CN108018370A - 冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。本发明以冬虫夏草菌培养液的基因组DNA为模板，采用本发明设计的检测引物组，进行2次单管特异PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的存在情况。本发明建立了一种通过常规PCR反应检测冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的携带情况，只需DNA提取、PCR扩增和电泳检测三步即可完成对样品的检测，操作简单、易于掌握、准确性高，通过本发明的方法可以进一步开发检测试剂盒。本发明为排除携带蝙蝠蛾拟青霉的冬虫夏草菌培养液提供了新的方法，为提高冬虫夏草菌对蝠蛾幼虫的侵染率及其子座形成提供技术支撑。

Description

冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂 盒和检测方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
背景技术：
冬虫夏草是冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis(Berk)侵染蝙蝠蛾科Hepialidae幼虫形成的僵虫与真菌子座复合体，与人参、鹿茸被誉为中华医学三大宝。由于其生境特殊(仅在高寒地区自然繁衍)，生长速度缓慢，周期较长，自然资源极为有限，有关部门已将冬虫夏草列为国家二级保护物种。人工培育冬虫夏草是保护生物资源和生态环境的需要，也是国民需求和市场的需要。经过30多年的研究，虽然一些研究团队已经掌握冬虫夏草菌的人工培养技术和寄主蝠蛾幼虫的规模化饲养技术，但用冬虫夏草菌侵染幼虫形成僵虫的成功率以及僵虫生长出子座的成功率都非常低。蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyceshepiali Chen et Dai是天然冬虫夏草的一种寄生菌，生长发育速度较冬虫夏草菌快，对蝠蛾幼虫的侵染力更强，即使用于侵染蝠蛾幼虫的冬虫夏草菌培养液中存在少量的蝙蝠蛾拟青霉，都会造成蝠蛾幼虫因感染蝙蝠蛾拟青霉而大量死亡，严重影响中华被毛孢成功侵染蝠蛾幼虫及其子座的形成，是目前制约冬虫夏草人工培育的瓶颈因素。因此，建立一种准确、灵敏、快速、经济的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉鉴定方法，排除携带蝙蝠蛾拟青霉的冬虫夏草菌培养液，是提高冬虫夏草人工培育成功率的一个关键因素。
关于冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉的区分鉴定，目前可以通过常规培养后镜检的菌丝和孢子形态差异来鉴定，但由于蝙蝠蛾拟青霉在纯化培养的冬虫夏草菌液中含量少或无，取样镜检不仅容易造成漏检，准确度不高，且操作费时，需要操作人员具备专业的理论和实践知识。目前尚没有专门用于检测冬虫夏草菌培养液质量的标准方法，菌液质量难以保证，极大限制了冬虫夏草人工培育产业的发展。因此，在冬虫夏草人工培育过程中，亟需一种灵敏、快速、准确的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉检测方法，以实现对冬虫夏草菌液品质的控制和管理。
发明内容：
本发明的目的是提供一种冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。利用本发明的检测引物组和检测试剂盒，按照本发明的检测方法能够准确、快速、经济的检测出冬虫夏草菌培养液中的蝙蝠蛾拟青霉，从而判定用于侵染蝠蛾幼虫的冬虫夏草菌培养液的质量，本发明具有准确、快速、经济、准确性高的优点。
本发明第一个目的是提供冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组，包括2对特异引物：
第一对特异引物：
Ph816F：5’-CCTTTTGTGAACATACCTATC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
Ph1302R：5’-GAGGTCAACGTTCAGAAGTC-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
第二对特异引物：
Ph935F：5’-GTATCTTCTGAATCCGCCGCA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
Ph1162R：5’-CCGATTTCCCCAAAGGGAAG-3’(如SEQ ID NO.4所示)。
本发明的第二个目的是提供一种冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测试剂盒，包括PCR反应试剂和检测引物组，所述的检测引物组包括2对特异引物：
第一对特异引物：
Ph816F：5’-CCTTTTGTGAACATACCTATC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
Ph1302R：5’-GAGGTCAACGTTCAGAAGTC-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
第二对特异引物：
Ph935F：5’-GTATCTTCTGAATCCGCCGCA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
Ph1162R：5’-CCGATTTCCCCAAAGGGAAG-3’(如SEQ ID NO.4所示)。
本发明的第三个目的是提供基于降低冬虫夏草菌侵染蝠蛾幼虫过程中幼虫感染蝙蝠蛾拟青霉死亡率目的的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测方法，包括以下步骤：提取待测冬虫夏草菌培养液的基因组DNA作为模板，使用上述的第一对特异引物Ph816F和Ph1302R进行第一轮PCR扩增，以稀释后的第一轮PCR扩增的PCR反应产物为模板，使用上述的第二对特异引物Ph935F和Ph1162R进行第二轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测第一轮和第二轮PCR扩增的PCR反应产物，若第一轮PCR产物在487bp处有电泳条带和第二轮PCR产物在228bp处有电泳条带，均说明冬虫夏草菌培养液中有蝙蝠蛾拟青霉，若无电泳条带，则说明冬虫夏草菌培养液中没有蝙蝠蛾拟青霉。
所述的第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，其反应体系均优选为25μL：包括10×TaqBuffer 2.5μL、2.5mM dNTPs 2μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、5U/μL高保真Taq DNA聚合酶0.5μL和模板DNA 2μL，余量用ddH2O补足至总体积25μL。
所述的第一轮PCR扩增，其反应条件优选为：94℃3～5min；94℃30sec，48℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃5～10min。
所述的第二轮PCR扩增，其反应条件优选为：94℃3～5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃5～10min。
需要说明的是，冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测方法。本发明的对象是检测纯化培养的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的存在情况，因为侵染蝠蛾幼虫的冬虫夏草菌培养液中即使存在少量的蝙蝠蛾拟青霉都会快速致死幼虫，降低冬虫夏草菌的侵染成功率和子座形成。因此，本发明通过抽取用于侵染的冬虫夏草菌培养液，提取其基因组DNA，利用蝙蝠蛾拟青霉特异引物，对蝙蝠蛾拟青霉进行检测，从而排除携带蝙蝠蛾拟青霉的冬虫夏草菌培养液，不将其作为侵染蝠蛾幼虫的母种，即节省了携带蝙蝠蛾拟青霉的冬虫夏草菌培养成本和时间，也有利于提高冬虫夏草菌的成功侵染率。
本发明建立了一种简单的单管PCR反应检测冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的方法，本发明的引物特异性强，PCR扩增条件简单，采用单管特异PCR反应后，通过电泳检测便可排除携带蝙蝠蛾拟青霉的冬虫夏草菌培养液，方法简单、快速、准确、成本低，并且通过本发明的方法可以进一步开发检测试剂盒，为提高人工培育冬虫夏草菌的侵染率，发展冬虫夏草人工培育产业提供了坚实的技术支撑。
附图说明：
图1是蝙蝠蛾拟青霉特异引物设计示意图(GenBank:EF555097.3)，其中黑色箭头指明的是第一对特异引物的位置和对应的核苷酸序列，灰色箭头指明的是第二对特异引物的位置和对应的核苷酸序列。
图2是利用本发明的检测引物组和检测方法对纯化的冬虫夏草菌、蝙蝠蛾拟青霉及两者等量杂合模板DNA的扩增结果，泳道1-3为第一对特异引物的PCR扩增电泳图(目的条带487bp)，泳道4-6为第二对特异引物的PCR扩增电泳图(目的条带228bp)；泳道1和4为冬虫夏草菌基因组DNA，泳道2和5为蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA，泳道3和6为冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉等量杂合模板DNA；M：DL2000 Marker。
图3是PCR扩增不同占比的冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉杂合模板DNA的电泳图谱验证特异引物组和检测方法的灵敏度；A为第一对特异引物的PCR扩增电泳图(目的条带487bp)，M：DL2000 Marker，泳道1：对照，虫草菌通用引物PCR扩增模板1，仅有冬虫夏草菌基因组DNA，泳道2为模板1，仅有冬虫夏草菌基因组DNA，泳道3为模板2，仅有蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA，泳道4-11依次为模板3-10，为冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA不同比例的杂合模板；B为第二对特异引物的PCR扩增电泳图(目的条带228bp)，M：DL2000 Marker，泳道1：对照，虫草菌通用引物PCR扩增模板1，仅有冬虫夏草菌基因组DNA，泳道2为模板1，仅有冬虫夏草菌基因组DNA，泳道3为模板2，仅有蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA，泳道4-11依次为模板3-10，为冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA不同比例的杂合模板。
图4是利用本发明的特异引物和检测方法对随机抽取的冬虫夏草菌培养液基因组DNA模板的扩增结果；A第一对特异引物的PCR扩增电泳图(目的条带487bp)，B为第二对特异引物的PCR扩增电泳图(目的条带228bp)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组
检测引物组包括2对蝙蝠蛾拟青霉特异引物：
第一对特异引物：
Ph816F：5’-CCTTTTGTGAACATACCTATC-3’(如图1所示)(如SEQ ID NO.1所示)；
Ph1302R：5’-GAGGTCAACGTTCAGAAGTC-3’(如图1所示)(如SEQ ID NO.2所示)；
第二对特异引物：
Ph935F：5’-GTATCTTCTGAATCCGCCGCA-3’(如图1所示)(如SEQ ID NO.3所示)；
Ph1162R：5’-CCGATTTCCCCAAAGGGAAG-3’(如图1所示)(如SEQ ID NO.4所示)。
2、PCR模板制备
取纯化培养的冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis(Berk)(中华被毛孢)菌丝和蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen et Dai菌丝各100mg于2mL Microfuge tubes中，研磨，分别按照真菌CTAB基因组提取方法和真菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA；以下列出真菌基因组DNA提取试剂盒(E.Z.N.A HP Fungal DNA Kit)步骤：
1)在研磨好的样品中，加500μL Buffer CPL混匀，再加10μL β-巯基乙醇，剧烈震荡混匀。
2)加入10μL RNase，65℃孵育15min，倒转Microfuge tubes数次。
3)取出Microfuge tubes后，加入500μL的氯仿/异丙醇(24：1)震荡混匀，在转速10000g离心5min。
4)小心吸取300μL上清液于1.5mL Microfuge tubes中，注意不要吸到沉淀。
5)加150mL Buffer CXD调整样品结合条件。随后加300μL无水乙醇，震荡混匀。
6)将全部样品(包括可能形成所有沉淀)加入HiBind DNA Columne，置于2mLcollection tube，10000g离心l min结合DNA，弃收集管及液体。
7)转移HiBind DNA Columne到新的收集管中，加入650μL SPW Wash buffer(用乙醇稀释过)，10000g离心l min，弃废液。
8)重新冲洗步骤，加入650μL SPW Wash buffer，10000g离心l min，弃废液。
9)15000g离心空的HiBind DNA Columne(放在collection tube)，以便干燥，除掉乙醇。
10)转移Column干净的1.5mL离心管，加30μL65℃预热的ddH2O，室温孵育1min，10000g离心1min，洗提DNA。
利用微量核酸分光光度计和电泳检测基因组DNA样品的浓度和质量，用ddH2O分别将冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA稀释至15ng/μL，将稀释后的冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA等体积混合得到冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉等量杂合模板。
3、巢式PCR
第一轮PCR扩增：
以第一对特异引物Ph816F和Ph1302R作为引物，分别以上述稀释后的纯化的冬虫夏草菌基因组DNA、纯化的蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA和冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉等量杂合模板作为模板进行PCR扩增。
PCR反应体系：
余下体积用ddH2O补足至总体积25μL。
反应条件：94℃3～5min；94℃30sec，48℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃5～10min。
第二轮PCR扩增：
吸取第一轮PCR扩增的PCR反应产物5μL，与195μLddH2O充分混匀，取稀释的PCR反应产物2μL作为第二轮PCR扩增的模板，以第二对特异引物Ph935F和Ph1162R作为引物进行PCR扩增，反应体系同第一轮PCR扩增，反应条件为：94℃3～5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃5～10min。
具体结果如图2所示，通过本发明的检测引物组和检测方法，通过电泳条带判断扩增目的片段大小，可以很好地区分冬虫夏草菌、蝙蝠蛾拟青霉以及两者混合样品，利用蝙蝠蛾拟青霉第一对特异引物进行PCR反应，根据PCR扩增产物电泳图结果显示，纯冬虫夏草菌487bp处无条带，而蝙蝠蛾拟青霉和两种菌的混合样本中均在487bp处有明显条带。利用蝙蝠蛾拟青霉第二对特异引物进行PCR反应结果同第一对特异引物，只是扩增目的片段的大小为228bp。由此可见，本发明的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组的特异性非常好。
实施例2：灵敏度分析
将纯化的冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉的基因组DNA，用微量核酸分光光度计和电泳检测基因组DNA样品的浓度和质量。然后根据两种菌的基因组DNA量制备10个PCR模板，见表1，分别以模板1～10作为模板进行巢式PCR扩增(同实施例1步骤3)，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的目的条带，根据条带大小证实检测引物组和检测方法的灵敏度和准确性。
第一轮PCR扩增的PCR反应产物电泳检测结果显示，当PCR模板DNA(冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA总量30ng)中蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA量只占10-5(即0.0003ng)时，反应产物目的条带清晰，当蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA量占总量的10-6(即0.00003ng)时，PCR反应产物电泳时仍可见一条模糊的带。第二轮PCR扩增的PCR反应产物电泳检测结果显示，当PCR模板DNA(冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA总量30ng)中蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA量只占10-6(即0.00003ng)时，反应产物目的条带清晰，当蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA量占总量的10-7(即0.000003ng)时，PCR反应产物电泳时可见一条模糊的带。由此可见，利用第一对特异引物或者2对特异引物结合应用，检测的灵敏度和准确度都是非常高的。结果如图3A、B所示。
表1冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉不同基因组DNA占比的PCR模板
实施例3：应用分析
本实施例随机选取16瓶冬虫夏草菌培养液，从每瓶培养液中分别取1mL菌液至2mL的离心管内，加入无菌水，8000rpm 10℃离心15min，弃洗脱液，将样品迅速置于液氮速冻，研磨，参照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，分别以16个冬虫夏草菌培养液基因组DNA作为模板进行巢式PCR扩增(同实施例1步骤3)，检测冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的存在情况。检测结果显示16个冬虫夏草菌培养液中，5号和13号瓶均检测出有蝙蝠蛾拟青霉，本发明提供的检测引物组和检测方法能够很好检测冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的存在情况。结果如图4所示。
序列表
<110> 广东省生物资源应用研究所
<120> 冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali Chen et Dai)
<400> 1
ccttttgtga acatacctat c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali Chen et Dai)
<400> 2
gaggtcaacg ttcagaagtc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali Chen et Dai)
<400> 3
gtatcttctg aatccgccgc a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali Chen et Dai)
<400> 4
ccgatttccc caaagggaag 20

Claims (6)

1.冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组，其特征在于，包括2对特异引物：
第一对特异引物：
Ph816F：5’-CCTTTTGTGAACATACCTATC-3’；
Ph1302R：5’-GAGGTCAACGTTCAGAAGTC-3’；
第二对特异引物：
Ph935F：5’-GTATCTTCTGAATCCGCCGCA-3’；
Ph1162R：5’-CCGATTTCCCCAAAGGGAAG-3’。
2.一种冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测试剂盒，包括PCR反应试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组包括2对特异引物：
第一对特异引物：
Ph816F：5’-CCTTTTGTGAACATACCTATC-3’；
Ph1302R：5’-GAGGTCAACGTTCAGAAGTC-3’；
第二对特异引物：
Ph935F：5’-GTATCTTCTGAATCCGCCGCA-3’；
Ph1162R：5’-CCGATTTCCCCAAAGGGAAG-3’。
3.基于降低冬虫夏草菌侵染蝠蛾幼虫过程中幼虫感染蝙蝠蛾拟青霉死亡率目的的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测冬虫夏草菌培养液的基因组DNA作为模板，使用权利要求1所述的第一对特异引物Ph816F和Ph1302R进行第一轮PCR扩增，以稀释后的第一轮PCR扩增的PCR反应产物为模板，使用权利要求1所述的第二对特异引物Ph935F和Ph1162R进行第二轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测第一轮和第二轮PCR扩增的PCR反应产物，若第一轮PCR产物在487bp处有电泳条带和第二轮PCR产物在228bp处有电泳条带，均说明冬虫夏草菌培养液中有蝙蝠蛾拟青霉，若无电泳条带，则说明冬虫夏草菌培养液中没有蝙蝠蛾拟青霉。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，其反应体系均为25μL：包括10×Taq Buffer 2.5μL、2.5mM dNTPs 2μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、5U/μL高保真Taq DNA聚合酶0.5μL和模板DNA 2μL，余量用ddH2O补足至总体积25μL。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的第一轮PCR扩增，其反应条件为：94℃ 3～5min；94℃ 30sec，48℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环；72℃ 5～10min。
6.根据权利要求3或5所述的检测方法，其特征在于，所述的第二轮PCR扩增，其反应条件为：94℃ 3～5min；94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环；72℃ 5～10min。
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