JPH06799B2 - 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白 - Google Patents
起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白Info
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- JPH06799B2 JPH06799B2 JP62079693A JP7969387A JPH06799B2 JP H06799 B2 JPH06799 B2 JP H06799B2 JP 62079693 A JP62079693 A JP 62079693A JP 7969387 A JP7969387 A JP 7969387A JP H06799 B2 JPH06799 B2 JP H06799B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、起炎性フォスフォリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）阻
害活性を有する蛋白に関する。更に詳しくは、グルココ
ルチコイド投与により、細胞から誘導され、起炎性ＰＬ
Ａ2阻害活性を有する蛋白に関するものである。
害活性を有する蛋白に関する。更に詳しくは、グルココ
ルチコイド投与により、細胞から誘導され、起炎性ＰＬ
Ａ2阻害活性を有する蛋白に関するものである。
グルココルチコイドは、慢性関節リウマチ、全身性エリ
テマトーデス、気管支喘息等の種々の炎症性、アレルギ
ー性疾患の治療薬として、今日最も有効性の高い医薬品
のひとつとして幅広く用いられている。その作用メカニ
ズムは、グルココルチコイドの抗炎症作用、抗浮腫作
用、免疫抑制作用などに由来している。その中で抗炎症
効果の発現は、炎症関連物質であるロイコトリエンやプ
ロスタグランジンの前駆体であるアラキドン酸の、遊離
を抑制することに関連する。即ち、アラキドン酸をリン
脂質から直接切り出す酵素、ＰＬＡ2を阻害するとの説
が近年Flower(Nature 278:456,1979)により提唱されて
いる。グルココルチコイドの作用機序については、細胞
内に入ったグルココルチコイドは最初に胞体内受容体と
結合子、この複合体が核内へと輸送されて、遺伝子発現
の制御が働き、最終的には蛋白合成の誘導が行なわれ
る。事実、鶴藤ら(Nature 280:408,1979)は、蛋白合成
阻害剤シクロヘキシミドとｍＲＮＡ合成阻害剤アクチノ
マイシンＤとが、セロトニンにより惹起される足蹠浮腫
（実験的炎症動物モデル）に対する、グルココルチコイ
ドの治療効果を抑制することを示した。これらの結果よ
り、グルココルチコイド抗炎症作用は、ＰＬＡ2阻害活
性のある蛋白の合成誘導を介して行なわれると考えられ
る。
テマトーデス、気管支喘息等の種々の炎症性、アレルギ
ー性疾患の治療薬として、今日最も有効性の高い医薬品
のひとつとして幅広く用いられている。その作用メカニ
ズムは、グルココルチコイドの抗炎症作用、抗浮腫作
用、免疫抑制作用などに由来している。その中で抗炎症
効果の発現は、炎症関連物質であるロイコトリエンやプ
ロスタグランジンの前駆体であるアラキドン酸の、遊離
を抑制することに関連する。即ち、アラキドン酸をリン
脂質から直接切り出す酵素、ＰＬＡ2を阻害するとの説
が近年Flower(Nature 278:456,1979)により提唱されて
いる。グルココルチコイドの作用機序については、細胞
内に入ったグルココルチコイドは最初に胞体内受容体と
結合子、この複合体が核内へと輸送されて、遺伝子発現
の制御が働き、最終的には蛋白合成の誘導が行なわれ
る。事実、鶴藤ら(Nature 280:408,1979)は、蛋白合成
阻害剤シクロヘキシミドとｍＲＮＡ合成阻害剤アクチノ
マイシンＤとが、セロトニンにより惹起される足蹠浮腫
（実験的炎症動物モデル）に対する、グルココルチコイ
ドの治療効果を抑制することを示した。これらの結果よ
り、グルココルチコイド抗炎症作用は、ＰＬＡ2阻害活
性のある蛋白の合成誘導を介して行なわれると考えられ
る。
グルココルチコイドにより合成が誘導され、invitroで
ＰＬＡ2活性を阻害し、in vivoでプロスタグランジン生
成を抑制するような蛋白を分離する試みは、これまで数
グループよりなされている。これらの試みはいずれも、
その評価系にブタ膵臓ＰＬＡ2を用いている。
ＰＬＡ2活性を阻害し、in vivoでプロスタグランジン生
成を抑制するような蛋白を分離する試みは、これまで数
グループよりなされている。これらの試みはいずれも、
その評価系にブタ膵臓ＰＬＡ2を用いている。
ところが、一般的に膵臓のＰＬＡ2は消化酵素的役割を
果すと考えられるのに対し、それとは性質の異なる起炎
性ＰＬＡ2が存在する。最近、井上らはカゼイン投与時
のラット腹腔中に見い出せるＰＬＡ2を単離・精製し、
その性質を調べている（生化学、Vol58,No.8,766,198
6）。それによれば、精製酵素100ngをラット背部皮内に
接種すると、あらかじめ静脈投与したエバンスブルーが
漏出し、局所での血管透過性が亢進していることを観察
している。一方膵臓由来のＰＬＡ2は、この活性を示さ
ないことも確認している。またVadasらは、リウマチ患
者の関節内ＰＬＡ2活性が、亢進していることを報告し
ており、更にその酵素を精製しその性質を調べたとこ
ろ、ヒト膵臓ＰＬＡ2の抗体とは反応しないことを報告
している（Ｊ．Biochem.100,1297-1303,1986）。このよ
うに膵臓由来ＰＬＡ2と起炎性ＰＬＡ2はその蛋白の一次
及び高次構造が異なり、なおかつ生体内に於ける役割が
明確に異なるものと思われる。
果すと考えられるのに対し、それとは性質の異なる起炎
性ＰＬＡ2が存在する。最近、井上らはカゼイン投与時
のラット腹腔中に見い出せるＰＬＡ2を単離・精製し、
その性質を調べている（生化学、Vol58,No.8,766,198
6）。それによれば、精製酵素100ngをラット背部皮内に
接種すると、あらかじめ静脈投与したエバンスブルーが
漏出し、局所での血管透過性が亢進していることを観察
している。一方膵臓由来のＰＬＡ2は、この活性を示さ
ないことも確認している。またVadasらは、リウマチ患
者の関節内ＰＬＡ2活性が、亢進していることを報告し
ており、更にその酵素を精製しその性質を調べたとこ
ろ、ヒト膵臓ＰＬＡ2の抗体とは反応しないことを報告
している（Ｊ．Biochem.100,1297-1303,1986）。このよ
うに膵臓由来ＰＬＡ2と起炎性ＰＬＡ2はその蛋白の一次
及び高次構造が異なり、なおかつ生体内に於ける役割が
明確に異なるものと思われる。
このような背景のもとに、本発明者らは、上記カゼイン
投与時のラット腹腔中に見いだされる起炎性ＰＬＡ2を
用い、本酵素を特異的に阻害する蛋白を鋭意検索し、本
発明に到った。
投与時のラット腹腔中に見いだされる起炎性ＰＬＡ2を
用い、本酵素を特異的に阻害する蛋白を鋭意検索し、本
発明に到った。
即ち、本発明は、グルココルチコイド投与により細胞か
ら誘導されるという性質を有し、グルココルチコイド投
与後、ラット腹腔より精製され、分子量40ＫでＮ端部の
アミノ酸配列が、Ｎ端部アミノ酸−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−よりなる、起炎性フォスフォリパーゼＡ2阻害活性
を有する蛋白である。
ら誘導されるという性質を有し、グルココルチコイド投
与後、ラット腹腔より精製され、分子量40ＫでＮ端部の
アミノ酸配列が、Ｎ端部アミノ酸−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−よりなる、起炎性フォスフォリパーゼＡ2阻害活性
を有する蛋白である。
次に本発明の蛋白の、単離精製方法について述べる。本
蛋白は、ステロイドの投与により生体内で合成される蛋
白であることから、その誘導法としては、直接ステロイ
ドを生体内に投与し、本蛋白を誘導してもよいが、正常
細胞あるいは株化細胞を用いて、in vitroで直接ステロ
イドと接触させて誘導させる方法もある。一例として
は、ラット背部皮下にデキサメサゾンを投与し、1.5時
間後にドライアイスにて炭酸ガス下窒息死させ、腹腔を
リン酸、ヘパリン及びＰＭＳＦ（Phenylmethyl-sulphon
ylfluoride）加生理食塩水にてよく洗浄後、洗浄液を回
収する。この洗浄液を酢酸アンモニウム緩衝液にてよく
透析後、凍結乾燥する。１匹のラットより、約20mgのラ
ット腹腔洗浄凍結標品を得る。この標品を出発材料とし
て、例えば、以下の如き方法で本蛋白は精製単離され
る。
蛋白は、ステロイドの投与により生体内で合成される蛋
白であることから、その誘導法としては、直接ステロイ
ドを生体内に投与し、本蛋白を誘導してもよいが、正常
細胞あるいは株化細胞を用いて、in vitroで直接ステロ
イドと接触させて誘導させる方法もある。一例として
は、ラット背部皮下にデキサメサゾンを投与し、1.5時
間後にドライアイスにて炭酸ガス下窒息死させ、腹腔を
リン酸、ヘパリン及びＰＭＳＦ（Phenylmethyl-sulphon
ylfluoride）加生理食塩水にてよく洗浄後、洗浄液を回
収する。この洗浄液を酢酸アンモニウム緩衝液にてよく
透析後、凍結乾燥する。１匹のラットより、約20mgのラ
ット腹腔洗浄凍結標品を得る。この標品を出発材料とし
て、例えば、以下の如き方法で本蛋白は精製単離され
る。
起炎性ＰＬＡ2を阻害する活性を指標にして、例えば、
アニオン交換高速液体クロマトグラフィーに標品をアプ
ライし、各画分の起炎性ＰＬＡ2阻害活性を測定し、活
性ピークを得た。活性ピークをＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動で調べたところ、多数の蛋白の混合物である
ことを認めた。更にこの活性画分をゲル濾過高速液体ク
ロマトグラフィーにかけた。ここに於いても活性画分は
得られたが、ただ単一蛋白には精製されておらず、更に
逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製を行ない、
活性ピークを得た。この活性ピークは、ＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動から単一蛋白であることがわかっ
た。約200mgの標品から、起炎性ＰＬＡ2阻害蛋白を約10
0ng単離した。
アニオン交換高速液体クロマトグラフィーに標品をアプ
ライし、各画分の起炎性ＰＬＡ2阻害活性を測定し、活
性ピークを得た。活性ピークをＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動で調べたところ、多数の蛋白の混合物である
ことを認めた。更にこの活性画分をゲル濾過高速液体ク
ロマトグラフィーにかけた。ここに於いても活性画分は
得られたが、ただ単一蛋白には精製されておらず、更に
逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製を行ない、
活性ピークを得た。この活性ピークは、ＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動から単一蛋白であることがわかっ
た。約200mgの標品から、起炎性ＰＬＡ2阻害蛋白を約10
0ng単離した。
以上、ステロイド誘導ラット腹腔から、本発明の起炎性
ＰＬＡ2阻害活性を有する蛋白を、精製・単離する方法
を中心に説明したが、本発明において、蛋白に起源や蛋
白の製法は何ら限定されるものではない。ヒトや他の動
物から抽出・精製単離してよく、また遺伝子工学的手法
で微生物あるいは動物細胞から製造してもよい。起炎性
ＰＬＡ2阻害活性を有する蛋白である限り、本発明に含
まれるものである。
ＰＬＡ2阻害活性を有する蛋白を、精製・単離する方法
を中心に説明したが、本発明において、蛋白に起源や蛋
白の製法は何ら限定されるものではない。ヒトや他の動
物から抽出・精製単離してよく、また遺伝子工学的手法
で微生物あるいは動物細胞から製造してもよい。起炎性
ＰＬＡ2阻害活性を有する蛋白である限り、本発明に含
まれるものである。
本発明において用いられた各種試験、測定法は以下の通
りである。
りである。
(1)起炎性ＰＬＡ2阻害活性の測定法 カゼイン誘導ラット腹腔浸出液より単離精製した起炎性
ＰＬＡ2を用い、基質としては14Ｃ酢酸をＥ．Ｃoliに取
り込ませ、14Ｃでラベル化されたホスファチジルエタノ
ールアミンを抽出して用いた。標準の反応系は、130μ
の試料あるいは対照（緩衝液）に50μの0.5ＭＴris
Ｈcl（pH9.0）及び25μの40mMCaCl2及び25μの基質
（400dpm/n mol,2mM）を入れ混合後、最後に20μの起
炎性ＰＬＡ2（0.1ng/μ,80Units/mg・蛋白）を入れて
混合し、37℃にて１０分間インキュベートする。その後
Dole試薬で反応を停止させる。ホスファチジルエタノー
ルアミンが加水分解されて生成したラベル化脂肪酸をヘ
プタンで抽出後、液体シンチレーションカウンターにて
その量を測定する。
ＰＬＡ2を用い、基質としては14Ｃ酢酸をＥ．Ｃoliに取
り込ませ、14Ｃでラベル化されたホスファチジルエタノ
ールアミンを抽出して用いた。標準の反応系は、130μ
の試料あるいは対照（緩衝液）に50μの0.5ＭＴris
Ｈcl（pH9.0）及び25μの40mMCaCl2及び25μの基質
（400dpm/n mol,2mM）を入れ混合後、最後に20μの起
炎性ＰＬＡ2（0.1ng/μ,80Units/mg・蛋白）を入れて
混合し、37℃にて１０分間インキュベートする。その後
Dole試薬で反応を停止させる。ホスファチジルエタノー
ルアミンが加水分解されて生成したラベル化脂肪酸をヘ
プタンで抽出後、液体シンチレーションカウンターにて
その量を測定する。
(2)ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動 各種クロマト的手法により分画した試料の一部を取り、
１％ＳＤＳ，２−メルカプトエタノール存在下、100℃
で10分間加熱した。次いで、12.5％ポリアクリルアミド
ゲルに試料をアプライし、15mAで、1.5時間電気泳動し
た。泳動終了後、バイオラッド社製シルバーステインキ
ットで染色した。
１％ＳＤＳ，２−メルカプトエタノール存在下、100℃
で10分間加熱した。次いで、12.5％ポリアクリルアミド
ゲルに試料をアプライし、15mAで、1.5時間電気泳動し
た。泳動終了後、バイオラッド社製シルバーステインキ
ットで染色した。
(3)蛋白一次構造の決定法 気相プロティンシーケンサー（アプライド・バイオシス
テム社、model 470Ａ）を用いて決定した。即ち、単離
精製されたサンプル10μｇを、30μの１％ＳＤＳに溶
解し、上記気相プロティンシーケンサーにアプライし
た。自動的にエドマン分解されたＰＴＨ（フェニルチオ
ヒダントイン）アミノ酸誘導体は、その後、高速液体ク
ロマトグラフィーにて各アミノ酸として分析された。
テム社、model 470Ａ）を用いて決定した。即ち、単離
精製されたサンプル10μｇを、30μの１％ＳＤＳに溶
解し、上記気相プロティンシーケンサーにアプライし
た。自動的にエドマン分解されたＰＴＨ（フェニルチオ
ヒダントイン）アミノ酸誘導体は、その後、高速液体ク
ロマトグラフィーにて各アミノ酸として分析された。
以下、実施例により本発明を詳述する。
実施例１ (1)ラット腹腔洗浄液凍結標品の作成 ＳＤ系ラット８週令、雄５０匹を用いて、デキサメサゾ
ンを1.5mg/kgとなるように背部皮下に注射し、1.5時間
後にドライアイスにて炭酸ガス下窒息死させ、腹腔を１
匹当り12mlの２ν／mlのヘパリン及び50μＭのＰＭＳＦ
(phenylmethylsulphonylfluoride)加生理食塩水にてよ
く洗浄後、洗浄液約500mlを回収した。この洗浄液を、4
0倍量の10mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH7.4）にて、２
回透析後、凍結乾燥し、約940mgのラット腹腔洗浄凍結
乾燥標品を得た。
ンを1.5mg/kgとなるように背部皮下に注射し、1.5時間
後にドライアイスにて炭酸ガス下窒息死させ、腹腔を１
匹当り12mlの２ν／mlのヘパリン及び50μＭのＰＭＳＦ
(phenylmethylsulphonylfluoride)加生理食塩水にてよ
く洗浄後、洗浄液約500mlを回収した。この洗浄液を、4
0倍量の10mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH7.4）にて、２
回透析後、凍結乾燥し、約940mgのラット腹腔洗浄凍結
乾燥標品を得た。
(2)分取用カラムを用いたアニオン交換高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）による目的蛋白の分離精製 氷冷下、200mgのラット腹腔洗浄凍結乾燥標品を50mlの2
0mM Tris-Hcl（pH8.0）に溶解させ、0.45μｍMembrane
Filterにて濾過した後に、直接sp8750ＨＰＬＣ用ポン
プでカラム（ＴＳＫ Gel ＤＥＡＥ−５ＰＷ）にアプ
ライした。吸着した試料は、流速2.5ml/minで、第１図
破線で示すNacl直接濃度勾配にて溶出させた。第１図の
実線は、ＵＶ280mm於ける吸収で蛋白量を表わしたもの
であるが、起炎性ＰＬＡ2に対する阻害活性がFr.Ｉ〜F
r.IVに認められた。各々の画分はＳＤＳ電気泳動の結
果、多くの分子量の異なる蛋白の混合物であった。
トグラフィー（ＨＰＬＣ）による目的蛋白の分離精製 氷冷下、200mgのラット腹腔洗浄凍結乾燥標品を50mlの2
0mM Tris-Hcl（pH8.0）に溶解させ、0.45μｍMembrane
Filterにて濾過した後に、直接sp8750ＨＰＬＣ用ポン
プでカラム（ＴＳＫ Gel ＤＥＡＥ−５ＰＷ）にアプ
ライした。吸着した試料は、流速2.5ml/minで、第１図
破線で示すNacl直接濃度勾配にて溶出させた。第１図の
実線は、ＵＶ280mm於ける吸収で蛋白量を表わしたもの
であるが、起炎性ＰＬＡ2に対する阻害活性がFr.Ｉ〜F
r.IVに認められた。各々の画分はＳＤＳ電気泳動の結
果、多くの分子量の異なる蛋白の混合物であった。
(3)ゲル濾過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ
ーによる目的蛋白の分離精製 更に起炎性ＰＬＡ2阻害分画（Fr.IV）を精製するため
に、限外濾過（セントリカット10×3000G）で濃縮し
た。約0.7mlに濃縮された分画を、0.1M Tris-Hcl，1.0
M Nacl，pH7.7で平衡化したゲル濾過カラム（ＴＳＫGel
Ｇ3000 ＳＷ）にアプライし、流速0.5ml/minで溶出
させた。起炎性ＰＬＡ2阻害活性は２ピーク得られた
（第２図の斜線部）。保持時間37分〜44分に溶出させる
分画に着目し、更に精製を進めた。
ーによる目的蛋白の分離精製 更に起炎性ＰＬＡ2阻害分画（Fr.IV）を精製するため
に、限外濾過（セントリカット10×3000G）で濃縮し
た。約0.7mlに濃縮された分画を、0.1M Tris-Hcl，1.0
M Nacl，pH7.7で平衡化したゲル濾過カラム（ＴＳＫGel
Ｇ3000 ＳＷ）にアプライし、流速0.5ml/minで溶出
させた。起炎性ＰＬＡ2阻害活性は２ピーク得られた
（第２図の斜線部）。保持時間37分〜44分に溶出させる
分画に着目し、更に精製を進めた。
(4)分析用カラムを用いたアニオン交換高速液体クロマ
トグラフィーによる目的蛋白の分離精製 ゲル濾過カラムにて保持時間40分前後に溶出された活性
分画を集め、25mM Tris-Hcl（pH7.7）のバッファーに
対し透析し、同バッファーで平衡化したアニオン交換カ
ラム（ＴＳＫ Ｇel ＤＥＡＥ−５pW）にアプライし
た。流速1.0ml/min,Nacl濃度勾配下、目的蛋白の分離を
行なった。
トグラフィーによる目的蛋白の分離精製 ゲル濾過カラムにて保持時間40分前後に溶出された活性
分画を集め、25mM Tris-Hcl（pH7.7）のバッファーに
対し透析し、同バッファーで平衡化したアニオン交換カ
ラム（ＴＳＫ Ｇel ＤＥＡＥ−５pW）にアプライし
た。流速1.0ml/min,Nacl濃度勾配下、目的蛋白の分離を
行なった。
起炎性ＰＬＡ2阻害活性は、保持時間26分〜36分の分画
に認められた（第３図の斜線部）。
に認められた（第３図の斜線部）。
(5)逆相高速液体クロマトグラフィーによる目的蛋白の
分離精製 分析用アニオン交換ＨＰＬＣにて起炎性ＰＬＡ2に阻害
活性を示す活性分画は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動より、主に40Kと35Kより成ることが判った。そ
こでこれらを単一蛋白とする目的で、それぞれ逆相ＨＰ
ＬＣによる精製を行なった。0.1%ＴＦＡで平衡化したカ
ラム（Bio-Rad Hi-pore ＲＰ−304）に第３図の活性ピ
ークを各々アプライした。40Kの蛋白は、流速1.0ml/min
にて、第４図破線で示すアセトニトリル直線濃度勾配に
て溶出させた。ＵＶ210nmで吸収を検出した画分につい
て、25mM Tris-Hcl,pH 9.0に対して透析した後、起炎性
ＰＬＡ2に対する阻害活性を測定した。その結果、第４
図に示す保持時間59分の単一な画分に、顕著な阻害活性
を検出した。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で、こ
の蛋白は単一で分子量が約400,000であることが判明し
た。また35Kを主に含む画分を同様に逆相ＨＰＬＣにて
精製し、同様に蛋白画分の起炎性ＰＬＡ2に対する阻害
活性を調べた結果、第５図に示すように保持時間59分の
単一な画分に、著名な阻害活性が検出された。この蛋白
は、ＳＤＳポリアクリルアミドに電気泳動で、単一で分
子量約35,000であることが判明した。
分離精製 分析用アニオン交換ＨＰＬＣにて起炎性ＰＬＡ2に阻害
活性を示す活性分画は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動より、主に40Kと35Kより成ることが判った。そ
こでこれらを単一蛋白とする目的で、それぞれ逆相ＨＰ
ＬＣによる精製を行なった。0.1%ＴＦＡで平衡化したカ
ラム（Bio-Rad Hi-pore ＲＰ−304）に第３図の活性ピ
ークを各々アプライした。40Kの蛋白は、流速1.0ml/min
にて、第４図破線で示すアセトニトリル直線濃度勾配に
て溶出させた。ＵＶ210nmで吸収を検出した画分につい
て、25mM Tris-Hcl,pH 9.0に対して透析した後、起炎性
ＰＬＡ2に対する阻害活性を測定した。その結果、第４
図に示す保持時間59分の単一な画分に、顕著な阻害活性
を検出した。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で、こ
の蛋白は単一で分子量が約400,000であることが判明し
た。また35Kを主に含む画分を同様に逆相ＨＰＬＣにて
精製し、同様に蛋白画分の起炎性ＰＬＡ2に対する阻害
活性を調べた結果、第５図に示すように保持時間59分の
単一な画分に、著名な阻害活性が検出された。この蛋白
は、ＳＤＳポリアクリルアミドに電気泳動で、単一で分
子量約35,000であることが判明した。
参考例 35Ｋ蛋白の起炎性ＰＬＡ2に対する阻害様式を知る目的
で、以下の実験を行なった。即ち、反応系に於ける酵素
濃度及び阻害蛋白の濃度を一定にし、基質濃度を変化さ
せて反応速度を測定した。その結果を、逆数プロットで
第６図に示した（白ぬきは阻害蛋白を含まない系での酵
素反応を示し、黒ぬきは一定量の阻害蛋白存在時の酵素
反応を示す）。
で、以下の実験を行なった。即ち、反応系に於ける酵素
濃度及び阻害蛋白の濃度を一定にし、基質濃度を変化さ
せて反応速度を測定した。その結果を、逆数プロットで
第６図に示した（白ぬきは阻害蛋白を含まない系での酵
素反応を示し、黒ぬきは一定量の阻害蛋白存在時の酵素
反応を示す）。
第６図より、本蛋白の阻害様式は非拮抗阻害（基質と阻
害物質が非拮抗的に作用する）であり、阻害定数は4.5
×10-8Ｍと算出された。
害物質が非拮抗的に作用する）であり、阻害定数は4.5
×10-8Ｍと算出された。
実施例２ 実施例１で単離精製したサンプルの、蛋白一次構造の一
部を決定した。その結果、40Ｋ蛋白は以下の通りであっ
た。即ち、Ｎ端部アミノ酸はGluかAspか決定されていな
いが、２番目からは、Asp-Val-Pro-Ala-AlaAsp-Leu-Ser
-Asp-であった。
部を決定した。その結果、40Ｋ蛋白は以下の通りであっ
た。即ち、Ｎ端部アミノ酸はGluかAspか決定されていな
いが、２番目からは、Asp-Val-Pro-Ala-AlaAsp-Leu-Ser
-Asp-であった。
また、35Ｋ蛋白の一次配列は、Ｎ端部アミノ酸はGlyかA
spか決定されていないが、２番目からは、Glu-Arg-Leu-
Lys-His-Leu-Ile-Val-であった。
spか決定されていないが、２番目からは、Glu-Arg-Leu-
Lys-His-Leu-Ile-Val-であった。
第１図は、アニオン交換ＨＰＬＣを用いた目的蛋白の溶
出パターンを示す。第２図は、ゲル濾過ＨＰＬＣを用い
た目的蛋白の溶出パターンを示す。第３図は、アニオン
交換ＨＰＬＣを用いた目的蛋白の溶出パターンを示す。
第４図は、逆相ＨＰＬＣを用いた目的蛋白(40K)の溶出
パターンを示す。第５図は、逆相ＨＰＬＣを用いた目的
蛋白(35K)の溶出パターンを示す。第６図、目的阻害蛋
白の動力学データを示す。
出パターンを示す。第２図は、ゲル濾過ＨＰＬＣを用い
た目的蛋白の溶出パターンを示す。第３図は、アニオン
交換ＨＰＬＣを用いた目的蛋白の溶出パターンを示す。
第４図は、逆相ＨＰＬＣを用いた目的蛋白(40K)の溶出
パターンを示す。第５図は、逆相ＨＰＬＣを用いた目的
蛋白(35K)の溶出パターンを示す。第６図、目的阻害蛋
白の動力学データを示す。
フロントページの続き (72)発明者 岡田 昌宏 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物医学研究所内 (72)発明者 鈴木 洋二 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物医学研究所内 (72)発明者 工藤 一郎 東京都文京区本郷７丁目３番１号 (72)発明者 井上 圭三 東京都文京区本郷７丁目３番１号 (56)参考文献 特開 昭62−56429（ＪＰ，Ａ) 国際公開第86／06100（ＷＯ，Ａ) 国際公開第86／04094（ＷＯ，Ａ) 生化学 Ｖｏｌ 58，Ｎｏ８，766, 1986 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．100，1297−1303, 1986
Claims (1)
- 【請求項１】グルココルチコイド投与により細胞から誘
導されるという性質を有し、グルココルチコイド投与
後、ラット腹腔より精製され、分子量40ＫでＮ端部のア
ミノ酸配列が、Ｎ端部アミノ酸−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒ
ｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
−よりなる、起炎性フォスフォリパーゼＡ2阻害活性を
有する蛋白。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62079693A JPH06799B2 (ja) | 1987-04-02 | 1987-04-02 | 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白 |
| US07/295,724 US5116942A (en) | 1987-04-02 | 1988-03-30 | Protein having an inflammatory phospholipase a2 inhibitory activity |
| PCT/JP1988/000318 WO1988007552A1 (en) | 1987-04-02 | 1988-03-30 | Protein having activity of inhibiting inflammation-inducing phospholipase a2 |
| EP88902933A EP0413024B1 (en) | 1987-04-02 | 1988-03-30 | Protein having activity of inhibiting inflammation-inducing phospholipase a2 |
| DE3850407T DE3850407T2 (de) | 1987-04-02 | 1988-03-30 | Protein mit inhibierender wirkung auf die entzündungserregende phospholipase a2. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62079693A JPH06799B2 (ja) | 1987-04-02 | 1987-04-02 | 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63246397A JPS63246397A (ja) | 1988-10-13 |
| JPH06799B2 true JPH06799B2 (ja) | 1994-01-05 |
Family
ID=13697288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62079693A Expired - Lifetime JPH06799B2 (ja) | 1987-04-02 | 1987-04-02 | 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白 |
Country Status (5)
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| EP (1) | EP0413024B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06799B2 (ja) |
| DE (1) | DE3850407T2 (ja) |
| WO (1) | WO1988007552A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0436737A4 (en) * | 1989-08-03 | 1992-10-28 | Teijin Limited | Phospholipase a 2? inhibiting protein originating in inflamed region, production thereof, and gene therefor |
| JPH0365187A (ja) * | 1989-08-03 | 1991-03-20 | Teijin Ltd | 起炎性ホスホリパーゼａ↓２阻害蛋白、その製造方法およびその遺伝子 |
| US5344764A (en) * | 1989-08-03 | 1994-09-06 | Teijin Limited | Protein inhibitors of phospholipase A2 purified from inflammatory sites and production process |
| JP3126733B2 (ja) * | 1990-11-20 | 2001-01-22 | 興和株式会社 | 皮膚・角膜疾患治療剤 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4874743A (en) * | 1985-01-10 | 1989-10-17 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor-like polypeptides |
| US4879224A (en) * | 1985-01-10 | 1989-11-07 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor polypeptides |
| CN86100721A (zh) * | 1985-01-10 | 1987-02-11 | 比奥根公司 | 为人类脂皮质激素多肽编码的脱氧核糖核酸顺序，含有它的重组脱氧核糖核酸分子及制造该多肽的方法 |
| EP0218696A4 (en) * | 1985-04-15 | 1989-08-16 | Biotech Res Partners Ltd | ANTI-INFLAMMATORY PROTEIN FOR INHIBITION OF HUMAN PHOSPHOLIPASE. |
| JPS6256429A (ja) * | 1985-09-04 | 1987-03-12 | Teijin Ltd | フオスフオリパ−ゼａ↓２阻害活性を有する蛋白 |
| US4937324A (en) * | 1987-02-06 | 1990-06-26 | Zymogenetics, Inc. | Chromatographic purification of human proteins having anticoagulant and anti-inflammatory activity |
-
1987
- 1987-04-02 JP JP62079693A patent/JPH06799B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-03-30 US US07/295,724 patent/US5116942A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-30 WO PCT/JP1988/000318 patent/WO1988007552A1/ja active IP Right Grant
- 1988-03-30 DE DE3850407T patent/DE3850407T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-30 EP EP88902933A patent/EP0413024B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１００，１２９７−１３０３，１９８６ |
| 生化学Ｖｏｌ５８，Ｎｏ８，７６６，１９８６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0413024A4 (en) | 1990-03-08 |
| US5116942A (en) | 1992-05-26 |
| DE3850407D1 (de) | 1994-07-28 |
| JPS63246397A (ja) | 1988-10-13 |
| EP0413024A1 (en) | 1991-02-20 |
| WO1988007552A1 (en) | 1988-10-06 |
| DE3850407T2 (de) | 1995-03-09 |
| EP0413024B1 (en) | 1994-06-22 |
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