CN111621443B - 一种冻干保护剂及其在冻干罗伊氏乳杆菌中的应用 - Google Patents

一种冻干保护剂及其在冻干罗伊氏乳杆菌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冻干保护剂及其在冻干罗伊氏乳杆菌中的应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一种可显著提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的冻干保护剂，此冻干保护剂的成分包含水苏糖、酪蛋白酸钠、甘氨酸和硫酸钠；使用此冻干保护剂制备罗伊氏乳杆菌冻干粉时，罗伊氏乳杆菌的冻干存活率高达100％。

Description

一种冻干保护剂及其在冻干罗伊氏乳杆菌中的应用
技术领域
本发明涉及一种冻干保护剂及其在冻干罗伊氏乳杆菌中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是重要的益生菌之一，它能够很好地黏附在肠黏膜上，调节肠道菌群结构，避免人体患上肠道疾病，并且，它能够很好地提高免疫力，从而促进人体健康。除此之外，它还能改善过敏体质，治疗小儿便秘、女性疾病等。
由于具有显著的益生功效，罗伊氏乳杆菌越来越成为人们研究、开发、生产的重点。目前，罗伊氏乳杆菌已被广泛地应用于食品、医药等领域。
罗伊氏乳杆菌冻干粉是市场上最常见的罗伊氏乳杆菌产品，此种产品主要是通过将罗伊氏乳杆菌进行冷冻干燥获得的，具有保藏期长、不易污染、便于运输贮藏和质量易控等优点。在制备罗伊氏乳杆菌冻干粉的过程中，虽然，冷冻干燥对罗伊氏乳杆菌的损伤较小，但是，由于冷冻干燥过程中，罗伊氏乳杆菌易发生低温胁迫、冻结应力损伤等导致的细胞膜通透性改变、蛋白质变性失活、pH动态平衡被破坏等状况，而这些状况都会导致罗伊氏乳杆菌的活性降低，因此，冷冻干燥前，需要在罗伊氏乳杆菌中加入特定的冻干保护剂，例如蔗糖、海藻糖、脱脂乳、羟乙基纤维素、聚蔗糖、抗坏血酸、透明质酸、醇类和/或钠盐等，以提高罗伊氏乳杆菌的冻干存活率。
但是，目前专门针对罗伊氏乳杆菌这一益生菌研发的冻干保护剂很少且效果大多并很不理想，例如，公开号为CN101974463A的专利申请文本中，朱战波等人使用含有脱脂奶粉、蔗糖、甘油、山梨醇的冻干保护剂冻干罗伊氏乳杆菌时，冻干存活率仅有70％。并且，由于不同菌株之间存在特异性(具体可见参考文献：黄科.真空冷冻干燥乳酸菌的研究进展[J].西安文理学院学报:自然科学版,2009(03):55-58.)，现有的针对其他益生菌研发的效果较好的冻干保护剂在提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率方面的效果也都很不理想，例如，公开号为CN106434463A的专利申请文本中，余萍等人使用含有脱脂奶粉、麦芽糊精、海藻糖、吐温-80、甘油、谷氨酸钠的冻干保护剂冻干鼠李糖乳杆菌时，冻干存活率有60％，然而，使用同样的冻干保护剂冻干罗伊氏乳杆菌时，冻干存活率仅有40％；公开号为CN106047709A的专利申请文本中，崔树茂等人使用含有乳清分离蛋白(WPI)、菊粉、山梨醇和抗坏血酸的冻干保护剂冻干植物乳杆菌时，冻干存活率高达100％，然而，使用同样的冻干保护剂冻干罗伊氏乳杆菌时，冻干存活率仅有50％。上述因素均使得现有的大多数罗伊氏乳杆菌冻干粉产品中罗伊氏乳杆菌的活菌数较低。
因此，急需找到一种可显著提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的冻干保护剂以提高罗伊氏乳杆菌冻干粉中罗伊氏乳杆菌的活菌数。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种可显著提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的冻干保护剂。
[技术方案]
为解决本发明的技术问题，本发明提供了一种冻干保护剂，所述冻干保护剂的成分包含水苏糖、酪蛋白酸钠、甘氨酸和硫酸钠。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂的成分包含水苏糖50～150g/L、酪蛋白酸钠20～60g/L、甘氨酸10～30g/L和硫酸钠20～60g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂的成分包含水苏糖120g/L、酪蛋白酸钠40g/L、甘氨酸15g/L和硫酸钠30g/L。
本发明还提供了一种制备罗伊氏乳杆菌冻干粉的方法，所述方法为使用上述冻干保护剂制备青春罗伊氏乳杆菌冻干粉。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将罗伊氏乳杆菌菌液离心，收集菌泥；将菌泥重悬于生理盐水或缓冲液中，得到重悬液；将重悬液与上述冻干保护剂混合，得到混合液；将混合液进行冷冻干燥，得到罗伊氏乳杆菌冻干粉。
在本发明的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌菌液的制备方法为将罗伊氏乳杆菌菌接种至培养基中进行培养。
在本发明的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌菌液的制备方法为将罗伊氏乳杆菌菌接种至培养基中培养至对数生长末期。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠缓冲液或磷酸二氢钠。
在本发明的一种实施方式中，所述菌泥与生理盐水或缓冲液的质量比为0.75～1.00:0.75～1.00。
在本发明的一种实施方式中，所述菌泥与生理盐水或缓冲液的质量比为1:1。
在本发明的一种实施方式中，所述重悬液与冻干保护剂的体积比为1.85～2.00:0.85～1.00。
在本发明的一种实施方式中，所述重悬液与冻干保护剂的体积比为2:1。
在本发明的一种实施方式中，所述重悬液的pH为6.2～6.6。
在本发明的一种实施方式中，所述重悬液的pH为6.5。
在本发明的一种实施方式中，所述冷冻干燥在冷冻干燥机内完成，包括预冻、一次干燥和二次干燥；所述预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h；所述一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h；所述二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。
在本发明的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌包括罗伊氏乳杆菌GDMCCNo.60515、罗伊氏乳杆菌CGMCC No.14394和/或罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60735。
本发明还提供了一种罗伊氏乳杆菌冻干粉，所述罗伊氏乳杆菌冻干粉是使用上述方法制备得到的。
本发明还提供了上述冻干保护剂或上述方法在冻干罗伊氏乳杆菌中的应用。
[有益效果]
(1)本发明提供了一种可显著提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的冻干保护剂，此冻干保护剂的成分包含水苏糖、酪蛋白酸钠、甘氨酸和硫酸钠；使用此冻干保护剂制备罗伊氏乳杆菌冻干粉时，罗伊氏乳杆菌的冻干存活率高达100％。
(2)本发明提供了一种可显著提高罗伊氏乳杆菌冻干存活率的制备罗伊氏乳杆菌冻干粉的方法，此方法为先将罗伊氏乳杆菌菌液离心获得的菌泥重悬于生理盐水或缓冲液中，得到重悬液，然后将重悬液与成分包含水苏糖、酪蛋白酸钠、甘氨酸和硫酸钠的冻干保护剂混合，得到混合液，最后将混合液进行冷冻干燥，得到罗伊氏乳杆菌冻干粉；利用此方法制备罗伊氏乳杆菌冻干粉时，罗伊氏乳杆菌的冻干存活率高达100％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的水苏糖、酪蛋白酸钠、甘氨酸、硫酸钠、脱脂乳、蔗糖、透明质酸、抗坏血酸、甘油、山梨醇、麦芽糊精、氯化钠均购自创赛生物科技有限公司；下述实施例中涉及的罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60515记载于公开号为CN109628359A的专利申请文本中，保藏编号为GDMCC No.60515；下述实施例中涉及的罗伊氏乳杆菌CGMCC No.14394记载于公开号为CN107523526A的专利申请文本中，保藏编号为CGMCC No.14394；下述实施例中涉及的罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60735记载于公开号为CN110643542A的专利申请文本中，保藏编号为GDMCC No.60735；下述实施例中涉及的生理盐水购自国药集团化学试剂有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
罗伊氏乳杆菌活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
实施例1：罗伊氏乳杆菌冻干粉的制备(罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60515)
具体步骤如下：
(1)按照表1的配方配置冻干保护剂1～12；其中，水苏糖溶液、硫酸钠溶液、麦芽糊精溶液、海藻糖溶液、吐温-80、甘油溶液、菊粉溶液、山梨醇溶液、蔗糖溶液115℃灭菌20min，酪蛋白酸钠溶液65℃灭菌30min灭菌，甘氨酸溶液、透明质酸溶液、抗坏血酸溶液、谷氨酸钠溶液过膜灭菌，脱脂奶粉溶液105℃灭菌10min，乳清分离蛋白(WPI)溶液85℃灭菌30min；
(2)用接种环蘸取保菌管中的罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60515菌液在MRS固体培养基上划线，于37℃恒温培养36h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养12h，得到种子液；将种子液按2％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃恒温培养12h至对数生长末期，得到菌液；将菌液8000g下离心20min，收集菌泥；将菌泥重悬于生理盐水中，得到重悬液；将重悬液的pH调节至6.5后(通过质量体积分数为3％的NaOH溶液调节pH)将重悬液分别与冻干保护剂1～12混合，得到混合液1～12；将混合液1～12进行冷冻干燥，得到罗伊氏乳杆菌冻干粉1～12；其中，菌泥与生理盐水的质量比为1:1；重悬液与冻干保护剂的体积比为2:1；冷冻干燥在冷冻干燥机(购自西班牙泰事达公司)内完成，包括预冻、一次干燥和二次干燥，预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h，一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h，二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。
检测罗伊氏乳杆菌冻干粉1～12中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌冻干粉1～12中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表2)；
其中，冻干存活率的计算公式为：
Figure GDA0002547393420000041
由表1-2可知，使用含有水苏糖120g/L、酪蛋白酸钠40g/L、甘氨酸15g/L和硫酸钠30g/L的冻干保护剂制备得到的罗伊氏乳杆菌冻干粉中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率最高，高达98.13±0.52％。
表1冻干保护剂1～12的配方
Figure GDA0002547393420000051
表2罗伊氏乳杆菌冻干粉1～12中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率
Figure GDA0002547393420000052
Figure GDA0002547393420000061
实施例2：罗伊氏乳杆菌冻干粉的制备
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60515替换为罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.14394，得到罗伊氏乳杆菌冻干粉13～24。
检测罗伊氏乳杆菌冻干粉13～24中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌冻干粉13～24中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表3)。
由表3可知，使用含有水苏糖120g/L、酪蛋白酸钠40g/L、甘氨酸15g/L和硫酸钠30g/L的冻干保护剂制备得到的罗伊氏乳杆菌冻干粉中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率最高，高达104.42±2.47％。
表3罗伊氏乳杆菌冻干粉13～24中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率
组别 冻干存活率
罗伊氏乳杆菌冻干粉13 50.32±0.32％
罗伊氏乳杆菌冻干粉14 20.47±2.32％
罗伊氏乳杆菌冻干粉15 30.25±1.23％
罗伊氏乳杆菌冻干粉16 34.26±0.23％
罗伊氏乳杆菌冻干粉17 104.42±2.47％
罗伊氏乳杆菌冻干粉18 40.71±3.26％
罗伊氏乳杆菌冻干粉19 50.21±5.32％
罗伊氏乳杆菌冻干粉20 63.13±2.53％
罗伊氏乳杆菌冻干粉21 78.46±0.42％
罗伊氏乳杆菌冻干粉22 82.22±1.23％
罗伊氏乳杆菌冻干粉23 72.23±1.32％
罗伊氏乳杆菌冻干粉24 68.21±3.25％
实施例3：罗伊氏乳杆菌冻干粉的制备
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将罗伊氏乳杆菌GDMCC No.60515替换为罗伊氏乳杆菌GDMCCNo.60735，得到罗伊氏乳杆菌冻干粉25～36。
检测罗伊氏乳杆菌冻干粉25～36中罗伊氏乳杆菌的活菌数，并且，计算罗伊氏乳杆菌冻干粉25～36中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率(检测结果见表4)。
由表4可知，使用含有水苏糖120g/L、酪蛋白酸钠40g/L、甘氨酸15g/L和硫酸钠30g/L的冻干保护剂制备得到的罗伊氏乳杆菌冻干粉中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率最高，高达99.72±4.01％。
表3罗伊氏乳杆菌冻干粉25～36中罗伊氏乳杆菌的冻干存活率
组别 冻干存活率
罗伊氏乳杆菌冻干粉25 48.24±3.21％
罗伊氏乳杆菌冻干粉26 10.32±2.32％
罗伊氏乳杆菌冻干粉27 38.43±0.24％
罗伊氏乳杆菌冻干粉28 30.43±1.32％
罗伊氏乳杆菌冻干粉29 99.72±4.01％
罗伊氏乳杆菌冻干粉30 43.28±3.54％
罗伊氏乳杆菌冻干粉31 56.02±1.36％
罗伊氏乳杆菌冻干粉32 73.16±0.21％
罗伊氏乳杆菌冻干粉33 84.66±2.14％
罗伊氏乳杆菌冻干粉34 88.23±1.43％
罗伊氏乳杆菌冻干粉35 78.66±0.14％
罗伊氏乳杆菌冻干粉36 64.43±2.01％
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种罗伊氏乳杆菌冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂的成分包含水苏糖120g/L、酪蛋白酸钠40g/L、甘氨酸15g/L和硫酸钠30g/L。
2.一种制备罗伊氏乳杆菌冻干粉的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1所述的冻干保护剂制备青春罗伊氏乳杆菌冻干粉。
3.如权利要求2所述的一种制备罗伊氏乳杆菌冻干粉的方法，其特征在于，所述方法为将罗伊氏乳杆菌菌液离心，收集菌泥；将菌泥重悬于生理盐水或缓冲液中，得到重悬液；将重悬液与权利要求1所述的冻干保护剂混合，得到混合液；将混合液进行冷冻干燥，得到罗伊氏乳杆菌冻干粉。
4.如权利要求3所述的一种制备罗伊氏乳杆菌冻干粉的方法，其特征在于，所述菌泥与生理盐水或缓冲液的质量比为0.75～1.00:0.75～1.00。
5.如权利要求3所述的一种制备罗伊氏乳杆菌冻干粉的方法，其特征在于，所述重悬液与冻干保护剂的体积比为1.85～2.00:0.85～1.00。
6.如权利要求3所述的一种制备罗伊氏乳杆菌冻干粉的方法，其特征在于，所述冷冻干燥在冷冻干燥机内完成，包括预冻、一次干燥和二次干燥；所述预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h；所述一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h；所述二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。
7.一种罗伊氏乳杆菌冻干粉，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌冻干粉是使用权利要求2-6任一项所述的方法制备得到的。
8.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌冻干保护剂或权利要求2-6任一项所述的方法在冻干罗伊氏乳杆菌中的应用。
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