CN101649293A - 一种微生物冷冻干燥保护剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微生物冷冻干燥保护剂，其以水苏糖为保护剂的主要成分之一，含有水苏糖0.8～3.5％、谷氨酸钠0.1～0.6％、半乳糖0.4～1.5％以及脱脂奶粉6～15％。本发明将水苏糖应用于菌种的冷冻干燥保护，作为冻干保护剂的成分之一，拓宽了水苏糖的应用。将水苏糖与谷氨酸钠等试剂优势互补，形成了很好的冻干保护剂的组合。其对短双歧杆菌、青春双歧杆菌等多种双歧杆菌和乳酸杆菌、乳球菌等多种乳酸菌都有很高的冻干保护率且保护效果稳定。解决了微生态制剂研究中冻干保护剂复杂且保护效果差异大的问题，也为双歧杆菌、乳酸菌类、酵母菌等益生菌的保藏提供了很好的保护剂的组方，有利于菌种在保藏过程中的稳定。
Description
技术领域
本发明涉及微生物冻藏技术，具体地说是一种用于微生物冷冻干燥保藏的保护剂，本发明还涉及该保护剂的用途。
背景技术
近年来，由于食品安全的需要，微生态制剂的研究和开发得以较快发展，双歧杆菌和乳酸菌在微生态制剂的研究方面备受亲睐，除了它具有常见益生菌的生理功能如：促进营养物质吸收利用、生物屏障和生物拮抗作用、免疫调节作用外，还具有抑制内毒素产生、改善饲养环境、产生细菌素广谱抑菌等作用。但实际生产中却很少使用。原因在于：双歧杆菌和乳酸杆菌的营养要求很高，生长条件极为苛刻，特别是在冷冻干燥过程中细胞死亡率很高，极大地限制了高活性双歧杆菌和乳酸菌制剂的生产。
冷冻干燥制剂因为活菌保藏期长、货架时间长、活菌数量高而被广泛研究和应用。在冻干过程中，培养条件、收获期、冷冻速率、保护剂、残留水分及复水条件等都或多或少影响冷冻干燥菌体的存活率，其中保护剂是最复杂、也最难选择的一个关键因素。因此，积极寻求新型冻干保护剂，最大限度降低细胞的损失，是制备高活性双歧杆菌和乳酸菌冻干制剂及进一步延长活菌保藏期的技术关键。
目前，还没有将水苏糖直接作为益生菌冷冻干燥保护剂的成分的研究和报道。水苏糖在微生态制剂方面的研究仍然仅是用作冻干菌粉的稀释剂或作为双歧因子。如专利CN101028290A用于降低人或禽畜血清胆固醇的益生菌制剂及工艺中，按重量比例称取屎链球菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌混合冻干菌粉，按比例添加到玉米粉或水苏糖中，制备粉剂或胶囊剂，能调节肠内菌群，降低血清胆固醇。又如专利CN101028289A调整菌群预防或治疗细菌性阴道病的益生菌制剂及工艺中，将高温干燥或冷冻干燥后获得的干燥菌粉，按重量比例添加到乳糖和水苏糖再制备成阴道外用或口服益生菌胶囊剂及外用泡腾片。这些报道都是在得到冻干菌粉以后，加入水苏糖作为稀释剂或者促生长因子。目前还没有将水苏糖作为冻干保护剂的应用。同时，以往常用的保护剂亦存在保护剂配方非常复杂、保护效果稳定性差等问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供水苏糖的新用途；
本发明的第二个目的在于提供一种含有水苏糖的冷冻干燥保护剂；
本发明的第三个目的在于提供上述保护剂的应用。
发明人尝试寻找新的冷冻干燥保护剂，用以降低冻干菌剂菌种的死亡率，结果意外发现，水苏糖对微生物的冷冻干燥具有良好的保护作用，从而可以用于制备冷冻干燥菌剂。
进一步，发明人尝试寻找含有水苏糖保护剂的较佳组合，结果发现，谷氨酸钠与水苏糖对冷冻干燥效果具有较大交互影响作用。进而本发明提供了一种含有水苏糖的冷冻干燥保护剂，包括水苏糖、谷氨酸钠、半乳糖和脱脂奶粉。
通过正交实验发现，以下配比的冷冻干燥保护剂具有较好的保护效果：
水苏糖 0.8～5.5％
谷氨酸钠 0.1～0.6％
半乳糖 0.4～1.5％
脱脂奶粉 6～15％
优选，该保护剂含有：
水苏糖 1.8-3.5％
谷氨酸钠 0.2-0.5％
半乳糖 0.5-1.2％
脱脂奶粉 8.5-12.5％。
更优选，该保护剂含有：
水苏糖 3.0％
谷氨酸钠 0.3％
半乳糖 1.0％
脱脂奶粉 10％。
上述保护剂在益生菌特别是双歧杆菌、乳酸菌或酵母菌的冷冻干燥中具有良好的应用效果，能大幅降低冷冻干燥引起的菌种死亡。从而，利用本发明保护剂制备冷冻干燥菌剂是有益的。制备冷冻干燥菌剂时，可采用常规方法添加本发明保护剂。
本发明还提供一种优选的制备冷冻干燥菌剂的方法，包括如下步骤：制备菌泥，向菌泥中加入0.5～3.5倍菌泥体积的上述保护剂，混匀，20.0～37.8℃水浴平衡20～70min，液氮速冻15～100s和/或低温(-18℃～-40℃)预冷冻1～4小时，然后冷冻干燥16～30h。
可采用常规方法制备菌泥，例如，将微生物发酵液2000～12000rpm离心5～15min，弃上清，留菌泥(bacteria mire，BM)；也可将上述菌泥继续用生理盐水洗涤，2000～12000rpm离心3～8min，弃上清得洗涤菌泥(washed bacteria mire，WBM)。
本申请中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。
若未特别说明，本发明中涉及到的溶液的溶剂为水。
本发明将水苏糖应用于菌种的冷冻干燥保护，作为冻干保护剂的成分之一，拓宽了水苏糖的应用。将水苏糖与谷氨酸钠等试剂优势互补，形成了很好的冻干保护剂的组合：水苏糖0.8～3.5％、谷氨酸钠0.1～0.6％、半乳糖0.4～1.5％、脱脂奶粉6～15％，其对短双歧杆菌、青春双歧杆菌等多种双歧杆菌和乳杆菌、乳球菌等多种乳酸菌和酵母菌都有很高的冻干保护率且保护效果稳定。解决了微生态制剂研究中冻干保护剂复杂且保护效果差异大的问题，也为双歧杆菌、乳酸菌和酵母菌等益生菌的保藏提供了很好的保护剂的组方，有利于菌种在保藏过程中的稳定。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中所述的低温保存是指在4℃下保存，未特别指明保存条件是指在常温(25℃)下保存。
在实施例中，冷冻干燥菌剂的制备及菌种存活率的计算采用如下方式进行：在常规的适宜条件下培养各待保藏或冷冻干燥的菌株，将微生物发酵液2000～12000rpm离心5～15min，弃上清，留菌泥(bacteria mire，BM)；也可将上述菌泥继续用生理盐水洗涤，2000～12000rpm离心3～8min，弃上清得洗涤菌泥(washed bacteria mire，WBM)。将得到的菌泥与0.5～3.5倍体积的保护剂混匀，在20.0～37.8℃水浴平衡20～70min，再通过液氮速冻15～100s或低温(-18℃～-40℃)预冷冻1～4小时，然后冷冻干燥16～30h，复水，37.0～38.5℃水浴20～45min，混匀后连续稀释计数，计算保护剂对于菌种的存活率，即冻干前后相同体积活菌数之比。
实施例中涉及的菌种及来源见表1。
表1供保藏的菌种及来源
注：CICC为中国工业微生物菌种保藏管理中心；CGMCC为中国普通微生物菌种保藏管理中心。BB2是本实验室分离筛选鉴定得到的短双歧杆菌菌株，该菌株已于2009年07月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为双歧杆菌(Bifidobacteriumsp.)，保藏号为CGMCC No.3200。
实施例1
在保护剂的研究和设计中，以短双歧杆菌BB2为供试菌株，进行水苏糖单因素试验，其中固定其他三种组合物比例为：谷氨酸钠0.1％、半乳糖0.4％、脱脂奶粉8％。结果如表2所示。
表2水苏糖不同水平的冻干存活率及多重比较结果
注：数字右侧标示的大写和小写字母分别表示统计的显著水平p≤0.01和p≤0.05的多重比较结果。
从表中看出，在保护剂中添加1％的水苏糖，即可显著提高对于双歧杆菌BB2的冻干保护率。随着水苏糖含量的增加，存活率也显著提高，冻干保护率与水苏糖在复合保护剂中含量呈强正相关(R2＝0.9949)，最高时(4％)可比不添加水苏糖时的冻干保护率提高70.9％。因此，水苏糖对于双歧杆菌的冷冻干燥有极强的保护作用。
在此基础之上，进一步采用三因素二水平有交互作用的正交试验，来考察谷氨酸钠和半乳糖与水苏糖之间的交互作用。各因素和水平如表3所示。
表3正交实验涉及的因素及水平
正交表L8(27)及各组合的存活率结果见表4，模型因素显著性检验结果见表5。
表4各正交组合冻干存活率及多重比较结果
注：1)A、B、C分别代表试验因素水苏糖、谷氨酸钠和半乳糖，A×B、A×C、B×C、A×B×C分别表示ABC三因素间的互作；2)数字右侧标示的大写和小写字母分别表示统计的显著水平p≤0.01(其差异性用A、B、C、D表示)和p≤0.05(其差异性用a，b，c表示)的多重比较结果
表5正交试验模型因素显著性检验结果
注：显著性中“**”“*”分别表示该因素对模型的影响极显著(p≤0.01)和显著(p≤0.05)。
从表5看出，水苏糖、半乳糖和谷氨酸钠的交互作用、三者的交互作用对组合保护效果有显著影响，其中以水苏糖和谷氨酸钠的交互作用影响最大，目前尚无相关报道。但是普遍认为，谷氨酸钠单独使用效果不佳，与糖类复合使用冷冻保护效果大大提高。本试验统计表明，谷氨酸钠与半乳糖的交互作用不显著，而水苏糖和谷氨酸钠的交互作用影响显著。从表4看出，组合5(即试验号5)的冻干保护效果最好，活菌存活率达到了90.87％。
实施例2
在适宜条件下培养短双歧杆菌(Bifidobacterium breve BB2)。将该发酵液2000rpm(即每分钟2000转)离心5min(即5分钟)，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，5000rpm离心4min，弃上清，留菌体(washedbacteria mire，WBM)，菌泥1.5倍体积加入保护剂A(水苏糖0.8％、谷氨酸钠0.1％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉12％)，混匀，33℃水浴平衡35min，液氮速冻20s(“s”代表“秒”，以下同)，冷冻干燥16h(h代表小时)，立即复水，37℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为48.32％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为32.79％。
其所述的在适宜条件下培养所用的培养基为：大豆蛋白胨5.0克，胰蛋白胨(BBL)5g，酵母提取物5g，葡萄糖15g，K2HPO42g，MgCl2·6H2O0.5g，ZnSO4·7H2O 0.25g，CaCl20.15g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，FeCl3微量，吐温-801mL，蒸馏水1000mL。调整pH 6.5左右，121℃灭菌15min，冷却备用；也可以是其他双歧杆菌的培养基。厌氧培养，培养温度35℃，每间隔2～3h进行120rpm搅拌，持续10min，培养48～72小时，得到双歧杆菌的发酵液。
实施例3
按照实施例2中的方法培养短双歧杆菌(Bifidobacterium breve BB2)。将该发酵液3500rpm离心8min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，3500rpm离心5min，弃上清，留菌体，菌泥1.5倍体积加入保护剂B(水苏糖1.5％、谷氨酸钠0.2％、半乳糖0.6％、脱脂奶粉12％)，混匀，35℃水浴平衡40min，液氮速冻40s，冷冻干燥15h，立即复水，37℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为62.94％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为49.27％。
实施例4
按照实施例2中的方法培养短双歧杆菌(Bifidobacterium breve BB2)(CGMCC No.3200)。将该发酵液2500rpm离心10min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，4000rpm离心5min，弃上清，留菌体，菌泥3倍体积加入保护剂C(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.5％、脱脂奶粉10％)，混匀，37℃水浴平衡45min，液氮速冻80s，冷冻干燥18h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为87.66％。低温保存12月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为75.56％。
实施例5
按照实施例2中的方法培养短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)1.2213(CGMCC)。将该发酵液2000rpm离心15min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，12000rpm离心3min，弃上清，留菌体，菌泥1.5倍体积加入保护剂A(水苏糖0.8％、谷氨酸钠0.1％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉12％)，混匀，33℃水浴平衡35min，液氮速冻20s，冷冻干燥16h，立即复水，37℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为49.15％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为33.82％。
实施例6
按照实施例2中的方法培养短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)1.2213(CGMCC)。将该发酵液2500rpm离心8min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，6000rpm离心6min，弃上清，留菌体，菌泥1.5倍体积加入保护剂B(水苏糖1.5％、谷氨酸钠0.2％、半乳糖0.6％、脱脂奶粉12％)，混匀，35℃水浴平衡40min，液氮速冻40s，冷冻干燥15h，立即复水，37℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为65.88％。3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为50.16％。
实施例7
按照实施例2中的方法培养短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)1.2213(CGMCC)。将该发酵液3500rpm离心10min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，8000rpm离心5min，弃上清，留菌体，菌泥3倍体积加入保护剂C(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.5％、脱脂奶粉10％)，混匀，37℃水浴平衡45min，液氮速冻80s，冷冻干燥18h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为85.64％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为76.78％。
实施例8
在适宜条件下培养青春双歧杆菌6070(CICC)。将该发酵液2000rpm离心5min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，10000rpm离心4min，弃上清，留菌泥(bacteria mire，BM)，菌泥1.5倍体积加入保护剂A(水苏糖0.8％、谷氨酸钠0.1％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉12％)，混匀，33℃水浴平衡35min，低温(-18℃)预冷冻2.5小时，然后冷冻干燥16h，立即复水，37℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为51.22％。低温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为32.56％。
其所述的在适宜条件下培养所用的培养基为：大豆蛋白胨0.5g，胰蛋白胨(oxoid)0.5g，酵母粉(oxoid)1g，葡萄糖1.0g，无机盐溶液4mL，蒸馏水100ml，半胱氨酸盐酸盐0.05g(培养基煮沸后加入)，pH7.0，以上培养基(液体)121℃灭菌15min，冷却备用；也可以是其他双歧杆菌的培养基。厌氧培养，培养温度35℃，每间隔2～3h进行120rpm搅拌，持续10min，培养48-72小时，得到双歧杆菌的发酵液。其无机盐溶液的配制为：CaCl2(无水)0.2g，MgSO4·7H2O 0.48g，K2HPO4 1.0g，NaCl 2g，NaHCO310g，混合CaCl2和MgSO4在300毫升蒸馏水中直至溶解，加500mL蒸馏水，边搅拌边缓慢加入其他盐类，继续搅拌直至全部溶解，加200mL蒸馏水混匀，保存到4℃下备用。
实施例9
按照实施例8中的方法培养青春双歧杆菌6070(CICC)。将该发酵液4500rpm离心12min，弃上清，留菌泥(bacteria mire，BM)，菌泥1.5倍体积加入保护剂B(水苏糖1.5％、谷氨酸钠0.2％、半乳糖0.6％、脱脂奶粉12％)，混匀，35℃水浴平衡40min，低温(-40℃)预冷冻1小时，冷冻干燥15h，立即复水，37℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为80.13％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为72.41％。
实施例10
按照实施例8中的方法培养青春双歧杆菌6070(CICC)。将该发酵液3500rpm离心13min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，12000rpm离心4min，弃上清，留菌泥(bacteria mire，BM)，菌泥3倍体积加入保护剂C(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.5％、脱脂奶粉10％)，混匀，37℃水浴平衡45min，低温(-35℃)预冷冻1.5小时，冷冻干燥18h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为79.12％。低温保存12月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为70.51％。
实施例11
按照实施例8中的方法培养青春双歧杆菌6070(CICC)。将该发酵液2500rpm离心14min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，8000rpm离心7min，弃上清，留菌泥(bacteria mire，BM)，菌泥3倍体积加入保护剂C(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.5％、脱脂奶粉10％)，混匀，37℃水浴平衡45min，液氮速冻20s，再低温(-35℃)预冷冻1小时，冷冻干燥18h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为82.05％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为78.02％。
实施例12
按照实施例8中的方法培养青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)BA11。将该发酵液3000rpm离心9min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，5000rpm离心8min，弃上清，留菌体，菌泥1.5倍体积加入保护剂D(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.1％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉8％)，混匀，37℃水浴平衡40min，液氮速冻80s，冷冻干燥20h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为80.11％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为76.28％。
实施例13
按照实施例8中的方法培养青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentisBA11)。将该发酵液3000rpm离心9min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，9000rpm离心6min，弃上清，留菌体，菌泥2.0倍体积加入保护剂E(水苏糖2.0％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉8％)，混匀，37℃水浴平衡40min，液氮速冻60s，冷冻干燥20h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为78.01％。3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为63.73％。
实施例14
按照实施例8中的方法培养青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentisBA15)。将该发酵液2500rpm离心13min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，7000rpm离心7min，弃上清，留菌体，菌泥2.0倍体积加入保护剂F(水苏糖1.8％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖0.6％、脱脂奶粉12％)，混匀，37.5℃水浴平衡30min，液氮速冻40s，冷冻干燥18h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为82.39％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为75.03％。
实施例15
按照实施例8中的方法培养青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentisBA15)。将该发酵液2500rpm离心12min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，6000rpm离心8min，弃上清，留菌体，菌泥1.5倍体积加入保护剂F(水苏糖1.8％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖0.6％、脱脂奶粉12％)，混匀，37.5℃水浴平衡40min，液氮速冻60s，冷冻干燥18h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为80.99％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为74.47％。
实施例16
按照实施例8中的方法培养鸡双歧杆菌(Bifidobacterium pullorum B1)。将该发酵液2500rpm离心11min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，4500rpm离心5min，弃上清，留菌体，菌泥2.5倍体积加入保护剂E(水苏糖2.0％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉8％)，混匀，37.5℃水浴平衡20min，液氮速冻30s，冷冻干燥18h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为60.22％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为53.48％。
实施例17
按照实施例8中的方法培养鸡双歧杆菌(Bifidobacterium pullorum B3)。将该发酵液3500rpm离心8min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，5000rpm离心5min，弃上清，留菌体，菌泥3倍体积加入保护剂E(水苏糖2.0％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉8％)，混匀，37.5℃水浴平衡30min，液氮速冻60s，冷冻干燥18h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为57.28％。常温保存1月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为50.08％。
实施例18
按照实施例8中的方法培养小鸡双歧杆菌1.2240(CGMCC)。将该发酵液5500rpm离心10min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，5500rpm离心8min，弃上清，留菌泥(bacteria mire，BM)，菌泥3倍体积加入保护剂C(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.5％、脱脂奶粉10％)，混匀，37℃水浴平衡45min，液氮速冻30s，再低温(-30℃)预冷冻2小时，冷冻干燥18h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为89.14％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为81.86％。
实施例19
按照实施例8中的方法培养小鸡双歧杆菌1.2240(CGMCC)。将该发酵液9000rpm离心4min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，6500rpm离心5min，弃上清，留菌体，将上述菌泥继续用生理盐水洗涤，7500rpm离心5min，弃上清得洗涤菌泥(washed bacteria mire，WBM)，按菌泥3倍体积加入保护剂C(水苏糖2.0％、谷氨酸钠0.4％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉8％)，混匀，37℃水浴平衡45min，液氮速冻60s，再低温(-30℃)预冷冻1小时，冷冻干燥24h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为77.08％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为68.12％。
实施例20
在适宜条件下培养两歧双歧杆菌1.2212(CGMCC)。将该发酵液4500rpm离心8min，弃上清，留菌体，将上述菌体继续用生理盐水洗涤，8500rpm离心3min，弃上清得洗涤菌泥(washed bacteria mire，WBM)，按菌泥3倍体积加入保护剂C(水苏糖3％、谷氨酸钠0.6％、半乳糖1％、脱脂奶粉15％)，混匀，37℃水浴平衡45min，液氮速冻100s，再低温(-30℃)预冷冻2小时，冷冻干燥24h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为90.13％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为84.81％。
其所述的在适宜条件下培养所用的培养基为：肉汤提取物3g，胰蛋白胨(BBL公司生产)5g，酵母提取物5g，蛋白质酶解物No.3(Difco公司生产)10g，植酮(BBL公司生产)3g，肝浸出物150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml，溶液B 5ml，吐温-801g，L-半胱氨酸盐酸盐溶液10ml(0.05g/L)，马血50ml，蒸馏水825ml，pH 7.2。动物浸膏的制备：加10g干粉于170ml水中，50℃到60℃下保温1h，加热至沸腾，维持5min，调pH 7.2，过滤。盐溶液A：KH2PO410g，K2HPO410g，水100ml。盐溶液B：MgSO4·7H2O 4g，MnSO4·H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，水100ml。也可以是其他乳酸菌培养基。以上培养基(液体)121℃灭菌15min，冷却备用；厌氧培养，培养温度35℃，每间隔2～3h进行120rpm搅拌，持续10min，培养48-72小时，得到该双歧杆菌的发酵液。
实施例21
按照实施例20的方法培养动物双歧杆菌1.2268(CGMCC)。将该发酵液7000rpm离心8min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，2500rpm离心5min，弃上清，留菌体，将上述菌泥继续用生理盐水洗涤，9500rpm离心3min，弃上清得洗涤菌泥(washed bacteria mire，WBM)，按菌泥3倍体积加入保护剂C(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.5％、脱脂奶粉10％)，混匀，37℃水浴平衡45min，液氮速冻75s，再低温(-30℃)预冷冻3小时，冷冻干燥24h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为90.47％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为81.32％。
实施例22
按照实施例20的方法培养婴儿双歧杆菌1.2202(CGMCC)。按实施例21的方法制备菌泥和冻干保护，得到该菌冻干粉的的保护率为80.11％。6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为69.89％。
实施例23
按照实施例20的方法培养猪双歧杆菌1.2184(CGMCC)、备菌泥和冻干保护，得到该菌冻干粉的的保护率为83.04％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为76.45％。
实施例24
按照实施例20的方法培养长双歧杆菌1.2186(CGMCC)，按实施例21的方法制备菌泥和冻干保护，得到该菌冻干粉的的保护率为79.44％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为66.32％。
实施例25
在适宜条件下培养德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.Bulgaricus)1.2161(CGMCC)。将该发酵液8500rpm离心5min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，8000rpm离心5min，弃上清，留菌体，菌泥2.5倍体积加入保护剂G(水苏糖1.5％、谷氨酸钠0.2％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉10％)，混匀，37.5℃水浴平衡30min，液氮速冻30s，冷冻干燥20h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为63.63％。常温保存1月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为56.70％。
其所述的在适宜条件下培养所用的培养基为：酪蛋白胨10g/L，肉汤提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，吐温-801g/L，K2HPO42g/L，醋酸钠5g/L，柠檬酸二铵2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，pH 6.2～6.5，也可以是其他乳酸菌培养基。以上液体培养基经121℃灭菌15min，冷却备用；培养温度35℃，每间隔2～3h进行120rpm搅拌10min，培养18～72小时，得到该菌的发酵液。
实施例26
在适宜条件下培养干酪乳杆菌(L.casei)1.539(CGMCC)。将该发酵液10000rpm离心7min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，6000rpm离心8min，弃上清，留菌体，菌泥2.5倍体积加入保护剂H(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉10％)，混匀，37.5℃水浴平衡35min，液氮速冻40s，冷冻干燥20h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为90.63％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为82.69％。
所述的在适宜条件下培养使用的培养基为：蛋白胨10克，牛肉膏10克，酵母浸膏5克，葡萄糖20克，磷酸氢二钾2克，醋酸钠5克，柠檬酸铵2克，硫酸镁0.2克，硫酸锰0.2克，吐温-801毫升，水1000毫升，琼脂1.5～2.0％，pH6.2～6.5，也可以是其他乳酸菌培养基。以上液体培养基经121℃灭菌15min，冷却备用；培养温度35℃，每间隔2～3h进行120rpm搅拌10min，培养18～72小时，得到该菌的发酵液。
实施例27
按照实施例25的方法培养鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus CICC 6157)。将该发酵液8000rpm离心10min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，7000rpm离心7min，弃上清，留菌体，菌泥2.0倍体积加入保护剂H(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉10％)，混匀，37.5℃水浴平衡35min，液氮速冻20s，冷冻干燥20h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为83.33％。常温保存1月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为75.36％。
实施例28
按照实施例20的方法培养培养嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)1.2467(CGMCC)。将该发酵液9500rpm离心8min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，9000rpm离心6min，弃上清，留菌体，菌泥2.0倍体积加入保护剂I(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.4％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉10％)，混匀，37.8℃水浴平衡45min，液氮速冻40s，冷冻干燥20h，立即复水，37.0℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为89.35％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为85.03％。
所述的在适宜条件下培养使用的培养基为：酪蛋白胨10g/L，肉汤提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，吐温-801g/L，K2HPO42g/L，醋酸钠5g/L，柠檬酸二铵2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，pH 6.2-6.5，也可以是其他乳酸菌培养基。以上液体培养基经121℃灭菌15min，冷却备用；培养温度35℃，每间隔2～3h进行120rpm搅拌10min，培养18～72小时，得到该菌的发酵液。
实施例29
按照实施例26的方法培养植物乳杆菌(L.plantarum)1.242(CGMCC)。将该发酵液3500rpm离心12min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，8000rpm离心8min，弃上清，留菌体，菌泥2.0倍体积加入保护剂I(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.4％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉10％)，混匀，37.8℃水浴平衡45min，液氮速冻40s，冷冻干燥20h，立即复水，37.0℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为81.30％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为70.28％。
实施例30
按照实施例26的方法培养戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)10196(CICC)。将该发酵液4000rpm离心13min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，12000rpm离心4min，弃上清，留菌体，菌泥2.0倍体积加入保护剂I(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.4％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉10％)，混匀，37.8℃水浴平衡45min，液氮速冻80s，冷冻干燥24h，立即复水，37.0℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为82.76％。常温保存3月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为73.19％。
实施例31
在适宜条件下培养粪肠球菌(Enterococcus faecalis)1.125。将该发酵液4000rpm离心15min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，5000rpm离心8min，弃上清，留菌体，菌泥2.0倍体积加入保护剂J(水苏糖3.0％、谷氨酸钠0.2％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉10％)，混匀，37.8℃水浴平衡45min，液氮速冻30s，冷冻干燥22h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为78.26％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为65.03％。
所述的在适宜条件下培养使用的培养基为：酵母浸膏7.5克，蛋白胨7.5克，葡萄糖10克，磷酸二氢钾2克，番茄汁100毫升，吐温800.5毫升，水900毫升，pH7.0，也可以是其他乳酸菌培养基。以上液体培养基经121℃灭菌15min，冷却备用；培养温度35℃，每间隔2～3h进行120rpm搅拌10min，培养18～72小时，得到该菌的发酵液。
实施例32
按照实施例26的方法培养屎肠球菌(Enterococcus faecium)1.2334(CGMCC)。将该发酵液11000rpm离心6min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，5500rpm离心8min，弃上清，留菌体，菌泥2.5倍体积加入保护剂J(水苏糖3.0％、谷氨酸钠0.2％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉10％)，混匀，37.8℃水浴平衡45min，液氮速冻30s，冷冻干燥24h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为90.55％。低温保存12月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为83.65％。
实施例33
按照实施例26的方法培养乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)1.4(CGMCC)。将该发酵液12000rpm离心5min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，11000rpm离心5min，弃上清，留菌体，菌泥2.5倍体积加入保护剂I(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.4％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉10％)，混匀，37.8℃水浴平衡45min，液氮速冻80s，冷冻干燥24h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为89.13％。低温保存8月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为84.37％。
实施例34
按照实施例31的方法培养乳酸乳球菌(Lactococcus lactics)1.2829(CGMCC)。将该发酵液9500rpm离心7min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，9500rpm离心4min，弃上清，留菌体，菌泥2.5倍体积加入保护剂I(水苏糖2.5％、谷氨酸钠0.4％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉10％)，混匀，37.8℃水浴平衡45min，液氮速冻30s，冷冻干燥24h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为87.80％。低温保存10月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为80.05％。
实施例35
按照实施例31的方法培养乳酸乳球菌(Lactococcus lactics)23609(CICC)。将该发酵液7500rpm离心9min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，10000rpm离心5min，弃上清，留菌体，菌泥2.5倍体积加入保护剂K(水苏糖3.5％、谷氨酸钠0.4％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉12％)，混匀，37.8℃水浴平衡45min，液氮速冻30s，冷冻干燥24h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为90.88％。低温保存12月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为86.01％。
实施例36
在适宜条件下培养产朊假丝酵母(Candida utilis)2.1004(CGMCC)。将该发酵液4500rpm离心14min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，6500rpm离心8min，弃上清，留菌体，菌泥2.5倍体积加入保护剂L(水苏糖3.5％、谷氨酸钠0.6％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉15％)，混匀，37.8℃水浴平衡45min，液氮速冻30s，冷冻干燥24h，立即复水，37.5℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为92.08％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为84.19％。
所述的适宜培养条件为：先按照后述的产朊假丝酵母培养基配方配制液体培养基，经121℃，灭菌30分钟，pH＝5.8～6.0，冷却到32～37℃，然后接种产朊假丝酵母5％(V/V)于32℃培养35小时，搅速220rpm，通气量为2.5VVM，得到产朊假丝酵母发酵液；所述的产朊假丝酵母培养液为按下述比例配制的混合液：120目豆粕粉0.9％、120目鱼粉0.8％、120目玉米面0.9％、葡萄糖0.8％、NaCl 0.2％、Na2HPO40.5％，消泡剂0.03％。也可使用其它酵母培养基配方。
实施例37
按照实施例36的方法培养酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2.1793(CGMCC)。将该发酵液6000rpm离心8min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，9000rpm离心7min，弃上清，留菌体，菌泥3倍体积加入保护剂M(水苏糖2.0％、谷氨酸钠0.4％、半乳糖0.4％、脱脂奶粉15％)，混匀，37℃水浴平衡40min，液氮速冻80s，冷冻干燥20h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为90.33％。低温保存9月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为81.65％。
实施例38
按照实施例36的方法培养深红酵母(Rhodotorula rubra)2.1515(CGMCC)。将该发酵液7500rpm离心11min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，4500rpm离心5min，弃上清，留菌体，菌泥3倍体积加入保护剂N(水苏糖3.5％、谷氨酸钠0.6％、半乳糖0.4％、脱脂奶粉6％)，混匀，37℃水浴平衡45min，液氮速冻80s，冷冻干燥18h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为83.76％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为76.61％。
实施例39
按照实施例36的方法培养中国红酵母(Rhodotorula sinensis)2.1391(CGMCC)。将该发酵液8000rpm离心13min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，5000rpm离心8min，弃上清，留菌体，菌泥3倍体积加入保护剂O(水苏糖3.0％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖0.6％、脱脂奶粉12％)，混匀，37℃水浴平衡40min，液氮速冻80s，冷冻干燥20h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为90.35％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为85.36％。
实施例40
按照实施例36的方法培养中国红酵母(Rhodotorula sinensis)2.1391(CGMCC)。将该发酵液4000rpm离心10min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，5000rpm离心8min，弃上清，留菌体，菌泥3倍体积加入保护剂P(水苏糖3.0％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖1.0％、脱脂奶粉10％)，混匀，37℃水浴平衡40min，液氮速冻80s，冷冻干燥20h，立即复水，37.8℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为91.30％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为86.43％。
实施例40
按照实施例36的方法培养中国红酵母(Rhodotorula sinensis)2.1391(CGMCC)。将该发酵液4000rpm离心10min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，6000rpm离心7min，弃上清，留菌体，菌泥3倍体积加入保护剂Q(水苏糖5.5％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖0.5％、脱脂奶粉12.5％)，混匀，37℃水浴平衡40min，液氮速冻80s，冷冻干燥20h，立即复水，37℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为88.55％。常温保存6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为83.64％。
实施例41
按照实施例36的方法培养中国红酵母(Rhodotorula sinensis)2.1391(CGMCC)。将该发酵液2000rpm离心15min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，12000rpm离心3min，弃上清，留菌体，菌泥3.5倍体积加入保护剂Q(水苏糖3.5％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖0.5％、脱脂奶粉12.5％)，混匀，20℃水浴平衡70min，液氮速冻15s，18℃预冷1h，冷冻干燥20h，立即复水，37℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为87.30％。6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为82.14％。
实施例42
按照实施例36的方法培养中国红酵母(Rhodotorula sinensis)2.1391(CGMCC)。将该发酵液12000rpm离心5min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，8000rpm离心5min，弃上清，留菌体，菌泥0.5倍体积加入保护剂K(水苏糖3.5％、谷氨酸钠0.4％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉12％)，混匀，37.8℃水浴平衡20min，液氮速冻15s，冷冻干燥30h，立即复水，38.5℃水浴20min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为88.35％。低温保存12月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为80.37％。
实施例43
按照31的方法培养乳酸乳球菌(Lactococcus lactics)23609(CICC)。将该发酵液8000rpm离心8min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，5000rpm离心7min，弃上清，留菌体，菌泥1.5倍体积加入保护剂K(水苏糖3.5％、谷氨酸钠0.4％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉12％)，混匀，37℃水浴平衡40min，预冷冻4h，冷冻干燥16h，立即复水，37℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为86.75％。6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为82.62％。
实施例44
按照实施例31的方法培养乳酸乳球菌(Lactococcus lactics)23609(CICC)。将该发酵液8000rpm离心8min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，5000rpm离心7min，弃上清，留菌体，菌泥1.5倍体积加入保护剂K(水苏糖3.5％、谷氨酸钠0.4％、半乳糖1.2％、脱脂奶粉12％)，混匀，37℃水浴平衡40min，预冷冻4h，冷冻干燥16h，立即复水，37℃水浴45min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为86.75％。6月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为82.62％。
实施例45
按照实施例36的方法培养中国红酵母(Rhodotorula sinensis)2.1391(CGMCC)。将该发酵液7000rpm离心9min，弃上清，留菌体，取一定量生理盐水洗涤，6000rpm离心6min，弃上清，留菌体，菌泥3.5倍体积加入保护剂Q(水苏糖3.5％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖0.5％、脱脂奶粉12.5％)，混匀，37℃水浴平衡40min，预冷冻1.5h，液氮速冻20s，冷冻干燥20h，立即复水，37℃水浴30min，混匀，连续稀释计数，计算存活率，得到保护剂的保护率为89.90％。低温保存9月后同样的复水步骤计算存活率，得到保护剂的保护率为82.25％。
Claims (10)
1、水苏糖在制备冷冻干燥菌剂中的应用。
2、含有水苏糖的冷冻干燥保护剂。
3、如权利要求2所述的冷冻干燥保护剂，其组成按重量体积百分比含有：
水苏糖 0.8～5.5％
谷氨酸钠 0.1～0.6％
半乳糖 0.4～1.5％
脱脂奶粉 6～15％。
4、如权利要求3所述的冷冻干燥保护剂，其特征在于，其组成按重量体积百分比含有：
水苏糖 1.8-3.5％
谷氨酸钠 0.2-0.5％
半乳糖 0.5-1.2％
脱脂奶粉 8.5-12.5％。
5、如权利要求3所述的冷冻干燥保护剂，其特征在于，其组成按重量体积百分比含有：
水苏糖 3％
谷氨酸钠 0.3％
半乳糖 1％
脱脂奶粉 10％。
6、权利要求2～5任一项所述冷冻干燥保护剂在微生物冷冻干燥中的应用。
7、如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述微生物为双歧杆菌、乳酸菌或酵母菌。
8、一种菌剂的制备方法，包括如下步骤：制备菌泥，向菌泥中加入0.5～3.5倍菌泥体积的权利要求2～5任一项所述的保护剂，混匀，20.0～37.8℃水浴平衡20～70min，液氮速冻15～100s和/或在-18℃～-40℃预冷冻1～4小时，然后冷冻干燥16～30h。
9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述菌泥的制备方法是将微生物发酵液2000～12000rpm离心5～15min，弃上清，留菌泥。
10、如权利要求9所述的方法，其特征在乎，还包括将所述菌泥继续用生理盐水洗涤，然后2000～12000rpm离心3～8min，弃上清得洗涤菌泥。
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