하기 전에, 배양 배지에 실온에서 30분 동안 항체를 연속 희석물과 Shh를 혼합하므로써 수행하였다.
이러한 분석에서, 가용성 사람 Shh는 1㎍/mL의 IC50및 3㎍/mL의 최대 시그널을 갖는 용량 의존적 반응을 나타내었다(도 6A). C-말단에 부착된 콜레스테롤 및 N-말단에는 팔미토일기를 갖는 테터링된 사람 Shh는 0.03㎍/mL의 IC50및 0.1㎍/mL의 최대 시그널을 갖는 용량 의존적 반응을 나타내었으며, 이는 가용성 Shh로서 약 30배 효과있는 것임을 의미한다. 관찰된 활성이 헤지호그 특이적이라는 것을 증명하기 위해, 본 발명자는 활성이 항-헤지호그 중화 mAb 5E1으로 억제될 수 있는지의 여부를 시험하였다. 가용성 및 테터링된 Shh 둘 모두는 5E1 처리에 의해 억제되었다(도 6B). 테터링된 Shh의 억제에는, 5E1이 분석에서 증가된 활성과 일치할 만큼 많은 5E1의 10/1이 요구되었다.
최근 공개된 분석(10)의 변형된 버젼을 이용하여, 테터링된 Shh의 패치드(patched)로 결합되는 능력을 모니터링하므로써 수용체 결합 분석에 대한 테터링된 Shh를 시험하였다. 테터링된 Shh는, 약 400ng/mL의 IC50로 패치드를 발현하는 세포에 용량 의존적으로 결합한다는 것을 보여주었다(도 7). 동일한 분석에서, 가용성 Shh는 150ng/mL의 IC50로 패치드에 결합하였으며, 이는 테터링된 형성물이 이것의 수용체에 좀 덜 단단하게 결합한다는 것을 의미한다.
실시예 4: 리포좀으로의 재구성후 테터링된 사람 소닉 헤지호그의 분석
이러한 실시예는, 리피드: 단백질(w/w)비가 1:1 내지 100:1의 광번위한 범위에 걸쳐 세정 희석액에 의해 양성 및 음성적으로 대전된 리포좀으로의 재구성 실험이 C3H10T1/2 분석에서 테터링된 Shh 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
포스포리피드 함유 리포좀으로의 재구성은 리피드 함유단백질에 대한 유용한 제형을 제공하는데, 그 이유는 이는 리피드 함유 단백질이 근접한 보통의 세팅에 존재할 수 있게 하기 때문이다. 이러한 제형이 테터링된 Shh에 대해 존속가능한 것인지를 시험하기 위해, 본 발명자는 단백질을 리포좀(60)에 삽입시키는 세정제 희석 방법을 사용하였으며, 여기서 수행된 리포좀은 옥틸글루코시드 및 관심있는 단백질과 혼합된 것이며, 세정제는 이것의 임계 미셀 농도 미만으로 희석되어 재구성을 유도하였다. 임의의 대량의 순수한 또는 리피드 혼합물이 사용될 수 있지만, 본 발명자는 모델로서 두가지의 시중에서 구입가능한 혼합물을 선택하였다: 에그 L-α-포스파티딜콜린, 디세틸 포스페이트 및 콜레스테롤을 함유하는 음성적으로 대전된 리포좀 키트(Cat. No. L-4262; Sigma, St. Louis, MO), 및 에그 포스파티딜 콜린, 스테아릴아민 및 콜레스테롤로 구성된 양성적으로 대전된 리포좀 키트(Cat. No L-4137, Sigma).
간단하게는, 리피드를 피렉스 튜브(Pyrex tube)로 이동시키고, 질소 스트림하에 건조시키고, 잔류 용매를 동결건조에 의해 제거하였다. 리피드를 10mM HEPES(pH7.5), 100mM NaCl, 2.0% 옥틸글루코시드에 현탁시키고, 볼텍스시키고, 현탁액이 유백광이 나타날 때 까지 초음파 분해하였다. 그 후, 리피드를 0.2 마이크론 필터를 통해 여과시켰다. 바쿨로바이러스 감염된 하이 화이브(등록상표명: Hight Five) 곤충 세포로부터의, 옥틸글루코시드중의 테터링된 Shh의 분취량을 400-, 1000-. 5000- 및 20000-배 과량의 리피드(w/w)로 처리하고, 15분 선인큐베이션시킨 후,샘플을 희석하고, C3H10T1/2 분석에서 활성을 분석하였다.
양성 또는 음성 리포좀 처리는 헤지호그의 활성에 아무런 영향을 미치지 못했으며, 이는 리피드 담체가 존속가능한 제형이라는 것을 의미한다. 헤지호그가 실제로 재구성됐음을 증명하기 위해, 비슷한 샘플을, 테터링된 Shh가 일반적으로 펠렛이며, 리포좀은 샘플의 표면에 부류되는 조건하에 원심분리하였다. 이러한 조건하에, 테터링 hh는 표면에 부류되며, 이는 재구성이 발생했다는 것을 의미한다.
실시예 5: 포유동물 (EBNA-293) 세포로부터의 막 테터링된 사람 소닉 헤지호그의 특징화
팔미토일화가 소닉 헤지호그에 대한 일반적 변형 경로인 지의 여부 또는 이것이 곤충 세포에 대해 특이적인 지의 여부를 평가하기 위해, 단백질을 EBNA-293 세포에서 포유동물 시스템으로 또한 생성하였다. 포유동물 세포에서의 온길이 Shh의 발현을 위해, 온길이 Shh를 함유하는 1.4kb NotI 단편 (실시예 1 참조)을 벡터 CH269 pCEP4(Invitrogen, San Diego, CA (21))의 유도체내로 클로닝시켰다. 구성물을 리포펙타민(Life Technologies, Inc.)를 사용하여 EBNA-293 세포내로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션시킨지 48시간 후에 세포를 수거하였다. 표면 Shh의 발현을 FACS 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증하였다.
EBNA-293 세포로부터의 테터링된 Shh를 좁은 보어(bore) C4칼럼상에서의 역상 HPLC에 의해 분별시켰다 (도 3 참조). 피크를 ESI-MS (표 4의 부분 a 및 b)에 의해 또는 매트릭스로서의 α-시아노-4-히드록시신남산을 사용하는 피니간 레이저매트 (Finnigan LaserMat) 질량분광계상에서의 MALDI-TOF MS (표 4의 부분 c)에 의해 분석하였다. SDS PAGE에 의해, 가용성 Shh 보다 약간 빠르게 이동하는 단백질은 역상 HPLC 분석에서의 C4칼럼상에서는 지체되었고, 질량분광법에 의해, 이것은 팔미트산+콜레스트롤 변형에 상응하는 이온을 함유하였다. 그러나, 생성물의 80% 이상이 팔미트산 및 콜레스테롤 변형 둘 모두를 함유하는 곤충 세포 유도된 생성물과는 달리, HPLC 용리 프로파일 및 질량분광법으로부터의 데이터는 대부분의 포유동물 세포 유도된 단백질에 팔미토일 부분이 없음을 밝혀냈다 (참조: 표 4 및 도 3C). 즉, EBNA-293 세포로부터의 피크 2의 경우, MS 신호에 의한 클립핑된(clipped) 단백질(des-1-10) 대 온전한 단백질은 50%이었던 반면에, 피크 1의 경우 Shh의 약 10%만이 클립핑되었다. 흥미롭게도, 곤충 세포 및 포유동물 세포 유도된 생성물 둘 모두는 C3II10T1/2 검정에서 필적하는 활성을 나타냈으며, 이는 콜레스테롤 및 콜레스테롤+팔미트산 변형 둘 모두가 작용성임을 제시한다. 제 2의 지질 부착 부위가 막에 대한 단백질의 결합을 추가로 안정화시키는데 간단하게 사용되는 지의 여부 또는 이것이 보다 능동적 역할을 하고 이것의 구조 또는 단백질-단백질 접촉에 영향을 미치는 지의 여부는 결정되어야 할 문제로 남아있다.
단백질의 지방산 유도체화는 성숙 프로세스에서 후기에 일어나는 보편적인 번역후 수식이다 (28,29). 시스테인 유도체의 경우, 프로세스는 술프히드릴기에서의 변형을 첨가하고 제거하는 개별적 효소를 포함하여 동적이다. 이러한 유도체화(예를 들어, 팔미토일화)의 가장 보편적인 기능은 단백질의 물리 화학적 특성을 변화, 즉, 단백질을 이것의 기능 부위에 표적화시켜서, 단백질-단백질 상호작용을 촉진시키고, 단백질-막 상호작용을 매개하는데 있다 (30). 헤지호그의 경우, 곤충 및 포유동물 세포 유도된 제제에서의 팔미토일화의 정도의 차이(곤충 세포에서의 80% 대 포유동물 세포에서의 30%)는 의외였지만, 본 발명자들은 이것이 생물학적으로 의미있는 것인지 또는 이것이 팔미트산을 첨가하고 제거하기 위한 두 가지 시험 시스템의 세포 기작의 차이를 단순히 반영하는 것인지는 알 수 없다. 곤충 세포 및 포유동물 세포에서의 변형의 정도의 차이는 종(species) 관련된 것으로 여겨지지 않는데, 이는 곤충 세포에서 생성된 테터링된 드로소필라 헤지호그가 동일한 N-말단 서열을 가짐에도 불구하고 팔미트산이 없기 때문이다 (19).
EBNA-293-유도된 테터링된 사람 소닉 헤지호그의 질량분광 분석
단백질 질량(Da)
계산치 측정치
a. 박테리아 발현된 단백질 (테터링되지 않음) 19560.02 19560
b. 바쿨로바이러스 발현된 단백질 (테터링됨) + 팔미트산 + 팔미트산/콜레스테롤 19798.4920167.14 1979620168
c. EBNA-293 세포 발현된 단백질 (테터링됨) 피크 1 (전체 헤지호그의 9%) 테터링되지 않음 테터링되지 않음(des 1-9) 피크 2 (전체 헤지호그의 61%) +콜레스테롤 +콜레스테롤 (des 1-10) 피크 3 (전체 헤지호그의 30%) +팔미토일/콜레스테롤 19560.0218700.0219928.6718912.4820167.14 1958118712199341888920174
실시예 6: 래트 소닉 헤지호그의 지질 변형
본 실시예는 잔기 1-174를 코드화하는 래트 Shh 유전자가 하이 파이브[등록상표: High Five] 곤충 세포에서 발현되는 경우, 본질적으로 실시예 1에 기재된 온길이 사람 Shh의 경우, 다수의 지질이 래트 소닉 헤지호그의 가용성 변형체에 결합하게 됨을 예시한다. 지질 변형은 이러한 분획이 막 결합되도록 만든다. N-말단 단편(프로세싱되지 않은 래트 소닉 헤지호그의 잔기 1-174)은 사람 소닉 헤지호그의 N-말단의 아미노산 잔기와 2개의 아미노산만이 다르다. 래트 소닉 헤지호그 N-말단 단편의 경우, 트레오닌은 위치 44에서 세린을 치환하고, 아스파르트산은 위치 173에서 글리신을 치환한다. 오토프로세싱(autoprocessing) 도메인이 결핍된 래트 소닉 헤지호그가 하이-파이브 곤충 세포/바쿨로바이러스 발현 시스템에서 발현되는 경우, 대부분의 단백질이 배지내로 분비되는데, 이는 콜레스테롤 부분을 C-말단에 부착시키는 능력이 없기 때문이다. 이러한 가용성 형태는 대장균으로부터 발현되고 정제된 사람 소닉 헤지호그의 가용성 N 말단 단편의 생물학적 활성과 유사한 특정 생물학적 활성 (실시예 3의 C3H10T1/2 알칼리 포스파타아제 유도 검정에 의해 측정하여)을 갖는다.
그러나, 전체 단백질의 소분획은 곤충 세포와 결합된 채로 남아있다. 세포 결합된 래트 소닉 헤지호그 단백질을 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제한 결과, 각각 대장균 및 하이-파이브 곤충 세포로부터 정제된 사람 또는 래트 소닉 헤지호그의 가용성 N 말단 단편 보다 알칼리 포스파타아제 검정에서 보다 현저하게 활성인 것으로 밝혀졌다. HPLC 및 일렉트로스프레이(electrospray)에 의한(실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이) 래트 소닉 헤지호그 N 말단 단편의 후속 분석은 단백질이 지질 변형되어 있으며, 1종이 넘는 지질 변형이 존재하였음을 제시한다. 이를 뒷받침하는 증거로는 하기 관찰이 있다:
1. 세포 결합된 형태가, 0.1% 트리플루오로아세트산중의 선형 30분 0 내지 70% 아세토니트릴 구배로 전개된 C4역상 HPLC 칼럼 (Vydac catalog number 214TP104)으로부터 사람 및 래트 헤지호그의 가용성 N-말단 단편 보다 늦게 용리된다;
2. 세포 결합된 형태의 질량이 표 5에 도시된 지질 변형된 단백질에 대해 예상된 질량과 일치한다.
래트 소닉 헤지호그의 다양한 지질 변형된 형태의 질량.
단백질 첨가생성물 예상 질량*(MH+) 실제 질량(MH+)
비변형 없음 19,632.08 19,632
미리스토일- CH3(CH2)12CO- 19,842.50 19,841
팔미토일- CH3(CH2)14CO- 19,870.55 19,868
스테아로일- CH3(CH2)16CO- 19,898.60 19,896
아라키도일- CH3(CH2)18CO- 19,926.66 19,925
*예상 질량을 계산하는데 평균 질량이 사용되었다.
지질 부분의 위치는 서열 분석 및 펩티드 맵핑을 조합하여 결정하였다. 지질 변형된 형태의 자동화된 N 말단 에드만 시퀀싱 결과, N 말단이 블록킹된 것으로 나타났으며, 이는 지질이 N 말단 시스테인의 α-아민에 부착되어 있음을 제시한다. 4-비닐피리딘 알킬화된 지질 변형된 형태의 엔도-Lys-C 펩티드 맵핑, MALDI-TOF 질량분광 분석 및 MALDI PSD 분석(실시예 1에 기재된 바와 같이)을 사용하여 지질 변형의 위치를 확인하고, 이들의 정확한 질량을 결정하였다.
지질 변형을 함유하는 N-말단 펩티드(잔기 1-9 + N 말단 시스테인의 티올 측쇄에 부착된 4-비닐피리딘)은 표 6에 나타난 지질 변형된 펩티드에 대해 예상된 질량과 0.1 Da의 범위내에서 일치하였다.
래트 소닉 헤지호그의 다양한 지질 변형된 형태로부터 단리된 N 말단 펩티드의 질량
단백질 첨가생성물 예상 질량*(MH+) 실제 질량(MH+)
미리스토일- CH3(CH2)12CO- 1193.69 1193.76
팔미토일- CH3(CH2)14CO- 1221.72 1221.65
스테아로일- CH3(CH2)16CO- 1249.75 1249.71
*예상 질량을 계산하는데 모노이소토프 질량이 사용되었다.
표 6에 도시된 지질 변형된 펩티드 이외에, 질량이 1191.74, 1219.84 및 1247.82인 펩티드가 또한 검출되었다. 이들 질량은 각각 미리스테이트, 팔미테이트 및 스테아레이트의 불포화 형태와 일치하였지만, 알킬 사슬중의 이중 결합의 위치는 결정되지 않았다. 이들 결과는 포화 지방산 및 불포화 지방산 둘 모두가 N-마단 시스테인에 공유 결합될 수 있음을 나타낸다. 포화 및 불포화 지질 변형된 펩티드 둘 모두의 경우, 실시예 1에 기재된 MALDI PSD 분석 결과, 지질이 N-말단 시스테인 잔기에 공유결합되어 있는 것으로 확인되었다.
실시예 7: 인디안 헤지호그의 지질 변형
팔미토일화 반응이 사람 Shh에 대해 유일한 것인 지 또는 이것이 다른 헤지호그 단백질에서 발생할 수 있는 지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 사람 인디안 헤지호그(대장균에서 성숙한 서열의 개시부위에 바로 인접해 있는 엔테로키나아제 절단 부위를 갖는 His 태그된 융합 단백질로서 발현되고, 재조합 사람 소닉 헤지호그에 대해서와 같이 정제된 (실시예 9 참조))가 실시예 2에 기술된 검정을 사용하여 팔미토일화될 수 있는 지를 시험하였다. 사람 인디안 헤지호그는 변형되었고 (도 1의 레인 h 참조), 이는 팔미토일화가 헤지호그 단백질의 공통적인 특징인 것으로 여겨짐을 나타낸다. 세포 비함유 시스템에서 방사성 팔미트산으로 Shh 및 Ihh를 직접 표지시키는 능력은 변형 반응에 관여하는 아미노산에 대한 간단한 스크린을 제공하였다. 더욱이, 실시예 8에 기재된 방법에 의해 팔미토일화된 인디안 헤지호그는 비변형된 Ihh 보다 C3H10T1/2 검정에서 더욱 현저하게 유력하였다.
실시예 8: 아실-조효소(Coenyme) A를 사용한 소닉 헤지호그의 지질 변형
N-말단 시스테인을 함유하는 단백질의 시험관내 아실화는 지방산-티오에스테르 도너에 의한 2단계 화학 반응을 통해 달성될 수 있다. 제 1 단계에서, 티오에스테르 도너의 아실기는 자발적 에스테르교환 반응에 의해 단백질상의 N-말단 시스테인의 술프히드릴로 전달된다. 그 후, 아실 부분은 N-말단 시스테인의 α-아민에 대해 S 대 N 시프트를 거쳐서, 안정한 아미드 결합을 형성한다. 단백질상의 아민 작용기의 직접적 아실화는 티오에스테르와의 장기 인큐베이션시에 또한 일어날 수 있지만, 단백질상에 시스테인이 존재하면 반응을 가속시키고, 아실화 부위에 대한 조절이 가능해질 것이다. 본 실시예에 있어서, 시판되는 조효소 A 유도체(Sigma Chemical Company, St. Louis MO)가 사용되지만, 그 밖의 티오에스테르기 동일한 결과를 또한 달성시킬 것이다. 실제로, 특정한 티오에스테르 이탈기, 예를 들어 티오벤질 에스테르는 더욱 신속하게 반응할 것으로 예상될 것이다. 내부 시스테인 잔기는 인접 리신에 대한 아실화를 또한 촉진시킬 수 있고(즉, 내부 시스테인-리신 쌍에서와 같이), 이것은 합성 펩티드를 사용하여 편리하게 시험될 수 있다. 티오에스테르와의 반응 도중에 단백질상에서 발생하는 2차 아실화는, 완충액 조성 (pH)을 조절하거나, 인접 리신의 특정부 변이 유발에 의해 억제될 수 있다.
C3H10T1/2 세포에서의 알칼리 포스파타아제를 유도시키는 사람 소닉 헤지호그의 능력에 대한 아실화의 효과의 예비 분석에서, 반응 혼합물은 1㎎/mL 사람 소닉 헤지호그 (51μM), 500μM의 시판되는 특정 아실-조효소 A (시험된 화합물로는 아세틸-CoA (C2:0), 부티릴-CoA (C4:0), 헥사노일-CoA (C6:0), 옥타노일-CoA (C8:0), 데카노일-CoA (C10:0), 라우로일-CoA (C12:0), 미리스토일-CoA (C14:0), 팔미토일-CoA (C16:0), 팔미톨레오일-CoA (C16:1), 스테아로일-CoA (C18:0), 아라키도일-CoA (C20:0), 베헤노일-CoA (C22:0), 리그노세로일-CoA (C24:0), 숙시닐-CoA, 및 벤조일-CoA이 있다), 25mM DTT, 및 50mM Na2HPO4pH 7.0을 함유하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 인큐베이션시킨 후, 실시예 3에 기재된 바와 같이 C3H10T1/2 검정에서 생체활성에 대해 즉시 분석하였다 (정제 없이). 일반적으로, 역상 HPLC 및 다른 물리적 방법에 의한 분석용 샘플을 -70℃에서 저장하였다. HPLC 분석을, 1mL/분의 유량으로 수성 0.1% TFA중의 5% 내지 85% 아세토니트릴의 40분 구배를 사용하는 바이댁(Vydac) C4역상 칼럼(4.6mm 내부 직경 x 250mm, 5마이크론 입자)상에서 수행하였다. 유출액을 280nm에서 모니터하고, 분획을 몇몇 실험에서 수거하고, 쿠마시에 염색 및 웨스턴 블롯팅에 의한 검출을 사용하여 SDS-PAGE상에서 헤지호그 단백질에 대해 분석하였다.
다양한 반응 혼합물의 활성을 비교한 결과 (도 10), 탄소수 12개 내지 18개의 사슬 길이가 비변형된 단백질과 비교하여 높은 알칼리 포스파타아제 활성을 유도시키는데 최적인 것으로 나타난다. 사슬 길이를 추가로 증가시키면, 활성을 명백히 감소시켰고, 불포화 팔미토일-CoA (C16:1)중의 이중 결합의 존재는 완전 포화된 팔미토일-CoA (C16:0)과 동일한 활성을 제공하였다. 반응 혼합물의 역상 HPLC 분석 결과, 본 발명자들은 다수의 짧은 사슬 길이 아실-CoA 유도체가 헤지호그 단백질과 반응하지 않으며, 이로써, 도 10에 도시된 생물학적 활성의 의존성은 아실 사슬 길이를 실제로 반영하지 않는 것으로 인식하였다.
개질된 단백질의 실제 활성도 및 아실 사슬 길이에 대한 활성도의 의존성에 대한 데이타를 수득하기 위해서, 본 발명자들은 개개의 N-말단 아실화된 형태의 합성 및 정제 방법을 개발하였다. N-말단 시스테인의 α-아민에 부착된 단일 아실쇄를 갖는 팔미토일화, 미리스토일화, 라우로일화, 데카노리화 및 옥타노일화된 사람 소닉 헤지호그 단백질을 0.80mg/ml(41μM)의 사람 소닉 헤지호그, 410μM(10배 몰 과량)의 팔미토일-CoA, 미리스토일-CoA 또는 라우로일-CoA, 또는 4.1mM(100배 몰 과량)의 데카노일-CoA 또는 옥타노일-CoA, 25mM DTT(팔미토일-CoA, 미리스토일-CoA 또는 라우로일-CoA를 함유하는 반응 혼합물에 대한 것) 또는 0.5mM DTT(데카노일-CoA 또는 옥타노일-CoA을 함유하는 반응 혼합물에 대한 것), 및 40mM Na2HPO4(pH 7.0)를 함유하는 반응 혼합물중에서 생성하였다. 반응 혼합물을 28℃에서 24시간 동안 인큐베이트시켰다. N-말단 시스테인과 아실 티오에스테르의 반응으로 자발적인 교차 에스테르 반응에 의해 아실기가 술프히드릴로 전환된 후, α-아민에서 S에서 N으로의 이동이 수행되어 안정한 아미드 결합을 형성하였다. 그 다음, 유리 술프히드릴은 2차 교차 에스테르화 반응을 거쳐, 티오에스테르 결합을 통해 술프히드릴에 부착되는 지방산 아실기를 갖는 단백질을 수득하였다. 티오에스테르 결합된 아실기를 0.11 부피의 1M Na2HPO4(pH 9.0) 및 0.11 부피의 1M 히드록실아민(0.1M 최종 농도)를 연속 첨가함으로써 제거한 후, 28℃에서 18시간 동안 인큐베이트시켰더니, 단지 단백질(62)에 부착된 아실 아미드가 남았다. 그 다음, 0.25 부피의 5% 옥틸글루코시드를 첨가하고(1% 최종 농도), 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이트시켰다. 그 다음, 단백질을 1% 옥틸글루코시드의 존재하에 SP-세파로오스 패스트 플로우(파마시아) 및 바이오 스케일 S(바이오래드) 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 1% 옥틸글루코시드, 0.5mM DTT에 대해서 투석시키고, -70℃에서 저장하였다. 옥틸글루코시드의 존재는 완전한 용해도를 유지시키는데 요구되었으며, 희석에 의해 세정제를 제거하였으며, 투석으로 팔미토일화된 단백질, 미리스토일화된 단백질 및 라우로일화된 단백질은 각각 75%, 41% 및 15% 손실되었다. HPLC 정제된 단백질의 ESI-MS로 완전성을 확인하였다: 팔미토일화된 소닉 헤지호그, 측정된 질량=19798, 계산된 질량=19798.43; 미리스트로일화된 소닉 헤지호그, 측정된 질량=19770, 계산된 질량=19770.33; 라우로일화된 소닉 헤지호그, 측정된 질량=19742, 계산된 질량=19742.33; 데카노일화된 소닉 헤지호그, 측정된 질량=19715, 계산된 질량=19714.28; 옥타노일화된 소닉 헤지호그, 측정된 질량=19686, 계산된 질량=19686.23.
C3H10T1/2 검정에서 사람 소닉 헤지호그의 다양한 아실화된 형태의 검정(도 11)은 단백질의 활성도가 사슬 길이에 의존함을 나타냈다. 팔미토일화된 단백질, 미리스토일화된 단백질 및 라우로일화된 단백질은 5 내지 10ng/ml의 EC50값(개질되지 않은 단백질에 비해 효능에 있어서 100 내지 200배 증가)을 갖는 거의 균등한 활성도를 나타냈다. 60 내지 70ng/ml의 EC50값(개질되지 않은 단백질에 비해 효능에 있어서 15 내지 30배 증가)을 갖는 데카노일화된 사람 소닉 헤지호그는 팔미토일화된 형태, 미리스토일화된 형태 및 라우로일화된 형태 보다 덜 활성인 반면에, 옥타노일화된 형태는 100 내지 200ng/ml의 EC50값(개질되지 않은 단백질에 비해 효능에 있어서 10배 증가)을 가져 활성이 가장 적다. 아실화된 형태 모두는 1000 내지 2000ng/ml의 EC50값을 갖는 개질되지 않은 단백질 보다 효능이 높다. EC50값의 감소외에, 팔미토일화된 단백질, 미리스토일화된 단백질 및 라우로일화된 단백질은 개질되지 않은 단백질 보다 거의 2배 이상의 알칼리성 포스파타제 활성도를 유도한 반면에, 데카노일화된 단백질 및 옥타노일화된 단백질은 약 1.5배 이상의 상기 활성도를 유도하였다.
C3H10T1/2 검정에서 관찰되는 사람 소닉 헤지호그의 미리스토일화된 형태의 효능의 증가 외에도, 이 형태는 배아 단계 E11의 쥐 종뇌의 외식편에서의 유도성 전뇌 앞쪽 신경에서 개질되지 않은 단백질 보다 효능이 상당히 높다. 개질되지 않은 소닉 헤지호그 또는 미리스토일화된 소닉 헤지호그의 다양한 농도를 갖는 E11 종뇌 외식편의 인큐베이트 및 dlx와 islet-1/2 유전자(전뇌 앞쪽 신경의 마커)의 생성물에 대한 외식편의 연속 착색은 개질되지 않은 단백질에 의한 유도가 처음에 48nM에서 관찰되는 한편, 미리스토일화된 형태에 의한 유도가 처음에 3nM에서 관찰됨을 나타냈다. 또한, 개질되지 않은 단백질은 3070nM에서 제한된 발현을 유도한 한편, 미리스토일화된 단백질은 단지 48nM에서 광범위한 발현을 유도하였다. 효능에 있어서의 유사한 증가는 배아 단계 E9 추정 종뇌의 외식편이 개질되지 않은 단백질 또는 미리스토일화된 단백질로 인큐베이트된 경우에 관찰되었다. Nkx2.1 유전자(전뇌 앞쪽 신경의 초기 마커)의 생성물에 대한 외식편의 착색은 개질되지 않은 단백질이 처음에 384nM에서 Nkx2.1을 유도하는 한편, Nkx2.1의 미리스토일화된 단백질의 발현은 처음에 12nM에서 관찰됨을 나타냈다. 또한, 48nM에서 미리스토일화된 소닉 헤지호그에 있어서, Nkx2.1의 발현은 광범위한 한편, 상기 농도에서 개질되지 않은 형태를 사용한 경우에는 검출되지 않았다.
부가적으로, 미리스토일화된 사람 소닉 헤지호그는 쥐의 뇌의 선조체내로 말로네이트의 투여로부터 수득되는 병소 부피의 감소에 있어서 개질되지 않은 단백질 보다 상당히 더욱 보호되는 것으로 나타났다.
실시예 9: 사람 소닉 헤지호그의 N 말단 시스테인의 화학적 유도체
A. 일반적인 방법
단백질의 알킬화: 실온에서 2시간 동안 50㎕의 6M 구아니딘 히드로클로라이드, 50mM Na2HPO4(pH 7.4)중의 단백질 약 20㎍을 함유하는 샘플을 0.5㎕의 4-비닐피리딘으로 처리하였다. S-피리딜에틸화된 단백질을 40 부피의 냉각된 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 용액을 -20℃에서 1시간 동안 저장한 후 4℃에서 8분 동안 14,000×g으로 원심분리시켰다. 상청액을 따라내고 침전물을 냉각된 에탄올로 세척하였다. 단백질을 -20℃에서 저장하였다.
펩티드 맵핑: 알킬화된 단백질(1M 구아니딘 히드로클로라이드, 20mM Na2HPO4(pH 6.0)중의 0.4mg/ml)을, 엔도 Lys-C(와코 퓨어 케미칼 인더스트리스, 리미티드(Wako Pure Chemical Industries, Ltd))를 1:20 비로 사용하여 분해시켰다. 분해는 실온에서 30분 동안 수행하였다. 반응을 5㎕의 25% 트리플루오로아세트산을 이용한 산성화로 중단시켰다. 모델 996 포토다이오드 어레이 검출기를 이용하여 워터 2690 세퍼레이션 모듈상에서 분해물을 분석하였다. 주입 이전에, 고형 구아니딘 히드로클로라이드를 분해물에 6M의 농도까지 첨가하여 불용성 물질을 용해시켰다. 가역상 "Vydac C18"(2.1mm의 내경×250mm) 칼럼을 분리에 사용하였으며, 이때, 0.2ml/분의 유동률에서 90분 구배의 0.1% 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산/아세토니트릴을 이용하였다. 개개의 피크를 질량 분석을 위해서 수동으로 수집하였다.
질량 결정: 손상되지 않은 단백질의 분자 질량을 마이크로매스 쿼트로 II 트리플 쿼드로폴 질량 분광계상에서 전기스프레이 이온화 질량 분광학(ESI-MS)으로 결정하였다. 샘플을 온라인 "Reliasil C4"(1mm의 내경×50mm) 칼럼이 장착된 온라인 미크롬 울트라패스트 마이크로프로테인(on-line Michrom Ultrafast Microprotein) 분석기 시스템을 사용하여 탈염시켰다. 유동률은 20㎕/분이었다. 모든 전기스프레이 질량 스펙트럼 데이타를 마이크로매스 매스링스 데이타 시스템을 사용하여 처리하였다. 펩티드의 분자 질량을 "Voyager-DETMSTR"(메사츄세츠 프라밍엄에 소재하는 펄셉티브 바이오시스템스(PerSeptive Biosystems) 제품)상에서 매트릭스 관련된 레이저 탈리 이온화 타임-오브-파이트(time-of-fight) 질량 분광학(MALDI-TOF-MS)으로 결정하였다. 개질된 단백질의 서열화를 동일한 기기상에서의 포스트-소스 디케이(PSD: Post-source decay) 측정으로 수행하였다. α-시아노-4-히드록시신남산을 매트릭스로서 사용하였다.
N-말단 서열화: 단백질을 퍼킨-엘머 어플라이드 바이오시스템스 모델 477A 펄스드-리퀴드 프로테인 시퀀서(Perkin-Elmer Applied Biosystems model 477A Pulsed-Liquid Protein Sequencer)상에서 에드만 분해로 서열화시켰다. 상기 시퀀서의 샘플 로딩 카트리지내로 티아프롤린(티아졸리딘-4-카르복실산)을 직접 로딩시킴으로써 PTH-티아프롤린을 온라인상에서 제조하였다.
화학적 개질에 사용되는 와일드형의 가용성 사람 소닉 헤지호그 N-말단 단편의 박테리아성 발현 및 정제: 전체 단백질의 4 내지 5%에서의 Shh를 발현시키는 세포로부터의 박테리아성 펠릿을 녹이고, 1:4(w/v)의 비율로 세포용해 완충액(25mM Na2HPO4(pH 8), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 0.5mM DTT)중에 재현탁시키고, 12,000 p.s.i에서 가울린 프레스(mfg, 덴마크 코펜하겐에 소재하는 "APV Rannie"사 제품)를 통한 2회 통과에 의해 용해시켰다. 다르게 지시하지 않는 한, 모든 연속적인 정제 단계를 2 내지 8℃에서 수행하였다. 균등액을 19,000×g에서 60분 동안 원심분리시키고, 0.5M MES(pH 5)를 생성된 용리물에 1:10(v/v)의 비로 첨가하였다. 용리물(pH 5.5)을 25mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl과 평형을 이룬 SP 세파로오스 패스트 플로우(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 제품) 칼럼(4g, E. coli 습윤 중량/수지 ml)상에서 로딩시켰다. 칼럼을 4 칼럼 부피(CV)의 평형 완충액으로 세척한 후, 3CV의 25mM Na2HPO4(pH 5.5), 200mM NaCl, 0.5mM DTT로 세척하고, Histag-SHH를 동일한 완충액에서 800mM NaCl로 용리시켰다. 용리 분획을 280nm에서의 흡광도에 대해서 SDS-PAGE로 분석하였다. 이미다졸(pH 7에서의 1M 원액) 및 NaCl(5M 원액)을 SP 세파로오스 용리액으로부터의 분획을 함유하는 피크 Shh의 푸울에 첨가형 최종 농도가 각각 20mM 및 1M이 되게 하였고, 이 물질을 25mM Na2HPO4(pH 8), 1M NaCl, 20mM 이미다졸, 0.5mM DTT과 평형을 이룬 NTA-Ni 아가로스(캘리포니아 산타 클라라에 소재하는 퀴아겐(Qiggen)사 제품) 칼럼(20mg/수지 ml)상에 로딩시켰다. 칼럼을 5CV의 동일한 완충액으로 세척하고 Histag-SHH를 3CV의 25mM Na2HPO4(pH 8), 1M NaCl, 20mM 이미다졸, 0.5mM DTT로 용리시켰다. NTA-Ni 칼럼으로부터의 용리액 푸울중의 단백질 함량을 280nm에서의 흡광도로 결정하였다. 푸울을 실온으로 가온시키고 균등한 부피의 2.5M 황산나트륨을 첨가하였다. 페닐 세파로오스 단계를 실온에서 수행하였다. 상기 물질을 25mM Na2HPO4(pH 8), 400mM NaCl, 1.25M 황산나트륨, 0.5mM DTT와 평형을 이룬 페닐 세파로오스 패스트 플로우(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 제품) 칼럼(20mg/수지 ml)상에서 로딩시켰다. Histag-SHH를 25mM Na2HPO4(pH 5.5), 400mM NaCl, 0.5mM DTT로 용리시켰다. 보편적으로, 본 발명자들은 0.5kg의 박테리아 페이스트(습윤 중량)로부터 His 표지된 Shh를 회수하였다. 생성물을 0.2㎛의 필터를 통해 여과시키고, 분취시키고 -70℃에서, 저장하였다. His 표지된 Shh는 SDS-PAGE로 결정한 결과 약 95%의 순도를 가졌다. 정제된 생성물의 특징의 추가 검정으로서, 샘플을 전기스프레이 이온화 질량 분광학(ESI-MS)으로 평가하였다. 단백질의 약 50%가 N-말단 메티오닌을 잃었다.
헥사히스티딘 표지를 분리하기 위해서, 28℃에서 2시간 동안 엔테로키나제(캘리포니아 샌디에고에 소재하는 바이오짐(Biozyme)사 제품)를, 1:1000(w/w)의 효소:Shh로 Histag-Shh를 사용하여 인큐베이트시켰다. 분할되지 않은 Histag-Shh 및 유리 Histag를 제 2 NTA-Ni 아가로스 칼럼(Shh 20mg/수지 ml)을 통해 분해물을 통과시킴으로서 제거하였다. 로딩 이전에, 이미다졸(pH 7에서의 1M 원액) 및 NaCl(5M 원액)을 분해물에 첨가하여 최종 농도가 각각 20mM 및 600mM이 되게 하였다. 이 물질을 25mM Na2HPO4(pH 8), 600mM NaCl, 20mM 이미다졸, 0.5mM DTT와 평형을 이룬 NTA-Ni 아가로스 칼럼상에 로딩시키고, 유동 물질을 수거하였다. 칼럼을 1CV의 동일한 완충액으로 세척하고 유동 물질로 푸울링시켰다. MES(pH 5에서의 0.5M 원액)을 NTA-Ni 아가로스에 결합되지 않은 분획에 첨가하여 최종 농도가 50mM이 되게 하고, 2 부피의 물을 첨가하였다. 이 물질을 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.5mM DTT와 평형을 이룬 제 2 SP 세파로오스 패스트 플로우 칼럼(20mg/수지 ml)상에 로딩시켰다. 칼럼을 3CV의 평형 완충액 및 300mM NaCl을 함유하는 1CV의 동일한 완충액으로 세척하였다. 원자 흡수 데이타는 상기 단계에서 Shh가 0.5몰 당량의 Zn2+를 함유함을 나타내고 있다. ZnCl2의 당량 농도는 Shh 용리제에 첨가하였으며, 단백질을 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 800mM NaCl, 0.5mM DTT에 대해 투석시켰다. 생성된 Shh의 순도는 SDS-PAGE, 크기 결정 크로마토그래피(SEC) 및 ESI-MS)로 결정한 결과 98% 이상이었으며, 원자 흡광도로 검정한 결과 0.9 및 1.1 Zn2+/Shh를 함유하였다.
Histag Shh 및 histag 제거후에 생성된 생성물에 대한 ESI-MS 데이타를 하기 표 7에 요약하였다.
ESI-MS에 의한 Shh의 특징화
단백질 질량
계산치 측정치
Histag-Shh (-Met) (Intact) 21433.8221565.01 2143421565
엔테로키나제 분할된 Shh 19560.02 19560
B. 특이적인 화학적 개질
N-에틸말레이미드를 이용한 사람 소닉 헤지호그의 개질: 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.5mM DTT중의 정제된 Shh를 얼음위에서 1시간 동안 10mM N-에틸말레이미드로 처리한 후, 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl에 투석시켰다. MALDI-TOF-MS 데이타는 N-에틸말레이미드(NEM) 개질된 단백질의 질량이 126Da으로 증가함을 보여주고 있으며, 이것은 Shh중의 단지 하나의 시스테인 잔기가 반응물에 의해 개질됨을 나타내는 것이다. N-말단의 서열화 데이타는 단백질이 연속적이고, 독특한 피크, 바람직하게는 PTH-NEM-Cys 관련된 피크가 첫번째 사이클(데이타는 도시되어 있지 않다)에서 검출됨을 보여주고 있다. 변성 조건하에서 피리딜에틸화된-NEM-Shh의 질량 분광학 분석은 상기 단백질중의 단지 2개의 시스테인이 알킬화되었음을 보여주고 있으며, 이것은 N-말단 시스테인 잔기의 티올기만이 자연 조건하에서 NEM에 의해 개질됨을 확실하게 하는 것이다(표 8). 단백질의 소수성 코어중에 자명하게 포함된 다른 2개의 시스테인 잔기는 이전의 변성 없이는 개질될 수 없다.
MS에 의한 NEM 개질된 Shh의 특징화
단백질 질량(계산치) 질량(측정치)
피리딜에틸화된 NEM Shh 19895Da
2개의 유리 Cys 잔기를 함유하는 경우 19895Da
3개의 유리 Cys 잔기를 함유하는 경우 20000Da
C3H10T1/2 검정으로 시험하는 경우(실시예 3 참조), N-에틸말레이미드 개질된 헤지호그 단백질의 활성도는 개질되지 않은 단백질과 균등하였다. 이는 헤지호그의 N-말단에서 유리 술프히드릴이 활성에 요구되지 않으며, N-에틸말레이미드 부분이 Cys-1에서 His 또는 Asp로의 전환(여기에서, 활성도가 감소되었다)와 같은 다른 더 많은 소수성 개질에 비해 헤지호그상에 일부 활성도를 제공하는데 충분히 소수성임을 증명하는 것이다.
사람 소닉 헤지호그를 포름알데히드로 개질시켜 N-말단 티아프롤린을 형성하는 방법 및 아세트알데히드 및 부티르알데히드로 개질시켜 N-말단 티아프롤린 유도체을 형성하는 방법: 포름알데히드를 이용한 개질에 있어서, 실온에서 1 내지 6시간 동안 10% 메탄올을 사용하거나 사용하지 않고서, 3mg/ml으로의 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.5mM DTT중의 정제된 Shh를 0.1% 포름알데히드로 처리하였다. 단백질을 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl에 대해 투석시키거나, 하기에 기술된 바와 같이 "CM-Poros" 칼럼 (Perseptive Biosystems)상에 정제시킨 후, 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl에 대해서 투석시켰다. 아세트알데히드 또는 부티르알데히드를 이용한 개질에 있어서, 3mg/ml의 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.5mM DTT중의 정제된 Shh를 실온에서 1시간 동안 0.1% 아세트알데히드 또는 부티르알데히드로 처리한 후 단백질을 CM-Poros 칼럼상에서 정제하였다. 단백질의 포름알데히드, 아세트알데히드 및 부티르알데히드 처리된 형태에 있어서의 ESI-MA 데이타는 질량이 각각 개질되지 않은 단백질 보다 높은 13Da, 27Da 및 54Da 임을 나타내고 있다(표 9).
포름알데히드, 아세트알데히드 및 부티르알데히드로 처리된 사람 소닉 헤지호그의 예상 질량 및 측정 질량
단백질 예상 질량*(MH+) 측정 질량*(MH+)
개질되지 않은 단백질 19560.02 19560
포름알데히드로 처리된 단백질 19572.03 19573
아세트알데히드로 처리된 단백질 19586.06 19587
부티르알데히드로 처리된 단백질 19614.11 19614
* 평균 질량을 예상 질량을 계산하는데 사용하였다.
포름알데히드 처리된 단백질에 있어서, 앞서 기술된 펩티드 맵핑은 개질 부위가 첫번째 9개의 N-말단 잔기를 스패닝(spanning)하는 펩티드중에 형성되고, 정확한 질량 증가가 12Da임을 증명하고 있다. 상기 펩티드의 MALDI-PSD MS 연구의 결과는 개질이 Cys-1에서 일어나며, N-말단 α-아민 및 Cys-1의 티올 측쇄의 개질에 의해 티아플로린을 형성(도 12)함으로써 설명될 수 있음을 나타내고 있다. 티아프로린의 구조는 표준치로서 "온-라인" 제조된 PTH-티아프롤린을 사용하는 자동화된 N-말단 에드만 서열화로 확인하였다. 아세트알데히드 및 부티르알데히드 처리된 단백질에 있어서, ESI-MS 데이타는 정확한 개질 부위가 설정되지 않았을지라도, 포름알데히드와의 반응과 관련된 동일한 화학적 방법에 의해 일어나는 개질과 일치하였다. C3H10T1/2 세포계 검정에서 시험하는 경우, 포름알데히드, 아세트알데히드 및 부티르알데히드 개질된 단백질의 효능은 개질되지 않은 Shh에 비해 각각 약 8배, 2배 및 3배 높았다.
N-이소프로필요도아세트아미드를 이용한 사람 소닉 헤지호그의 개질: 이 실시예는 요도아세트아미드의 소수성 유도체를 이용한 사람 Shh의 개질이 개질되지 않은 Shh에 비해 단백질의 효능을 증가시킬 수 있음을 보여주고 있다. 4℃에서 18시간 동안 정제된 Shh (5mM Na2HPO4(pH 7.0), 150mM NaCl, 0.1mM DTT중의 1mg/ml)를 1mM N-이소프로필요도아세트아미드(NIPIA)로 인큐베이트시켰다. 그 다음, DTT를 10mM 최종 농도까지 첨가하고, 샘플을 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.5mM DTT에 대해서 광범위하게 투석시켰다. 샘플을 SP 세파로오스 패스트 플로우 수지상에서 정제시키고, 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.5mM DTT에 대해서 추가 투석시켰다. ESI-MS 데이타는 단독으로 개질된 단백질에 있어서 예상된 질량 값(19659)에 상응하는 19660의 질량을 갖는 종으로의 완전한 전환을 나타내고 있다. N-말단 시스테인의 특이적인 개질은 단백질 가수분해성 분획의 펩티드 맵핑으로 확인하였다. C3H10T1/2 세포계 검정에서 시험하는 경우, NIPIA 개질된 사람 Shh의 효능은 개질되지 않은 단백질 보다 약 2배 높았다. 단백질의 상기 개질이 단지 효능을 적당히 증가시키는 반면에, 장쇄 알킬 요도아세트아미드 유도체를 이용한 단백질의 개질은 단백질의 소수적으로 개질된 형태에서 효능을 매우 증가시킬 것으로 예상되며, 가능하게는 팔미토일화된 Shh 단백질, 미리스토일화된 Shh 단백질 및 라우로일화된 Shh 단백질에 있어서 100 내지 200배의 증가가 예상된다(실시예 8 참조).
사람 소닉 헤지호그를 1-브로모-2-부타논으로 개질시켜 N-말단에서 6원 소수성 링을 형성시키는 방법: 실온에서 60분 동안 사람 Shh-N(5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.15mM DTT중의 3mg/ml)을 11mM 1-브로모-2-부타논으로 인큐베이트시킨 후 실온에서 60분 동안 5mM NaCNBH3로 환원시킴으로써 Shh의 티오모르폴리닐-(테트라히드로티아지닐-) 유도체를 제조하였다. 반응 생성물을 하기에 기술된 바와 같이 CM-Poros 칼럼(Perseptive Biosystems)상에서 정제하고 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.5mM DTT에 대해 투석시켰다. ESI-MS 및 단백질 가수분해 펩티드 맵핑 데이타는 생성물이 예상된 티오모르폴리닐 유도체(계산된 질량=19615, 측정된 질량=19615)과 16개의 부가 질량 유닛을 갖는 단백질의 2가지 형태 모두의 ㅎ노합물임을 나타내고 있다. 이들 형태 중 한 가지는 순환되지 않은 케토-티오에테르 중간체로 추정된다. 혼합물을 C3H10T1/2 세포계 검정에서 시험하였더니, 개질되지 않은 단백질 보다 효능이 약 5배 높았다.
실시예 10: 사람 소닉 헤지호그의 유전공학적으로 처리된 변이
A. N-말단 시스테인의 유전공학적으로 처리된 변이
이 실시예에서, 본 발명자들은 단일 및 다수의 소수성 아미노산 잔기에 의한 사람 소닉 헤지호그(Cys-1)의 N-말단 시스테인의 특이적인 대체가 실시예 3에 기술된 C3H10T1/2 세포계 검정에서 와일드형 단백질에 비해 효능을 증가시킴을 제시하고 있다.
Shh Cys-1 변이의 구성: p6H SHH로부터의 His 표지된 와일드형 Shh N-말단 단편을 갖는 584bp의 NcoI-XhoI 제한 단편을 pUC 유도된 클로닝 벡터 pNN05내로 서브클로닝시켜 플라스미드 pEAG649를 구성하였다. 제조자가 추천하는 프로토콜에 따라 파마시아 키트를 사용하는 pEAG649 플라스미드 주형의 독특한 부위 제거 변이 유발에 의해 가용성 사람 Shh의 Cys-1 변이를 생성하였다. 변이유발성 프라이머의 고안에 있어서, 원하는 변이가 제한 부위 변화를 일으키지 않는 경우, 제한 부위 변화를 일으키는 휴지 변이를 이웃하고 있는 코돈내로 도입시켜 변이 유발에 따른 변이 클론의 확인을 용이하게 한다. 이상한 코돈 사용을 피하기 위해서, 치환된 코돈을 사람 Shh cDNA 서열에서 하나 이상 다른 곳에서 발견되는 것으로부터 선택하였다. 하기의 변이유발성 프라이머를 사용하였다: (1) C1F의 경우 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA TTC GGA CCG GGC AGG GGG TTC 3' (서열 번호: )을 사용하여 Apol 부위를 도입시켜 pEAG837를 생성하고; (2) C1I의 경우 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATA GGA CCG GGC AGG GGG TTC 3' (서열 번호: )를 사용하여 RsrII 부위를 손실시키고 pEAG838을 생성시키며; (3) C1M의 경우 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATG GGC CCG GGC AGG GGG TTC GGG 3' (서열 번호: )를 사용하여 RsrII 및 AvaII 부위를 모두 손실시키고 pEAG839를 생성시켰다. 플라스미드 pEAG837-839에서 변이 SHH 단백질의 N-말단을 갖는 180bp의 NcoI-BgIII 제한 단편을 통한 DNA 서열화에 의해 변이를 확인하였다. 발현 벡터를 각각의 변이 플라스미드의 180bp의 NcoI-BgIII 단편 및 pEAG649로부터의 404bp의 BgIII-XhoI 단편을 포스파타제 처리된 5.64bp의 p6H-SHH의 XhoI-NcoI pET11d 벡터 본쇄내로 서브클로닝시킴으로써 구성하였다. 유도된 제한 부위 변화를 각각의 Cys-1 변이(pEAG840중의 C1F, pEAG841중의 C1I, 및 pEAG842중의 C1M)에 대한 발현 벡터중에서 재확인하였다. 발현 벡터를 제조자가 추천한 프로토콜에 따라 성분 E.coli BL21(DE3)pLysS (Stratagene)내로 형질전환시키고, 100㎍/ml 암피실린 및 30㎍/ml 클로르암페니콜을 함유하는 LB 아가르 플레이트상에서 선택하였다. 개개의 콜로니를 선택하고 형질전환된 박테리아를 0.4-0.6의 A600에 대해 성장시키고, 3시간 동안 0.5mM IPTG를 사용하여 유도하였다. 박테리아 펠릿을 변이 단백질의 발현에 대해서 환원 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅으로 분석하였다.
다수의 N-말단 소수성 치환체(c1II)를 갖는 가용성 사람 Shh 변이를 제조자가 추천한 프로토콜에 따른 파마시아 키트를 사용하는 독특한 부위 제거 변이 유발로 생성하였다. 변이유발성 프라이머의 고안에 있어서, 원하는 변이가 제한 부위 변화를 일으키지 않는 경우, 제한 부위 변화를 일으키는 휴지 변이를 이웃하고 있는 코돈내로 도입시켜 변이 유발에 따른 변이 클론의 확인을 용이하게 한다. 이상한 코돈 사용을 피하기 위해서, 치환된 코돈을 사람 Shh cDNA 서열에서 하나 이상 다른 곳에서 발견되는 것으로부터 선택하였다. 하기의 변이 유발성 프라이머를 C1F 주형 플라스미드 pEAG837 상에서 C1IIdp 5' GCG GCG ATG ACG ATG ACA AAA TCA TCG GAC CGG GCA GGG GGT TCG GG 3' (서열 번호: )를 사용하여 AvaII 부위를 제거하여 pEAG872를 생성하였다. 변이 C1II Shh를 갖는 0.59kb의 NcoI-XhoI 제한 단편을 통한 DNA 서열화에 의해 변이를 확인하였다. 발현 벡터를 각각의 변이 플라스미드의 NcoI-XhoI 단편을 포스파타제 처리된 5.64bp의 p6H-SHH의 XhoI-NcoI pET11d 벡터 본쇄내로 서브클로닝시킴으로써 구성하였다. 유도된 제한 부위 변화를 C1II 변이 pEAG875에 대한 발현 벡터중에서 재확인하였다. 발현 벡터를 제조자가 추천한 프로토콜에 따라 성분 E.coli BL21(DE3)pLysS (Stratagene)내로 형질전환시키고, 100㎍/ml 암피실린 및 30㎍/ml 클로르암페니콜을 함유하는 LB 아가르 플레이트상에서 선택하였다. 개개의 콜로니를 선택하고 형질전환된 박테리아를 0.4-0.6의 A600에 대해 성장시키고, 3시간 동안 0.5mM IPTG를 사용하여 유도하였다. 박테리아 펠릿을 앞서 기술된 바와 같이 분석하여 변이 Shh 단백질의 발현을 확인하였다.
사람 소닉 헤지호그의 Cys-1 변이의 정제: His 표지된 변이 헤지호그 단백질을 2가지 개질은 제외하고 상기의 와일드형 단백질에 있어서 기술된 박테리아 펠릿으로부터 제조하였다. (1) 페닐 세파로오스 단계를 삭제하고 대신 엔테로키나제 분할 단계를 위한 제조시에 첫번째 NTA-Ni 아가로스 칼럼으로부터의 단백질 푸울을 25mM Na2HPO4(pH 8), 400mM NaCl, 0.5mM DTT내로 투석시켰다. (2) 최종 이온 교환 단계를 SP-세파로오스 패스트 플로상의 용리 단계에서 CM-Poros 칼럼(Perseptive Biosystems)으로부터의 구배 용리로 변화시켰다. 이것은 30 칼럼 부피에 대해 0 내지 800mM NaCl 구배를 갖는 50mM Na2HPO4(pH 6.0)중에서 수행하였다. 이 단계로부터의 푸울링된 피크 분획을 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl내로 투석시키고, -80℃에서 저장하였다. 질량 분광학으로 각각의 정제된 단백질 형태의 예상된 질량 이온을 제공하였다.
사람 소닉 헤지호그의 Cys-1 변이의 활성: 하기 표 10에 제시된 바와 같이, N-말단 시스테인의 변이은 C3H10T1/2 검정에서 생성된 헤지호그 단백질의 효능에 상당한 영향을 미쳤다. 단일 변화에 있어서, 효능은 일반적으로 치환된 아미노산의 소수성과 연관이 있으며, 페닐알라닌 및 이소루신은 가장 큰 활성을 제공하고, 메티오닌은 그 보다는 활성이 적은 반면, 히스티딘 및 아스파르트산은 와일드형 시스테인에 비해 활성을 감소시킨다. 시스테인을 2개의 이소루신으로 대체하면 단일 이소루신 치환의 경우보다 활성도를 추가로 증가시킨다. 9개의 아미노산이 시스테인 보다 소수성이 더 큰 것으로 분류되어 있는 경우[참조: Proteins: structures and molecular properties, 2nded, 1993, T. E. Creighton, W. H. Freeman Co. page 154], 상기 시험된 치환체들은 헤지호그의 더욱 활성인 형태를 형성할 수 있는 N-말단에서의 가능한 변이의 완벽한 결과는 아니다. 그러나, 그 결과들은 활성화가 단일 아미노산 구조에 제한되지 않으며, 하나 이상의 아미노산의 치환이 효능을 추가 증가시킬 수 있음을 증명하는 것이다. 그러므로, 당업자들은 와일드형 단백질 보다 더 큰 효능을 갖는 것으로 예상되는 N-말단에서의 다른 아미노산 치환체를 갖는 헤지호그의 형태를 생성할 수 있다.
C3H10T1/2 검정에서 관찰된 사람 소닉 헤지호그의 아미노산 개질된 형태의 상대적인 효능
N-말단 상대적인 효능
C (와일드형) 1배
M 2배
F 4배
I 4배
II 10배
B. 유전공학적으로 처리된 내부 잔기의 변이
C1II/A169C 변이의 구성: 가용성 사람 Shh 변이 C1II/A169C(높은 분별 용매 영향성을 갖는 것으로 예상되는 분산가능한 C-말단 잔기 A169를 치환한 시스테인이 있다)을 제조자가 추천한 프로토콜에 따라 파마시아 키트를 사용하고 앞서 기술된 변이유발성 올리고 고안 원리를 이용한 독특한 부위 제거 변이 유발로 제조하였다. 하기 변이유발성 프라이머 5' GAG TCA TCA GCC TCC CGA TTT TGC GCA CAC CGA GTT CTC TGC TTT CAC C 3'(서열 번호: )를 C1II Shh 주형 pEAG872에 사용하여 FspI 부위를 첨가하여 pSYS049를 생성하였다. C1II/A169C 변이를 0.59kb의 NcoI-XhoI 제한 단편을 통한 DNA 서열화로 확인하였다. NcoI-XhoI 단편을 포스파타제 처리된 p6H SHH의 5.64kb의 XhoI-NcoI pET11d 벡터내로 서브클로닝시킴으로써 pSYS049를 구성하였다. 도입된 제한 부위 교환을 발현 벡터내에서 재확인하였다. 발현 벡터를 성분 E.coli BL21(DE3)pLysS내로 형질전환시키고, 콜로니를 선택하고, 유도하고 앞서 기술된 바와 같이 Shh 발현에 대해서 스크리닝시켰다.
C1II/A169C 변이의 정제: C1II/A169C 변이를 개질된 단백질은 제외한 와일드형 단백질에 있어서 실시예 9에 기술된 바와 같이 정제하였다. (1) EDTA를 세포 용해 완충액으로부터 분리해내고, (2) NTA-Ni 및 SP 세파로오스 단계를 바꾸고, 페닐 세파로오스 단계를 생략하고, (3) 원심분리에 의해 용해된 박테리아를 깨끗하게 한 후, 부가 NaCl을 상청액에 300mM의 최종 농도까지 첨가하고, (4) 25mM Na2HPO4(pH 8.0), 200mM 이미다졸, 400mM NaCl을 함유하는 NTA-Ni 칼럼으로부터 완충액을 용리시키고, (5) SP 세파로오스 칼럼상에 로딩시키기 전에 NTA-Ni 칼럼으로부터 용리된 푸울을 3 부피의 100mM MES(pH 5.0)으로 희석시키고, (6) 엔테로키나제를 첨가하기 이전에, SP 세파로오스 용리 푸울을 1/2 부피의 50mM Na2HPO4(pH 8.0)로 희석시키며, (7) 0.2mM DTT을 함유하는 최종 SP 세파로오스 칼럼으로부터의 용리 완충액중의 DTT 및 상기 단계로부터의 용리 푸울을 분취시키고, -70℃에서 저장하였다.
C1II/A169C 변이의 소수성 개질 및 활성도: N-(1-피렌)말레이미드(Sigma)를 이용한 개질을 위해서, 4.6mg/ml으로의 5mM Na2HPO4(pH 5.5), 800mM NaCl, 0.2mM DTT중의 정제된 C1II/A169C를 균등한 부피의 50mM MES(pH 6.5)로 희석시키고, 여기에 DMSO중의 2.5.mg/ml 원액으로부터의 1/20 부피의 피렌 말레이미드를 첨가하였다. 샘플을 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이트시켰다. 이때, 부가의 DTT를 0.5mM에 첨가하고, 샘플을 실온에서 추가 1시간 동안 인큐베이트시켰다. 개질된 단백질을 실시예 3에 기술된 바와 같이 C3H10T1/2 검정중의 활성도에 대해 직접 시험하였다. 개질 이전에, 단백질의 특이적인 활성도는 EC50=0.22㎍/ml 인 반해, 피렌 말레이미드로 처리한 후의 특이적인 활성도는 EC50=0.08㎍/ml으로 증가하였다. 3개까지 증가된 개질된 생성물의 특이적인 활성도는 Shh의 C-말단 근처에서의 소수성 기의 첨가가 C1II 출발 물질에 비해 활성도를 추가로 증가시킴을 나타내는 것으로 종종 관찰되었다. 와일드형의 개질되지 않은 소닉 헤지호그 단백질과 비교하는 경우, N-(1-피렌)말레이미드 개질된 C1II 단백질의 효능은 약 30배 높았다. 피렌 말레이미드가 상기 부위에서서의 개질을 평가하기 위한 간단한 시험 시스템에 제공되는 반면에, 다른 소수성 말레이미드 또는 다른 시스테인 표적화된 화학물질이 또한 사용될 수 있다.
실시예 11: C3H10T1/2 검정중의 사람 소닉 헤지호그의 다양한 소수적으로 개질된 형태의 효능 비교
사람 소닉 헤조호그의 다양한 소수적으로 개질된 형태(섹션 V에 기술된 화학 및 유전공학적 방법으로 제조)의 활성도를 실시예 3에 기술된 C3H10T1/2 검정으로 시험하였다.
유도체를 실시예 3에 기술된 농도 범위에 대해서 검정하였다. 최대 반응의 50%를 일으키는 헤지호그 유도체의 농도를 와일드형 농도와 비교하였다. 상대적인 활성도를 하기 표 11 및 도 13에 제시하였다.
C3H10T1/2 검정에서 헤지호그 유도체의 상대적인 효능
개질 EC50(와일드형에 비해 증가한 효능의 배율)
C:16 팔미토일C:14 미리스토일C:12 라우로일C:10 데카노일A169C 피레닐을 갖는 이소루실-이소루실C:8 옥타노일이소루실-이소루실C:0 티아프롤릴티오모르폴리닐페닐알라닐이소루실N-이소프로필아세트아미딜메티오닐N-에틸말레이미딜시스테닐 (와일드형)아스파르틸히스티딜 100배100배100배33배30배10배10배8배5배4배4배2배2배1배1배〈 1〈 1
C3H10T1/2 검정은 개질되지 않은 단백질은 와일드형과 비교하여, 헤지호그의 다양한 소수적 개질 형태는 단백질의 활성도가 증가함을 증명하고 있다. 친수성 개질(아스파르트산 및 히스티딘)은 이러한 효과가 없다.
실시예 12: 쥐의 말로네이트 유도된 선조체 병소 검정에서의 소수적으로 개질된 사람 소닉 헤지호그의 효능 평가
쥐의 선조체(영장류 미상 및 경막의 설치류 균등물)에 미토콘드리아 효소 숙시네이트 탈수소화효소의 억제인자인 말로네이트를 주입하는 경우 선조성 매질 스피니 뉴런의 퇴화를 일으킨다. 사람에게서, 미상 및 경막에서의 매질 스피니 뉴런의 퇴화는 헌팅톤병의 주요 병리학적 특징이다. 이와 같이, 쥐에게서 말로네이트 유도된 선조체 병소는 소수적으로 개질된 헤지호그 단백질이 헌팅톤병에서 퇴화하는 뉴런의 파괴를 방지할 수 있는지를 시험하기 위한 모델로서 사용될 수 있다.
스프라그-둘리(Sprague-Dawley) 쥐에게 입체공간적인 기술을 사용하여 다양한 농도의 선조체중의 소수적으로 개질된 사람 소닉 헤지호그를 주입하였다. 입체공간적인 주입액(2㎕)을 나트륨 펜토바르비탈 마취(40mg/kg)하에서 준비하고 하기 위치에 놓았다: 봉합 접합점으로부터 0.7mm 앞쪽, 중간선으로부터 2.8mm 뒤쪽, 및 봉합 접합점에서 두개골 표면의 5.5mm 앞쪽. 소수적으로 개질된 단백질의 주입한지 여러 시간(일반적으로 48시간) 경과후에, 쥐를 이소플루레인으로 마취시키고 선조체에서의 동일한 위치에서 말로네이트(2㎕중의 2μmol)을 입체공간적으로 주입하였다. 관측 부분을 선조체를 통해 25㎛ 두께로 절단하고 손상되지 않은 조직으로부터 손상된 조직을 구별하기 위해서 시토크롬 산화제 활성에 대해 착색시켰다. 선조체중의 병소 부피를 상 분석 시스템을 이용하여 측정하였다.
말로네이트 유도된 쥐 선조체의 병소 모델에서 소수적으로 개질된 사람 소닉 헤지호그 단백질의 영향을 도 14에 도시하였다. 개지되지 않은 소닉 헤지호그(실시예 9에 기술된 바와 같이 제조), 미리스토일화된 Shh(실시예 8에 기술된 바와 같이 제조) 및 Shh의 C1II 변이(실시예 10에 기술된 바와 같이 제조) 모두는 상기 모델에서 유사한 크기로 병소 부피가 감소하였다. 그러나, 소수적으로 개질된 단백질(미리스토일화된 Shh 및 C1II Shh)는 개질되지 않은 소닉 헤지호그에 비해 효능이 증가하였다.
실시예 13: sHh-N의 N-옥틸말레이미드 유도화
1mg/ml 최종 농도가 되게 하는 방법
1) DMSO(약 4.2mg/ml)중의 20mM 옥틸말레이미드(m.w.=209) 용액을 제조한다.
2) (5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.5mM DTT 중의)10mg/ml sHh-N의 원액을 PBS(Gibco product # 20012-027, pH 7.2)로 10배 희석하여 1mg/ml (또는 50uM) sHh-N 용액을 수득한다. [주의: 연속 반응에서 말레이미드에 대해서 sHh-N과 경쟁하는 DTT는 또한 상기 용액중에서 50μM 이다].
3) 1mg/ml sHh-N(즉, 5㎕/1ml)에 1/200 부피의 옥틸말레이미드를 바로 첨가한다. 이것은 2:1 몰비(100μM:50μM)의 옥틸말레이미드 대 sHh-N를 제공한다.
4) 실온에서 1시간 동안 튜브 및 인큐베이트를 적당히 거꾸로 함으로써 용액을 혼합한다.
5) 마지막으로, 1/1000 부피의 0.35M DTT를 각각의 튜브에 첨가하여 남아있는 옥틸말레이미드를 멸균시키고 환원제로서 작용시킨다.
6) 비이클 조절을 위해서, 비이클 용액(5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.5mM DTT)과 PBS(Gibco product # 20012-027, pH 7.2)를 1:10의 비율로 배합한다. 1/400 부피의 DMSO중의 20mM 옥틸말레이미드 및 1/400 부피의 DMSO를 첨가하여 최종 농도 50μM N-옥틸말레이미드 및 0.5% DMSO를 수득하였다. 마지막으로 1/1000 부피의 0.35M DTT를 첨가한다.
1mg/ml N-옥틸말레이미드 sHh-N 용액의 대략적인 조성
PBS(pH 약 7.2)
N-옥틸말레이미드에 콘쥬게이트된 50μM sHh-N
N-옥틸말레이미드에 콘쥬게이트된 50μM DTT
300μM DTT
0.5% DMSO
N-옥틸말레이미드 비이클 용액의 대략적인 조성
PBS(pH 약 7.2)
N-옥틸말레이미드에 콘쥬게이트된 50μM DTT
300μM DTT
0.5% DMSO
3mg/ml 최종 농도가 되게 방법
1) DMSO(약 12.6mg/ml)중의 26mM 옥틸말레이미드(m.w.=209) 용액을 제조한다.
2) (5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.5mM DTT 중의)10mg/ml sHh-N의 원액을 PBS(Gibco product # 20012-027, pH 7.2)로 10배 희석하여 3mg/ml (또는 150uM) sHh-N 용액을 수득한다. [주의: 연속 반응에서 말레이미드에 대해서 sHh-N과 경쟁하는 DTT는 또한 상기 용액중에서 150μM 이다].
3) 3mg/ml sHh-N(즉, 5㎕/1ml)에 1/200 부피의 옥틸말레이미드를 바로 첨가한다. 이것은 2:1 몰비(300μM:50μM)의 옥틸말레이미드 대 sHh-N를 제공한다.
4) 실온에서 1시간 동안 튜브 및 인큐베이트를 적당히 거꾸로 함으로써 용액을 혼합한다.
5) 마지막으로, 1/1000 부피의 0.35M DTT를 각각의 튜브에 첨가하여 남아있는 옥틸말레이미드를 멸균시키고 환원제로서 작용시킨다.
6) 비이클 조절을 위해서, 비이클 용액(5mM Na2HPO4(pH 5.5), 150mM NaCl, 0.5mM DTT)과 PBS(Gibco product # 20012-027, pH 7.2)를 3:7의 비율로 배합한다. 1/400 부피의 DMSO중의 60mM 옥틸말레이미드 및 1/400 부피의 DMSO를 첨가하여 최종 농도 150μM N-옥틸말레이미드 및 0.5% DMSO를 수득하였다. 마지막으로 1/1000 부피의 0.5M DTT를 첨가한다.
3mg/ml N-옥틸말레이미드 sHh-N 용액의 대략적인 조성
PBS(pH 약 7.2)
N-옥틸말레이미드에 콘쥬게이트된 150μM sHh-N
N-옥틸말레이미드에 콘쥬게이트된 150μM DTT
500μM DTT
0.5% DMSO
N-옥틸말레이미드 비이클 용액의 대략적인 조성
PBS(pH 약 7.2)
N-옥틸말레이미드에 콘쥬게이트된 150μM DTT
500μM DTT
0.5% DMSO
0.5% DMSO
참고문헌
상기에 언급된 모든 참고문헌은 본원에 참조적으로 인용되고 있다.
균등물
본 발명자들이 본 발명의 수많은 구체예를 기술하고 있을지라도, 당업자라면 본 발명자들의 기본 구체예가 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하는 다른 구체예를 제공하도록 변형될 수 있음을 자명하게 인식할 것이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 상기 발명의 상세한 설명 및 첨부되는 특허청구범위에서 한정되는 모든 대안적인 구체예 및 변형을 포함하는 것으로 인지될 것이며, 본 발명은 본원에 기재된 특정 구체예들에 의해 제한되지 않는다.

Claims (86)

  1. N-말단 아미노산 및 C-말단 아미노산을 포함하는 단리된 단백질로서,
    (a) 하나 이상의 소수성 부분이 부착된 N-말단 시스테인을 갖는 단백질;
    (b) 하나 이상의 소수성 부분이 부착된 시스테인이 아닌 N-말단 아미노산을 갖는 단백질; 및
    (c) N-말단 아미노산이 하나 이상의 소수성 부분으로 대체된 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 소수성 부분이 하나 이상의 소수성 아미노산을 포함하는 펩티드임을 특징으로 하는 단백질.
  3. 제 1항에 있어서, 소수성 부분이 지질임을 특징으로 하는 단백질.
  4. 제 1항에 있어서, C-말단 아미노산을 대체하거나 이에 부착된 소수성 부분을 추가로 포함함을 특징으로 하는 단백질.
  5. 제 1항에 있어서, 세포외 시그날링 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
  6. 제 1항에 있어서, N-말단 아미노산이 시스테인의 작용성 유도체임을 특징으로 하는 단백질.
  7. 제 1항에 있어서, N-말단 아미노산 및 C-말단 아미노산에서 개질됨을 특징으로 하는 단백질.
  8. 제 4항 또는 제 7항에 있어서, N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이의 하나 이상의 아미노산 중간체를 대체하거나 이에 부착된 소수성 부분임을 특징으로 하는 단백질.
  9. 제 1항에 있어서, N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이의 하나 이상의 아미노산 중간체를 대체하거나 이에 부착된 소수성 부분임을 특징으로 하는 단백질.
  10. 제 3항에 있어서, 지질 부분이 탄소수가 2 내지 24개인 포화 및 불포화된 지방산으로부터 선택됨을 특징으로 하는 단백질.
  11. 제 1항에 있어서, 척추 동물원으로부터 수득될 수 있는 헤지호그(hedgehog) 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
  12. 제 11항에 있어서, 헤지호그가 사람 또는 쥐로부터 수득될 수 있음을 특징으로 하는 단백질.
  13. 제 11항에 있어서, 척추 헤지호그가 소닉(Sonic), 인디언(Indian) 및 데저트 (Desert) 헤지호그로부터 선택됨을 특징으로 하는 단백질.
  14. 제 1항에 있어서, 소수성 부분과 접촉하는 소포를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단백질.
  15. 제 14항에 있어서, 소포가 세포막, 미셀 및 리포솜으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 단백질.
  16. 제 11항에 있어서, 헤지호그 단백질이 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 단백질.
  17. 제 13항에 있어서, 헤지호그 단백질이 와일드형 헤지호그 단백질과 비교하여 C-말단에서 1 내지 약 10개의 아미노산이 손실됨을 특징으로 하는 단백질.
  18. 제 16항에 있어서, 아미노산이 소닉, 인디언 또는 데저트 헤지호그와 60% 이상 동일함을 특징으로 하는 단백질.
  19. 하기 형태의 단리된 단백질:
    A-Cys-[Sp]-B-X
    상기에서,
    A는 소수성 부분이고;
    Cys는 시스테인 또는 이들의 작용성 균등물이고;
    [Sp]는 임의의 스페이서 펩티드 서열이고;
    B는 다수의 아미노산 및 임의의 또 다른 스페이서 펩티드 서열을 포함하는 단백질이며;
    X는 단백질 B의 아미노산에 결합되는 임의의 또 다른 소수성 부분이다.
  20. 제 19항에서, 헤지호그 단백질임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  21. 제 20항에서, X가 존재하는 경우 콜레스테롤임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  22. 제 19항에서, 단백질 B가 하나 이상의 다른 아미노산에서 하나 이상의 소수성 부분으로 개질됨을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  23. 제 19항에서, A-Cys 결합이 시스테인의 아미노기를 통해 이루어짐을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  24. 제 19항에서, 단백질과 접촉하는 소포를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  25. 제 24항에서, 단백질과 접촉하는 소포가 세포막, 미셀 및 리포솜으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  26. 다수의 분자, 제 19항에 따른 형태를 갖는 다수의 단리된 단백질 중 2개 이상의 분자에 부착되는 소포.
  27. 제 26항에서, 세포막, 미셀 및 리포솜으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 소포.
  28. 알데히드와 단백질의 N-말단 시스테인과의 반응에 의해 형성된 N-말단 티오프롤린기 및 C-말단 아미노산을 갖는 단리된 단백질.
  29. 지방산 티오에스테르와 단백질의 N-말단 시스테인과의 반응에 의해 형성된 N-말단 아미드기 및 C-말단 아미노산을 갖는 단리된 단백질.
  30. 말레이미드기와 단백질의 N-말단 시스테인과의 반응에 의해 형성된 N-말단 말레이미드기 및 C-말단 아미노산을 갖는 단리된 단백질.
  31. 제 28항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질의 C-말단 아미노산이 소수성 부분으로 개질됨을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  32. 제 31항에 있어서, 헤지호그 단백질임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  33. 제 32항에 있어서, C-말단 소수성 부분이 콜레스테롤임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  34. 소포의 존재하에, 단백질의 N-말단 시스테인 또는 이것의 작용성 균등물을 소수성 부분에 결합시키는 단계를 포함하는 다가 단백질 복합체를 형성시키는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 결합 단계가 탄소수가 2 내지 24개인 포화 및 불포화 지방산으로부터 선택된 지질 부분을 결합시키는 것을 포함하는 방법.
  36. 제 34항에 있어서, 단백질이 헤지호그 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 헤지호그가 소닉, 인디언 및 데저트 헤지호그로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 36항에 있어서, 헤지호그 단백질이 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 34항에 있어서, 결합 단계가 세포막, 리포솜 및 미셀로 이루어진 군으로부터 선택된 소포와 결합시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  40. 단백질의 N-말단 시스테인 또는 이것의 작용성 균등물에 하나 이상의 소수성 부분을 도입시키는 단계를 포함하여, 단백질의 물리화학적 성질을 개질시키는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 소수성 부분을 소포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 40항에 있어서, 소수성 부분이 탄소수가 2 내지 24개인 포화 및 불포화 지방산으로부터 선택되는 지질이거나 소수성 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 40항에 있어서, 단백질이 헤지호그 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 헤지호그 단백질이 소닉, 인디언 및 데저트 헤지호그로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 43항에 있어서, 헤지호그 단백질이 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 41항에 있어서, 접촉 단계가 세포막, 리포솜 및 미셀로 이루어진 군으로부터 선택된 소포와 접촉시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 34항에 따른 방법으로 제조된 단백질 복합체.
  48. 제 40항에 따른 방법으로 제조된 개질된 단백질.
  49. 제 47항에 있어서, 단백질이 겔솔린(gelsolin); 인터페론, 인터루킨, 종양 회사 인자, 단핵구 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 혈소판 유도된 성장 인자, 성장 호르몬 및 인슐린으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 복합체.
  50. N-말단 시스테인을 지방산 티오에스테르와 반응시켜 아미드를 형성하는 단계를 포함하여, 생물학적 활성도를 갖고 N-말단 시스테인을 함유하는 단백질을 개질시키는 방법으로서, 단백질의 생물학적 활성도를 증가시키는 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 단백질이 헤지호그 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 51항에 있어서, 헤지호그 단백질이 소닉, 인디언, 데저트 헤지호그 및 이것의 작용성 변이체로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  53. N-말단 시스테인을 말레이미드기와 반응시키는 단계를 포함하여, 생물학적 활성도를 갖고 N-말단 시스테인을 함유하는 단백질을 개질시키는 방법으로서, 단백질의 생물학적 활성도를 증가시키는 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 단백질이 헤지호그 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 헤지호그 단백질이 소닉, 인디언, 데저트 헤지호그 및 이것의 작용성 변이체로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  56. 생물학적 활성도를 갖는 단백질에 소수성 펩티드를 부착시키는 단계를 포함하여, 상기 단백질을 개질시키는 방법.
  57. 제 56항에 있어서, 소수성 펩티드가 N-말단 아미노산, C-말단 아미노산, N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이의 아미노산 중간체 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 아미노산에 부착됨을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 69항에 있어서, 단백질이 헤지호그 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 71항에 있어서, 헤지호그 단백질이 소닉, 인디언 및 데저트 헤지호그로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  60. 피검체에 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 단백질의 치료학적 용도.
  61. 환자에게 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 투여함을 포함하여, 환자에게서 신경계 질환을 치료하는 방법.
  62. 제 1항에 있어서, 세포외 시그날링 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
  63. 제 57항에 있어서, 부착 단계가 최소한 단백질의 N-말단 아미노산을 하나 이상의 소수성 아미노산으로 대체시킴을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 63항에 있어서, 하나 이상의 소수성 아미노산이 다수의 이소루신 잔기임을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 63항에 있어서, 하나 이상의 이소루신 잔기를 화학적으로 개질시킴을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  66. 치환된 아세트아미드와 단백질의 N-말단 시스테인과의 반응에 의해 형성된 N-말단 아세트아미드기 및 C-말단 아미노산을 갖는 단리된 단백질.
  67. 할로케톤기와 단백질의 N-말단 시스테인과의 반응에 의해 형성된 N-말단 티오모르폴린기 및 C-말단 아미노산을 갖는 단리된 단백질.
  68. N-말단 시스테인을 치환된 아세트아미드기와 반응시키는 단계를 포함하여, 생물학적 활성도를 갖고 N-말단 시스테인을 함유하는 단백질을 개질시키는 방법으로서, 단백질의 생물학적 활성도를 증가시키는 방법.
  69. 제 68항에 있어서, 단백질이 헤지호그 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 69항에 있어서, 헤지호그 단백질이 소닉, 인디언, 데저트 헤지호그 및 이것의 작용성 변이체로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  71. N-말단 시스테인을 할로케톤기와 반응시키는 단계를 포함하여, 생물학적 활성도를 갖고 N-말단 시스테인을 함유하는 단백질을 개질시키는 방법으로서, 단백질의 생물학적 활성도를 증가시키는 방법.
  72. 제 71항에 있어서, 단백질이 헤지호그 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 72항에 있어서, 헤지호그 단백질이 소닉, 인디언, 데저트 헤지호그 및 이것의 작용성 변이체로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  74. 헤지호그 폴리펩티드가 헤지호그 단백질의 성숙 N-말단 단백질 가수분해성 단편이고, 친유성 부분이 C-말단 잔기에서 스테롤과 다른 경우에 하나 이상의 친유성 부분으로 개질된 헤지호그 폴리펩티드.
  75. 내부 아미노산 잔기에서 하나 이상의 친유성 부분으로 개질된 헤지호그 폴리펩티드.
  76. 하나 이상의 친유성 방향족 탄화수소로 개질된 헤지호그 폴리펩티드.
  77. 제 74항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 단백질 제형으로서 제공됨을 특징으로 하는 헤지호그 폴리펩티드.
  78. 제 74항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 제형으로서 제공됨을 특징으로 하는 헤지호그 폴리펩티드.
  79. 제 74항 또는 제 75항에 있어서, 친유성 부분이 지방산, 지질, 에스테르, 알코올, 케이지 구조 및 방향족 탄화수소로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 헤지호그 폴리펩티드.
  80. 제 76항 또는 제 79항에 있어서, 방향족 탄화수소가 벤젠, 페릴렌, 페난트렌, 안트라센, 나프탈렌, 피렌, 크리센 및 나프타센으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 헤지호그 폴리펩티드.
  81. 제 80항에 있어서, 방향족 탄화수소가 피렌임을 특징으로 하는 헤지호그 단백질.
  82. 제 74항 또는 제 75항에 있어서, 친유성 부분이 이소프레노이드, 테르펜 및 다지환족로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 헤지호그 폴리펩티드.
  83. 제 82항에 있어서, 친유성 부분이 아다만탄, 부크민스터풀러렌, 비타민, 폴리에틸렌 글리콜, 올리고에틸렌 글리콜, (C1-C18)-알킬 포스페이트 디에스테르, -O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-알킬로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 헤지호그 폴리펩티드.
  84. 제 83항에 있어서, 친유성 부분이 1- 또는 2-아다만틸아세틸, 3-메틸아다만탄-1-일아세틸, 3-메틸-3-브로모-1-아다만틸아세틸,, 1-데칼린아세틸, 캄포르아세틸, 캄판아세틸, 노르아다만틸아세틸, 노르보르난아세틸, 비시클로[2.2.2.]-옥트-5-엔아세틸, 1-메톡시비시클로[2.2.2.]-옥트-5-엔-2-카르보닐, 시스-5-노르보르넨-엔도-2,3-디카르보닐, 5-노르보르넨-2-일아세틸, (1R)-(-)-미르텐탄아세틸, 2-노르보르난아세틸, 안티-3-옥소-트리시클로[2.2.1.0〈2.6〉]-헵탄-7-카르보닐, 데카노일, 도데카노일, 도데세노일, 테트라데카디에노일, 데시노일 및 도데시노일로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 헤지호그 폴리펩티드.
  85. 제 74항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서, 친유성 부분(들)이 개질된 헤지호그 폴리펩티드와 관련된 폴리펩티드의 생물학적 활성도를 증가시킴을 특징으로 하는 헤지호그 폴리펩티드.
  86. 세포를 제 74항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 따른 친유성 부분으로 개질된 헤지호그 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하여, 헤지호그 시그날링에 반응하는 세포의 성장 상태를 변화시키는 방법.
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