JPS63500561A - ヒト抗‐炎症ホスホリパ−ゼ阻害蛋白 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒトー−コ′「ホスホリパーゼ　Ｉ丘 及血並光互 本発明は、ヒトならびに動物における炎症を処理する分野に関係する。さらに詳 細に言えば、炎症を調整するのに効果的であるホスホリパーゼ阻害蛋白の純粋な 試料に関する。

宜且技血 創傷もしくは怒染部位における炎症の生理学的現象については、何世紀もの間認 識されてきている。また、この現象が。

そのような刺激に反応して正の値を示す間、ヒトもしくは動物の安全を確保する ために、この反応の程度をたびたび調節しなければならないことも十分に理解さ れている。さらに。

炎症は１例えば慢性関節リウマチもしくは全身性エリテマトーデスの様な慢性炎 症性疾患として発現することもある。この様な状態は２本人を衰弱させ、さらに 生命にかかわったり。

象、性のエピソードの結果にもなりかねない。他のこの様な疾患、喘息を伴う炎 症も、気管支の狭窄のためによる死を招くこともある。

過去数十年の間に、炎症を伴う生化学的事象に関するより詳細な情況が集積され てきた。この情況は複雑なものである。

開始過程の部分は１組織破壊のカリクレインプロテアーゼによって遊離されるブ ラジキニンの様なペプチドキニンによって媒介されるものである。このキニンも しくは、他のペプチドメツセンジャーは、アラキトネートカスケードを開始すべ く、ホスホリパーゼ酵素Ａ２および／もしくはＣを活性化するために、炎症部位 の特異的細胞受容体に作用するものである。

この“アラキトネートカスケード″は、炎症反応を維持する上で、驚くべき重要 性を示す。第１図に示した複雑な反応の中で、アラキドン酸は、対象症例の膜リ ン脂質より遊離され、集合してエイコサノイドとして知られる種々の生成物へ変 換される。このエイコサノイドには、ロイコトリエンおよびプロスタグランジン が含まれており、これらは、炎症部位に対する直接的な効果を発揮するために細 胞外へ放出される。

これらは、比較的短い半減期を示す。しかしながら、その生理学的効果は多岐に 渡り、かつ驚くべきものであり、血管拡張（例えば、プロスタシリンおよびロイ コトリエンしＴＣ，ならびにＬＴＤ、）　、血管収縮（例えば、トロンボキサン およびしτＢ、）さらにヒスタミン放出を含む。

抗炎症薬学における最近の役割はほとんどが、アラキトネートカスケードに向け られている。この観点からみれば、第１図に示されている様に、カスケードの有 意な特徴は２次の通りである。すなわち、全生成物の生成は、細胞リン脂質から のアラキドン酸の遊離（ホスホリパーゼによって媒介される）と共に始まり、そ の後反応経路は、数種の反応系へと分かれるということである。この反応系のう ち、シクロオキシゲナーゼ経路は、プロスタグランジンを生成し、リボオキシゲ ナーゼ経路は、ロイコトリエンを生成する。

アスピリンおよびインドメタシンの様な繁用されている非ステロイド系抗炎症薬 剤は、シクロオキシゲナーゼを抑制し。

従って、アラキドン酸が最終生成物へ変換される経路のいくつかのみを抑制する ものである。アラキトネートカスケードの他の経路については、影響はみられな い。一方、ステロイド、グルココルチコイド、ホルモンは、一般的に、リン脂質 膜からのアラキドン酸の生成に対して効果を発揮するものであり、すなわち、全 カスケードに対する直接的な効果を示す。

）ｌｏｎｇ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ＋　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ 　（ＬＩＳＡ）　（１９７６）　７３　：１７３０−１７３４゜しかし、ステロ イド療法の欠点については、十分知られている。水分停留、高グリシン血症、高 脂血症、骨粗しよう症、緑内障ならびに冠状および大血管のアテローム硬化症の 危険性の増加の様な副作用が、この様な治療に伴う好ましくない反応である。

近年１次の事実が証明されている。すなわち、ステロイドの抗炎症効果は、少な くともその一部は、結合する蛋白の分泌を誘発する能力、さらに、アラキドン酸 放出の原因であるホスホリパーゼ酵素を抑制する能力によるものであるというこ とである。）Ｉｉｒａｔａ、　Ｆ、、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８１） 　２５６　：　７７３０−７７３３゜この抑制因子は、マクロコルチンと呼ばれ ている（Ｂｌａｃｋ。

ｗｅｌｌ、　Ｒ，Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８０’）　２８ ７　：　１４７−１４９）　：また。

レノコルチン（Ｒｕｓｓｏ−Ｍａｒｉｅ、　Ｆ、＋　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈ ｉｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ紅田（１９８２）　７１２　：　１７７−１８５　）　： もしくは、リポモジュリン（Ｈｉｒａｔａ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ 　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９８０）７７　：２５３３− ２５３６　）とも呼ばれている。この蛋白は、一部う、、トやウサギの細胞から 精製されており２免疫学的に交叉−反応性であると思われる（Ｈｉｒａｔａ、　 Ｆ、ｅｔ　ａｌ＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　ＲｅｓＣｏｍｍ　（１９ ８２）旦：　２２３−２３０　；　Ｒｏｔｈｈｕｔ、　Ｂ、ｌ　ｅｔ　ａｔ、　 １ｂｉｄ　（１９８３）　１１７　：　８７Ｂ−８８４）。

最近、リポコルチンと名付けられたヒトの抑制因子が、ヒト繊維芽細胞において 確認されている（Ｅｒｒａｓｆａ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ。

旦匹旦ｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ａｃ田（１９８５）　８４７　：　２４７−２５４ 　、さらに、　Ｗａｌｌｎｅｒ＋Ｂ、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（ １９８６）　３２０　：　７７−８１ならびにｐ６ｐｉｎｓｋｙ。

Ｒ，Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８６）　２６１　 ：　４２３９−４２６１　、もラットリボコルチンの単離およびその結果、なら びにヒトの類似体ノクローニング、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏではＰＡ２抑制因子でア ル、ニついて報告している。

グルココルチコイドよりはむしろアラキドン酸生成を抑制する蛋白を直接投与す ること（これは、これらの蛋白の生成を刺激することになる）は、対象例を、付 随する副作用の危険性にさらすことなく、炎症のステロイド調整ができるという 結果となると考えられる。しかし、ヒトにおけるこの蛋白は、精製された状態で はない。言うまでもなく、望ましくな゛　い炎症反応を直接治療できるために、 十分に精製された十分な量の純粋なヒトホスホリパーゼ阻害蛋白（ＰＩＦ）の開 発が望まれているところである。

光１Ｅ旧肛示 本発明は、精製ヒトホスホリパーゼ阻害蛋白（ｈＰＩＰ）ならびに２組換え技術 によるその生成において有用な物質を提供するものである。５ＯＳ−ＰＡＧＥに 対する単一４０ｋｄ結合を有するヒト腹膜透析液から明らかな均質物へ精製され た物質は５かなりの量のアポリポ蛋白ＴＶ　（ａｐｏＡＩＶ）と有意なＰＩＰ活 性を含存している。この４０ｋｄ結合から）容出した蛋白を用いたウサギの免疫 処置は、　ａｐｏＡＩＶおよびＰＩＰの両方と反応できる抗血清を増加させる。

従って、これらの抗体は、スクリーニング組換え型ならびにｈＰＩＰ生成のため の他の細胞に充当するものである。

これに関連して、他の蛋白から遊離しているヒトＰＩＰは。

次の２つの方法によって得られる。すなわち、膜腔透析液からの直接的精製によ って、ならびに２組換え型宿主を用いた生成によっての２方法である。従って、 ある面では、この発明は、実質上純粋な型でのヒトＰＩＦに関するものである。

他の面では、この発明は、第１３図に示したアミノ酸配列から成るヒトＰＩＦ活 性を有する蛋白に関するものである。さらに他の面においては、この発明は、腹 膜透析液からの精製ｈＰＩＰの調整のための過程およびこの過程の生成物に関す るものである。精製過程の生成物は、それぞれ非グリコシレートもしくは、グリ コシレート化型の３６ｋｄもしくは４０ｋｄの分子量によって特徴付けられ、さ らにＰＩＦ活性によって特徴付けられる。

純粋ｈｐｒｐも２組換え方法を用いて生成されると考えられる。

従って１本発明の他の面は９組換えによって生成されたｈｐｒｐ（非グリコシレ ートならびにグリコシレート型両方において）に１組換え型宿主において、この 蛋白の生成をもたらす発現システムに、この発現システムを含む媒介体に、この システムにより変換される宿主に、さらに１組換え型宿主細胞を培養することに よってｈＰＩＰを生成する方法に関連する。

さらに他の面においては１本発明は、　ａｐｏＡＩＶおよびＰＥＰの４０ｋｄ混 合物、ならびに発明自体のＰＩＦ蛋白の投与に反応して生成された抗体に、ＰＩ Ｆを含む薬学的組成に、さらに、この様な成分もしくは精製ＰＩＦを用いて、ヒ トならびに家畜における炎症を改善する方法に関する。ＰＩＰはａｐｏＡＩＶの 存在によって安定化され、　ａｐｏＡＩＶとの混合物においてＰＩＦを含んだ成 分は、薬剤として特に有用であると考えられる。

回訓ぶ４１１通Ｗ呪 第１図は１反応計画のアラキトネートカスケードならびにエイコサノイド生成物 を示す。

第２図は、ここで用いた精製方法の概要を示す。

第３図は、腹膜透析物の４０％−６０％飽和硫酸アンモニウム分画を、　Ａｆｆ ｆ−ゲルブルー、コンカナバリＡ−セファロースならびにＤＥＡＥセルロースク ロマトグラフィーにかけた場合に得られた溶出パターンを示す。

第４図は、腹膜透析液の未精製ならびに精製された分画に対する５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅの結果を示す。

第５図は、精製計画の様々な段階における相対的なＰＩＦ活性を示す。

第６図は、コンカナバリンＡ−セファロースカラムからの活性含有分画に対して 実施された分析−反対層高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）の結 果を示す。

第７図は、精製段階において１種々の分画におけるｈＰＩＰを検出するために、 精製ｈｐｒｐに対する多クローン性抗血清の能力を示す。

第８図は、抗−４０ｋｃ＋抗体によって、ＰＡ２へ結合したｈＰＩＰの検出につ いて示す。

第９図は、　ｈＰＩＰを生成する細胞に対するＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔの結果 を示す。

第１０図は、ｐＵ２００へ挿入するためのヌクレオチドならびに推定アミノ酸配 列を示す。

第１１図は、ｐＵ５００へ挿入するためのヌクレオチドならびに推定アミノ酸配 列を示す。

第１２図は、　ｐ６００へ挿入するためのヌクレオチドならびに推定アミノ酸配 列を示す。

第１３図は、　ｈＰＩＰに関する完全なコード配列を有するｐＬＥ−１へ挿入す るためのヌクレオチドならびに推定アミノ酸配列を示す。

第１４図は１種々のクローンｈＰＩＰ　ｃＤＮＡとゲノム部分との関係を示す。

第１５図は、　ｈＰＩＰ−変換ＣＨＯ細胞におけるＰＡ２活性の抑制を示す。

第１６図は１組換え型ｈＰＩＰによるＰＡ２抑制を示す。

第１７図は、　ｈｐｒｐならびにホスホリパーゼに関する比較アミノ酸配列を示 す。

第１８図は、　ＰＧＥ２放出を測定する圏　νｉ　ｔｒｏ検定における４０ｋｄ 蛋白の活性を示す。

第１９図は、　ｈＰＩＰ活性に関するｉｎ　ｖｉｖｏにおけるラット胸膜炎抑制 検定の結果を示す。

第２０図Ｌｔ、且　■凱における足−浮腫検定において、カラゲニンと同時に注 射したｈＰｉＰの活性を示す。

第２１図は、１００μｇの精製ｈｐｒｐ、ｉ■のインドメタシンならびに２００ μｇのデキサメサゾンを腹膜腔内へ投与した場合。

後足の浮腫を抑制する相対的な能力を示す。

第２２図は、ラットの大腿静脈から投与された場合１種々の用量の精製ｈＰＩＰ が後足浮腫を抑制する相対的な能力について示す。

第２３図は、ラットに対して筋肉内投与された場合、補助薬誘発関節炎を伴う関 節腫脹を抑制する精製ｈＰＩＰおよびデキサメサゾン（２００μｇ）の相対的能 力を示す。

木生所少実施…様 Ａ、ＰせＩ亘■性１ 本発明の蛋白は、出発物質として、透析症例から得たヒト腹膜透析液を用いて調 製した。ここに示した精製方法によって、均等質の蛋白であってかつそのままの 状態でみられるような蛋白に伴う不純物を含まない蛋白が得られる。この精製方 法によって、それ自体を治療に用いられるほど十分に純粋な蛋白を得ることに成 功したが、この精製物質の効力も２選択可能な調製方法の開発において重要なス テップである。ｈｐｉｐのための組換え技術についてここで述べる。従って２本 発明のＰＩＦは、ここで述べた様に調製されたｈＰＩＰのみならず１選択可能な 方法を用いて得られた実質的に同様な構造の蛋白を含む。“実質的に同じ′によ って、ホスホリパーゼＡ２の抑制における蛋白の活性（ＰＡ２抑制検定）（下記 に述べる亘ｖｉｔｒｏの酵素検定方法において述べたように）は、保持されると いうことを意味している。第１３図に示したアミノ酸配列は、この活性を示すこ とが知られている。

アミノ酸配列は１種々の方法において修正されても、その基本的な活性を保持す るということは十分に認識されている。

第１に、ペプチド配列のある部分は、活性に関して欠くことのできないものでな く、全く純粋に生成された蛋白の分画のみが必要とされると考えられる。従って 、第１３図に示されたアミノ酸配列の部分は、活性が保持されるならば定義内に 含まれるものである。第２に、配列中の特別な、もしくは、わずかに特別なアミ ノ酸の追加、削除または修正は１機能に関しては重要でない変化をもたらすと考 えられる。第３に、蛋白は、イオン化水素を含んでいるため、中性もしくは塩の ような蛋白のイオン化状態は２周囲の培地のｐ）ｌに依存するものであり、蛋白 が液体の形で存在するならば、液体のｐＨに依存するものである。このことより 、蛋白は、固体の形で調製される。さらに、配列中のアミノ酸は、その側鎖にお いて、それほど重要でない変化を被るものである。例えば、スルフヒドリル群の 酸化のようなものである。修正も、活性を破壊する点において無効であると思わ れる。最後に、蛋白は、非蛋白残留分（例えば、リン酸、アセチル群もしくは炭 水化物のような）を伴い１本来の状態で見出されることがある。本発明の精製さ れたもしくは組換え型ＰＩＦは２機能的に定義されているが、すべての実施態様 は、第１３図において例示したｈＰＩＰと相同な広範な配列を保持することが期 待される。相同性のレベルは、第１３図のヌクレオチド４９０−８５２によって コード化されている興味ある部分における保存的な変化ならびに正確な相同性の 両方を考慮して、４０％以上であることが期待される。付加的な変化は、蛋白の 他の部分において受け入れられる。前述の修正はすべて、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏに おけるホスホリパーゼＡ２　（ＰＡ２）抑制検定において示された活性が破壊さ れない限り、定義内にあると言える。

“活性ＰＩＰ断片″は、ＰＩＰに関しては、前述の第１３図のヌクレオチド４９ ０−８５２によってコード化された配列のみから成るペプチドを意味する。この 断片のみ用いるならば、Ｃｈｏｕ−ＦａｓｍａｎもしくはＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉ ｔｔｌｅの標準アルゴリズムの適用によって定めたように、第２の構造が十分に 類似する場合には、最初の構造において、４０％より幾分少ない相同性が必要で ある。特に、　Ｗａｌｌｎｅｔ等によって報告されたりポコルチンにおける３１ −３８１と付されたヌクレオチドによってコード化されたペプチドは、最初のア ミノ酸配列が、この部分において。

４０％以下の相同性を明らかに示しているにもかかわらず、この要求を満たす第 ２の構造を備えている。従って、　ｈｐｒｐ配列よりひき出されたものと同様に 、この特別な断片もまたクレームされる。

′“動作可能な結合′”は、成分が、その通常の機能を実行するために立体配置 されている近位を意味するものである。従って、コード化配列に動作可能に結合 した対照配列は、コード化配列の表現をもたらせることができる。

ＩＩ対照配列（ｃｏｎｔｒｏｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　”は、ＤＮＡ配列、もし くは所望のコード化配列に適切につながれたとき、このような配列と調和できる 宿主において表現をもたらさせることができる配列を意味する。このような対照 配列は、原核生物および真核生物宿主の両方においてプロモータを含み、そして 原核生物においても、配列に結合するリポソーム、さらに、真核細胞において、 終末シグナルを含む。表現を生じさせるのに必要もしくはその助けとなる付加因 子についても、結果的に確認され得る。ここで用いた様に、゛対照配列°”は用 いられた特別な宿主において表現をもたらせるのにどんなりＮＡ配列でも必要で あり得るということを単に意味している。

“細胞”′もしくは“°組換え型宿主細胞°′または“″宿主細胞”は１文脈よ り明らかな様に交互にとり替えのきく言葉である。

これらの言葉は、直接対象細胞、さらに言うまでもなくその結果（子孫）も含む ものである。突然変異や環境の違いのため、すべての子孫が親の細胞と精密に同 じであるというわけにはいかないことは理解されていることである。しかし、こ の様な変化した子孫は、前記の言葉が用いられる場合に含まれるものである。

（以下余白） Ｂ、゛　ゞか゛のＰＩＰの＃″ｌ＋ −ｌ＋一般的明のｈＰＩＰの精製は、第２図に示した様に実施した。言うまでも なく、別の方法も可能であるが、ここに記載された方法により均質性の活性試料 が得られる。第２図に示した特異的な方法に関して要約されたアプローチは、簡 単に言えば１次の通りである。

約２１の液体を得るために充分な透析液は、連続的な腹膜透析を受けている症例 の一バンチから都合よく入手できる。

その後、所望量の純粋生成物を得るために、２！のバッチについて、下記の方法 を実施する。その液体はまず、濃度が増加する硫酸アンモニウムにさらされる。

約４０％〜６０％の硫酸アンモニウム飽和において沈澱した分画は、活性を含ん でおり、さらに精製を受ける。４０％以下の硫酸アンモニウムにおいては不溶で ある蛋白を、前もって沈澱させることは有用なことである。この沈澱物を遠心分 離によって取り出し、さらに精製を実施する。

塩濃度を低下させるために、硫酸アンモニウム含有分画を。

およそｐＨ８の適当な緩衝剤中に溶解した後、低温において。

同じもしくは匹敵する緩衝剤に対して透析を実施する。

（以下余白） その後、透析物は、アルブミン成分を取り除（処置に供される。このアルブミン 成分は最も多量の不純物である。同じ緩衝剤においてこれまで平衡であった親和 力支持Ａｆｆｉ−ｆｆミーゲルブルークロマトグラフィーは、この目的に適合す る。所望のＰＩＰ含存分画は、これらの条件下でカラムに結合せず、流出容量中 に現れる。しかし、溶液中の不純蛋白は。

カラムによって保持され、高塩濃度下で溶出される。

ＰＩＰ分画は１例えばコンカナバリン−Ａセファロース、レンチルレクチン−セ ファロース、もしくは、ピーナツツアグルチニンーセファロース、ｐＨ８緩衝剤 と平衡しているコンカナバリン−Ａセファロースの様なレクチン支持（ｓｕｐｐ ｏｒｔ）により処理される。再び、所望の活性は、これらの条件下にてカラムに 付着しない。

ＰＩＦ含有流出分画を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって２例えばおよ そｐＨ８において、同様な緩衝剤中に平衡状態であるＤＥＡＥセルロース、ＱＡ Ｅ−セルロースもしくハｓｐ−セルロース、　ＤＥＡＥセルロースを用いて、さ らに精製スる。ｈＰＩＰはカラムへ吸収させ１分画は塩分勾配を用いて溶出させ る。

溶出物分画のＰＡ２抑制活性が測定され所望のＰＩＰ分画を確認する。

活性分画を、　５ＯＳ−ＰＡＧＥにかけたとき、　５ＯＳ−ＰＡＧＥは、不活性 蛋白の１８ｋＤ結合、ならびに活性４０ｋＤ結合をもたらす。洗浄剤を用いずに 、この４０ｋＤ結合を溶出させ、再形成させて所望の活性を示す蛋白を得た。こ の調製方法は基本的にはＬａｅｍｌｉ。

Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２３　：　６８０−６８５の方法に従っ たものである。

そして約３ｍｍ１２．５％ゲルが、１０■の総蛋白を含む混合物を精製するため に適切である。

前述の様にして得られた４０ｋｄ結合は、下記のＤ章で述べる様に、数多くのｉ ｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉシ０効力検定において証明されているように高 いＰＩＦ活性を有する。しかし、ＰＩＦに加えて、　ａｐｏＡＩＶならびに、同 様な分子量を示す他の蛋白（複数）も含んでいる。この精製過程を通ったＰＩＦ に続いてみられるａｐｏＡＩＶは、ｐｒｐに対する安定性をもたらすこと、さら に。

ＰＩＰはａｐｏＡＩＶ複合物として９本来の場所にみられるであろうことが信じ られている。下記のようにａｐｏＡＩＶから一旦分雌されると、ＰＩＦは比較的 不安定になりやすい。従って、この複合物の形で、薬学的組成のＰＩＦを調製す ることが得策であると考えられる。

ＰＩＦ活性と４０ｋｄ蛋白との関連性は、コンカナバリン−Ａセファロース処置 による結果の活性分画に対して分析的ＲＰ−１（ＰＬＯを実施することによって 、さらにｆ！認された。このＲＰ−）ＩＰＬＣにより分離がなされ、そこでは多 数の蛋白（溶出ピークを含む）のうちひとつのみに活性が存在する。この活性ピ ークは。

５Ｏ３−ＰＡＧＥにかけた場合、単一４０ｋｄ結合をもたらした。

さらに、下記に述べる様に、この４０ｋｄ結合は、ウサギに注射した場合、　Ｐ Ａ２抑制活性を結合するために、さらに、ホスホリパーゼＡとの複合物を生成で きる蛋白を結合するために。

免疫反応が可能な多クローン性抗血清をひきおこした。従って、この免疫抗原も ａｐｏＡｉＶを含有しているが、誘発された抗体は、ＰＩＦとの反応を示す。

しかしながら、第２図に示した様に、上述の陰イオン交換クロマトグラフィーか らの活性溶出液をｐＨ５，５のクエン酸ナトリウム緩衝液を用いる等電性の沈澱 反応に供することによって、付随した蛋白からヒトＰＩＰを単離することも可能 である。この緩衝剤に対して活性分画を透析することによって。

ａｐｏＡＩＶを含む非−ＰＩＦ不純物の沈澱という結果をもたらす。

この上澄液は、ヒトＰＩＦを含んでおり、これは、上述の様に。

電気泳動によって、純粋な４０ｋｄ結合として取り出される。

Ｃ０宜且比並よ乏投与 本発明のＰＩＰ蛋白はｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、ホスホリパーゼ抑制因子とし ての活性を示すが、細胞培養においてＰＧＥｚの生成を抑制することができ、い くつかのｉｎ　ｖｉｖｏモデルにおいて。

有効な抗炎症作用を示すものである。従って９本発明の蛋白は、ヒトならびに家 畜における望ましくない炎症徴候を改善。

治療もしくは減少させるのに有用である。本発明の蛋白は。

次の点において有用である。すなわち、感染や創傷のような外部の刺激に反応し て生成された過剰の炎症反応を調整する点、さらに、慢性関節リウマチ、喘息、 浮腫、皮膚炎、関節炎、結膜炎、アレルギーならびにエリテマトーデスのような 炎症性疾患を治療する点の両方である。

本発明の蛋白の投与は、一般的に０．１−１００μｇ／ｋｇの用量範囲であり、 宿主の体重あたり０．１−１０μｇ／ｋｇがより望ましい。言うまでもな（、投 与量は、対象症例の性質、治療すべき症状の重篤度および投与の方法に依存する 。例えば、静脈内注射は一般的に他の選択可能な経路より少量で済む。所望の効 果が得られるまで、数回にわたってＰＩＦ蛋白を、−回投与、もしくは、長期に わたって一定の注入により投与する。

この蛋白は、望まれる投与方法に依存して、水溶液もしくは、製剤的賦形剤の存 在下で投与され得る。蛋白製剤については、望ましくは、皮下、静脈内、もしく は筋肉的注射のような注射によって、または膜を通過する非経口投与により投与 される。エロゾルもしくは経口投与も、安定化成分の存在下で可能である。ａｐ ｏＡＩＶとの複合体は、注射用の製剤と同様に、これらの成分中のＰＩＦに対し 安定しているものである。

注入可能物質は、注射の前の再形成に適している。液体。

もしくは懸濁液、固体としてもしくは、ＰＩＦまたはそのａｐｏＡＩＶ複合体の 乳濁液として調製される。適切な賦形剤としては１例えば、水１食塩水、デキス トロース他があげられる。緩衝剤、乳化剤他の様な少量の補助物質も含まれ得る 。

坐剤投与にはポリアルキレングリコールおよびトリグリセライドのような結合剤 や担体が付加的に用いられ得る。エロゾル投与は、気管支疾患の緩解に特に適し ており、それには−Ｃ的にＰＩＦ蛋白もしくはその複合体（界面活性剤およびプ ロペラントと共に微細に分離された形で）を利用する。代表的な界面活性剤は、 脂肪酸エステルを含む。代表的なプロペラントは、フレオンの様な、低アルカン もしくはフッ化アルカンである。ローション剤もしくは軟膏剤のような局所的投 与も実用的であり２局所的治療の場合に好まれる。

ｐｒｐおよびａｐｏＡＩＶの両方を含有する４０ｋｄ　５ＤＳ−ＰＡＧＥ溶出液 と９本発明の精製蛋白は双方共１診断や治療のモニターに有用な免疫検定のため の抗血清もしくは単クローン抗体を調製するために有用である。免疫検定の方法 は、当該分野において良く理解されており、多くの変更が可能である。拮抗的な 抗原もしくは抗体のどちらかは、放射性物質、蛍光物質もしくは酵素を用いて標 識化できる。この検定は、抗原−抗体複合体の直接的検出として、免疫複合のた めの拮抗検定として。

もしくは、複合体が、追加抗体によってさらに免疫活性化されるサンドインチ検 定として実施され得る。この検定では。

標準の方法を用いる。本発明の貢献は、適切な抗原の提供であると言える。すな わちこのような検定の実施のための標準。

もしくは拮抗的抗原として、および、適切な抗血清の調製のための物質をひき出 す抗体としての直接的使用のための抗原である。

（以下余白） Ｄ、１星± 以下に、　ｈＰＩＰの精製のための例証となる方法を記述する。

これに限定するつもりはない。活性かつ純粋な蛋白質を得るためには、付加的な 修正が明らかに必要だからである。しかしながら、この特別な方法によれば、実 ＩＩ、　ｈＰＩＰ活性を有する４０ｋｄ蛋白が均質に（ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対す る）調製され、かつ結合蛋白から遊離したヒ）　ＰＩＦが調製される。

Ｄ、１　秀　？からのｈＰＩＰの′　制ヒトＰＩＦを、精製についての検査を行 うために、ホスホリパーゼ（ＰＡ２）抑制検定を用いて透析液から単離した。約 ２２のヒト腹腔洗浄液（これは、連続的に外来腹腔透析を受けている患者から得 た）を、粗い薄地の綿布を通して濾過することによって清澄にした後、硫酸アン モニウム分画にかけた。

４０％の飽和液を得るのに十分な固体硫酸アンモニウムを供給し、得られた沈澱 物を２０分間、　１０，０００Ｘｇで遠心分離にかけて、上澄液を回収した。十 分な量の固体硫酸アンモニウムを。

６０％の飽和液を得るためにこの上澄液に添加し、さらに遠心分離を繰り返した 。この沈澱物（これは、ＰＡ２抑制活性を含んでいた）を＋　２０ｍＭの重炭酸 アンモニウム、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を 含有するｐＨ７，８の緩衝剤（緩衝剤Ａ）およびアプロチニンに５０μｇ／ｄで 溶解した。この再構成した溶液を、全塩濃度を低下させるために。

４°Ｃにおいて緩衝剤Ａに対して透析を実施し、インビトロ中におけるＰＡ２抑 制検定（下記）において活性であることが示された。

５０■の蛋白を含有するこの透析物の一部は、緩衝剤Ａにおいてあらかじめ平衡 状態にした２、５ｃｍ　Ｘ　１２ｃｍのＡｆｆｉ−ゲルブルー（ＢｉｏＲａｄ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）カ ラムに適用した。０．３ｄ／分の流速で、２ｍｌの分画を集めた。二〇カラムは 、Ｏ〜０．５Ｍ　ＮａＣ１の濃度勾配のＮａＣ］を用いて溶出させた。この分画 について、ＰＡ２抑制活性に関する検定を実施し、全活性は、第３ａ図に示すよ うに、容積による流量で示された。（第３ａ−３ｃ図において、実線はＰＩＦ活 性を指示している）。

この活性分画をプールし、凍結乾燥させた後、再構成し。

緩衝剤Ａ中で、あらかじめ平衡状態にした２、５ｃｍＸ１２ｃ＋ｎのコンカナバ リン−Ａセファロースカラムに適用した。流速０．２成／分で溶出したところ、 第３ｂ図に示される溶出プロフィールが得られた。再度、全活性は、インビトロ 中のＰＡ２抑制検定によって検定したように、容積による流量で見出された。

この活性分画をプールし、凍結乾燥した。活性分画プールの少量部分をＲＰ−Ｈ ＰＬ’Ｃ分析のために取っておいた。

次いで、この凍結乾燥した分画を緩衝剤Ａ中に再構成し。

緩衝剤Ａ中であらかじめ平衡状態にしたＤＥＡＥ−５２の２．５ｃｍＸ１２ｃｍ カラムに適用した。さらにＯ−０，２Ｍの直線的なＮａＣ］勾配を用いて溶出を 実施した。第３Ｃ図は、この溶出のプロフィール、および約０．１２５Ｍ　Ｎａ Ｃ１において溶出した分画中の活性の存在を示す。

この活性ＤＥＡＥ溶出物の分画をプールし、濃縮し、脱塩した後、約１０■の蛋 白を、電気泳動分離のための３ｍｍ１２．５％ポリアクリルアミドゲルに負荷し た。この電気泳動分離は、ジスルフィド結合が１分画前に、β−メルカプトエタ ノールで還元されないこと以外は、　Ｌａｅｍｌｉ　（前出）の方法に従う。蛋 白のバンドについては、５０％トリクロロ酢酸における０、１％クマシーブルー を用いた３分間の染色過程、およびそれに続く５％の酢酸溶液中における５分間 の脱染色によって検出された。結果として、２つの主な蛋白のバンドのみが得ら れた。

１つは、　１８ＫＤにおけるバンドであり、もう１つは４０ＫＤにおけるバンド である。これらのバンドをゲルより切り離し、９ｎｒｍ”の立方体へ切りきざみ 、この蛋白を４°Ｃにおいて一昼夜、緩衝剤Ａで溶出した。

この溶出物を処理してグリシン、ＳＤＳおよび染料を数段階で除去した。第一に 、この溶出物を２４時間にわたって緩衝剤Ａに対して透析し９次いでこの透析物 を凍結乾燥によって濃縮した。この凍結乾燥した物質を緩衝剤Ａ中において再構 成し、２容量の水飽和ブタノールを用いて３回抽出を行った。

界面を含んだ水層を窒素下で乾燥して、残りのブタノールを除去した。次いで、 蛋白のレフオールディングを完成させるために、少なくとも２４時間にわたって 、１■蛋白／　ｍｆｌの状態で、４°Ｃにおいて放置した。インビトロ検定にお けるＰＡ２抑制に関する検定では、この４０ＫＤバンドは、活性を示したが。

この１８ＫＯバンドは、活性を示さなかった。

（以下余白） 第４図は、最初の抽出物、精製の各段階における調製物。

および精製した蛋白について実施した５ＤＳ−ＰＡＧＥの比較結果を示す。この バンドは、２回の連続した酸化操作ならびに染色操作（製造者の指令に従って） による銀染色（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｓ＋Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を用いて 展開された。１列は分子量マーカーを含む。２列は硫酸アンモニウム処置前の透 析液である。３列は４０−６０％硫酸アンモニウム沈澱物。４列は、　Ａｆｆｉ −ゲルブルークロマトグラフィーからのプールした活性分画を含む。

５列は、コンカナバリン−Ａセファロースクロマｉ・グラフィーからのプールし た活性分画を含む。７列および８列は、予備的なゲル電気泳動から得られたそれ ぞれ１μｇおよび５０μｇの４０ｋＤバンドを含む。この全操作により、第５図 に例示された結果にみられるように約５００倍の精製が得られる。５０％抑制に 必要なμｇ蛋白の比較を用いれば、この粗抽出物の特異的活性は、精製された４ ０ｋＤバンドの活性の約０．２％となる。

上述したコンカナバリン−Ａセファロース処理から得られる活性分画の一部分を ０８カラムを用いてＲＰ−ＨＰＬＣに供し。

０．１％のトリフルオロ！￥酸中のアセトニトリルの勾配を用いて溶出した。第 ６図は、このカラムの溶出プロフィールを示す。多数の蛋白分画が得られ、ただ ひとつの分画のみが活性を含有している。次いで、この活性分画を１２．５％ゲ ルを用いて分析的５ＯＳ−ＰＡＧＥに供し、この展開したゲルをクマシーブルー Ｇ−２５０もしくは銀試薬を用いて染色した。各場合において、　４０ｋｄバン ドのみが観察された。

純粋なヒ）　ＰＩＦを得るために、このプールした活性溶出物（陰イオン交換レ ジンからの）を、　ｐｎ　５．５のクエン酸ナトリウム緩衝液に対して透析した 。沈澱した蛋白を遠心分離によって取り除き、この上澄液中蛋白を５ＤＳ−ＰＡ ＧＥに供した。次いで、上述のように、この４０ｋｄバンドを回収した。必要に 応じて、この上澄液をｐＨ７，５とし、　Ｐａｒｅｎｔｅ＋　Ｌ、、　ｅｔ　ａ ｌ、　ＬｉｆｅΣリー（１９８５）皿：　１２２５−１２３１に記述されている ようにＰＬＡ２−セファロースのカラムを通過させ得る。このカラムを１５０ｍ ＭのＮａＣ１を用いて洗浄した後、この結合したｈＰＩＰを、　１．ＯＭ　Ｎａ Ｃ１もしくは０．１Ｍ酢酸のいずれかを用いて純粋な形で溶出させる。

Ｄ、２．坑ニヱ胆」【Ｋｑ則−堅 この上記４０ｋｄバンドは、続いて、　ｈＰＩＰおよびアポリボ蛋白ＡＩＶ　（ ａｐｏＡＩＶ）を含む蛋白混合物であることが示された。（下記にさらに詳しく 述べる）。しかしながら、この混合物は。

ｈＰＩＰと特異的に反応する抗体を増加させることが可能であった。抗−ｈＰＴ Ｐを得るために、ニューイングランド白ウサギに。

完全フロインドアジュバントに含まれている熔出４０ｋｄバンド分画の２００μ ｇを、皮下もしくは筋肉内に注射した。次いで３週間の間隔で同じワクチンをこ のウサギに接種した。次いで、この接種後７−１０日間に、このウサギの耳の静 脈から採血し、得られた血清について、対照として非−免疫血清を用いて、その ４０ｋｄ溶出物（前述）を結合する能力を試験した。

この結合検定について、　４０ｋｄ蛋白を含む精製ｈＰＩＰの５００ｎｇを、ポ リスチレンプレートの個々の穴に固定し、様々な稀釈度の抗血清をこの穴に加え た。特異的に結合した抗体の量については　１＋ｚｓ−標識化蛋白（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ、　Ｉｎｃ、）を用いて定量した。下記の表１に示されているように、１ ：４００の血清稀釈は、著しい量の抗体を示している。

表１ 抗血清稀釈　ｃｐｍ結合ＩｇＧ 免段血遺　非免皮嵐涜 １　：　１０　１２，５２５　１．２１３１　：　５０　１Ｌ４８２　８６２ １　：　１００　６，７４５　９４３ １　：２００　３．２５１　７８２ １　：　４００　２．８５２　８４に れらの結果から、　４０ｋｄ蛋白を含む遊離ｈｐｒｐ、精製ｈＰＩＰをを用いた 競合した置換によって確認された。この１：１００の血清稀釈は、精製された４ ０ｋｄ蛋白の量を変化させるのと同時に、被覆されたポリスチレンプレートに適 用した。この量の変化については、その結果を表２に示す。

表２ 、−４０ｋｄ”ｅ　ｃ　ｍ　”’　Ｉ　Ｇｏ　１３．５２８ ０．０１０　１２．０１４ ０．１０　７，８４６ １．０　２．００５ １０．０　１，０６２ このウェスタンプロットによる精製の過程を示すために。

さらに、この抗血清の免疫反応性を用いた。この抗血清に対して試験すべき標本 を、２ＸＳＤＳを用いて１：１に稀釈した。

標本緩衝液（Ｌａｅｍ１ｉ＋前出）および１０−２５μｇの蛋白を、１．５ｍｍ の厚い５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分画した（１２．５％アクリルアミ ド）。この分画された蛋白を、ニトロセルロースシート上へ電気移送した。非特 異的部位をブロックするために、５％ＢＳＡ、５％オバルブミンおよび５％無脂 肪乾燥牛乳を含有する溶液を用いて、免疫反応性４０ｋｄ蛋白は、抗−ｈＰＩＰ 抗体および＋ｚｓＩ−蛋白Ａと共に検出される。対照は。

非免疫ウサギ血清と並行して走らせた。

第７図は、第４図に示された同じ分画（様々な精製段階で得られた）について実 施したウェスタンプロットの結果を示す。１列は、　４３ｋｄ”ＳＩ−オバルブ ミン、２列は透析液、３−５列は、それぞれ、　Ａｆｆｉ−ゲルブルー、　Ｃｏ ｎ−ＡセファロースおよびＤＥＡＥカラムからの活性分画であり、６列は、　５ ＤＳ−ＰＡＧＥ調製後に得られた物質である。この４０ｋｄバンドは、精製を通 して特異的に検出される。

この抗血清のｈｐｒｐと特異的に反応する能力は、　４０ｋｄ混合物と反応して 増加されるが、第８図に示されているように、ホスホリパーゼＡ２（ＰＡ２）と 特異的に結合する蛋白（ＰＩＦ）を検出する能力によって示される。ＰＡ２　（ １５０ｐｍｏｌ）を、ポリスチレン穴に固定し、過剰の部位をヒト血清アルブミ ンを用いてふさいだ。次いで、増量した４０ｋｄ蛋白を、　１５００ｐｍｏ＋の 遊離ＰＡ２の有無にかかわらず添加し、２２°Ｃにおいて３０分間結合を維持し た。洗浄後、抗−１’ＩＰ抗体および＋２５１−蛋白−Ａを用いて、この結合し たＰＩＦを検出した。ＩＳＡだけを含有する穴もネガティブな対照として含めた 。

第８図の結果は、　４０ｋｄ混合物を含むＰＩＰを添加する量を増加した場合、 穴に対する抗体結合も増加することを示している。しかし、　１５００ｐｍｏｌ 　ＰＡ２を４０ｋｄ混合物を含むＰＩＦとあらがしめインキュベートした場合、 この結合は、　ＩＳＡで被覆した穴の非特異的結合レベルに減少され得る。それ ゆえ、この抗体は、それ自体がＰＡ２に結合する蛋白に結合する。このことは、 　ＰＩＦの特質であるが、この４０ｋｄ混合物の他の成分の特質ではない。

また、１：１００の稀釈率において、ｌｏμｇの４０ｋｄ混合物との抗血清のブ レインキュベーションは、　ＰＡ２を固定する蛋白結合を検出する能力を中和さ せた。

Ｄ、３．　ｃＤＮＡ生　のためのｍＲＮＡ　給２の６１精製４０ｋｄ蛋白に対し て増加した多クローン性抗血清を、　ｃＤＮＡライブラリーを得るために有益な ｍＲＮＡのための供給源を確認するため、　ｈＰＩＰの生成のための種々のヒト 細胞供給源を評価するべく用いた。適当なスクリーニング操作において、５ＯＳ −ポリアクリルアミドゲルにおける分画後に、溶解した細胞蛋白について、　ｈ ｐｒｐ免疫反応に関し検定した。

スクリーニングについて考えられるものに、単核−マクロファージ細胞系Ｕ９３ ７およびＨＬ６０のような培養されたヒト炎症細胞；多形核細胞（ＰＭＮ）のよ うな単離されたヒト血液細胞だけでなく２０％までのマクロファージを含むこと が知られている肺組織などが包含される。この細胞を、デキサメサゾン（０，１ ｔＩＭ　）の有無にかかわらず適切な培地（血清を含むもしくは含まない）にお いて−昼夜インキュベートした。細胞上澄液もしくは、この細胞自体について、 抗−ｈｐｒｐとの蛋白免疫反応性に関し検定した。

細胞溶解産物のために、細胞を洗浄して、血清蛋白を取り除き、４°Ｃにおイブ 、５　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　０．１％ＮＰ−４０，０，１ｍＭＰＭＳＦ　。

５０μｇ／ｍｌｌアプロチニンを含有するリン酸塩緩衝食塩水を添加することに よって溶解した。培養皿に付着した細胞については、直接皿上で溶解させ、一方 、懸濁細胞については、遠心分離によって収集し、上記の緩衝剤に再懸濁させた 。３−５分後、この溶解産物をこの培養皿から集め、遠心分離（１０００×ｇ、 ５分）によって核を取り除いた。

抗血清に対してテストされるべき標本（上澄液もしくは溶解産物）を、２ＸＳＤ Ｓを用いて１：１へ稀釈した。標本緩衝剤（Ｌａｅｍｍｌｉ、　１１．に、、前 出）および５０−１００　ｕ　ｇの蛋白を、１．５鵬の厚い５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル（１２，５％アクリルアミド）上で分画した。このゲルは、この抗 体の非特異的結合のための対照として、精製された４０ｋｄ蛋白５０μｇとブレ インキュベートした抗−ｈＰＩＰ抗血清の使用を加えることによって。

展開された。ニトロセルロースを、Ｘ−線フィルムにさらした後、様々な細胞タ イプにおけるｈＰｒＰ免疫反応性は、オートラジオグラムの濃度走査によって定 量できる。

ある細胞タイプにおいて、　ｈＰＴＰは、培養媒体へ分泌される。

このような培養媒体からの部分的に精製されたｈＰＩＰについて。

上記のような検定を行う。（数例において、調整された媒体について、硫酸アン モニウム分画、　Ａｆｆｉ−ゲルブルークロマトグラフィーおよびＣｏｎ−Ａセ ファロースのクロマトグラフィーと供し得る。Ｃｏｎ−Ａセファロースカラムに 結合しない分画は、凍結乾燥され、上述のウェスタンゲルに対するｈＰＩＰ免疫 反応性について分析される）。

第９図は、　Ｕ９３７細胞によって４８時間調整された血清含有培地および血清 を含有しない培地の両方から得られた結果を示す。

このｐｒｐ蛋白は、血清を含まない培養細胞からの培地において、　３７ｋｄ結 合として現れる。〜４０，０００ダルトンにおける免疫反応性バンドはほとんど がａｐｏＡＩＶである。この結合は。

血清中、および血清含有Ｕ９３７で調整された培地に存在するが。

血清を含まないＵ９３７調整培地には存在しないからである。同様に、〜６８， ０００ダルトンにおいてみられる免疫反応性バンドは、血清中に含まれているア ルブミンを表している。この５０．０００ダルトンのバンドは、ＩｇＧ重鎖であ り血清含有培地においてのみみられる。また、これは、非免疫抗血清を用いた場 合にも検出される。このＩｇＧ重鎮は、このウェスタンを調べるために用いられ る抗体とは無関係の１２５１−蛋白Ａと結合し得る。

これらの結果は、培養されたマウスの線維肉腫細胞におけるＰＧＥ２生成の抑制 によって示されるように（下記を参照）。

ＰＡ２抑制活性について、血清を含まないＵ９３７調整培地由来の同じ標本を検 定することによって確認された。従って、　Ｕ９３７細胞は、ひき続いた抗体ス クリーニングのためのｃＤＮＡ発現ライブラリーを調製するために選択された。

Ｄ−４−Ｍ　された　からのｃＤＮＡ−イブラリ−のｈｐｒｐ弛Ｎ」ｕ℃囚肚製 ｃＤＮＡライブラリーは、最初はＵ９３７細胞から調製された。しかし、　ＰＭ Ｎおよび肺細胞の調製物も用いられた。

全細胞ＲＮＡは、標準方法によって２選択細胞から調製された（Ｃｈｉｒｇｗｉ ｎ、　Ｊ、Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９７９）　１ ８　：　５２９４−５２９９　）。ポリＡ″ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロース カラムを通るこのＲＮＡの２つの連続経路によって単離された。

ｈＰＩＰをコード化するｃＤＮＡクローンを得る最大限の可能性を提供するため に、２つの分離したｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーが構成され得る。そのうちのひ とつは、無作為のブリマーＣＰ、Ｌ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用し、 もう１つは、オリゴ−ｄＴプリマーを使用した。両方の場合において、最初の鎖 の合成は、この適当なブリマーとともに１５μｇのポリＡ’　ＲＮＡを使用し、 標準反応状態を用いた逆のトランスクリブターゼ（Ａｖｉａｎ　Ｍｙｅｌｏｂｌ ａｓｔｏｓｉｓν１ｒｕｓ）により合成した。

各ｃＤＮＡ調製物の第２鎖は、このＲＮＡをＤＮＡ−ＲＮＡ　ハイブリッドから 加水分解するためにＲＮＡ５ｅ　Ｈ（Ｇｕｂｂｅｒ、　Ｕ、、　ｅｔ　ａｌ。

釦匣（１９８３）益：　２６３−２６９）を用いて合成され、続いて、得られた 単一鎖領域を満たずためにＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｉｙ断片）を用いて 合成された。それゆえ、二重鎖で平滑末端のｃＤＮＡｓが生成する。内部のＥｃ ｏＲＩ限定部位については、製造者の指示に従って、ＥｃｏＲＩメチラーゼ（Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてメチル化することによって保 護される。さらにＥｃｏＲ１部位（Ｐ、Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含 む合成オリゴヌクレオチド連鎖については、その後、Ｔ、リガーゼを用いて、平 滑末端ＣＤＮＡ！。

へ結紮する。重合体連鎖は、その後のＥｃｏＲＩによる消化によって単量体へ還 元され、その断片は、低融点アガロース（１，５％アガロース）を通した電気泳 動によって特異的な大きさに分類するべくスクリーニングされ得る。さらに必要 であれば取り出すこともできる。

得られた二重鎖ｃＤＮＡは、バタテリオファージの独特なＥｃｏＲ１部位（’ｆ ｏｕｎｇ、　Ｒ−Δ、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、、　５ｃｉｅμ四−（１９ ８３）　２２２　ニア７８−７８２によって示されているような発現ベクターλ ｇｔｌｌ）へ結紮する。このベクターにおけるＥｃｏＲ１部位が、β−ガラクト シダーゼ遺伝子のアミノ部位１０１５における正しい読み枠に存在するため、Ｅ ｃｏＲ１部位に関して、読み枠および配位も正しいｃＤＮＡは、イソプロピルチ オガラクトシド（ＩＰＴＧ）の誘Ｓ導によって、β−ガラクトシダーゼとの融合 蛋白として表され得る。この発生率（無作為）は６口中１回である。（２配位× ３読み枠）。このように誘導されたファージプラークによって表される蛋白につ いても、この４０ｋｄ蛋白を用いて調製したｈＰＩＰに対して、多クローン性抗 血清を用いて評価を行った。

この（ＤＮＡｓの結紮後、この組換えＤＮＡを、市販のバッキング抽出物（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ、　Ｉｎｃ、）を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてパッケージし１ 組換えファージについては、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、、　ｅｔａｌ、（前出） によって記述のように、宿主株Ｅ、　ｃｏｌｉ、　Ｃ６００Ｈｆｌに対し力価検 定を行った。約２００．０００の組換えが得られた。

このｃＤＮＡライブラリーについては、　ｈＰＴＰに対して抗体を用いて評価を 行った。約５Ｘ１０５の適切な力価のファージを。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０とインキュベートし、（平板培養）、所望のファー ジ濃度を得るために、　１００１５０ｍｍ板」二で２０時間生長させた（Ｙｏｕ ｎｇ、　Ｒ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ＋前出）。β−ｇａｌ−融合ＰＩＰ蛋白が、溶解 産物中にみられるため、寒天上にニトロセルロースを重ね、板を３７°Ｃにおい て一昼夜インキユベートした。次いで、このニトロセルロースフィルターについ て２組換え融合蛋白の抗体検出を実施する。この抗体検出は、抗体がファージベ クター（λｇｔｌｌ）のみに感染したバクテリアからの溶解産物に前吸収される こと以外は、ウェスタンプロットと実質的に同じである。

より詳細に言えば２　このフィルターは、まず、　ＰＢＳ、　０．１％ＮＰ−４ ０に溶解した５７％の無脂肪乾燥牛乳を用いて非特異的結合をブロックすること により、処理した。このフィルターを。

ＰＢＳ、　０．１％ＮＰ−４０，５％ＢＳＡ、５％オバルブミン中で調製した抗 血清の１　：　１００　ＩＩ釈液を用いて２時間インキュベートを行った後、　 ＰＢＳ、　０．１％ＮＰ−４０中で洗浄した。結合抗体は　＋２Ｊ−蛋白Ａ　（ １０’ｃｐｍ／フィルター）および洗浄フィルターのオートラジオグラフを用い て検出した。

この検出方法を用いて、各プールにおける全プラークがポジティブとなるまで、 連続的なスクリーニングを通してポジティブクローンを精製した。誤ったポジテ ィブについては。

次のように確認した。すなわち、これは、２ＣＩｆｌのニトロセルロースディス クを重ねた１００プラーク／２ＣＩＩＩにおいて９重複を用いてスクリーニング を実施し、さらにこの重複ニトロセルロースディスクを、　４０ｋｄ蛋白を含む １０ｕｇのｈＰＴＰによる前処置を受けた抗体、もしくは受けなかった抗体とと もにインキュベートすることによって確認した。誤ったポジティブクローンと結 合する抗体は、　ｈＰＩＰによる前処置を受けた抗血清と共に現れるはずである 。

５つの最も強いポジティブクローンから調製されたファージＤＮＡについて、　 ｃＤＮＡ挿入の大きさおよび連鎖−関連性に関する分析を行った。

５つの全ｃＤＮＡ挿入は約２ｏｏｂｐであった。そのうちのひとつ（λＵ−２０ ０で表される）を、　ＰＵ２００にするためにｐＢＲ３２９のＥｃｏＲＩ部位へ サブクローンし、そしてさらに引き続いて分析を行うためにＭ１３ｍｐ９および Ｍ１３ｍｐ８ヘサブクローンした。第１０図に得られたヌクレオチド配列および その起源のアミノ酸配列を示す。生成された融合蛋白の長さから、正しい読み枠 を推定することが可能であった。これらの蛋白は、このβ−ｇａｌより、およそ ７０アミノ酸分長かった。従って、このリンカ−に続いて、挿入した配列は、お そらくこのＰＩＦ蛋白の内部の部分から、　２００ｂｐの開放読み枠を維持した 。従って、付加的なｃＤＮＡライフ゛ラリ−を８周べるためにＰＵ２００を用い た。

（以下余白） ｌ・　口白ろなライブラリー−ＰＭＮ ０．１５Ｍ　ＮａＣ１中の６％デキストランを通して、血液を沈澱させることに よってヒト白血球を調製した。この上澄液中の白血球細胞を遠心分離によって集 め、ＰＢＳ中で洗浄し、ＲＮＡ単離のために用いた。λｇｔｌＯにおけるｃＤＮ Ａライブラリーは、クローン化ベクターとしてλｇｔｌｏを用いること以外は、 上記のように調製した。このライブラリーは、このＰＭＮライブラリーを意味す る。λｇｔｌＯライブラリーも上記の如＜、０９３７細胞より調製した。

各ｃＤＮＡライブラリーは、　Ｅ、　ｃｏｌｉ、　Ｃ６００Ｈｆｌ上で約１０ｂ フアージを生長させることにより、さらに、ニトロセルロースフィルターへプラ ーク溶解産物を移送することによって、スクリーニングのために８周製した。こ のフィルターについてＢｅｎｔｏｎ。

Ｗ、Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９７７）　１９６　：　１８ ０−１８２に記述のように交雑を実施した。探針については、　Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａＬＣｌｏｎｉｎ　Ｍａｎｕａｌに従ってニックトランス レーションによって。

標識化を行った。次いで、４２°Ｃにおいて１６時間にわたり、１−の交雑緩衝 剤中１０’ｃｐｍ　ＰＬ１２００を用いて、各フィルターを処理した。その後、 このフィルターを、２２°Ｃにおいて５分間。

２　Ｘ５ＳＣ、０，１％ＳＤＳ中で２回洗浄した。さらに、より高い温度（６０ ”Ｃ）において、０．２ｘｓＳＣ、０，１％ＳＤＳ中で洗浄した。次いで、この 交雑されたフィルターを乾燥し、オートラジオグラフィーによってポジティブな シグナルを検出した。

このＵ９３７λｇｔｌｏライブラリーは、数種の交雑ｃＤＮＡを生成した。その うちで最も長いｃＤＮＡは約５００ｂｐであり、λ１１５００で表されている。

λＵ３００のヌクレオチド配列は、ジデオキシ配列によって決定され、それは第 １１図に示されている。第１１図を第１０図と比較することによって、λｔｉ２ ００およびλＵ３００は、各々の５”末端の約５０ｂｐを共有し、その後分岐し ていることがわかる。この分岐は、下記のごとく、イントロンスプライシングの ためであることが後に証明された。

、：、　（７）　／、　ｇｔｌＯＰＭＮ　−７イブラリ−は、その大きさ４００ −６００ｂｐ　（７）４つの交雑ポジティブを生じた。そのうち最も長いｃＤＮ Ａは。

ＰＭＮ６００で表され、ジデオキシ配列であった。推論したアミノ酸配列に沿っ て、　ＰＭＮ６００に対し決定された配列を第１２図に示す。ＰＭＮ６００は、 　５ｏｂｐ区分をλＵ２００およびλＵ３００と共有しているだけでなく、λＵ ３００との相同性は、他の約２００ｂｐにまで及ぶ。次いで、これらの配列も分 岐する。この分岐は、以下のように遺伝子における任意の３゛末端エキソンの存 在によるものであることが示された。

（以下余白） ヒト　のｃＤＮＡライブラリー λｇｔにおけるｃＤＮＡライブラリーは、上述の方法を用いてヒト肺組織から調 製されたものである。２つのライブラリーが得られ、ひとつは胎児の肺組織から のものであり、他は成人肺からのものであった。肺組織は１重量にして約２０％ のマクロファージを含有しており２モルモットの肺からのＰＡ２抑制因子の生成 について報告されている（Ｆｌｏｗｅｒ、　Ｒ，Ｊ、＋　ｅｔ　ａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９）　２７８　：　４５６−４５９　）。

胎児の肺ライブラリーについては、　５’−ＧＡＡＧＧＴＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣ ＡＣＧＧ−３″の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて、上述の如（検 索を実施した。この配列は、　ＰＭＮ６００の配列の塩基２３−４２を表してい る（第１２図）。陽性にハイブリダイズするｃＤＮＡは２付加的な上流配列を含 有していた。この配列は実際。

以下に示すゲノムクローンの上流のエキソン上にマツプできた。このｃＤＮ八を 、　ｐＢＲ３２９ヘサブクローン化し、ｐＳＲ−１と名付け、ＰＩＰコードｍＲ ＮＡの大きさを測定するために２次のように用いた。

ヒト肺ポリーへ’ＲＮへについて、ナザンプロットを実施した場合（プローブと してｐＳＲ−１を使用する）、成熟したｍＲＮＡは。

長さにして約１４００塩基であることが証明された。プライマーとしてｐＳＲ− １からの５８６ｂｐ　Ｂａｍ１分画を用いたプライマー伸長分析が、付加的な５ ００塩基が、完全長のｃＤＮＡを得るために必要であることを証明した。

６全　のｈＰＩＰ　ｃＤＮＡ 成人ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーについては２つのプローブを用いてスクリーニ ングを実施した。すなわち、　ｐＢＲ３２９へクローン化したＰＭＮ６００　（ ｐ６００）　、および合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＴＧＡＧＣＴＧＴＧＡＧ ＡＧＧＧＧＣＣＧ−３’　（これはｐＳＲ−１の５゛末端を表している）である 。４つの陽性にハイブリダイズするプラークを精製し、サイズを決め、　１３６ ０もしくは１３４０ｂｐのどちらかを含有することがわかった。これらのｃＤＮ Ａをジデオキシ配列決定用にＭ１３ｍｐ８およびＭ１３ｍｐ９ヘクローン化した 後、そのうちのひとつは、　ｈＰＩＰに対する完全長のコード配列を含有してい ることが証明された。第１３図は、完全なりＮＡ配列およびこのクローンによっ てコード化された推定アミノ酸配列を示したものである。このクローン、　ｐｔ 、ｉニー　１は８約３６．５ｋｄの蛋白を表ず３３１アミノ酸の最初の翻訳産物 に相当するものである。成熟した蛋白は、ロイシンをコードするヌクレオチド１ １２−１１４で始まると信じられている。

ｐＬＥ−１のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける翻訳産物は、製造者の指示に従ってＲＮ Ａポリメラーゼ（ＳＰ　６システム、　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎ。

ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ、　ｌｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）を添加して、ｐＬＥ−１挿入 を転写ベクター５Ｐ−６へサブクローン化することによって、さらにその後網状 赤血球ライゼートシステム（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ −ａｔｏｒｉｅｓ＋　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　ＭＤ）において生成（ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏにおいて）されたｍＲＮＡを翻訳することによって得られた翻訳産物は、予想 した大きさの３６ｋｄを示していた。コード化された３６ｋｄ蛋白と腹腔液に関 連した４０ｋｄ蛋白との間の相違は、グリコジル化のためであると信じられてい る。ｐＬＥ−１の配列は、塩基６２５゜５９５．７０９および８０８で開始する ４つの規範的なグリコジル化部位（八５ｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を有する。こ のことは、　５Ｐ６−ｐＬＥ−１から上述のように転写されたＲＮＡをに二重Ｓ 　１ａｅｖ旦卵母細胞（最初の翻訳産物をグリコジル化できる）へ、注入し、さ らに、卵母細胞の膜分画における成熟４０ｋｄ産物を局在化させることによって 確認した。

Ｄ、５．　ｈＰＩＰをコード化するゲノムクロー４９躾阻ｈＰＩＰをコード化す る完全なりＮＡ配列もヒトゲノムライブラリーより単離した。ｐＵ２００．およ びｐ６００からの塩基１９８−５９０を含有するＮｃｏ　Ｉ断片をプローブとし て用いた。これらには共通の配列をもたない。λＣｈａｒｏｎファージにおける ライブラリーは、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　（前出）　ｐｐ２７０の方法に よって、　５ａｕ３Ａ　Ｉ　−分解ヒトＤＮＡから構築した。スクリーニングの ために、１０６フアージを増殖させ、三重のニトロセルロースフィルターを用い て、上述のようにプラークの釣り上げを実施する。このフィルターを、上記のプ ローブを用いてハイブリダイズさせた後、このフィルターを０，２ＸＳＳＣ、０ ，１％ＳＤＳ中、６０°Ｃの厳しい条件下で洗浄した。二重に陽性であるプラー クを取り出し、溶出させ、第２のスクリーニングを実施するため再びまく。ファ ージがプラーク−精製されるまで、この方法を繰り返す。

ｐＨ２００プローブに対しハイブリダイズするプラーク−精製済ファージ組換体 ２つ、およびＮｃｏ　Ｉ断片に対してハイブリダイズする７つの陽性のものが得 られた。これらのクローンの各々からの精製ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで制限分解し 、その結果の断片をｐＵ２００またはＮｃｏ　Ｉ断片でのブロービング用にニト ロセルロースヘブロソトした。組換え型ファージのひとつ、λ１２−３は９両プ ローブに陽性である断片をもたらした。λ１２−３はエキソンｎ、ｍ、ｒｖおよ びＶを含有していたが、エキソンＩのみが欠けていた。付加的制限酵素マツピン グは、λ１２−３が他のクローンに重なっていることを示していた。エキソンＩ はλＣＭ−１４に含まれているものであり、λＣＭ−１４は断片とハイブリダイ ズしないが、ｐＬ１２００とハイブリダイズするゲノムクローンである。λ１２ −３クローンの制限分析および配列決定、さらに他の陽性クローンを分析するこ とによって。

エキソンＶは、第１４図に示されているように、もうひとつの型ＶＡで供給され ると考えられるということが証明された。エキソンＶＡは、λ１２−３に存在せ ず、λ１２−１にみられるものであり、λ１２−１はＮＣＯＩ断片およびｐＵ５ ００とハイブリダイズするゲノムクローンである。

遺伝子および得られたｃＤＮＡクローンにおける配列を比較することによって、 　５０ｂｐ後における。他のクローンとのｐＵ２００の相違は、イントロンをス プライスさせるのに失敗したためであるということ、また、　ＰＭＮ６００およ びλＵ３００間の相違（これらの２５０ｂｐ相同性の下流）は１代替りならびに ＶＡを含有しており、　ＰＭ’＋６００はエキソンＶを含有している（ｐＬＥ− １のように）。

Ｄ、５．ｉ眉でソフナゴＩＰおよびｈｐｒｐの捕」Ｊしシとｌ： ｈＰＩＰをコード化するｃ　Ｄ　ＮＡクローンは、様々な宿主において組換え型 蛋白を生成するのに通常用いられる（後述のＥ、１゜参照）。しかし、宿主が自 然に生産された蛋白によって経験したのと類似の、その後の翻訳処理が可能であ るため、＠乳類系における発現が好ましい。宿主はまた。イントロンを複写する こともできるため、　ｃＤＮＡもしくはゲノム連鎖が用いられ得る。

ｈＰＩＰをコード化する完全長のｃＤＮＡクローン、ｐＬＥ−１は、ＥｃｏＲＩ 断片として後述の哺乳頻発現ベクターｐＨｓ　１へ挿入される。

（以下余白） 」世ΣＵ射竺　゛　ベク　− プラスミドｐ）Ｉｓ　１は、　ｐ８４）１からの８４０ｂｐのｈＭＴ−Ｉｔ配列 を含有する（Ｍａｒｉｎ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２ ）　２９９　：　２９７−８０２）。

これは、ｂＭＴ−ｎ遺伝子の−７６５における旧ｎｄＩＩ［部位から、塩基＋７ ０におけるＢａｍＨ１割線までにおよぶ。プラスミドｐ８４ＨをＢａｍＨＩを用 いて完全に分解させ、端末のヌクレオチドを取り除くため、エキソヌクレアーゼ Ｂａ１−３１を用いて処理した。そして次に、　）ｌｉｎｄＩｎを用いて分解さ せた。所望の８４０ｂｐ断片をｐｕｃ８へ連結させた（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、、 　ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９　：　２５９−２６８）。

これは、　Ｈｉｎｄ［および旧ｎｃＩ［消化で切り開いたものである。

この連結混合物をＡｍｐｌに対するＥ、　ｃｏｌｉ、へ形質転換させ２ひとつの プラスミド（ｐＨ５１で表される）を単離し、ジデオキシ配列決定法によって配 列決定した。ｐｌ（Ｓ　Ｌは、適当な制限部位を含むポリリンカーの上流に、ｈ ＭＴ−ＩＩ制御配列を含有する。

廿せ１刀こ弓ワ≧シλｌ染 ｈＰＩＰをコード化するＥｃｏＲＩ断片（上記のように調製）をＥｃｏＲＩ消化 ｐｕｓ　１へ連結し、連結混合物はＡｍｐｌに対するＥ、　ｃｏｌｉ、　ＭＣ１ ０６１へ形質転換させた。その後の形質転換物を、制限分析によってスクリーニ ングし、所望のプラスミドを含有する株。

１）ＭＴ−ＰＩＦを、多量のプラスミドＤＮＡを調製するために増殖させた。

ｈＰＩＰ蛋白に対する修飾されたコード配列を有する別の発現ベクターもまた。

ｐＬＥ−２およびｐＬＥ−３と呼ばれる修飾コード配列から調製した。ｐＬＥ− ２には、　ｈＰＩＰ蛋白の２０−末端部分における配列が欠けている。このこと は、その細胞膜への結合のためであると考えられる。ｐＬＥ−２は、第１３図に 示されるρＬＥ−１の配列を有する？１１３ファージについて、ＴＡＣ（チロシ ン残基をコード化する）を置換するために、塩基９５１においてＴＡＡ終止コド ンを配置する位置特異的変異を被らせることによって構成されたものである。オ リゴヌクレオチド５’−ＣＡＣＴＧＣＧＴＴＡＣＴＧＧＡ−３’　をプライマー として使用し、変異させた配列は。

５５”Ｃ３Ｍテトラメチルアンモニウムクロライドによる洗浄下において、プロ ーブとして賦活されたオリゴヌクレオチド５゛−ＧＣＡＧＣＣＣＣＡＣＴＧＣＧ ＴＴＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧ−３’　を使用し１組替えファージプラークを スクリーニングすることによって回復させた。

突然変異は、ジデオキシ配列決定法および二重鎖ＤＮＡへ変換される単−形鎖に より確認された。終止コドンの正確な機能についても、ＥｃｏＲＩ挿入物ＳＰ６ ベクターシステムへのサブクローニング、ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写、そ れに続く網状赤血球溶解産物システムにおける翻訳により確認した。

単離生成物の５ＯＳ−ＰＡＧＥは、　ｈＰＩＰをコード化する完全長の配列から 得られる３６．４ｋｄ蛋白と比較すると、　３４ｋｄの蛋白であることが示され る。ＳＰ６ｍＲＮＡもまた」弧皿旦卵母細胞へ注入された。注入された細胞によ って１８時間にわたり調整された培地は、チモサン刺激マウス腹腔マクロファー ジからの標識化アラキトネートの放出によって検定したところ、ＰＩＦ活性を示 した。　ＳＦ３へクローン化されたＬＥ−１配列からのｍＲＮＡを注入された卵 母細胞によって調整された培地は、この検定において活性を示さない。ＥｃｏＲ Ｉ挿入物は、　ｐＭＴ−ＰＩＰ（−）を得るためにｐＬＥ−！を構築したのと同 様に、Ｉ）Ｒ５−１へ形質転換させた。

連結混合物を、　Ａｍｐ’に対するＥ、　ｃｏｌｔ、　ＨＢＩＯＩへ形質転換さ せ、正しい方向性および配置は、制限分析によって確認した。

ｐＬＢ−３は、上記ｐｔｉ５００中に回復されたＶＡエキソンによってコード化 されたもうひとつの３”−末端配列を含んでいる。ｐＬＥ−３は、ｐＬＥ−１に おける下流の配列を、適切なＰＵ５００からの断片で置換することにより構築さ れた：　ｐＬＥ−１は、ＮｃｏｉおよびＥｃｏＲＩならびに精製された独特の７ １８ｂｐ断片で分解された。

ｐＵ５００は、ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏ　Ｉ　、ならびに精製されたｃＤＮＡ挿 入物の独特の４１９ｂｐ下流部分で分解された。これらの断片の連結により、　 １１３７ｂｐ断片が得られ、この断片は、　ｐＵｃ８のＥｃｏＲ１部位へ挿入さ れ、増殖およびプラスミド精製のためにＥ、　ｃｏｌｉ。

ＨＢＩＯＩ細胞へトランスフェクションされた。挿入物の正しい方向性および配 置を含むプラスミドは、ｐＬＥ−３と表された。

（以下余白） ｐＬＥ−３コ一ド配列は、　ＡｖｒｌｌによるｐＬＥ−３の分解、ブラント末端 化、らにｈＰＩＰコード化断片を得るためのＥｃｏ　Ｒ１による分解、による３ ”未翻訳配列に対するポリアゾニレ−ジョンシグナルの付加により修飾された。

次に独自の１０３７ｂｐ　ｃＤＮＡ挿入物を単離した。ａｐｏＡＩ　ｃＤＮＡ由 来のｐｏｌｙ−Ａ付加部位を、　Ｎａｒｌを用いたプラスミドｐＢＬ１３Ａ１（ Ｓｅｉｌｌｉａｍｅｒ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、ＤＮＡ　（１９８４）　３　： ３０９−３１７）による分解、プラント末端化、さらにＥｃｏ　ＲＴによる分解 、ならびに全ａｐｏＡＩ　３’未翻訳領域を含む独自の６５ｂｐ断片の精製によ り単離した。この６５ｂｐ断片をｈＰＩＰ　ｃＤＮＡ連結し、　Ｅｃｏ　Ｒ１分 解ｐＨ３Ｉと混合し、そしてさらに、連結させｐＭＴ〜ＰＩＰ／Ａを生成させた 。次にこの連結混合物を、Ａｍｐ”に対するＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１へ形質 転換させた。Ａｍｐ抵抗性のコロニーからのプラスミドについて、正確なサイズ の挿入物を得るためにスクリーニングを実施した。

発現ｈＰＩＰの充分な分泌のために、ヒト成長ホルモン、ヒトアロリポ蛋白ＡＩ 、　ヒト肺界面活性物質もしくはヒトレニンから誘導されるようなもうひとつの シグナル配列を採用することが、好都合であり得る。これは、標準的な方法によ り達成される。それは２例えばｃＤＮＡの５゛末端を除去するためにｓｐｈ　１ を用いてｐＬＥ−１，ｐＬＥ−２もしくはｐＬＥ−３を分解し、成熟した蛋白の 損失コドンを配置し、さらに、上流にある適切なシグナル配列を連結する方法で ある。成熟したｈＰＩＰの第一のアミノ酸は、第１３図の塩基１１２におけるロ イシン開始および、塩基１２４における５ｐｈＩで切断であると予想されるため 、　Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔをコード化するオリゴヌクレオチドを用い て最初の４個のアミノ酸を再構築することが必要である。

大の且　え刑によるｈＰＩＰの　Ｊ゛ 中国産ハムスター卵巣（ＣＩ（０）−Ｋｌ細胞をＦ１２培地およびＤＭＥ培地の １＝１混合物および１２％ウシ胎児血清よりを含む培地において成長させた。相 当な細胞が、　ｐＭＴ−ＰＩＰ、　ＰＭＴ−ＰＩＰ　（）ｐＭＴ−ＰＩＦ／Ａも しくはｐＡｃ−ＰＩＰ／ＡおよびｐＳＶ２　：　ＮＥＯと共同断片される（Ｓｏ ｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ　、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ａ　Ｉ　Ｇｅｎｅｔ（ １９８２）上：３２７−３４１）。ｐＳＶ２　：　ＮＥＯは、ネオ−フィシ７１ 似物Ｇ４１８ニ対して抵抗性を示す機能的遺伝子を含有する。形質転換において は。

Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ　、　Ｃｅ１ｌ（１９７９０６：　７７７ −７８５．のプロトコール（ＤＮＡ！二対し４時間暴露した後１５％グリセロー ルを用いた２分間の”′ショック゛を含む〕に従って、　５００ｎｇのｐＳＶ２ −ＮＥＯおよび５μｇのｐｌＩＴ−ｈＰＩＰを、リン酸カルシウム−ＤＮＡ中の 共沈澱した細胞を含む１６馴の皿上に付与した。−日後、この細胞を１■／　ｙ ｒｌ、のＧ４１８へさらし、　Ｇ４１８−抵抗性コロニーを得た。

得られた形質転換物は、またＰＩＦ−コード化プラスミドの安定した遺伝形質を 有する。この形質転換物を低濃度でプレートし、クローン単離物の精製を行なっ た。旧プロモーターの制御下のおいて、ＰＩＦ配列を含む形質転換物については 、検定のためにこれらの単離物の少量を、マルチウェルプレートにおいて生長さ せ、１〇−門の塩化亜鉛を用いて誘導した。ｈｐＩＰ生成物については、培養細 胞中の誘導されたＰＡ２活性の抑制を証明することによって検定した。

ｐｓＶ２　：　ＮＥＯもしくは、　ｐＳＶ２　：　ＮＥＯ／ｐ＋’ＩＴ−ＰＩＦ Ｉ（７）イずれかを用いたトランスフェクションの７２時間後に、細胞はＣ−１ ４アラキドン酸により２時間にわたり標識化された。細胞を洗浄し。

１０％のウシ胎児血清もしくは１０μＭ　ＡＨ＋ｓｔ＋　カルシウムイオノフオ ア（いずれも細胞ＰＡ２の活性化因子）のいずれかを用いて刺激し、そして細胞 膜から放出された標識化゛アラキドン酸を測定した。ｐＳＶ２　：　ＮＥＯのみ で形質転換された細胞は、　ＰＭＴ−ＰＩＰを用いてコトランスフェクションさ れたもの（第１４図参照）より、３０〜９０％を越える量のアラキドン酸の放出 （２０分後）がみられた。ＰＡ２抑制によって示されるように、多量の所望のｈ ｐｒｐを生成するクローン単離物は、直接検定のために取り出される。

ＰＩＦ生成の直接検定のために、これらの細胞を、　１０％のウシ胎児血清が補 足された基本培地において１／１ｏの融合において接種し、８５０ｃｆｆｌの回 転びん内において融合まで生長させた。

次に、この細胞を洗浄し、血清を含まない培地へ、　１０−’Ｈの塩化亜鉛およ び１０−６のデキサメタシンを添加することにより。

２４時間にわたり、　ｈＰＩＰ生成を誘発した。

培地および細胞膜の両方について、ＰＩＦＩＰ活性いての検定を行なった。培地 を取り出し、　Ａｍ１ｃｏｎ　Ｌ！Ｍ−１００１’Ｊｉ外濾過装置により濃縮し た。膜を得るために、細胞を１ｍＨのＥＤＴＡを用いて処理した。そして１１０ ０Ｘで５分間遠心分離を行うことによって採取した。細胞ペレットを、　１０ｍ Ｍ　Ｔｔｒｓ、　ｐＨ８＋　２５０ｍＦショ槻、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ、　１　ｍＭ　ＰＭＳＦを含む２ｍ２溶液中に再懸濁させ、そして 、ガラスホモジナイザーで破壊した後１位相差顕微鏡を用いて、細胞の破壊度に ついて検査した。

１１０００Ｘにおいて５分間遠心分離を行うことによって核を取り除き、」−澄 液ライセードについては、　１００，０００　Ｘ　ｇにおいて１時間遠心分離を 行うことによって可溶部分と、膜分画とに分割した。膜分画は、０．１％のＴｔ 〜ｅｅｎ−２０を用いて抽出り。

不溶物質は、遠心分離によって取り除いた。上澄液ライセードからの膜ペレット は、均質化緩衝剤（さらに１０％のグリセロールを含む）中に再懸濁させた。

次に、培地、細胞ライセード可溶分画２膜、および核抽出物分画について、２つ の異なった検定法を用いてＰ、ＩＰ活性に関する検定を行なった。すなわぢ、　 Ｂｏｎｎｅｙ　Ｒ，Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、（ＢｉｏｃｈｅｍＪ　（１９７９）皿： ４３３−４４０）に記載されている様に、チモサン刺激マウス固有の腹膜マクロ ファージの細胞膜からの標識化アラキドン酸の放出の抑制：および、νａｄａｓ 　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、（Ｌｉｆｅ−５ｃｉ　（１９８５）　３６　：　５７９ −５８３）に記載されている様に、ブタのすい臓ＰＡ−２を用いた１Ｌαｊ−ｔ ｒｏ検定において、旦浅鄭１膜へとり込まれたＣ−１４−標識化オレイン酸の放 出の抑制である。これらの両検定において、膜分画のみが、活性を示している。

得られた他の分画においては、活性はみられなかった。これらの結果を、第１５ 図に示す。ｌｌ：、ｃｏｌｉ検定において、　ｐＦＩｒ−ｐｉｐ−形質転換細胞 からの膜は、　Ｅ、ｃｏｌｊ膜の加水分解を、対照によって示された約５０％か ら約３０％へ減少させた。チモサンー介在マクロファージ検定において、放出は 、対照の８０％のみであ５’　ＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧ ＡＧＴＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣ３’　ＴＣＴＴＡＡＧＴＴＴＡＴＡＡＧ ＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＡＧＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧ ＴＴＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＡ ＣＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧ` ＧＴＡＧＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴ ＴＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＧＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＣs １および１０を除いて、　５００ｐｍｏｌの各オリゴデオギシヌクレオチドを、 ３２Ｐ−γＡＴＰを用いて個々にキナーゼ処理した。これらのオリゴの対２例え ば、１＋２．３＋４．５÷６などを。

９０゛Ｃにおいて２分間各々１６．７ｐｍｏｌｅｓをインキユベートシ、室温ま でゆっくりと冷却することによってアニーリルさせ、そして、フェノール／クロ ロホルム抽出およびエタノール沈澱によって回収した。この対のセットを、　Ｔ ４リガーゼと共に連結し、そして回収した連結ｒｌＮＡをＥｃｏ　ＲＩおよびＰ ｓｔｌを用いて分解させた。得られたＤＮＡ断片を、湿性ゲルオートラジオグラ フィーによって視覚化し、上記所望の二重鎖配列をするために１００ｂｐ断片を 溶出させ、ジデオキシ配列決定法で確認した。この二重鎖には、　ｔｒｐオペロ ンのプロモーターおよびオペレーター領域、およびｔｒｐ誘導ペプチドのりボゾ ーム結合部位が含まれている。

プラスミドｐＫＫ２３３−２（Ａｍａｎｎ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、；　Ｇｅｎｅ 　０９８５）　４０　：１８３−１９０）をＮｄｅｉを用いて完全に分解させ、 プラント末端化し。

連結し、　Ｎｄｅ１部位を欠き、相当するプラスミド、　ｐＫＫ−２３３−２− Ｎ　ｄ　ｅを得た。

ｐＫＫ−２３３−２−Ｎｄｅ　１０ｎｇを、　Ｅｃｏ　Ｒ１およびＰｓｔｌを用 いて完全に分解し、　ＣＩＰで処理し、そして、　５０ｎｇの合成Ｅｃｏ　ＲＩ ／Ｐｓｔｌｔｒｐプロモーター／オペレーター配列（上記）と混合した。

この混合物を７４　ＤＮＡ−リガーゼと連結し、　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１１ ｐｐ−／Ｉ’　ＩａｃＩ９へ形質転換させた。形質転換物について、所望の挿入 物（ｐＴＲＰ−２３３で表される）を含有するプラスミドＤＮＡの存在を調べた 。

ＰＩＦのためのバクテリア　ベクター （以下余白） 本来のシグナル配列を欠＜ｈｐｒｐコード化区分を、５ｐｈＩ（これは、第１３ 図に示されるように、ヌクレオチド１１４において切断する）を用いて分解し、 クレノーによりプラント末端化し、そして、　）ｉｉｎｄＩ［（これは、挿入物 のちょうど３゛のベクタ一部位において切断する）を用いて分解することにより 。

ｐ［、Ｅ−１、ｐＬＥ−２およびｐＬＥ−３から取り除いた。５ｐｈＩ（プラン ト）／ＨｉｎｄＩ［断片を、Ｋｐｎｌ（プラント）／Ｒｉｎｄｌｌ’［分解ｐＴ ＲＰ２３３へ連結し、ｔｒｐプロモーターの制御下においてコード配列を配置し 、　ｐＴＲＰ−ＰＩＰ、　ｐＴＲＰ−ＰＩＰ　（−）およびｐＴＲＰ−ＰＩＰ／ Ａをそれぞれ得た。この連結混合物を、正確な方向性を証明するために、　Ｅ、 　ｃｏｌｉ、　ＨＢＩＯＩへ形質転換させ、これらの形質転換物を。

標準Ｍ９塩＋０．５％カザミノｍ　（Ｄｉｆｃｏ）において、生長させた。

つまり、誘導前の０Ｄ−５５０の値が０．１となるまで、そして２５μｇ／戚Ｉ ＡＡによる処理を行い、生長させた後の００値が１．０となるまで生長させた。

次に、バクテリアを採取し、　Ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓを用いて溶解し、もし くは音波破砕によって溶解した。そしてそのライセードについて、Ｖａｄａｓら （前出）のｉｎ　ｖｉｔｒ。

検定を用いて、ＰＡ２抑制に関する検定を行った。

ｈＰＩＰ蛋白は、非グリコシレート化型で得られ、標準方法を用いて精製が可能 であり、精製の後、ＰＡ２抑制検定を実施する。４０〜６０％の飽和硫酸アンモ ニウムにより生成する沈澱分画と、　２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ　、　ｐｉ（ ８，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ中に再溶解させ。

同じ緩衝剤に平衡化させたＤＥＡＥセファデックスにかける。蛋白を０．１２５ ＭにおいてＮａＣ１勾配で溶出させ、　Ｃ８１（ＰＬＣカラムもしくは他の疎水 性カラムにおいて９均質になるまで精製する。

このカラムにおいては、活性分画が、１％ＴＦＡにおける２０〜１００％アセト ニトリル勾配において、およそ５０％のアセトニトリル時に溶出する。活性分画 中の蛋白の乾燥物を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ。

ｐｉ（８，０に再溶解させ、必要に応じ、　Ｖａｎ　Ｓｃｈｅｒｒｅｎｂｅｒｇ Ｇ、　Ｍ、１ｅｔ　ａｌ、　Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ　血止ｌＪ■ｅ ｍ　（１９８０）　３６１　：　５７Ｌ３５７６の方法に従って、・ブスルフイ ドにまで再酸化する。

Ｄ、６．凹Ω話判斯片 第１７図は、第１３図のｈ　Ｐ　Ｉ　Ｐのアミノ酸配列との比較、すなわち、ず い臓およびＣ，ａｔｒ旦り毒物ホスホリパーゼの既知の配列と、ヌクレオチド４ ９０〜８５２間の比較を示す。この部分の相同性は、亘匹巳システムとの類似性 から、活性のために十分であることが示唆されており、これはまた、酵素および 抑制因子間の相同性も示している。（Ｍａｎｅｈｅｖａ、　１．、　ｅｔ　ａｌ 、　Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ　ハｕｋＬ防ｅｍ　（１９８４）　３４ 支−：　８８５−８９４　）　、　ｈＰＩＰのこの領域（種々の下流の配列を有 する）は、　ｐＬＥ−］、　、　ｐＬＥ−２およびｐＬＥ−３からのＢｓｔＥＩ ｉ　（プラント）／旧ｎｄＩＩＩ断片として得られる。（ＢｓｔＥＩＴは、塩基 ４６５において切断する。）上記のように、その断片は、Ｋｐｎｌ（プラント） 　／ＨｉｎｄＩＩＩ分解ｐＴＲＰ２３３に連結され、　ｐＴＲＰ−ＰＩＰ（Ｆ） 　、　ｐＴＲＰ−ＰＩＦ（Ｆ−）およびｐＴＲＰ−ＰＩＰ　（Ｆ／Ａ）がそれぞ れ得られる。これらのプラスミドは、上述のようにＥ　ｃｏｌｉ中に発現された 。

さらに上記ベクターのいずれをも修飾して所望の均質領域を示す所望の断片のみ をコード化することができる。これは。

ヌクレオチド位８５３〜８５５におけるＣＡＡグルタミンコドンを。

位置特異的変異によって、　ＴＡＡ柊未コドンへ変換することにより達成できる 。

ｐＴＲＰ−ＰＩＰ（Ｆ）を旧ｎｄｌＩ！およびＥｃｏＲＴを用いて分解し、　Ｈ ｉｎｄ　ｍ　／ＥｃｏＲＩ分解Ｍ１３ｍｐ１８ヘクローン化した。単−ｉｉ　Ｄ ！ＪＡを、プライマーとして、　５’−ＧＣＡＴＧＴＴＡＧＣＡＣＡＴＴ−３’ 　を使用し、ＤＮＡポリメラーゼで処理する。そして得られた二重鎖ＤＮＡを完 全な細胞へトランスフェクションさせる。突然変異ファージについて、厳密な条 件下で５’　−ＡＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＡＧＣＡＣＡＴＴＧＡＴＴ−３”を 用いて検査する。そして、精製プラークを用い、正確な構築を確認するために、 配列決定する。回収したＤＮＡは、二重鎖を再形成させ、ＥｃｏＲＩおよび旧ｎ ｄＩｉｌを用いて分解し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ直線化ｐＴＲＰ−Ｐ　Ｉ Ｆ　（Ｆ）へ連絡させる。得られたベクター（ｐＴＲＰ−ＰＩＦ（４６５〜８５ ２）で表される）は２発現のためにＬ朋旦へ形質転換させる。次に、生成した活 性ｐｒｐ断片を精製し。

上述のように還元／酸化させる。

Ｄ、７．アポ八■斤己１およびｈＰＩＰｉｌ≧υ□５Ｏ５−ＰＡＧＥ上の４０ｋ ｄバンドとしてり、１．において得られた蛋白は、　Ｎ−末端がブロックされた 形のｈＰＴＰおよびＮ−末端が配列決定に利用可能なアポＡｌνを含んでいた。

静ρｌ１ｅｃｌ　Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａガス相シークエンサーを用 いて、全分画を配列決定にかけた場合に、アポＡＩＶＮ−末端の存在が確認され た。

約５０μｇの蛋白について、Ｎ−末端配列決定を実施し、　ＰＴ）Ｉアミノ酸を Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｗ、およびＨｏｏｄ＋　ｔ、、Ｅ、ｊ　ｐ（１ ９８３）　９１　：４８６−４９２．によって報告されているように、　１８Ｍ ＣＮカラムを用いて、　Ｂｅｃｋｍａｎ　３３４Ｔ　）ＩＰＬｃで同定した。得 られたＮ−末端配列は次の通りである。

Ｇｌｕ−Ｖａ　１−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｖａ　１．−Ａｌａ−Ｔ ｈｒ−Ｖａ　Ｉ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇ　Ｉｎ −Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａ　１　ａ−Ｌｙｓ−Ｇ　１．　ｕ−Ａ　 ｌａ−Ｖａ　１−Ｇ　ｌ氏| Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　。

４０ｋｄ混合物の小さい２次的配列は次の通りである。

Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ　。

おそらく、この配列は、ブロックされたｈＰＩＰ分子の内部蛋白分解性クリップ から生じたものであり、過剰のジスルフィド結合を含んでいる。この配列は、第 １３図に示されている塩基６６２から始まり、塩基６９３で終わる。

Ｄ、８．４０ｋｄバンド■」引胡究 ホスホリバー菟り皿回ｐ訣一定 ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける標準の抑制検定（ＰＡ　２抑制検定）を１次のように 実施した。

１１００ｎのブタのすい臓ホスホリパーゼＡ　ＩＩ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌＣｏ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）および試験する種々の濃度の蛋白 （１０ｕｇまで）を、　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ８，０および２ｍＭカル シウムイオンを含む５０μ！の緩衝液中に入れた。その溶液を３０°Ｃにて１０ 分間インキュベートした後、前述の緩衝液中、２０μｇのヒト血清アルブミンお よび２μＣｉのα−β−［１１４−Ｃ）−アラキドニルポスファチジルコリンス テアロイル（３Ｈ）　（Ａｍｅｒｓｈａｍ。

Ｉｎｃ、　）を含む１００μ！の溶液（添加直前に、２２°Ｃにおいて超音波破 砕水浴中で、２分間超音波処理された溶液）を添加した。３０°Ｃにおいて１５ 分後、２５μ２のＩＯＮ酢酸を添加することによって、この反応を中止させた。

反応混合液の２５−５０ｕ（！を、クロロホルム、メタノール。

酢酸（９０：１０：１）を含む増加溶媒システムにおいて分析するために、シリ カＧ型几Ｃ板へ塗布した。アラキドン酸バンドの位置付けのため、標準としてア ラキドン酸を用いた。ホスファチジルコリンバンドはもとの位置にとどまる。ス ポットは、ヨウ素蒸気で染色することによって視覚化し、そして。

標準化されたアラキドン酸塩およびホスファチジルコリンスポットを板より削り 取り、トルエン−オムニフルオア（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）に おいてシンチレーション計数を用いて放射能を測定した。加水分解の％は２分画 １００　Ｘ　ｃｐｍアラキドンＩＪ／　（Ｃｐｍアラキドン酸十ｃｐｍホスファ チジルコリン）で算出した。

匹り生城訓ｙ真遣ｊ並一定 ｈＰＩＰは、培養線維肉腫細胞によるＰＧＥ、の生成を抑制することができるこ とも証明された。この検定において、　ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ　１４８） から得たマウスの線維肉腫細胞の融合性培養物を。

１５０ｕｊ２ＨＡＭＭｓ　ＦＩＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で検定すべき様々な濃度 の蛋白および２５μ！リン酸緩衝食塩水と、３７“Ｃにおいて１５分間前培養し た。２％の胎児牛血清を含む１００μｅのＦＩＯ培地を添加し、その細胞を、５ ％ＣＯ□／９５％空気で湿らせた培養器を用いて、３７°Ｃにおいてさらに１時 間培養した。対照として用いるデキサメタシン（ＤＥＸ）を誘導１６時間前に、 細胞に加えた。培地を取り、市販の放射免疫検定キラ）　（Ｓｅｒａｇｅｎ・Ｉ ｎｃ、。

Ｈｏ５ｔｏｎ、　ＭＡ）を用いて、　ＰＧＥ、について検定した。

第１８図は、精製された（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって）　ＰＩＦによる。

またＤＥＸによるＰＧＥ２産生の抑制を示している。ゲルからの１８ＫＤバンド を、対照として用いた（白丸）。黒丸は、　Ｃｏｎ−Ａセファロースカラムから の活性分画を用いた結果である。四角は、　４０ＫＤバンドからの蛋白の結果で あり、三角形は、ＤＥＸを使用した結果である。反応は、活性蛋白およびＤＥＸ に関しては用量依存である。細胞に１００μｇのアラキドン酸を添加（ＰＩＦが 適用されるのと同時に添加）することによって、ＰＩＰおよびＤＥＸの両方によ る抑制を取り消すことができた。

（以下余白） ｂ二買ｖｏ検淀 ＰＩＦの活性を証明するために、３種のｉｎ　ｖｉｖｏモデルを用いた。ラット 胸膜炎モデル、ラット足浮腫モデルおよびアジュバント誘導関節炎である。

ラット胸膜炎モデルにおいて、３群のう・ノドの胸膜腔に。

食塩水中０．５％カラゲーニンの０．１ｍｌを注入することによって炎症を誘発 し、試験物質がこの炎症を制御する能力を調べた。ＰＩＰ蛋白の活性検出のため 、１０ｕｇのＰＩＰをカラゲーニンとともに注入した。２００μｇのＤＥＸを含 むカラゲーニン注入を、陽性の対照として用いた。５時間後、胸膜腔を開け。

１　ｍｌの食塩水で洗浄し、液体容量を記録した。さらに、液体中の蛋白濃度に ついても、　Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（ １９７Ｂ）７２　：　２４−８−２５４．の方法によって測定した。抑制活性は 。

滲出容量および滲出蛋白の減少によって証明された。第１９図に示されているよ うに、１０ｕｇの精製ＰＩＰは、この両パラメーターを抑制するという点で２０ ０μｇ　ＤＥＸと、同じ効果を示した。

左のデータは、滲出した蛋白の量（■／キャビティ）を記録したものである。こ の量は、５０ｕｇ　ＤＥＸもしくは１０ｕｇＰＩＦのどちらかの存在において、 実質的に正常レベルへと減少する。１８出容量の測定結果は、右側に示す（Ｉｎ ｆ）。同様に、５０ｕｇ　ＤＥＸもしくは１０ｕｇ　ｐｒｐのどちらかが、滲出 液体容量を正常レベルへ減少させる。

ラット後足浮腫モデルにおいて、　Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１８ ０−２００ｇ　）の雄群を、エーテル下で軽く麻酔し、０．５％重量／容量のカ ラゲーニン懸濁液０．１ｍｌを、右後足の足底組織へ注射することによって後肢 浮腫を誘発した（Ｖａｎ　Ａｒｎ１ｅｎ。

Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｅｘ　Ｔｈｅｒａ　（１９６５）　１５ ０　：　３２８−３３４゜試験物質の抗炎症活性は９次の３方法のうちひとつを 用いて試験物質を投与することによって調べた。すなわち、静脈内注射、腹腔内 注射もしくはカラゲーニンとの共−注射である。特別な場合を除いて２３時間前 に腹腔内へ投与したデキサメタシンを対照として用いた。結果は、ゼロ時（試験 物質の注射の時間）に開始する一定圧力のカリパスを用いて、その後１時間毎に 後足の厚さを測定することによって評価した。

第２０図は、実験的注射には、　５ＯＳ−ＰＡＧＥより単離したＯ−５μｇの精 製ｈＰＩＰ、対照注射には、２．５μｇのデキサメタシンを、共にカラゲーニン と一緒に投与した場合の足パッドの厚さくｍｍＸ１０２）の増加の結果を示した ものである。ｈＰＩＰは。

用量に依存して、有意に浮腫を減少させた。対照ＤＥＸも炎症を減少させたが、 第２０図に示されているように１時間依存性がＰＩＰとわずかに異なっている。

第２１図は、試験物質の注射を、炎症誘発前３０分に腹腔内へ行った場合の結果 を示したものである。ＤＥＸと同様に、インドメタシンを対照として用いた。こ のデータは、ＰＩＦおよびインドメタシンが１足腫脹を抑制するという点におい て同等に効果的であることを示しているが１両者共、ＤＥＸよりは。

わずかに効果が劣っている。従って、　ｈＰＩＰは循環の中へ入り。

炎症部位に作用することができることを示している。

第２２図は、投与を、カラゲーエン注射２分前に大腿静脈への注射として行った 場合の結果を示したものである。同様に。

ｈＰＩＰは、用量に依存して、■投与後３．４もしくは５時間にわたり、炎症を 抑制するのに効果的であった。さらに、２５μｇのＰＩＦは、３または４時間後 に、２００μｇ　ＤＥＸの効果と同等になった。この結果より、ＰＩＦの生物学 的半減期は、２−３時間であることがわかった。

残りのｉｎ　ｖｉｖｏ検定は、アジュバント誘発関節炎モデルであり、これは、 　Ｃｏ１ｐａｅｒｔ、　Ｆ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ　（１９ ８２）３１６７−７５の方法に従ったものである。誘発後３０日に、動物に。

食塩水、精製ｈＰＩＰもしくはデキサメタシンを筋注により投与した。第２３図 に示されているように、　ｈＰＩＰは後足および関節の腫脹（１０時間までに最 大値に達する）をすばや（減少させることに成功したが、この腫脹は、２８時間 後に、対照レヘルへもどった。ＤＥＸは、３時間後に腫脹の減少をもたらし、２ ８時間の実験期間の間十分にその効果を維持した。

ｕＵ裏汰 細胞の形質転換、ベクター構築、メツセンジャーＲＮＡの抽出、　ｃＤＮＡライ ブラリーの調製などに使用される技法の大部分は当業者に広範に実施されている ものであり、またたいていの当業者はその特別な条件と操作が記載されている標 準的な源材料に精通している。しかし１便宜上２次の節はガイドラインとなるで あろう。

Ｅ、１．狛」ｂ址胴ＭＲ且 原核生物系と真核生物系の両方がＰＩＰコード配列の発現に使用できる。クロー ニング操作には原核生物宿主が最も好都合であることはいうまでもない。原核生 物としてはｐ、ｃｏｌｉの種々の菌株で示されることがほどんどであるが、他の 微生物の菌株も使用できる。宿主と和合可能な種由来の制御配列および複製部位 を含有するプラスミドベクターを使用する。例えば、影工山は典型的には、　Ｂ ｏｌｊｖａｒ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ（１９７７）　２　：９５によるＥ、 ｃｏｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換する 。ｐＢＲ３２２はアンピシリンとテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、従って 、所望ベクターの構築の際に保持されるかまたは破壊されるかのいずれかが可能 な付加的なマーカーを提供する。通常使用する原核生物の制御配列は、ここでは 転写開始用プロモーター、任意にオペレーク−２およびリポソーム結合部位配列 を含むものと定義されるが。

β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）やラクトース（Ｉａｃ）のプロモーター系 （Ｃｈａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａ↓ｕｒｅ（１９７７）ユ９８：１０５６） 。

トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８０）　８　：　４０５７）およびλ 由来のＰ、プロモーターのような普通に用いられるプロモーター、およびＮ−遺 伝子リポソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ 　（１９８１）…２　：１２８）を含んでいる。

細菌の他に、酵母のような真核微生物も宿主として使用できる。サン力ロマイセ ス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の研究室 用菌株であるＢａｋｅｒの酵母が最も繁用されるが、他の多くの菌株も普通入手 可能である。例えばＢｒｏａｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　（１９８ ３）１０１　：３０７の２μ複複製点。

あるいは酵母と和合可能な他の複製起点（例えばＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ。

ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９）　２８２：３９．　Ｔｓｃｈｅｍｐ ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ（１９８０）１０：１５７およびＣ１ａｒｋｅ、 　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ（１９８３）　１０１：３００を参照 せよ）を用いたベクターが使用できる。酵母ベクターに対する対照の配列には解 糖系酵素合成用のプロモーター（ｌｅｓｓ。

ｅｔ　ａｔ、Ｊ　Ａｄｖ　Ｅｎｚ　ｍｅ　Ｒｅ　（１９６Ｂ）　７　：１４９； 　）Ｉｏｌｌａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ。

」且動匹圏旦１（１９７８）　ｘｙ：４９ｏｏ）が含まれる。当業者に既知の他 のプロモーターとしては、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター（Ｈ ｉｔｚｅｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｂｅｍ　（１９８０）２５ ５　：　２０７３）および他の解糖系酵素のプロモーターがある。増殖条件によ り転写が制御されるという付加的な利点を有する他のプロモーターは、アルコー ルデヒドロゲナーゼ２．イソチトクロムＣ１酸ホスフアターゼ、窒素代謝に関連 した分解用酵素、およびマルトースやガラクトース利用を担う酵素のプロモータ ー領域である。またターミネータ−配列はコード配列の３′末端にあることが望 ましいと考えられる。このようなターミネータ−は、酵母由来の遺伝子中のコー ド配列に続＜３′の非翻訳領域に見出される。

また、ポリペプチドをコードする遺伝子はもちろん多細胞生物由来の真核宿主細 胞培養物で発現させることもできる。

例えばＡｘｅｌ等の米国特許第４，３９９．２１６号を参照せよ。これらの系は さらに、イントロンをスプライシングでき、よってゲノム断片の発現に直接使用 できるという利点を有する。有用な宿主細胞系にはＶＥＲＯやＨｅＬａ細胞、そ してチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ）１０）細胞がある。このような細胞に対 する発現ベクターは通常、＠乳動物細胞に和合可能な制御配列およびプロモータ ー、例えば普通用いられるシミアンウィルス４０（ＳＶ４０　）の初期および後 期プロモーター（Ｆｉｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）　２ ７３：１１３）、あるいはポリオーマ、アデノウィルス２゜ウシ乳頭腫ウィルス または鳥肉腫ウィルスに由来するような他のウィルス性プロモーターのようなも のを含む。制御可能なプロモーターｈＭＴ−Ｉｆ　（Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、、　ｅ ｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）２９９　：　７９７−８０２＞　も使 用できる。哺乳動物細胞宿主系形質転換に関する一般的な面はＡｘｅｌ　（前出 ）に記載されている。ここでまた１発現を最適化するには“エンハンサ−”領域 が重要であると考えられる。これは一般的には、非コードＤ　Ｎ　Ａ　９ｉ域中 のプロモーター領域の上流または下流に見出される配列である。必要に応じて、 複製起点をウィルス源から得る。しかし、染色体への組み込みが真核生物におけ るＤＮＡ複製の共通の機構である。

五−ｌ−工厘藍換 用いる宿主細胞に従って、この細胞に適切な標準技法により形質転換を行う。Ｃ ｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳへ） （１９７２）６９：２１１０に記載のような塩化カルシウムによるカルシウム処 理、あるいはＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｆｌｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ−レゆｏｒａ↓ｇｇ　Ｍａｎｕａ！　（１９８２）Ｃｏ１ ．ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ＋　ｐ、２５４に記載のＲｂＣ ＩＺ法を、実質的な細胞壁の障壁を有する原核生物や他の細胞に使用する。この ような細胞壁をもたない哺乳動物細胞については、　Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖ ａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、７　（１９７８）　５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱 法を使用し、これはＷｉｇｌｅｒ、　Ｍ、＋　ｅｔ　ａｌ、Ｃａ旦（１９７９） 　１６　：　７７７−７８５に従い改変してもよい。酵母の形質転換はＶａｎ　 Ｓｏｌｉｎｇｅｎ、　Ｐ−＋　ｅｔ　ａｌ。

Ｊ　Ｂａｃｔ（１９７７）１３０　：９４６あるいはＨｓｉａｏ、　Ｃ，Ｌ、、 　ｅｔ　ａｌ、　ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ（ＩＪＳＡ）　（１９７ ９）　７６　：　３８２９の方法に従って行う。

旦−３，ヘク久二４」１袋 所望のコード配列と制御配列とを有する適切なベクターの構築には、当業者に周 知の標準的な連結技術および制限技術を使用する。単離したプラスミド、ＤＮＡ 配列あるいは合成オリゴヌクレオチドを切断し２手を入れ、そして所望の型に再 連結する。

部位特異的ＤＮＡ切断は、適当な制限酵素を当業者に一般的に理解されている条 件で用いて処理することにより行うが。

この条件の詳細はこれら市販の制限酵素の製造者により特定されている。例えば 、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓの製品カタログを見よ。通常、約 １μｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列を、約２０ｕｌの緩衝溶液中の酵素１単位 で切断する。ここでの実施例では、典型的には、過剰の制限酵素を使用してＤＮ Ａ基質の分解を完全にしている。約３７°Ｃでの約１時間から２時間のインキュ ベート時間で作用可能であるが、変更も許される。各インキュベーションの後、 フェノール／クロロホルム抽出により蛋白を除去し、続いてエーテル抽出を行っ てもよく、その後エタノール沈Ｉ２による水性画分から核酸を回収する。必要に 応じて、切断断片のサイズによる分離を、標準的な技術を使用したポリアクリル アミドゲルまたはアガロースゲルの電気泳動により行なってもよい。サイズによ る分離の一般的な記述はＭｅｔｈｏｄｓユｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　（１９８０） 　６Ｆし４９９−５６０にある。

制限切断断片は、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６）、　５０ｍＭ　ＮａＣ１ ，６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ＋６ｍＭＤＴＴおよび５−１０ｇＭ　ｄＮＴＰ中で、２０ から２５°Ｃにて約１５から２５分のインキュベーション時間で、４種のデオキ シヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）存在下、　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラ ーゼ■の巨大断片（クレノー）を用いて処理することによりプラント末端化する 。クレノー断片は４種のｄＮＴＰが存在しても５′の粘着末端は埋めるが３”の 突出している一本鎖は削り取る。必要に応じ°ζ、粘着末端の性質によって決ま る制限内でｄＮＴＰを１種のみあるいは選択されたｄＮＴＰを供することにより 選択的修復を行うことができる。クレノーでの処理後、混合液をフェノール／ク ロロホルムで抽出し、エタノール沈澱を行う。

適当な条件下での３１ヌクレアーゼまたばＢａｔ−３１による処理により、あら ゆる一本鎖部分がｐｏ水分解される。

合成オリゴヌクレオチドはＥｆｉｍｏｖ、　Ｖ、Ａ、等の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８２）６８７５−６８９４により調製するが、市販 の自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製できる。アニーリング前のあるい は標識するための一本鎖のキナーゼ処理は、過剰の例えば基質１　ｎｍｏｌに対 して約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７ ，６）、　１０ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、５ｍＭジチオスレイトール、１　２ｍＭ　Ａ ＴＰ、１．７μｍｏｌ　Ｔ３２Ｐ−ＡＴＰ　（２，９ｍＣ１／ｍｍｏｌ）＋　０ １１ｍ門スペルミジンおよび０．１ｍＭＥＤＴＡ存在下で使用することにより行 う。

連結は１５−５０μ２容量中で、下記の標準条件および温度で行う：　２０ｎ＋ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ　（ｐ）１７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ＋　１０ｍＭ　 ＤＴＴ、　３３ｇ　ｇ　／ｍｌ　ＢＳＡ、　１０ｍＭ−５Ｏｎ＋Ｍ　ＮａＣ１， そして４０ｇＭ　ＡＴＰ、　０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４　Ｄ ＮＡリガーゼを０°Ｃにて（′°粘着末端”連結用）、あるいは１　＋ｎＭ　Ａ ＴＰ、　０．３−０．６　（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを１４° Ｃにて（“プラント末端゛′連結用）を用いる。

分子間の゛粘着末端“連結は通常Ｉ）ＮＡ総濃度３３−１００μｇ　／　ｍｌ（ 最終総濃度５　１０１００ｎで行う。分子間のプラント末端連結（普通１０−３ ０倍モル過剰のリンカ−を使用する）は最終総濃度１μ門で行う。

“ベクター断片゛を使用したベクターの構築においては。

−ａにベクター断片を細菌アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）あるいはウシ腸 アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理することにより、５′のホスフェー トを除去してベクターの再連結を防ぐ。分解は約１５０ｍＭのＴｒｉｓ中ｐＨ８ にて、　Ｎａ”およびＭｇ”存在下、ベクター１μｇあたり約１単位のＢＡＰあ るいはＣＩＰを用いて、６０°Ｃにて約１時間で行う。核酸断片を回収するため 、この調製液をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱する。あるい は、再連結は、さらなる制限酵素分解で望ましくない断片を二重分解しであるベ クターを使用することにより防げる。

ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡ由来のベクタ一部分で配列の修飾を必要とする部 分については１部位特異的プライマーによる突然変異形成を使用する。これは限 られたミスマツチ以外の突然変異形成予定の一本鎖ファ・−ジＤＮＡに相補的な プライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ、これにより所望の突然変異 が生じる。簡単に言えば２合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてフ ァージの相補鎖を直接合成し。

得られた二本鎖ＤＮＡを用いてファージ支持用の宿主細菌を形質転換する。形質 転換した細菌の培養物を上層寒天にまき。

ファージを保持する単細胞のプラーク形成を可能にする。

理論的には、新しいプラークの５０％が一本鎖として変異型を有するファージを 含み、５０％はもとの配列を有するであろう。得られたプラークをキナーゼ処理 した合成プライマーとハイブリダイズさせる。このときの温度は正確なマツチの ハイブリダイゼーションを可能にするものとするが、この温度ではもとの鎖との ミスマツチはハイブリダイゼーションを防ぐに充分なものである。次にプローブ とハイブリダイズするプラークを拾い、培養し、ＤＮＡを回収する。

Ｅ、４．揚築■篠ル 以下に述べる構築では、プラスミド構築のための正確な連結は、まずＭ、　Ｃａ ５ａｂａｄａｎ博士から入手したＥ、　ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１　（Ｃａｓａｂ ａｄａｎ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８０）　１ ３８　：　１７９−２０７）あるいは他の適当な宿主を連結混合液で形質転換す ることにより確証される。成功した形質転換体をアンピシリン。

テトラサイクリンまたは他の抗生物質の耐性により、あるいは当業者に理解され ているようにプラスミド構築の様式に従い他のマーカーを用いて９選択する。次 に形質転換体のプラスミドをＣｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、　Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、　 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）（１９６９）　６２　：　 １１５９の方法に従って、続いて任意にクロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅ ｌｌ、　Ｄ、　Ｂ、、　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　（１９７２）１１０　：６６ ７）を行って調製する。単離したＤＮＡを制限処理および／もしくはＳａｎｇｅ ｒ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳ Ａ）　（１９７７）　７４　：　５４６３のジブオキ法をさらに月ｅｓｓｉｎｇ 、　ｅｔ　ａｌ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８１）　９　：　３０９により述 べられているよウニ用イタまタハＭａｘａｍ、　ｅｔ　ａｌ、亘幻上旦戯；　ｉ ｎ　Ｅｎムだ四上幻ひ−（１９８０）　６５　：　４９９の方法による配列決定 により分析する。

Ｅ、、　５．　ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーの制ヒトゲノムライブラリー を当業者に既知のようにλファージで構築する。例えばＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ 、ｌ　ｅｔ　ａＬ　Ｃｅｌ＋　（１９７８）１５　：　６８７−７０１を参照せ よ。ｃＤＮＡライブラリーは上述のようにλｇｔｌｌファージ内で調製でき、あ るいは標準技法により単離したｍＲＮＡから合成した二本鎖ｃＤＮＡを調製し、 仔ウシ胸腺ターミナルトランスフェラーゼが媒介するホモポリマー性テーリング （Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、　Ｊ、　Ｇ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ　 （１９７８）　５　：　２７２１−２７３２）によりｐＢＲ３２２のようなプラ スミドベクターへ挿入することができる。第１鎖ｃＤＮＡを、鳥骨髄芽球症ウィ ルスのＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを用いて、５μｇ　ｍＲＮＡ上オリゴ（ｄ Ｔ）１２−１８によりプライム合成する。次に１００°Ｃにて５分間変性させ続 いて氷上で冷却することにより、　ＲＮＡ鋳型を初期ＤＮＡ鎖から離す。第２鎖 ＤＮＡは、　Ｅ、　ｃｏｌｔ　のＤＮＡポリメラーゼＩの巨大断片を用いて、第 １鎖分子の３゛−末端での自己プライミングにより合成し、これにより二本鎖ヘ アピンＤＮＡが形成される。これら分子の開放終結末端をプラント末端化し、ま たヘアピンループをアスペルギラス　オリザエ（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ肛Ｌａ ｅ）のＳ１ヌクレアーゼで切り開く。二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの８１ヌクレア一ゼ 分解は、　３００ｍＭ　ＮａＣ１，３０ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ＋　ｐ）１４．５＋　 ３ｍＭ　ＺｎＣＩｚ中で６００単位の酵素により、　３７’Ｃ，３０分間で行う 。ｃＤＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、酢酸アンモニウム存在下でエ タノール沈澱を３回行って小さなオリゴヌクレオチドを除去する。これは次のよ うにして行う：１７２容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量のエタノー ルをｃＤＮＡ溶液に加え。

これを−７０°Ｃで沈澱させる。プラント末端化した二本ｔＪｋ　ｃ　Ｄ　Ｎ　 Ａを次に、ゲル濾過によりカラム（０，３Ｘ１４Ｃ１１１）セファロース４Ｂ　 （ファルマシアファインケミカルス、ビスカタウェイ、　ＮＪ）を通してサイズ により分画するか、あるいは５−２０％グリセロール勾配中で超遠心分離して勾 配を分画する。所望の長さ例えば３００塩基対よりざっと大きいｃＤＮＡを保有 し、７０％エタノール沈澱により回収する。デオキシシトシンの短い（１〇−３ ０ヌクレオチド）ポリマー性テールをｃＤＮＡの３”末端につける。

このときの反応は０．２Ｍカコジル酸カリウム、　２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ ６，９）　２ｍＭジチオスレイトール、　０．５ｍＭ　ＣｏＣ１ｇ、　２００ｍ Ｍ　ｃＤＴＰ。

４００μｇ／ｄ　ＢＳＡおよび４〇単位の仔ウシ胸腺ターミナルデオキシヌクレ オチドトランスフェラーゼを含む中で２２°Ｃにて５分間行う。反応液をフェノ ール：クロロホルムで抽出し、酢酸アンモニウム存在下でエタノール沈澱を３回 行って小さなオリゴヌクレオチドを除去する。

テールのついたｃＤＮＡをｐＢＲ３２２のような宿主ベクターとアニーリングさ せるが、このベクターは前もって例えばＰｓｔＩで切断しオリゴｄＧのテールを つけておく。１つの実施可能な実施態様では、２．５μｇのｐＢＲ３２２−ｄＧ 　ＤＮＡをベクター濃度５μｇ／雁でｃＤＮＡとアニーリングさせ、そしてこの ハイブリッドをＣａ５ａｂａｄａ＋Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（ １９８０）　１３８　：　１７９−２０７に記載のＣａＣ１□処理によりＥ、　 ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１へ移す。

Ｅ、６．　ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのブロービングｃＤＮＡまたはゲ ノムライブラリーを、必要に応じてコロニーまたはプラークのハイブリダイゼー ション操作を用いて１選別する。コロニーあるいはプラークを二重のニトロセル ロースフィルター紙（Ｓ　Ｋ　ＳタイプＢＡ−８５）上にレプリカし、コロニー を１５ｄｇ／Ｉｎｌテトラサイクリンを含むし寒天上で３７°Ｃにて１４−１６ 時間増殖させる。コロニーを１０％ＳＤＳで溶解し、５００ｍＭ　ＮａＯＨ／１ ．５Ｍ　ＮａＣ１、次に０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ　］（Ｃ１（ｐ）１８．０）／１． ５Ｍ　ＮａＣ１続いて２×標準ク工ン酸生理食塩水（ＳＳＣ）で５分間連続処理 することにより、　ＤＮＡをフィルター上に固定する。フィルターを風乾し、８ ０°Ｃにて２時間焼く。

ニックトランスレーションしたプローブについては、二重フィルターを１フイル ターあたり１０ｄのＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド （厳重性を低下させる場合は４０％ホルムアミド）　、５　Ｘ５ＳＣ，ｐＨ７， ０，５Ｘデンハート溶液（ポリビニルピロリドンにフィコールおよびウシ血清ア ルブミンを加えたもの；１ｘ＝各０．０２％）　、　５０ｍＭリン酸ナトリウム 緩衝液（ｐＨ７，０）、０．２％ＳＯＳ　、　５０ｄｇ／成酵母ｔＲＮＡ　。

および５０ｄｇ／ｄの変性、剪断済サケ精子ＤＮＡ　）で、４２”Ｃにて１６− １８時間プレハイブリダイズさせる。

［、試料をこの同じＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液５ｍβ中に含まれるニ ックトランスレーションしたＤＮＡプローブと。

同種起源の場合は４２゛Ｃにて１２−３６時間、異種起源の場合は３７°Ｃにて ハイブリダイズさせる。同種のハイブリダイゼーションの場合はフィルターを０ ．２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で各回５０°Ｃにて３０分間、２回洗浄し、異 種のハイブリダイゼーションの場合はフィルターを３　ｘｓｓｃ、　ｏ、ｉ％Ｓ ＤＳ中で５０°Ｃにて洗浄する。フィルターを風乾し、−７０°Ｃにて１−３日 間オートラジオグラフィーにかける。

合成（１５−３０マー）オリゴヌクレオチドプローブについては、二重フィルタ ーを１フイルターあたり１０　ｍｌのオリゴハイブリダイゼーション緩衝液（６ Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＯＳ、１ｍＭεＤＴＡ　。

５×デンハート溶液、　０．０５％リン酸ナトリウムおよび５０μｇ／ｍｌの変 性、剪断済サケ精子ＤＮＡ　）で、４２°Ｃにて２−８時間プレハイブリダイズ させる。

試料をキナーゼ処理した１５−３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブ と、オリゴヌクレオチドの組成に応じた条件下でハイブリダイズさせる。典型的 な条件としては、３〇−４２°Ｃの温度、　２４−３６時間、プローブを含有す るこの同じオリゴハイブリダイゼーション緩衝液５成／フイルターを使用する。

フィルターを、各回６　Ｘ５ＳＣ，Ｏ，Ｌ％ＳＯＳおよび５０ｍＭリン酸ナトリ ウム緩衝液（ｐＨ７）で２３°Ｃにて１５分間、２回洗浄し。

次いで６ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで算定したハイブリダイゼーション温度 にて２分間洗浄し、風乾し、−７０°Ｃにて２−３日間オートラジオグラフィー にかける。

所望蛋白のアミノ酸配列あるいはそれをコードするｍ　ＲＮ　Ａ中のヌクレオチ ド配列がわかっている場合は２本発明の宿主ベクターへの挿入用のＤＮＡは合成 手段にするか、あるいはこのような配列を含むベクターが寄託されているか入手 可能であれば、このようなベクターをクローニングすることにより。

得ることができる。コード配列の合成では、センスとアンチセンスとが交互に重 なり合っている一本鎖オリゴヌクレオチドを調製し、センスとアンチセンスとが 交互になっている一木鎖部分をＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰで処理して酵素的 に埋める。オリゴマーをＥｆｉｍｏｖ、　Ｖ、　Ａ、等の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ匠（１９８２）　６８７５−６８９４）により調製するが、これは 市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して調製できる。アニーリング前の あるいは標識するための一本鎖のキナーゼ処理は。

過剰の例えば基質ｌ　ｍｍｏｌに対し約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを 用いて、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，６）、　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　 ５ｍＭジチオスレイトール、１　２ｍＭ　ＡＴＰ、　１．７ｐｍｏｌ　γ”Ｐ− ＡＴＰ　（２，９ｍ　Ｃｊ／ｍｍｏｌ　）　、　０．１ｍ？スペルミジンおよび ０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ存在下で行う。

Ｅ、７．血工開 ここでクローニングおよび発現に使用する宿主株は以下の通りである： クローニングおよび配列決定用に、またたいていの細菌プロモーターの制御下で の構築物の発現用には、　Ｅ、　ｃｏｌｔ　ａＭｃ１０６１を使用した。

哺乳動物発現のために使用する細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細 胞である。

ＦＩＧ、　２ ２　６　Ｉｏ　１４　旧　２２ ＦＩＧ、　３０　Ｈ開°・ １２３４５６７Ｂ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ リミ＃二＝９ジ郭ξ茹慕云＝ミ　ミ９＃ミ９三と討　？ご　？ご　８二　？ご　 ご　８　ご　呆　乏ヨ３　諏　Ｆζ　と＝　Ｉ　３　ミ　３　已　母８ぶ　呂ご 　８二　８二　旨　ご　旨　淀　む　乏＜ｈ　ｕべ　＜ｒｓ　＜ｈ　ｕ、ａ　＊ 　ｏ　ｕ　＜　υジ芸　拍　ト　葺ぎ　Ｉ　ミ　葺　ミ　ａ　ご８二　２；　討 　旨ご　？ご　８　ご　？　？　讐と　χさ　贅圧　Ｉ　葺９　託　要　目　葺 　ミｒ、じ３８８＝　ミニ　８；　８　淀　８　ご偽　Ｃｏ　ｌ”＋　％１）　 の　マ　円　へ　−。

ψ　閂　０１％　マ　−。　ψ　へ　色ｔ−１（Ｎ　ＩＮ　Ｆ’ｌ　マ　！　鉛 　ψ　ψＡＩＰ’　苓≦ｉ来笛Ｉｔ邑１；ｂ゛けう　ビＬ４２９舌イケ。

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Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に純粋型のヒトホスホリパーゼ阻害蛋白（ｈＰＩＰ）。
2. ２．第１３図の成熟蛋白用に示されたアミノ酸配列と４０％の相同性を有する一 次アミノ酸配列を有する請求の範囲第１項に記載のｈＰＩＰ。
3. ３．アポリポ蛋白ＡＩＶ（アポＡＩＶ）との複合体型である請求の範囲第１項に 記載のｈＰＩＰ。
4. ４．活性ＰＩＰ断片であって，該ＰＩＰのアミノ酸配列の二次構造が第１３図の ヌクレオチド４９０−８５２でコードされる活性ＰＩＰ断片のものと類似してい る活性ＰＩＰ断片。
5. ５．ｐＴＲＰ−ＰＩＰ（Ｆ），ｐＴＲＰ−ＰＩＰ（Ｆ＿），ｐＴＲＰ−ＰＩＰ（ Ｆ／Ａ）およびｐＴＲＰ−ＰＩＰ（４６５−８５２）からなる群より選ばれたベ クターのいかなるもののＰＩＰコード挿入物によりコードされる請求の範囲第４ 項に記載の活性ＰＩＰ断片。
6. ６．請求の範囲第３項に記載のｈＰＩＰ／アポＡＩＶ複合体の精製法であって， 以下の工程： （ａ）ヒト腹膜間透析液を４０−６０％硫安処理して沈澱を得ること； （ｂ）該沈澱をＡｆｆｉ−ゲルＢにかけて非結合画分を得ること；（ｃ）（ｂ） の非結合面分をコンカナバリン−Ａセファロースで処理して非結合画分を得るこ と； （ｄ）（ｃ）の非結合画分をｐＨ７−９で陰イオン交換クロマトグラフィーにか けて活性面分を得ること； （ｅ）（ｄ）の活性画分を予備のＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理して４０ｋｄ画分を得 ること；および （ｆ）（ｅ）の４０ｋｄ画分を回収し，再構成すること，を含有する精製法。
7. ７．請求の範囲第６項に記載の方法で得られるｈＰＩＰ／アポＡＩＶの複合体蛋 白。
8. ８．請求の範囲第１項に記載のｈＰＩＰの精製法であって，以下の工程： （ａ）ヒト腹膜間透析液を４０−６０％硫安処理して沈澱を得ること； （ｂ）該沈澱をＡｆｆｉ−ゲルＢにかけて非結合画分を得ること；（ｃ）（ｂ） の非結合画分をコンカナバリン−Ａセファロースで処理して非結合画分を得るこ と； （ｄ）（ｃ）の非結合画分をｐＨ７−９で陰イオン交換クロマトグラフィーにか けて活性画分を得ること； （ｅ）（ｄ）の活性面分をｐＨ５．５クエン酸ナトリウムに対して透析して，沈 澱と上清を得ること；および （ｆ）（ｅ）の上清を回収すること， を含有する精製法。
9. ９．請求の範囲第８項に記載の方法で得られるｈＰＩＰ蛋白。
10. １０．請求の範囲第７項または第９項に記載の蛋白に対して調製された抗体。
11. １１．組換えにより作られるヒトホスホリパーゼ阻害蛋白（ｈＰＩＰ）。
12. １２．第１３図の成熟蛋白用に示されたアミノ酸配列と４０％の相同性を有する 一次アミノ酸配列を有する請求の範囲第１１項に記載のｈＰＩＰ。
13. １３．ｈＰＩＰ用の組換え発現系であって，該系が組換え宿主と和合可能な制御 配列に動作可能なように連結したｈＰＩＰコードＤＮＡ配列を有する発現系。
14. １４．前記コード配列が第１３図の成熟蛋白用に示されたアミノ酸配列と４０％ の相同性を有する一次アミノ酸配列を有する蛋白をコードする請求の範囲第１３ 項に記載の発現系。
15. １５．前記コード配列が第１３図のアミノ酸配列を有する蛋白をコードする請求 の範囲第１３項に記載の発現系。
16. １６．請求の範囲第４項に記載の活性ｈＰＩＰ断片用の組換え発現系であって， 該系が組換え宿主と和合可能な制御配列に動作可能なように連結した該活性ｈＰ ＩＰ断片コードＤＮＡ配列を有する発現系。
17. １７．形質転換用ベクター上に置かれた請求の範囲第１３項または第１６項に記 載の発現系。
18. １８．請求の範囲第１３項または第１６項に記載の発現系により形質転換された 組換え宿主細胞。
19. １９．請求の範囲第１８項に記載の細胞の培養により調製されたｈＰＩＰ。
20. ２０．ヒトＰＩＰの産生法であって，請求の範囲第１８項に記載の細胞を培養す ることを含む産生法。
21. ２１．哺乳動物の炎症状態を治療するための薬剤組成物であって，治療上有効量 の請求の範囲第１項−第５項に記載のｈＰＩＰを少なくとも１種の製剤的に受容 可能な賦形剤との混合物として含む薬剤組成物。
22. ２２．哺乳動物の炎症治療法であって，該方法がそのような治療を必要とする被 験体に，治療上有効量の請求の範囲第１項−第５項に記載のｈＰＩＰ，あるいは 治療上有効量の請求の範囲第１項−第５項に記載のｈＰＩＰを含む薬剤組成物を 投与することを含む治療法。