CN113151115B - 一种提高双歧杆菌冻干存活率及储藏稳定性的方法 - Google Patents

一种提高双歧杆菌冻干存活率及储藏稳定性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高双歧杆菌冻干存活率及储藏稳定性的方法，属于微生物工程发酵领域。为了解决发酵乳杆菌受环境因素的影响降低活性和抗逆性差的问题。本发明提供了一种提高双歧杆菌冻干存活率及储藏稳定性的方法，步骤为利用含有吐温80、胡萝卜素和褪黑素中任意一种或任意多种的发酵培养基培养双歧杆菌。调节双歧杆菌细胞膜后双歧杆菌的冻干存活率在95％以上，37℃储藏2个月后存活率为65％以上。

Description

一种提高双歧杆菌冻干存活率及储藏稳定性的方法
技术领域
本发明涉及一种提高双歧杆菌冻干存活率及储藏稳定性的方法，属于微生物发酵工程领域。
背景技术
双歧杆菌(Bifidobacterium)是益生菌的一种，它具有丰富的益生功能。近年来在欧盟、美国、日本和中国等国家和地区的市场上，含有双歧杆菌的产品种类逐年增多。大量的科学实验已经证实经常性的摄入双歧杆菌及其制品能够保证肠道的健康。
要使双歧杆菌产品可以发挥理想的益生效果，必须要保证产品中活菌的数量足够，所以工业上通常使用冷冻干燥的方法制备双歧杆菌益生菌粉。为了提高双歧杆菌冻干存活率以及保证其储藏稳定性一般要添加合适的冻干保护剂，冻干保护剂的价格昂贵。然而通过复配优化出来的冻干保护剂往往存在着保护效果的菌株差异性，对不同的双歧杆菌冻干保护的效果不一样。并且相对于乳杆菌来说，双歧杆菌在冷冻干燥过程中受到的损伤更严重，即使有冻干保护剂的保护存活率往往仍不能达到理想水平。例如文献“王桃，纪瑞，刘海燕，等.长双歧杆菌DD98冻干保护剂优化及菌粉保存稳定性研究[J].工业微生物，2020，50(2)：22-27.”中王桃等人使用海藻糖作为冻干保护剂对长双歧杆菌进行冻干，存活率最高可达到90.3％，然而在25℃储藏60天后存活率下降为15.65％。文献“田洪涛，张篪，贾英民，等.海藻糖在双歧杆菌冻干菌粉制备和保藏中生物保护作用的初探[J].河北农业大学学报,2000(2):62-65.”中使用海藻糖的复配保护剂冻干长双歧杆菌存活率最高仅45.09％。上述内容均表明现有的大多数复配优化出的冻干保护剂冻干保护效果达不到令人满意的效果。
发明内容
本发明的目的是为了在节约成本的前提下，提高双歧杆菌的冻干存活率和储存稳定性，解决了双歧杆菌受环境因素的影响降低活性和抗逆性差的问题。
本发明提供了一种提高双歧杆菌抗逆性的方法，所述方法是利用含有吐温80、胡萝卜素和褪黑素中任意两种或任意多种的发酵培养基培养双歧杆菌。
在一种实施方式中，所述双歧杆菌为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌((Bifidobacterium bifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)或短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)。
在一种实施方式中，所述吐温80的浓度为0.1g/L～2.0g/L；所述胡萝卜素的浓度为0.1g/L～2.0g/L；所述褪黑素的浓度为0.1g/L～2.0g/L。
本发明还提供了一种提高双歧杆菌抗逆性的培养基，所述培养基是含有吐温80、胡萝卜素和褪黑素中任意两种种或任意多种的发酵培养基。
在一种实施方式中，所述培养基还包括碳源和氮源。所述碳源包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、低聚糖中的一种或多种；所述氮源包括酵母浸粉FM528、酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、牛肉浸粉中的一种或多种。
本发明还提供了一种制备双歧杆菌冻干粉的方法，所述方法的步骤如下：
(1)利用上述的培养基培养双歧杆菌；
(2)收集步骤(1)得到的双歧杆菌与冻干保护剂按照质量比为1:1混合，再进行冻干处理后获得双歧杆菌冻干粉。
在一种实施方式中，所述冻干保护剂的成分为：山梨糖醇、棉子糖、乳清蛋白、硫酸镁、谷胱甘肽和硫酸锰中的任意一种或多种。
在一种实施方式中，冻干保护剂的成分为：山梨糖醇20-22g，棉子糖16-18g，乳清蛋白6-8g，硫酸镁0.4-0.5g，谷胱甘肽0.3-0.5g，硫酸锰0.2-0.4g。
本发明还提供了一种双歧杆菌冻干粉，所述双歧杆菌冻干粉是由上述制备双歧杆菌菌粉的的方法得到的。
本发明还提供了上述双歧杆菌冻干粉在制备食品、药品和保健品中的应用。
本发明还提供了上述培养基或上述提高双歧杆菌抗逆性的方法在制备双歧杆菌冻干粉和提高双歧杆菌的冻干存活率及储藏稳定性中的应用。
有益效果：
(1)本发明提供了一种可显著提高各种双歧杆菌冻干存活率及储藏稳定性的方法，此方法包括在发酵培养基中添加吐温80、β胡萝卜素、褪黑素调节双歧杆菌细胞膜组成；调节双歧杆菌细胞膜后双歧杆菌的冻干存活率在95％以上，37℃储藏2个月后存活率为65％以上。
(2)本发明提供了一种提高双歧杆菌抗逆性的培养基用于培养双歧杆菌，从提高双歧杆菌自身抗逆性角度出发，提高双歧杆菌细胞膜的流动性及稳定性从而减少双歧杆菌在冷冻干燥和储藏过程中受到的损伤，提高最终冻干菌粉的质量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的β胡萝卜素、维生素K1、角鲨烯、维生素E、褪黑素、胆固醇、豆甾醇、吐温80、吐温20购自上海萨恩化学技术有限公司。
下述实施例中涉及的长双歧杆菌GDMCC No.60926记载于公开号为CN111557378A的专利申请文本中,保藏编号为GDMCC No.60926；下述实施例涉及的两歧双歧杆菌CGMCCNO.13632记载于公开号为CN106834187B的专利文本中；下述实施例涉及的青春双歧杆菌GDMCCNo.60706记载于公开号为CN110331118B的专利文本中；下述实施例涉及的短双歧杆菌CGMCC No.11828记载于公开号为CN105925514B的专利文本中。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、牛肉浸膏10g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·7H2O0.25g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、蒸馏水1000g/L。
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、牛肉浸膏10g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·7H2O0.25g/L、吐温80 1g/L、琼脂20g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、蒸馏水1000g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
双歧杆菌活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
冻干存活率的计算公式为：
Figure GDA0004142208920000031
实施例1.控制不同培养基成分制备长双歧杆菌冻干粉
1.配制培养基：
按照表1的配方在MRS培养基中额外添加可以调节长双歧菌细胞膜组成与性质的物质；各类调节物质均使用5mL无水乙醇溶解混匀后添加至MRS培养基中，后115℃灭菌20min。
2.制备长双歧杆菌冻干粉：
用接种环蘸取保菌管中的长双歧杆菌GDMCC No.60926菌液在MRS固体培养基上划线，于37℃恒温培养36h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养12h，得到种子液；将种子液按2％(v/v)的接种量接种至添加调节物质1～12的MRS液体培养基中，37℃恒温培养12h至对数生长末期，得到菌液；将菌液8000g下离心20min，收集菌泥；将菌泥与冻干保护剂按质量比1：1混合，得到混合液1～12；将混合液1～12进行冷冻干燥,得到长双歧杆菌冻干粉1～12，定容至100mL；冷冻干燥在冷冻干燥机(购自西班牙泰事达公司)内完成,包括预冻、一次干燥和二次干燥，预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h，一次干燥为控制层板1.5h升温至-30℃，保持30h，二次干燥为控制层板1h升温至25℃,保持20h。冻干保护剂配制方法为准确称量山梨糖醇22.16g，棉子糖17.9g，乳清蛋白7.16g，硫酸镁0.6g，谷胱甘肽0.45g，硫酸锰0.3g，定容至100mL。
3.将长双歧杆菌冻干粉用铝箔袋真空保存，置于37℃培养箱中进行储藏，在2个月后取出检测活菌数，计算储藏2个月后的存活率。
检测长双歧杆菌冻干粉1～12中长双歧杆菌的活菌数,并且,计算长双歧杆菌冻干粉1～12中长双歧杆菌的冻干存活率及储藏后存活率(检测结果见表2)；
结果：由表1-2可知在MRS培养基中添加吐温80 1g/L、β胡萝卜素0.5g/L和褪黑素0.5g/L后培养的长双歧杆菌制备得到的长双歧杆菌冻干粉中的长双歧杆菌的冻干存活率最高为96.69±3.52％，并且37℃储藏2个月后存活率最高为65.24±2.68％。
表1通过向MRS培养基添加物质调节细胞膜组成的配方
组别 配方
调节物质1 维生素E 0.5g/L
调节物质2 维生素K1 0.5g/L
调节物质3 角鲨烯0.5g/L
调节物质4 β胡萝卜素0.5g/L
调节物质5 胆固醇0.5g/L
调节物质6 豆甾醇0.5g/L
调节物质7 褪黑素0.5g/L
调节物质8 吐温80 1g/L
调节物质9 吐温80 1g/L+β胡萝卜素0.5g/L
调节物质10 吐温80 1g/L+褪黑素0.5g/L
调节物质11 β胡萝卜素0.5g/L+褪黑素0.5g/L
调节物质12 吐温80 1g/L+β胡萝卜素0.5g/L+褪黑素0.5g/L
调节物质12 吐温80 1g/L
表2长双歧杆菌冻干粉1～12中长双歧杆菌的冻干存活率及储藏存活率
Figure GDA0004142208920000041
Figure GDA0004142208920000051
实施例2.控制不同培养基成分制备两歧双歧杆菌冻干粉
1.两歧双歧杆菌冻干粉的制备：
在实施例1的基础上，将长双歧杆菌GDMCC No.60926替换为两歧双歧杆菌CGMCCNO.13632，得到两歧双歧杆菌冻干粉1-12。
2.检测两歧双歧杆菌冻干粉1～12中两歧双歧杆菌的活菌数，并且计算两歧双歧杆菌冻干粉1～11中两歧双歧杆菌的冻干存活率及两歧双歧杆菌冻干粉储藏2个月后对比冻干前的冻干存活率(检测结果见表3)。
结果：由表3可知在MRS培养基中添加吐温80 1g/L、β胡萝卜素0.5g/L和褪黑素0.5g/L后培养的两歧双歧杆菌制备得到的两歧双歧杆菌冻干粉中的两歧双歧杆菌的冻干存活率最高为95.53±4.37％，并且37℃储藏2个月后存活率最高为59.14±1.93％。
表3两歧双歧杆菌冻干粉1～12中两歧双歧杆菌的冻干存活率及储藏存活率
Figure GDA0004142208920000052
实施例3.控制不同培养基成分制备青春双歧杆菌冻干粉
1.青春双歧杆菌冻干粉的制备
在实施例1的基础上，将长双歧杆菌GDMCC No.60926替换为青春双歧杆菌GDMCCNo.60706，得到青春双歧杆菌冻干粉1～12。
2.检测青春双歧杆菌冻干粉1～12中青春双歧杆菌的活菌数，并且计算青春双歧杆菌冻干粉1～12中青春双歧杆菌的冻干存活率及青春双歧杆菌冻干粉储藏2个月后对比冻干前的冻干存活率(检测结果见表4)。
结果：由表4可知在MRS培养基中添加吐温80 1g/L、β胡萝卜素0.5g/L和褪黑素0.5g/L后培养的青春双歧杆菌制备得到的青春双歧杆菌冻干粉中的青春双歧杆菌的冻干存活率最高，为93.72±3.49％，并且37℃储藏2个月后存活率最高为63.75±2.65％。
表4青春双歧杆菌冻干粉1～12中青春双歧杆菌的冻干存活率及储藏存活率
Figure GDA0004142208920000061
实施例4.控制不同培养基成分制备短双歧杆菌冻干粉
1.短双歧杆菌冻干粉的制备
在实施例1的基础上，将长双歧杆菌GDMCC No.60926替换为短双歧杆菌CGMCCNo.11828，得到短双歧杆菌冻干粉1～12。
2.检测短双歧杆菌冻干粉1～12中短双歧杆菌的活菌数，并且计算短双歧杆菌冻干粉1～12中短双歧杆菌的冻干存活率及短双歧杆菌冻干粉储藏2个月后对比冻干前的冻干存活率(检测结果见表5)。
结果：由表5可知在MRS培养基中添加吐温80 1g/L、β胡萝卜素0.5g/L和褪黑素0.5g/L后培养的短双歧杆菌制备得到的短双歧杆菌冻干粉中的短双歧杆菌的冻干存活率最高，达97.28±4.12％，并且37℃储藏2个月后存活率最高为65.63±2.87％。
表5短双歧杆菌冻干粉1～12中短双歧杆菌的冻干存活率及储藏存活率
Figure GDA0004142208920000062
Figure GDA0004142208920000071
实施例5.控制不同培养基成分制备双歧杆菌菌粉
1.双歧杆菌菌粉的制备：
在实施例1的基础上，MRS培养基中添加吐温80 0.1g/L、β胡萝卜素0.1g/L和褪黑素0.1g/L后培养；MRS培养基中添加吐温80 2g/L、β胡萝卜素2g/L和褪黑素2g/L后培养；MRS培养基中添加吐温80 1g/L、β胡萝卜素1g/L和褪黑素1g/L后培养；将长双歧杆菌替换为短双歧杆菌、青春双歧杆菌和两歧双歧杆菌分别在上述培养基中培养后获得菌粉。
2.检测活菌数和存活率，结果如表6所示。
表6双歧杆菌冻干存活率及储藏存活率
Figure GDA0004142208920000072
Figure GDA0004142208920000081
3.结果显示：同时添加吐温80、β胡萝卜素、褪黑素这三种物质，添加范围在0.1-2g/L时，长双歧杆菌、两歧双歧杆菌以及青春双歧杆菌的冻干存活率以及储藏存活率均发生了不同程度的提高，但是低于添加吐温80 1g/L、β胡萝卜素0.5g/L和褪黑素0.5g/L的效果。在MRS培养基中添加吐温80 1g/L、β胡萝卜素0.5g/L和褪黑素0.5g/L后培养的各种双歧菌冻干存活率及储藏存活率最高。
实施例6.控制不同培养基成分制备双歧杆菌菌粉
1.双歧杆菌菌粉的制备：
在实施例1的基础上，MRS培养基中添加吐温80 0.1g/L和β胡萝卜素0.1g/L后培养；
MRS培养基中添加β胡萝卜素2g/L和褪黑素2g/L后培养；MRS培养基中添加吐温801g/L和褪黑素1g/L后培养，将长双歧杆菌替换为短双歧杆菌、青春双歧杆菌和两歧双歧杆菌分别在上述培养基中培养后获得菌粉。
2.检测活菌数和存活率，结果如表7所示。
表7双歧杆菌冻干存活率及储藏存活率
Figure GDA0004142208920000082
Figure GDA0004142208920000091
3.结果显示：添加两种物质组合的调节效果不如添加三种调节物质的调节效果，添加吐温80 0.1g/L和β胡萝卜素0.1g/L、β胡萝卜素2g/L和褪黑素2g/L及吐温80 1g/L和褪黑素1g/L的调节后，长双歧杆菌、两歧双歧杆菌以及青春双歧杆菌的冻干存活率以及储藏存活率均发生了显著提高但是低于添加吐温80 1g/L、β胡萝卜素0.5g/L和褪黑素0.5g/L的效果。添加吐温80、β胡萝卜素、褪黑素中的两类物质，添加范围在0.1-2g/L时对双歧杆菌的冻干存活率和储藏存活率有提高，但效果比在MRS培养基中添加吐温80 1g/L、β胡萝卜素0.5g/L和褪黑素0.5g/L较差。
对比例1.控制胁迫处理的条件制备双歧杆菌冻干粉
1.双歧杆菌菌粉的制备：
在实施例1-4的基础上，将调节细胞膜的方法改变为4℃冷胁迫处理2h并按相同的方法进行冻干，得到长双歧杆菌A1、两歧双歧杆菌A1、青春双歧杆菌A1、短双歧杆菌A1。
2.检测不同双歧杆菌中双歧杆菌的活菌数，并且计算各双歧杆菌冻干存活率及双歧杆菌冻干粉储藏2个月后对比冻干前的冻干存活率(检测结果见表8)。
结果：由表8可知，通过冷胁迫处理可以略微提高冻干存活率和储藏稳定性，但是效果有限，不如添加吐温80、β胡萝卜素和褪黑素的效果显著。因此，使用实施例1中的调节配方效果最佳。
表8不同双歧杆菌通过冷应激调节后的冻干存活率及储藏稳定性
Figure GDA0004142208920000092
对比例2.控制胁迫处理的条件制备双歧杆菌冻干粉
1.双歧杆菌菌粉的制备：
在实施例1-4的基础上，将调节细胞膜的方法改变为40℃热应激处理2h并按相同的方法进行冻干，得到长双歧杆菌B1、两歧双歧杆菌B1、青春双歧杆菌B1、短双歧杆菌B1。
2.检测不同双歧杆菌中双歧杆菌的活菌数，并且计算各双歧杆菌冻干存活率及双歧杆菌冻干粉储藏2个月后对比冻干前的冻干存活率(检测结果见表9)。
结果：由表9可知，通过热应激处理可以略微提高冻干存活率和储藏稳定性，但是效果有限，不如添加吐温80、β胡萝卜素和褪黑素的效果显著。因此，使用实施例1中的调节配方效果最佳。
表9不同双歧杆菌通过热应激调节后的冻干存活率及储藏稳定性
Figure GDA0004142208920000101
对比例3.控制培养基成分制备双歧杆菌冻干粉
1.双歧杆菌菌粉的制备
在实施例1-4的基础上，将调节细胞膜的方法改变为在培养基中添加1g/L的卵磷脂并按相同的方法进行冻干，得到长双歧杆菌C1、两歧双歧杆菌C1、青春双歧杆菌C1、短双歧杆菌C1。
2.检测得到不同双歧杆菌中双歧杆菌的活菌数，并且计算各双歧杆菌冻干存活率及双歧杆菌冻干粉储藏2个月后对比冻干前的冻干存活率(检测结果见表10)。
结果：由表10可知，通过添加卵磷脂能略微提高冻干存活率和储藏稳定性，但是效果有限，不如添加吐温80、β胡萝卜素和褪黑素的效果显著。因此，使用实施例1中的调节配方效果最佳。
表10不同双歧杆菌通过添加卵磷脂调节后的冻干存活率及储藏稳定性
Figure GDA0004142208920000102
Figure GDA0004142208920000111
对比例4.控制培养基中不同成分的浓度制备双歧杆菌冻干粉
在实施例1的基础上，改变培养基中的调节物质，得到双歧杆菌冻干粉，检测得到不同双歧杆菌中双歧杆菌的活菌数，并且计算各双歧杆菌冻干存活率。对照组是只加实施例1中的冻干保护剂。
结果如表11所示，对比表2、表6和表7的培养基，表明加入β胡萝卜素、褪黑素和吐温80其中的任意一个单个成分作为调节剂的效果是不如他们中任意两种或多种的效果好。
表11不同浓度的物质对不同双歧杆菌冻干存活率的提高效果
Figure GDA0004142208920000112
Figure GDA0004142208920000121
虽然本发明己以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种提高双歧杆菌冻干存活率的方法，其特征在于，所述方法是利用含有1g/L吐温80、0.5g/L胡萝卜素和0.5g/L褪黑素的发酵培养基培养双歧杆菌；所述双歧杆菌为长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌或短双歧杆菌；所述发酵培养基为MRS培养基。
2.一种制备双歧杆菌冻干粉的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：
（1）利用含1g/L吐温80、0.5g/L胡萝卜素和0.5g/L褪黑素发酵培养基培养双歧杆菌；所述发酵培养基为MRS培养基；
（2）收集步骤（1）得到的双歧杆菌与冻干保护剂按照质量比为1:1混合，再进行冻干处理后获得双歧杆菌冻干粉；冻干保护剂配制方法为准确称量山梨糖醇22.16g，棉子糖17.9g，乳清蛋白7.16g，硫酸镁0.6g，谷胱甘肽0.45g，硫酸锰0.3g，定容至100 mL；
所述双歧杆菌为长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌或短双歧杆菌。
3.一种双歧杆菌冻干粉，其特征在于，所述双歧杆菌冻干粉是由权利要求2所述的方法得到的；所述双歧杆菌为长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌或短双歧杆菌。
4.权利要求1或2所述的方法在制备双歧杆菌冻干粉和提高双歧杆菌的冻干存活率及储藏稳定性中的应用。
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