JP3126733B2 - 皮膚・角膜疾患治療剤 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は皮膚・角膜疾患治療剤、更に詳細にはCPB−
Ｉ又はリコンビナントCPB−Ｉを有効成分とし、創傷や
乾癬等の皮膚や角膜における疾患の治療に有用な皮膚・
角膜疾患治療剤に関する。
Ｉ又はリコンビナントCPB−Ｉを有効成分とし、創傷や
乾癬等の皮膚や角膜における疾患の治療に有用な皮膚・
角膜疾患治療剤に関する。
背景技術 従来、皮膚や角膜などの疾患、特に創傷に対する治癒
効果を有する数多くの物質が提供されている。例えば、
表皮成長因子（EGF）（Exp.Cell Res.,164−１−10,198
6）、酸性及び塩基性線維芽細胞成長因子（acid及びbas
ic FGF）（J.Surg.Res.,45,145−153,1988）、形質転換
因子（TGF−α及びTGF−β）（特開平２−167231号公
報、Science,233,532−534,1986）及びインシュリン様
成長因子（IGF−Ｉ及びII）等の成長因子（BIO/Techonl
ogy,135−140,1985）、フィブロネクチン、ラミニン、
ビトロネクチン（Ann.Rev.Biochem.,52,961,1983）等の
接着因子、レチノイド及び類縁化合物（Am.J.Ophthalmo
l.,95,353−358,1983:Ann.Ophthal.,19,175−180,198
7）等の化学物質が知られている。皮膚の創傷治癒過程
においては、肉芽の新生、脈管形成及び表皮の新生を伴
うが、それぞれ、線維芽細胞、血管内皮細胞、表皮細胞
（ケラチノサイト）の増殖及び伸展が必要であり、上述
の因子や化学物質の有効性が知られている。
効果を有する数多くの物質が提供されている。例えば、
表皮成長因子（EGF）（Exp.Cell Res.,164−１−10,198
6）、酸性及び塩基性線維芽細胞成長因子（acid及びbas
ic FGF）（J.Surg.Res.,45,145−153,1988）、形質転換
因子（TGF−α及びTGF−β）（特開平２−167231号公
報、Science,233,532−534,1986）及びインシュリン様
成長因子（IGF−Ｉ及びII）等の成長因子（BIO/Techonl
ogy,135−140,1985）、フィブロネクチン、ラミニン、
ビトロネクチン（Ann.Rev.Biochem.,52,961,1983）等の
接着因子、レチノイド及び類縁化合物（Am.J.Ophthalmo
l.,95,353−358,1983:Ann.Ophthal.,19,175−180,198
7）等の化学物質が知られている。皮膚の創傷治癒過程
においては、肉芽の新生、脈管形成及び表皮の新生を伴
うが、それぞれ、線維芽細胞、血管内皮細胞、表皮細胞
（ケラチノサイト）の増殖及び伸展が必要であり、上述
の因子や化学物質の有効性が知られている。
角膜の上皮、実質及び内皮の治癒過程では、それぞれ
上皮細胞の伸展・増殖、実質細胞の老廃物の貧食・細胞
外マトリックスの産生、内皮細胞の伸展を伴う。
上皮細胞の伸展・増殖、実質細胞の老廃物の貧食・細胞
外マトリックスの産生、内皮細胞の伸展を伴う。
近年、白内障治療手段、角膜移植及びコンタクトレン
ズ装着による内皮細胞の障害が認められるようになり、
内皮細胞の重要性が指摘されている。ヒトの内皮細胞は
増殖しないか、又は増殖しにくいと言われており、治癒
過程では、細胞の伸展・接着が重要である。現在のとこ
ろ、増殖能を有するウサギの培養内皮細胞を用いて、EG
FやFGFが増殖を促進することは報告されているが、有効
な治療薬は未だ見出されておらず、内皮細胞の伸展・接
着を促進するような薬剤が望まれるところである。
ズ装着による内皮細胞の障害が認められるようになり、
内皮細胞の重要性が指摘されている。ヒトの内皮細胞は
増殖しないか、又は増殖しにくいと言われており、治癒
過程では、細胞の伸展・接着が重要である。現在のとこ
ろ、増殖能を有するウサギの培養内皮細胞を用いて、EG
FやFGFが増殖を促進することは報告されているが、有効
な治療薬は未だ見出されておらず、内皮細胞の伸展・接
着を促進するような薬剤が望まれるところである。
一方、皮膚疾患、特に、慢性皮膚疾患である乾癬の臨
床像としては、白血球の湿潤（J.Invest.Dermatol.,68,
43−50,1977）、表皮の肥厚（J.Invest.Dermatol.,50,2
54−258,1968）及び不完全角化（J.Invest.Dermatol.,7
0,294−297,1978）が、また、生化学的所見としては、
乾癬様所見を示す発癌物質であるフォルボールエステル
（TPA）を塗布したマウスの皮膚の研究により、プロテ
インキナーゼＣ（PKC）活性化（J.Invest.Dermatol.,9
3,379−386,1989）、アラキドン酸及びプロスタグラン
ジンの遊離の増大（Biochem.Biophys.Res.Commun.,92,7
49−756,1980）、オルニチンデヒドロゲナーゼ及びトラ
ンスグルタミナーゼ活性の誘導（Cancer Res.,39,4183
−4188,1979;Bicohem.Biophys.Res.Commun.,97,700−70
8,1980）、及びインターロイキン１の増大（J.Invest.D
ermatol.,88,499A,1987）が知られている。
床像としては、白血球の湿潤（J.Invest.Dermatol.,68,
43−50,1977）、表皮の肥厚（J.Invest.Dermatol.,50,2
54−258,1968）及び不完全角化（J.Invest.Dermatol.,7
0,294−297,1978）が、また、生化学的所見としては、
乾癬様所見を示す発癌物質であるフォルボールエステル
（TPA）を塗布したマウスの皮膚の研究により、プロテ
インキナーゼＣ（PKC）活性化（J.Invest.Dermatol.,9
3,379−386,1989）、アラキドン酸及びプロスタグラン
ジンの遊離の増大（Biochem.Biophys.Res.Commun.,92,7
49−756,1980）、オルニチンデヒドロゲナーゼ及びトラ
ンスグルタミナーゼ活性の誘導（Cancer Res.,39,4183
−4188,1979;Bicohem.Biophys.Res.Commun.,97,700−70
8,1980）、及びインターロイキン１の増大（J.Invest.D
ermatol.,88,499A,1987）が知られている。
斯かる乾癬の局所的治療はステロイド軟膏、PUVA療法
が、全身的治療には食餌療法、ビタミンD2、ビタミンB
12、エトレチノイド等が用いられている。また、最近で
は、ケラチノサイトの抗増殖作用を有するTGF−β（特
開平２−167231号公報）や抗炎症作用を有するサイクロ
スポリンＡ（JAMA,256,3110−3116,1986）が、乾癬治療
薬として研究されてきているが、これらの作用機序は未
だ明らかにはなっていない。
が、全身的治療には食餌療法、ビタミンD2、ビタミンB
12、エトレチノイド等が用いられている。また、最近で
は、ケラチノサイトの抗増殖作用を有するTGF−β（特
開平２−167231号公報）や抗炎症作用を有するサイクロ
スポリンＡ（JAMA,256,3110−3116,1986）が、乾癬治療
薬として研究されてきているが、これらの作用機序は未
だ明らかにはなっていない。
創傷や乾癬等の皮膚・角膜疾患の治療薬としては、前
述した因子や化学物質などが知られているが、その効果
は未だ満足のゆくものではなかった。
述した因子や化学物質などが知られているが、その効果
は未だ満足のゆくものではなかった。
また、従来の治療剤の治療効果を増大させ、皮膚・角
膜疾患を早期治癒又は完治させるには、作用機序の異な
る治療剤を併用することが考えられるが、未だ満足すべ
きものは得られていなかった。
膜疾患を早期治癒又は完治させるには、作用機序の異な
る治療剤を併用することが考えられるが、未だ満足すべ
きものは得られていなかった。
従って、本発明の目的は、従来の薬物とは異なる作用
機序を有し、かつ優れた治療効果を有する皮膚・角膜疾
患治療剤を提供することにある。
機序を有し、かつ優れた治療効果を有する皮膚・角膜疾
患治療剤を提供することにある。
斯かる実状において、本発明者らは鋭意研究を行った
結果、抗血液凝固物質であるCPB−Ｉが優れた皮膚・角
膜疾患治療作用を有し、かつその作用機序は従来の薬物
とは異なることを見出し、本発明を完成した。
結果、抗血液凝固物質であるCPB−Ｉが優れた皮膚・角
膜疾患治療作用を有し、かつその作用機序は従来の薬物
とは異なることを見出し、本発明を完成した。
発明の開示 本発明は、CPB−Ｉ若しくはリコンビナントCPB−Ｉを
有効成分とする皮膚・角膜創傷治療剤又は乾癬治療剤に
係るものである。
有効成分とする皮膚・角膜創傷治療剤又は乾癬治療剤に
係るものである。
図面の簡単な説明 図１（１）〜（３）は、それぞれ試験例１におけるHN
EK、HUVEC及びFlow2000の伸展に対する作用についての
試験結果を示す図面である。
EK、HUVEC及びFlow2000の伸展に対する作用についての
試験結果を示す図面である。
図２（１）〜（３）は、それぞれ試験例２におけるFl
ow2000、HUVEC及びHNEKの接着に対する作用についての
試験結果を示す図面である。
ow2000、HUVEC及びHNEKの接着に対する作用についての
試験結果を示す図面である。
図３は、試験例４におけるPKC活性に対する作用につ
いての試験結果を示す図面である。
いての試験結果を示す図面である。
図４は、試験例５におけるPKC活性に対する作用につ
いての試験結果を示す図面である。
いての試験結果を示す図面である。
発明を実施するための最良の形態 本発明皮膚・角膜疾患治療剤の有効成分であるCPB−
Ｉはヒト胎盤をはじめとする生体内の組織及び分泌液に
広く分布し（Chem.Pharma.Bull,38,1957−1960,199
0）、また細胞内では細胞質に存在する抗血液凝固作用
等の生理活性を有する物質である。
Ｉはヒト胎盤をはじめとする生体内の組織及び分泌液に
広く分布し（Chem.Pharma.Bull,38,1957−1960,199
0）、また細胞内では細胞質に存在する抗血液凝固作用
等の生理活性を有する物質である。
CPB−Ｉはヒトあるいは動物の臓器から抽出すること
ができ（特開昭62−174023号公報）、このようにして得
られたCPB−Ｉは以下の性質を有する。
ができ（特開昭62−174023号公報）、このようにして得
られたCPB−Ｉは以下の性質を有する。
分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法、還元状態） 34,000±2,000 等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電気
泳動法） 4.7±0.1 安定性 （イ）50℃、30分加熱処理で失活 （ロ）pH4〜10で安定 （ハ）血漿中37℃、30分で安定 血液凝固系に対する作用 （イ）カルシウム再加凝固時間を延長 （ロ）プロトロンビン時間を延長 （ハ）活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、シ
スチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシ
ン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン
及びアルギニンの存在が認められる。
法、還元状態） 34,000±2,000 等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電気
泳動法） 4.7±0.1 安定性 （イ）50℃、30分加熱処理で失活 （ロ）pH4〜10で安定 （ハ）血漿中37℃、30分で安定 血液凝固系に対する作用 （イ）カルシウム再加凝固時間を延長 （ロ）プロトロンビン時間を延長 （ハ）活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、シ
スチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシ
ン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン
及びアルギニンの存在が認められる。
また、CPB−Ｉはヒト又は動物のCPB−Ｉをコードする
遺伝子断片を用いて、遺伝子組換え技術により大腸菌で
発現させることができる（特開昭64−20095号公報）。
このように遺伝子組換えにより得られたCPB−Ｉ（以
下、これを「リコンビナントCPB−Ｉ」という）は下記
のアミノ酸配列を有する。
遺伝子断片を用いて、遺伝子組換え技術により大腸菌で
発現させることができる（特開昭64−20095号公報）。
このように遺伝子組換えにより得られたCPB−Ｉ（以
下、これを「リコンビナントCPB−Ｉ」という）は下記
のアミノ酸配列を有する。
また、リコンビナントCPB−Ｉは大腸菌以外にも酵母
を使用しても製造することができる（特開平３−219875
号公報）。
を使用しても製造することができる（特開平３−219875
号公報）。
斯くして得られたCPB−Ｉ及びリコンビナントCPB−Ｉ
は皮膚・角膜疾患治療作用を有する。
は皮膚・角膜疾患治療作用を有する。
例えば、CPB−Ｉ又はリコンビナントCPB−Ｉの創傷に
対する治療作用をヒト皮膚組織由来の培養細胞を用いて
検討したところ、これらはケラチノサイトの伸展を促進
し、またケラチノサイト及び血管内皮細胞に対してはフ
ィブロネクチンに匹敵又は同等の接着因子としての作用
を有する。また、ラット皮膚の欠損創に用いた場合は、
表皮及び肉芽の新生を促進する。
対する治療作用をヒト皮膚組織由来の培養細胞を用いて
検討したところ、これらはケラチノサイトの伸展を促進
し、またケラチノサイト及び血管内皮細胞に対してはフ
ィブロネクチンに匹敵又は同等の接着因子としての作用
を有する。また、ラット皮膚の欠損創に用いた場合は、
表皮及び肉芽の新生を促進する。
これらの結果よりCPB−Ｉ及びリコンビナントCPB−Ｉ
は創傷においては、表皮新生を促進し、ひいては、肉芽
の新生を促し、全体的な治癒促進を示すと考えられ、ま
た従来の創傷治癒物質とは、その作用機序も異なると考
えられる。
は創傷においては、表皮新生を促進し、ひいては、肉芽
の新生を促し、全体的な治癒促進を示すと考えられ、ま
た従来の創傷治癒物質とは、その作用機序も異なると考
えられる。
また、従来の創傷治癒物質は、皮膚の創傷だけでな
く、角膜の創傷にも使用されており、また、角膜は発生
学的に構築する細胞の種類も皮膚と類似している（上
皮、実質及び内皮細胞）ことからCPB−Ｉの作用が期待
できる。
く、角膜の創傷にも使用されており、また、角膜は発生
学的に構築する細胞の種類も皮膚と類似している（上
皮、実質及び内皮細胞）ことからCPB−Ｉの作用が期待
できる。
そこで、ウサギの培養角膜内皮細胞を用いて、CPB−
Ｉの伸展・接着に対する作用を検討した。伸展において
は、EGFやフィブロネクチンに匹敵する効果が認めら
れ、またEGFとの併用効果も認められ、作用機序がEGFと
異なることも示唆された。また、接着に対する効果はフ
ィブロネクチンには及ばないものの、接着作用を有する
ことも認められた。以上のことから、CPB−Ｉを角膜移
植時、ドナー角膜片用の保存液に添加することにより角
膜内皮細胞の維持や、白内障手術時の眼内潅流液や前房
内注入剤に添加することにより、角膜内皮細胞の保護や
創傷治癒を、ひいては角膜の治癒を促進することが期待
できる。
Ｉの伸展・接着に対する作用を検討した。伸展において
は、EGFやフィブロネクチンに匹敵する効果が認めら
れ、またEGFとの併用効果も認められ、作用機序がEGFと
異なることも示唆された。また、接着に対する効果はフ
ィブロネクチンには及ばないものの、接着作用を有する
ことも認められた。以上のことから、CPB−Ｉを角膜移
植時、ドナー角膜片用の保存液に添加することにより角
膜内皮細胞の維持や、白内障手術時の眼内潅流液や前房
内注入剤に添加することにより、角膜内皮細胞の保護や
創傷治癒を、ひいては角膜の治癒を促進することが期待
できる。
一方、慢性皮膚疾患である乾癬は、未だその発生機序
が明らかになっていないためにモデル動物が存在しな
い。しかし、マウスの皮膚に発癌物質であるTPAを塗布
すれば、乾癬様所見を示し、生化学的側面からはPKCの
活性化、アラキドン酸及びプロスタグランジンの遊離の
増大、オルニチンデヒドロゲナーゼ及びトランスグルタ
ミナーゼ活性の誘導、及びインターロイキン１の増大が
生じることが知られている。また、ケラチノサイトの培
養は、低濃度のカルシウム（＜0.15mM）で行うが、カル
シウム濃度を1mM以上にすると、数日のうちに角化する
ことが知られている（Cell,19,245−254,1980）。この
時、細胞内カルシウム濃度が上昇し（Carcinogenesis,1
0,777−780,1989）、続いてデスモゾームが数時間で形
成されることも知られている（Cell.19,245−254,198
0）。TPAはPKCを活性化し（J.Invest.Dermatol.,92,175
−178,1989）、培養ケラチノサイトに対しては、一部の
細胞のみ角化させ、他の細胞には増殖促進作用を示すこ
と（Cancer Res.,42,2344−2349,1982）が知られてお
り、マウスの皮膚に対する作用と一致している。
が明らかになっていないためにモデル動物が存在しな
い。しかし、マウスの皮膚に発癌物質であるTPAを塗布
すれば、乾癬様所見を示し、生化学的側面からはPKCの
活性化、アラキドン酸及びプロスタグランジンの遊離の
増大、オルニチンデヒドロゲナーゼ及びトランスグルタ
ミナーゼ活性の誘導、及びインターロイキン１の増大が
生じることが知られている。また、ケラチノサイトの培
養は、低濃度のカルシウム（＜0.15mM）で行うが、カル
シウム濃度を1mM以上にすると、数日のうちに角化する
ことが知られている（Cell,19,245−254,1980）。この
時、細胞内カルシウム濃度が上昇し（Carcinogenesis,1
0,777−780,1989）、続いてデスモゾームが数時間で形
成されることも知られている（Cell.19,245−254,198
0）。TPAはPKCを活性化し（J.Invest.Dermatol.,92,175
−178,1989）、培養ケラチノサイトに対しては、一部の
細胞のみ角化させ、他の細胞には増殖促進作用を示すこ
と（Cancer Res.,42,2344−2349,1982）が知られてお
り、マウスの皮膚に対する作用と一致している。
そこで、CPB−Ｉ及びリコンビナントCPB−Ｉの乾癬に
対する治療作用は、生物学的側面から培養ヒトケラチノ
サイトを用いて検討した。すなわち、CPB−Ｉ又はリコ
ンビナントCPB−Ｉの細胞内PKC活性に対する作用及びTP
AによるPKC活性化に対する作用を検討したところ、これ
らは可溶性PKC活性を減少させ、また、TPAによるPKCの
活性化を抑制した。
対する治療作用は、生物学的側面から培養ヒトケラチノ
サイトを用いて検討した。すなわち、CPB−Ｉ又はリコ
ンビナントCPB−Ｉの細胞内PKC活性に対する作用及びTP
AによるPKC活性化に対する作用を検討したところ、これ
らは可溶性PKC活性を減少させ、また、TPAによるPKCの
活性化を抑制した。
CPB−Ｉ及びリコンビナントCPB−Ｉの乾癬治療におけ
る作用機序は明らかではないが、従来の乾癬治療剤であ
るサイクロスポリンＡはPKC活性には影響を与えない
（J.Invest.Dermatol.,93,379−386,1989）ことを考慮
すると、これらは従来とは異なる作用機序を有している
と推察される。
る作用機序は明らかではないが、従来の乾癬治療剤であ
るサイクロスポリンＡはPKC活性には影響を与えない
（J.Invest.Dermatol.,93,379−386,1989）ことを考慮
すると、これらは従来とは異なる作用機序を有している
と推察される。
従って、CPB−Ｉ及びリコンビナントCPB−Ｉはそれぞ
れ単独でも皮膚・角膜疾患治療に用いることができる
が、他の皮膚・角膜疾患治療剤と併用して用いることに
より、更なる効果の増大が期待できる。
れ単独でも皮膚・角膜疾患治療に用いることができる
が、他の皮膚・角膜疾患治療剤と併用して用いることに
より、更なる効果の増大が期待できる。
CPB−Ｉ及びリコンビナントCPB−Ｉは本発明の皮膚・
角膜疾患治療剤中100gに対して0.01〜100mg、特に１〜1
00mgの範囲で配合されることが好ましい。
角膜疾患治療剤中100gに対して0.01〜100mg、特に１〜1
00mgの範囲で配合されることが好ましい。
本発明の皮膚・角膜疾患治療剤の剤形は、通常製剤に
用いられるものであれば特に限定されず、緩衝溶液、ゲ
ル、クリーム、軟膏、点眼液、眼軟膏等の形態とするこ
とができる。
用いられるものであれば特に限定されず、緩衝溶液、ゲ
ル、クリーム、軟膏、点眼液、眼軟膏等の形態とするこ
とができる。
ドナー角膜片用の保存液としては、例えば、現在使用
されているEP−II（科研製薬（株）製）にCPB−Ｉを添
加した形態で用いることができる。また、眼内潅流液や
前房内注入剤としては、例えば、現在それぞれ使用され
ているOpegard MA（千寿製薬社製）、BSS（アルコンラ
ボ社製）、BSS Plus（アルコンラボ社製）やヒアルロン
酸ナトリウム水溶液等にCPB−Ｉを添加した形態で用い
ることができる。
されているEP−II（科研製薬（株）製）にCPB−Ｉを添
加した形態で用いることができる。また、眼内潅流液や
前房内注入剤としては、例えば、現在それぞれ使用され
ているOpegard MA（千寿製薬社製）、BSS（アルコンラ
ボ社製）、BSS Plus（アルコンラボ社製）やヒアルロン
酸ナトリウム水溶液等にCPB−Ｉを添加した形態で用い
ることができる。
実施例 以下に試験例及び実施例を挙げて本発明を更に詳細に
説明する。
説明する。
尚、本試験例及び実施例においてCPB−Ｉは特開昭62
−174023号の実施例１で得られたものを、またリコンビ
ナントCPB−Ｉは特開昭64−20095号の実施例４で得られ
たものを使用した。
−174023号の実施例１で得られたものを、またリコンビ
ナントCPB−Ｉは特開昭64−20095号の実施例４で得られ
たものを使用した。
試験例１ 伸展に対する作用 （１）正常ヒト表皮角化細胞（HNEK）、（２）正常ヒ
ト血管内皮細胞（HUVEC）、（３）ヒト胎児肺由来線維
芽細胞（Flow2000）及び（４）ウサギ角膜内皮細胞〔Ne
w Zealand White Rabbitの角膜から、Raymond G.M.らの
方法（Raymond G.M.et al.,Invest.Ophthalmol.Vis.Sc
i.,27:474−479（1986））に従って培養した〕を、それ
ぞれウシ下垂体エキス（BPE）を含む角化細胞増殖培地
（KGM）（Clonetics社製）、内皮細胞増殖培地（EGM）
（Clonetics社製）、10％ウシ胎児血清（FCS）を含むEa
gle's Minimum Essential Medium（E'MEM）及び10％FCS
と10ng/mlのマウスEGFを含むMedium 199中でコンフルエ
ントになるまで培養した。そして、中心線から半面の細
胞をrubberpolicemanで掻き取り、それぞれの培養液で
ウェルを洗浄後、CPB−Ｉを含む培養液に交換し、交換
日、２日後にそれぞれのウェルを顕微鏡下録画した。録
画面上にて、HNEK及びウサギ角膜内皮細胞では伸展した
細胞の切線からの距離、HUVEC及びFlow2000では切線か
らのある距離内に存在する伸展した細胞数を計測した。
ウサギ角膜内皮細胞についての結果を表１に、他の細胞
についての結果を図１に示す。
ト血管内皮細胞（HUVEC）、（３）ヒト胎児肺由来線維
芽細胞（Flow2000）及び（４）ウサギ角膜内皮細胞〔Ne
w Zealand White Rabbitの角膜から、Raymond G.M.らの
方法（Raymond G.M.et al.,Invest.Ophthalmol.Vis.Sc
i.,27:474−479（1986））に従って培養した〕を、それ
ぞれウシ下垂体エキス（BPE）を含む角化細胞増殖培地
（KGM）（Clonetics社製）、内皮細胞増殖培地（EGM）
（Clonetics社製）、10％ウシ胎児血清（FCS）を含むEa
gle's Minimum Essential Medium（E'MEM）及び10％FCS
と10ng/mlのマウスEGFを含むMedium 199中でコンフルエ
ントになるまで培養した。そして、中心線から半面の細
胞をrubberpolicemanで掻き取り、それぞれの培養液で
ウェルを洗浄後、CPB−Ｉを含む培養液に交換し、交換
日、２日後にそれぞれのウェルを顕微鏡下録画した。録
画面上にて、HNEK及びウサギ角膜内皮細胞では伸展した
細胞の切線からの距離、HUVEC及びFlow2000では切線か
らのある距離内に存在する伸展した細胞数を計測した。
ウサギ角膜内皮細胞についての結果を表１に、他の細胞
についての結果を図１に示す。
その結果、CPB−Ｉは角膜内皮細胞の伸展を促進させ
る効果を有し、EGFとの併用効果も認められた。また図
１よりCPB−ＩはHNEKの伸展を促進させることがわか
る。
る効果を有し、EGFとの併用効果も認められた。また図
１よりCPB−ＩはHNEKの伸展を促進させることがわか
る。
試験例２ 接着に対する作用 CPB−Ｉ、フィブロネクチン（Fibronectin）又はウシ
血清アルブミン（BSA）でコーティングしたプレート
に、それぞれKGM、MCDB151、E'MEN及びMedium 199に懸
濁したHNEK、HUVEC、Flow2000及びウサギ角膜内皮細胞
をウェル当り1000個播種し、各時間にハンクス緩衝液で
ウェルに接着していない細胞を洗い去り、20％中性緩衝
ホルマリン液で固定後へマトキシリン・エオジン（H.
E.）染色し、顕微鏡下、接着している細胞数を計測し
た。ウサギ角膜内皮細胞についての結果を表２に、他の
細胞についての結果を図２に示す。
血清アルブミン（BSA）でコーティングしたプレート
に、それぞれKGM、MCDB151、E'MEN及びMedium 199に懸
濁したHNEK、HUVEC、Flow2000及びウサギ角膜内皮細胞
をウェル当り1000個播種し、各時間にハンクス緩衝液で
ウェルに接着していない細胞を洗い去り、20％中性緩衝
ホルマリン液で固定後へマトキシリン・エオジン（H.
E.）染色し、顕微鏡下、接着している細胞数を計測し
た。ウサギ角膜内皮細胞についての結果を表２に、他の
細胞についての結果を図２に示す。
表２及び図２よりCPB−Ｉは明確な細胞接着作用を有
していることがわかる。
していることがわかる。
試験例３ ラット欠損創に対する作用 ８週齢のWister系雄性ラットをエーテル麻酔し、背部
を電気カミソリで剃毛した後、トレパン（夏目製作所）
にて直径9mmの皮膚を切除することにより、欠損創を作
製した。この欠損部位に欠損創製作日より４日間、朝夕
２回CPB−Ｉのリン酸緩衝液（PBS）（対照群ではPBS）
を50μｌ塗布した。欠損創作製４日後に背部皮膚を切り
取り10％中性緩衝ホルマリン液で固定した後、欠損中心
部を通る横断面パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリ
ン・エオジン（H.E.）染色組織標本を作製した。H.E.染
色組織標本の顕微鏡下写真撮影を行い、23倍に拡大し再
生表皮の長さを測定した。新生肉芽の面積は、23倍に拡
大した写真を複写後、新生肉芽部分を切り取り、その重
量を測定して、算出した。肉芽中の新生血管数は顕微鏡
下、計測した。その結果を表３に示す。
を電気カミソリで剃毛した後、トレパン（夏目製作所）
にて直径9mmの皮膚を切除することにより、欠損創を作
製した。この欠損部位に欠損創製作日より４日間、朝夕
２回CPB−Ｉのリン酸緩衝液（PBS）（対照群ではPBS）
を50μｌ塗布した。欠損創作製４日後に背部皮膚を切り
取り10％中性緩衝ホルマリン液で固定した後、欠損中心
部を通る横断面パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリ
ン・エオジン（H.E.）染色組織標本を作製した。H.E.染
色組織標本の顕微鏡下写真撮影を行い、23倍に拡大し再
生表皮の長さを測定した。新生肉芽の面積は、23倍に拡
大した写真を複写後、新生肉芽部分を切り取り、その重
量を測定して、算出した。肉芽中の新生血管数は顕微鏡
下、計測した。その結果を表３に示す。
表３よりCPB−Ｉは表皮を再生させ、肉芽を新生させ
ることがわかる。
ることがわかる。
試験例４ PKC活性に対する作用 HNEKを70〜80％コンフルエントになるまで培養後、CP
B−Ｉを含むKGM培地に交換し、図３に示した量のCPB−
Ｉを添加し、30分培養後細胞を採取し、ホモゲナイズ
後、可溶性画分と膜画分に分け、PKC assay system（Am
ersham社製）を用いて、PKC活性を測定した。３回試験
した平均値を図３に示す。図３よりCPB−ＩはPKC活性を
低下させることがわかる。
B−Ｉを含むKGM培地に交換し、図３に示した量のCPB−
Ｉを添加し、30分培養後細胞を採取し、ホモゲナイズ
後、可溶性画分と膜画分に分け、PKC assay system（Am
ersham社製）を用いて、PKC活性を測定した。３回試験
した平均値を図３に示す。図３よりCPB−ＩはPKC活性を
低下させることがわかる。
試験例５ PKC活性化に対する作用 HNEKを70〜80％コンフルエントになるまで培養後、CP
B−Ｉ（10μg/ml）を含むKGM培地で30分培養後、10ng/m
lのTPAを加え、図４に示した時間培養後細胞を採取し、
ホモゲナイズ後、可溶性画分と膜画分に分け、PKC assa
y system（Amersham社製）を用いて、PKC活性を測定し
た（図４）。
B−Ｉ（10μg/ml）を含むKGM培地で30分培養後、10ng/m
lのTPAを加え、図４に示した時間培養後細胞を採取し、
ホモゲナイズ後、可溶性画分と膜画分に分け、PKC assa
y system（Amersham社製）を用いて、PKC活性を測定し
た（図４）。
図４よりCPB−ＩはTPAによるPKC活性化を抑制するこ
とがわかる。
とがわかる。
実施例１ 下記組成のクリーム配合剤を常法により製造した。
（組成） CPB−Ｉ １〜100mg 白色ワセリン 4.0g 軽質流動パラフィン 6.0g セタノール 3.0g ステアリルアルコール 3.0g ミリスチン酸イソプロピル 4.0g 乳化剤 3.5g 精製水 全量 100.0g また、CPB−ＩのかわりにリコンビナントCPB−Ｉを使
用して、同様なクリーム配合剤を製造した。
用して、同様なクリーム配合剤を製造した。
実施例２ 下記組成のゲル配合剤を常法により製造した。
（組成） CPB−Ｉ １〜100mg カルボキシビニルポリマー 0.5g メチルセルロース 0.2g グリセリン 5.0g 水酸化ナトリウム 適量 精製水 全量 100.0g また、CPB−ＩのかわりにリコンビナントCPB−Ｉを使
用して、同様なゲル配合剤を製造した。
用して、同様なゲル配合剤を製造した。
実施例３ 下記組成の眼軟膏を常法により製造した。
（組成） CPB−Ｉ １〜100mg 精製ラノリン 10.0g 白色ワセリン 全量 100.0g また、CPB−ＩのかわりにリコンビナントCPB−Ｉを使
用して、同様な眼軟膏を製造した。
用して、同様な眼軟膏を製造した。
実施例４ 下記組成の点眼剤を常法により製造した。
（組成） CPB−Ｉ １〜100mg 10％塩化ベンザルコニウム液 0.05ml 等張リン酸緩衝液（pH7.4） 全量 100.0g また、CPB−ＩのかわりにリコンビナントCPB−Ｉを使
用して、同様な点眼剤を製造した。
用して、同様な点眼剤を製造した。
産業上の利用可能性 本発明皮膚・角膜疾患治療剤の有効成分であるCPB−
Ｉ及びリコンビナントCPB−Ｉは、優れた肉芽の新生促
進作用及び角膜内皮細胞、表皮細胞等の伸展作用を有
し、PKC活性を低下させる作用を有する。また、従来の
皮膚・角膜疾患治療剤とは異なる作用機序を有するた
め、併用が可能であり、治療効果の向上が期待できる。
Ｉ及びリコンビナントCPB−Ｉは、優れた肉芽の新生促
進作用及び角膜内皮細胞、表皮細胞等の伸展作用を有
し、PKC活性を低下させる作用を有する。また、従来の
皮膚・角膜疾患治療剤とは異なる作用機序を有するた
め、併用が可能であり、治療効果の向上が期待できる。
従って、本発明の皮膚・角膜疾患治療剤は、あらゆる
皮膚や角膜の疾患、特に創傷及び乾癬の治療に対して極
めて有用なものである。
皮膚や角膜の疾患、特に創傷及び乾癬の治療に対して極
めて有用なものである。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−5869（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 38/00 - 38/42 A61P 17/00 - 17/16 A61P 27/00 - 27/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】CPB−Ｉ若しくはリコンビナントCPB−Ｉを
有効成分とする皮膚・角膜創傷治療剤又は乾癬治療剤。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-314648 | 1990-11-20 | ||
| JP31464890 | 1990-11-20 | ||
| PCT/JP1991/001587 WO1992008475A1 (fr) | 1990-11-20 | 1991-11-19 | Agent therapeutique pour la peau ou contre les maladies corneennes |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3126733B2 true JP3126733B2 (ja) | 2001-01-22 |
Family
ID=18055860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03518024A Expired - Fee Related JP3126733B2 (ja) | 1990-11-20 | 1991-11-19 | 皮膚・角膜疾患治療剤 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0558751B1 (ja) |
| JP (1) | JP3126733B2 (ja) |
| KR (1) | KR100191192B1 (ja) |
| AT (1) | ATE189393T1 (ja) |
| CA (1) | CA2096520C (ja) |
| DE (1) | DE69131964T2 (ja) |
| DK (1) | DK0558751T3 (ja) |
| ES (1) | ES2143467T3 (ja) |
| GR (1) | GR3033157T3 (ja) |
| WO (1) | WO1992008475A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ511762A (en) | 1993-07-19 | 2003-09-26 | Univ British Columbia | Anti-angiogenic compositions and methods of use |
| US20030203976A1 (en) * | 1993-07-19 | 2003-10-30 | William L. Hunter | Anti-angiogenic compositions and methods of use |
| US5698533A (en) * | 1994-07-26 | 1997-12-16 | Kang; Meng-Che | Ophthalmic pharmaceutical composition |
| JPH0848634A (ja) * | 1994-08-05 | 1996-02-20 | Akio Okamoto | 角膜治療剤 |
| US5534261A (en) * | 1995-01-17 | 1996-07-09 | University Of Southern California | Retinoid-based compositions and method for preventing adhesion formation using the same |
| ATE470449T1 (de) * | 2000-08-10 | 2010-06-15 | Santen Pharmaceutical Co Ltd | Förderer der hautwundheilung |
| US20090291086A1 (en) * | 2001-02-21 | 2009-11-26 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and Methods for Treating Cerebral Thrombosis and Global Cerebral Ischemia |
| EP1839670A3 (en) * | 2001-02-21 | 2009-11-11 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Modified Annexin Proteins and their use against thrombosis |
| US7635676B2 (en) * | 2001-02-21 | 2009-12-22 | Alavita Pharmaccuticals, Inc. | Modified annexin proteins and methods for their use in organ transplantation |
| US7635680B2 (en) * | 2001-02-21 | 2009-12-22 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Attenuation of reperfusion injury |
| US20050222030A1 (en) * | 2001-02-21 | 2005-10-06 | Anthony Allison | Modified annexin proteins and methods for preventing thrombosis |
| US7645739B2 (en) * | 2001-02-21 | 2010-01-12 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Modified annexin compositions and methods of using same |
| CN1267150C (zh) * | 2001-02-26 | 2006-08-02 | 兴和株式会社 | 滴眼剂 |
| AU2003903896A0 (en) * | 2003-07-28 | 2003-08-07 | Queensland University Of Technology | Skin regeneration system |
| CA2720280C (en) | 2008-04-01 | 2018-02-20 | Mosamedix B.V. | Annexin a5 for reducing scar formation in wound healing |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1265446A (en) * | 1985-09-30 | 1990-02-06 | Masahiro Maki | Anticoagulating substance, process for preparing same and anticoagulant comprising same as an effective component |
| JPH0764878B2 (ja) * | 1986-10-14 | 1995-07-12 | 興和株式会社 | 抗血液凝固物質及びその製法 |
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| JPH06799B2 (ja) * | 1987-04-02 | 1994-01-05 | 帝人株式会社 | 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白 |
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| US5179081A (en) * | 1988-07-21 | 1993-01-12 | Kowa Co., Ltd. | Method of treatment using an anticoagulant polypeptide |
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- 1991-11-19 US US08/050,330 patent/US5360789A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-19 CA CA002096520A patent/CA2096520C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-19 DK DK91919800T patent/DK0558751T3/da active
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- 1991-11-19 WO PCT/JP1991/001587 patent/WO1992008475A1/ja active IP Right Grant
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- 1997-11-19 KR KR1019930701416A patent/KR100191192B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-04-04 GR GR20000400850T patent/GR3033157T3/el not_active IP Right Cessation
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