PL197833B1

PL197833B1 - Wyizolowane białko, sposób wytwarzania multiwalentnego kompleksu białkowego białka hedgehog, sposób modyfikacji białka hedgehog, zastosowanie białka, rekombinantowy polipeptyd hedgehog o zwiększonej aktywności biologicznej oraz zastosowanie zmodyfikowanego lipofilowo polipeptydu hedgehog

Info

Publication number: PL197833B1
Application number: PL341430A
Authority: PL
Inventors: R.Blake Pepinsky; Darren P. Baker; Dingyi Wen; Kevin P. Williams; Ellen A. Garber; Frederick R. Taylor; Alphonse Galdes; Jeffrey Porter
Original assignee: Biogen Idec Inc; Curis Inc
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-03
Publication date: 2008-04-30
Also published as: EA200000605A1; PT1036092E; WO1999028343A3; KR20010032753A; EE200000308A; IS5499A; WO1999028343A9; JP2001525336A; TR200001612T2; HUP0100535A2; NZ504752A; PL341430A1; EA003739B1; NO20002789D0; MXPA00005494A; IS2163B; HUP0100535A3; AU757497B2; ATE295372T1; DE69830192T2

Abstract

1. Wyizolowane bia lko zawieraj ace N-ko ncowy i C-ko ncowy aminokwas, znamienne tym, ze jest bia lkiem hedgehog wybranym z (a) bia lka z N-ko ncow a cystein a, która ma przy laczon a co najmniej jedn a reszt e hydrofobow a; (b) bialka z N-ko ncowym aminokwasem, który nie jest cystein a z przy laczon a przynajmniej jed- n a reszt a hydrofobow a i (c) bia lka z co najmniej jedn a reszt a hydrofobow a podstawion a zamiast N-ko ncowego amino- kwasu, przy czym bia lko hedgehog nie jest modyfikowane na C-ko ncowej reszcie sterolem. PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197833 (21) Numer zgłoszenia: 341430 ^{(13) B1} (22) Data zgłoszenia: 03.12.1998 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

03.12.1998, PCT/US98/25676 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

10.06.1999, WO99/28343 PCT Gazette nr 22/99 (51) Int.Cl.

C07K 14/435 (2006.01) A61K 38/17 (2006.01) A61K 38/18 (2006.01)

Wyizolowane białko, sposób wytwarzania multiwalentnego kompleksu białkowego białka hedgehog, sposób modyfikacji białka hedgehog, zastosowanie białka, rekombinantowy polipeptyd hedgehog o zwiększonej aktywności biologicznej oraz zastosowanie zmodyfikowanego lipofilowo polipeptydu hedgehog (30) Pierwszeństwo:

03.12.1997,US,60/067,423

20.03.1998,US,60/078,935

17.06.1998,US,60/089,685

10.09.1998,US,60/099,800 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

09.04.2001 BUP 08/01 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.04.2008 WUP 04/08 (73) Uprawniony z patentu:

BIOGEN IDEC MA INC.,Cambridge,US CURIS INC.,Cambridge,US (72) Twórca(y) wynalazku:

R.Blake Pepinsky,Arlington,US Darren P. Baker,Highham,US Dingyi Wen,Waltham,US Kevin P. Williams,Natick,US Ellen A. Garber,Cambridge,US Frederick R. Taylor,Milton,US Alphonse Galdes,Lexington,US Jeffrey Porter,Cambridge,US (74) Pełnomocnik:

Jan Wierzchoń,

JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY (57) 1. Wyizolowane białko zawierające N-końcowy i C-końcowy aminokwas, znamienne tym, że jest białkiem hedgehog wybranym z (a) białka z N-końcową cysteiną, która ma przyłączoną co najmniej jedną resztę hydrofobową;

(b) białka z N-końcowym aminokwasem, który nie jest cysteiną z przyłączoną przynajmniej jedną resztą hydrofobową i (c) białka z co najmniej jedną resztą hydrofobową podstawioną zamiast N-końcowego aminokwasu, przy czym białko hedgehog nie jest modyfikowane na C-końcowej reszcie sterolem.

PL 197 833 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowane białko, sposób wytwarzania multiwalentnego kompleksu białkowego białka hedgehog, sposób modyfikacji białka hedgehog i zastosowanie tego białka oraz rekombinantowy polipeptyd hedgehog o zwiększonej aktywności biologicznej oraz zastosowanie tego zmodyfikowanego lipofilowo polipeptydu hedgehog.

Wiadomo, że pewne białka wykazują większą aktywność biologiczną gdy są przyłączone do innych reszt, albo przez tworzenie multimerycznych kompleksów, gdzie białka mają możliwość działania wspólnie, lub przez inne zmiany w fizykochemicznych właściwościach białka, takich jak absorpcja, biodystrybucja i okres półtrwania. Tak więc jedna współczesna dziedzina badań w biotechnologii dotyczy rozwoju sposobów do modyfikowania fizykochemicznych właściwości białek tak by mogły być podawane w mniejszych ilościach z mniejszą ilością efektów ubocznych za pomocą nowych dróg i z mniejszymi kosztami.

Na przykład powinowactwo wiązania dowolnego pojedynczego białka (takiego jak ligandu dla jego odpowiedniego receptora) może być niskie. Jednak komórki normalnie wyrażają setki do tysięcy kopii danego receptora powierzchniowego, i równocześnie zachodzi wiele interakcji receptor-ligand. Gdy wiele cząsteczek powierzchniowych bierze udział w wiązaniu całkowite efektywne powinowactwo jest większe niż suma powinowactw wiązania poszczególnych cząsteczek. Przeciwnie, gdy białka ligandów są usunięte z powierzchni komórki i oczyszczone lub izolowane za pomocą technik rekombinacji DNA do stosowania np. jako terapeutyki, działają jako monomery i tracą zaletę działania razem z wieloma innymi kopiami tego samego białka blisko zasocjowanymi na powierzchni komórki. Tak odizolowane niskie powinowactwo białka dla jego receptora może stać się poważnym zahamowaniem dla jego skuteczności jako terapeutyk by blokować dany szlak wiązania ponieważ musi współzawodniczyć z interakcjami komórka-komórka o wysokim powinowactwie. Skuteczna terapia mogłaby wymagać stałego podawania i/lub wysokich dawek. Takich ograniczeń można by jednak uniknąć jeśli by można znaleźć sposób na dostarczanie multimerycznych form wyizolowanego białka.

Podobnie byłoby pożyteczne modyfikowanie innych fizykochemicznych właściwości biologicznie czynnych białek, tak by na przykład zaindukować asocjację białka z błoną w ten sposób lokalizując je w miejscu podania i zwiększając jego zdolności do wiązania, i innego reagowania z danym celem. Takie zmiany mogą też wpływać na farmakodystrybucję białka.

Opracowano kilka sposobów generowania sprzęgniętych białek. Wiele z tych sposobów nie jest wysoce specyficznych tzn. nie kierują punktu połączenia do żadnego specyficznego miejsca na białku. W efekcie konwencjonalne czynniki sprzęgające mogą atakować miejsca funkcjonalne lub sferycznie blokować miejsca czynne unieczynniając sprzęgnięte białka. Co więcej, sprzęgnięte produkty mogą być tak zorientowane, że aktywne miejsca nie mogą działać synergistycznie powodując, że produkty mogą nie być bardziej skuteczne niż samo białko monomeryczne.

Jako dodatkowa motywacja aby znaleźć nowe sposoby modyfikacji białek, białka z N-końcową resztą cysteiny są podatne na utlenianie lub inne modyfikacje chemiczne, które mogą upośledzać aktywność lub okres półtrwania. Dodatkowo, pewne bufory popularnie stosowane w oczyszczaniu białek mają składniki lub zanieczyszczenia, które mogą modyfikować N-końcową cysteinę. Nawet jeśli się unika tych buforów, N-końcowa cysteina jest modyfikowana w miarę upływu czasu być może ze względu na chemikalia w fiolkach używanych do przechowywania lub w powietrzu. W efekcie bufory do formułowania muszą zawierać czynnik ochronny, taki jak ditiotreitol, aby zapobiegać modyfikacji i/lub utlenianiu cysteiny. Jednak ochronne czynniki mają własne znaczące biologiczne aktywności i mogą więc komplikować doświadczenia i niekorzystnie wpływać na terapeutyczną użyteczność danej formuły.

Tak więc istnieje potrzeba w dziedzinie opracowania bardziej specyficznych i wygodnych sposobów uzyskania pochodnych produktów lub ich form multimerycznych aby zmieniać właściwości białka w celu wpływania na jego stabilność, moc, farmakokinetykę i farmakodynamikę.

Sposoby te mogą być stosowane aby uzyskać pochodne multimeryczne formy białek i/lub mogą być użyte do zmiany ich właściwości fizykochemicznych. Zostało przez nas stwierdzone, że modyfikacja białka (tzn. dodanie lub przyłączenie reszty hydrofobowej do istniejącego aminokwasu lub podstawienie reszty hydrofobowej za aminokwas tak by wprowadzić resztę hydrofobową do białka) może zwiększyć aktywność biologiczną białka i/lub jego stabilność. Na przykład, N-końcowa cysteina może być stosowana jako wygodny „cel” do przyłączenia reszty hydrofobowej (np. lipidu) i w ten sposób zmodyfikowania biologicznie czynnych białek.

PL 197 833 B1

Alternatywnie, reszta hydrofobowa może być przyłączona do reszty C-końcowej biologicznie czynnego białka takiego jak białko hedgehog, aby zmodyfikować aktywność białka. Hydrofobowa reszta może być też przyłączona do wewnętrznej reszty aminokwasu do zwiększenia aktywności białka, pod warunkiem, że modyfikacja nie wpłynie na aktywność białka, np. zdolność białka do wiązania do receptora lub koreceptora ani na trójwymiarową strukturę białka. Korzystnie reszta hydrofobowa jest przyłączana do wewnętrznej reszty aminokwasowej, która jest na powierzchni białka gdy białko jest w swojej natywnej postaci. Hydrofobowa modyfikacja według wynalazku dostarcza ogólnie pożyteczny sposób tworzenia białek ze zmienionymi właściwościami fizykochemicznymi w porównaniu z postaciami niezmodyfikowanymi.

Wynalazek związany jest z odkryciem, że gdy wyrażano białko Sonic hedgehog pełnej długości w komórkach owadów i ssaków, dojrzała postać białka (reszty 1-174 w dojrzałej sekwencji) oprócz posiadania cholesterolu na C-końcu była też podstawiona na N-końcu kwasem tłuszczowym. Znacząco, ta postać hedgehog wykazywała około 30-krotny wzrost w sile w porównaniu z rozpuszczalnym, niezmodyfikowanym hedgehog w oznaczeniu in vitro.

Zgodnie z wynalazkiem wyizolowane białko zawierające N-końcowy i C-końcowy aminokwas, charakteryzuje się tym, że jest białkiem hedgehog wybranym z (a) białka z N-końcową cysteiną, która ma przyłączoną co najmniej jedną resztę hydrofobową;

(b) białka z N-końcowym aminokwasem. który nie jest cysteiną z przyłączoną przynajmniej jedną resztą hydrofobową i (c) białka z co najmniej jedną resztą hydrofobową podstawioną zamiast N-końcowego aminokwasu, przy czym białko hedgehog nie jest modyfikowane na C-końcowej reszcie sterolem.

Korzystnie białko według wynalazku ma resztę hydrofobową, która jest peptydem zawierającym co najmniej jeden hydrofobowy aminokwas, albo alternatywnie jest lipidem, przy czym reszta lipidowa jest w szczególności kwasem tłuszczowym wybranym z nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych mających 2-24 atomów węgla.

Białko według wynalazku korzystnie ma dalej resztę hydrofobową zamiast, lub przyłączoną do C-końcowego aminokwasu, przy czym szczególnie korzystne jest gdy białko to ma resztę hydrofobową podstawioną za, lub przyłączoną do co najmniej jednego aminokwasu pośredniego pomiędzy N-końcowym i C-końcowym aminokwasem.

Białko hedgehog według wynalazku zawiera korzystnie fragment bioaktywny, który może wiązać się z białkiem patched, korzystnie też w białku według wynalazku N-końcowy aminokwas jest funkcjonalną pochodną cysteiny.

Korzystnie białko według wynalazku jest modyfikowane na zarówno N-końcowym aminokwasie i C-końcowym aminokwasie, przy czym jest szczególnie korzystne gdy reszta hydrofobowa podstawiona za, lub przyłączona do co najmniej jednego aminokwasu pośredniego znajduje się pomiędzy N-końcowym i C-końcowym aminokwasem.

Białko według wynalazku ma korzystnie resztę hydrofobową podstawioną za, lub przyłączoną do co najmniej jednego aminokwasu pośredniego pomiędzy N-końcowym i C-końcowym aminokwasem.

Białko według wynalazku jest korzystnie białkiem hedgehog uzyskiwanym ze źródła będącego kręgowcem, zwłaszcza uzyskiwanym z człowieka lub szczura, w szczególności jest białkiem hedgehog kręgowca wybranym z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedghog albo jego bioaktywnym fragmentem, przy czym to białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched.

Białko hedgehog według wynalazku może wiązać się z białkiem patched.

Białko według wynalazku korzystnie zawiera dodatkowo pęcherzyk przyłączony do niego poprzez resztę hydrofobową białka, który w szczególności jest wybrany z grupy złożonej z błony komórkowej, miceli i liposomu.

Białko według wynalazku korzystnie zawiera sekwencję aminokwasów w co najmniej 80% identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4, przy czym białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched, a szczególnie korzystnie zawiera sekwencję aminokwasów identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4.

W białku według wynalazku, a w szczególności w białku maaącym sekwencję aminokwasów identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4, korzystnie jest usuniętych 1 do 10 aminokwasów z jego C-końca w porównaniu z hedgehog typu dzikiego.

Korzystne według wynalazku jest białko, które ma C-końcowy aminokwas oraz N-końcową grupę tioprolinową utworzoną przez reakcję aldehydu z N-końcową cysteiną białka, albo białko, które ma C-końcowy aminokwas i N-końcową grupę amidową utworzoną przez reakcję tioestru kwasu tłuszczowego z N-końcową cysteiną białka, albo białko, które ma C-końcowy aminokwas i N-końcową grupę

PL 197 833 B1 maleimidową utworzoną przez reakcję grupy maleimidowej z N-końcową cysteiną białka, przy czym szczególnie korzystne jest gdy C-końcowy aminokwas tych alternatywnych białek jest modyfikowany resztą hydrofobową.

Również korzystnym według wynalazku jest białko, które ma C-końcowy aminokwas i N-końcową grupę acetamidową, przy czym wymienioną grupę utworzono przez reakcję podstawionego acetamidu z N-końcową cysteiną białka oraz białko, które ma C-końcowy aminokwas i N-końcową grupę tiomorfolinową, przy czym wymienioną grupę utworzono przez reakcję grupy haloketonowej z N-końcową cysteiną białka.

Korzystne jest też według wynalazku białko, które jest polipeptydem hedgehog modyfikowanym jedną lub większą liczbą reszt lipofilowych na wewnętrznych resztach aminokwasów oraz białko, które jest polipeptydem hedgehog modyfikowanym jednym lub więcej lipofilowymi aromatycznymi węglowodorami.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania multiwalentnego kompleksu białkowego białka hedgehog, charakteryzuje się tym, że do N-końcowej cysteiny białka według wynalazku lub funkcjonalnego ekwiwalentu N-końcowej cysteiny takiego białka przyłącza się hydrofobowe reszty w obecności lipofilowego pęcherzyka.

Korzystnie jako hydrofobowe reszty przyłącza się reszty lipidu, wybranego z nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych mających 2 do 24 atomów węgla, przy czym stosuje się zwłaszcza białko hedgehog albo jego bioaktywny fragment, które mogą wiązać się z białkiem patched oraz szczególnie korzystnie równocześnie z przyłączeniem reszty lipidu przyłącza się pęcherzyk wybrany z grupy złożonej z błony komórkowej, liposomu i miceli. Jako białko hedgehog stosuje się białko hedgehog wybrane z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog albo jego bioaktywny fragment, przy czym białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched. Stosuje się białko hedgehog, które zawiera sekwencję aminokwasów w co najmniej 80% identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4, a zwłaszcza stosuje się białko hedgehog zawierające sekwencję aminokwasów identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4.

Zgodnie z wynalazkiem sposób modyfikacji białka hedgehog, charakteryzuje się tym, że wprowadza się przynajmniej jedną resztę hydrofobową do N-końcowej cysteiny białka według wynalazku lub do funkcjonalnego równoważnika N-końcowej cysteiny w białku według wynalazku przy czym korzystnie dodatkowo kontaktuje się resztę hydrofobową z pęcherzykiem, zwłaszcza z pęcherzykiem wybranym z grupy złożonej z błony komórkowej, liposomu i miceli.

Stosuje się resztę hydrofobową, która jest resztą lipidu, wybraną z nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych mających między 2 i 24 atomy węgla, albo jest białkiem hydrofobowym. Korzystnie stosuje się białko, które jest białkiem hedgehog albo jego bioaktywnym fragmentem, przy czym białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched. Korzystnym jest gdy stosuje się białko hedgehog wybrane z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog albo jego bioaktywny fragment, przy czym białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched.

Korzystnie stosuje się białko hedgehog, które zawiera sekwencję aminokwasów w przynajmniej 80% identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4, a szczególnie korzystnie stosuje się białko hedgehog, które zawiera sekwencję aminokwasów identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4.

Zgodnie z wynalazkiem sposób modyfikacji białka hedgehog zawierającego N-końcową cysteinę, która to modyfikacja zwiększa aktywność biologiczną białka, charakteryzuje się tym, że dostarcza się białko hedgehog lub jego bioaktywny fragment zawierający N-końcową cysteinę, mogące wiązać się z białkiem patched, poddaje się reakcji N-końcową cysteinę z tioestrem kwasu tłuszczowego i wytwarza się postać amidu białka hedgehog według wynalazku. Korzystnie stosuje się białko hedgehog wybrane z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog albo jego bioaktywny fragment, przy czym wybrane białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched.

Zgodnie z wynalazkiem sposób modyfikacji białka hedgehog zawierającego N-końcową cysteinę, która to modyfikacja zwiększa aktywność biologiczną białka, charakteryzuje się tym, że dostarcza się białko hedgehog lub jego bioaktywny fragment, zawierające N-końcową cysteinę i mogące wiązać się z białkiem patched i poddaje się reakcji N-końcową cysteinę z grupą maleimidową. Korzystnie stosuje się białko hedgehog wybrane z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog albo jego bioaktywny fragment, przy czym wybrane białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched.

Zgodnie z wynalazkiem sposób modyfikacji białka hedgehog zawierającego N-końcową cysteinę, która to modyfikacja zwiększa aktywność biologiczną tego białka, charakteryzuje się tym, że dostarcza się białko hedgehog lub jego bioaktywny fragment, zawierające N-końcową cysteinę i mogące wiązać się z białkiem patched i poddaje się reakcji N-końcową cysteinę z podstawioną grupą acetamidową.

PL 197 833 B1

Korzystnie stosuje się białko hedgehog wybrane z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog albo jego bioaktywny fragment, przy czym wybrane białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched.

Zgodnie z wynalazkiem sposób modyfikacji białka hedgehog zawierającego N-końcową cysteinę, która to modyfikacja zwiększa aktywność biologiczną białka, charakteryzuje się tym, że dostarcza się białko hedgehog lub jego bioaktywny fragment, zawierające N-końcową cysteinę i mogące wiązać się z białkiem patched i poddaje się reakcji N-końcową cysteinę z grupą haloketonową. Korzystnie stosuje się białko hedgehog wybrane z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog albo jego bioaktywny fragment.

Zgodnie z wynalazkiem białko zdefiniowane wyżej jest przeznaczone do stosowania jako lek oraz jest przeznaczone do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia neurologicznego.

Zgodnie z wynalazkiem rekombinantowy polipeptyd hedgehog o zwiększonej aktywności biologicznej i mogący wiązać się z białkiem patched, charakteryzuje się tym, że polipeptyd hedgehog odpowiadający białku wybranemu z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog jest modyfikowany przez jedną lub większą liczbę reszt lipofilowych. Korzystnie zawiera on sekwencję aminokwasów w przynajmniej 80% identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4, a szczególnie korzystnie zawiera sekwencję aminokwasów identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4.

Polipeptyd hedgehog według wynalazku jest korzystnie polipeptydem hedgehog modyfikowanym jedną lub więcej grupami lipofilowymi na wewnętrznych resztach aminokwasów albo alternatywnie jest korzystnie polipeptydem hedgehog modyfikowanym jednym lub więcej lipofilowymi aromatycznymi węglowodorami.

Polipeptyd hedgehog według wynalazku oraz każda jego korzystna postać jest dostarczany jako oczyszczony preparat białka.

Polipeptyd hedgehog według wynalazku oraz każda jego korzystna postać mają reszty lipofilowe wybrane zwłaszcza z grupy złożonej z kwasów tłuszczowych, lipidów, estrów, alkoholi, struktur klatki i aromatycznych węglowodorów.

Polipeptyd hedgehog według wynalazku modyfikowany jednym lub więcej lipofilowymi aromatycznymi węglowodorami jest korzystnie modyfikowany aromatycznymi węglowodorami wybranymi z grupy złożonej z benzenu, perilenu, fenantrenu, antracenu, naftalenu, pirenu, chrysenu i naftacenu. Szczególnie korzystnie jest modyfikowany pirenem.

Polipeptyd hedgehog według wynalazku oraz każda jego korzystna postać, jest korzystnie modyfikowany przez jedną lub większą liczbę reszt lipofilowych wybranych z grupy złożonej z izoprenoidów, terpenów i policyklicznych węglowodorów.

Polipeptyd hedgehog według wynalazku jest modyfikowany przez jedną lub większą liczbę reszt lipofilowych, które to reszty lipofilowe są szczególnie korzystnie wybrane z grupy złożonej z adamantów, buckminsterfullerenów, witamin, glikolu polietylenowego, glikolu oligoetylenowego, diestrów (C1-C18) alkilofosforanów, -O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-alkilu.

Polipeptyd hedgehog według wynalazku jest modyfikowany przez jedną lub większą liczbę reszt lipofilowych, które to reszty lipofilowe są szczególnie korzystnie wybrane z grupy złożonej z 1- lub 2-adamantyloacetylu, 3-metyloadamant-1-yloacetylu, 3-metylo-3-bromo-1-adamantyloacetylu, 1-dekalinoacetylu, kamforoacetylu, kamfaneacetylu, noradamantyloacetylu, norbornanenoacetylu, bicyklo[2.2.2]-okt-5-enoacetylu, 1-metoksybicyklo[2.2.2]-okt-5-eno-2-karbonylu, cis-5-norborneno-endo-2,3-dikarbonylu, 5-norborneno-2-yloacetylu, (1R)-(-)mirtentanoacetylu, 2-norbornanenoacetylu, anty-3-oksytricyklo[2.2.1.0<2,6>]heptano-7-karbonylu, dekanoilu, dodekanoilu, dodecynoilu, tetradekadienoilu, decynoilu i dodecynoilu.

Polipeptyd hedgehog według wynalazku oraz każda jego korzystna postać ma w szczególności wprowadzone resztę lipofilową lub reszty lipofilowe wzmagające aktywność biologiczną polipeptydu względem niezmodyfikowanego białka hedgehog.

Polipeptyd hedgehog według wynalazku oraz każda jego korzystna postać jest stosowany/a jako lek.

Zmodyfikowany lipofilowo polipeptyd hedgehog oraz każda jego korzystna postać jest stosowany/a do wytwarzania leku do zmiany stanu wzrostu komórki reagującej na sygnały hedgehog.

Opis figur

Figura 1. Charakterystyka palmitylowanej postaci Shh. Zakotwiczoną postać ludzkiego Shh oczyszczono za pomocą immunopowinowactwa z komórek owadzich High Five™ i analizowano za pomocą SDS-PAGE. Białko barwiono błękitem Coomassie (ścieżka a, Life Technologies, Inc. barwione uprzednio markery wysokiej masy cząsteczkowej; ścieżka b, rozpuszczalny Shh (0,6 mg); ścieżka c, zakotwiczony Shh (0,6 mg); ścieżka d, mieszanina rozpuszczalnego plus zakotwiczonego Shh (0,6 mg

PL 197 833 B1 każdego). Zdolność Shh i Ihh (zob. ścieżka h) do podlegania modyfikacji kwasem palmitynowym oznaczano stosując układ bezkomórkowy opisany w Przykładzie 2. Rozpuszczalne postacie białka hedgehog (3 mg/próbę) inkubowano przez 1 godz. z mikrosomami wątroby szczura, ATP, koenzymem A, i kwasem ³H palmitylowym, i następnie badano w nich palmitoilacją za pomocą SDS-PAGE. Próbki pokazane w ścieżkach e-i wizualizowano za pomocą fluorografii (ścieżka e, Ssh; ścieżka F, des 1-10 Shh; ścieżka g, Cys-1 do Ser Shh; ścieżka h, Ihh; ścieżka i, Shh ze znacznikiem His) i w ścieżkach j-k za pomocą barwienia Coomassie (ścieżka j, Shh; ścieżka k des 1-10 Shh).

Figura 2. Analiza oczyszczonego Shh za pomocą ESI-MS. Rozpuszczalny ludzki Shh (A) i zakotwiczony ludzki Shh (B) analizowano za pomocą ESI-MS na spektrometrze masowym Micromass Ouatro II o potrójnej kwadrupoli, wyposażonym w źródło elektrorozpylanych jonów. Wszystkie dane o widmach mas elektrosprayu zdobywano i magazynowano w trybie profilu i obrabiano stosując system danych Micromass MassLynx. Widma masy cząsteczkowej są przedstawione (przypisywanie masy uzyskano za pomocą systemu danych).

Figura 3. Analiza zakotwiczonego Shh za pomocą HPLC fazy odwróconej. Rozpuszczalny ludzki Shh (A), zakotwiczony ludzki Shh z komórek owadzich High Five™ (B), zakotwiczony ludzki Shh z komórek EBNA-293 (C), i zasocjowany z komórką szczurzy Shh (D) były poddane HPLC fazy odwróconej na kolumnie Vydac C₄ o wąskiej średnicy (2,1 mm średnicy wewnętrznej x 250 mm). Kolumnę rozwijano w 30 min gradiencie acetonitrylu 0-80% w 0,1% kwasie trifluorooctowym przy 0,25 ml/min i wyciek monitorowano stosując detektor z zestawem fotodiod od 200-300 nm (dane przedstawiono w 214 nm). Zbierano frakcje szczytów i dalej scharakteryzowano za pomocą SDS-PAGE i MS (dane podsumowano w Tabelach 3, 4 i 5).

Figura 4. Charakterystyka Shh za pomocą LC-MS. Zakotwiczony ludzki Shh (A) i rozpuszczalny ludzki Shh (P) alkilowano 4-winylopirydyną (1 ml/100 ml próbki w 6 M chlorowodorku guanidyny, 1 mM EDTA, 100 mM Tris HCI pH 8,0), strącano etanolem i trawiono endoproteinazą Lys-C w 20 mM Tris pH 7,0, 2 M moczniku przy stosunku enzym białko 1:5 jak opisano uprzednio (27). Produkty trawienia analizowano za pomocą HPLC fazy odwróconej połączonym ze spektrometrem masowym Micromass Ouatro II o potrójnej kwadrupoli. Skany zbierano podczas obiegu i obrabiano stosując układ danych Micromass MassLynx (przedstawiono całkowite chromatogramy jonowe z przebiegów). Gwiazdki wskazują pozycje N-końcowego peptydu, które były sprawdzane albo przez MALDI PSD albo przez sekwencjonowanie N-końca metodą Edmana.

Figura 5. Sekwencjonowanie N-końcowego peptydu Shh za pomocą pomiaru MALDI PSD. N-końcowy peptyd uzyskany stosując endoproteinazę Lys-C z zakotwiczonego ludzkiego Shh został poddany pomiarowi MALDI PSD na Voyager-DE™ STR spektrometrze masowym czasu przebiegu. Przewidywany wzór fragmentacji i nomenklatura dla wykrywanych jonowych fragmentów są przedstawione u góry panelu (PA, kwas palmitoilowy; 4vp, grupa pirydyloetylowa). Reszta Figury przedstawia spektrum masy molekularnej wyprodukowanej przez przebieg. Odnośne jony są określane stosując nomenklaturą zdefiniowaną na schemacie. Wyliczone masy (Da) dla b1 - b8 są 447,3, 504,3, 601,4, 658,4, 814,5, 871,5, 1018,6 i 1075,6 odpowiednio. Dla y1 do y8 masy (Da) są 147,1, 204,1, 351,2, 408,2, 564,3, 621,3, 718,4, i 775,4, odpowiednio. Wyliczona masa dla z8 wynosi 758,4 Da. Obserwowana masa dla b8 zawiera dodatkowe 18 kDa ze wzglądu na dodaną wodą.

Figura 6. Zwiększona aktywność zakotwiczonego Shh w oznaczeniu C3H10T1/2. Względne siły działania rozpuszczalnego i zakotwiczonego ludzkiego Shh samego (A) lub w obecności neutralizującego Mab 5E1 przeciw-hedgehog (B) oceniano na komórkach C3H10T1/2 mierząc indukcję fosfatazy alkalicznej. Liczby przedstawiane są odbiciem średnich z oznaczeń w dwóch powtórzeniach. (A)Seryjne 2-krotne rozcieńczenia rozpuszczalnego (6) i zakotwiczonego (8) Shh inkubowano z komórkami przez 5 dni i powstałe poziomy aktywności fosfatazy alkalicznej mierzono przy 405 nm stosując chromogenny substrat fosfatazy alkalicznej p-nitrofenylofosforan. (B) Seryjne rozcieńczenia Mab 5E1 inkubowano z rozpuszczalnym Ssh (5 mg/ml; czarne paski) lub zakotwiczonym Ssh (0,25 mg, szare paski) lub kontrolą nośnika bez dodanego Shh (białe paski) przez 30 min i następnie poddano analizie w oznaczeniu C3HT101/2.

Figura 7. Analiza Shh w oznaczeniu wiązania receptora. Względną siłę wiązania Shh rozpuszczalnego (6) i zakotwiczonego (8) do wiązania patched oceniano za pomocą analizy FACS na komórkach EBNA-293 transfekowanych patched. Rozcieńczenia seryjne badanych próbek inkubowano z komórkami EBNA-293, płukano i następnie procent wiązania mierzono przez zdolność próbek do współzawodniczenia z Shh-lg w wiązaniu do komórek. Związany Shh-lg oznaczano ilościowo za pomocą

PL 197 833 B1 średniej fluorescencji stosując do czytania znakowaną FITC sondę przeciwciała anty-lg. Dane dopasowywano do krzywej hiperbolicznej za pomocą nieliniowej regresji.

Figura 8. Przyrównanie N-końca ludzkich białek hedgehog. Białka ludzkie hedgehog 20 kDa (Sonic „Shh”, Desert „Duh” i Indian „Ihh”) są przyrównane odnośnie swej N-końcowej cysteiny (Cys-2 w dojrzałej sekwencji). Ta cysteina jest normalnie Cys-24 w białku prekursorze Shh pełnej długości ze względu na obecność naturalnej sekwencji sygnałowej, która jest usuwana w czasie sekrecji. Aktualna pozycja cysteiny może się zmieniać nieznacznie w zależności od różnic gatunkowych.

Figura 9. Sekwencja najwyższej zgodności N-końcowego fragmentu ludzkich białek hedgehog.

Figura 10. Wpływ długości łańcucha lipidowego na aktywny ludzki Sonic hedgehog. Seria białek hedgehog modyfikowanych kwasami tłuszczowymi syntetyzowano według niniejszego wynalazku i testowano wpływ długości kwasu tłuszczowego na aktywność hedgehog stosując oznaczenie indukcji fosfatazy alkalicznej C3H10T1/2 tu opisane. Wyniki wykreślono jako histogram.

Figura 11. Oznaczenie C3H10T1/2 palmityloilowanego, mirystoilowanego, lauroillowanego, dekanoilowanego i oktanoilowanego ludzkiego Sonic hedgehog. Palmitoilowany, mirystoilowany, lauroilowany, dekanoilowany i oktanoilowany ludzki Sonic hedgehog sformułowany w 5 MM Na2HPO4, pH 5,5, 150 mM NaCI, 1% oktyloglukozyd, 0,5 mM DTT, i mirystoliowany ludzki sonic hedgehog, formułowany w 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT, oznaczano na komórkach C3H10T1/2 stosując indukcję alkalicznej fosfatazy. Liczby oznaczają średnie podwójnych oznaczeń. Seria 3-krotnych oznaczeń palmitoilowanego (Ο), mirystoilowanego (•), lauroilowanego (□), dekanoilowanego (), oktanoilowanego (Δ) i niezmodyfikowanego (▲ oraz x) ludzkiego Sonic hedgehog inkubowano z komórkami przez 5 dni i mierzono powstałe poziomy fosfatazy alkalicznej przy 405 nm stosując chromogenny substrat fosforan p-nitrofenolu. Palmitoilowane, mirystoilowane, lauroilowane i dekanoilowane białka oznaczano w jednym doświadczeniu z niemodyfikowanym białkiem przedstawionym jako (▲) podczas gdy oktanoilowane białko badano w innym eksperymencie z niezmodyfikowanym białkiem przedstawionym jako (x). Strzałka na osi y oznacza poziom tła fosfatazy alkalicznej pod nieobecność dodanego białka hedgehog.

Figura 12. Ogólna struktura różnych hydrofobowo modyfikowanych postaci hedgehog. (A) Pochodna tłuszczowa amidu gdzie R = łańcuch węglowodoru kwasu tłuszczowego; (B) pochodna tiazoliny gdzie R = węglowodór (C) podstawienie aminokwasu gdzie R = łańcuch boczny hydrofobowego aminokwasu; (D) pochodna maleimidowa gdzie R = węglowodór; (E) SH = wolny tiol na N-końcowej cysteinie hedgehog dzikiego typu; (F) pochodna jodoacetamidowa gdzie R1 = węglowodór i R2 = albo H albo węglowodór; i (G) tiomorfolinylowa pochodna gdzie R = węglowodór. Dla wszystkich struktur HH = hedgehog.

Figura 13. Względna siła działania różnych hydrofobowo zmodyfikowanych postaci hedgehog w znaczeniu C3H10T1/2. EC50 (2 pg/ml) niezmodyfikowanego ludzkiego Sonic hedgehog jest opisane jako 1 x. Siła działania pozostałych białek jest wyrażana jako stosunek EC50 białka typu dzikiego podzielona przez EC50 białka zmodyfikowanego. Modyfikacje są na N-końcu białka, o ile nie podano inaczej.

Figura 14. Względna siła działania niezmodyfikowanego, mirystoilowanego, i mutanta CIII ludzkiego Sonic hedgehog w indukowanym malonianem oznaczeniu uszkodzenia prążkowia. Figura przedstawia zmniejszenie objętości uszkodzeń indukowanych przez malonian która wynika z podania albo niezmodyfikowanego, myristoilowanego lub mutanta CIII ludzkiego Sonic hedgehog do prążkowia szczura.

Figura 15 ilustruje specyficzne aktywności polipeptydów hedgehog modyfikowanych maleimidem i nie modyfikowanych.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek jest częściowo oparty na odkryciu, że ludzki Sonic hedgehog, wyrażany jako konstrukt pełnej długości w komórkach owadzich lub ssaczych, ma hydrofobową grupę palmitoilową przyłączoną do aaminy N-końcowej cysteiny. To jest pierwszy przykład zdaniem wynalazców, zewnątrzkomórkowego białka sygnalizującego modyfikowanego w taki sposób i w przeciwieństwie do połączonego z tiolem kwasu palmitylowego, którym modyfikacja jest łatwo usuwana, ta nowa N-połączona reszta palmitoilowa ma szansę być bardzo stabilna przez analogię z modyfikacją kwasem mirystylowym.

Jako bezpośrednią konsekwencję tego wstępnego odkrycia, wynalazcy stwierdzili, że zwiększenie hydrofobowej natury białka sygnalizującego może zwiększyć aktywność biologiczną białka. W szczególności, wynalazcy wykryli, że dodanie hydrofobowej reszty do białka sygnalizującego takiego jak białko hedgehog może zwiększyć aktywność białka. Wynalazcy stwierdzili, że N-końcowa cysteina biologicznie czynnych białek nie tylko dostarcza wygodne miejsce do dodania reszty hydrofobowej, w ten sposób modyfikując fizykochemiczne właściwości białka, ale modyfikacje N-końcowej

PL 197 833 B1 cysteiny mogą też zwiększyć stabilność białka. Dodatkowo, dodanie hydrofobowej reszty do reszty aminokwasu wewnętrznego na powierzchni struktury białka zwiększa aktywność białka. Jako przykład stosujemy nasze odkrycie hydrofobowych (tzn. lipidami i hydrofobowymi aminokwasami) modyfikacji białka hedgehog.

Jeden aspekt niniejszego wynalazku jest nakierowany na odkrycie, że oprócz efektów widzianych po dodaniu cholesterolu do C-końca zewnątrzkomórkowych fragmentów białka przynajmniej pewne z aktywności biologicznych produktów genu hedgehog są niespodziewanie wzmocnione przez podstawienie białka lipofilowymi resztami w innych miejscach białka i/lub które są zmodyfikowane w takich końcowych resztach lipofilowymi resztami innymi niż sterol na C-końcu lub kwas tłuszczowy na N-końcu.

Jak opisano w publikacjach PCT WO 95/18856 i WO 96/17924 (z których wszystkie są tu wyraźnie włączone w postaci odniesienia) polipeptydy hedgehog są na ogół pożyteczne w naprawie i/lub regulacji in vitro i in vivo funkcjonalnego działania szerokiego zakresu komórek, tkanek i narządów, i mają terapeutyczne zastosowania w zakresie od neuroprotekcji, neuroregeneracji, wzmagania działania nerwów, regulacji tworzenia kości i chrząstki i naprawy, regulacji spermatogenezy, regulacji płuc, wątroby i innych narządów powstających z jelita pierwotnego, regulację funkcji hematopoetycznych itd. Tak więc sposoby i kompozycje niniejszego wynalazku obejmują stosowanie podstawionych polipeptydów hedgehog do wszystkich takich zastosowań w jakich implikowano białka hedgehog. Co więcej, omawiane sposoby mogą być przeprowadzone na komórkach, które są dostarczone w hodowli (in vitro) lub komórkach w całym zwierzęciu (in vivo).

W jednym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza farmaceutyczne preparaty zawierające jako składnik czynny polipeptyd hedgehog podstawiony jedną lub więcej reszt lipofilowych jak tu opisano.

Omawiane traktowanie hedgehog jest skuteczne zarówno na ludziach i zwierzętach. Zwierzęta do których wynalazek się stosuje obejmują zarówno domowe zwierzęta i żywy inwentarz, hodowane jako ulubieńcy lub w celach handlowych. Przykładami są psy, koty, bydło, konie, owce, świnie i kozy.

Białka hedgehog są rodziną zewnątrzkomórkowych białek sygnalizacyjnych, które regulują różne aspekty rozwoju zarodkowego zarówno u kręgowców i u bezkręgowców (Przegląd - zobacz 1,2). Najlepiej scharakteryzowane białko hedgehog to Sonic hedgehog (Shh), biorące udział w wytwarzaniu wzoru przód-tył, tworzeniu apikalnej bruzdy ektodermy, mezodermy jelita tylnego, kolumny rdzeniowej, dystalnych kończyn, rozwoju żeber, i rozwoju płuc, i w indukcji brzusznych typów komórek w strunie grzbietowej, tyłomózgowia i przodomózgowia (3-8). Podczas gdy mechanizm działania białka hedgehog nie jest zrozumiany, nowsze dane biochemiczne i genetyczne sugerują, że receptor dla Shh jest produktem genu supresora nowotworów patched (9,10) i że inne białka, smoothened (10,11), Cubitus interruptus (12, 13) i fused (14) biorą udział w szlaku sygnalizacji hedgehog.

Ludzki Shh jest syntetyzowany jako białko prekursorowe 45 kDa, które jest cięte autokatalitycznie dając: (1) N-końcowy fragment 20 kDa, który jest odpowiedzialny za całą znaną aktywność sygnalizacyjną hedgehog (SEQ ID NO:1-4); i (II) C-końcowy fragment 25 kDa, który zawiera aktywność autokatalityczną (15-17). Fragment N-końcowy składa się z reszt aminokwasów 24-197 sekwencji prekursorowej pełnej długości.

N-końcowy fragment pozostaje zasocjowany z błoną podczas dodawania cholesterolu na jego C-końcu (18,19). Cholesterol jest krytyczny dla ograniczenia lokalizacji tkankowej sygnału hedgehog. Dodanie cholesterolu jest katalizowane przez C-końcową domenę w czasie etapu obróbki.

Wszystkie odnośniki cytowane w szczegółowym opisie są, o ile nie podano inaczej, włączone tu w postaci odniesienia.

Definicje

Wynalazek będzie obecnie opisany w odniesieniu do następujących szczegółowych opisów, których następujące definicje są włączone:

„aminokwas” - jest monomeryczną jednostką peptydu, polipeptydu lub białka. W naturalnie występujących peptydach, polipeptydach i białkach jest dwadzieścia aminokwasów, z których wszystkie są L-izomerami. Określenie obejmuje także analogi aminokwasów i D-izomery białkowych aminokwasów i ich analogów.

„białko” - dowolny polimer złożony zasadniczo z dowolnych z 20 aminokwasów. Choć „polipeptyd” jest często stosowany w odniesieniu do stosunkowo dużych polipeptydów, i „peptyd” jest też często stosowany w odniesieniu do małych polipeptydów, stosowanie tych określeń w dziedzinie zachodzi na siebie i jest różne. Określenie „białko” jak jest to tu stosowane dotyczy peptydów, białek i polipeptydów, o ile nie podano inaczej.

PL 197 833 B1 „N-końcowy aminokwas” dotyczy reszty pierwszego aminokwasu (aminokwasu numer 1) jak pokazano w SEQ ID NO: 1-4. Dotyczy to także każdej cysteiny w pozycji 1 dowolnego innego białka, lub funkcjonalnych ekwiwalentów tej cysteiny (zob. Dział IV).

„przerywnik” dotyczy krótkiej sekwencji, która może być tak mała jak pojedynczy aminokwas, który może być wstawiony między aminokwasem, który ma być hydrofobowe modyfikowany (taki jak na przykład N-końcowa cysteina lub funkcjonalny ekwiwalent) i resztą białka. Przerywnik jest zaprojektowany by zapewnić rozdział między hydrofobową modyfikacją (np. modyfikowaną N-końcową cysteiną) i resztą białka tak by zapobiec interferowaniu modyfikacji w działanie białka i/lub by ułatwić modyfikacji (np. N-końcowej cysteinie) połączenie z lipidem, pęcherzykiem, lub inną resztą hydrofobową. Tak więc jeśli białko jest modyfikowane na N-końcowej cysteinie i na aminokwasie w innym miejscu, mogą być dwie, lub więcej, sekwencje przerywnika.

„zakotwiczone” białko - dotyczy hydrofobowo zmodyfikowanego białka według wynalazku.

„multiwalenty kompleks białka” dotyczy szeregu białek (tzn. jednego lub więcej). Lipid lub reszta lipidowa jest przyłączona do przynajmniej jednego z wielu białek. Lipid lub inna reszta lipidowa może dowolnie być w kontakcie z pęcherzykiem. Jeśli białko nie posiada lipidu lub innej reszty hydrofobowej wówczas to białko może być krzyżowo połączone lub związane z białkiem, które ma lipid lub inną resztę hydrofobową.

Każde białko może być takie samo lub różne i każdy lipid lub inna reszta hydrofobowa może być taka sama lub różna.

„pęcherzyk” dotyczy dowolnego agregatu lipofilowych cząsteczek. Pęcherzyk może być uzyskany ze źródła biologicznego (np. dwuwarstwy lipidowej takiej jak błona komórkowa lub otrzymany z pomocą kwasu cholinowego preparat detergentowy) lub ze źródła niebiologicznego (np. niebiologiczny pęcherzyk detergentowy jak opisano w Dziale VI). Kształt, typ i konfiguracja nie ma ograniczać zakresu tego wynalazku.

„funkcjonalny ekwiwalent” reszty aminokwasu (np. N-końcowej cysteiny) jest (i) aminokwasem mających podobne właściwości reaktywne jak reszta aminokwasu, która została zastąpiona przez funkcjonalny ekwiwalent; (ii) aminokwasowy ligand polipeptydu według wynalazku, aminokwas ma podobne właściwości wiązań hydrofobowych (np. lipidowych) reszt jak reszta aminokwasu, która została zastąpiona przez funkcjonalny ekwiwalent; (iii) nie będąca aminokwasem cząsteczka mająca podobne zdolności wiązania reszty hydrofobowej (tzn. lipidowej) jak reszta aminokwasu, która została zastąpiona przez funkcjonalny ekwiwalent.

„fuzja genetyczna” dotyczy kolinearnego, kowalencyjnego połączenia dwóch lub więcej białek lub ich fragmentów poprzez ich indywidualne szkielety peptydowe, poprzez genetyczną ekspresję cząsteczki polinukleotydu kodującej te białka.

„Białko hybrydowe” lub „fuzja białkowa” jest połączeniem pierwszej sekwencji aminokwasów kodującej polipeptyd hedgehog z drugą sekwencją aminokwasów definiującą domenę obcą i nie będącą w znacznym stopniu homologiczną z żadną domeną białka hh. Białko hybrydowe może prezentować obcą domenę, która jest spotykana (choć może w innym białku) u organizmu, który także wyraża pierwsze białko, lub może być „międzygatunkową”, „międzyrodzajową” itd. fuzją struktur białkowych wyrażanych przez różne rodzaje organizmów. Ogólnie, fuzja białkowa może być przedstawiona przez ogólny wzór (X)n-(hh)_m-(Y)_m gdzie hh przedstawia całe lub część białka hedgehog, X i Y niezależnie przedstawiają sekwencje aminokwasów, które nie są naturalnie spotykane jako ciągły łańcuch polipeptydowy z sekwencją hedgehog, m jest liczbą całkowitą większą lub równą 1, i każde wystąpienie n jest niezależnie 0 lub liczbą całkowitą większą lub równą 1 (n i m są korzystnie nie większe niż 5 lub 10).

„mutant” - każda zmiana w materiale genetycznym organizmu, w szczególnie dowolna zmiana sekwencji polinukleotydowej typu dzikiego lub dowolna zmiana w białku typu dzikiego.

„typ dziki” - naturalnie występująca polinukleotydowa sekwencja eksonu białka, lub jego części, lub sekwencji białka, lub jego części, odpowiednio jak normalnie występuje in vivo.

„standardowe warunki hybrydyzacji” - warunki soli i temperatury znacząco równoważne do 0,5 x SSC do około 5 x SSC i 65°C do zarówno hybrydyzacji i płukania. Określenie „standaryzowane warunki hybrydyzacji” jak jest tu stosowane jest operacyjną definicją i obejmuje zakres warunków hybrydyzacji. Zobacz też Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Nowy Jork, działy 6.3.1-6.3.6 (1989).

„sekwencja kontroli ekspresji” - sekwencja polinukleotydów, która kontroluje i reguluje ekspresję genów, gdy jest funkcjonalnie połączona do tych genów.

PL 197 833 B1 „funkcjonalnie połączona” - sekwencja polinukleotydowa (DNA, RNA) jest funkcjonalnie połączona z sekwencją kontroli ekspresji gdy ta sekwencja kontroli ekspresji kontroluje i reguluje transkrypcję i translację sekwencji polinukleotydowej. Określenie „funkcjonalnie połączona” obejmuje posiadanie odpowiedniego sygnału start (np. ATG) przed sekwencją polinukleotydową, która ma ulec ekspresji pod kontrolą sekwencji kontroli ekspresji, i produkcją pożądanego polipeptydu kodowanego przez sekwencję polinukleotydową.

„wektor ekspresyjny” - polinukleotyd taki jak plazmid lub fag DNA (między innymi powszechnymi przykładami), który pozwala na ekspresję przynajmniej jednego genu gdy wektor ekspresyjny jest wprowadzony do komórki gospodarza. Wektor może być zdolny do replikacji w komórce lub nie.

„Wyizolowany” (stosowany zamiennie z „zasadniczo czysty”) gdy jest stosowany do kwasu nukleinowego np. sekwencji polinukleotydowych, które kodują polipeptydy, oznacza polinukleotyd RNA lub DNA, część genomowego polinukleotydu, cDNA lub syntetyczny polinukleotyd, który ze względu na swoje pochodzenie lub manipulację: (i) nie jest połączony z całością polinukleotydu, z którą jest połączony w naturze (np. jest obecny w komórce gospodarza jako wektor ekspresyjny, lub jego część); lub (ii) jest połączony z kwasem nukleinowym lub inną resztą chemiczną inną niż ta, z którą jest połączony w naturze; lub (iii) nie występuje w naturze. Przez „wyizolowany” dalej rozumie się sekwencję polinukleotydową, która jest: (i) amplifikowana in vitro przez na przykład reakcję łańcuchową polimerazy (PCR); (ii) syntetyzowana chemicznie; (iii) produkowana technikami rekombinacji poprzez klonowanie; lub (iv) oczyszczana, jak przez trawienie i rozdział na żelu.

Tak więc „zasadniczo czysty kwas nukleinowy” jest kwasem nukleinowym, który nie przylega bezpośrednio do jednej lub obu sekwencji kodujących do których normalnie przylega w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego kwas nukleinowy pochodzi. Zasadniczo czysty DNA także obejmuje zrekombinowany DNA, który jest częścią hybrydowego genu zawierającego dodatkowe sekwencje hedgehog.

„Wyizolowany” (stosowany zamiennie z „zasadniczo czysty”) gdy jest stosowany do polipeptydów oznacza polipeptyd lub jego część, który ze względu na swoje pochodzenie lub manipulację: (i) jest obecny w komórce gospodarza jako produkt ekspresji lub część wektora ekspresyjnego; lub (ii) jest połączony z białkiem lub inną resztą chemiczną inną niż ta, z którą jest połączony w naturze; lub (iii) nie występuje w jiatuuze. na przykład białko, które j est chemicznie nie lub dodanie przynajmniej jednej reszty hydrofobowej do białka, tak że białko jest w postaci nie spotykanej w naturze. Przez „wyizolowany” dalej rozumie się białko, które jest: (i) syntetyzowane chemicznie; lub (ii) wyrażane w komórce gospodarza i oczyszczane od zasocjowanych i zanieczyszczających białek. Określenie oznacza na ogół polipeptyd, który był oddzielony od innych białek i kwasów nukleinowych, z którymi naturalnie występuje. Korzystnie polipeptyd jest też oddzielony od substancji takich jak przeciwciała lub macierze żelowe (poliakryloamid), które są stosowane do oczyszczania go.

„Heterologiczny promotor” jak jest tu stosowane jest promotorem, który nie jest naturalnie zasocjowany z genem lub oczyszczonym kwasem nukleinowym.

„Homologiczny” jak jest tu stosowane jest synonimem określenia „identyczny” i dotyczy podobieństwa sekwencji między dwoma peptydami, cząsteczkami lub dwoma kwasami nukleinowymi. Gdy pozycja w obu porównywanych sekwencjach jest zajmowana przez tę samą monomeryczną podjednostkę zasady lub aminokwasu (na przykład gdy pozycja w każdej z dwóch cząsteczek DNA jest zajmowana przez adeninę, lub pozycja w każdym z dwóch polipeptydów jest zajmowana przez lizynę) wówczas odpowiednie cząsteczki są homologiczne w tej pozycji. Procent homologii między dwiema sekwencjami jest funkcją liczby pasujących lub homologicznych pozycji wspólnych dla obu cząsteczek podzieloną przez liczbę porównywanych pozycji x 100. Na przykład jeśli 6 z 10 pozycji w dwóch sekwencjach jest dopasowanych lub są homologiczne wówczas dwie sekwencje mają 60% homologii. Dla przykładu, sekwencje DNA CTGACT i CAGGTT mają 50% homologii (3 z wszystkich 6 pozycji są dopasowane). Na ogół porównania dokonuje się gdy dwie sekwencje są przyrównane by dać maksimum homologii. Takie przyrównania można dostarczyć stosując, na przykład, metodę według Needleman i wsp., J. Mol. Biol. 48:443-454 (1970) wprowadzaną w wygodny sposób za pomocą programów komputerowych takich jak program Align (DNAstar, Inc.). Homologiczne sekwencje mają wspólne identyczne lub podobne reszty aminokwasów, gdzie podobne reszty są konserwatywnymi podstawieniami za, lub „dozwolonymi mutacjami punktowymi” odpowiednich reszt aminokwasów w przyrównanej sekwencji referencyjnej. Pod tym względem, „konserwatywne podstawienie” reszty w sekwencji referencyjnej to takie substytucje, które są fizycznie lub funkcjonalnie podobne do odpowiednich reszt

PL 197 833 B1 referencyjnych np. mają podobną wielkość, kształt, ładunek elektryczny, właściwości chemiczne, w tym zdolność do tworzenia wiązań kowalencyjnych lub wodorowych, lub tym podobne. Szczególnie korzystne substytucje to te spełniające kryteria zdefiniowane dla „akceptowanej mutacji punktowej” w Dayhoff i wsp., 5 Atlas of Protein Sequences and Structure, 5, Suppl.3, rozdz. 22, 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Waszyngton, D.C. (1978).

„Białko hedgehog” lub „polipeptyd hedgehog”, jako że określenia stosowane są wymiennie, według wynalazku jest definiowany jako mający przynajmniej część, która składa się z sekwencji najwyższej zgodności SEQ ID NO: 4. Określenie oznacza też polipeptyd hedgehog lub funkcjonalny wariant polipeptydu hedgehog, homolog polipeptydu hedgehog, lub funkcjonalny wariant, który ma aktywność biologiczną. W szczególności określenie obejmuje preparaty białek hedgehog i ich peptydylowe fragmenty, zarówno postacie agonistów i antagonistów co stanie się jasne w konkretnym kontekście. Jak jest to tu stosowane określenie „bioaktywne fragmenty białka hedgehog” dotyczy fragmentu polipeptydu hedgehog o pełnej długości, znamiennego tym, że fragment specyficznie agonizuje lub antagonizuje indukcyjne zdarzenia, w których biorą udział białka hedgehog typu dzikiego. Bioaktywny fragment hedgehog korzystnie jest rozpuszczalną zewnątrzkomórkową częścią białka hedgehog, gdzie rozpuszczalność jest w odniesieniu do fizjologicznie kompatybilnych roztworów. Przykładowe fragmenty bioaktywne są opisane w publikacjach PCT WO 95/18856 i WO 96/17924. W korzystnej postaci polipeptydy hedgehog niniejszego wynalazku wiążą się z białkiem patched.

Określenie „odpowiada” gdy odnosi się do danej sekwencji polipeptydu lub kwasu nukleinowego ma oznaczać, że interesująca sekwencja jest identyczna lub homologiczna do sekwencji referencyjnej, której ma odpowiadać.

Określenia „peptyd(y)”, „białko (białka)” i „polipeptyd(y)” jest tu stosowane wymiennie. Określenie „sekwencja polinukleotydowa” i „sekwencja nukleotydowa” są też tu stosowane wymiennie. Określenie „fragment Hedgehog” i „N-końcowy fragment Hedgehog” są stosowane wymiennie z „Hedgehog”.

Cząsteczka hedgehog ma „aktywność biologiczną” jeśli ma przynajmniej jedną z następujących właściwości: (i) cząsteczka spełnia kryteria konsensusu hedgehog jak tu zdefiniowano (SEQ ID NO: 4) i ma zdolność do wiązania do jego receptora, patched, lub koduje po ekspresji, polipeptyd, który ma tę cechę; (ii) cząsteczka spełnia kryteria konsensusu hedgehog jak tu zdefiniowano lub koduje, po ekspresji, polipeptyd, który ma tę cechę; i (iii) może indukować aktywność fosfatazy alkalicznej w komórkach C3H10T1/2. Ogólnie dowolne białko ma „aktywność biologiczną” jeśli białko ma in vitro efekty, cechy lub właściwości, które osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie by rozpoznały jako będące reprezentacyjne dla, lub zgodne z, lub rozsądnie przewidujące, efekty in vivo białka.

Określenie „hydrofobowy” dotyczy tendencji cząsteczek z niepolarnymi atomami do oddziaływania ze sobą raczej niż z wodą lub innymi atomami polarnymi. Materiały, które są hydrofobowe, są w większości nierozpuszczalne w wodzie. Naturalne produkty z właściwościami hydrofobowymi obejmują lipidy, kwasy tłuszczowe, fosfolipidy, sfingolipidy, acyloglicerole, woski, sterole, steroidy, terpeny, prostaglandyny, tromboksany, leukotrieny, izoprenoidy, retinoidy, biotynę i hydrofobowe aminokwasy takie jak tryptofan, fenyloalanina, izoleucyna, leucyna, walina, metionina alanina, prolina i tyrozyna. Chemiczna reszta jest też hydrofobowa lub ma właściwości hydrofobowe jeśli jej właściwości fizyczne są określane przez obecność atomów niepolarnych. Określenie obejmuje grupy lipofilowe.

Określenie „grupa lipofilowa” w kontekście bycia połączonym z polipeptydem, dotyczy grupy mającej wysoką zawartość węglowodorów w ten sposób dając grupie względnie wysokie powinowactwo do fazy lipidowej. Grupa lipofilowa może na przykład być względnie długołańcuchową alkilową lub cykloalkilową (korzystnie n-alkilową) grupą mającą około 7 do 30 węgli. Grupa alkilowa może się kończyć „ogonem” hydroksy lub pierwszorzędowej aminy. Aby dalej to zilustrować, cząsteczki lipofilowe obejmują naturalnie występujące i syntetyczne aromatyczne i niearomatyczne reszty takie jak adamantan i buckminsterfullereny, i aromatyczne węglowodory takie jak benzen, perylen, fenantren, antracen, naftalen, piren, chrysen i naftacen.

Określenie „wewnętrzny aminokwas” oznacza dowolny aminokwas w sekwencji peptydu, który nie jest ani N-końcowym aminokwasem ani C-końcowym aminokwasem.

Określenie „powierzchniowy aminokwas” oznacza dowolny aminokwas, który jest eksponowany na rozpuszczalnik gdy białko jest zwinięte do formy natywnej.

Określenie „zewnątrzkomórkowe białko sygnalizujące” oznacza dowolne białko, które jest albo wydzielane z komórki, albo zakotwiczone do zewnętrza komórki i po wiązaniu receptora dla tego białka na komórce docelowej inicjuje odpowiedź w komórce docelowej.

PL 197 833 B1 „Skuteczna ilość” np. polipeptydu grupy hedgehog odnośnie omawianych metod leczenia, dotyczy ilości polipeptydu w preparacie, która gdy jest stosowana jako część pożądanego sposobu podawania dawki powoduje np. zmianę w tempie proliferacji komórek i/lub stanie zróżnicowania komórki i/lub częstości przeżycia komórki według klinicznie akceptowalnych standardów dla choroby, która ma być leczona lub celu kosmetycznego.

„Pacjent” lub „osobnik”, który ma być leczony za pomocą omawianego sposobu może oznaczać człowieka lub zwierzę nie będące człowiekiem.

„Stan wzrostu” komórki dotyczy tempa proliferacji komórki i stanu zróżnicowania komórki.

Praktyka niniejszego wynalazku będzie stosować, o ile nie jest wskazane inaczej, konwencjonalne techniki biologii komórkowej, hodowli komórek, biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinowanego DNA, chemii białek, i immunologii, które są w zakresie umiejętności w dziedzinie. Takie techniki są opisane w literaturze.

II. Ogólne właściwości wyizolowanych białek hedehog

Część polipeptydowa kompozycji hedgehog opisywanego sposobu może być wygenerowana za pomocą dowolnej z różnych technik, w tym oczyszczania naturalnie występujących białek, białek wyprodukowanych technikami rekombinacji, i syntetycznej chemii. Postacie polipeptydowe terapeutyków hedgehog pochodzą korzystnie z białek hedgehog kręgowców, np. mają sekwencje odpowiadające naturalnie występującym białkom hedgehog lub ich fragmentom z organizmów kręgowców. Jednak będzie docenione, że polipeptyd hedgehog może odpowiadać białku hedgehog (lub jego fragmentowi), który występuje w dowolnym organizmie z metazoa.

Wyizolowane białka hedgehog stosowane w sposobach niniejszego wynalazku są naturalnie występującymi lub zrekombinowanymi białkami rodziny hedgehog i mogą być do uzyskania z bezkręgowców albo z kręgowców (zob. odnośniki poniżej). Członkowie rodziny białek hedgehog kręgowców mają homologię z białkami kodowanymi przez gen hedgehog Drosophila (hh) (33). Dotychczas połączone przeszukiwanie bibliotek DNA genomowego i cDNA myszy wykryło trzy ssacze odpowiedniki hh określane jako Sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh), i Desert hedgehog (Dhh), które też istnieją u innych ssaków, w tym u człowieka, jak i u ryb i ptaków. Inni członkowie obejmują Moonrat hedgehog (Mhh) jak i Sonic hh kurczęcia i Sonic hh ryby Brachydanio rerio.

Geny Shh myszy i kurczęcia i mysie geny Ihh kodują glikoproteiny, które poddawane są cięciu, dając N-końcowy fragment około 20 kDa (zob. Figura 8) i C-końcowy fragment o wielkości około 25 kDa. Najbardziej korzystny fragment 20 kDa ma sekwencję najwyższej zgodności SEQ ID NO: 4 i zawiera sekwencje aminokwasów SEQ ID NO: 1-3. Różne inne fragmenty, które obejmują resztę 20 kDa są rozważane w obrębie obecnie zastrzeganego wynalazku. Publikacje ujawniające te sekwencje jak i ich właściwości chemiczne i fizyczne obejmują (34-38), Zgłoszenia Patentowe PCT WO 95/23223 (Jessell, Dodd, Roelink i Edlund). WO 95/18856 (Ingham, McMahon i Tabin) i WO 96/17924 (Beachy i wsp.).

Członkowie rodziny pożyteczni w sposobach wynalazku obejmują dowolne z naturalnie występujących białek hedgehog obejmując alleliczne, filogenetyczne odpowiedniki lub inne ich warianty, czy ze źródeł naturalnych czy wyprodukowane chemicznie w tym muteiny lub zmutowane białka, jak i zrekombinowane postacie i nowych aktywnych członków rodziny hedgehog. Szczególnie użyteczne polipeptydy hedgehog obejmują SEQ ID NO: 1-4.

Izolowane polipeptydy hedgehog stosowane w sposobie według wynalazku mają aktywność biologiczną. Polipeptydy zawierają sekwencję aminokwasów homologiczną przynajmniej 60%, 80%, 90%, 95%, 98% lub 99% do sekwencji aminokwasów z SEQ ID NO: 1-4. Polipeptyd może też zawierać sekwencję aminokwasów zasadniczo taką samą jak sekwencja aminokwasów w SEQ ID NO: 1-4. Polipeptyd ma przynajmniej 5, 10, 20, 50, 100, lub 150 aminokwasów długości i zawiera przynajmniej 5, korzystnie przynajmniej 10, bardziej korzystnie przynajmniej 20, bardziej korzystnie przynajmniej 50, 100 lub 150 ciągłych aminokwasów z SEQ ID NO: 1-4.

Korzystne polipeptydy według wynalazku zawierają sekwencję polipeptydu hedgehog jak i inne N-końcowe i/lub C-końcowe sekwencje aminokwasów. Wyizolowany polipeptyd hedgehog może też być zrekombinowaną fuzją białkową mającą pierwszą część polipeptydu hedgehog i drugą część polipeptydu np. drugą część polipeptydu mającą sekwencję aminokwasów niespokrewnioną z hedgehog. Druga część polipeptydu może być np. znacznikiem histydynowym, białkiem wiążącym maltozę, glutationylo-S-transferazą, domeną wiążącą DNA lub domeną aktywującą polimerazę.

Polipeptydy wynalazku obejmują te, które powstają w wyniku istnienia wielokrotnych genów, zjawisk alternatywnej transkrypcji, alternatywnego składania RNA, i zdarzeń alternatywnej obróbki translacyjnej i potranslacyjnej. Polipeptyd może być całkowicie sporządzony za pomocą sposobów

PL 197 833 B1 syntetycznych lub może być wyrażany w systemach np. komórkach w hodowli, które w efekcie dają zasadniczo te same potranslacyjne modyfikacje obecne gdy białko ulega ekspresji w natywnej komórce, lub w systemach, które powodują pomijanie potranslacyjnych modyfikacji obecnych przy ekspresji w natywnej komórce.

W korzystnej postaci wyizolowany hedgehog jest polipeptydem hedgehog z jedną lub więcej z następujących cech:

(i) ma prr^z^rn^jrmn^j 30, 40, 42, 50, 60, 70, 80, 90 I ub95% i dentyczności sekwencjj z aminokwasami z SEQ ID NO: 1-4;

(ii) ma cysteinę lub jej funkcjonalny ekwiwalent na N-końcu;

(iii) może indukować aktywność fosfatazy alkalicznej w komórkach C3HWT1/2;

(iv) maogólną I dennyczriość sekwoi-myj przynarmniej 50%, korzystnie przynarmniej 60%, bardziee korzystnie przynajmniej 7,, 8,, 9, lub 95% z polipeptydem z SEQ ID NO: 1-4;

(v) może być wyizolowany z naturalnych źródeł takich jak komórki ssaków;

(vi) może wiązać lub oddziaływać z patched;

(vii) jest modyfikowany hydrofobowo (tzn. ma przynajmniej jedną resztą hydrofobową przyłączoną do polipeptydu).

III. Inne białka

Ponieważ istnieją techniki dla inżynierii reszty cysteinowej (lub jej funkcjonalnego ekwiwalentu) do pierwszorzędowej sekwencji polipeptydu, w zasadzie dowolne białko może być przekształcone do postaci modyfikowanej hydrofobowo stosując tu opisane sposoby.

Receptory wirusowe, receptory komórkowe, i ligandy komórek są pożyteczne ponieważ wiążą się typowo do komórek lub tkanek mających wiele kopii receptora. Pożyteczne receptory wirusów na komórkach, które mogą być razem kompleksowane stosując sposoby tego wynalazku obejmują ICAM1, receptor rinowirusa; CD2, receptor wirusa Epsteina-Barra; i CD4, receptor ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Inne białka obejmują członków rodziny cząsteczek adhezji komórkowej, takich jak ELAM-1 i VCAM-1 i VCAM-1b i ich odpowiedniki limfocytowe (ligandy); antygeny związane z limfocytami LFA1, LFA2 (CD2) i LFA3 (CD58), CD59 (drugi ligand CD2), członkowie rodziny CD11/CD18 i bardzo późne antygeny takie jak VLA4 i ich ligandy.

Immunogeny z różnych patogenów (np. z bakterii, grzybów, wirusów i innych pasożytów eukariotycznych) mogą być też stosowane w polipeptydach w sposobach według wynalazku. Bakteryjne immunogeny obejmują, ale nie ograniczają się do, źródła bakteryjne odpowiedzialne za bakteryjne zapalenie płuc i zapalenie płuc powodowane przez pneumocystis. Pasożytnicze źródła obejmują pasożyt malarii Plasmodium. Wirusowe źródła obejmują wirus ospy (np. ospę krowiankę, opryszczkę, cytomegalowirus), adenowirusy, papowawirusy (np. wirusy brodawczaka), parwowirusy (np. wirus związany z adeno), retrowirusy (np. HTLV l, HTLV II, HIV 1 i HIV II) i inne. Immunoglobuliny lub ich fragmenty mogą też być polipeptydami, które mogą być zmodyfikowane według wynalazku. Można generować monoklonalne fragmenty Fab rozpoznające specyficzne antygeny stosując metody konwencjonalne (49) i stosować indywidualne domeny Fab jako reszty funkcjonalne w multimerycznych konstruktach według tego wynalazku. Inne użyteczne białka obejmują gelsoliną (59), cytokiny, w tym różne interferony (interferon-α, interferon-β i interferon-γ); różne interleukiny (np. IL-1, -2, -3, -4 i tym podobne); czynniki martwicy guzów a i b, czynnik stymulujący kolonie monocytów (M-CSF), czynnik stymulujący kolonie granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący kolonie granulocytarnych makrofagów (GM-CSF), erytropoetynę, czynnik wzrostu pochodzący od płytek krwi (PDGF), i ludzkie i zwierzęce hormony, w tym wzrostowy i insulinę.

Ogólnie struktura modyfikowanych białek według wynalazku ma ogólny wzór A-Cys-[Sp]-B-[Sp]-X, gdzie A jest resztą hydrofobową; Cys jest cysteiną lub jej funkcjonalnym ekwiwalentem; [Sp] jest sekwencją dowolnego peptydowego przerywnika; B jest białkiem (które może mieć dowolnie dodatkową sekwencję przerywnika jak pokazano); i X jest hydrofobową resztą połączoną (dowolnie poprzez białko przerywnika) z C-końcem białka lub innym miejscem na powierzchni białka, gdzie podstawione białko zawiera przynajmniej jedno A lub X. Jeśli X jest cholesterolem, B może być, lub nie, białkiem hedgehog. Jak dyskutowano powyżej celem przerywnika jest zapewnienie oddzielenia reszty hydrofobowej od pozostałego białka tak by ułatwić reszcie hydrofobowej (np. modyfikowanej N-końcowej cysteinie) połączenie się z inną resztą, która może być lipidem lub pęcherzykiem. Przerywnik ma też na celu uczynić trudniejszym interferencją przez modyfikację z funkcją białka. Przerywnik może być tak mały jak pojedynczy aminokwas. Na ogół proliny i glicyny są korzystne. Szczególnie korzystna sekwencja przerywnika pochodzi z Sonic hedhegog i składa się z sekwencji aminokwasów O-P-G-R.

PL 197 833 B1

IV. Produkcja zrekombinowanych polipeptydów

Wyizolowane peptydy tu opisane mogą być wyprodukowane za pomocą dowolnego odpowiedniego sposobu znanego w dziedzinie. Takie sposoby są w zakresie od bezpośrednich sposobów syntezy białka do konstrukcji sekwencji DNA kodujących sekwencje wyizolowanego polipeptydu i wyrażających te sekwencje w odpowiednim transformowanym gospodarzu.

W jednej postaci sposobu rekombinacyjnego, konstruuje się sekwencję DNA przez izolację lub syntezę sekwencji DNA kodującej interesujące białko typu dzikiego. Dowolnie sekwencja może być mutagenizowana za pomocą mutagenezy ukierunkowanej aby dostarczyć jej funkcjonalne analogi. Zobacz m.in. (40) i Patent USA 4,588,585. Inny sposób konstrukcji sekwencji DNA kodującej interesujący polipeptyd byłby za pomocą syntezy chemicznej stosując syntetyzator oligonukleotydów. Takie oligonukleotydy mogą być korzystnie zaprojektowane w oparciu o sekwencję aminokwasów pożądanego polipeptydu i korzystnie wybierając te kodony, które są korzystne w komórce gospodarza w której rekombinowany interesujący polipeptyd będzie syntetyzowany.

Można zastosować standardowe sposoby do syntezy wyizolowanej sekwencji polinukleotydu kodującej interesujący wyizolowany polipeptyd. Na przykład można zastosować całkowitą sekwencję aminokwasów do konstrukcji genu po translacji wstecznej. Zobacz Maniatis i wsp., powyżej. Dalej, można zsyntetyzować oligomer DNA zawierający sekwencję nukleotydów kodującą dany wyizolowany polipeptyd. Na przykład kilka małych oligonukleotydów kodujących części pożądanego polipeptydu mogą być zsyntetyzowane a następnie zligowane. Poszczególne nukleotydy typowo zawierają sekwencje 5' lub 3' przedłużone dla łączenia komplementarnego.

Po połączeniu (poprzez syntezę, mutagenezę ukierunkowaną lub innym sposobem) zmutowane sekwencje DNA kodujące dany interesujący wyizolowany polipeptyd będą wstawione do wektora ekspresyjnego i funkcjonalnie połączone z sekwencją kontroli ekspresji odpowiednią do ekspresji białka w pożądanym gospodarzu. Odpowiednie złożenie może być potwierdzone przez sekwencjonowanie nukleotydów, mapowanie restrykcyjne, i ekspresje biologicznie czynnego polipeptydu w odpowiednim gospodarzu. Jak dobrze wiadomo w dziedzinie, aby uzyskać wysokie poziomy ekspresji transfekowanego genu w gospodarzu gen musi być funkcjonalnie połączony z sekwencjami kontroli transkrypcji i translacji, które są funkcjonalne w wybranym do ekspresji gospodarzu.

Wybór sekwencji do kontroli ekspresji i wektora ekspresyjnego będzie zależeć od wyboru gospodarza. Może być stosowany szeroki zestaw kombinacji gospodarz ekspresyjny/wektor. Użyteczne wektory ekspresyjne dla gospodarzy eukariotycznych obejmują na przykład wektory zawierające sekwencje kontroli ekspresji z SV40, wirusa brodawczaka bydlęcego, adenowirua i cytomegalowirusa. Użyteczne wektory ekspresyjne dla gospodarzy prokariotycznych obejmują na przykład znane plazmidy bakteryjne, takie jak plazmidy z Escherichia coli, w tym pCR1, pBR322, pMB9 i ich pochodne, plazmidy o szerszym zakresie gospodarza takie jak M13 i nitkowate jednoniciowe fagi DNA. Korzystne wektory E. coli obejmują wektory pl zawierające promotor pL faga lambda (Patent US 4,874,702), wektory pET zawierające promotor polimerazy T7 (Studier i wsp., Methods in Enzymology 185: 60-89, 1990 1) i wektor pSP72 (Kaelin i wsp., powyżej). Użyteczne wektory ekspresyjne w komórkach drożdży na przykład obejmują plazmidy 2T i centromerowe.

Dodatkowo dowolna z szerokiego zakresu sekwencji kontroli ekspresji może być stosowana w tych wektorach. Takie użyteczne sekwencje kontroli ekspresji obejmują sekwencje kontroli ekspresji zawiązane z genami struktury uprzednich wektorów ekspresyjnych. Przykłady użytecznych sekwencji kontroli ekspresji obejmują na przykład wczesne i późne promotory SV40 lub adenowirusa, układ lac, układ trp, układ TAC lub TRC, regiony głównego operatora i promotora faga lambda, na przykład pL, regiony kontroli białka płaszcza fd, promotor dla kinazy 3-fosfoglicerynianu lub innych enzymów glikolitycznych, promotory kwaśnej fosfatazy np. Pho5, promotory układu koniugacji drożdży α i inne sekwencje o których wiadomo, że kontrolują ekspresję genów komórek prokariotycznych lub eukariotycznych i ich wirusów i ich różnych kombinacji.

Może być stosowany dowolny odpowiedni gospodarz aby produkować w dużych ilościach tu opisane wyizolowane polipeptydy hedgehog, w tym bakterie, grzyby (w tym drożdże), rośliny, owady, ssaki, lub inne odpowiednie komórki zwierzęce lub linie komórkowe jak i transgeniczne zwierzęta lub rośliny. Bardziej szczegółowo gospodarze ci mogą obejmować dobrze znanych gospodarzy eukariotycznych i prokariotycznych takich jak szczepy E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, grzyby, drożdże (np. Hansenula), komórki owadów takich jak Spodoptera frugiperda (SF9) i High Five™ (zob. Przykład 1), komórki zwierzęce takie jak jajnik chomika chińskiego (CHO), komórki myszy takie jak

PL 197 833 B1 komórki NS/O, komórki zielonego makaka afrykańskiego COS1, COS7, BSC1, BSC 40, BMT 10 i komórki ludzkie jak i komórki roślinne.

Powinno być zrozumiane, że nie wszystkie wektory i sekwencje kontroli ekspresji będą działały równie dobrze z tym samym układem ekspresyjnym. Jednak osoba biegła w dziedzinie może dokonać wyboru wśród tych wektorów, układów kontroli ekspresji i gospodarzy bez nadmiernego przeprowadzania doświadczeń. Na przykład aby wyprodukować wyizolowany interesujący polipeptyd w hodowli zwierzęcej na dużą skalę musi być kontrolowana liczba kopii wektora ekspresyjnego. Amplifikowalne wektory są dobrze znane w dziedzinie. Zob. na przykład (41) i patenty US 4,470,461 i 5,122,464.

Takie funkcjonalne połączenie sekwencji DNA do sekwencji kontroli ekspresji obejmuje dostarczenie sygnału startu translacji we właściwej ramce odczytu powyżej sekwencji DNA. Jeśli dana sekwencja DNA ulegająca ekspresji nie rozpoczyna się od metioniny sygnał start da w efekcie dodatkowy aminokwas (metioninę) położoną na N-końcu produktu. Jeśli hydrofobowa reszta ma być przyłączona do białka zawierającego na N-końcu metioninę, białko może być stosowane bezpośrednio w kompozycji wynalazku. Jednak ponieważ korzystny N-koniec białka ma się składać z cysteiny (lub jej funkcjonalnego ekwiwalentu) metionina musi być usunięta przed użyciem. W dziedzinie są dostępne sposoby aby usunąć takie N-końcowe metioniny z polipeptydów wyrażanych z nimi. Na przykład pewni gospodarze i warunki fermentacji pozwalają na usunięcie zasadniczo wszystkich N-końcowych metionin in vivo. Inni gospodarze wymagają usunięcia N-końcowej metioniny in vitro. Takie sposoby in vitro i in vivo są dobrze znane w dziedzinie.

Białka tworzone przez transformowanego gospodarza mogą być oczyszczone według dowolnego odpowiedniego sposobu. Takie standardowe sposoby obejmują chromatografię (np. jonowymienną, powinowactwa, i podziału zależnie od wielkości), wirowania, różnicowej rozpuszczalności lub dowolną inną technikę standardową dla oczyszczania białek. Do chromatografii immunopowinowactwa (zob. Przykład 1), można wyizolować białko takie jak Sonic hedgehog przez wiązanie do kolumny powinowactwa zawierającej przeciwciała, które uzyskano przeciwko Sonic hedgehog, lub zbliżonemu białku i przyłączono do stacjonarnego nośnika. Alternatywnie, znaczniki do powinowactwa takie jak heksahistydyna, domena wiążąca maltozę, sekwencja białka płaszcza wirusa grypy, i glutationylo-S-transferaza mogą być przyłączone do białka, aby pozwolić na łatwe oczyszczenie przez pasaż przez odpowiednią kolumnę powinowactwa. Wyizolowane białka mogą być też charakteryzowane fizycznie stosując takie techniki jak proteoliza, jądrowy rezonans magnetyczny i krystalografia rentgenowska.

A. Produkcja fragmentów i analogów

Fragmenty izolowane białka (np. fragmenty SEQ ID NO: 1-4) mogą być też produkowane skutecznie za pomocą metod rekombinacji, przez trawienie proteolityczne, lub przez chemiczną syntezę stosując sposoby znane specjalistom. W metodach z rekombinacją, wewnętrzne lub końcowe fragmenty polipeptydu mogą być generowane przez usunięcie jednego lub więcej nukleotydów z jednego końca (dla końcowego fragmentu) lub obu końcach (dla wewnętrznego fragmentu) sekwencji DNA, która koduje wyizolowany polipeptyd hedgehog. Ekspresja mutagenizowanego DNA produkuje fragmenty polipeptydów. Trawienie endonukleazami „podgryzającymi” końce może też generować DNA, które kodują zestaw fragmentów. DNA, które kodują fragmenty białka mogą być też generowane przez losowe rozrywanie, trawienie restrykcyjne, lub kombinację obu. Fragmenty białka mogą być generowane bezpośrednio z nienaruszonego białka. Peptydy mogą być trawione specyficzne przez enzymy proteolityczne, w tym, ale nie ograniczając się do, plazminy, trombiny, trypsyny, chymotrypsyny lub pepsyny. Każdy z tych enzymów jest specyficzny dla typu wiązania peptydowego, który atakuje. Trypsyna katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w których grupa karbonylowa jest z zasadowego aminokwasu, na ogół argininy lub lizyny. Pepsyna i chymotrypsyna katalizują hydrolizę wiązań peptydowych z aromatycznych aminokwasów takich jak tryptofan, tyrozyna i fenyloalanina. Alternatywne zestawy ciętych fragmentów białek są generowane przez zapobieganie cięciu w miejscu, które jest podatne na enzym proteolityczny. Na przykład reakcja grupy ε-aminowej lizyny z etylortifluorooctanem w umiarkowanie zasadowym roztworze daje zablokowane reszty aminokwasów, których przyległe wiązanie peptydowe nie jest już podatne na hydrolizą przez trypsynę. Białka mogą być modyfikowane aby stworzyć wiązania peptydowe, które są podatne na enzymy proteolityczne. Na przykład alkilacja reszt cysteinowych β-haloetyloaminami daje wiązania peptydowe, które są hydrolizowane przez trypsyną (51). Dodatkowo, odczynniki chemiczne, które tną łańcuchy peptydowe w specyficznych miejscach mogą być stosowane. Na przykład bromek cyjanogenu tnie peptydy przy reszcie metioninowej (52). Tak więc traktując białka różnymi kombinacjami modyfikatorów, enzymów proteolitycznych i/lub odczynników chemicznych białka mogą być podzielone na fragmenty o pożądanej długości

PL 197 833 B1 bez zachodzenia na siebie fragmentów, lub podzielone na zachodzące na siebie fragmenty o pożądanej długości.

Fragmenty mogą być też syntetyzowane chemicznie stosując techniki znane w dziedzinie takie jak chemia F moc lub t-Boc Merrifield fazy stałej. Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23:451 (1967).

Przykłady sposobów uprzedniego stanu wiedzy, które pozwalają na produkcję i testowanie fragmentów i analogów są przedyskutowane poniżej. Te lub analogiczne sposoby mogą być stosowane do produkcji i badania przesiewowego fragmentów i analogów wyizolowanego polipeptydu (np. hedgehog), którego aktywność biologiczną można wykazać. Przykładowy sposób testowania czy fragmenty i analogi hedgehog mają aktywność biologiczną jest podany w Przykładzie 3.

B. Produkty zmienionego DNA i sekwencji peptydowych: Sposoby losowe

Warianty sekwencji aminokwasów białka (takie jak warianty SEQ ID NO: 1-4) mogą być przygotowane przez losową mutagenezę DNA, które koduje białko lub jego konkretną część. Pożyteczne sposoby obejmują mutagenezą PCR i mutagenezą saturacyjną. Można też wygenerować bibliotekę losowych sekwencji aminokwasów przez syntezę zestawu zdegenerowanych sekwencji oligonukleotydów. Sposoby generowania wariantów sekwencji aminokwasów danego białka stosując zmieniony DNA i peptydy są dobrze znane w dziedzinie. Następujące przykłady takich sposobów nie mają na celu ograniczenia zakresu wynalazku ale służą wyłącznie do ilustracji reprezentatywnych technik. Osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie rozpoznają, że inne metody są też pożyteczne w tym względzie.

Mutagenezą PCR: Pokrótce, polimeraza Taq (lub inna polimeraza) jest stosowana do wprowadzenia losowych mutacji do sklonowanego fragmentu DNA (42). Warunki PCR są dobrane tak, by wierność syntezy DNA została obniżona przez polimery Taq DNA stosując na przykład stosunek dGTP/dATP równy pięć i dodając Mn²⁺ do reakcji PCR. Pula zamplifikowanych fragmentów DNA jest wstawiana do odpowiednich wektorów do klonowania by zapewnić biblioteki losowych mutantów.

Mutageneza saturacyjna. Jedna metoda jest ogólnie opisana w (43). Pokrótce technika obejmuje generację mutacji przez chemiczne traktowanie lub napromieniowanie jednoniciowego DNA in vitro i syntezą nici cDNA. Częstość mutacji jest modulowana przez ostrość traktowania i można uzyskać zasadniczo wszystkie możliwe podstawienia zasad.

Mutageneza zdegenerowanymi oligonukleotydami: Biblioteka homologicznych peptydów może być wygenerowana z zestawu zdegenerowanych sekwencji oligonukleotydowych. Synteza chemiczna zdegenerowanych sekwencji może być przeprowadzona w automatycznym syntetyzerze DNA i geny syntetyczne są wligowywane do odpowiedniego wektora ekspresyjnego. Zobacz na przykład (44, 45) i Itakura i wsp., Recombinant DNA, Proc. 3^rd Cleveland Symposium on Macromolecules, str. 273-289 (A.G. Walton, str. 273-289 (A.G. Walton red.) Elsevier Amsterdam, 1981.

C. Produkcja zmienionego DNA i sekwencji peptydów: metody ukierunkowane

Nielosowa, czyli ukierunkowana mutageneza dostarcza specyficzne sekwencje lub mutacje w konkretnych częściach polinukleotydowej sekwencji, które kodują wyizolowany peptyd aby dostarczyć warianty, które obejmują delecje, insercje i podstawienia reszt znanej sekwencji aminokwasów wyizolowanego peptydu. Miejsca mutacji mogą być indywidualnie zmodyfikowane lub w seriach na przykład przez (1) podstawienie najpierw z zakonserwowanymi aminokwasami i następnie z bardziej radykalne wybory w zależności od uzyskanych wyników; (2) delecję docelowej reszty; lub (3) wstawienie reszt tego samego lub innej klasy przyległej do zlokalizowanego miejsca lub kombinacje opcji 1-3.

Jasne jest, że takie ukierunkowane metody są jednym sposobem, za pomocą którego N-końcowa cysteina (lub jej funkcjonalny ekwiwalent) może być wprowadzana do danej sekwencji polipeptydowej aby dostarczyć miejsce przyczepu dla reszty hydrofobowej.

Mutageneza skanująca alaniny: Ten sposób lokalizuje te reszty lub regiony pożądanego białka, które są preferowanymi miejscami dla mutagenezy (46). W skriningu alaninowym reszta lub grupa reszt docelowych jest wybrana i zastąpiona przez alaniną. To zastąpienie może wpłynąć na interakcję aminokwasu z sąsiadującymi aminokwasami i/lub otaczającym środowiskiem wodnym lub membranowym. Te mające funkcjonalną wrażliwość na podstawienia są wówczas zawężane przez wprowadzenie dalszych lub innych wariantów w miejscu, lub za miejscem substytucji.

Mutageneza z udziałem oligonukleotydów: Jedna wersja tej metody może być stosowania do przygotowania wariantów DNA substytucyjnych, delecyjnych i insercyjnych (47). Pokrótce, pożądany DNA jest zmieniony przez hybrydyzację primera oligonukleotydowego kodującego mutacją DNA do matrycy DNA, która jest typowo jednoniciową postacią plazmidu lub faga zawierającego sekwencję

PL 197 833 B1

DNA niezmienioną lub typu dzikiego matrycy pożądanego białka (np. białka hedgehog). Po hybrydyzacji stosuje się polimerazę DNA aby sporządzić drugą i komplementarną nić DNA do matrycy, która włączy primer oligonukleotydowy i będzie kodować wybraną zmianę pożądanej sekwencji DNA. Na ogół stosowane są oligonukleotydy o długości przynajmniej 25 nukleotydów. Optymalny oligonukleotyd będzie miał 12 do 15 nukleotydów, które są całkowicie komplementarne do matrycy po obu stronach mutacji. To zapewnia, że oligonukleotyd będzie odpowiednio hybrydyzował do jednoniciowej cząsteczki DNA matrycy.

Mutageneza kasetowa: Ten sposób (48) wymaga plazmidu lub innego wektora, który zawiera DNA podjednostki białka, które ma być zmutowane. Kodon(y) DNA podjednostki białka są określane i wstawia się unikalne miejsce dla endonukleazy restrykcyjnej z każdej strony zidentyfikowanego miejsca (miejsc) mutacji, stosując opisaną powyżej metodę mutagenezy sterowanej przez oligonukleotydy. Plazmid jest wówczas cięty w tych miejscach by go zlinearyzować. Dwuniciowy oligonukleotyd kodujący sekwencję DNA pomiędzy miejscami restrykcyjnymi ale zawierający pożądaną mutację (mutacje) jest syntetyzowany stosując standardowe procedury. Dwie nici są syntetyzowane oddzielnie i następnie hybrydyzowane razem stosując metody standardowe. Ten dwuniciowy oligonukleotyd jest „kasetą” i ma 3' i 5' końce, które są kompatybilne z końcami linearyzowanego plazmidu tak, że może być do niego bezpośrednio wligowany. Plazmid obecnie zawiera zmutowaną sekwencję DNA pożądanej podjednostki białkowej.

Mutageneza kombinatoryczna: W jednej wersji tego sposobu (Ladner i wsp., WP 88/06630) sekwencje aminokwasów grupy homologów lub innych spokrewnionych białek są przyporządkowywane, korzystnie aby uzyskać jak najwyższą możliwą homologię. Wszystkie aminokwasy, które pojawiają się w danej pozycji przyporządkowanych sekwencji mogą być wybrane aby dać zdegenerowany zestaw kombinatorycznych sekwencji. Biblioteka różnorodna jest generowana przez mutagenezę kombinatoryczną na poziomie kwasu nukleinowego, i jest kodowana przez różnorodną bibliotekę genów. Na przykład mieszanina syntetycznych oligonukleotydów może być ligowana enzymatycznie do sekwencji genu tak, że zdegenerowany zestaw potencjalnych sekwencji może być wyrażany jako indywidualne peptydy, lub alternatywnie jako zestaw białek zawierających cały zestaw zdegenerowanych sekwencji.

D. Inne warianty izolowanych polipeptydów

W tym wynalazku są włączone izolowane cząsteczki, które są allelicznymi wariantami, naturalnymi mutantami, indukowanymi mutantami, i białkami kodowanymi przez DNA, który hybrydyzuje w warunkach wysokiej lub niskiej ostrości do kwasu nukleinowego, który koduje polipeptyd taki jak N-końcowy fragment Sonic hedgehog (SEQ ID NO: 1) i polipeptydy wiązane specyficznie przez przeciwciała na aktywne miejsce hedgehog. Oczekuje się, że wszystkie warianty tu opisane: (i) utrzymają biologiczne funkcje oryginalnego białka i (ii) zachowają zdolność do przyłączenia do reszty hydrofobowej (np. lipidu).

Sposób wynalazku też obejmuje użycie fragmentów, korzystnie biologicznie czynnych fragmentów, lub analogów wyizolowanego peptydu takiego jak hedgehog. Specyficznie biologicznie czynny fragment lub analog jest taki, który ma in vivo lub in vitro aktywność, która jest charakterystyczna dla peptydu przedstawionego w SEQ ID NO: 1-4 lub innego naturalnie występującego izolowanego hedgehog. Najbardziej korzystne, hydrofobowo modyfikowany fragment lub analog ma przynajmniej 10%, korzystnie 40% lub więcej lub najbardziej korzystnie przynajmniej 90% aktywności Sonic hedgehog (zob. Przykład 3) w dowolnym oznaczeniu in vivo lub in vitro.

Analogi mogą różnić się od naturalnie występującego wyizolowanego białka w sekwencji aminokwasów lub w sposobach, które nie obejmują sekwencji, lub w obu. Najbardziej korzystne polipeptydy wynalazku mają korzystne niesekwencyjne modyfikacje, które obejmują in vivo lub in vitro podstawienie chemiczne (np. N-końca) jak i możliwe zmiany w acetylacji, metylacji, fosforylacji, amidacji, karboksylacji lub glikozylacji.

Inne analogi obejmują białka takie jak Sonic hedgehog lub jego biologicznie czynne fragmenty, których sekwencje różnią się od sekwencji najwyższej zgodności typu dzikiego (np. SEQ ID NO: 4) jednym lub więcej konserwatywnym podstawieniem aminokwasów lub jednym lub więcej niekonserwatywnym podstawieniem aminokwasów, lub przez delecje lub insercje, które nie znoszą biologicznej aktywności wyizolowanego białka. Konserwatywne podstawienia typowo obejmują podstawienie jednego aminokwasu za inny o podobnych cechach takie jak podstawienia następującymi grupami: walina, alanina i glicyna; leucyna i izoleucyna; kwas asparaginowy i kwas glutaminowy; asparagina i glutamina; seryna i treonina; lizyna i arginina; i fenyloalanina i tyrozyna. Niepolarne aminokwasy obejmują alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne obojętne

PL 197 833 B1 aminokwasy obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę, i glutaminę. Dodatnio naładowane (zasadowe) aminokwasy obejmują argininę, lizynę i histydynę. Negatywnie naładowane (kwaśne) aminokwasy obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Inne konserwatywne substytucje będą łatwo określone przez osoby o przeciętnych umiejętnościach. Na przykład dla aminokwasu alaniny konserwatywna substytucja może być dowolna z: D-alanina, beta alanina, L-cysteina i D-cysteina. Na przykład dla aminokwasu lizyny konserwatywna substytucja może być dowolna: D-lizyna, arginina, D-arginina, homoarginina, metionina, D-metionina, ornityna lub D-ornityna.

Na ogół substytucje, co do których można oczekiwać, że zaindukują zmiany w właściwościach funkcjonalnych wyizolowanych peptydów to takie w których: (i) reszta polarna, np. seryna lub treonina, jest podstawiona za (lub przez) resztę hydrofobową, np. leucynę, izoleucynę, fenyloalaninę lub alaninę; (ii) reszta cysteinowa jest podstawiona za (lub przez) dowolną inną resztę (zob. Przykład 10); (iii) reszta mająca elektrododatni łańcuch boczny np. lizyna, arginina lub histydyna jest podstawiona przez (lub za) resztę mającą elektronegatywny łańcuch boczny, np. kwas glutaminowy lub kwas asparaginowy; lub (iv) reszta mająca objętościowy łańcuch boczny np. fenyloalaninę jest podstawiona za (lub przez) taką, która nie ma takiego łańcucha np. glicynę.

Inne analogi stosowane w sposobach wynalazku są te, z modyfikacjami, które zwiększają stabilność peptydu. Takie analogi mogą zawierać, np. jedno lub więcej wiązań niepeptydowych (które zastępują wiązania peptydowe) w sekwencji peptydu. Także włączone są analogi, które obejmują reszty inne niż naturalnie występujące L-aminokwasy takie jak D-aminokwasy lub nie występujące naturalnie lub syntetyczne aminokwasy takie jak beta lub gamma aminokwasy i analogi cykliczne. Włączenie aminokwasów D- zamiast L do wyizolowanego białka hedgehog może zwiększyć jego oporność na proteazy. Zob. Patent US 5,219,990, powyżej.

Określenie „fragment” jak stosowane do wyizolowanego analogu hedgehog może być tak małe jak pojedynczy aminokwas pod warunkiem, że zachowuje biologiczną aktywność. Może mieć przynajmniej około 20 reszt, bardziej typowo przynajmniej około 40 reszt, korzystnie przynajmniej około 60 reszt długości. Fragmenty mogą być generowane sposobami znanymi specjalistom. Zdolność fragmentu kandydata do wykazywania aktywności biologicznej wyizolowanego hedgehog może być też oceniana sposobami znanymi w dziedzinie jak tu opisano.

V. Robienie pochodnych hydrofobowych

Wynalazcy wykryli, że zwiększenie ogólnej hydrofobowej natury białka sygnalizującego takiego jak białko hedgehog, zwiększa biologiczna aktywność białka. Siła sygnalizującego białka takiego jak hedgehog może być zwiększona przez (a) modyfikacje chemiczną, taką jak dodanie reszty hydrofobowej do sulfhydrylowej i/lub α-aminowej N-końcowej cysteiny (Przykłady 8 i 9); (b) zastąpienie N-końcowej cysteiny hydrofobowym aminokwasem (Przykład 10); lub (c) zastąpienie N-końcowej cysteiny innym aminokwasem a następnie chemiczną modyfikację podstawionej reszty tak by dodać resztę hydrofobową w miejscu podstawienia.

Dodatkowo, modyfikacje białka takiego jak białko hedgehog w wewnętrznej reszcie na powierzchni białka resztą hydrofobową przez: (a) zastąpienie wewnętrznej reszty aminokwasem hydrofobowym, lub (b) zastąpienie wewnętrznej reszty innym aminokwasem i następnie chemiczną modyfikację podstawionej reszty tak by dodać resztę hydrofobową w miejscu substytucji (zob. Przykład 10) utrzyma lub zwiększy aktywność biologiczną białka.

Dodatkowo modyfikacja białka takiego jak białko hedgehog na C-końcu przez (a) zastąpienie C-końcowej reszty aminokwasem hydrofobowym, lub (b) zastąpienie C-końcowej reszty innym aminokwasem i następnie chemiczną modyfikację podstawionej reszty tak by dodać resztę hydrofobową w miejscu substytucji (zob. Przykład 10) utrzyma lub zwiększy aktywność biologiczną białka.

Istnieje szeroki zakres reszt lipofilowych, którymi mogą być podstawione polipeptydy hedgehog. Lipofilowa grupa może na przykład być zawierającym stosunkowo długi łańcuch alkilem lub cykloalkilem (korzystnie n-alkilem) mającym około 7 do 30 węgli. Grupa alkilowa może kończyć się ogonem hydroksy lub pierwotnej aminy. Aby to dalej zilustrować, reszty lipofilowe obejmują naturalnie występujące i syntetyczne aromatyczne i niearomatyczne reszty takie jak kwasy tłuszczowe, estry i alkohole, inne cząsteczki lipidów, struktury klatek takie jak adamantan i buckminsterfullereny i aromatyczne węglowodory takie jak benzen, perylen, fenantren, antracen, naftalen, piren, chrysen, i naftacen.

Szczególnie korzystne jako cząsteczki lipofilowe są acykliczne węglowodory, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe i inne reszty lipidów i fosfolipidów, woski, cholesterol, izoprenoidy, terpeny i polialicykliczne węglowodory obejmujące adamantan i buckminsterfullereny, witaminy, glikol polietylenowy, glikol oligoetylenowy, diestry (C1-C18) alkilofosforanów, -O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-alkile

PL 197 833 B1 i w szczególności koniugaty z pochodnymi pirenowymi. Cząsteczka lipofilowa może być barwnikiem lipofilowym odpowiednim do stosowania w wynalazku, co obejmuje, ale nie ogranicza się do, difenyloheksatrien, czerwień Nilu, N-fenylo-1-naftyloaminę, Prodan, Laurodan, Piren, Perylen, rodamina, rodamina B, tetrametylorodamina, czerwień Texas, sulforodamina, nadchloran 1,1'-didodecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindolokarbocyjaniny, oktadecylorodamina B i barwniki BODIPY dostępne od Molecular Probes Inc.

Inne przykładowe lipofilowe cząsteczki obejmują alifatyczne karbonylowe grupy reszt, w tym 1lub 2-adamantyloacetyl, 3-metyloadamant-1-yloacetyl, 3-metylo-3-bromo-1-adamantyloacetyl, 1-dekalinoacetyl, kamforacetyl, kamfanoacetyl, noradamyntyloacetyl, norbornanenoacetyl, bicyklo[2.2.2]-okt-5-enoacetyl, 1-metoksybicyklo[2.2.2]-okt-5-eno-2-karbonyl, cis-5-norborneno-endo-2,3-dikarbonyl, 5-norborneno-2-yloacetyl, (1 R)-(-)mirtentanoacetyl, 2-norbornanenooacetyl, anty-3-oksy-tricyklo[2.2.1.0<2,6>]heptano-7-karbonylo, dekanoil, dodekanoil, dodecenoil, tetradekadionoil, decenoil, i dodecenoil.

Struktury przykładowych hydrofobowych modyfikacji są przedstawione na Fig. 12. Jeśli odpowiedni aminokwas nie jest dostępny w specyficznej pozycji, mutageneza ukierunkowana może być zastosowana aby umieścić reaktywny aminokwas w tym miejscu. Reaktywne aminokwasy obejmują cysteinę, lizynę, histydynę, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, serynę, treoninę, tyrozynę, argininę, metioninę i tryptofan. Mutageneza może być zastosowana do umieszczenia reaktywnego aminokwasu na N- lub C-końcu wewnętrznej pozycji.

Na przykład odkryliśmy, że jest możliwa chemiczna modyfikacja N-końcowej cysteiny biologicznie czynnego białka, takiego jak białko hedgehog, lub wyeliminowanie całkiem N-końcowej cysteiny nadal zachowując aktywność biologiczną białka, pod warunkiem, że zmodyfikowana lub podstawiona reszta jest hydrofobowa. Wynalazcy stwierdzili, że zwiększenie aktywności biologicznej hedgehog z grubsza koreluje z hydrofobowością modyfikacji. Oprócz wzmagania aktywności białka modyfikacja lub zastąpienie N-końcowej cysteiny eliminuje niepożądane reakcje krzyżowe i/lub modyfikacje cysteiny, które mogą wystąpić w czasie produkcji, oczyszczania, formułowania lub przechowywania białka. Tiol N-końcowej grupy jest bardzo aktywny ze względu na jego bliskość do aaminy, co obniża pKa cysteiny i zwiększa dysocjację protonów i tworzenie reaktywnego jonu tiolanowego w pH obojętnym lub kwaśnym.

Wykazaliśmy, że zastąpienie N-końcowej cysteiny hedgehog hydrofobową resztą daje białko o zwiększonej sile w oznaczeniu opartym na sygnalizacji komórkowej. Przez zastąpienie cysteiny to podejście eliminuje problem supresji innych niepożądanych modyfikacji cysteiny, które mogą wystąpić w czasie produkcji, oczyszczania, formułowania lub przechowywania białka. Ogólność tego podejścia jest wspierana przez nasze odkrycie, że dla trzech różnych aminokwasów hydrofobowych, fenyloalaniny, izoleucyny i metioniny, każdy daje bardziej czynną postać hedgehog. Tak więc zastąpienie cysteiny dowolnym innym hydrofobowym aminokwasem powinno dać aktywne białko. Co więcej, ponieważ stwierdziliśmy korelację pomiędzy hydrofobowością aminokwasu lub modyfikacji chemicznej i siłą odpowiedniego zmodyfikowanego białka w oznaczeniu C3H10T1/2 (np. Phe > Met, długołańcuchowe kwasy tłuszczowe > krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe) można było oczekiwać, że dodanie więcej niż jednego aminokwasu hydrofobowego do sekwencji hedgehog zwiększy siłę działania białka poza tą uzyskaną przez dodanie pojedynczego aminokwasu. Zaiste dodanie dwóch kolejnych reszt izoleucynowych do N-końca ludzkiego Sonic hedgehog powoduje zwiększenie w mocy oznaczenia C3H10T1/2 w porównaniu z mutantem z dodatkiem tylko pojedynczej izoleucyny (zob. Przykład 10). Tak więc oczekuje się, że dodanie hydrofobowych aminokwasów na N- lub C-końcu białka hedgehog, pętli powierzchniowej, lub jakiejś kombinacji pozycji da bardziej aktywną postać białka. Podstawiony aminokwas nie musi być jednym z 20 pospolitych aminokwasów. Opisano sposoby podstawiania nienaturalnych aminokwasów w specyficznych miejscach w białkach (78, 79), i to by było korzystne jeśli aminokwas byłby bardziej z natury hydrofobowy, oporny na atak proteolityczny, lub mógłby być stosowany aby dalej sterować białkiem hedgehog do konkretnego miejsca in vitro, które by czyniło jego aktywność silniejszą lub bardziej specyficzną. Nienaturalne aminokwasy mogą być winkorporowane w specyficznych miejscach w białkach w czasie translacji in vitro, i opisuje się postęp w tworzeniu systemów in vivo, które pozwolą na produkcję takich zmodyfikowanych białek na dużą skalę.

Jest nieoczekiwane, że białko, takie jak białko hedghog, modyfikowane według wynalazku, zachowa swoją aktywność biologiczną. Po pierwsze, N-końcowa cysteina jest konserwowana we wszystkich znanych sekwencjach białka hedgehog w tym u ryb, żab, owadów, ptaków i ssaków. Tak więc jest rozsądne oczekiwanie, że wolna grupa sulfhydrylowa N-końcowej cysteiny jest ważna dla struktury lub aktywności białka. Po drugie białka hedgehog pozbawione N-końcowej cysteiny ze

PL 197 833 B1 względu na cięcie proteolityczne lub mutację do aminokwasów hydrofilowych (np. kwas asparaginowy lub histydyna) są nieaktywne w oznaczeniu C3H10T1/2 opartym o komórki, takim jak opisano w Przykładzie 3.

Istnieje wiele modyfikacji N-końcowej cysteiny, które chronią tiol i dodają resztę hydrofobową. Te modyfikacje są przedyskutowane bardziej szczegółowo poniżej. Osoba biegła w dziedzinie jest w stanie określić, która modyfikacja jest najbardziej odpowiednia dla danego celu terapeutycznego. Czynniki wpływające na takie określenie obejmują koszt i łatwość produkcji, oczyszczania i formułowania, rozpuszczalność, stabilność, moc, farmakodynamikę i kinetykę, bezpieczeństwo, immunogenność i nakierowanie na tkanki.

A. Chemiczne modyfikacje pierwszorzędowej sekwencji aminokwasów

Chemiczna modyfikacja N-końcowej cysteiny aby chronić tiol, z towarzyszącą aktywacją przez resztą hydrofobową, może być przeprowadzona na różne sposoby przez osobą biegłą w dziedzinie. Reszta sulfhydrylowa, z jonem tiolanowym jako czynną postacią, jest najbardziej reaktywną grupą funkcjonalną w białku. Istnieje wiele odczynników, które reagują szybciej z tiolem niż z innymi grupami, Zob. Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (S.S. Wong, CRC Press, Boca Raton, FL 1991). Oczekiwano by, że tiol N-końcowej cysteiny, taki jaki jest spotykany we wszystkich białkach hedgehog, będzie bardziej reaktywny niż wewnętrzne cysteiny w sekwencji. Jest tak ponieważ bliskość aaminy obniży pKa tiolu powodując większy stopień dysocjacji protonu do reaktywnego jonu tiolanowego w pH obojętnym lub kwaśnym. W dodatku cysteina na N-końcu struktury ma większą szansę bycia eksponowaną niż dwie pozostałe cysteiny w sekwencji hedgehog, które jest zakopane w strukturze białka. Wykazaliśmy, że N-końcowa cysteina jest jedynym aminokwasem zmodyfikowanym po 1 godzinnej reakcji z N-etylomaleimidem w pH 5,5 (zobacz Przykład 9) i po 18 godzinnej reakcji z N-izopropylojodoacetamidem w pH 7,0 (zobacz Przykład 9). Innym przykładem takich sposobów byłyby reakcje z innymi związkami α-haloacetylowymi, rtęcioorganicznymi, disiarczkowymi, i innymi N-podstawionymi N-maleimidami. Liczne hydrofobowe pochodne tych aktywnych form są dostępne handlowo (np. jodooctan etylu (Aldrich, Milwaukee, Wl), disiarczek fenylu (Aldrich), i N-pirenomaleimid (Molecular Probes, Eugene, OR)) lub mogą być łatwo syntetyzowane (np. N-alkilodiacetamidy (84), N-alkilomaleimidy (85) i związki organortęciowe (86). Wykazaliśmy, że N-końcowa cysteina ludzkiego Sonic hedgehog może być specyficznie modyfikowana N-izopropylojodoacetamidem i że hydrofobowo modyfikowane białko jest 2 razy silniejsze w oznaczeniu C3H10T1/2 niż niezmodyfikowane białko (zobacz Przykład 9). Oczekuje się, że modyfikacja Shh długołańcuchową alkilową pochodną jodoacetamidu da w efekcie zmodyfikowane białko z jeszcze większym zwiększeniem mocy. Takie N-alkiloacetamidy mogą być łatwo syntetyzowane przez specjalistę, stosując handlowo dostępne materiały wyjściowe.

Innym aspektem reaktywności N-końcowej cysteiny jest, że może uczestniczyć w reakcjach chemicznych unikalnych dla jej konfiguracji 1,2-aminotiolu. Jednym przykładem jest reakcja z grupami tioestrowymi aby wytworzyć N-końcową grupę amidową przez szybkie przesunięcie S do N tioestru. Ta chemia reakcji może łączyć razem syntetyczne peptydy i może być stosowana do dodawania pojedynczych lub wielokrotnych, naturalnych lub nienaturalnych, aminokwasów lub innych grup hydrofobowych przez odpowiednio aktywowany peptyd. Inny przykład, tu pokazany, to reakcja z aldehydami aby wytworzyć addukt tiazolidynowy. Liczne hydrofobowe pochodne estrów tiolowych (np. estry C2-C24 nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych acylo Koenzymu A (Sigma Chemical Co, St. Louis MO)), aldehydy (np. butyryloaldehyd, n-decyloaldehyd, i n-mirystylo aldehyd (Aldrich)) i ketony (np. 2-, 3-, i 4-dekanon (Aldrich) są dostępne handlowo lub mogą być łatwo zsyntetyzowane (87, 88). W podobny sposób pochodne tiomorfolinowe egzemplifikowane przez chemię 1-2-bromobutanonową opisaną w Przykładzie 9 mogą być przygotowane z szeregu wyjściowych materiałów α-haloketonowych (88). Ze względu na łatwość znajdowania alternatywnych dróg modyfikacji N-końcowej cysteiny, lub dowolnej cysteiny w białku, nie chcemy być ograniczani przez tu pokazane specyficzne przykłady.

α-amina białka może być modyfikowana preferencyjnie w stosunku do innych amin w białku ponieważ jej niższy pKa powoduje wyższe ilości nieprotowanej reaktywnej postaci w pH obojętnym lub kwaśnym. Wykazaliśmy, że modyfikacja N-końcowej aminy grupą aminową z długim łańcuchem tłuszczowym podczas gdy zachowuje wolną grupę tiolową cysteiny, aktywuje białko hedgehog o aż dwa rzędy wielkości (zobacz Przykład 8). Tak więc oczekiwano by, że chemie nastawione na reagowanie preferencyjnie z N-końcową aminą będą użyteczne w zwiększaniu mocy białek hedgehog. Halidki aryli, aldehydy i ketony, bezwodniki kwasów, izocyjaniany, izotiocyjaniany, imidoestry, halidki kwaśne,

PL 197 833 B1

N-hydroksysukcynoimidyl (np. sulfo-NHS-octan), estry nitrofenylu, acyloimidazole, i inne zaktywowane estry są wśród tych, co do których wiadomo, że reagują z aminami.

Przez zastąpienie N-końcowej cysteiny hedgehog pewnymi innymi aminokwasami można zastosować inne sposoby chemiczne do dodania reszty hydrofobowej do N-końca. Jeden przykład to umieszczenie seryny lub treoniny na N-końcu, utlenienie aminokwasu aby wytworzyć aldehyd, i następnie koniugacja białka z resztą chemiczną zawierającą strukturę 1,2-aminotiolową (np. cysteinę). Drugim przykładem byłoby umieszczenie histydyny na N-końcu by sprząc C-końcowy kwas trikarboksylowy.

Chemiczna modyfikacja innych aminokwasów

Są inne specyficzne chemiczne sposoby modyfikacji wielu innych aminokwasów. Tak więc innym sposobem syntetyzowania bardziej aktywnej postaci hedgehog byłoby przyłączenie reszty hydrofobowej do aminokwasu w hedgehog innym niż N-końcowa cysteina. Jeśli odpowiedni aminokwas nie jest dostępny w pożądanej pozycji, można zastosować mutagenezę ukierunkowaną aby umieścić reaktywny aminokwas w tej pozycji w strukturze hedgehog, czy na N- czy C-końcu czy w innej pozycji. Reaktywne aminokwasy obejmują cysteinę, lizynę, histydynę, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, serynę, treoninę, tyrozynę, argininę, metioninę i tryptofan. Tak więc cel stworzenia bardziej hydrofobowej postaci hedgehog mógłby być uzyskany za pomocą wielu chemicznych sposobów i nie chcemy ograniczać się do żadnej konkretnej chemii lub modyfikacji, ponieważ nasze badania potwierdzają ogólność tego podejścia.

Polipeptyd hedgehog może być połączony z resztą hydrofobową w szereg sposobów w tym za pomocą łączenia chemicznego, lub poprzez inżynierię genetyczną.

Aby to zilustrować, istnieje duża liczba chemicznych czynników łączących krzyżowo znanych osobom biegłym w dziedzinie. Dla niniejszego wynalazku korzystne czynniki do połączeń krzyżowych są heterofunkcjonalnymi połączeniami krzyżowymi, które mogą być stosowane do połączenia polipeptydu hedgehog i reszty hydrofobowej za pomocą kolejnych kroków. Heterobifunkcjonalne połączenia krzyżowe dają zdolność zaprojektowania bardziej specyficznych sposobów sprzęgania do koniugacji białek w ten sposób zmniejszając występowanie niepożądanych reakcji ubocznych takich jak polimery homobiałek. W dziedzinie znanych jest wiele różnorodnych heterobifunkcjonalnych połączeń krzyżowych. Obejmują one: sukcynoimidylo 4(N-maleimidometylo) cykloheksano-1-karboksylan (SMCC), ester n-maleimidobenzoilo-N-hydroksysukcynoamidu (MBS); N-sukcynoimidylo (4-jodoacetylo) aminobenzoesan (SIAB), sukcynoimidylo 4-(p-maleimidofenylo) maślan (SPMB), 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo) karbodiimidu chlorowodorek (EDC); 4-sukcynoimidylooksykarbonylo-a-metylo-a-(2-pirydylotio)-toluen (SMPT), N-sukcynoimidylo-3-(2-pirydylotio) propionian (SPDP), sukcynoimidylo 6-[3-(2-pirydylotio)propionianu] heksanoian (LC-SPDP). Te łączące krzyżowo czynniki mające reszty N-hydroksysukcynoimidu mogą być uzyskane jako analogi N-hydroksylosulfosukcynoimidowe, które ogólnie mają większą rozpuszczalność w wodzie. Dodatkowo, te krzyżowo łączące czynniki mające dwusiarczkowe mostki z łączącym łańcuchem mogą być syntetyzowane jako pochodne alkilowe aby zredukować ilość cięcia linkera in vivo.

Oprócz heterobifunkcjonalnych czynników łączących istnieje szereg innych łączących krzyżowo czynników obejmujących homobifunkcjonalne i fotoreaktywne czynniki łączące krzyżowo. Disukcynoimidylosuberan (DSS), bismaleidoheksan (BMH) i dimetylopimelimidanu 2 HCI (DMP) są przykładami pożytecznych homobifunkcjonalnych łączących krzyżowo związków i bis-[p-(4-azydosalicylamido)etylo]disiarczan (BASED) i N-sukcynoimido-6(4'-azydo-2'-nitrofenylo-amino) heksanoan (SANPAH) są przykładami użytecznych fotoaktywnych połączeń krzyżowych do stosowania w tym wynalazku. Niedawny przegląd technik sprzęgania z białkami zob. Means i wsp. (1990) Bioconjugate Chemistry 1:2-12 włączone tu w postaci odniesienia.

Jedna szczególnie pożyteczna klasa heterobifunkcjonalnych połączeń krzyżowych, włączonych powyżej, zawiera pierwszorzędową reaktywną grupą aminową N-hydroksysukcynoamid (NHS) lub jego rozpuszczalny w wodzie analog N-hydroksysulfosukcynoamid (sulfo-NHS). Pierwszorzędowe aminy (grupy epsilonowe lizyny) w pH alkalicznym nie są protonowane i reagują poprzez atak nukleofilowy na estry NHS lub sulfoNHS. Ta reakcja powoduje tworzenie wiązania amidowego, i uwolnienie NHS lub sulfo-NHS jako produktu ubocznego.

Inna reaktywna grupa pożyteczna jako część heterobifunkjonalnego połączenia krzyżowego jest reaktywną grupą tiolową. Powszechne reaktywne grupy tiolowe obejmują maleimidy, halogeny i disiarczki pirydylu. Maleimidy reagują specyficznie z wolnymi sulfhydrylami (reszty cysteiny) w ciągu minut, w warunkach nieco kwaśnych do obojętnych (pH 6,5-7,5). Halogenki (funkcje jodoacetylowe)

PL 197 833 B1 reagują z grupami SH w fizjologicznym pH. Obie te reaktywne grupy dają tworzenie stabilnych wiązań tioeterowych.

Trzecim składnikiem heterobifunkcjonalnego połączenie krzyżowego jest ramię przerywnika lub mostek. Mostek jest strukturą, która łączy dwa końce reaktywne. Najbardziej widocznym atrybutem mostka jest jego wpływ na zawadę przestrzenną. W niektórych przypadkach dłuższy mostek może znacznie łatwiej objąć odległość konieczną do połączenia dwóch biomolekuł kompleksu. Na przykład SMPB ma rozległość 14,5 angstremów.

Przygotowanie konjugatów białko-białko stosując heterobifunkcjonalne odczynniki jest procesem dwuetapowym obejmującym reakcję aminową i reakcję sulfhydrylową. Do pierwszego etapu reakcji aminowej, wybrane białko powinno zawierać pierwszorzędową aminę. To może być epsilon amina lizyny lub pierwszorzędową amino alfa spotykana na N-końcu większości białek. Białko nie powinno zawierać wolnych grup sulfhydrylowych. W przypadkach gdy oba białka, które mają być koniugowane zawierają wolne grupy sulfhydrylowe, jedno białko może być modyfikowane tak, że wszystkie sulfhydryle są zablokowane stosując na przykład N-etylomaleimid (zob. Partis i wsp. (1983) J. Pro. Chem, 2:263 włączone tu w postaci odniesienia). Może być stosowany odczynnik Ellmana do wyliczenia ilości sulfhydryli w danym białku (zob. np. Ellman i wsp. (1958) Arch. Biochem. Biophys. 74:443 i Riddles i wsp. (1979) Anal Biochem. 94:75, włączone tu w postaci odniesienia).

Bufor do reakcji powinien być wolny od zewnętrznych amin i sulfhydryli. pH buforu reakcyjnego powinno być 7,0 - 7,5. Ten zakres pH zapobiega reakcji grup maleimidowych z aminami, zachowując grupę maleimidową do drugiej reakcji z sulfhydrylami.

Linkery krzyżowe zawierające ester NHS mają ograniczoną rozpuszczalność w wodzie. Powinny być rozpuszczone w minimalnej ilości rozpuszczalnika organicznego (DMF lub DMSO) przed wprowadzeniem linkera krzyżowego do mieszaniny reakcyjnej. Linker krzyżowy/rozpuszczalnik tworzy emulsję, która pozwala na zajście reakcji.

Analogi estrów sulfo-NHS są lepiej rozpuszczalne w wodzie i mogą być dodawane bezpośrednio do buforu reakcyjnego. Należy unikać buforów o wysokiej mocy jonowej jako że mają skłonność do „wysalania” estrów sulfo-NHS. Aby zapobiec utracie reaktywności ze względu na hydrolizę, dodaje się linker krzyżowy do mieszaniny reakcyjnej bezpośrednio po rozpuszczeniu roztworu białka.

Reakcje mogą być bardziej skuteczne w stężonych roztworach białka. Im bardziej alkaliczne pH mieszaniny reakcyjnej tym szybsza reakcja. Tempo hydrolizy estrów NHS i sulfo-NHS będzie zwiększać się ze zwiększającym pH. Wyższe temperatury zwiększą tempo reakcji dla zarówno hydrolizy i acylacji.

Po zakończeniu reakcji pierwsze białko jest obecnie zaktywowane z reaktywną resztą sulfhydrylową. Zaktywowane białko może być wyizolowane z mieszaniny reakcyjnej za pomocą prostego sączenia na żelu lub dializy. Aby przeprowadzić drugi etap połączenia krzyżowego, reakcje sulfhydrylu, lipofilowa grupa wybrana do reakcji z maleimidami, aktywowanymi halogenami lub pochodnymi disiarczków pirydylu musi zawierać wolny sulfhydryl. Alternatywnie, pierwotna amina może być modyfikowana aby dodać sulfhydryl.

We wszystkich przypadkach bufor powinien być odpowietrzony aby zapobiec utlenianiu grup sulfhydrylowych. EDTA może być dodany aby chelatować dowolne utleniające metale, które mogą być obecne w buforze. Bufory powinny być wolne od dowolnych związków zawierających sulfhydryl.

Maleimidy reagują specyficznie z grupami SH w nieznacznie kwaśnym lub neutralnym zakresie pH (6,5 - 7,5). Neutralny pH jest wystarczający dla reakcji dotyczących halogenów i disiarczków pirydylu. W tych warunkach maleimidy na ogół reagują z grupami SH w obrębie czasu minut. Dłuższe czasy reakcji są wymagane dla halogenów i disiarczków pirydylu.

Pierwsze białko do reakcji sulfhydrylu przygotowane w etapie reakcji aminy miesza się z grupą lipofilową w warunkach odpowiedniego buforu. Koniugaty mogą być izolowane z mieszaniny reakcyjnej przez sposoby takie jak sączenie na żelu lub dializa.

Przykładowe zaktywowane reszty lipofilowe do koniugacji obejmują: N-(1-pireno)maleimid; 2,5-dimetoksystilbeno-4'-maleimid, eozyno-5-maleimid; fluoresceino-5-maleimid; N-(4-(6-dimetyloamino-2-benzofuranylo)fenylo)maleimid; benzofenono-4-maleimid; 4-dimetyloaminofenyloazofenylo-4'-maleimid (DABMI); tetrametylorodamino-5-maleimid; tetrametylorodamino-6-maleimid; rodaminy czerwieni TM C2 maleimid; N-(5-aminopentylo) maleimid, sól kwasu trifluorooctowego), N-(2-aminometylo)maleimid, sól kwasu trifluoroacetowego, maleimid zieleni Oregon TM 488, N-(2-((2-(((4-azydo-2,3,5,6-tetrafluoro)benzoilo)amino)etylo)ditio)etylo) maleimid (TFPAM-SS1), 2-(1-(3-dimetyloaminopropylo)indol-3-ylo)-3(indolo-3-ylo) maleimid (bisindolylomaleimid; GF 109203X), BODIPY® FL N-(2-aminoetylo)

PL 197 833 B1 maleimid, N-(7-dimetyloamino-4-metylokumaryno-3-ylo) maleimid (DACM), AlexaTM 488 maleimid, Alexa RM 594 C% maleimid, sól sodowa N-(1-pireno) maleimidu; 2,5-dimetoksystilbeno-4-maleimid, eozyno-5-maleimid, fluoresceino-5-maleimid, N(4-(6-dimetyloamino-2-benzofuranylo)fenylo)maleimid, benzofenono-4-maleimid, 4-dimetyloaminofenyloazofenylo-4'-maleimid, 1-(2-maleimidyloetylo)-4-(5-(4-metoksyfenylo)oksazolo-2-ylo)pirydyniowy metanosiarczan, tetrametylorodamino-5-maleimid, tetrametylorodamino-6-maleimid, maleimid czerwieni Rodaminy TM C2, N-(5-aminopentenylo)maleimid, N-(2-aminoetylo)maleimid, N-(2-((2-(((4-aazyo-2,3,5,6-tetrafluoro)bbnzzilo)amino)etylo)ditio)etylo)maleimid, 2-(1-(3-dimetyloaminopropylo)-indolo-3-ilo)-3-(indolo-3-ylo)maleimid, N-(7-dimetyloamino-4-metylokumaryno-3-ylo)maleimid (DACM), 11H-benzo[a]fluoren, benzo[a]piren.

W jednej postaci polipeptyd hedgehog może być podstawiony stosując pirenomaleimid, który można kupić od Molecular Probes (Eugene, Oreg) np. N-(1-pireno)maleimid lub jodooctan 1-pirenometylu (ester PMIA). Jak zilustrowano na Figurze 1, podstawione pirenem białko hedgehog miało profil aktywności wskazujący, że było nieomal 2 rządy wielkości bardziej aktywne niż niezmodyfikowana postać białka.

B. Robienie pochodnych hydrofobowych peptydów

Według wynalazku, białko może być też modyfikowane stosując peptyd hydrofobowy. Jak jest to tu stosowane określenie „peptyd” obejmuje sekwencję przynajmniej jednej reszty aminokwasu. Korzystnie peptyd ma długość pomiędzy jednym aminokwasem i 18-26 aminokwasami, te ostatnie mają typową długość odcinka białka przechodzącego przez membranę. Aby stworzyć peptyd o charakterze hydrofobowym, aminokwasy są wybrane przede wszystkim z następujących hydrofobowych aminokwasów: fenyloalanina, izoleucyna, leucyna, walina, metionina, tryptofan, alanina, prolina i tyrozyna. Hydrofobowy peptyd może też zawierać nienaturalne analogi aminokwasów o hydrofobowym charakterze, lub D-aminokwasy, wiązania peptydowe, N-końcową acetylację lub inne cechy, które zmniejszają podatność białka na proteolizę. Sposoby podstawiania nienaturalnych aminokwasów w specyficznych miejscach w białkach są znane (78, 79).

Ogólnie, hydrofobowy peptyd jest dodawany w różnych miejscach w białku. Jednym miejscem może być reszta N-końcowa. Alternatywnie, hydrofobowy peptyd wprowadza się zamiast reszty N-końcowej. W innej postaci hydrofobowy peptyd jest dodawany do C-końca peptydu. Alternatywnie, hydrofobowy peptyd wprowadza się zamiast reszty C-końcowej. C-koniec może być natywnym C-końcowym aminokwasem ale może być też C-końcem skróconego białka tak, że hydrofobowy peptyd jest dodany do C-końcowego aminokwasu skróconej postaci, która jest nadal określana jako „C-koniec”. Obcięte białko hedgehog będzie zachowywać aktywność gdy z natywnej C-końcowej sekwencji usunie się do jedenastu aminokwasów. Peptyd hydrofobowy może być wstawiony między N-końcową resztę i wewnętrzną resztę bezpośrednio przylegającą do N-końcowej reszty lub między C-końcową resztę i resztę bezpośrednio przylegającą do C-końcowej reszty; lub między dwoma wewnętrznymi resztami.

W niektórych postaciach reszta lipofilowa jest amfipatycznym polipeptydem, takim jak magainina, cekropina, atacyna, melityna, gramicydyna S, alfa toksyna Staph. aureus, alametacyna lub syntetyczny amfipatyczny polipeptyd. Fuzogenne białka płaszcza z cząsteczek wirusowych mogą być też wygodnym źródłem amfipatycznych sekwencji dla omawianych białek hedgehog.

C. Przygotowanie pochodnych lipidowych

Inna postać białka objętego przez wynalazek jest białkiem podstawionym szeregiem cząsteczek lipidowych. Na ogół „lipid” jest członkiem heterogennej klasy hydrofobowych substancji charakteryzowanych przez zmienną rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych i na ogół nierozpuszczalność w wodzie. Główne klasy lipidów, które są objęte przez ten wynalazek są to kwasy tłuszczowe i sterole (np. cholesterol). Podstawione białka wynalazku zawierają kwasy tłuszczowe, które są cykliczne, acykliczne (np. proste łańcuchy), nasycone lub nienasycone, kwasy monokarboksylowe. Przykładowe kwasy nasycone maja ogólny wzór CH3(CH2)nCOOH. Następująca tabela wylicza przykłady kwasów tłuszczowych które mogą być wygodnie podstawione stosując konwencjonalne sposoby chemiczne.

PL 197 833 B1

T a b e l a 2

Przykładowe Nasycone i Nienasycone Kwasy Tłuszczowe

Nasycone kwasy: CH3(CH2)nCOOH
Wartość n	Nazwa potoczna
2	kwas masłowy
4	kwas kapronowy
6	kwas kaprylowy
8	kwas kaprowy
10	kwas laurowy
12	kwas mirystylowy*
14	kwas palmitynowy*
16	kwas stearynowy*
18	kwas arachidonowy*
20	kwas behenowy
22	kwas lignocerowy
Nienasycone kwasy:
CH3CH=CHCOOH	kwas krotonowy
CH3(CH2)3CH=CH(CH2)yCOOH	kwas mirystolejowy*
CH3(CH2)5CH=CH(CH2)yCOOH	kwas palmitoolejowy*
CH3(CH2)yCH=CH(CH2)yCOOH	kwas olejowy*
CH3(CH2)3(CH2CH=CH)2(CH2)yCOOH	kwas linoleiowy
CH3(CH2CH=CH)3(CH2)yCOOH	kwas linolenowy
CH3(CH2)3(CH2CH=CH)4(CH2)3COOH	kwas arachidonowy

Gwiazdka (*) oznacza kwasy tłuszczowe, które znaleźliśmy w zrekombinowanych białkach hedgehog wydzielanych z rozpuszczalnego konstruktu

Inne lipidy, które mogą być przyłączone do białka obejmują kwasy tłuszczowe o rozgałęzionym łańcuchu i te o grupie fosfolipidowej takie jak fosfatydyloinozytole (tzn. 4-monofosforan fosfatydyloinozytolu i 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytol), fosfatydylocholina, fosfatydyloetanolamina, fosfatydyloseryna, i izoprenoidy takie jak grupy farnezylowe lub geranylowe.

Wykazaliśmy, że białka hedgehog zmodyfikowane przez lipidy mogą być oczyszczane z naturalnego źródła albo mogą być uzyskane przez chemiczną modyfikacją rozpuszczalnego niemodyfikowanego białka. Dla białka oczyszczanego z naturalnego źródła wykazaliśmy, że gdy ludzki Sonic hedgehog (Shh) był wyrażany w komórkach owadów i oczyszczono związany z błoną Shh z komórek traktowanych detergentem stosując kombinacje chromatografii na SP-Sefarozie i chromatografii immunopowinowactwa tak, że oczyszczone białko wędrowało na redukujących żelach SDS-PAGE jako pojedynczy ostry prążek z pozorną masą cząsteczkową 20 kDa (zob. Przykład 1). Rozpuszczalne i związane z błoną białka SHH były łatwe do odróżnienia za pomocą HPLC fazy odwróconej gdzie formy zakotwiczone eluowały później w gradiencie acetonitrylu (zob. Przykład 2 i Figura 3). Następnie wykazaliśmy, że ludzki Sonic hedgehog jest zakotwiczony do błon komórkowych w dwóch postaciach, jedna postać zawiera cholesterol, i jest więc analogiczna do danych opisanych uprzednio dla hedgehog Drosophila (18) a druga nowa postać, która zawiera zarówno modyfikację cholesterolem i kwasem paltmitylowym. Rozpuszczalne i zakotwiczone postacie Shh analizowano za pomocą elektrosprajowej spektrometrii masowej stosując potrójne kwadrupolowe spektrometry masowe, wyposażone w elektrosprajowe źródło jonów (Przykład 1) jak i przez chromatografię cieczową - spektrometrię masową (zob. Przykład 1). Tożsamość N-końcowego peptydu zakotwiczonego Shh trawionego endoproteinazą Lys-C została potwierdzona przez pomiar MALDI PSD na spektrometrze masowym czasu

PL 197 833 B1 przebiegu MALDI. Miejsce palmitoilacji identyfikowano poprzez kombinację mapowania peptydowego i analizy sekwencji na N-końcu białka (reszta 1 sekwencji dojrzałego białka w SEQ ID NO: 1-4). Obie zakotwiczone postacie były równie aktywne w oznaczeniu fosfatazy alkalicznej w C3H10T1/2, ale co jest interesujące oba były około 30 razy silniejsze niż rozpuszczalny ludzki Shh pozbawiony kotwic(y). Modyfikacje lipidów nie zmieniały znacząco pozornego powinowactwa wiązania dla Shh dla jego receptora, patched (Figura 7).

Sprawdziliśmy użyteczność podstawionych postaci przez oznaczenie względnych mocy rozpuszczalnych i zakotwiczonych Shh samego lub w obecności neutralizującego Mab anty-hedgehog na komórkach C3H10T1/2 oznaczając indukcje fosfatazy alkalicznej. Ponadto, względna siła rozpuszczalnego i zakotwiczonego Shh do wiązania patched była oceniona na komórkach EBNA-293 za pomocą analizy FACS (Przykład 3).

Dla modyfikowanego lipidem hedgehog uzyskanego przez chemiczną modyfikację rozpuszczalnego niezmodyfikowanego białka, wykazaliśmy, że kwas palmitynowy i inne lipidy mogą być dodane do rozpuszczalnego Shh aby stworzyć zmodyfikowane lipidami postacie o zwiększonej mocy w oznaczeniu C3H10T1/2 (Przykład 8). Wykazaliśmy (Przykłady 1, 2 i 8), że tiol i α-amina na N-końcowej cysteinie biorą udział w reakcji podstawiania przez tłuszcze. Bez chęci bycia związanym jakąś teorią, modyfikacja lipidu na białku rozpoczyna się od wytworzenie tioestrowego związku pośredniego i reszta lipidowa jest następnie przenoszona na α-aminę N-końca poprzez wytworzenie cyklicznego pośrednika. Na ogół więc reaktywna reszta lipidowa może być w postaci tioestów nasyconych lub nienasyconych kwasów karboksylowych takich jak tioestry koenzymu A. Takie materiały i ich pochodne mogą obejmować na przykład handlowo dostępne pochodne koenzymu A takie jak palmitooleilo koenzym A, arachidonylo koenzym A, arachidonoilo koenzym A, lauroilo koenzym A, i tym podobne. Materiały te są łatwo dostępne od Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, katalog 1998 str. 303-306).

Mierzono wpływ różnych reszt lipidów na funkcjonalną aktywność białka hedgehog (zob. Przykład 8 i 9 i Figury 10 i 11). Podobnie, wpływ efektów różnych reszt lipidowych na aktywność funkcjonalną innych białek takich jak te opisane powyżej w Części III może być wygodnie testowany stosując sposoby znane osobom o przeciętnych umiejętnościach. Na przykład funkcjonalne testowanie gelsoliny (50), różnych interferonów (α-interferon, β-interferon, γ-interferon) i różnych interleukin (np. IL-1, -2, -3, -4, i tym podobne), czynników martwicy nowotworów -α oraz -β i innych czynników wzrostowych, które są modyfikowane lipidami według wynalazku może być uzyskane stosując dobrze znane sposoby.

Choć ustaliliśmy chemiczne sposoby, za pomocą których kwas tłuszczowy może być przyłączony do N-końcowej cysteiny białek hedgehog, można by oczekiwać, że lipidy można przyłączyć do tego samego lub innych miejsc stosując reakcje katalizowane enzymatycznie. Palmitoilacja białek in vivo jest katalizowana przez klasę enzymów znanych jako S-palmitoilotransferazy palmitoiloCoA-białko. Stosując oczyszczone enzymy wykazano acylację substratów białkowych in vitro (80, 81). Substratowa specyficzność enzymów palmitoilotransferaz nie jest dobrze określona; analiza miejsc palmitoilacji białek komórkowych i wirusowych wykryła niewiele w stylu sekwencji najwyższej zgodności otaczającej zmodyfikowaną resztę cysteiny, ale sugeruje, wspólną obecność reszty lizyny lub argininy w odległości do dwóch aminokwasów od cysteiny, i duże, hydrofobowe aminokwasy w pobliżu cysteiny. N-końcowa sekwencja Shh, CGPGRGFG może pasować do tej sekwencji najwyższej zgodności i służyć jako miejsce rozpoznawane przy palmitoilacji.

Jako alternatywa, mirystoilacja tego samego N-końca białka hedgehog mogłaby być przeprowadzona stosując N-mirystoilotransferazę, których szereg zostało dobrze scharakteryzowanych zarówno u ssaków (82) i u drożdży (83). Miejsce rozpoznawane przez N-mirystoilotransferazę mogłoby być wprowadzone do N-końcowej sekwencji hedgehog aby ułatwić rozpoznanie przez enzym. Obie te strategie by wymagały użycia tłuszczowych pochodnych acylo-CoA jako substratów, i są stosowane do nieenzymatycznej acylacji tłuszczowej ludzkiego Sonic hedgehog opisanej w Przykładzie 8. Alternatywnie, białko ze skonstruowaną sekwencją rozpoznawania może być mirystoilowane w czasie ekspresji w odpowiedniej linii komórkowej. Innym sposobem modyfikacji białka takiego jak hedgehog z resztą hydrofobową jest stworzenie miejsca rozpoznawania dla dodania grupy izoprenoidowej na C-końcu białka. Miejsca rozpoznawania dla dodatku farnezylu i geranylogeranylu są znane i białko może być modyfikowane w czasie ekspresji w komórce eukariotycznej (Gelb i wsp., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:40-48 (1998)).

PL 197 833 B1

VI. Multimeryczne kompleksy białkowe

Niniejszym opisane, hydrofobowo zmodyfikowane białka nadają się do zrobienia z nich multimerycznych kompleksów białkowych. Multimeryczne kompleksy białkowe według wynalazku obejmują białka, opcjonalnie przyłączone przez swoją resztę hydrofobową (np. lipidową) do pęcherzyka. Pęcherzyk może być naturalnie występującą błoną biologiczną, oczyszczoną z materiału naturalnego albo pęcherzyk może być sztucznie skonstruowany. Preferowane pęcherzyki są strukturami kulistymi stworzonymi ze związków amfilicznych, np. związków powierzchniowo czynnych lub fosfolipidów. Lipidy tych kulistych pęcherzyków ogólnie zorganizowane są w formie lipidów posiadających jedną lub więcej warstw strukturalnych, np. pęcherzyki multilamellarne (wielokrotne podobne do cebuli skorupki podwójnych warstw lipidowych zawierające objętość wodną między dwuwarstwami) lub micelle.

W szczególności, liposomy są małymi, kulistymi pęcherzykami stworzonymi pierwotnie z różnych typów lipidów, fosfolipidów i drugorzędnych składników lipofilowych. Składniki te są zwykle zorganizowane w formę dwuwarstwową, podobną do organizacji lipidów w błonach biologicznych.

Typowo, polarny koniec składnika lipidowego lub cząsteczki podobnej fosfolipidu jest w kontakcie z otaczającym roztworem, zwykle roztworem wodnym, gdy niepolarny, hydrofobowy koniec lipidu lub cząsteczki podobnej do lipidu jest w kontakcie z niepolarnym, hydrofobowym końcem innego lipidu lub cząstki podobnej do lipidu. Uzyskana błona dwuwarstwowa (to jest pęcherzyk) jest selektywnie przepuszczalna dla cząsteczek o pewnym rozmiarze, hydrofobowości, kształcie i ładunku sieciowym. Większość pęcherzyków jest lipidowa, lub lipidopodobna z natury, chociaż istnieją alternatywne preparaty dwuwarstw liposomowych, obejmujące związki powierzchniowo czynne z albo lipidem albo cholesterolem.

Pęcherzyki liposomów mogą być szczególnie preferowane dlatego, że istnieje wiele zastosowań terapeutycznych, diagnostycznych, przemysłowych i handlowych. Wykorzystywane są do dostarczania cząsteczek, które nie są łatwo rozpuszczalne w wodzie, lub gdy pożądane jest uwalnianie czasowe. Z powodu ich selektywnej przepuszczalności dla wielu składników chemicznych, liposomy są użyteczne jako pęcherzyki dostarczające leki i materiał biologiczny. Tak więc, białka wyprowadzone od lipidów, takie jak hedgehog można uczynić multimerami przez włączenie do dwuwarstwy lipidowej pęcherzyków liposomowych. Przy docieraniu do celu liposomy mogą być degradowane (na przykład przez enzymy przewodu pokarmowego) lub mogą ulegać fuzji z błonami komórek.

Znanych jest kilka metod przygotowywania pęcherzyków takich jak liposomy. Produkcja pęcherzyków fosfolipidowych jest dobrze znana (53). Dla ogólnego wglądu w powszechnie stosowane metody patrz (54). Pośród bardziej powszechnych z nich są (1) sonikacja roztworu zawierającego lipidy po której czasami następuje odparowanie/liofilizacja i rehydratacja (patrz np. Stryer, Biochemistry, pp. 290-291), Freeman & Co., New York, (1988), i (55); (2) homogenizacja roztworu lipidów, czasami pod wysokim ciśnieniem lub wysoką siłą rozrywającą (patrz np. U.S. Pat. Nr 4.743.449 wydany 10 Maja 1988 i U.S. Pat. Nr 4.753.788 wydany 28 czerwca 1988), (3) Hydratacja i czasami sonikacja wysuszonej warstewki lipidów tworzących pęcherzyk gdzie warstewkę lipidów przygotowuje się przez odparowanie roztworu lipidów rozpuszczonych w rozpuszczalnikach organicznych (patrz np. U.S. Pat. Nr 4.452.747 wydany 5 czerwca 1984, U.S. Pat. Nr 4.895.719 wydany 23 stycznia 1990 i U.S. Pat. Nr 4.946.787 wydany 7 sierpnia 1990), (4) liofilizacja lub odparowanie i rehydratacja (patrz np. U.S. Pat. Nr 4.897.355 wydany 30 stycznia 1990, EP 172.007 opublikowany 5 listopada 1986 i australijskie zgłoszenie patentowe AU-A-48713/85 opublikowane 24 kwietnia 1986), (5) wstrzyknięcie rozpuszczalnika lub infuzja roztworu lipidu do środowiska wodnego lub odwrotnie (patrz np. (56); U.S. Pat. Nr 4.921.757 wydany 1 Maja 1990, U.S. Pat. Nr 4.781.871 wydany 1 listopada 1988, WO 87/02396 opublikowany 24 marca 1988 i U.S. Pat. Nr 4.895.452 wydany 23 stycznia 1990), (6) Osuszenie rozpylaczem (patrz np. australijskie zgłoszenie patentowe AU-A-48713/85 opublikowane 24 kwietnia 1986 i U.S. Pat. Nr 4.830.858 wydany 16 maja 1989), (7) filtracja (patrz np. WO 85/01161), (8) odparowanie odwróconej fazy. Patrz np. (57); i (9) kombinacje powyższych metod. Patrz np. (58) i (59).

Preferowane lipidy i składniki podobne do lipidów nadające się do wykorzystania przy tworzeniu pęcherzyków obejmują fosfolipidy, mieszaninę fosfolipidów, lipidy polarne, lipidy neutralne, kwasy tłuszczowe i ich pochodne. Preferowany lipid charakteryzuje się tym, że sam rozpuszczony w wodzie, w temperaturze wyższej niż temperatura tranzycji lipidu, jest w fazie emulsyjnej lipidów. W pewnych zastosowaniach, lipid jest pojedynczym łańcuchem alifatycznym więcej niż 12 węgli i może być albo saturowany, albo niesaturowany, albo podstawiony w inny sposób. Odpowiednie lipidy obejmują estrowe, alkoholowe i kwasowe formy następujących kwasów tłuszczowych: stearynianu, kwasu oleinowego, kwasu linolowego, arachidynianu, kwasu arachidonowego i innych kwasów o pojedynczym łańcuchu alifatycznym. Kolejni kandydaci obejmują estrowe, alkoholowe i kwasowe formy retinoli,

PL 197 833 B1 w szczególności retinolu i kwasu retinoinowego. Inne preferowane lipidy obejmują fosfatydylocholinę (PC), fosfatydyloglicerol (PG) i inne pochodne, stworzone syntetycznie lub pochodzące z różnorodnych źródeł naturalnych.

W pewnych zastosowaniach, pęcherzyki mogą być stabilizowane sterycznie przez włączenie glikolu polietylenowego (PEG), lub przez grupy główne PEG fosfolipidów syntetycznych (PEG połączony z disteroilo fosfatydyloetanoloaminą (DSPE), patrz np. (61). Preferowanymi substancjami powierzchniowo czynnymi są takie o dobrej zdolności do mieszania się jak Tween™, Triton™, sól sodowa siarczanu dodecylu, laurylosiarczanu sodowego lub oktyloglikozyd sodowy.

Preferowane substancje powierzchniowo czynne dodane do wody tworzą micelle w temperaturze wyższej niż temperatura tranzycji fazy substancji powierzchniowo czynnej. Substancje powierzchniowo czynne mogą składać się z jednego lub więcej łańcuchów alifatycznych. Łańcuchy alifatyczne mogą być saturowane, niesaturowane lub podstawione w inny sposób, jak przez oksyetylowanie; typowo łańcuchy alifatyczne zawierają więcej niż około 12 węgli. Dodatkowe odpowiednie substancje powierzchniowo czynne obejmują następujące: laurylo-, mirystylo-, linoleilo-, lub stearylo-sulfobetainę; laurylo-, mirystylo-, linoleilo-, lub stearylo-sarkozynę; linoleilo-, mirystylo-, lub cetylo-betainę; lauroamidopropylo-, kokamidopropylo-, linoleoamidopropylo-, mirystamidopropylo-, palmidopropylo-, lub izosteramidopropylo-betainę (np. lauroamidopropyl); myristyamidopropylo-, palmidopropylo-, lub izostearoamidopropylo-dimetyloaminę; sodowy metylokokoilo-, lub dwusodometylooleilo-taurat; i serie MANAQUAT (Mona Industries, Inc., Paterson, N. J.) Patrz także przykład 4.

Preferowane sterole i estry steroli odpowiednie do wykorzystania w preparatyce multimerycznych kompleksów białkowych obejmują cholesterol, cholestanol, siarczan cholesterolu oraz inne analogi i pochodne cholesterolu. Fakt, że pęcherzyk może składać się z wielu różnych lipidów i detergentów zapewnia ogromną elastyczność manipulowania zakotwiczonymi kompleksami białko-pęcherzyk o pożądanych właściwościach. Na przykład, można wyprodukować pęcherzyki wiążące różną liczbę białek przez zmienianie składu lipidów materiału początkowego by stworzyć pęcherzyki większe, albo przez zwiększanie procentu lipidów fosfatydyloinozytolowych w pęcherzyku.

VII. Użyteczności

Ogólnie, niniejszym opisane, zmodyfikowane białka są użyteczne w leczeniu niektórych stanów medycznych, które można leczyć niezmodyfikowanymi formami białek. Jednakże, niniejszym opisane, hydrofobowo zmodyfikowane białka dostarczają kilku znaczących ulepszeń w porównaniu z formami niezmodyfikowanymi. Po pierwsze, ich zwiększona siła umożliwia leczenie mniejszą ilością białka i przez krótszy okres czasu. Będzie to istotne przy obu zastosowaniach: systemowych i CNS. Po drugie, zastąpienie N-końcowej cysteiny aminokwasem mniej reaktywnym chemicznie umożliwia łatwiejszą produkcję, preparatykę i przechowywanie białka do zastosowań klinicznych. Po trzecie, farmakodynamika białka zmieni się przez modyfikacje hydrofobowe i umożliwi to białkom lokalizację w sąsiedztwie miejsca podawania, a więc zwiększy ich bezpieczeństwo przez minimalizację systematycznego narażenia i ich efektywność przez zwiększenie ich stężenia miejscowego. Białka według wynalazku są także użyteczne w kompozycjach diagnostycznych i metodach wykrywania odpowiednich dla nich receptorów.

Jako przykład do punktu pierwszego, stwierdzono, że okres pół-rozpadu hedgehog jest bardzo krótki po podaniu systemowym i aby uzyskać silną odpowiedź na białko konieczne są wielokrotne zastrzyki. Większa siła form zmodyfikowanych i możliwość preparowania w liposomach dostarcza środka do osiągnięcia odpowiedzi stosując niewiele zabiegów. Dla podawania CNS, większa siła dostarcza środka zaopatrzenia odpowiedniej ilości białka w małych objętościach wymaganych przy bezpośrednim zastrzyku do CNS.

Znaczenie punktu drugiego ilustruje fakt, że odkryliśmy, że N-końcowa cysteina hedgehog jest wysoce wrażliwa na atak chemiczny, albo tworząc inne chemiczne związki addukcyjne, albo dimeryzując oksydatywnie z innymi białkami hedgehog. Aby temu zapobiec, w czasie oczyszczania używa się specjalnych buforów i procedur, a w końcowej preparatyce stosuje się ditiotreitol. Takie środki ostrożności wymuszają uważną ocenę wpływu buforu do preparatu w modelach zwierzęcych.

Jako przykład punktu trzeciego, im bardziej ograniczony jest zakres w obrębie którego dyfunduje białko z miejsca podania, tym wyższe stężenie miejscowe. Wyższe stężenie miejscowe może więc pozwolić na bardziej specyficzne odpowiedzi kliniczne w czasie leczenia zaburzeń neurologicznych po bezpośrednim wstrzyknięciu do pożądanego obszaru mózgu lub rdzenia kręgowego.

Podobnie, zmodyfikowane białka można podawać lokalnie w miejsce pęknięcia kości by wspomóc leczenie tych pęknięć, do gonad by leczyć zaburzenia płodności, do oka by leczyć zaburzenia

PL 197 833 B1 oczu i pod skórę by leczyć stany dermatologiczne i aby stymulować miejscowy porost włosów. Lokalizacja zmodyfikowanych hyrofobowo białek w miejscu podania redukuje więc możliwość niepożądanego narażenia systemowego innych narządów i tkanek.

Do zastosowań terapeutycznych, hydrofobowo zmodyfikowane białka według wynalazku umieszcza się w dopuszczanych farmaceutycznie, sterylnych, izotonicznych preparatach i opcjonalnie podaje dobrze znanymi w dziedzinie środkami. Preparat jest preferencyjnie ciekły, albo może być liofilizowanym proszkiem. Przewiduje się, że podawanie terapeutyczne, na przykład, multimerycznego kompleksu białkowego może obejmować włączanie przez liposomy opisanych tutaj białek pochodnych.

Docenione zostanie przez osoby o podstawowej biegłości w dziedzinie, że szczegółowe podawanie, dawkowanie i zastosowania kliniczne białek zmodyfikowanych hydrofobowo według wynalazku będzie różnić się w zależności od konkretnego białka i jego aktywności biologicznej.

Jako zaledwie jeden przykład zastosowania białek według niniejszego wynalazku w kontekście terapeutycznym, lecznicze hydrofobowo zmodyfikowane białka hedgehog można podawać pacjentom cierpiącym z powodu różnorodnych stanów neurologicznych. Zdolność białka hedgehog do regulacji różnicowania neuronalnego w czasie rozwoju systemu nerwowego a także, przypuszczalnie, w stanie dorosłym wskazuje, że od hydrofobowo zmodyfikowanego hedgehog słusznie można oczekiwać ułatwiania kontroli dorosłych neuronów pod względem utrzymania, działania i starzenia normalnych komórek; procesów naprawy i regeneracji w komórkach uszkodzonych; oraz zapobiegania degeneracji i przedwczesnej śmierci powodowanej przez utratą różnicowania w pewnych stanach patologicznych. W świetle tego, obecne kompozycje hydrofobowo zmodyfikowanego hedgehog, przez leczenie miejscową infuzją, mogą zapobiegać i/lub redukować ciężkość stanów neurologicznych pochodzących z: (i) ostrych, podostrych lub chronicznych uszkodzeń systemu nerwowego, obejmujących uszkodzenia urazowe, uszkodzenia chemiczne, uszkodzenia naczyniowe i deficyty (takie jak niedokrwienie z powodu udaru) wraz z uszkodzeniami powodowanymi przez infekcje i nowotwory; (ii) starzenia systemu nerwowego włączając chorobę Alzheimera; (iii) chronicznych chorób neurodegeneracyjnych systemu nerwowego, włączając chorobę Parkinsona, chorobę Huntingtona, stwardnienie zanikowe boczne i podobne; oraz (iv) chroniczne choroby immunologiczne systemu nerwowego włączając stwardnienie rozsiane. Hydrofobowo zmodyfikowane białka można także wstrzykiwać do płynu mózgowo-rdzeniowego, np. w celu skierowania do miejsc deficytów komórek mózgu albo do systemu limfatycznego lub krwi w miarę potrzeby leczenia zaburzeń specyficznych względem innej tkanki lub narządu.

Kompozycje hedgehog według wynalazku można użyć do uchronienia, na przykład różnych neuronów przed śmiercią spowodowaną przez uszkodzenie jak też jako przewodnika do przeprojektowania neuronów po takim uszkodzeniu. Uszkodzenie takie można przypisać do stanów obejmujących ale nie ograniczanych przez zawał urazowy CNS, infekcję, chorobę metaboliczną, niedobory żywieniowe i czynniki toksyczne (takie jak działanie cisplatyną). Pewne białka hedgehog powodują, że neoplastycznie lub hiperplastycznie stransformowane komórki stają się albo postmitotyczne albo apoptotyczne. Takie kompozycje można, więc używać w leczeniu na przykład złośliwych glejaków, blastom szpiku i raków neuroektodermalnych.

Białka można także połączyć z wykrywalnymi markerami, takimi jak substancje nieprzejrzyste fluoroskopowo lub radiograficznie i podawać osobnikom by umożliwić obrazowanie tkanek eksprymujących receptory hedgehog. Białka można także wiązać z substancjami, takimi jak peroksydaza z chrzanu, których można używać jako barwników immunocytochemicznych by umożliwić uwidocznienie obszarów komórek pozytywnych względem ligandów dla hedgehog na przekrojach histologicznych. Hydrofobowo zmodyfikowane białka według wynalazku, albo same, albo jako wielowartościowe kompleksy białkowe, można wykorzystać aby specyficznie ukierunkować medyczne terapie przeciwko rakom i nowotworom, które wyrażają receptor dla białka, materiały takie mogą być efektywniejsze jako leki na raka przez użycie ich jako pęcherzyków dostarczających leki antyneoplastyczne, toksyny i radionuklidy komórkobójcze, takie jak itr 90.

Toksyny mogą być także sprzężone z hydrofobowo zmodyfikowanym hedgehog (albo zawierającym pęcherzyk wielowartościowym jego kompleksem) by selektywnie ukierunkować i zabić komórki odpowiadające na hedgehog, takie jak nowotwory eksprymujące receptor(y) dla hedgehog. Inne toksyny są równie użyteczne, jak wiadomo specjalistom. Toksyny takie obejmują, ale nie ograniczają się do egzotoksyny Pseudomonas, toksyny Diphtheria i saporyny. Podejście takie powinno okazać się skuteczne, ponieważ receptor(y) dla hedgehog ulegają ekspresji w bardzo ograniczonej liczbie tkanek. Innym podejściem do takich terapii medycznych jest wykorzystanie hydrofobowo zmodyfikowanych białek wyznakowanych radioizotopowo (lub ich kompleksów wielowartościowych). Takie składniki

PL 197 833 B1 wyznakowane radioaktywnie będą preferencyjnie kierować radioaktywność do miejsc wyrażających receptor(y), oszczędzając zdrową tkankę. W zależności od użytego radioizotopu, promieniowanie emitowane z wyznakowanego białka związanego z komórką nowotworową może zabijać także sąsiednie złośliwe komórki nowotworowe nie wyrażające receptora białkowego. Można zastosować różnorodne nuklidy. Radio-jod (na przykład l¹³¹) odniósł sukces w zastosowaniu z przeciwciałami monoklonalnymi przeciw CD20 obecnemu w limfomach komórek B (63).

Kompozycje białkowe do wykorzystania w terapii będą preparowane i ustalane będą dawki w sposób zgodny z dobrą praktyką medyczną, biorąc pod uwagę leczone zaburzenie, stan indywidualnego pacjenta, miejsce dostarczenia izolowanego peptydu, metodę podawania i inne czynniki znane praktykom. Terapeutyk może zostać przygotowany do podawania przez zmieszanie białka, pęcherzyka zawierającego białko, albo kompleksu pochodnego o pożądanym stopniu czystości z fizjologicznie dopuszczanymi nośnikami (np. nośnikami nietoksycznymi dla biorcy w stosowanych dawkach i stężeniach).

Przewiduje się, że lokalne dostarczanie do miejsca będzie pierwszym sposobem podawania terapeutycznego białek według wynalazku. Dożylne podawanie, lub podawanie poprzez kateter lub inną rurkę chirurgiczną może także być przewidywane. Alternatywny sposób obejmuje tabletki i podobne, handlowo dostępne nebulizery do preparatów lipidowych i inhalacje preparatów liofilizowanych lub w aerozolu. Płynne preparaty można wykorzystać po odzyskaniu z preparatów proszkowych.

Podawana dawka zależeć będzie od właściwości użytego pęcherzyka i białka, np. jego aktywności wiązania i okresu półtrwania w cytoplazmie in vivo, stężenia pęcherzyka i białka w preparacie, sposobu podawania, miejsca i tempa dawkowania, tolerancji klinicznej pacjenta, stanu patologicznego z powodu którego cierpi pacjent i podobnych, jak dobrze wiadomo lekarzom. Ogólnie, preferowane są dawki od około 5 x 10⁷ do 5 x 10⁹ mola białka na pacjenta na podanie, chociaż dawka zależeć będzie od natury białka. Różne dawki można wykorzystywać w czasie serii kolejnych podań.

Wynalazek jest także ukierunkowany na preparaty farmaceutyczne obejmujące białko hedgehog zmodyfikowane zgodnie z wynalazkiem, w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczanym nośnikiem. W jednym zastosowaniu, preparat zawiera także pęcherzyki.

Hydrofobowo zmodyfikowane białka hedgehog według wynalazku są także użyteczne w metodach terapii genowej.

Dla zaburzeń neurodegeneracyjnych dostępne jest kilka modeli zwierzęcych o których sądzi się, że mają pewną kliniczną wartość prognostyczną. Dla choroby Parkinsona modele wymagają ochrony lub odzyskiwania w gryzoniach lub naczelnych w których szlak dopaminergiczny prążków czarnych jest uszkodzony albo przez systemowe podawanie MPTP albo lokalne (doczaszkowe) podawanie 6-hydroksydopaminy [6-OHDA], dwóch wybiórczo dopaminergicznych toksyn. Specyficznymi modelami są: model myszy traktowanych MPTP (64); model naczelnych traktowanych MPTP (marmoset albo rezus) (65); i model szczurzy z jednostronnym uszkodzeniem przez 6-OHDA (66). Dla ALS (ang. amyotrophic lateral sclerosis, stwardnienie zanikowe boczne) modele obejmują traktowanie kilku szczepów myszy wykazujących spontaniczną degeneracje neuronów ruchowych włączając myszy wobbler (67) i pmn (68) i transgeniczne myszy wyrażające zmutowany gen ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej (hSOD), który został sprzężony z rodzinnym ALS (69). Dla uszkodzeń rdzenia kręgowego, najpowszechniejsze modele obejmują uszkodzenia przy stłuczeniu u szczurów, albo przez upuszczenie skalibrowanego ciężaru, albo uszkodzenia hydrodynamiczne (70). Dla Huntingtona modele obejmują ochronę przed toksyną pobudzającą (NMDA, kwas hinolowy, kwas kainowy, kwas 3-nitro propionowy, APMA) uszkodzeniem prążkowia u szczurów (71, 72). Ostatnio opisano także model myszy transgenicznej nadeksprymującej ludzkie powielające się powtórzenia trzynukleotydowe w genie huntingtyny (73). Dla stwardnienia rozsianego, EAE u myszy i szczurów indukuje się przez immunizację MBP (podstawowe białko mieliny) lub pasywny transfer komórek T aktywowanych MBP (74). Dla Alzheimera odpowiednim modelem szczurzym jest ustalenie ochrony przed uszkodzeniami strzępków sklepienia u szczurów (uszkodzenie przegrodowe), głównej wiązki nerwowej dostarczającej unerwienia cholinergicznego hipokampusa (75), jak też wykorzystanie myszy transgenicznej nadeksprymującej ludzki gen beta amyloidu. Dla neuropatii obwodowych odpowiednim modelem jest ochrona przed utratą przewodnictwa nerwów obwodowych powodowaną przez czynniki chemioterapeutyczne takie jak taksol, winkrystyna i cisplatyna u myszy i szczurów.

Niniejszy wynalazek zostanie teraz pełniej opisany w odniesieniu do następujących, nieograniczających przykładów.

P r z y k ł a d 1: Ludzkie sonic hedgehog jest zmodyfikowane lipidowo gdy ulega ekspresji w komórkach owadów.

PL 197 833 B1

A. Ekspresja ludzkiego sonic hedgehog cDNA dla ludzkiego sonic hedgehog (Shh) pełnej długości dostarczono jako fragment EcoRI o ^dłu^go^ścⁱ 1,6 ^kb subldonowany w ^pB^lue-scr^{ipt S}K⁺ (20) (dar Dav^ida Bumcrota z Onto^geny, Mc. Cambridge MA). Miejsca Notl na końcach 5' i 3' bezpośrednio flankujące otwartą ramkę odczytu Shh dodano przez mutagenezę poprzez eliminację unikalnego miejsca wykorzystując zestaw Pharmacia i postępując zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Fragment Notl o wielkości 1,4 kb niosący cDNA Shh pełnej długości subklonowano do owadziego wektora ekspresyjnego pFastBac (Life Technologies, Inc.). Stworzono zrekombinowany bakulowirus stosując procedury dostarczone przez Life Technologies, Inc. Uzyskany wirus wykorzystano do stworzenia zapasu wirusa o wysokim mianie. Poniżej opisano metody użyte do produkcji i oczyszczenia Shh. Obecność związanego z błoną Shh zbadano przez FACS i analizę Western. Szczytowa ekspresja pojawiła się po 48 h po infekcji. Do analizy Western nadsącze i lizaty komórkowe z komórek infekowanych Shh lub nieinfekowanych poddano SDS-PAGE w 10-20% gradiencie żelowym w warunkach redukujących, przeprowadzono transfer elektroforetyczny na nitrocelulozę i wykrywano Shh króliczą antysurowicą poliklonalną przeciw koniugatowi N-końcowego peptydu będącego 15-to merem Shh i hemocyjaniny skałoczepa. Lizaty komórkowe robiono przez inkubację komórek przez 5 min. w 25°C w 20 mM Na2HPO4 pH 6,5, 1% nonided P-40 i 0,5% deoksycholanie sodowym i osadzanie cząstek stałych przy 13 000 rpm przez 10 min. w 4°C w wirówce Eppendorf.

B. Oczyszczanie ludzkiego sonic hedgehod zakotwiczonego w błonie

Formę Shh zakotwiczoną w błonie stworzono w komórkach owadzich High Five™ (lnvitrogen) wykorzystując zrekombinowane bakulowirusy kodujące Shh pełnej długości omawiane powyżej. Komórki High Five™ hodowano w 28°C w pożywce sf900 II wolnej od surowicy (Life Technologies, Inc.) w 10 l bioreaktorze z kontrolą tlenową, komórki infekowano w późnej fazie logarytmicznej przy około 2 x 10⁶ komórek/ml wirusem o MOI wynoszącym 3 i zbierano 48 h po infekcji (żywotność komórek w czasie zbierania wynosiła > 50%). Komórki zbierano przez wirowanie i płukano w 10 mM Na2HPO4 pH 6,5, 150 mM NaCI pH plus 0,5 mM PMSF. Uzyskany osad komórek (150 g wagi) zawieszono w 1,2 l 10 mM Na2HPO4 pH 6,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM PMSF, 5 pM pepstatynie A, 10 pg/ml leupeptynie i 2 pg/ml E64 i wtedy dodano 120 ml 10% roztworu Triton Χ-100.

Po 30 min. inkubacji w lodzie cząstki stałe usunięto przez wirowanie (1500 x g, 10 min.). Wszystkie następne etapy przeprowadzano w 4-6°C. pH nadsączu doprowadzono do 5,0 roztworem 0,5 M MES pH 5,0 (końcowe stężenie 50 mM) załadowano na kolumnę 150 ml SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Kolumnę płukano 300 ml 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM PMSF, 0,1% Nonided P-40, a następnie 200 ml 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 300 mM NaCI, 0,1% Nonided P-40 i związane hedgehog wypłukano 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 800 mM NaCI, 0,1% Nonided P-40.

Shh poddano następnie chromatografii immunopowinowactwa na złożu 5E1-Sepharose przygotowanym przez sprzężenie 4 mg przeciwciał na ml złoża Sepharose 4B aktywowanego CNBr. Pulę elucyjną SP-Sepharose rozcieńczono dwoma objętościami 50 mM HEPES pH 7,5 i porcjami załadowano na złoże 5E1 (1h). Złoże zebrano na kolumnie, przepłukano 10 objętościami kolumny PBS zawierającym 0,1% uwodorniony Triton Χ-100 (Calbiochem) i wypłukiwano 25 mM Na2HPO4 pH 3,0, 200 mM NaCI, 0,1% uwodornionego Triton Χ-100. Frakcje elucyjne neutralizowano 0,1 objętością 1M HEPES pH 7,5 i analizowano pod kątem całkowitej zawartości białka z pomiarów absorbancji przy 240-340 nm i czystości przez SDS-PAGE. Frakcje przechowywano w -70°C.

Szczytowe frakcje z trzech etapów powinowactwa zebrano, rozcieńczono 1,3 objętości 40 mM HEPES pH 7,5, 0,2% uwodornionego Triton Χ-100 i znowu porcjami nałożono na złoże 5E1. Złoże zebrano na kolumnie, przepłukano trzema objętościami kolumny PBS pH 7,2, 1% oktyloglikozyd (US Biochemical Corp.) i wypłukano 25 mM Na2HPO4 pH 3,0, 200 mM NaCI, 1% oktyloglikozyd. Frakcje elucyjne neutralizowano i analizowano jak opisano wyżej, zebrano, filtrowano przez filtr 0,2 mikrona, porcjowano i przechowywano w -70°C.

Gdy pełnej długości ludzkie sonic hedgehog (Shh) eksprymowano w owadzich komórkach High Five™, ponad 95% fragmentu N-końcowego wykrywano metodą Western w formie związanej z komórkami. Przy SDS-PAGE, oczyszczone białko migrowało jako jeden ostry prążek o widocznej masie 20 kDa (Rysunek 1, ścieżka c). Białko migrowało szybciej o około 0,5 kDa niż rozpuszczalna wersja białka produkowana w E. coli (Rysunek 1, kieszonki b-d), zgodnie z opublikowanymi wcześniej danymi (19). Podobnie jak opisano (19), rozpuszczalna i związana z błoną forma białka Shh były także wyraźnie rozróżnialne przez HPLC w odwróconej fazie gdzie zakotwiczona forma wypłukiwana była później

PL 197 833 B1 w gradiencie acetonitrylu. Stężenie acetonitrylu potrzebne do elucji formy związanej z błoną wynosiło 60%, a tylko 45% dla formy rozpuszczalnej; wskazując znaczący wzrost hydrofobowości białka.

C. Analiza związanego z błoną ludzkiego sonic hedgehog przez spektrometrię masową

Próbki Shh poddano HPLC w odwróconej fazie na kolumnie C4 (Vydac, nr kat. 214TP104, rozmiar kolumny 4,6 wewnętrznej średnicy x 250 mm) w temperaturze otoczenia. Związane składniki wypłukiwano przez 30 min. 0-80% gradientem acetonitrylu w 0,1% kwasie trójfluorooctowym z szybkością przepływu 1,4 ml/min. Ciecz wypływającą z kolumny monitorowano przy 280 nm i zbierano frakcje co 0,5 min. 25 μΙ próby frakcji zawierających białka suszono na zagęszczaczu Speed Vac, rozpuszczano w buforze do próbek do elektroforezy i analizowano przez SDS-PAGE. Frakcje zawierające hedgehog zebrano razem, zagęszczono czterokrotnie w zagęszczaczu Speed Vac i zawartość białka oceniano przez absorbancją przy 280 nm stosując współczynnik ekstynkcji 1,33 dla 1 mg/ml roztworu Shh. Próbki poddano ESI-MS na potrójnym kwadropolowym spektrometrze masowym Micromass Quattro II wyposażonym w źródło elektrosprayowe jonów. Objętość 6 μl hedgehog oczyszczonego przez HPLC wlano bezpośrednio do źródła jonów z szybkością 10 μΙ/min stosując jako rozpuszczalnik w pompie strzykawkowej 50% wodę, 50% acetonitryl, 0,1% kwas mrówkowy. Skany uzyskiwano poprzez wlewanie próbki. Wszystkie dane z elektrosprayowego widma masy uzyskiwano i przechowywano w profilu oraz obrabiano stosując system Micromass MassLynx.

Peptydy z trawienia pirydyloetylowanego Shh endoproteinazą Lys-C analizowano przez HPLC w odwróconej fazie równocześnie z potrójnym kwadropolowym spektrometrem masowym Micromass Quattro II. Trawienia rozdzielano na kolumnie Reliasil C18 stosując Michrom™: ultraszybki system Microprotein Analyzer przy szybkości przepływu 50 μΙ/min w 5-85% gradiencie acetonitrylu w 0,05% kwasie trójfluorooctowym. Skany zbierano z m/z 400-2000 przez przebieg i obrabiano jak opisano wyżej.

Sekwencjonowanie N-końcowego peptydu z zakotwiczonego Shh przeprowadzano przez pomiar Sourse Decay (PSD) na Voyager-DE™ STR (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) spektrometrze masowym TOF stosując kwas a-cyjano-4 hydroksycynamonowy jako macierz (22,23). Dokładnie 0,5 ml peptydu trawionego endoproteinazą Lys-C oczyszczonego na HPLC zmieszano z 0,5 μl macierzy płytce docelowej. Aby pokryć całe widmo fragmentów jonowych, napięcia lustrzane obniżono z 20 do 1,2 kV w 11 etapach.

Dane ze spektrometrii elektrorozpylanej masy jonizacyjnej dla rozpuszczalnych i związanych z błoną form Shh wykazały masy odpowiednio 19560 i 20167 Da (Rysunek 2). Zmierzona masa 19560 pasuje do przewidzianej masy dla Shh zaczynającego się od Cys-1 i kończącego się Gly-174 (obliczona masa 19560,02 Da). W odróżnieniu, masa 20167 nie zgadzała się z żadnym dostępnym przewidywaniem, ani różnicy w masie zakotwiczonej i rozpuszczalnej formy nie można było wyjaśnić żadną znaną modyfikacją lub odmienną obróbką proteolityczną. Wcześniej, Porter i wsp. (18) wykazali, że hedgehog z Drospohila zawierało resztę cholesterolową więc możliwe było, że różnica masy w systemie ludzkim była spowodowana przynajmniej częściowo przez cholesterol (obliczona masa estryfikowanego cholesterolu wynosi 368,65 Da). Obecność mniejszego składnika w widmie masy związanego Shh przy 19796, która różni się od pierwszego szczytu o 371 Da popiera tę możliwość.

Późniejsze dane dla cholesterolu otrzymano przez traktowanie związanego Shh słabymi związkami zasadowymi w warunkach w których można rozerwać wiązanie z cholesterolem bez naruszenia wiązań peptydowych (18), a następnie ponownie analizowano produkt reakcji przez spektroskopię masową (MS). Krótko, Shh pochodzące z komórek owadzich traktowano 50 mM KOH, 95% metanolem przez 1 h w temperaturze otoczenia i analizowano przez ESI-MS lub trawiono endoproteinazą Lys-C i poddawano LC (od ang. liquid chromatography, chromatografia cieczowa)-MS na potrójnym kwadropolowym spektrometrze masowym Micromass Quattro II. W próbkach poddawanych LC-MS białka wpierw traktowano 4-winylopirydyną. Działanie zasadą przesuwało masę o 387 Da co jest zgodne z utratą cholesterolu z wodą (patrz Tabela 3). Masa rozpuszczalnego Shh nie była zaburzana przez działanie zasadą. Razem, obserwacje te sugerowały, że związane z błoną ludzkie Shh zawierało dwie modyfikacje, cholesterol i drugą resztą o masie 236 Da. Podobieństwo masy między tą wartością i masą dodanej grupy palmitoilowej (238 Da) sugerowało, że białko może być palmitoilowane. Bardziej dokładne oszacowania masy, omówione poniżej ujawniły korelacją w obrębie 0,1 Da przewidywanej masy reszty palmitoilowej.

PL 197 833 B1

T a b e l a 3

Charakteryzacja związanego Shh przez SM.

Obliczone wartości masy ustalono stosując średnią masę reszty wraz z izotopowo uprotonowanymi masami w części b.

Białko	Masa (Da)
Obliczona	Mierzona
a. Shh traktowane KOH
nie związane	(-traktowanie)	19560,20	19560,00
nie związane	(+traktowanie)	19560,20	19561,00
związane	(-traktowanie)	20167,14	20167,00
związane	(+traktowanie)	19798,49	19780,00
B. Peptyd N-końcowy po cięciu endoproteinazą Lys-C (MH+)*
nie związane		983,49	983,50
związane		1221,72	1221,79

Wszystkie wartości masy niniejszym opisane są masami uprotonowanymi

Następnie ustaliliśmy, że zakotwiczone Shh można frakcjonować na podtypach HPLC z modyfikowanym gradientem elucyjnym i stworzyliśmy proste oznaczenie HPLC do obliczania różnych form. Wyniki tej analizy pokazano na Rysunku 3. W oznaczeniu tym niezmodyfikowane Shh wypłukuje się pierwsze (pik 1), następnie wypłukuje się Shh zmodyfikowane cholesterolem (pik 2) a na końcu wypłukuje się produkt zawierający obie modyfikacje Shh, cholesterol i kwas palmitynowy (pik 3). Złożony kształt piku 3 odzwierciedla obecność zmodyfikowanej formy grupy palmitoilowej zidentyfikowanej przez sekwencjonowanie przez pomiar MALDI PSD. Wariant był o 2 Da mniejszy niż przewidywano i stąd może zawierać niesaturowane wiązanie (dane nieprezentowane).

D. Lokalizacja modyfikacji kwasem palmitynowym w sekwencji ludzkiego sonic hedgehog.

Miejsce palmitoilacji w sekwencji ludzkiej zidentyfikowano używając kombinacji mapowania peptydu i analizy sekwencji. Rysunek 4B pokazuje wyniki analizy mapowania peptydu rozpuszczalnego białka przez odczyt LC-MS. Dane masowe zapisane dla ponad 98% sekwencji rozpuszczalnego Shh można wytłumaczyć na podstawie analizy. Pik oznaczony gwiazdką odpowiada N-końcowi peptydu (reszty 1-9 plus winylopirydyna, obserwowana masa 983,50 Da, obliczona masa 983,49 Da; Tabela 3). W analogicznej analizie produktu zakotwiczonego (Rysunek 4A), peptydu tego brakowało a w zamian obserwowano bardziej hydrofobowy peptyd o masie 1221,79 Da (oznaczony gwiazdką).

Związek o wielkości 1221,79 Da jest zgodny z obecnością zmodyfikowanej formy N-końcowego peptydu to jest 983,49 Da dla składnika peptydowego plus 238,23 Da. Peptyd 1221,79 Da następnie poddano analizie sekwencyjnej przez pomiar MALDI PSD. Uzyskane widmo PSD pokazano na Rysunku 5. Wykryto jony odpowiadające fragmentom b1, b2, b4, b5, b8 + H2O, y8, y7, y5, y4, y2 i y1 co potwierdziła sekwencja. W dodatku jony b1 i b2 wskazywały, że pirydyloetylowany addukt Cys-1 był palmitoilowany. Tylko jony zawierające Cys-1 posiadały dodane 238,23 Da masy.

Jako, że cysteina jest normalnym miejscem palmitoilacji białek in vivo, odnalezienie nowego adduktu przyłączonego do N-końcowej cysteiny nie było zdumiewające. Jednakże, dwie składowe danych sugerowały, że lipid był dołączony do grupy aminowej cysteiny, a nie do tiolowej. Po pierwsze w badaniach mapowania peptydu użyliśmy 4-winylopirydyny jako znacznika spektroskopowego do badania wolnych grup tiolowych (27). Pirydyloetylacja jest silnie specyficzna dla tioli cysteiny dodaje addukt 105 Da, który można wykryć przez MS. Obserwowane w widmie PSD fragmenty zawierające Cys-1 posiadały obie modyfikacje palmitoilową i pirydoetylową, co sugeruje obecność wolnej grupy tiolowej. Po drugie zakotwiczone Shh poddano automatycznemu N-końcowemu sekwencjonowaniu Edmana i nie uzyskano sekwencji, co sugeruje blokowanie N-końcowej α-aminy. W odróżnieniu analogiczna rozpuszczalna forma Shh została z łatwością zsekwencjonowana.

P r z y k ł a d 2. Ludzkie sonic hedgehog można zmodyfikować kwasem palmitynowym w systemie bezkomórkowym.

Rozpuszczalne Shh wyznakowano ³H kwasem palmitynowym w systemie bezkomórkowym stosując zmodyfikowaną wersję opublikowanej procedury (24). Przygotowano surową frakcję mikrosomalną

PL 197 833 B1 z wątroby szczura przez poddanie homogenatu wątroby kolejnym wirowaniem przy 3000 x g przez 10 min., 9000 x g przez 20 min. i 100 000 x g przez 30 min. Osad z 100 000 x g zawieszono w 10 mM HEPES pH 7,4, 10% sacharozie i ponownie zwirowano przy 100 000 x g przez 20 min. Końcowy osad (pochodzący z 10 g wątroby) zawieszono w 3 ml 20 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 10 pg/ml leupeptyny, 0,15% Triton Χ-100, podzielono i przechowywano w -70°C. Reakcje zawierające 3 pg Shh, 1 pl szczurzych mikrosomów, 50 ng/ml Koenzymu A (Sigma), 0,3 mM ATP, 20 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 10 pg/ml Leupeptyny i 0,5 kwasu pCi-[9,10-³H]-palmitynowego (50 Ci/mol; New England Nuclear) przeprowadzano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Reakcje zatrzymywano redukującym buforem do próbek do elektroforezy, poddawano SDS-PAGE w 10-20% gradiencie żelu i uwidaczniano przez fluorografię.

Jak pokazano na Rysunku 1 (ścieżka e), Shh łatwo znakuje się wskaźnikiem radioaktywnym. Żadne z ok. stu innych białek w mieszaninie reakcyjnej nie zostało wyznakowane (patrz odpowiedni profil żelu wybarwiony Coomassie blue w ścieżce j), wskazując na wysoki stopień specyficzności reakcji palmitoilacji. Jako następny dowód specyficzności reakcji palmitoilacji, przetestowaliśmy dwa warianty Shh, w których wyeliminowano miejsce palmitoilacji. Rysunek 1 (ścieżka f) pokazuje wyniki analizy skróconej formy rozpuszczalnego Shh, której brakowało pierwszych 10 reszt aminokwasowych dojrzałej sekwencji, a ścieżka g zmutowanej formy Shh zawierającej na swoim N-końcu pojedynczą mutację punktową Cys-1 w Ser. Żaden z wariantów nie znakował się.

Znaczenie N-końcowej cysteiny jako miejsca derywatyzacji lipidowej jest podkreślane przez fakt, że rozpuszczalne Shh typu dzikiego znakuje się łatwo, kiedy mutant N-końcowej cysteiny w serynę nie. Niezdolność do wyznakowania N-końcowego mutanta serynowego świadczy przeciw prostemu mechanizmowi reakcji gdzie reszta palmitoilowa jest bezpośrednio przyłączana do N-końcowej α-aminy ponieważ w warunkach testu seryna powinna była zastępować cysteinę.

Badaliśmy także rolę wolnego N-końca stosując formę rozpuszczalnego Shh z N-końcowym wydłużeniem histydynowym (His)-tag. Rozpuszczalne ludzkie Shh użyte w tych testach produkowano początkowo jako oznakowana histydynami fuzja białkowa z miejscem cięcia dla enterokinazy na połączeniu dojrzałej sekwencji i poddawano obróbce enterokinazą w celu usunięcia znacznika His. Oznakowane His Shh nie było palmitoilowane mimo obecności wolnej grupy tiolowej cysteiny (patrz Rysunek 1, ścieżka i). Chociaż nie możemy wykluczyć możliwości, że N-końcowe wydłużenie sterycznie hamuje zajście palmitoilacji, Cys-1 jest w pozycji P1' miejsca cięcia enterokinazy i jest łatwo dostępna dla obróbki enzymatycznej. A więc okazuje się, że zarówno tiol jak i α-amina Cys-1 biorą udział w reakcji palmitoilacji. Ponieważ wszystkie znane reakcje palmitoilacji atakują łańcuch boczny reszt Cys, Ser lub Thr wnioskujemy, że modyfikacja hedgehog zaczyna się utworzeniem półproduktu tioestrowego i, że związek palmitynowy jest przenoszony na N-koniec przez utworzenie półproduktu cyklicznego. Hipotezę tę potwierdzono w czasie badania modyfikacji ludzkiego sonic hedgehog stosując palmitoilo koenzym A (patrz przykład 8).

P r z y k ł a d 3: Wykazanie podwyższonego potencjału naturalnie występującego, acylowanego kwasami tłuszczowymi, ludzkiego sonic hedgehog w teście komórkowym (C3H10T1/2).

Funkcję Shh testowano w teście komórkowym mierząc indukcję alkalicznej fosfatazy w komórkach C3H10T1/2 (25) z odczytem pięciodniowym. Test przeprowadzano w formacie 96 studzienek. Próbki puszczano w dwóch powtórzeniach. Dla zakotwiczonego Shh (100 pg/ml) próbki wpierw rozcieńczono 200 krotnie normalną pożywką do wzrostu, a następnie poddano seryjnym 2-krotnym rozcieńczeniom na płytki. Studzienki normalizowano pod kątem potencjalnego wpływu dodanego oktyloglikozydu przez włączenie 0,005% oktyloglikozydu do pożywki do hodowli. Badania blokowania przy użyciu neutralizującego mysiego mAb 5E1 (26) przeprowadzono przez zmieszanie Shh z seryjnymi rozcieńczeniami przeciwciała przez 30 min. w temperaturze otoczenia w pożywce do hodowli przed dodaniem próbek badanych na płytki.

W teście tym, rozpuszczalne ludzkie Shh produkuje zależną od dawki odpowiedź o IC50 wynoszącym 1 ng/ml i maksymalnym sygnałem przy 3 pg/ml (Rysunek A6). Zakotwiczone ludzkie Shh z cholesterolem dołączonym na C-końcu i grupą palmitoilową na N-końcu podobnie produkowało zależną od dawki odpowiedź w teście, ale o IC50 wynoszącym 0,03 pg/ml i maksymalnym sygnałem przy 0,1 pg/ml, wskazując że było około 30 razy silniejsze niż rozpuszczalne Shh. By potwierdzić, że obserwowana aktywność była specyficzna dla hedgehog sprawdzaliśmy czy aktywność może zostać zahamowana przez działanie 5E1 (Rysunek 6B). Hamowanie zakotwiczonego Shh wymagało przy swojej zwiększonej aktywności dziesięć razy więcej 5E1 w tym teście.

PL 197 833 B1

Zakotwiczone Shh badano w teście wiązania receptora, śledząc jego zdolność do wiązania patched, stosując zmodyfikowaną wersję niedawno opublikowanego testu (10). Zakotwiczone Shh wykazywało zależne od dawki wiązanie z komórkami wyrażającymi patched z obserwowanym IC₅0 wynoszącym 400 ng/ml (Rysunek 7). W tym samym teście, rozpuszczalne Shh wiązało się z patched z obserwowanym IC₅0 wynoszącym 150 ng/ml wskazując, że forma zakotwiczona wiązała się tylko trochę mniej ściśle ze swoim receptorem.

P r z y k ł a d 4. Analiza zakotwiczonego ludzkiego sonic hedgehog po odtworzeniu na liposomach.

Przykład pokazuje, że eksperymenty z odtworzeniem w dodatnio i ujemnie naładowanych liposomach przez rozcieńczanie detergentu przy dużym zakresie stosunków lipid : białko (w/w) od 1:1 do 100:1 nie miały wpływu na aktywność zakotwiczonego Shh w teście C3H10T1/2.

Odbudowanie w liposomach zawierających fosfolipidy dostarcza użytecznych preparatów dla białek zawierających lipidy, ponieważ umożliwia białku zawierającemu lipidy egzystowanie w prawie normalnym ustawieniu. By zbadać, czy taki preparat jest odpowiedni dla zakotwiczonego Shh użyliśmy metody rozcieńczeń detergentu do włączenie białka do liposomu (60), gdzie utworzone liposomy miesza się z oktyloglikozydem i interesującym białkiem, a następnie detergent rozcieńcza się poniżej jego krytycznego stężenia micelli powodując odtworzenie. Chociaż można użyć jakąkolwiek z dużej liczby mieszanin czystych lub lipidowych, wybraliśmy jako modele dwie dostępne handlowo mieszaniny; ujemnie naładowany zestaw liposomów zawierających L-a-fosfatydylocholinę jaja, fosforan dicetylu i cholesterol (nr kat. L-4262; Sigma, St. Louis, MO) i zestaw dodatnio naładowanych liposomów zawierający posfatydylocholinę jaja, stearyloaminę i cholesterol (nr kat. L-4137, Sigma).

W skrócie, lipidy przeniesiono do probówki Pyrex, wysuszono w strumieniu azotu i szczątkowy rozpuszczalnik usunięto przez liofilizację. Lipid zawieszono w 10 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCI, 0,2% oktyloglikozydzie, wytrząśnięto i sonikowano aż zawiesina stała się opalizująca w wyglądzie. Lipid następnie przefiltrowano przez filtr 0,2 mikrona, porcje zakotwiczonego Shh z infekowanych bakulowirusem owadzich komórek High Five™ w oktyloglikozydzie traktowano 400-, 100-, 5000- i 20000-krotnym nadmiarem lipidu (w/w) i po 15 min. preinkubacji próbki rozcieńczano i testowano aktywność w teście C3H10T1/2.

Ani traktowanie dodatnimi, ani ujemnymi liposomami nie miało żadnego wpływu na aktywność hedgehog wskazując, że nośnik lipidowy był odpowiednim preparatem. Do potwierdzenia, że hedgehog rzeczywiście został odtworzony równoległe próbki poddano wirowaniu w warunkach w których zakotwiczone Shh normalnie osadzałoby się a liposomy unosiłyby się na powierzchni próbki. W warunkach tych zakotwiczone Shh unosiło się na powierzchni wskazując, że nastąpiło odtworzenie.

P r z y k ł a d 5. Charakterystyka zakotwiczonego w błonie ludzkiego Sonic hedgehog ze ssaczych komórek (EBNA-293).

W celu oszacowania czy palmitylacja była ogólnym szlakiem modyfikacji Sonic hedgehog czy zachodziła specyficznie w komórkach owadzich, białko wytwarzano także w systemie ssaczych komórek EBNA-293. Dla wytworzenia Shh o pełnej długości w komórkach ssaczych, fragment Notl 1,4 kb zawierający pełnej długości Shh (patrz Przykład 1) sklonowano w wektorze pochodnym CH269 pCEP4 (lnvirogen, San Diego, CA (21). Konstrukt wprowadzono na drodze transfekcji do komórek EBNA-293 przy użyciu lipofektaminy (Life Technologies, Inc.), komórki zbierano 48 godz. po transfekcji. Ekspresję powierzchniowego Shh określano poprzez FACS i analizą typu Western blot.

Zakotwiczony Shh z komórek EBNA-293 frakcjonowano poprzez HPLC odwróconej fazy i kolumnę C4 o wąskiej średnicy (patrz Fig. 3). Piki analizowano poprzez ESI-MS (części a i b z Tab. 4) lub MALDI-TOF MS w spektrometrze mas Finnigan LaserMat przy użyciu kwasu a-cyjano-4-hydroksycynamonowego jako matrycy (część c w Tab. 4). W SDS-PAGE białko to migruje nieco szybciej niż rozpuszczalne Shh, było opóźnione na kolumnie C4 w analizie HPLC odwróconej fazy a na podstawie spektrometrii mas zawiera ono jon odpowiadający kwasowi palmitynowemu plus modyfikacji cholesterolem. Chociaż w przeciwieństwie do produktu pochodzącego z komórek insektów, ponad 80% produktu zawiera zarówno kwas palmitynowy jak modyfikację cholesterolem, profil elucji w HPLC i dane ze spektrometrii mas ujawniły, że większość białka pochodzącego z komórek ssaczych straciła cząstkę palmitoilową (patrz Tab. 4 i Fig. 3C). To znaczy, dla piku 2 z komórek EBNA-293 stosunek białka obciętego (des-1-10) do nietkniętego na podstawie sygnału MS wynosił 50% podczas gdy dla piku 1 jedynie około 10% Shh było obcięte. Interesujące, zarówno produkty pochodzące z komórek insektów jak komórek ssaczych wykazywały porównywalną aktywność w teście C3H10T1/2 co sugeruje, że obie modyfikacje cholesterolowa i cholesterolowa plus kwas palmitynowy były funkcjonalne. Do wyjaśnienia pozostaje to czy miejsce przyłączenia drugiego lipidu jest używane po prostu do stabilizowania

PL 197 833 B1 połączenia białka z błoną czy odgrywa bardziej aktywną rolę i wywiera wpływ na jego konformację lub oddziaływanie białko-białko.

Derywatyzacja kwasem tłuszczowym białek jest powszechną modyfikacją postranslacyjną pojawiającą się późno podczas procesu dojrzewania (28,29). Dla pochodnych cysteiny, jest to proces dynamiczny, wymagający oddzielnych enzymów, które dodają i usuwają modyfikację w grupie sulfhydrylowej. Najbardziej powszechnymi funkcjami takich derywatyzacji (np. palmitoilacji) jest zmiana właściwości fizyko-chemicznych białka, tzn. naprowadzanie białka do miejsca jego funkcjonowania, pobudzanie oddziaływań białko-białko i pośredniczenie w oddziaływaniach białko-błona (30). Nie wiemy czy dla hedgehog, u którego różnice wielkości palmitoilacji w preparatach pochodzących z komórek owadzich i ssaczych były zaskakujące (80% w komórkach owadzich versus 30% w komórkach ssaczych) ma to znaczenie biologiczne czy po prostu odzwierciedla różnice w maszynerii komórkowej tych dwu testowanych systemów w dodawaniu i usuwaniu kwasu palmitynowego. Jest mało prawdopodobne aby różnica wielkości modyfikacji w komórkach owadzich i ssaczych była zależna od gatunku, dlatego, że zakotwiczony hedgehog z Drosophila był w komórkach owadzich wytwarzany bez kwasu palmitynowego (19) mimo, że posiada identyczną sekwencję na końcu N.

T a b e l a 4

Analiza w spektrometrze mas zakotwiczonego ludzkiego Sonic hedgehog pochodzącego z EBNA-293

Białko	Masa (Da)
Obliczona	Zmierzona
a. wytwarzane w bakteriach (nie zakotwiczone)	19560,02	19560
b. wytwarzane w bakulowirusach (zakotwiczone) +kwas palmitynowy	19798,49	19796
+kwas palmitynowy/cholesterol	20167,14	20168
c. wytwarzane w komórkach EBNA-293 pik 1 (9% całkowitego hedgehod) nie zakotwiczone	19560,02	19581
nie zakotwiczone (des 1-9) pik 2 (61% całkowitego hedgehog)	18700,02	18712
-cholesterol	19928,67	19934
-cholesterol (des 1-10)	18912,48	18889
pik 3 (30% całkowitego hedgehog) -palmitoil/cholesterol	20167,14	20174

P r z y k ł a d 6: Lipidowe modyfikacje szczurzego Sonic hedgehog

Przykład ten pokazuje, że z rozpuszczalną wersją Sonic hedgehog łączą sią różnorodne lipidy kiedy szczurzy gen Shh, kodujący reszty 1-174, jest wytwarzany w komórkach owadzich High Five™, zasadniczo tak jak w przypadku ludzkiego Shh o pełnej długości opisanym w Przykładzie 1. Modyfikacja lipidowa przedstawia tę frakcję związaną z błoną. Fragment końca N (reszty 1-174 nie przekształconego szczurzego Sonic hedgehog) różni sią tylko 2 resztami aminokwasowymi od tych występujących we fragmencie końca N ludzkiego Sonic hedgehog. We fragmencie końca N szczurzego Sonic hedgehog treonina wymienia serynę w pozycji 44, a kwas asparaginowy - glicynę w pozycji 173. Kiedy wytwarzany jest szczurzy Sonic hedgehog nie posiadający domeny autoprocesującej w systemie ekspresyjnym High-Five™ komórki owadzie/bakulowirus większość białka jest wydzielana do podłoża hodowlanego ze względu na utratę zdolności do przyłączania cząstki cholesterolu do końca C. Taka rozpuszczalna forma ma specyficzną aktywność (mierzoną za pomocą testu C3H10T1/2 indukcji alkalicznej fosfatazy z Przykładu 3) podobną do tej dla rozpuszczalnego fragmentu końca N ludzkiego Sonic hedgehog wytwarzanego i oczyszczanego z E.coli.

Jednakże mała frakcja całkowitego białka pozostaje związana z komórkami owadzimi. Związane z komórkami szczurze białko Sonic hedgehog oczyszczano zasadniczo jak opisano w Przykładzie 1 i okazało się, znacząco aktywniejsze w teście z alkaliczną fosfatazą (wyniki nie przedstawione) niż rozpuszczalne fragmenty końca N czy to ludzkiego czy szczurzego Sonic hedgehog oczyszczone odpowiednio z E. coli i systemu ekspresyjnego High-Five™ komórki owadzie/bakulowirus. Dalsza analiza fragmentów końca N szczurzego Sonic hedgehog przy pomocy HPLC i spektrometrii mas z elektrorozpylaniem (jak opisano w Przykładzie 1) sugeruje, że białko jest modyfikowane lipidem i że

PL 197 833 B1 występuje więcej niż jeden typ modyfikacji lipidowej. Dowody potwierdzające to obejmują następujące obserwacje:

1. Związane z komórkami formy są wypłukiwane później niż rozpuszczalne, fragmenty końca N ludzkiego i szczurzego Sonic hedgehog z kolumny C₄ w HPLC odwróconej fazy (Vydac nr katalogowy 214TP104) rozwijanej przez 30 min. w liniowym gradiencie 0-70% acetonitrylu w 0,1% kwasie trifluorooctowym;

2. Masy form związanych z komórkami są zgodne ze spodziewanymi dla białek modyfikowanych lipidami, jak przedstawiono w Tab. 5.

T a b e l a 5

Masy różnych form szczurzego Sonic hedgehog modyfikowanych lipidami

Białko	Związek addycyjny	Masa spodziewana* (MH⁺)	Masa obserwowana (MH⁺)
niemodyfikowane	brak	19632,08	19632
mirystoilo-	CH3(CH2)12CO-	19842,50	19841
palmitoilo-	CH3(CH2)14CO-	19870,55	19868
stearoilo-	CH3(CH2)16CO-	19898,60	19896
arachidoilo-	CH3(CH2)18CO-	19926,66	19925

*Przy obliczaniu spodziewanych mas użyto masy średnie

Lokalizację cząstek lipidowych określano przy użyciu kombinacji analizy sekwencji i mapowania peptydu. Zautomatyzowane sekwencjonowanie Edmana końca N form zmodyfikowanych lipidami wykazało, że koniec N był zablokowany co sugeruje, że lipid był połączony z α-aminą N końcowej cysteiny. Dla potwierdzenia lokalizacji modyfikacji lipidowych i określenia ich właściwych mas stosowano mapowanie peptydu endo-Lys-C, spektrometrią mas MALDI-TPF i analizą MALDI PSD (jak opisano w Przykładzie 1) form modyfikowanych lipidem alkilowanym 4-winylopirydyną.

Jak przedstawiono w Tab. 6 masy peptydów z końca N (reszty 1-9 włącznie plus 4-vinylopirydyna przyłączona do tiolowego łańcucha bocznego N końcowej cysteiny) niosących modyfikacje lipidowe były zgodne do 0,1 Da z oczekiwanymi dla peptydów modyfikowanych lipidami.

T a b e l a 6

Masy peptydów z końca N izolowanych z różnych form zmodyfikowanych lipidami szczurzego Sonic hedgehog

Białko	Związek addycyjny	Masa spodziewana* (MH+)	Masa obserwowana (MH⁺)
mirystoilo-	CH3(CH2)12CO-	1193,69	1193,76
palmitoilo-	CH3(CH2)14CO-	1221,72	1221,65
stearoilo-	CH3(CH2)16CO-	1249,75	1249,71

*Przy obliczaniu spodziewanych mas użyto masy monoizotopowe

Dodatkowo do mas peptydów modyfikowanych lipidami przedstawionych w Tab. 6 wykryto także masy 1191,74, 1219,84 oraz 1247,82. Masy te są zgodne z nienasyconymi formami odpowiednio mirystynianu, palmitynianu i stearynianu, chociaż nie określono pozycji podwójnych wiązań w łańcuchu alkilowym. Obserwacje te wykazują, że zarówno nasycone jak i nienasycone kwasy tłuszczowe mogą być kowalencyjnie przyłączone do N końcowej cysteiny. Analiza MALDI PSD, jak opisano w Przykładzie 1, potwierdziła, że zarówno dla białek modyfikowanych lipidem nasyconym jak nienasyconym lipidy były przyłączone do N końcowej reszty cysteiny.

P r z y k ł a d 7. Indian hedgehog modyfikowane lipidami

Dla stwierdzenia czy reakcja palmitoilacji była unikalna dla ludzkiego Shh czy też może się ona pojawiać w innych białkach hedgehog badano czy ludzki Indian hedgehog (wytwarzany w E. coli jako białko fuzyjne ze znacznikiem His, odcinanym przez enterokinazę bezpośrednio przy miejscu start dojrzałej sekwencji i oczyszczane dokładnie jak zrekombinowany ludzki Sonic hedgehog (patrz Przykład 9)) może być palmitoilowany przy użyciu testu opisanego w Przykładzie 2. Ludzki Indian Hedgehog był modyfikowany (patrz Fig. 1, ścieżka h), co wskazuje na to, że palmitoilacja jest prawdopodobnie powszechną cechą białek hedgehog. Zdolność bezpośredniego znakowania Shh i Ihh radioaktywnym kwasem palmitynowym w systemie bezkomórkowym dostarcza prostego sposobu poszukiwania

PL 197 833 B1 aminokwasów wymaganych w reakcji modyfikacji. Ponadto palmitoilowany Indian hedgehog metodą opisaną w Przykładzie 8 był znacząco bardziej skuteczny w testach C3H10T1/2 niż niezmodyfikowany Ihh.

P r z y k ł a d 8. Modyfikacje lipidowe Sonic hedgehog przy użyciu acylokoenzymu A

Acylacją in vitro białka zawierającego N końcową cysteinę można osiągnąć poprzez dwu etapową reakcję chemiczną z donorem będącym tioestrem kwasu tłuszczowego. W pierwszym etapie acylowa grupa z tioestrowego donora jest przenoszona na grupą sulfhydrylową N końcowej cysteiny w białku poprzez spontaniczną reakcję transestryfikacji. Następnie cząstka acylowa przechodzi przekształcenie z S na N do α-aminy N terminalnej cysteiny tworząc stabilne wiązanie amidowe. Bezpośrednia acylacja aminy zachodząca na białku może pojawić się także podczas przedłużonej inkubacji z tioestrem lecz obecność cysteiny w białku przyspieszy reakcją i pozwoli na kontrolowanie miejsca acylacji. W niniejszych przykładach wykorzystywane są handlowo dostępne pochodne Koenzymu A (Sigma Chemical Company, St. Louis MO), lecz takie same wyniki można także osiągnąć dla innych grup tioestrów. W rzeczywistości, oczekuje się, że pewne żyjące grupy, takie jak estry tiobenzylowe będą reagować gwałtowniej. Wewnętrzne reszty cysteinowe mogą także pobudzać acylację na sąsiadujących lizynach, a to można z łatwością badać przy użyciu syntetycznych peptydów. Wtórnym acylacjom, pojawiającym się na białku podczas reakcji z tioestrami, można zapobiec poprzez kontrolowanie składników buforu, pH lub poprzez ukierunkowaną mutagenezę sąsiadujących lizyn.

We wstępnej analizie wpływu acylacji na zdolność ludzkiego Sonic hedgehog do indukowania fosfatazy alkalicznej w komórkach C3H10T1/2, mieszaniny reakcyjne zawierały 1 mg/ml ludzkiego Sonic hedgehog (51 pM), 500 pM odpowiedniego, dostępnego handlowo, acylo-Koenzymu A (testowane związki zawierały acetylo-CoA (C2:0), butyrylo-CoA (C4:0), heksanoilo-CoA (C6:0), oktanoilo-CoA (C8:0), dekanoilo-CoA (C10:0), lauroilo-CoA (C12:0), mirystoilo-CoA (C14:0), palmitoilo-CoA (C16:0), palmitoleoilo-CoA (C16:1), stearoilo-CoA (C18:0), arachidoilo-CoA (C20:0), behenoilo-CoA (C22:0), lignoceroilo-CoA (C24:0), sukcynilo-CoA oraz benzoilo-CoA, 25 mM DTT oraz 50 mM Na2HPO4 pH 7,0. Reakcje inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3 godz., a następnie natychmiast analizowano (bez oczyszczania) pod względem aktywności biologicznej w teście C3H10T1/2 jak opisano w Przykładzie 3. Próbki do analizy w HPLC odwróconej fazy i innymi metodami fizycznymi przechowywano przeważnie w -70°C. Analizę HPLC prowadzono na kolumnie odwróconej fazy Vydac C4 (4,6 mm wewnętrzna średnica x 250 mm, 5 mikronowe kulki) przez 40 min. z gradientem od 5% acetonitrylu do 85% acetonitrylu w wodnym roztworze 0,1% TFA, przy szybkości przepływu 1 ml/min. Wypływ monitorowano przy 280 nm, a frakcje zbierano w niektórych eksperymentach i analizowano pod względem obecności białka hedgehog na SDS-PAGE z wykrywaniem barwnikiem Coomassie oraz metodą Western blotting.

Porównanie aktywności różnych mieszanin reakcyjnych (Fig. 10) wykazuje, że długość łańcucha pomiędzy 12 do 18 atomami węgla jest optymalna dla indukcji alkalicznej fosfatazy w porównaniu z niezmodyfikowanym białkiem. Dalsze zwiększanie długości łańcucha daje widoczną redukcję aktywności a obecność podwójnych wiązań w nienasyconym palmitoleoilo-CoA (16:1) daje podobną aktywność jak całkowicie nasycony palmitoilo-CoA (C16:0). W analizie mieszanin reakcyjnych za pomocą HPLC odwróconej fazy obserwowaliśmy, że wiele pochodnych z krótszym łańcuchem acylo-CoA nie reagowało z białkiem hedgehog a zatem zależność biologicznej aktywności na Fig. 10 nie była prawdziwym odzwierciedleniem długości łańcucha acylowego.

W celu otrzymania danych o prawdziwej aktywności zmodyfikowanych białek oraz o zależności aktywności od długości łańcucha acylowego stworzyliśmy metody syntezy i oczyszczania poszczególnych form acylowanych na końcu N. Palmitoilowane, mirystoilowane, lauroilowane, dekanoilowane oraz oktanoilowane białka Sonic hedgehog niosące pojedynczy łańcuch acylowy połączony z α-aminą N końcowej cysteiny wytwarzano w mieszaninach reakcyjnych zawierających 0,80 mg/ml (41 pM) ludzkiego Sonic hedgehog, 410 pM (10 krotny nadmiar molarny) albo palmitoilo-CoA, mirystoilo-CoA lub lauroilo-CoA, czy 4,1 mM (100 krotny nadmiar molarny) dekanoilo-CoA lub oktanoilo-CoA, 25 mM DTT (do mieszanin reakcyjnych zawierających palmitoilo-CoA, mirystoilo-CoA lub lauroilo-CoA) lub 0,5 mM DTT (do mieszanin reakcyjnych zawierających dekanoilo-CoA albo oktanoilo-CoA) oraz 40 mM Na2HPO4 pH 7,0. Mieszaniny reakcyjne inkubowano w 28°C przez 24 godz. Reakcja N-końcowej cysteiny z tioestrami acylowymi daje przeniesienie grupy acylowej na sulfhydrylową poprzez reakcję spontanicznej transestryfikacji, po której następuje przekształcenie S w N do α-aminie dla stworzenia stabilnego wiązania amidowego. Następnie wolny sulfhydryl przechodzi drugą reakcję transestryfikacji dającą białko z tłuszczową grupą acylową przyłączoną poprzez wiązanie tioestrowe do sulfhydrylu. Połączoną wiązaniem tioestrowym grupę acylową usuwano poprzez dodanie kolejno 0,11 objętości 1 M

PL 197 833 B1

Na2HPO₄ pH 9,0 i 0,11 objętość 1 M hydroksyalaniny (końcowe stężenie 0,1 M) a następnie inkubację w 28°C przez 18 godz., co usuwa jedynie amid akrylowy połączony z białkiem (62). Następnie dodawano 0,25 objętości 5% oktyloglikozydu (końcowe stężenie 1%) i mieszaninę inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Następnie białka oczyszczano w obecności 1% oktyloglikozydu przy użyciu chromatografii kationowymiennych SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) i Bio Scale S (Biorad). Oczyszczone białka dializowano wobec 5 mM Na2HPO₄ pH 5,5, 150 mM NaCI, 1% oktyloglikozydu, 0,5 mM DTT i przechowywano w -70°C. Dla zachowania pełnej rozpuszczalności wymagana była obecność oktyloglikozydu; usunięcie detergentu poprzez rozcieńczenie i dializę powodowało utratę odpowiednio 75%, 41% i 15% białek palmitoilowanych, mirystoilowanych i lauroilowanych. ESI-MS białek oczyszczonych przez HPLC potwierdził ich integralność: palmitoilowany Sonic hedgehog, masa zmierzona = 19798, masa obliczona = 19798,43; mirystoilowany Sonic hedgehog, masa zmierzona = 19770, masa obliczona = 19770,33; lauroilowany Sonic hedgehog, masa zmierzona = 19742, masa obliczona = 19742,33; dekanoilowany Sonic hedgehog, masa zmierzona = 19715, masa obliczona = 19714,28; oktanoilowany Sonic hedgehog, masa zmierzona = 19686, masa obliczona = 19686,23.

Analiza różnych acylowanych form Sonic hedgehog w teście C3H10T1/2 (Figura 11) wykazała, że aktywność białek zależała od długości łańcucha. Białka palmitoilowane, mirystoilowane i lauroilowane wykazywały w przybliżeniu takie same aktywności o wartościach EC₅₀ 5-10 ng/ml (100-200 razy podniesiona siła w porównaniu z niezmodyfikowanym białkiem). Dekanoilowany ludzki Sonic hedgehog, o wartości EC₅₀ 60-70 ng/ml (15-30 razy podniesiona siła w porównaniu z niezmodyfikowanym białkiem) był mniej aktywny niż formy palmitoilowane, mirystoilowane i lauroilowane, podczas gdy forma oktanoilowana była najmniej aktywną z EC₅₀ 100-200 ng/ml (10 razy podniesiona siła w porównaniu z niezmodyfikowanym białkiem). Wszystkie formy miały wyższą siłą niż niezmodyfikowane, które posiadały EC₅₀ 1000-2000 ng/ml. Poza obniżeniem EC₅₀ białka palmitoilowane, mirystoilowane i lauroilowane indukowały około 2 razy więcej aktywności alkalicznej fosfatazy niż białko niezmodyfikowane, podczas gdy białka dekanoilowane i oktanoilowane indukowały około 1,5 razy więcej.

Formy mirystoilowana ludzkiego Sonic hedgehog dodatkowo do podniesionej siły obserwowanej w teście C3H10T1/2, ma znacząco wyższą siłę niż niezmodyfikowane białko w indukowaniu brzusznych neuronów przedmózgowia w eksplantach stadium zarodkowego E11 szczurzego kresomózgowia mózgu. Inkubacja eksplantów E11 kresomózgowia z różnymi stężeniami zmodyfikowanego lub niezmodyfikowanego Sonic hedgehog a następnie barwienie tych eksplantów celem wykrycia produktów genów dix i istet-1/2 (markery brzusznych neuronów przedmózgowia) wykazały, że podczas gdy pierwsza indukcja przez niezmodyfikowane białko jest obserwowana przy 48 nM, pierwsza indukcja mirystoilowanych form jest obserwowana przy 3 nM. Ponadto, podczas gdy niezmodyfikowane białko indukuje ograniczoną ekspresję przy 3070 nM, białko mirystoilowane indukuje ogólną ekspresję jedynie przy 48 nM. Podobny wzrost siły obserwowano kiedy eksplanty stadium E9 przypuszczalnego kresomózgowia inkubowano z białkami niezmodyfikowanymi i mirystoilowanymi. Barwienie eksplantów celem wykrycia produktu genu Nkx2.1 (wczesny marker brzusznych neuronów przedmózgowia) wykazało, że dla niezmodyfikowanego białka pierwsza indukcja Nkx2.1 występuje przy 384 nM, podczas gdy dla mirystoilowanego białka pierwszą ekspresję Nkx2.1 obserwowano przy 12 nM. Ponadto, dla mirystoilowanego Sonic hedgehog ekspresja Nkx2.1 przy 48 nM była ogólna, podczas gdy była niewykrywalna przy stężeniu użytym dla niezmodyfikowanej formy.

Dodatkowo wykazano, że mirystoilowany ludzki Sonic hedgehog jest znacząco bardziej zaangażowany niż niezmodyfikowane białko w redukowanie wielkości uszkodzenia powstającego w wyniku podawania malonianu do prążkowia szczurzego mózgu (patrz Przykład 16).

P r z y k ł a d 9. Chemiczne pochodne N końcowej cysteiny ludzkiego Sonic hedgehog

A. Metody ogólne

Alkilacja białek. Próbki zawierające około 20 pg białka w 50 μΙ 6 M chlorowodorku guanidyny, 50 mM Na₂HPO₄ pH 7,0 poddawano działaniu 0,5 pl 4-winylopirydyny przez 2 godz. w temperaturze pokojowej. Białka S-pirydyloetylowane wytrącano poprzez dodanie 40 objętości schłodzonego etanolu. Roztwór trzymano w -20°C przez 1 godz. a następnie wirowano przy 14000 x g przez 8 min w 4°C. Supernatanty zlewano, a osad płukano schłodzonym etanolem. Białko przechowywano w -20°C.

Mapowanie peptydu. Alkilowane białko (0,4 mg/ml w 1 M chlorowodorku guanidyny, 20 mM Na2HPO4 pH 6,0) trawiono endo Lys-C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) w rozcieńczeniu 1:20. Trawienie prowadzono w temperaturze pokojowej przez 30 godz. Reakcję hamowano przez zakwaszenie 5 pl 25% kwasu trifluorooctowego. Trawienie analizowano w układzie detektora Waters 2690 Separation Module z fotodiodą Model 996. Przed wstrzyknięciem, do trawienia dodawano stałego

PL 197 833 B1 chlorowodorku guanidyny do stężenia 6 M celem rozpuszczenia nie rozpuszczonego materiału. Do rozdziału stosowano kolumnę odwróconej fazy Vydac C₁₈ (2,1 mm średnica wewnętrzna x 250 mm), z 90 min. gradientem 0,1% kwas trifluorooctowy/acetonitryl oraz 0,1% kwasu trójfluorooctowego/acetonitryl z szybkością przepływu 0,2 ml/min. Do analizowania masy poszczególne piki zbierano ręcznie.

Określanie masy. Masy cząsteczkowe całych białek określano za pomocą spektrometrii mas z jonizacją przez elektrorozpylanie (ESI-MS) na kwadrupolowym spektrometrze mas Micromass Quattro II triple. Próbki odsalano przy użyciu ciągłego systemu Michrom Ultrafast Microprotein Analyzer z kolumną Reliasil C₄ (1 mm średnica wewnętrzna x 50 mm). Wszystkie dane uzyskane ze spektometrii mas przez elektrorozpylanie przetwarzano przy użyciu systemu Micromass MassLynx. Masy cząsteczkowe peptydów określano poprzez spektrometrię mas laserowej desorpcji z matrycy czasu przelotu z jonizacją (MALDI-TOF-MS) na Voyager-DE™ STR (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA). Sekwencjonowanie zmodyfikowanego peptydu prowadzono poprzez pomiar PSD (ang. Post-source decay) na tym samym urządzeniu. Jako matrycę stosowano kwas a-cyjano-4-hydroksycynamonowy.

Sekwencjonowanie końca N. Białka sekwencjonowano za pomocą metody degradacji Edmana stosując system Perkin-Elmer Applied Biosystems model 477 Pulsed-Liquid Protein Sequencer. PTH-tiaprolinę wytwarzano w sposób ciągły poprzez bezpośrednie nanoszenie tiaproliny (kwas tiazolidyno-4-karboksylowy) do pojemnika do którego nanosi się próbkę w sekwenerze.

Wytwarzanie w bakteriach dzikiego typu rozpuszczalnego fragmentu końca N ludzkiego Sonic hedgehog stosowanego w modyfikacjach chemicznych i jego oczyszczanie. Osady bakterii z komórek wytwarzających Shh na poziomie 4-5% całkowitego białka rozmrażano, zawieszano w buforze lizującym (25 mM Na2HPO4 pH 8, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,5 mM DTT) w stosunku 1:4 (W/v) i lizowano przez dwukrotne przepuszczenie przez prasę Gaulin'a (mfg. APV Rannie, Kopenhaga, Dania) przy 12000 p.s.i. Wszystkie dalsze etapy oczyszczania prowadzono w 2-8°C do czasu kiedy podano inaczej. Homogenaty wirowano przy 19000 x g przez 60 min i do otrzymanego lizatu dodawano MES 0,5 M pH 5, w stosunki 1:10 (v/v). Lizat (w pH 5,5) nanoszono na kolumnę z Sefarozą SP o szybkim przepływie (Pharmacia, Piscataway, NJ) (4 g E. coli mokrej masy/ml złoża) zrównoważoną 25 mM Na2HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI. Kolumnę przepłukiwano 4 objętościami kolumny (CV) buforu do równoważenia, następnie 3 CV 25 mM Na2HPO4 pH 5,5, 200 mM NaCI, 0,5 mM DTT i Histag-Shh wymywano 800 mM NaCI w tym samym buforze. Analizowano absorpcję frakcji elucyjnych przy 280 nm i poprzez SDS-PAGE. Dodawano imidazol (1 M roztwór podstawowy przy pH 7) i NaCI (5 M roztwór podstawowy) do puli frakcji zawierających piki Shh z eluatów z Sefarozy SP odpowiednio do końcowego stężenia 20 mM i 1 M i materiał nanoszono na kolumnę z agarozą NTA-Ni (Qiagen, Santa Clara, CA) (20 mg/ml złoża) zrównoważoną 25 mM Na2HPO4 pH 8,1, 1 M NaCI, 20 mM imidazol, 0,5 mM DTT. Kolumnę przepłukiwano 5 CV tego samego buforu i Histag-Shh wymywano 3 CV 25 mM Na2HPO4 pH 8,1, 1 M NaCI, 200 mM imidazol, 0,5 mM DTT. Zawartość białka w puli eluatu z kolumny NTA-Ni określano za pomocą pomiaru absorpcji przy 280 nm. Pule podgrzewano do temperatury pokojowej i dodawano równą objętość 2,5 M siarczanu sodowego. Etap z Fenylo Sefarozą przeprowadzano w temperaturze pokojowej. Materiał nanoszono na kolumnę z Fenylo Sefarozą o szybkim przepływie (Pharmacia, Piscataway, NJ) (20 mg/ml złoża) zrównoważoną 25 mM Na2HPO4 pH 8, 400 mM NaCI, 1,25 M siarczanem sodowym, 0,5 mM DTT. Zazwyczaj odzyskiwano 2-3 g Histag Shh z 0,5 kg pasty bakteryjnej (mokrej masy). Produkt filtrowano przez 0,2 pm filtry, porcjowano i przechowywano w -70°C. Histag Shh miał około 95% czystości co określano na podstawie SDS-PAGE. Dla dalszego scharakteryzowania oczyszczonego białka próbki poddawano ocenie poprzez spektrometrię mas z jonizacją przez elektrorozpylanie (ESI-MS). Około 50% białka miało utraconą metioninę.

Dla odcięcia sześciohistydynowego znacznika, Histag-Shh inkubowano z enterokinazą (Biozyme, San Diego, CA) w stosunku enzym: Shh jak 1:1000 (w/w) przez 2 godz. w 28°C. Nie rozcięte Histag-Shh i wolny Histag usuwano poprzez przepuszczenie trawienia przez drugą kolumnę z agarozą NTA-Ni (20 mg Shh/ml złoża). Przed naniesieniem na kolumnę do trawienia dodawano imidazol (1 M roztwór podstawowy o pH 7) i NaCI (5 M roztwór podstawowy) do końcowego stężenia odpowiednio 20 mM i 600 mM. Materiał nanoszono na kolumnę NTA-Ni zrównoważoną 25 mM Na2HPO4 pH 8, 600 mM NaCI, 20 mM imidazol, 0,5 mM DTT i zbierano wypływ. Kolumnę przepłukiwano 1 CV tego samego buforu i łączono z wypływem. Dodawano MES (0,5 M roztwór podstawowy o pH 5) do niezwiązanej z agarozą NTA-Ni frakcji do końcowego stężenia 50 mM i dodawano dwie objętości wody. Materiał ten nanoszono na drugą kolumnę z SP Sefarozą o szybkim przepływie (20 mg/ml złoża) zrównoważoną 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT. Kolumnę przepłukiwano 3 CV buforu do równoważenia i 1 CV tego samego buforu zawierającego 300 mM NaCI. Shh wymywano 5 mM Na2HPO4 pH 5,5,

PL 197 833 B1

800 mM NaCI, 0,5 mM DTT. Dane z absorpcji atomowej ujawniły, że Shh w tym stadium zawiera 0,5 molarny ekwiwalent Zn²⁺. Ekwimolarne stężenie ZnCh dodano do eluatu Shh i białko dializowano wobec 5 mM Na2HPO₄ pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT. Otrzymane Shh miało > 98% czystości co określono poprzez SDS-PAGE, chromatografię odcinającą wielkość (SEC) oraz ESI-MS, a na podstawie absorpcji atomowej, zawiera od 0,9 do 1,1 Zn2⁺/Shh.

Dane otrzymane z ESI-MS dla Histag Shh i produktów wytworzonych po usunięciu histag podsumowano w Tab. 7.

T a b e l a 7

Charakteryzacja Shh za pomocą ESI-MS

Białko	Masa (Da)
Obliczona	Zmierzona
Histag-Shh	(-Met) (niezmienione)	21433,82 21565,01	21434 21565
Shh trawione enterokinazą		19560,02	19560

B. Specyficzne modyfikacje chemiczne

Modyfikacja ludzkiego Sonic hedgehog z N-etylomaleimidem. Oczyszczony Shh w 5 mM Na2HPO₄ pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT poddawano działaniu 10 mM N-etylomaleimidu przez godz. w lodzie po czym dializowano do 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI. Dane uzyskane z MALDI-TOF-MS pokazały, że jedynie jedna reszta cysteinowa w Shh została zmodyfikowana przez reagent. Dane z sekwencjonowania końca N pokazały, że białko daje się sekwencjonować a w pierwszym cyklu wykrywano niezwykły pik, prawdopodobnie odnoszący się do PTH-NEM-Cys (wyniki nie pokazane). Analiza za pomocą spektrometrii mas pirydyloetylowanego-NEM-Shh w warunkach denaturujących pokazała, że jedynie dwie reszty cysteinowe w białku były alkilowane, co potwierdziło, że tylko grupa tiolowa N końcowej cysteiny była modyfikowana przez NEM w warunkach natywnych (Tab. 8). Pozostałe dwie reszty cysteinowe, które są widocznie schowane w hydrofobowym rdzeniu białka, nie mogą być modyfikowane bez uprzedniej denaturacji.

T a b e l a 8

Charakteryzacja Shh zmodyfikowanego NEM za pomocą MS

Białko	Masa (obliczona)	Masa (zmierzona)
Pirydyloetylowane NEM Shh		19895 Da
jeśli zawiera 2 wolne reszty Cys	19895 Da
jeśli zawiera 3 wolne reszty Cys	20000 Da

Białko hedgehog modyfikowane N-etylomaleimidem badane testem C3H10T1/2 (patrz Przykład 3) miało aktywność równoważną białku niemodyfikowanemu. Pokazuje to, że wolny sulfhydryl na końcu N hedgehog nie jest wymagany dla aktywności oraz, że cząstka N-etylomaleimidu jest wystarczająco hydrofobowa aby nadać pewną aktywność hedgehog w porównaniu z innymi bardziej hydrofilowymi modyfikacjami, takimi jak konwersja Cys-1 do His lub Asp dająca redukcję aktywności.

Modyfikacja ludzkiego Sonic hedgehog formaldehydem dla wytworzenia tiaproliny na końcu N, oraz acetaldehydem i butyraldehydem do tworzenia pochodnych tiaproliny na końcu N. Dla modyfikacji formaldehydem, oczyszczony Shh 3 mg/ml w 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT poddawano działaniu 0,1% formaldehydu z lub bez 10% metanolu w temperaturze pokojowej przez 1 do 6 godz. Białko albo dializowano wobec 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI lub oczyszczano na kolumnie CM-Poros (Perseptive Biosystems) jak opisano poniżej a następnie dializowano wobec 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI. Dla modyfikacji acetaldehydem lub butyraldehydem, oczyszczony Shh 3 mg/ml w 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT poddawano działaniu 0,1% acetaldehydu lub butyraldehydu w temperaturze pokojowej przez 1 godz. a następnie oczyszczano na kolumnie CM-Poros. Dane z ESI-MS dla form białka traktowanego formaldehydem, acetaldehydem i butyraldehydem pokazały, że ich masy były odpowiednio wyższe o 13 Da, 27 Da i 54 Da niż białka niezmodyfikowanego (Tab. 9).

PL 197 833 B1

T a b e l a 9

Masy oczekiwane i obserwowane ludzkiego Sonic hedgehog poddanego działaniu formaldehydu, acetaldehydu i butyraldehydu

Białko	Oczekiwana masa* (MH⁺)	Obserwowana masa* (MH+)
Niezmodyfikowane	19560,02	19560
Traktowane formaldehydem	19572,03	19573
Traktowane acetaldehydem	19586,06	19587
Traktowane butyraldehydem	19614,11	19614

*Użyto średnich mas do obliczenia mas oczekiwanych

Mapowanie peptydowe, jak opisano powyżej, białka poddanego działaniu formaldehydu wykazało, że miejsce modyfikacji pojawiał się w peptydzie obejmującym pierwszych 9 reszt na końcu N i, że dokładny wzrost masy wynosił 12 Da. Wyniki badań MALDI-PSD MS tego peptydu wykazały, że modyfikacja pojawiała sią w Cys-1 i może być tłumaczona poprzez modyfikację α-aminy na końcu N i tiolowym łańcuchem bocznym Cys-1 tworzącym tiaprolinę (patrz Fig. 12). Struktura tiaproliny została potwierdzona poprzez automatyczne sekwencjonowanie Edman'a końca N wykorzystującego „ciągle” wytwarzanie PTH-tioproliny jako standardu. Dane z ESI-MS dla białek traktowanych acetaldehydem i butyraldehydem były konsystentne z modyfikacjami występującymi, w znaczeniu tej samej chemii, dla reakcji z formaldehydem, chociaż dokładne miejsce modyfikacji nie zostało ustalone. Badane testem opartym na komórkach C3H10T1/2 białka modyfikowane formaldehydem, acetaldehydem i butyraldehydem były, odpowiednio, średnio 8 razy, 2 razy i 3 razy silniejsze niż niezmodyfikowany Shh.

Modyfikacja ludzkiego Sonic hedgehog N-izopropylojodoacetamidem. Przykład ten pokazuje, że modyfikacja ludzkiego Shh hydrofobową pochodną jodoacetamidu może wzmocnić siłę białka w porównaniu z niezmodyfikowanym Shh. Oczyszczony Shh (1 mg/ml w 5 mM Na₂HPO4 pH 7,0, 150 mM NaCI, 0,1 mM DTT) inkubowano z 1 mM N-izopropylojodoacetamidem (NIPIA) w 4°C przez 18 godz. Dodawano DTT do końcowego stężenia 10 mM i próbkę dializowano ekstensywnie wobec 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT. Próbkę oczyszczano na złożu SP Sefarozy o szybkim przepływie i dializowano dalej wobec 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT. Dane z ESI-MS wykazały całkowitą konwersję do cząstek o masie 19660, odpowiadającej wartości przewidywanej masy (19659) dla białka zmodyfikowanego w pojedynczym miejscu. Specyficzna modyfikacja N końcowej cysteiny została potwierdzona poprzez mapowanie peptydowe fragmentów po proteolizie. Badane testem opartym na komórkach C2H10T1/2 ludzkie białko Shh zmodyfikowane NIPIA było w przybliżeniu 2 razy silniejsze niż białko niezmodyfikowane. Podczas gdy modyfikacja białka daje niewielki wzrost siły spodziewane jest, że modyfikacja białka pochodnymi jodoacetamidu z długim łańcuchem alkilowym da formy białka o zmienionej hydrofobowości o dużo większej sile, możliwe że zbliżonej do 100-200 razy podniesionej aktywności obserwowanej dla palmitylowanych, mirystylowanych i lauroilowanych białek Shh (patrz Przykład 8).

Modyfikacja ludzkiego Sonic hedgehog 1-bromo-2-butanonem dla sześcioczłonowego hydrofobowego pierścienia na końcu N. Pochodną tiomorfolinową (tetrahydrotiazinylową) Shh wytwarzano poprzez inkubację ludzkiego Shh-N (3 mg/ml w 5 mM Na₂HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,15 mM DTT) z 11 mM 1-bromo-2-butanonem w temperaturze pokojowej przez 60 min., a następnie redukcją 5 mM NaCNBH3 w temperaturze pokojowej przez 60 min. Produkt reakcji oczyszczano na kolumnie CMPoros (Perseptive Biosystems) jak opisano poniżej i dializowano wobec 5 mM Na₂HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT. Dane z ESI-MS i proteolitycznego mapowania białka wykazały, że produkt był mieszaniną spodziewanej pochodnej timorfolinylowej (masa obliczona = 19615, masa obserwowana = 19615) oraz dwóch form białka obu z dodatkowymi 16 jednostkami masy. Jedna z tych form jest prawdopodobnie keto-tioeterem, niecyklicznym produktem pośrednim. Mieszaninę badano w teście C3H10T1/2, który wykazał, że była ona około 5 razy silniejsza niż białko niezmodyfikowane.

P r z y k ł a d 10. Ogólnie wytwarzane mutacje ludzkiego Sonic hedgehog

A. Ogólnie wytwarzane mutacje w cysteinie na końcu N

W przykładzie tym pokazujemy, że specyficzna zamiana cysteiny na końcu N ludzkiego Sonic hedgehog (Cys-1) poprzez pojedynczą lub wiele reszt hydrofobowych aminokwasów daje podniesienie siły w porównaniu z białkiem dzikiego typu w teście opartym na C3H10T1/2 opisanym w Przykładzie 3.

PL 197 833 B1

Konstruowanie mutantów Cys-1 Shh. Fragment restrykcyjny Ncol-Xhol o długości 584 bp niosący fragment końca N dzikiego typu Shh ze znacznikiem His z p6H-SHH subklonowano w wektorze do klonowania pNN05, pochodna pUC, konstruując plazmid pEAG649. Mutanty Cys-1 rozpuszczalnego ludzkiego Shh wytwarzano poprzez mutagenezę eliminującą unikalne miejsce z matrycy, którą stanowił plazmid pEAG649 przy użyciu zestawu Pharmacia, stosując zalecaną przez producenta procedurę. Przy projektowaniu starterów wprowadzających mutacje, jeśli żądana mutacja nie prowadziła do powstania zmiany miejsca restrykcyjnego, cicha mutacja, wytwarzająca zmianę miejsca restrykcyjnego wprowadzana była do przyległego kodonu dla ułatwienia identyfikacji klonów mutantów uzyskiwanych po mutagenezie. Dla uniknięcia nieprawidłowego wykorzystania kodonów, podstawiane kodony wyselekcjonowano z tych, które pojawiają się co najmniej raz gdziekolwiek w sekwencji cDNA ludzkiego Shh. Zastosowano następujące startery wprowadzające mutacje: (1) dla C1F: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA TTC GGA CCG GGC AGG GGG TTC 3' wprowadzający miejsce dla Apol, tworzący pE-AG837; (2) dla C1I: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATA GGA CCG GGC AGG GGG TTC 3' gubiący miejsce dla Rsrll, tworzący pEAG838 oraz (3) dla C1M: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATG GGC CCG GGC AGG GGG TTC GGG 3' gubiący miejsca dla Rsrll i Avall, tworzący pEAG839. Mutacje potwierdzano poprzez sekwencjonowanie DNA fragmentu restrykcyjnego Ncol-Bglll o wielkości 180 bp niosącego zmutowane końce N białek SHH w plazmidach pEAG837-839. Wektory ekspresyjne konstruowano poprzez subklonowanie fragmentu Ncol-Bglll o wielkości 180 bp każdego zmutowanego plazmidu i fragmentu Bglll-Xhol o wielkości 404 bp z pEAG649 w poddanym działaniu fosfatazy 5,64 kb Xhol-Ncol pET11d wektorowym kręgosłupie p6H-SHH. Obecność wprowadzonej zmiany miejsca restrykcyjnego ponownie potwierdzano w wektorze ekspresyjnym dla każdej zmutowanej Cys-1 (C1F w pEAG840, C1I w pEAG841 i C1M w pEAG842). Wektory ekspresyjne wprowadzano na drodze transformacji do kompetentnych E.coli BL21(DE3)pLysS (Stratagene) zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta i selekcjonowano na szalkach z pożywką LB z agarem zawierającą 100 pg/ml ampicyliny i 30 pg/ml chloramfenikolu. Wybierano pojedyncze kolonie i stransformowane bakterie hodowano do A600 równego 0,4-0,6 i indukowano za pomocą 0,5 mM IPTG. Osady bakteryjne analizowano pod względem ekspresji zmutowanych białek za pomocą redukującego SDS-PAGE i metodą Western blotting.

Rozpuszczalne ludzkie białko Shh z wielokrotnymi hydrofobowymi podstawieniami (C1II) na końcu N wytworzono poprzez mutagenezę eliminującą unikalne miejsce, przy użyciu zestawu Pharmacia, stosując procedurę zalecaną przez producenta. Przy projektowaniu starterów wprowadzających mutacje, jeśli żądana mutacja nie prowadziła do powstania zmiany miejsca restrykcyjnego, cicha mutacja, wytwarzająca zmianę miejsca restrykcyjnego wprowadzana była do przyległego kodonu dla ułatwienia identyfikacji klonów mutantów uzyskiwanych po muta-genezie. Dla uniknięcia nieprawidłowego wykorzystania kodonów, podstawiane kodony wyselekcjonowano z tych, które pojawiają się co najmniej raz gdziekolwiek w sekwencji cDNA ludzkiego Shh. Zastosowano następujący starter wprowadzający mutacje dla C1F matrycowego plazmidu pEAG837 dla C1II: 5' GCG GCG ATG ACG ATG ACA AAA TCA TCG GAC CGG GCA GGG GGT GCT GG 3', usuwający miejsce Apol, tworzący pEAG872. Mutacje potwierdzano poprzez sekwencjono-wanie DNA fragmentu restrykcyjnego Ncol-Xhol o wielkości 0,59 kb niosącego zmutowane Shh C1II. Wektor ekspresyjny konstruowano poprzez subklonowanie fragmentu Ncol-Bglll zmutowanego plazmidu w poddanym działaniu fosfatazy 5,64 kb Xhol-Ncol pET11d, wektorowym kręgosłupie p6H-SHH. Obecność wprowadzonej zmiany miejsca restrykcyjnego ponownie potwierdzano w wektorze ekspresyjnym dla mutanta C1II w pEAG875. Wektory ekspresyjne wprowadzano na drodze transformacji do kompetentnych E.coli BL21(DE3)pLysS (Stratagene) zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta i selekcjonowano na szalkach z pożywką LB z agarem zawierającą 100 pg/ml ampicyliny i 30 pg/ml chloramfenikolu. Wybierano pojedyncze kolonie i stransformowane bakterie hodowano do A600 równego 0,4-0,6 i indukowano przez 0,5 mM IPTG. Dla potwierdzenia ekspresji zmutowanego białka Shh osady bakteryjne analizowano jak opisano powyżej.

Oczyszczanie mutantów Cys-1 ludzkiego Sonic hedgehog. Zmutowane białka hedgehog ze znacznikiem His oczyszczano z osadów bakteryjnych jak opisano powyżej dla białka dzikiego typu z wyjątkiem dwóch modyfikacji. (1) etap z Fenylo Sefarozą wyeliminowano a zamiast niego pulę białka z pierwszej kolumny z agarozą NTA-Ni dializowano do 25 mM Na2HPO4 pH 8, 400 mM NaCI, 0,5 mM DTT przygotowując do etapu cięcia enterokinazą. (2) Końcowy etap jonowymiany zmieniono z etapu elucji z SP-Sefarozy o szybkim przepływie na gradientową elucję z kolumny CM-Poros (Perseptive Biosystems). Prowadzono to w 50 mM Na2HPO4 pH 5,5 z gradientem 0-800 mM NaCI dla 30 objętości

PL 197 833 B1 kolumny. Łączone w pule frakcje, dające piki z tego etapu, dializowano do 5 mM Na2HPO₄ pH 5,5, 150 mM NaCI i przechowywano w -80°C. Spektrometria mas oczyszczonych białek wykazała oczekiwaną masę jonów dla każdej oczyszczonej formy.

Aktywność mutantów Cys-1 ludzkiego Sonic hedgehog. Jak pokazano w Tab. 10, mutacja w N końcowej cysteinie ma znaczący wpływ na siłę powstającego białka hedgehog w teście C3H10T1/2. Dla pojedynczych zmian, siła ta ogólnie koreluje z hydrofobowością podstawionego aminokwasu, to znaczy fenyloalanina i izoleucyna dają wyższą aktywację, metionina jest mniej aktywująca, podczas gdy histydyna i kwas asparaginowy zmniejszają aktywność w porównaniu z cysteiną dzikiego typu. Zamiana cysteiny na dwie izoleucyny daje dodatkowy wzrost aktywności wyższy niż dla podstawienia przez pojedynczą izoleucynę.

Wiedząc, że dziewięć aminokwasów jest zaklasyfikowanych jako bardziej hydrofobowe niż cysteina (Proteins:structures and molecular properties, wyd. 2-gie, 1993, T.E. Creighton, W.H. Freeman Co, str. 154), testowane powyżej substytucje stanowią wyczerpujący przegląd możliwych mutacji na końcu N, które mogą nadać większą aktywność formom hedgehog. Jednakże wyniki pokazują, że aktywacja nie jest ograniczona do jednej struktury aminokwasowej oraz, że substytucja przez więcej niż jeden aminokwas może dać dalszy wzrost siły. Zatem, specjaliści mogą tworzyć formy hedgehog z innymi substytucjami aminokwasowymi na końcu N, co do których można by się spodziewać, że będą miały większą siłę niż białko dzikiego typu.

T a b ela 10

Względna siła modyfikacji aminokwasowych ludzkiego Sonic hedgehog w teście C3H10T1/2

Koniec N	Względna siła
C (dziki typ)	1X
M	2X
F	4X
l	4X
ii	10X

B. Ogólnie wytwarzane mutacje w resztach wewnętrznych

Konstrukcja mutanta C1II/A169C. Rozpuszczalny mutant ludzkiego Shh C1II/A169C (z substytucją cysteiną zbędnej reszty A169 na C-końcu, o której sądzi się, że ma wysoki udział w dostępności rozpuszczalnika) był zrobiony przez mutagenezę eliminującą unikalne miejsce, przy użyciu zestawu Pharmacia zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta i z wykorzystaniem właściwości mutagennych projektowanych oligonukleotydów opisane powyżej. Stosowano następujący starter wprowadzający mutacje 5' GAG TCA TCA GCC TCC CGA TTT TGC GCA CAC CGA GTT CTC TGC TTT CAC C 3' na matrycy pEAG872 z C1lIShh dla dodania miejsca Fspl tworząc pSYS049. Obecność mutacji C1II/A169C potwierdzano sekwencjonowaniem DNA fragmentu restrykcyjnego Ncol-Xhol 0,59 kb. Wektor ekspresyjny pSYS050 konstruowano poprzez subklonowanie fragmentu Ncol-Xhol w poddanym działaniu fosfatazy 5,64 kb Xhol-Ncol pET11d, wektorowym kręgosłupie p6H-SHH. Obecność wprowadzonej zmiany miejsca restrykcyjnego ponownie potwierdzano w wektorze ekspresyjnym. Wektor ekspresyjny wprowadzano na drodze transformacji do kompetentnych E.coli BL21(DE3)pLysS, kolonie selekcjonowano, indukowano i przeszukiwano pod kątem ekspresji Shh jak opisano powyżej.

Oczyszczanie mutanta C1II/A169C. Zmutowane białko C1II/A169C oczyszczano tak jak opisano w Przykładzie 9 dla dzikiego typu Shh z wyjątkiem następujących modyfikacji. (1) z buforu do lizy usunięto EDTA, (2) przestawiono kolejność etapów z NTA-Ni i SP Sefarozą i opuszczono etap z Fenylo Sefarozą, (3) po sklarowaniu zlizowanych bakterii poprzez wirowanie supernatantu dodawano dodatkowy NaCI do końcowego stężenia 300 mM, (4) bufor elucyjny dla kolumny z NTA-Ni zawierał 25 mM Na2HPO4 pH 8,0, 200 mM imidazol, 400 mM NaCI, (5) pule po elucji z kolumny z NTA-Ni rozcieńczano 3 objętościami 100 MES pH 5,0 przed nanoszeniem na kolumnę z SP Sefarozą, (6) przed dodaniem enterokinazy, pule po elucji z SP Sefarozy rozcieńczano połową objętości 50 mM Na2HPO4 pH 8,0 oraz (7) DTT w buforze elucyjnym dla kolumny z SP Sefarozą zawierał 0,2 mM DTT a pule po elucji w tym etapie porcjowano i przechowywano w -70°C.

Hydrofobowe modyfikacje i aktywność mutanta C1II/A169C. Dla modyfikacji z N-(1-pireno-) maleimidem (Sigma), oczyszczone C1II/A169C 4,6 mg/ml w 5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 800 mM NaCI, 0,2 mM

PL 197 833 B1

DTT rozcieńczano równą objętością 50 mM MES pH 6,5 i dodawano jedną dwudziestą objętości maleimidu pirenowego z 2,5 mg/ml roztworu podstawowego w DMSO. Próbkę inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej, w ciemności. Po tym czasie dodawano dodatkową ilość DTT do stężenia 0,5 mM i próbkę inkubowano dalej przez dodatkową godzinę w temperaturze pokojowej. Zmodyfikowane białko badano bezpośrednio pod względem aktywności w teście C3H10T1/2 jak opisano w Przykładzie 3. Przed modyfikacją, specyficzna aktywność białka wynosiła EC50 = 0,22 pg/ml, podczas gdy poddaniu działaniu maleimidu pirenowego aktywność specyficzna wzrastała do EC50 = 0,08 pg/ml. 3 krotny wzrost aktywności specyficznej zmodyfikowanego produktu obserwowano często, co wskazuje na to, że dodanie grupy hydrofobowej blisko końca C Shh daje dodatkowy wzrost aktywności w porównaniu z materiałem wyjściowym C1II. W porównaniu z niezmodyfikowanym białkiem Sonic hedgehog dzikiego typu, białko zmodyfikowane N-(1-pireno-) maleimidem miało w przybliżeniu 30 krotną siłę. Podczas gdy maleimid pirenowy dostarcza prostego systemu badania dla oszacowania modyfikacji w tym miejscu, stosowano także inne hydrofobowe maleimidy lub inne związki chemiczne łączące się z cysteiną.

P r z y k ł a d 11: Porównanie siły różnych zmodyfikowanych hydrofobowo form ludzkiego Sonic hedgehog w teście C3H10T1/2

Aktywność różnych zmodyfikowanych hydrofobowo form ludzkiego Sonic hedgehog (wytworzonych przy użyciu technik chemicznych i metod inżynierii genetycznej opisanych w Sekcji V) badano przy użyciu testu C3H10T1/2 opisanego w Przykładzie 3.

Pochodne badano w zakresie stężeń opisanych w Przykładzie 3. Stężenie pochodnej hedgehog dające 50% maksymalnej odpowiedzi w teście porównywano ze stężeniem dzikiego typu. Względne aktywności przedstawiono w Tab. 11, poniżej oraz na Fig. 13.

T a b e l a 11

Względna moc pochodnych hedgehog w teście C3H10T1/2

Modyfikacja	EC50 (x-razy silniejsze niż Shh dzikiego typu)
C:16 palmitoil	100
C:14 mirystoil	100
C:12 lauroil	100
C:10 dekanoil	33
Izoleucyno-izoleucyl z A169C pirenylem	30
C:8 oktanoil	100
Izoleucyno-izoleucyl	10
C:0 tiaproil	8
Tiamorfolinyl	5
Fenyloalanyl	4
Izoleucyl	4
N-izopropyloacetamidyl	2
Metionyl	2
N-etylomaleimidyl	1
Cysteiny (dziki typ)	1
Aspartyl	<1
Histydyl	<1

Test C3H10T1/2 pokazuje, że szereg różnorodnych modyfikacji hydrofobowych hedgehog podnosi aktywność białek w porównaniu z niezmodyfikowanym białkiem dzikiego typu. Modyfikacje hydrofilowe (kwas asparaginowy i histydyna) nie mają takiego wpływu.

PL 197 833 B1

P r z y k ł a d 12: Ocena skuteczności działania ludzkiego Sonic hedgehog zmodyfikowanego hydrofobowo w teście ze szczurami z uszkodzeniami prążkowia indukowanymi malonatem

Wstrzyknięcie malonatu, inhibitora dehydrogenazy bursztynianowej - enzymu mitochondrialnego, do prążkowia (szczurzy odpowiednik jądra ogoniastego i skorupy u naczelnych) wywołuje zwyrodnienie środkowych neuronów kolczastych prążkowia. U ludzi, zwyrodnienie środkowych neuronów kolczastych w jądrze ogoniastym i skorupie jest pierwotną cechą patologiczną w chorobie Huntingtona. Zatem indukowane malonatem uszkodzenia prążkowia u szczurów można stosować jako model do badania czy białka hedgehog zmodyfikowane hydrofobowo mogą zapobiegać śmierci neuronów, które degenerują w chorobie Huntington'a.

Szczurom Spraque-Dawley wstrzykiwano różne stężenia ludzkiego Sonic hedgehog zmodyfikowanego hydrofobowo do prążkowia stosując techniki stereotaktyczne. Stereotaktyczne wstrzyknięcie (2 μΙ) przeprowadzano w uśpieniu pentobarbitalem sodowym (40 mg/kg) i stosowano w miejscu o następujących współrzędnych: 0,7 mm przed ciemieniem dużym, 2,8 mm bocznie od linii środkowej oraz 5,5 mm brzusznie od powierzchni czaszki w ciemieniu dużym. W różnych czasach (zazwyczaj 48 godz.) po podaniu zastrzyku ze zmodyfikowanego hydrofobowo białka, szczury usypiano izofluranem i podawano zastrzyk stereotaktyczny z malonatu (2 μmole w 2 μ) w miejscu o w tych samych współrzędnych prążkowia. Cztery dni po wstrzyknięciu malonatu szczury usypiano i pobierano ich mózgi do analizy histologicznej. Skrawki wieńcowe krojono przez prążkowie na grubość 25 μm i barwiono celem określenia aktywność oksydazy cytochromowej dla rozróżnienia tkanki uszkodzonej od nieuszkodzonej. Wielkość uszkodzenia w prążkowiu jest mierzona przy użyciu obrazowego systemu analizy.

Wpływ ludzkiego białka Sonic hedgehog zmodyfikowanego hydrofobowo w modelu szczurzym z zaindukowanym malonatem uszkodzeniem prążkowia przedstawiono na Fig. 14. W modelu tym zarówno niezmodyfikowany Sonic hedgehog (wytworzony jak opisano w Przykładzie 9), mirystoilowany Shh (wytworzony jak opisano w Przykładzie 8) oraz C1II mutant Shh (wytworzony jak opisano w Przykładzie 10) redukował wielkość uszkodzenia do podobnego rozmiaru. Chociaż, białka zmodyfikowane hydrofobowo (mirystoilowane Shh i C1II Shh) wykazywały podwyższoną siłą względem niezmodyfikowanego Sonic hedgehog.

P r z y k ł a d 13. Otrzymywanie N-oktylomaleimidowych pochodnych sHh-N

Dla końcowego stężenia 1 mg/ml

1) Przygotować 20 mM roztwór oktylomaleimidu (m.cz. = 209) w DMSO (~4,2 mg/ml).

2) Rozcieńczyć roztwór podstawowy 10 mg/ml sHh-N (w 5 mM Na₂HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT) 10 razy PBS (Gibko kat. nr 20012-027, pH 7,2) co daje 1 mg/ml (lub 50 μM) roztwór sHh-N. [Uwaga: DTT, który współzawodniczy z sHh-N o maleimid w następującej reakcji, jest w tym roztworze także 50 μM].

3) Natychmiast dodać 1/200 obj. oktylomaleimidu do 1 mg/ml sHh-N (tj. 5 μΙ/1 ml). Da to stosunek molarny 2:1 (100 μM : 50 μM) oktylomaleimidu do sHh-N.

4) Wymieszać ten roztwór przez łagodne odwracanie probówki i inkubować 1 godz. w temperaturze pokojowej.

5) W końcu dodać 1/1000 obj. 0,35 M DTT do każdej probówki w celu oczyszczenia z jakiegokolwiek pozostałego oktylomaleimidu i służącego jako reduktant.

6) Dla kontroli nośnika, zmieszać roztwór nośnika (5 mM Na₂HPO4 pH 5,5,150 mM NaCI, 0,5 mM DTT) z PBS (Gibko kat. nr 20012-027, pH 7,2) w stosunku 1:10. Dodać 1/400 obj. 20 mM oktylomaleimidu w DMSO oraz 1/400 obj. DMSO co daje końcowe stężenie 50 μM N-oktylomaleimidu i 0,5% DMSO. W końcu dodać 1:1000 obj. 0,35 M DTT.

Przybliżona kompozycja roztworu 1 mg/ml N-oktylomaleimidu sHh-N PBS (~pH 7,2) μM sHh-N sprzężony z N-oktylomaleimidem μM DTT sprzężony z N-oktylomaleimidem

350 μM DTT

0,5% DMSO

Przybliżona kompozycja roztworu nośnika N-oktylomaleimidu

PBS (~pH 7,2) μM DTT sprzężony z N-oktylomaleimidem

350 μM DTT

0,5% DMSO

Dla końcowego stężenia 3 mg/ml

1) Przygotować 60 mM roztwór oktylomaleimidu (m.cz. = 209) w DMSO (~12,6 mg/ml).

PL 197 833 B1

2) Rozcieńczyć roztwór podstawowy 10 mg/ml sHh-N (w 5 mM Na2HPO₄ pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT) 10 razy PBS (Gibko kat. nr 20012-027, pH 7,2) co daje 3 mg/ml (lub 150 μΜ) roztwór sHh-N. [Uwaga: DTT, który współzawodniczy z sHh-N o maleimid w następującej reakcji, jest w tym roztworze także 150 μΜ],

3) Natychmiast dodać 1/200 obj. oktylomaleimidu do 31 mg/ml sHh-N (tj. 5 μΙ/1 ml). Da to stosunek molarny 2:1 (300 μΜ : 150 μΜ) oktylomaleimidu do sHh-N.

6) Dla kontroli nośnika, zmieszać roztwór nośnika (5 mM Na2HPO4 pH 5,5, 150 mM NaCI, 0,5 mM DTT) z PBS (Gibko kat. nr 20012-027, pH 7,2) w stosunku 3:7. Dodać 1/400 obj. 60 mM oktylomaleimidu w DMSO oraz 1/400 obj. DMSO co daje końcowe stężenie 150 μM N-oktylomaleimidu i 0,5% DMSO. W końcu dodać 1:1000 obj. 0,5 M DTT.

Przybliżona kompozycja roztworu 3 mg/ml N-oktylomaleimidu sHh-N PBS (~pH 7,2)

150 μM sHh-N sprzężony z N-oktylomaleimidem

150 μM DTT sprzężony z N-oktylomaleimidem

500 μM DTT

0,5% DMSO

Przybliżona kompozycja roztworu nośnika N-oktylomaleimidu PBS (~pH 7,2)

150 μM DTT sprzężony z N-oktylomaleimidem

500 μM DTT

0,5% DMSO

Odnośniki literaturowe

1. Perrimon, N. (1995) Cell 80, 517-520

2. Johnson, R.L, and Tabin, C. (1995) Celi 81,313-316

3. Riddle, R.D. et al. (1993) Cell 75, 1401-1416

4. Niswander, L., et al. (1994) Nature 371,609-612

5. Laufter, E., et al. (1994) Cell 79. 993-1003

6. Roberts, D.J., et al. (1995) Development 121,3163-3174

7. Chiang, C., et al. (1996) Nature 382, 407-413

8. Bellusci, S., et al. (1997) Development 124, 53-63

9. Marigo, V., et al. (1996) Nature 384, 176-179

10. Stone, D.M., et al. (1996) Nature 384, 129-134

11. Alcedo, J., etal. (1996) Cell 86, 221-232

12. Dominguez, M., et al. (1996) Science 272, 1621-1625

13. Alexandre, C., et al. (1996) Genes & Dev. 10, 2003-2013

14. Therond, P.P., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4224-4228

15. Lee, J.J., et al. (1994) Science 266, 1528-1536

16. Bumcrot, D.A., et al. (1995), Mol. Cell Biol. 15, 2294-2303

17. Porter, J.A., et al. (1995) Nature 374, 363-366

18. Porter, J.A., et al. (1996) Science 274, 255-258

19. Porter, J.A., et al. (1995) Cell 86, 21-34

20. Marigo, V., et al. (1995) Genomics 28, 44-51

21. Sanicola, M., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6238-6243.

22. Spengler, B., et al. (1992) Rapid. Commun. Mass Spectrom. 6, 105-108.

23. Spengler, B. et al. (1992) J. Phys. Chem. 96, 9678-9684

24. Caron, J.M. (1997) Mol. Biol. Cell 8, 621-636

25. Kinto, N., et al. (1997) FEBS Letts. 404, 319-323

26. Ericson, J., et al. (1996) Cell 87, 661-673

27. Wen, D., et al. (1996) Biochemistry 30, 9700-9709

28. Bizzozero, O.A. (1996) Meth. Enzymol. 250, 361-382

29. Wedegaertner, P.B., et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 503-506

30. Grosenbach, D.W., et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 1956-1964

31. Pepinsky, R.B., et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 18244-18249

PL 197 833 B1

32. TanakaHall, T.M., et al· (1995) Nature378, 212-216

33. Mohleta nadlani, ( '\999'-Devek^pp^ent) 99, 997-998

34. Hall et ak, ei999)/Vat/re?^38, ^122212

37. Ekaatatak, (1999)Ccr/^^vt6B)P)pyE), 994-997

36. Faeetal., ,1999)/1βη 447-445

38. Chanaet ak, ,1995- DenelnpmenttU, ,333-3337

38. Ekhalatderai., 71999)Ce// 78. 76-6-1673

39. EkehOhet ai., ,19997 /1eV 88,784-787

40. Zohlleret an, 71672-JhopΛ/ad. Acad. Sci. USA.88 7766-66

49. Kanfman a waSAarp, 71998- JMoP Chii. Biol.) 7 ,7 930-19)9

42. Leusaerat, 71998- 7'evae/gqe/, 9 9 99 9

43. Moeyrsor an, 71998) 500/0.222,7124

44. Ha^^na,71A, 719983 Te2rade2ron 33,3

47.ltakuraerat, 71998)Aco.Rev. β/cpaeve 27,779

46.Chneinaeam ana Wells O1998-Sc/enoa 224, 7 90899908

42. APdlmaeet an, 71998)/ne/e 22 798

48. Wells etan, 71998)Geno37, 7D9

49. W.D. Husoet an, 71998-Sc/enoa 224, 7 222-122)

70. H.L. Yin ana T.P. Storool, 71998- Nature228,578-578

79. Linaiee, 71997)/Vadyre?/ 988 767

72. Grohso na Witkip,7 195)9J. Am. Chem.Scp. 88, 7 979

73. D.M. Haeerstichaka M. Glaeor, 719988 /1«)P. Nad. Acad.Sci. USA66, 7478.4478 74.SAOhaet an, 71998)Aco.Rev. BiopPes. Biopno.'0,445-2>70

77.0haowa et an, 71998- Chem Phetm.Bull. 332 7244

76.Batzoi etan, 71978)Biopaim BiopPes. Arta 2298 79)97|9)9

72. SAOhael an, 71998)l1hmp. Nad. Acad. Sci. USA72,e-9--4-99

78. Pich,71998)Arca.Biopaem.Biopmes. 216, 7 925|97

79. Kaeokara et an, 71998) J. BioP Chem. 25),e838-7839

60. Ranhatat a k, 7 1992)Arca.Biopaem.Biopmys. 1 998 7 72-472

69. Paeokakjopohlohor an, 7199-9Jhop. Nad. Acad.ScP 11 SA 888 7 9645)) 9646

62. Chah,T.C.anaLipmane,F. (19971/Λ Biop Chem. 197,718

63. KawineOiet an, 71999) NawEnol. J. Mo2.3399 747

64. Tamae ht an, 71999)J/ad7re338, e^737233

67. GaeO etan, 71997)J/ad/reV38, 227-227

66.HaPet etan, 71997)NavropcienoaLeW. 1922 7 908 99

68.0111/111.7^. . kastrichi S.A., 71975), 7. New^ol. Namropurg. PhysaiatryS), 773-574

68. Kanaal et a i., 71997)NavroPiolopusfDisevseV3 7 D-ID

69. Ripooeral., e1677-Jhop. Nad. Acad.Sca USA, 99: 658-659

89.ΝΙοΙίιΙρορ. 7. etat, 71999)NavropcienoaQ6,570-571

82. beel, M.F. <^t £1 k, 71999)J , Navropcienoa/93 4 -6)-4-67

23. Danier, i^.et ak, 71999)ChV89, 573-574

24. Hatr-Katz, R. (1999) lnt. Rev. lmmenoP «^9 227-222

87. Barget al., 71999) BrainRem., 5798 299-299

26. ApOel et ak, 7199-)J1co. ΝνμόΙ., 229 78-99

22. Νογθπ. C.h, et ak, 71998)Scienoa V24, 7 929|98

88. TaersoipJ.S^tak, 719998 BioP 12, e7-72

89. Dae,A.K.etak, 71999)J. BioP Chem.2222 7 9901-9 9909

80. Bathiawmai L.& RaeOiM.D. .1999)J. BioP Chem.228, 22939-22270

89.Rajt| R.V. etat, 71999) MoP Chii. Biopaem.124767,po, (9--290

82. Dasohio,R.a, .t ak, 71999)in LipiO MoPifichtiorr aPmroteina, M.O, SAhleeinaer, 7111

83. KautsohiH.C. & lnmak.e.K.(1999)Jmot Biopaem.290, 790--96

84. Hailz, 7 .R^t a k, 71975)Arca. Biopaem.Biophys. 1 6,669-657

87. Stefanim, S^tak, 71992)Arca.Biopaem.Biophys. 19),

86. Kawaeeshl, A.J, .1998); β/opaeve1Tahyo) 88, 733-333

82. HahSOiH.O. .1992)in MoPemSAnthaticRaeetiohe, W.A.Baejawin.7eι

Wooyofaie hylow^e powyżej ρΙ.ΙιοΙι.Ιι i osenaecje oą fą drogą włącorae oaoeo aemereacje.

PL 197 833 B1

Równoważniki

Pomimo, że opisaliśmy szereg wykonań według niniejszego wynalazku oczywiste jest dla specjalistów, że nasze podstawowe wykonania można zmienić dostarczając innych wykonań, które wykorzystują kompozycje i procesy według wynalazku. Zatem, uznaje się, że zakres niniejszego wynalazku obejmuje wszystkie alternatywne wykonania i warianty, które są zdefiniowane w powyższej specyfikacji oraz przez załączone tu zastrzeżenia; niniejszy wynalazek nie jest ograniczony specyficznymi wykonaniami przedstawionymi w przykładach.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. VWizzlowane białkozzwierającc N-końńcwy i C-końńcwy aminokwas,zznmieenntym, żż jest białkiem hedgehog wybranym z (a) białka z N-końcową cysteiną, która ma przyłączoną co najmniej jedną resztę hydrofobową;

(b) białka z N-końcowym aminokwasem, który nie jest cysteiną z przyłączoną przynajmniej jedną resztą hydrofobową i (c) biało z cc nojąaierj ąeneresztą hyyrońoObwy bPOstawiońezzmiastN-końccwyeg amineń kwasu, przy czym białko hedgehog nie jest modyfikowane na C-końcowej reszcie sterolem.
2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że reszta hydrofobowa jest peptydem zawierającym co najmniej jeden hydrofobowy aminokwas.
3. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że reszta hydrofobowa jest lipidem.
4. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że białko dalej zawiera resztę hydrofobową zamiast, lub przyłączoną do, C-końcowego aminokwasu.
5. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że białko hedgehog zawiera fragment bioaktywny, który może wiązać się z białkiem patched.
6. Białko wweług zzasz. b, zznmieenn tym, bż N-końccwy bmineńwys j jst fuueojońelne npo chodną cysteiny.
7. Białko wyeług gzate. 1 1 zznrnieenn eyyi, żż b iaWo jeet maOdfikowyno n o zamówn N-końccwym aminokwasie i C-końcowym aminokwasie.
8. Białkowyeługzzsttz.4a Ibb7 , zznmieenntym. żż ma łesztęh yyrońoObwy ppOstawiońocz, lub przyłączoną do co najmniej jednego aminokwasu pośredniego pomiędzy N-końcowym i C-końcowym aminokwasem.
9. Białko wyeług ζθι^ζ. L zznmieenn tym, zż nm zreztę hyyłańoObwy ppOstawiońo zz, I uu przyłączoną do co najmniej jednego aminokwasu pośredniego pomiędzy N-końcowym i C-końcowym aminokwasem.
10. Białkowyeług zzssrz.3, zznn^m^enntyy^. żż reesta i Ipiódow j ees bwyszm tługzzczwym wwbranym z nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych mających 2 - 24 atomów węgla.
11. Białkowyeług zzłsta. 1 1 zznrnieenn eyy^, żż rest białkiem heedgecou gzsSiwysom zz źróóda będącego kręgowcem.
12. Białkowyeługzzstrz.1 h zznmieenntym. żż białko heedgSeo j oss ugzsSiwyso z cctowieSo lub szczura.
13. Białkowyeług zzssrz. 1 albb C11 zzamieenntym, żż biało heedgSeoj oss białkiem heedgr hog kręgowca wybranym z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedghog albo jego bioaktywnym fragmentem, przy czym białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched.
14. Białkowyeług zasto. L z znmieenntym. bż białko ZeedgSeo maOżwiącza zię z białkiem patched.
15. Białkowyeługzzstrz. L zznmieenntym. żż ddOdjkowyzzwierappęherzzk z^rzZ-^{^}kcczńodd niego poprzez resztę hydrofobową białka.
16. Białko wyeług zaska. 15, zr^ć^r^i(^i'^r^e! tym, zż 1θ^ ζ^^πο ^z grupp ztoOżńor z błony komórkowej, miceli i liposomu.
17. Białko wyeług ζε^ηή'ζ. L zznmieenn ty^n^, że białko heedgSeo zzwiera zzSwysoją θπΙποkwasów w co najmniej 80% identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4, przy czym białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched.
18. Białkowyeług zzasz. 17, zzamieenntym, bż białko ZeedgSeozzwiera zzSwysoją zminokwasów identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4.

PL 197 833 B1
19. Białko według zastrz. 1 albo 18, znamienne tym, że w białku hedgehog jest usuniętych 1 do 10 smingOwsuów a jseo C-0gńhs w pgzównsnin a OsdesOoe tcpn daiOiseo.
20. Białko według zastrz. 1, znamienna tym, że ma C-^u^aminokwas ooas N-końcową eznpę rigpzglingwą nrwgzagną prasa zssOhję sldsOcdn a N-0gńhgwą hcutsiną OisłOs.
21. Białko iwe^s^^^g zastrz. 1, znamienna tym, że ma C-koScooty i N-koOńc>wegrzgp smidgwą nrwgragną prasa rssOhję rig-surrn Owsun rłnuahagwseg a N-Ogńhgwą hcutsiną OisłOs.
22. BiałkO iwe^s^^^g zasSz. 1, znamienna tym, że ma C-koOcc>we zminc>0wes i N-koOchweZ^Γzgp mslsimidgwą nrwgragną prasa rssOhję ernpc mslsimidgwsj a N-Ogńhgwą hcutsiną OisłOs.
23. Białko weSług zastrz. 11 1100 12, zlbO 12, znamienaa tym, Ze C-koOchwe zminoOwes Z^^ł Os jsut mgdcfiOgwsnc rsuałą OcdrgfgOgwą.
24. BiałkO weSług zastrz. 1, znamienaa tym, Ze m^ C-koOchwe zminoOwes ί N-koOchwezrzgp shsrsmidgwą, prac hacm wcmisnigną ernpę nrwgragng prasa rssOhję pgdurswignseg shsrsmidn a N-Ogńhgwą hcutsiną OisłOs.
25. BiałkO weSług zasSz. 1, znamienaa tym, Ze m^ C-koOchwe zminoOwes z N-koOchwezrzgp rigmgrfglingwą, prac hacm wcmisnigną ernpę nrwgragng prasa rssOhję ernpc eslgOsrgngwsj a N-Ogńhgwą hcursiną OisłOs.
26. BićJłk^uo wr^s^ług zastrz. 1, znamienna tym, że j jst pplippptyCdm hesdesog magdfiaowenym jsdną lnO więOuaą lihaOą rsuał lipgfilgwchO ns wswnęrranchO rstarshO sminoOwsuów.
27. Białko wr^s^ług zastrr. 1, znamienna tym, że j jst pplippptyCdm hesdesog magdfiaowenym jsdncm lnO więhsj lipgfilgwcmi srgmstyhancmi węelgwgdgrsmi.
28. Sppgtó maltiwelehtyese białło/wse bić^łk^^ hesdesog, znamienaa yym, es do N-Oońhowsj hcursinc OisłOs adsfinigwsnseo w asurra. , lnO fnnOhjgnslnseo sOwiwslsnrn N-Oońhowsj hcursinc rsOiseo OisłOs pracłąhas uię ecdrgfgOows rsuaty w oOshnośhi lipofilowseo pęhesracOs.
29. Sppsuó Owe^s^^^g zastrz. 18. znamienaa 1^ jji^u) aoCrzfo0owe zzsu^^ zzyłącha zię reszty Z żpidn, wcOrsnseo a nsuchonche i nisnsuchonche Owsuów tłnuahagwche msjąhche 2 do 24 sromów węels.
30. Sppsóó weSług zastrZaH, znamienaa tym, ze s^^sz^^ się Ziałko hesdesegalbO jjjse Ziooku łcwnc frsemsnl, którs moeą wiąasć uię a OisłOism psthhdd.

3,. Sppsóó weSług 18ιΖζ. 13, znamienaa tym, Ze str^sz^^ zię 1iałko aeSdehegweCozke z zejpc ałoeonsj a Sonih, Indisn i Dsusrt hsdeshge slOo jseo OiosOtywnc frsemsnt, prac hacm OisłOo Osdeslioe moes wiąasć uię a OisłOism psthhsd.
32. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że stosuj się białko hedgehog usOwsnhję sminoOwsuów w ho nsjmnisj 80% idsntyhaną a dowolną a SEQ ID NO: U4.
33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że stosuj się białko hedgehog zawiei-ałące usOwsnhję sminoOwsuów idsntyhaną a dowolną a SEQ ID NO: U4.
34. Sppsóó wr^s^łL^g 18ι^ζ. 12, znamienaa tym, Ze rZwec>ohaSśie z przałąchaniem rzsóty Z iiiclu pracłąhas uię pęhhsracO wcOrsnc a ernpc ałoeonsj a Ołonc OomórOowsj, lipouomn i mihsli.
35. Sppsóó mmOdfilcu^sh Ziałko heSdehegzadhniowekcse w załóz. 1, z namienaa tym, że wwrzwsdas uię prycnsjmnisj jsdną rsuałę OcdrofoOową do N-Oońhowsj hcursinc OisłOs lnO do fnnOhjonslnseo równowseniOs N-Oońhowsj hcursinc.
36. Sppsóó v^^s^hj^g 1^ιΖζ. 13, znamienaa tym, Ze 1οΟοΙΙ«ο^ aosCykUyje zię Zedrz-oSOwą a pęhhsracOism.
37. Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że stosuj sj łtyclrz-obOwą, kkóra j jsi rsuałą lipidn, wcOrsną a nsuchonchS i nisnsuchgnchh Owsuów tłnuahagwchh msjąhchb międac 2 i 24 słomc węels, slOo jsuł OisłOism hcdrgfgOgwcm.
38. Sppsóó weSług zastrZa 13, znamienaa tym, Ze stosz^^ zię 1iałko, Ztóre se^st Ziałkiem aeSdeheg slOo jseo OiosOtywncm frsemsntsm, prac hacm OisłOo hsdeshge moes wiąasć uię a OisłOism psthhsd.
39. Sppsóó v^^s^hj^g 18ιΖζ. 13, znamienaa tym, Ze str^sz^^ zię Ziałko aeSoeheg weCozkc z cjrzpc ałoeonsj a ponih, Indisn i Dsusrt hsdeshge slOo jseo OiosOtywnc frsemsnt, prac hacm OisłOo OsdesOoe moes wiąasć uię a OisłOism psthhsd.
40. Sppsóó wt^s^ług zastrz. 33, znamienna tyi, że atosz-e zię; bićtłl^o hesoesieg, kUóóz zawi^z usOwsnhję sminoOwsuów w pracnsjmnisj 80% idsntyhaną a dowolną a pEQ ID NO: U4.

4, Sppsóó wt^s^ług zastrz. 44, znamienny tym, że atosz-e zię? bićtłl^o hesgesieg, kOóóz zawi^z usOwsnhję sminoOwsuów idsntyhaną a dowolną a pEQ ID NO: U4.
42. Sppsóó v^^s^Oj^sj zasti^. 13, znamienaa tym, Ze aosCykUyje zię rzsóty 10^-00(0^ z zpęheracOism wcOrsncm a ernpc ałoeonsj a Ołonc OomórOowsj, lipouomn i mihsli.

PL 197 833 B1
43. białkahedgehogzawierającegoN-końcową cysteinę, którato moc^y^fil^^cja zwiększa aktywność biologiczną białka, znamienny tym, że dostarcza się białko hedgehog lub jego bioaktywny fragment zawierający N-końcową cysteinę, mogące wiązać się z białkiem patched, poddaje się reakcji N-końcową cysteinę z tioestrem kwasu tłuszczowego i wytwarza się postać amidu białka hedgehog zdefiniowanego w zastrz. 1.
44. Sposób według 41, znamienny tym, że stosuje się białko hedgehog wybrane z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog albo jego bioaktywny fragment, przy czym wybrane białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched.
45. Sposób modyfikacji białkahedgehogzawierającegoN-korίcowącysteinę. którato modyfikacja zwiększa aktywność biologiczną białka, znamienny tym, że dostarcza się białko hedgehog lub jego bioaktywny fragment, zawierające N-końcową cysteinę i mogące wiązać się z białkiem patched i poddaje się reakcji N-końcową cysteinę z grupą maleimidową.
46. Spooób według 45, zi^^r^i^r^r^\y tym, że stosuj się białko hedgehog wybrane z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog albo jego bioaktywny fragment, przy czym wybrane białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched.
47. Sposób modyfikacji białkahedgehcgzawierającegoN-końcowącystoinę, którato modyfikacja zwiększa aktywność biologiczną tego białka, znamienny tym, że dostarcza się białko hedgehog lub jego bioaktywny fragment, zawierające N-końcową cysteinę i mogące wiązać się z białkiem patched i poddaje się reakcji N-końcową cysteinę z podstawioną grupą acetamidową.
48. Spooób według zas^z. 47, znamienny tym, że stosuj się białko hedgehog wybrane z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog albo jego bioaktywny fragment, przy czym wybrane białko hedgehog może wiązać się z białkiem patched.
49. Sposóbmodyfikacji białkahedgehcgzawierającegoN-końcowącystoinę, którato modyfikacja zwiększa aktywność biologiczną białka, znamienny tym, że dostarcza się białko hedgehog lub jego bioaktywny fragment, zawierające N-końcową cysteinę i mogące wiązać się z białkiem patched i poddaje się reakcji N-końcową cysteinę z grupą haloketonową.
50. Sposób według zas^z. 49, znamienny tym, że stosuj się białko hedgehog wybrane z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog albo jego bioaktywny fragment.
51. Białko zdefiniowane w zastrz. 1 do stosowania jako lek.
52. Biaako według zas^z. 51, znam jenne tym, że stosujesię j akolek białko zdefiniowane w zastrz. 2-19.
53. Zastosowanie białka zdefiniowanego w zas^z. 1 do wyywarzania leku do leczenia zabuuzenia neurologicznego.
54. Zastosowanie według zas^z. 53, znamienne t^r^, że do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia neurologicznego stosuje się białko zdefiniowane w zastrz. 2-19.
55. Rekombinantowy polipeptyd hedgehog o zwiększonej aktywności biologicznej i mogący wiązać się z białkiem patched, znamienny tym, że polipeptyd hedgehog odpowiadający białku wybranemu z grupy złożonej z Sonic, Indian i Desert hedgehog jest modyfikowany przez jedną lub większą liczbę reszt lipofilowych.
56. Pollpeppyd hedgehog weedrigzastóz. 55, znamiennytym, że zawiera sekwenccj aminokwasów w przynajmniej 80% identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4.
57. Pollpeppyd hedgehog weedrigzastóz. 56, znamiennytym, że ζ£^^ϊ^ί^£- sekwenccj aminokwasów identyczną z dowolną z SEQ ID NO: 1-4.
58. Pollpeptyd hedgehog według zas^z. 55, zi^^i^i^i^i^^ tym, że less pollpeptydem hedgehog modyfikowanym jedną lub więcej grupami lipofilowymi na wewnętrznych resztach aminokwasów.
59. Pollpept:yd hedgehog według zas^z. 55, zi^^i^i^i^i^^ tym, że less pollpept:ydem hedgehog modyfikowanym jednym lub więcej lipofilowymi aromatycznymi węglowodorami.
60. Pollpeppyd hedgehog według zas^z. 55, zr^^r^i^ι^ι^rr tym. że less dc^^t^r^c^^£^rn/ czony preparat białka.
61. Pollpeppyd hedgehog według 56 albo 57, albo 58, albo 59, znamienny tym, że fess dostarczany jako oczyszczony preparat białka.
62. Pollpept:yd hedgehog według zass:rz. 55, znamienny tym, że resz.y Ilpofiiowe są wybrane z grupy złożonej z kwasów tłuszczowych, lipidów, estrów, alkoholi, struktur klatki i aromatycznych węglowodorów.

PL 197 833 B1
63. Polipeptydhedgehogwedługzastrz. 556 albo 57, albo 58, albo59, zr^ć^r^ic^r^r^n/tt^r^, żeIeszty iipofiiowe są wyOzsne z grupy złożonej z kwssów tłuszczowych, lipidów, estrów, sikohoii, struktur kistki i sromstycznych węgiowodorów.
64. Ρο^^- hedęgeeoo weełuu zaste. 59, zr^s^mie^r^r^ć/ tym, że aromattcczn węęlowodór jees wyOrsny z grupy złożonej z benzenu, periienu, fensntrenu, sntrscenu, nsftsienu, pirenu, chrysenu i nsftscenu.
65. Polipeppyd hedgehog według zas^z. 64, znamienny tym, że węglowodór jess pirenem.
66. Polipeppyd hedgehog według zaste. 55, znamienny tym, ze reszty lif^c^oiic^\^^ są wybrane z grupy złożonej z izoprenoidów, terpenów i poiicykiicznych węgiowodorów.
67. Polipeptyd hedgehog według zass^. 555 albo 55, albo 58, albo 59, znamiennytym, że r^^^ty iipofiiowe są wyOrsne z grupy złożonej z izoprenoidów, terpenów i poiicykiicznych węgiowołorów.
68. Polipeptyd hedgehog według 66, znamienny tym, że reszty Iipofiiowe są wybrane z grupy złożone z sdsmsntów, Ouckminsterfuiierenów, witsmin, giikoiu poiietyienowego, giikoiu oiigoetyienowego, diestrów (C1-C18) sikiiofosforsnów, -O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-sikiiu.
69. Polipeppyd hedgehog według 66, znamienny tym, że reszty Iipofiiowe są wybrane z grupy złożone z 1- iuO 2-sdsmsntyioscetyiu, 3-metyiosdsmsnt-1-yioscetyiu, 3-metyio-3-Oromo-1-sdsmsntyioscetyiu, 1-deksiinoscetyiu, ksmforoscetyiu, ksmfsnescetyiu, norsdsmsntyioscetyiu, norOornsnenoscetyiu, Oicykio[2.2.2]-okt-5-enoscetyiu, 1-metoksyOicykio[2.2.2]-okt-5-eno-2-ksrOonyiu, cis-5-norOorneno-endo-2,3-diksrOonyiu, 5-norOorneno-2-yioscetyiu, (1 R)-(-)mirtentsnoscetyiu, 2-norOornsnenoscetyiu, snty-3-oksy-tricykio[2.2.1.0<2,6>]heptsno-7-ksrOonyiu, łeksnoiiu, dodeksnoiiu, łołecynoiiu, tetrsdeksdienoiiu, decynoiiu i dodecenoiiu.
70. Polipeptydhedgehogwedługzastrz. 55, znamiennytym, że ma wprowadłone I ipofiiową iuO reszty iipofiiowe, wzmsgsjące sktywność Oioiogiczną poiipeptydu wzgięłem niezmołyfikowsnego Oisłks hełgehog.
71. Polipeppyd hedgehog według 553 albo 55, albo 58, albo 59, znamienny tym, ze ma wprowsdzone resztę iipofiiową iuO reszty iipofiiowe, wzmsgsjące sktywność Oioiogiczną poiipeptydu wzgięłem niezmodyfikowsnego Oisłks hełgehog.
72. Poiipeptyd hełgehog zdefiniowsny w zsstrz. 55 ło zsstosowsnis jsko iek.
73. Polipeptyd hedgehog zdeefniowann w zass^. 555 albo 55, albo 58, albo 59, do zastooowania jsko iek.
74. Zastyoowynie żmoddCkowynedo I Ippofowo polipPdtyCd ż^d^e^e^c^^, żZedniowynedo w zassrz. ż5, ło wytwsrzsnis ieku ło zmisny stsnu wzrostu komórki resgującej ns sygnsły hełgehog.
75. Zastosowanie zr^oc^^fiłcc^o^i^r^c^c^o I ipofitowo polipeptyCu heegehoo, zdefiniowanedo w zas^z. 56 siOo 57, siOo 58, siOo 59, ło wytwsrzsnis ieku ło zmisny stsnu wzrostu komórki resgującej ns sygnsły hełgehog.