CN117890335B - 一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括氮掺杂碳量子点荧光探针(N‑CDs)和荧光染料碘化丙啶(PI)。所述氮掺杂碳量子点荧光探针作为新型荧光探针，以地衣芽孢杆菌为前体合成，对细菌或真菌等微生物的活体具有标记作用，具有较好的荧光成像效果，且不会影响微生物结构完整性，可以用于检测微生物的活性。本发明还提供了利用该试剂盒检测微生物活性的方法，可通过菌群位置分布，准确测定微生物活性，结合细菌计数微球后还能够得出活菌与死菌的绝对数量。

Description

一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒 及其检测方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒及其检测方法。
背景技术
细菌活性检测是医药、卫生及食品、工业生产等多个行业质量检测的重要内容，细菌的活性决定其侵袭力，因此必须严格控制微生物含量确保产品符合相关行业标准，并通过探明细菌活性情况为疾病诊断、治疗、分析提供客观依据。在传统方法上，活细菌的数量是通过平板计数法测定，其细菌活性的判定结果完全取决于细胞的繁殖能力，仅对能形成菌落的细菌进行计数，无法提供死亡细菌或存活但不可培养状态细菌的指示。此外，平板计数法由于需要培养，导致其过程耗时长(24～48h甚至更长)，无法快速获得样本中细菌活性情况。除平板计数法外，常见的细菌活性检测方法是基于PCR技术的研究，通过利用可透过细胞膜与死菌DNA结合的核酸交联剂以抑制死菌DNA扩增；或扩增仅存在于活菌中的mRNA，达到检测活菌的目的。但该方法中，死菌的DNA或mRNA很难完全从样本内完全去除，易导致结果假阳性，无法满足实际需要。因此，目前细菌活性测定仍以与单细胞技术结合检测为主，如流式细胞术、显微镜观察或分子鉴定等。其中流式细胞术由于其测量速度快(达上万个单细胞或颗粒每秒)，目标范围广(细胞、细菌或各种微粒，大小范围在0.5～50μm均可)等优点，其与荧光物质结合使用，可对细菌的结构和功能特性等多参数(如代谢活性、膜电位、膜完整性或大分子生物合成)进行单细胞水平分析，从而对细胞群体更深层的表征。
常用于流式细胞仪测定细菌活性的荧光物质主要根据细胞膜完整性或酶活力等指标检测细胞活死状态。其中，应用于死细菌检测领域的膜非渗透性荧光物质可穿过受损细菌的细胞膜并几乎无序列倾向性地与核酸结合。应用于活细菌检测的荧光物质分为两类，一类为活细菌与死细菌通用的荧光染料，其可渗透完整或破损的细菌细胞膜进入核区与DNA结合；另一类为活细菌特异性染料，其与细胞内非特异性酯酶结合。尽管这些荧光物质在细菌活性鉴定上取得了较好的应用效果，但也存在具有毒性、对菌体的染色结果受菌体生理状态和结构等因素影响。其中，菌体因对数生长期、稳定期等生理状态不同，导致菌体与染料的结合情况不同。此外，相较革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌具有双层膜结构，使得其对荧光物质的透过性可能不同，导致部分荧光物质无法透过细胞膜与细菌相应位点结合而出现荧光较低的情况。
近年来，各种发光纳米颗粒如量子点具有低毒性、良好的生物相容性、优异的荧光特性和易于功能化等优点被应用于生物标记领域。其中，氮掺杂碳量子点(N-碳量子点，N-CDs)具有独特的荧光性质，可与细胞膜结合显现出明亮荧光；同时，N-CDs具有良好的荧光稳定性，即N-CDs在室温环境长期放置、紫外照射数小时等条件处理几乎不会影响N-CDs的荧光强度。此外，当合成N-CDs采用的碳源及所用的合成方法改变时，N-CDs所获得的含氧官能团及尺寸也会相应改变。由于不同的含氧官能团可与特定场合的表面结构反应，以碳源为例，以艾草为碳源合成的氮掺杂碳量子点(N-CDs)可与细菌表面结合并反应；以酵母浸膏粉等前体合成的氮磷掺杂碳量子点(NP-CDs)因所含官能团导致其可与活细菌产生静电排斥作用无法与活细菌结合。此外，N-CDs尺寸较小，不仅易被细胞捕获，通过光子激发实现细胞成像，还可以在不干扰强的组织自发荧光情况下，深入细胞和各种生物屏障，实现探测小型生物结构和细胞成像。目前，N-CDs荧光探针仅应用于生物成像领域。然而，在生物成像领域中，荧光探针N-CDs对细菌染色时，主要探究荧光探针N-CDs对菌体的毒性，导致目前使用该荧光探针染色细菌需时较长，例如荧光探针与细菌共同孵育2h后测定；对荧光探针N-CDs与细菌的结合情况及其染色细菌后流式细胞仪检测结果准确性及活菌死菌分布则尚无探究，也尚未见N-CDs与荧光染料组合成为细菌活性检测试剂盒，且未见其与流式细胞仪结合应用的报道。
目前针对细菌活性检测的相关专利如下：
中国专利文献CN107271410A公开了一种细菌或真菌的活性快速检测方法，该专利提出了一种利用荧光分子印迹聚合物即靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体，与细菌或真菌结合测定荧光值快速初步检测细菌或真菌数量的方法，但该方法所需荧光分子印迹聚合物制备较为复杂、且荧光分子印迹聚合物与细菌或真菌为特异性识别与结合，因此对不同细菌活性进行测定时，需重新根据靶细菌制备荧光分子印迹聚合物，无法通用于所有细菌。
中国专利文献CN102967545A公开了一种检测活性细菌含量的方法，该专利提出了一种利用CTC染料与待测液体样本共孵育，通过流式细胞仪检测活性病原菌的方法。该方法可准确、快速检测样本中活细菌数量，但无法检测样本中死细菌含量，无法判断死亡细菌或其产物对样本的影响。
中国专利文献CN108603881A公开了一种检测生物样品中细菌活性的方法与相应的检测单元，该专利提出了一种利用微型气相色谱仪通过检测细菌代谢产生无机气态物质的含量检测细菌活性的方法，该方法无法检测代谢较弱及死亡细菌的数量。
中国专利文献CN114047241A公开了一种细菌活性电化学检测方法，该专利提出了一种通过水浴加热促进菌体内电活性物质释放，运用电化学方法检测细菌活性的方法。但该方法对低活性细菌响应较低、无法检测死亡细菌的数量。
目前针对细菌活性检测虽已有相关专利，但专利中所述方法依赖于菌体胞内相关酶的催化作用及相应的化学发光技术及其它辅助设备，无法计算样品中活菌与死菌数目或比例；此外，现有专利中，均未曾涉及荧光探针N-CDs结合荧光染料在细菌活性检测领域的应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒及其检测方法。特别是提供了一种活菌荧光探针N-CDs、死菌荧光染料PI结合流式细胞仪进行活菌和死菌状态及含量的检测方法。旨在克服传统微生物活性检测方法无法检测微生物的存活情况，传统荧光染料对微生物的染色效果受菌体影响较大等问题，基于地衣芽孢杆菌制备可对微生物成像且对微生物结构完整性无影响的N-CDs，建立一种流式细胞仪与荧光探针N-CDs和死菌荧光染料PI相结合，准确、快速的微生物活性鉴定方法，该方法测定结果重复性好、灵敏度高，可用于科研实验室对新型抑菌物质的评价及临床实验室开展微生物感染相关的检测。
本发明的技术方案如下：
一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒，包括氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)和荧光染料碘化丙啶(PI)。
根据本发明优选的，所述氮掺杂碳量子点荧光探针是以地衣芽孢杆菌为前体合成的氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)。
进一步优选的，所述氮掺杂碳量子点荧光探针的制备方法如下：
a)将地衣芽孢杆菌接种至LB液体培养基中，培养并收集活化后菌悬液；然后将活化后菌悬液接种至LB液体培养基中，在37℃、150～180rpm下培养12～24h，再将菌液离心并清洗2～4次后，收集菌体；
b)向步骤a)收集的菌体中添加超纯水，混合均匀后转入不锈钢高压釜的聚四氟乙烯内衬中，在180～220℃下加热10～15h，通过一步水热法制备得到含氮掺杂碳量子点荧光探针的反应溶液，然后将反应溶液冷却、过滤、冷冻干燥后，得到氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)。
最优选的，步骤a)中，所述地衣芽孢杆菌和LB液体培养基体积比为(1～4)：(500～2000)；所述活化后菌悬液和LB液体培养基的体积比为(1～4)：(500～2000)。
一种利用上述试剂盒检测微生物活性的方法，包括步骤如下：
将待检测菌活化培养，得到待检测菌液；然后将氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)加入至待检测菌液中进行第一次共孵育，再继续添加荧光染料碘化丙啶(PI)进行第二次共孵育，得到待检测体系；最后使用流式细胞仪检测待检测体系，根据流式细胞仪检测结果获得待检测菌的活性与分布。
根据本发明优选的，所述待检测菌为真菌或细菌。
进一步优选的，所述待检测菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
根据本发明优选的，所述流式细胞仪在检测前进行区域门圈定及补偿调节参数设置，具体如下：
1)利用流式细胞仪仪器标准微球校准仪器的光路和液流系统，保证仪器各项指标在仪器可用范围内；
2)上样未染色待测菌液，建立FSC和SSC散点图，设定流式细胞仪阈值为500～5000，调节FSC通道电压为200～600V、SSC通道电压为200～600V、紫外激光器激发的蓝色通道电压为200～600V、氩离子激光器激发的FL3通道电压为200～600V；
3)上样未染色待测菌液，调节N-CDs和PI荧光通道的阴性峰右边缘在102-103的位置，移动P1门圈定细胞群体并将其应用于所有结果图；
4)将氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)加入至待检测菌的活菌液中单独共孵育，得到N-CDs单染管；将荧光染料碘化丙啶(PI)加入至待检测菌活菌液与死菌液的混合菌液中单独共孵育，得到PI单染管；
5)上样N-CDs单染管，选择上样速度为“Low”，收集事件数为10000～50000events，此时其阳性峰右侧位置低于105，选中阳性区域，圈定为活菌区域门；
6)上样PI单染管，选择上样速度为“Low”，收集事件数为10000～50000events，此时其阳性峰右侧位置低于105，选中阳性区域，圈定为死菌区域门；
7)收集事件完毕后，利用流式细胞仪在Experiment菜单下，点击CompensationSetup>Calculate Compensation Controls，并在弹出的对话框中命名此补偿条件并将其应用于此Experiment下所有新建的样品管。
根据本发明优选的，所述第一次共孵育为：在20～40℃条件下共孵育30～120min；所述第二次共孵育为：在20～40℃、避光条件下共孵育10～30min。
进一步优选的，所述第一次共孵育为：在20～30℃条件下共孵育30～60min；所述第二次共孵育为：在20～30℃、避光条件下共孵育10～20min。
最优选的，所述第一次共孵育为：在25℃条件下共孵育45min；所述第二次共孵育为：在25℃、避光条件下共孵育15min。
根据本发明优选的，所述待检测体系中氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)的浓度为0.1～10mg/mL，荧光染料碘化丙啶(PI)的浓度为10～40μM。
进一步优选的，所述待检测体系中氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)的浓度为0.5～2mg/mL，荧光染料碘化丙啶(PI)的浓度为20～30μM。
最优选的，所述待检测体系中氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)的浓度为1mg/mL，荧光染料碘化丙啶(PI)的浓度为30μM。
根据本发明优选的，所述流式细胞仪检测时，紫外激光器激发的蓝色通道检测被氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)结合的活菌显示绿色荧光；氩离子激光器激发的FL3通道检测被荧光染料碘化丙啶(PI)结合的死菌显示红色荧光。
根据本发明优选的，在第一次共孵育和第二次共孵育完成后，向待检测体系中添加细菌计数微球，根据流式细胞仪检测结果，计算得到待检测菌的活菌与死菌的绝对数量。
本发明的技术特点：
本发明使用的氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)是以地衣芽孢杆菌为前体合成的，与细菌、真菌等微生物不存在静电排斥作用，该N-CDs可选择性地与细菌、真菌等微生物的细胞膜结合，对细菌、真菌等微生物的活体具有标记效果。然后本发明利用N-CDs对活菌的标记功能，使用流式细胞仪检测时，细胞群体分布于右侧椭圆内(微生物活体)；而当活菌受损或死亡后，仅可被荧光染料PI沾染，使用流式细胞仪检测时，细胞群体分布于左侧椭圆内(微生物死体)。当细菌从存活状态变为受损或死亡状态后，细胞群体位置将由右侧椭圆(微生物活体)向左侧椭圆(微生物死体)迁移，实现对微生物活性的检测。
并且本发明提供了待检测菌的活菌液和死菌液的制备方法，在检测细菌活性前用该待检测菌的活菌液和死菌液对流式细胞仪进行了区域门圈定及补偿调节参数设置，使得流式细胞仪处于最合适检测待测菌液的参数，增强检测准确度。
本发明的有益效果：
1、本发明提供了基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒，该试剂盒包括氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)和荧光染料碘化丙啶(PI)，其中N-CDs作为新型荧光探针，以地衣芽孢杆菌为前体合成，对活体微生物具有标记效果，具有较好的荧光成像效果，且不会影响微生物结构完整性，可以用于检测微生物的活性，结合细菌计数微球后还能够得出活菌与死菌的绝对数量。
2、本发明基于提供的试剂盒，结合流式细胞仪建立了检测微生物活性的方法，其中N-CDs结合PI染色细菌后可获得明显的活体微生物与死体微生物的位置分布，同时建立染色结果与细菌状态的关系，通过菌群位置分布判断微生物活性状态，准确测定微生物活性。并且本发明方法在检测前对流式细胞仪进行了区域门圈定及补偿调节参数设置，通过建立阳性对照样品菌悬液区域门参数设置以建立流式细胞仪检测方法模板，能够普遍适用于含该阳性菌株的其它待测样本，可简便、快速的检测待测样本中微生物存活情况。
3、本发明提供了基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒，以及结合流式细胞仪建立了检测微生物活性的方法广泛适用于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌等样本的检测，可应用于新型抑菌或杀菌物质的开发、临床上微生物感染检测等领域。
附图说明
图1为使用本发明试剂盒检测大肠杆菌活性的结果图。
图2为使用本发明试剂盒检测金黄色葡萄球菌活性的结果图；
图中，图a：以地衣芽孢杆菌为前体制备N-CDs与荧光染料PI组成试剂盒，检测金黄色葡萄球菌结果；图b：以大肠杆菌为前体制备N-CDs与荧光染料PI组成试剂盒，检测金黄色葡萄球菌结果。
图3为不同前体制备的N-CDs检测溶血性蜡样芽孢杆菌活性的结果图。
图中，图a和b：以地衣芽孢杆菌为前体制备N-CDs检测溶血性蜡样芽孢杆菌的显微镜结果图与SEM图；图c和d：以艾草为前体制备N-CDs检测溶血性蜡样芽孢杆菌的显微镜结果图与SEM图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例中使用材料均可通过市售得到。
实施例1、基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒制备与使用
1、基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒的制备
(1)氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)的制备与纯化
从-80℃冰箱中取出地衣芽孢杆菌菌种，移取100μL地衣芽孢杆菌菌悬液接入50mL已灭菌的LB液体培养基中，在37℃、150rpm下活化培养24h；
取200μL活化培养后的菌悬液接种至50mL已灭菌的LB液体培养基中，在37℃下培养12h，然后将所培养菌液在8000×g、4℃的条件下离心3次，每次10min，收集得到地衣芽孢杆菌菌体；
向地衣芽孢杆菌菌体中添加40mL超纯水，混合均匀后转入不锈钢高压釜的聚四氟乙烯内衬中，在200℃下加热12h，通过一步水热法制备得到含氮掺杂碳量子点荧光探针的反应溶液，然后将反应溶液冷却，经12000×g离心10min，收集上清液，接着通过0.22μm的水系滤膜进行过滤，再置于-80℃冰箱预冻，最后利用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到氮掺杂碳量子点荧光探针(N-CDs)干燥粉末，保存在4℃冰箱备用。
(2)N-CDs储备液与PI储备液制备
取40mg的N-CDs干燥粉末，使用1mL无菌水充分溶解N-CDs，配成40mg/mL储备液。
取1mg的PI粉末，使用1mL DMSO充分溶解PI，配成1mg/mL(1.5mM)的储存液。
(3)一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒，包括N-CDs储备液与PI储备液。
2、利用上述试剂盒检测大肠杆菌活性的方法，包括步骤如下：
(1)制备大肠杆菌样品菌悬液
移取100μL大肠杆菌标准菌株接入50mL已灭菌的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下活化培养24h；
取200μL活化培养后的菌悬液接种至50mL已灭菌的LB液体培养基中，在37℃下培养8h至对数生长期，然后取10mL所培养菌液在6000rpm、4℃的条件下离心3次，每次10min，收集得到大肠杆菌菌体，最后将大肠杆菌菌体使用无菌生理盐水重悬，制备成浓度为108CFU/mL的大肠杆菌菌液。
(2)制备大肠杆菌活菌样品与死菌样品
异丙醇处理可增加细菌细胞膜的通透性并使其变性破坏蛋白质功能，从而杀灭细菌，且其处理后的细菌仍保持结构完整性，获得的死细菌光密度与0.85％NaCl溶液处理的细菌光密度相似。
因此，取步骤(1)所述制备的大肠杆菌菌液制备大肠杆菌活菌样品与死菌样品，即分别使用0.85％NaCl溶液和70％异丙醇处理，具体如下。
将菌液等分为两组：
第一组为活菌处理组，取10mL菌液至15mL离心管中，调整菌浓为106CFU/mL，作为活菌样品；
第二组为死菌处理组，取20mL菌液至50mL离心管中，6000rpm离心10min除去上清液，使用20mL 70％异丙醇重悬并处理1h，使用无菌生理盐水清洗3次并重悬，调整菌浓为106CFU/mL，作为死菌样品；
(3)制备用于流式细胞仪检测区域门圈定及补偿调节参数设置的样本
分别设置3组对照样本：
①阴性对照组：1mL大肠杆菌活菌样品，不添加试剂盒试剂；
②PI单染组：将500μL大肠杆菌活菌样品与500μL大肠杆菌死菌样品混合，添加20μL的PI染料于25℃避光染色15min，得到PI单染管；
③N-CDs荧光探针单染组：向500μL大肠杆菌活菌样品添加12.5μL本实施例制备的N-CDs，于25℃孵育45min，离心洗去N-CDs，再加入500μL大肠杆菌活菌样品混合均匀，得到N-CDs单染管。
(4)流式细胞仪检测前的区域门圈定及补偿调节参数设置
利用流式细胞仪仪器标准微球校准仪器的光路和液流系统，保证仪器各项指标在可用范围内。
建立FSC和SSC散点图，利用等高线图中等高线分布，在FSC-SSC散点图中，使用圈门工具画P1门建立散点图与细胞群关系，并将该门应用于所有结果图。依次上样阴性对照管和各单染管，选择上样速度为“Low”，收集事件数为10000events，收集数据。
具体参数设置如下：
使用细菌的阴性对照组设定阈值为2000，目的是排除大颗粒、非生物碎片的干扰。然后调节流式细胞仪的FSC通道电压为498V、SSC通道电压为424V、紫外激光器激发的蓝色通道(N-CDs检测通道)电压为375V、氩离子激光器激发的FL3通道(PI检测通道)电压为374V，此时各阴性峰右边缘在102～103的位置，移动P1门圈定细胞群体。
活菌区域门圈定：上样N-CDs单染管，此时其阳性峰右侧位置低于105；选中阳性区域，圈定为活细菌区域门。
死菌区域门圈定：上样PI单染管，此时其阳性峰右侧位置低于105；选中阳性区域，圈定为死细菌区域门。
收集完毕后，利用BD FACSCantoⅡ流式细胞仪在Experiment菜单下，点击Compensation Setup>Calculate Compensation Controls，并在弹出的对话框中命名此补偿条件并将其应用于此Experiment下所有新建的样品管。
(5)大肠杆菌样本检测
取10mL大肠杆菌，使用10mL无菌0.85％NaCl溶液清洗，经6000rpm离心10min后，再用无菌0.85％NaCl重悬大肠杆菌制备成浓度为106CFU/mL的菌液，作为待检测样本；
将待检测样本转移至流式上样管中，然后将本实施例制备的N-CDs加入至待检测样本中在25℃条件下共孵育45min，再继续添加荧光染料PI，在25℃、避光条件下共孵育15min，得到待检测体系；所述待检测体系中N-CDs的浓度为1mg/mL，荧光染料碘化丙啶(PI)的浓度为30μM；最后使用流式细胞仪检测待检测体系(低速上样10000events)，根据流式细胞仪检测结果获得待检测菌的活性与分布，检测结果如图1所示。
检测结果分析：本实施例试剂盒中的N-CDs对活体微生物具有标记作用，使用流式细胞仪检测时，活的大肠杆菌细胞群体分布于右侧椭圆内(活菌)；而当大肠杆菌受损或死亡后，仅可被荧光染料PI沾染，使用流式细胞仪检测时，大肠杆菌细胞群体分布于左侧椭圆内(死菌)。当大肠杆菌从存活状态变为受损或死亡状态后，大肠杆菌细胞群体位置将由右侧椭圆(活菌群体)向左侧椭圆(死菌群体)迁移，实现对大肠杆菌活菌与死菌的检测。
本实施例以大肠杆菌作为待检测样本，使用本发明试剂盒染色待检测样本后，使用流式细胞仪进行检测，由图1可知，大肠杆菌活菌菌群与死菌菌群位置分布较为明显，活菌菌群与死菌菌群位置距离较远，且菌群重叠较小，可较好区分活菌与死菌，说明基于本试剂盒可实现对大肠杆菌活性的检测。
实施例2、本发明试剂盒检测结果准确性测定
本实施例中，通过分别采用不同前体制备N-CDs并与荧光染料PI共同构建微生物活性检测试剂盒，并使用金黄色葡萄球菌作为待检测样本测试本发明试剂盒的染色效果，以及检测结果准确性。
1、基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒的制备
(1)按照实施例1所述的方法，分别以地衣芽孢杆菌和大肠杆菌为前体，制备得到地衣芽孢杆菌-N-CDs干燥粉末和大肠杆菌-N-CDs干燥粉末。
(2)N-CDs储备液与PI储备液制备
取40mg地衣芽孢杆菌-N-CDs干燥粉末和40mg大肠杆菌-N-CDs干燥粉末，使用1mL无菌水充分溶解，分别配成40mg/mL的地衣芽孢杆菌-N-CDs储备液和大肠杆菌-N-CDs储备液。
取1mg的PI粉末，使用1mL DMSO充分溶解PI，配成1mg/mL(1.5mM)的储存液。
(3)一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒A，包括地衣芽孢杆菌-N-CDs储备液与PI储备液。
一种基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒B，包括大肠杆菌-N-CDs储备液与PI储备液。
2、利用上述试剂盒检测金黄色葡萄球菌活性的方法，包括步骤如下：
(1)按照实施例1所述的方法培养金黄色葡萄球菌，得到浓度为108CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液。
(2)取步骤(1)所述制备的金黄色葡萄球菌菌液制备金黄色葡萄球菌活菌样品与死菌样品，即分别使用0.85％NaCl溶液和70％异丙醇处理，具体如下。
将菌液等分为两组：
第一组为活菌处理组，取10mL菌液至15mL离心管中，调整菌浓为106CFU/mL，作为活菌样品；
第二组为死菌处理组，取20mL菌液至50mL离心管中，6000rpm离心10min除去上清液，使用20mL 70％异丙醇重悬并处理1h，使用无菌生理盐水清洗3次并重悬，调整菌浓为106CFU/mL，作为死菌样品；
(3)制备用于流式细胞仪检测区域门圈定及补偿调节参数设置的样本
分别设置3组对照样本：
①阴性对照组：1mL金黄色葡萄球菌活菌样品，不添加试剂盒试剂；
②PI单染组：将500μL金黄色葡萄球菌活菌样品与500μL金黄色葡萄球菌死菌样品混合，添加20μL的PI染料室温避光染色15min，得到PI单染管；
③N-CDs荧光探针单染组：向500μL金黄色葡萄球菌活菌样品中分别添加12.5μL地衣芽孢杆菌-N-CDs和大肠杆菌-N-CDs，室温孵育45min，离心洗去N-CDs，再加入500μL大肠杆菌活菌样品混合均匀，分别得到N-CDs单染管A(地衣芽孢杆菌-N-CDs处理)和N-CDs单染管B(大肠杆菌-N-CDs处理)。
(4)流式细胞仪检测前的区域门圈定及补偿调节参数设置
利用流式细胞仪仪器标准微球校准仪器的光路和液流系统，保证仪器各项指标在可用范围内。
建立FSC和SSC散点图，利用等高线图中等高线分布，在FSC-SSC散点图中，使用圈门工具画P1门建立散点图与细胞群关系，并将该门应用于所有结果图。依次上样阴性对照管和各单染管，选择上样速度为“Low”，收集事件数为10000events，收集数据。
具体参数设置如下：
使用细菌的阴性对照组设定阈值为2000，目的是排除大颗粒、非生物碎片的干扰。然后调节流式细胞仪的FSC通道电压为488V、SSC通道电压为435V、紫外激光器激发的蓝色通道(N-CDs检测通道)电压为307V、氩离子激光器激发的FL3通道(PI检测通道)电压为314V，此时各阴性峰右边缘在102～103的位置，移动P1门圈定细胞群体。
活细菌区域门圈定：上样N-CDs单染管A/B，此时其阳性峰右侧位置低于105；选中阳性区域，圈定为活细菌区域门。
死细菌区域门圈定：上样PI单染管，此时其阳性峰右侧位置低于105；选中阳性区域，圈定为死细菌区域门。
收集完毕后，利用BD FACSCantoⅡ流式细胞仪在Experiment菜单下，点击Compensation Setup>Calculate Compensation Controls，并在弹出的对话框中命名此补偿条件并将其应用于此Experiment下所有新建的样品管。
(5)金黄色葡萄球菌样本检测
取10mL金黄色葡萄球菌，使用10mL无菌0.85％NaCl溶液清洗，经6000rpm离心10min后，再用无菌0.85％NaCl重悬金黄色葡萄球菌制备成浓度为106CFU/mL的菌液，作为待检测样本。
将待检测样本转移至流式上样管中，然后将地衣芽孢杆菌-N-CDs加入至待检测样本中在25℃条件下共孵育45min，再继续添加荧光染料PI，在25℃、避光条件下共孵育15min，得到待检测体系A；所述待检测体系A中地衣芽孢杆菌-N-CDs的浓度为1mg/mL，荧光染料碘化丙啶(PI)的浓度为30μM；再按照相同的方法使用大肠杆菌-N-CDs、荧光染料PI和待检测样本进行两次共孵育，得到待检测体系B；最后使用流式细胞仪检测分别待检测体系A/B(低速上样10000events)，根据流式细胞仪检测结果获得待检测菌的活性与分布，检测结果如图2所示。
检测结果分析：图2中左侧椭圆内细胞群体为PI染色的金黄色葡萄球菌死菌样品，右侧椭圆内细胞群体为N-CDs染色的金黄色葡萄球菌活菌样品。当金黄色葡萄球菌受损或死亡后，金黄色葡萄球菌细胞群体位置将由右侧椭圆(活菌群体)向左侧椭圆(死菌群体)迁移，实现对金黄色葡萄球菌活菌与死菌的检测。
更具体来说，图2a为组别一中以地衣芽孢杆菌为前体制备N-CDs与荧光染料PI染色金黄色葡萄球菌结果图，由图2a可知，金黄色葡萄球菌经试剂盒染色、使用流式细胞仪检测后，活菌与死菌分布较为明显，无菌群重叠，说明可基于本试剂盒实现对金黄色葡萄球菌活菌死菌的检测。图2b为组别二中以大肠杆菌为前体制备N-CDs与荧光染料PI染色金黄色葡萄球菌结果图，发现使用该试剂盒染色后，活菌与死菌菌群位置分布较近，部分菌群出现位置重叠，这可能会影响活菌与死菌的检测结果判定，即说明以大肠杆菌为前体制备N-CDs并与荧光染料PI形成的活菌和死菌检测试剂盒可能不适用于金黄色葡萄球菌的活菌和死菌检测。
实施例3、本发明试剂盒组分应用性测定
1、基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒的制备
按照实施例1所述的方法，以地衣芽孢杆菌为前体，制备得到地衣芽孢杆菌-N-CDs干燥粉末。
称取30g艾草，于65℃烘箱中烘干1h。取烘干后艾草使用水热法(115℃加热20min)，制备得到含氮掺杂碳量子点荧光探针的反应溶液，取60mL超纯水加入冷却后的反应溶液中，在200W功率下超声30min，经抽滤收集上清液并通过截留量1KD的透析袋透析12h以去除其他杂质，将收集到的透析液使用0.22μm的水系滤膜进行过滤，将所得溶液进行冷冻干燥，制备得到艾草-N-CDs干燥粉末。
将地衣芽孢杆菌-N-CDs干燥粉末和艾草-N-CDs干燥粉末，使用无菌水充分溶解，分别配成40mg/mL的地衣芽孢杆菌-N-CDs溶液和艾草-N-CDs溶液，备用。
2、荧光显微镜观察两种N-CDs分别与溶血性蜡样芽孢杆菌结合情况
(1)制备溶血性蜡样芽孢杆菌菌悬液
从-80℃冰箱中取出溶血性蜡样芽孢杆菌，移取100μL溶血性蜡样芽孢杆菌菌悬液接入50mL已灭菌的营养肉汤培养基中，在37℃、200rpm下活化培养24h；
取200μL活化培养后的溶血性蜡样芽孢杆菌菌悬液接种至50mL已灭菌的营养肉汤培养基中，在37℃下培养8h，然后将所培养菌液在6000rpm下离心3次，每次10min，收集得到溶血性蜡样芽孢杆菌菌体，最后将溶血性蜡样芽孢杆菌使用无菌生理盐水重悬，制备成浓度为106CFU/mL的溶血性蜡样芽孢杆菌菌液。
(3)两种N-CDs分别与溶血性蜡样芽孢杆菌共孵育
将1mL溶血性蜡样芽孢杆菌悬液(1×106CFU/mL)分别与1mL地衣芽孢杆菌-N-CDs(终浓度为1mg/mL)、1mL艾草-N-CDs(终浓度为1mg/mL)混合，于室温条件下共孵育45min，得到共培养物；然后将共培养物在6000rpm下离心3次，每10min，收集得到溶血性蜡样芽孢杆菌菌体，采用徕卡激光共聚焦荧光显微镜于激发光和发射光为340nm和440nm条件下观察染色情况，结果如图3a和图3c所示。
3、扫描电镜(SEM)观察两种N-CDs与溶血性蜡样芽孢杆菌结合情况
(1)制备溶血性蜡样芽孢杆菌菌悬液
从-80℃冰箱中取出溶血性蜡样芽孢杆菌，移取100μL溶血性蜡样芽孢杆菌菌悬液接入5mL已灭菌的营养肉汤培养基中，在37℃、200rpm下活化培养24h；
取200μL活化培养后的溶血性蜡样芽孢杆菌菌悬液接种至50mL已灭菌的营养肉汤培养基中，在37℃下培养8h，然后将所培养菌液在6000rpm下离心3次，每次10min，收集得到溶血性蜡样芽孢杆菌菌体，最后将溶血性蜡样芽孢杆菌使用无菌生理盐水重悬，制备成浓度为106CFU/mL的溶血性蜡样芽孢杆菌菌液。
(2)将1mL溶血性蜡样芽孢杆菌悬液(1×106CFU/mL)分别与1mL地衣芽孢杆菌-N-CDs(终浓度为1mg/mL)、1mL艾草-N-CDs(终浓度为1mg/mL)混合，于37℃下共孵育1h，得到共培养物；然后将共培养物在6000rpm下离心3次，每次10min，收集得到溶血性蜡样芽孢杆菌菌体，分别加入2mL的2.5％戊二醛固定过夜，用0.1M的PBS(pH 7.0)清洗3次；再将样品分别使用2mL乙醇溶液(30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％)梯度脱水，每次15min，接着使用2mL 100％乙醇脱水2次，每次20min；再使用体积比为1：1的乙醇和乙酸异戊酯混合液处理30min，最后用乙酸异戊酯清洗2h，自然风干后，使用扫描电镜(SEM)观察，结果如图3b和图3d所示。
检测结果分析：以溶血性蜡样芽孢杆菌为检测对象时，地衣芽孢杆菌-N-CDs可特异性与溶血性蜡样芽孢杆菌细胞膜结合，具有较好的荧光成像效果(图3a)；由图3b中椭圆标注的溶血性蜡样芽孢杆菌可知，该溶血性蜡样芽孢杆菌呈现杆状、形态饱满，无破损、塌陷等现象。说明本试剂盒使用的N-CDs对细菌具有较好的荧光成像作用，且对溶血性蜡样芽孢杆菌结构无明显影响。虽然艾草-N-CDs也可以染色溶血性蜡样芽孢杆菌，具有较好的荧光成像效果(图3c)；但由图3-d中椭圆标注的溶血性蜡样芽孢杆菌可以发现，该艾草-N-CDs会导致溶血性蜡样芽孢杆菌表面皱缩、塌陷，出现粘连现象，说明该艾草-N-CDs无法应用于细菌活性检测。
以上所述仅为本申请的实施例而已，本发明所述实施例应理解为说明性的，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在不背离本发明本质和范围的前提下，对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (6)

1.一种利用基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒检测微生物活性的方法，其特征在于，包括步骤如下：
将待检测菌活化培养，得到待检测菌液；然后将氮掺杂碳量子点荧光探针加入至待检测菌液中进行第一次共孵育，再继续添加荧光染料碘化丙啶进行第二次共孵育，得到待检测体系；最后使用流式细胞仪检测待检测体系，根据流式细胞仪检测结果获得待检测菌的活性与分布；
所述流式细胞仪在检测前进行区域门圈定及补偿调节参数设置，具体如下：
1）利用流式细胞仪仪器标准微球校准仪器的光路和液流系统，保证仪器各项指标在仪器可用范围内；
2）上样未染色待测菌液，建立FSC和SSC散点图，设定流式细胞仪阈值为500~5000，调节FSC通道电压为200~600V、SSC通道电压为200~600V、紫外激光器激发的蓝色通道电压为200~600V、氩离子激光器激发的FL3通道电压为200~600V；
3）上样未染色待测菌液，调节N-CDs和PI荧光通道的阴性峰右边缘在102-103的位置，移动P1门圈定细胞群体并将其应用于所有结果图；
4）将氮掺杂碳量子点荧光探针加入至待检测菌的活菌液中单独共孵育，得到N-CDs单染管；将荧光染料碘化丙啶加入至待检测菌活菌液与死菌液的混合菌液中单独共孵育，得到PI单染管；
5）上样N-CDs单染管，选择上样速度为“Low”，收集事件数为10000~50000events，此时其阳性峰右侧位置低于105，选中阳性区域，圈定为活菌区域门；
6）上样PI单染管，选择上样速度为“Low”，收集事件数为10000~50000events，此时其阳性峰右侧位置低于105，选中阳性区域，圈定为死菌区域门；
7）收集事件完毕后，利用流式细胞仪在Experiment菜单下，点击Compensation Setup>Calculate Compensation Controls，并在弹出的对话框中命名此补偿条件并将其应用于此Experiment下所有新建的样品管；
所述基于氮掺杂碳量子点荧光探针检测微生物活性的试剂盒包括氮掺杂碳量子点荧光探针和荧光染料碘化丙啶；所述氮掺杂碳量子点荧光探针是以地衣芽孢杆菌为前体合成的氮掺杂碳量子点荧光探针；
所述氮掺杂碳量子点荧光探针的制备方法如下：
a）将地衣芽孢杆菌接种至LB液体培养基中，培养并收集活化后菌悬液；然后将活化后菌悬液接种至LB液体培养基中，在37℃、150~180 rpm下培养12~24h，再将菌液离心并清洗2~4次后，收集菌体；
其中，所述地衣芽孢杆菌和LB液体培养基体积比为（1~4）：（500~2000）；所述活化后菌悬液和LB液体培养基的体积比为（1~4）：（500~2000）；
b）向步骤a）收集的菌体中添加超纯水，混合均匀后转入不锈钢高压釜的聚四氟乙烯内衬中，在180~220℃下加热10~15h，通过一步水热法制备得到含氮掺杂碳量子点荧光探针的反应溶液，然后将反应溶液冷却、过滤、冷冻干燥后，得到氮掺杂碳量子点荧光探针；
所述待检测菌为真菌或细菌；
所述第一次共孵育为：在20~40℃条件下共孵育30~120min；所述第二次共孵育为：在20~40℃、避光条件下共孵育10~30min；所述待检测体系中氮掺杂碳量子点荧光探针的浓度为0.1~10mg/mL，荧光染料碘化丙啶的浓度为10~40μM；
所述流式细胞仪检测时，紫外激光器激发的蓝色通道检测被氮掺杂碳量子点荧光探针结合的活菌显示绿色荧光；氩离子激光器激发的FL3通道检测被荧光染料碘化丙啶结合的死菌显示红色荧光；
在第一次共孵育和第二次共孵育完成后，向待检测体系中添加细菌计数微球，根据流式细胞仪检测结果，计算得到待检测菌的活菌与死菌的绝对数量。
2.如权利要求1所述检测微生物活性的方法，其特征在于，所述待检测菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
3.如权利要求1所述检测微生物活性的方法，其特征在于，所述第一次共孵育为：在20~30℃条件下共孵育30~60min；所述第二次共孵育为：在20~30℃、避光条件下共孵育10~20min。
4.如权利要求3所述检测微生物活性的方法，其特征在于，所述第一次共孵育为：在25℃条件下共孵育45min；所述第二次共孵育为：在25℃、避光条件下共孵育15min。
5.如权利要求1所述检测微生物活性的方法，其特征在于，所述待检测体系中氮掺杂碳量子点荧光探针的浓度为0.5~2mg/mL，荧光染料碘化丙啶的浓度为20~30μM。
6.如权利要求5所述检测微生物活性的方法，其特征在于，所述待检测体系中氮掺杂碳量子点荧光探针的浓度为1mg/mL，荧光染料碘化丙啶的浓度为30μM。
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