KR100191192B1 - 피부.각막 질환 치료제 - Google Patents

Abstract

CPB-I 또는 재조합 CPB-I를 유효성분으로 하는 피부각막질환치료제, 이 CPB-I 및 재조합 CPB-I은 우수한 육아의 신생촉진작용 및 각막내피세포, 표피세포 등의 늘림 작용을 가지며 활성을 저하시키는 작용을 갖고 있기 때문에 병용이 가능하며, 치유효과의 향상이 기대된다.

따라서, 본 발명 약제는 모든 피부나 각막의 질환, 특히 창상 및 건선의 치료에 대하여 극히 유용한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

피부·각막 질환 칠료제

[기술분야]

본 발명은 피부·각막질환 치료제, 더 상세히는 CPB-I 또는 재조합 CPB-I를 유효성분으로 하고 창상(創傷)이나 건선 등의 피부나 각막 질환의 치료에 유용한 피부·각막·질환 치료제에 관한 것이다.

[배경기술]

종래, 피부나 각막 등의 질환, 특히 창상에 대한 치유효과를 갖는 수많은 물질이 제공되고 있다. 예를 들면, 표피성장인자(EGF)(Exp. Cell Res., 164, 1-10, 1986), 산성 및 염기성 선유아세포성장인자(acid 및 basic FGF) (J. surg. Res., 45, 145-153, 1988), 형질전환인자(TGF-α 및 TGF-β)(일본국 특개평 2-167231호 공보, Science, 233,532-534, 1986)및 인슈린 모양 성장인자 (IGF-I 및 II)등의 성장인자(BIO/Technology, 135-140, 1985), 피브로넥틴, 라미린, 비트로넥틴(Ann. Rev. Biochem, 52, 961, 1983)등의 접착인자, 레티노이드 및 유사화합물(Am. J. OphtHalmol., 95, 353-358, 1983; Ann. Ophthal., 19, 175-180, 1987)등의 화학물질이 알려져 있다. 피부의 창상 치유과정에서는 육아(肉芽)의 신생, 맥관형성 및 표피의 신생을 수반하나, 각각 선유아세포(線維芽細胞), 혈관내피세포, 표피세포(케라티노사이트)의 증식 및 늘림이 필요하고 상술한 인자나 화학물질의 유효성이 알려져 있다.

각막의 상피, 실질 및 내피의 치유과정에서는 각각 상피세포의 늘림·증식, 실질세포의 노페물의 빈식(貧食)·세포외 매트릭스의 산생, 내피 세포의 늘림을 수반한다.

근래, 백내장치료 수술, 각막이식 및 콘택트랜즈의 착용에 의한 내피 세포의 장해가 관찰되며, 내피세포의 중요성이 지적되고 있다. 사람의 내피세포는 증식하지 않든가, 또는 증식하기 어렵다고 말하고 있으며, 치유과정에서는 세포의 늘림·접착이 중요하다. 현재, 증식능을 갖는 토끼는 배양내피세포를 사용하여 EGF나 FGF가 증식을 촉진시킨다고 보고되어 있으나, 유효한 치료약은 아직 발견되지 않고, 내피세포의 늘림·접착을 촉진하는 약제가 요망되고 있다.

한편, 피부질환, 특히 만성피부질환인 건선의 임상현상으로서는 백혈구의 침윤(J. Invest, dermatol., 68, 43-50, 1977), 표피의 비후(J. Invest. Dermatrol., 50, 254-258, 1968)및 불완전 각화(J. Invest, Dermatol., 70, 294-297-1978)가, 또한 생화학적 소견으로는 건선모양의 소견을 나타내는 발암물질인 포르보르에스테르(TPA)를 도포한 마우스의 피부의 연구에 의해 프로테인키나제(PKC) 활성화(J. Invest. Dermatol., 93, 379-386, 1989), 아라키돈 산 및 프로스타그란딘의 유리의 증대(Biochem. Biopyhs. Res. Commun., 92, 749-756, 1980), 오르니텐데히드로키나제 및 트랜스글타미나제 활성의 유도(Cancer Res., 39, 4183-4188, 1979; Biochem. Biophys,. Res. Commun., 97, 700-708, 1980) 및 인터로이킨 1의 증대(J. Invest. Dermatol., 88, 499A, 1987)알려져 있다.

이러한 건선의 국소적 치료는 스테로이드 연고, PUVA 요법이, 전신적 치료에는 식이요법, 비타민 D₂, 비타민 B₁₂, 에톨레티노이드 등이 알려져 있다. 또한, 최근에는 케라티노사이트의 항증식작용을 갖는 TGF-β(일본국 특개평 2-167231호 공보)나 항염증작용을 갖는 사이클로스폴린A (JAMA, 256-3110-3116, 1986)가 건선치료약으로서 연구되고 있으나, 이들의 작용기전은 아직 알려져 있지 않다.

창상이나 건선 등의 피부 각막 질환의 치료악으로서는 전술한 인자나 화학물질등이 알려져 있으나, 그의 효과는 아직 만족한 것은 아니었다.

또한, 종래의 치료제의 치료효과를 증대시켜 피부 각막질환을 조기치유 또는 완치하기 위하여는 작용기전이 다른 치료제를 병용하는 것이 고려되나, 아직 만족스러운 것은 얻어지지 않았다.

[발명이 해결하고자 하는 과제]

따라서, 본 발명의 목적은 종래의 약물과는 다른 작용기전을 가지며, 또한 우수한 치료효과를 갖는 피부·각막질환치료제를 제공하는 것이다.

이러한 실상에 있어서 본 발명자들은 예의 연구한 결과, 항혈액 응고 물질인 CPB-I가 우수한 피부 각막질환 치료 작용을 가지며, 또한 작용기전은 종래의 약물과는 다른 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 CPB-I 또는 재조합 CPB-I를 유효성분으로 하는 피부각막질환치료제의 관한 것이다.

[도면의 간단한 설명]

제1도의 (1)~(3)은 각각 시험예 1에서 HNEK, HUVEC 및 Flow2000의 늘림에 대한 작용에 대해서의 시험결과를 나타낸 도면이다.

제2도의 (1)~(3)은 각각 시험예 2에서 Flow 2000, HUVEC 및 HNEK의 접착에 대한 작용에 대해서의 시험결과를 나타낸 도면이다.

제3도는 시험예 4에서 PKC 활성에 대한 작용에 대해서의 시험결과를 나타낸 도면이다.

제4는 시험혜 5에서 PKC 활성에 대한 작용에 대해서의 시험결과를 나타낸 도면이다.

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

본 발명 피부·각막질환치료제의 유효성분인 CPB-I은 사람태반을 비롯하여 생체내의 조직 및 분배액에 널리 분포하고(Chem. Pharma. Bull, 38, 1957-1960, 1990), 또한 세포내에서는 세포질에 존재하는 항혈액 응고작용 등의 생리활성을 갖는 물질이다.

CPB-I는 사람 또는 동물의 장기에서 추출할 수 있고 (일본국 특개소 62-174023호 공보), 이와 같이 하여 얻어진 CPB-I은 다음의 성질을 갖는다.

① 분자량(SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법, 환원상태) 34,000±2,000

② 등전점(암포라이트를 사용한 등전점 컬럼 전기 영동법) 4.7±0.1

③ 안정성

(i) 50℃, 30분 가열처리하여 실활.

(ii) pH 4~10에서 안정

(iii) 혈장중 37℃, 30분에서 안정

④ 혈액응고계에 대한 작용

(i) 칼슘제가 응고시간을 연장

(ii) 프로트롬빈시간을 연장

(iii) 활성화부분 트롬보플라스틴 시간을 연장

⑤ 아미노산 분석

아미노산 분석에서 아스파라긴산, 쓰레오닌, 세린, 글루타민산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 스시틴, 바린, 메타오닌, 이소로이신, 로이신, 티로신, 페닐알라닌, 히스티딘, 리진 및 알기닌의 존재가 관찰되었다.

또한 CPB-I은 사람 또는 동물의 CPB-I를 코드하는 유전자 단편을 사용하여 유전자 재조합 기술에 의해 대장균에서 발현시킬 수 있다(일본국 특개소 64-20095호,. 이와 같은 유전자 재조합에 의해 얻어진 CPB-I(이하, 이를 [재조합 CPB-I]이라 한다)는 다음 아미노산 배열을 갖는다.

또한, 재조합 CPB-I은 대장균이외에도 효모를 사용하여도 제조할 수 있다(일본국 특개평 3-219875호 공보).

이렇게 하여 얻어진 CPB-I 및 재조합 CPB-I은 피부 각막질환 치료작용을 갖는다.

예를 들면, CPB-I 또는 재조합 CPB-의 창상에 대한 치료 작용을 사람 피부조직 유래의 배양세포를 사용하여 검토한 바, 이들은 케라티노사이트의 늘림을 촉진하고, 또한 케라티노사이트 및 혈관내피세포에 대하여는 피브로넥틴에 필적 또는 동등의 접착인자로서 작용을 갖는다. 또한 랫트 피부의 결손창에 사용한 경우는 표피 및 육아의 신생을 촉진한다.

이들 결과로부터 CPB-I 및 재조합 CPB-I는 창상에 있어서는 표피신생을 촉진하고, 나아가 맥관형성 및 육아의 신생을 촉진하여 전채적인 치유촉진을 나타낸다고 고려되며,또한 종래의 창생치유물질과 그의 기전도 다르다고 생각된다.

또한, 종래의 창상치료물질은 피부의 창상 뿐 아니라 각막의 창생에도 사용되고 있으며,또한 각막은 발생학적으로 구축하는 세포의 종류도 피부와 유사한(상피, 실질 및 내피세포)것으로부터 CPB-I의 작용이 기대될 수 있다.

여기서 토끼의 배양각막 내피세포를 사용하여 CPB-I의 늘림·접착에 대한 작용을 검토했다. 늘림에 있어서는 EGF나 피브로넥틴에 필적하는 효과가 관찰되며,또한 EGF와의 병용효과도 인식되고, 작용기전도 EGF와 다른것도 시사된다. 또한 접착에 대한 효과는 피브로넥틴에는 미치지 않는 것의 접착작용을 갖는 것도 관찰되었다. 이상으로부터 CPB-I을 각막이식시,도우너 각막편용의 보존액에 첨가함으로써 각막내피세포의 유지나, 백내장 수술시의 안내관류액(眼內灌流液) 이나 전방내주입제(前房內住入劑)에 첨가함으로서 각막내피세포의 보호나 창상치료를, 나아가서는 각막의 치유를 촉진하는것이 기대될 수 있다.

한편, 만성피부질환인 건선은 아직 그의 발생기전이 밝혀져 있지 않기 때문에 모델동물이 존재하지 않는다. 그러나, 마우스의 피부에 발암물질인 TPA를 도포하면 건선과 같은 소견을 나타내고 생화학적 측면으로부터는 PKC의 활성화, 아라키돈산 및 프로스타그란딘의 유리의 증대, 오르니틴데히드로게나제 및 트랜스글루나미나제 활성의 유도 및 인터로이킨1의 증대가 생기는 것이 알려져 있다. 또한, 케라니토사이트의 배양은 저농도의 칼슘(0.15 mM)에서 수행하나, 칼슘농도를 1mM이상으로 하면 수일내 각화하는 것이 알려져 있다(Cell, 19, 245-24, 1980). 이때 세포내 칼슘농도가 상승하여(Carcinogenesis, 10, 777-780-1989), 계속하여 데스모좀이 수시간에서 형성되는 것도 알려져 있다(Cell, 19, 245-254, 1980), TRA는 PKC를 활성화하고 (J. Invest. Dermatol, 92, 175-178, 1989), 배양 케라티노사이트에 대하여는 일부세포만 각화시키고, 다른 세포에는 증식촉진작용을 나타내는 것(Cancer Res, 42, 2344-2349, 1982)알려져 있고, 마우스의 피부에 대한 작용도 일치하고 있다.

여기서 CPB-I및 재조합 CPB-I의 건선에 대한 치료작용은 생물학적 측면에서 배양사람 케라티노사이트를 사용하여 검토했다. 즉, CPB-I 또는 재조합 CPB-의 세포내 PKC 활성에 대한 작용 및 TPA에 의한 PKC 활성화에 대한 작용을 검토한 바, 이들은 가용성 PKC 활성을 감소시키고, 또한 TPA에 의한 PKC의 활성화를 억제했다.

건선치료제인 사인클로스폴린 A는 PKC활성에는 영향을 미치지 않는다. (J. Invest, Dermatol., 93, 379-386, 1989)는 것을 고려하면, CPB-I이 단독 또는 병용함으로서 건전에 대한 치유효과를 갖는 것으로 추찰된다.

따라서, CPB-I 및 재조합 CPB-I는 각각 단독으로도 피부 각막질환치료에 사용될 수 있으나, 다른 피부 각막질환치료제와 병용하여 사용함으로서 또 다른 효과의 증대가 기대될 수 있다.

CPB-I 및 재조합 CPB-I는 본 발명의 피부 각막질환 치료제중 100g에 대하여 0.01~100㎎, 특히 1~100㎎의 범위에서 배합하는 것이 바람직하다.

본 발명의 피부 각막질환치료제의 제형은 통상제제에 사용되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 완충용액, 겔, 크림, 연고, 점안액, 안연고 등의 형태로 할 수 있다.

도우너 각막편용의 보존액으로서는 예를 들면 현재 사용되고 있는 EP-II(일본, 科硏製藥(株)제)에 CPB-I을 첨가한 형태로 사용할 수 있다. 또한 안내관류액이나 전방 내주입제로서는 예를 들면, 현재 각각 사용되고 있는 Opegard MA(일본, 千壽製藥社제), , BSS(알콘라보사제), BSS Plus(알콘라보사제)나 히아루론산 나트륨 수용액에 CPB-I을 첨가한 형태로 사용할 수 있다.

[실시예]

이하 시험예 및 실시예를 들어 본 발명을 더 상세히 설명한다.

또, 본 시험예 및 실시예에서 CPB-I은 일본국 특개소 62-174023호의 실시예 1에서 얻어진 것을, 또한 재조합 CPB-I는 일본국 특개소 64-20095호의 실시예 4에서 얻어진 것을 사용했다.

[시험예 ] 늘림에 대한 작용

(1) 정상사람 표피각화세포(HNEK), (2) 정상사람 혈관내피세포(HUVEC), (3) 사람 태아 폐유래 선유아세포(Flow 2000) 및 (4) 토끼 각막내피세포 [New Zealand White Rabbit의 각막에서, Raymond G. M. 등의 방법(Raymond G. M. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 27 : 474-479(1986)에 따라서 배양했다]를 각각 소 하수체 엑기스(BPE)를 함유하는 각화세포 증식배지(KGM)(Clonetics 사제), 내피세포증색배지(EGM)(Clonetics 사제), 10% 소태아 혈청(FCS)를 함유하는 Eagle's Minimm Essential Medium (E' MEM) 및 10% FCS와 10ng/㎖재조합의 마우스 EGF를 함유하는 Medium 199중에서 콘플루어트 될 때까지 배양했다. 그리하여 중심선에서 반면의 세포를 rubber policeman으로 긁어 취하고, 각각의 배양액으로 웰을 세정한 후, 참고예 1에서 얻어진 CPB-I을 함유하는 배양액으로 교환하고, 교환일, 2일후에 각각 웰을 현미경하 녹화했다. 녹화면상에서 HNEK 및 토끼 각막내피세포에서는 늘어난 세포의 절단선으로부터의 거리, HUVEC 및 Flow 2000에서는 절단선으로부터 일정거리내에 존재하는 늘어난 세포수를 계측하였다. 토끼각막내피세포에 대한 결과를 표 1에 나타내고, 다른 세포에 대한 결과는 제1도에 나타냈다.

*1 : 마우스

*2 : 토끼 혈장 피브로넥틴[Int. J. cancer 20, 1-5 (1977)에 의해 조제]

그 결과, CPB-1은 각막 내피세포를 늘림의 촉진시키는 효과를 가지며, EGF와의 병용 효과도 관찰되었다. 또한, 제2도로부터 CPB-I을 촉진시키는 것을 알았다

[시험예 2] 접착에 대한 작용

일본국 특개소 62-174023호 공보에 기재된 방법으로 얻어진 CPB-I, 피브로넥틴(Fibronectin) 또는 소혈청 알부민(BSA)으로 코팅한 플레이트게 각각 KGM, MCDB151, E' MEM 및 Medium 199에 현탁한 HNEK, HUVED, Flow 2000 밑 토끼 각막 내피세포를 웰당 1000개 파종하고, 각시간에 헝크스 완충액으로 웰에 접착하고 있지 않은 세포를 씻어내고, 20% 중성 완충 포르말린용액으로 고정한 후 헤마톡실린 에오딘(H. E. )염색하고, 현미경하, 접착하고 있는 세포수를 계측하였다. 토끼 각막 내피세포에 대한 결과를 표 2에 다른, 세포에 대한 결과를 제2도에 나타냈다.

표 2 및 제2도로부터 CPB-I는 명확한 세로 접착작용을 갖고 있는 것을 알 수 있다.

[시험예 3 (랫트 결손창에 대한 작용)]

8주령의 Wister계 숫컷 랫트를 에테르로 마취하고, 등을 전기 면도기로 털을 깎은 후, 토래판(일본, 夏目製作所)으로 직경 9㎜의 피부를 잘라내어 결손창을 만들었다. 이 결손 부위에 결손창 제작일로부터 4일간, 조석 2회 일본국 특개소 62-1742023호 공보에 기재된 방법으로 얻어진 CPB-I의 인산완충(PBS) (대조군에서는 PBS)를 50㎕ 도포했다. 결손창 제작 4일후에 등피부를 절취하고, 10% 중성완충 포르말린액으로 고정한 후, 결손중심부를 통하는 횡단면 파라핀절편을 작제하고, 헤마톡실린 에오딘(H.E.)염색조직 표본을 작제했다. H.E.염색조직 표본의 현미경하 사진촬영하고, 23배로 확대하여 재생표피의 길이를 측정했다. 신생육아의 면적을 23배로 확대한 사진을 복사후, 신생육아 부분을 절취하고, 그의 중량을 측정하여 산출했다. 육아중의 신생혈관수는 현미경하 계측했다. 그 결과를 표 3에 나타냈다.

표 3으로부터 CPB-I은 표피를 재생시키고, 육아 및 혈관을 신생시키는 것을 알 수 있다.

[시험예 4] PKC 활성에 대한 작용

HNEK를 70~80% 콘플루언트될 때 까지 배양한 후, 일본국 특개소 62-1742023호 공보 기재된 방법으로 얻어진 CPB-I을 함유하는 KGM 배지에 교환하고, 제3도에 나타난 양의 CPB-I을 첨가하고, 30분 배양후 세포를 채취하고, 호모게나이즈한 후, 가용성 획분과 막획분으로 나누고 PKC assay system(Amersham사제)를 사용하여 PKC활성을 측정했다. 3회 시험한 평균치를 제3도에 나타냈다. 제3도로부터 CPB-I는 PKC 활성을 저하시킬 수 있음을 알 수 있다.

[시험예 5] PKC 활성에 대한 작용

HNEK를 70~80% 콘플루언트될 때 까지 배양한 후, 일본국 특개소 62-1742023호 공보 기재된 방법으로 얻어진 CPB-I(10㎕/㎖재조합)를 함유하는 KGM 배지에서 30분 배양후, 10ng/㎖재조합의 TPA를 가하고, 도면에 나타낸 시간동안 배양한 후, 세포를 채취하고 호모게나이즈한 후, 가용성 획분과 막획분으로 나누고 PKC assay system(Amersham 사제)를 사용하여 PKC활성을 측정했다(제4도).

제4도로부터 CPB-I는 TPA에 의한 PKC 활성화를 억제할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 1]

하기 조성의 크림배합제를 통상의 방법으로 제조했다

또한, CPB-I대신에 재조합 CPB-I를 사용하여 동일한 크림 배합제를 제조했다.

[실시예 2]

하기조성의 겔 배합체를 통상의 방법으로 제조했다.

또한 CPB-I대신에 재조합 CPB-I를 사용하여 동일한 겔 배합제를 제조했다.

[실시예 3]

하기 조성의 안연고를 통상의 방법으로 제조했다.

또한 CPB-I 대신에 재조합 CPB-I를 사용하여 동일한 안연고를 제조했다.

[실시예 4]

하기 조성의 점안제를 통상의 방법에 따라 제조했다.

또한 CPB-I 대신에 재조합 CPB-I을 사용하여 동일한 점안제를 제조했다.

[산업상의 이용 가능성]

본 발명 피부각막 질환 치료제의 유효성분인 CPB-I 및 재조합 CPB-I는 우수한 육아(肉芽)의 신생촉진작용 및 각막내피세포, 표피세포등의 늘림작용을 가지며 PKC 활성을 저하시키는 작용을 갖는다. 또한 종래의 피부각막 질환 치료제와는 다른 작용기전을 갖기 때문에 병용이 가능하며 치료효과의 향상이 기대될 수 있다.

따라서 본 발명의 피부각막 질환 치료제는 모든 피부나 각막의 질환, 특히 창상 및 건선의 치료에 대하여 극히 유용한 것이다.

Claims (1)

1. CPB-I 또는 재조합 CPB-I을 유효성분으로 하는 피부·각막질환 치료제.