CN102408993A - 一种两歧双歧杆菌抗冻培养基及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种两歧双歧杆菌抗冻培养基，包括以下组分：16-20g乳糖、3-5g酵母提取物、6-9g氯化钠、0.6-1.0g山梨醇、0.2-0.5g谷氨酸，8-12g大豆蛋白胨、0.5-2.0g柠檬酸氢二铵、0.2-0.5g甜菜碱、1.0-2.5g磷酸氢二钾、0.4-0.8g抗坏血酸钠、0.1-0.2gMgSO4、0.5-1.0ml吐温80、3-5g半胱氨酸盐酸盐和1000ml蒸馏水。采用该抗冻培养基制备的两歧双歧杆菌冻干菌粉，冻干存活率在58％以上，活菌数在2.0×1011cfu/g以上，而以MRS肉汤制备的菌粉冻干存活率最高为8.74％；本发明所述两歧双歧杆菌抗冻培养基不含脱脂乳粉和海藻糖，解决了菌粉在贮存中易吸水变潮的问题。
Description
技术领域
本发明属于双歧杆菌制品生产技术领域，涉及一种提高冻干存活率的两歧双歧杆菌抗冻培养基及其应用方法。
背景技术
双歧杆菌(Bifidobacteria)最早于1899年由法国学者Tissier从母乳营养婴儿的粪便中分离出，该菌形态多变，常呈Y字形、V字形、弯曲、棍棒、鹿角状或分叉，故称双歧杆菌。目前已发现的双歧杆菌有36种，其中从人体分离的有12种，国家卫生部规定可用于保健食品的有5种，分别为两歧双歧杆菌(B.bifidum)，短双歧杆菌(B.breve)，长双歧杆菌(B.longum)，青春双歧杆菌(B.adolescentis)，婴儿双歧杆菌(B.infantis)。双歧杆菌伴随人体的一生，只有在患病、衰老或其他不利条件下才减少，甚至消失。作为一种优良的生态菌种，双歧杆菌与机体的健康状况密切相关，具有抑制肠道病原菌生长、改善蛋白质代谢、提供维生素、降低胆固醇、提高免疫机能等生理功能，因此已被开发成微生态制剂广泛应用于医疗、保健和食品等领域，并已成为微生态制剂的核心。
真空冷冻干燥是制备和保存双歧杆菌最有效的方法之一，双歧杆菌细胞在冻干过程中要经受冷冻和干燥两种激烈因素的作用，导致菌体死亡。影响两歧双歧杆菌冻干效果的因素有很多，主要有菌株自身特性、培养基、培养条件、菌龄、预冻条件、菌悬液浓度、冻干保护剂、亚致死处理等，目前对两歧双歧杆菌冻干菌粉的研究主要集中在制备过程中冻干保护剂的筛选方面，并获得了各种冻干保护剂配方，如ZL200610012689.5中公开了一种高活性双歧杆菌干粉制剂的复合保护剂，其配方组成为β-环糊精10g、乳糖2-5g、海藻糖0.5-2.0g、酵母膏0.5-2.0g，维生素E0.05-0.1g及蒸馏水100ml；ZL200610012690.8中也公开了一种直投式双歧杆菌纯种冻干发酵剂的复合保护剂，其配方组成为脱脂乳粉10g、乳糖3-6g、海藻糖1.0-2.0g、吐温800.05-1.0g、酵母膏0.5-1.0g，血清0.5-1g、维生素E0.05-0.2g及蒸馏水100ml；ZL200710006529.4中也公开了一种双歧杆菌活菌制剂及其专用保护剂，其配方组成为甘油0.01-5.0份，聚乙烯吡咯烷酮0.1-6.0份、聚乙二醇0.1-5.0份、脱脂奶粉1.0-10.0份、海藻糖0.5-15.0份、谷氨酸钠0.1-5.0份、L-天冬氨酸0.1-5.0份、维生素C钠0.1-5.0份、鸟氨酸盐酸盐0.1-5.0份。目前，尚没有研究培养基组成对两歧双歧杆菌冻干存活率的影响，更没有筛选及优化得到提高两歧双歧杆菌冻干存活率的抗冻培养基。
发明内容
本发明的目的在于提供一种两歧双歧杆菌抗冻培养基及其应用方法，该抗冻培养基解决了两歧双歧杆菌在冻干过程中存在的冻干存活率不高，活菌数低、冻干菌粉容易吸水潮湿以及不便在非乳制品如制剂、胶囊等中使用的问题。
一种两歧双歧杆菌抗冻培养基，该抗冻培养基的配方组成包括以下组分：16-20g乳糖、3-5g酵母提取物、6-9g氯化钠、0.6-1.0g山梨醇、0.2-0.5g谷氨酸，8-12g大豆蛋白胨、0.5-2.0g柠檬酸氢二铵、0.2-0.5g甜菜碱、1.0-2.5g磷酸氢二钾、0.4-0.8g抗坏血酸钠、0.1-0.2g MgSO4、0.5-1.0ml吐温80、3-5g半胱氨酸盐酸盐和1000ml蒸馏水。
所述抗冻培养基的配方组成包括以下组分：18g乳糖、4g酵母提取物、7g氯化钠、0.6g山梨醇、0.3g谷氨酸，10g大豆蛋白胨、1.5g柠檬酸氢二铵、0.3g甜菜碱、2.0g磷酸氢二钾、0.5g抗坏血酸钠、0.15g MgSO4、1.0ml吐温80、4g半胱氨酸盐酸盐和1000ml蒸馏水。
所述抗冻培养基的配方组成包括以下组分：20g乳糖、5g酵母提取物、6g氯化钠、0.8g山梨醇、0.4g谷氨酸，8g大豆蛋白胨、2.0g柠檬酸氢二铵、0.5g甜菜碱、1.0g磷酸氢二钾、0.8g抗坏血酸钠、0.2g MgSO4、1.0ml吐温80、3.5g半胱氨酸盐酸盐和1000ml蒸馏水。
所述抗冻培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)将准确称取的乳糖、酵母提取物、氯化钠、大豆蛋白胨、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、MgSO4和吐温80溶解于950mL蒸馏水中，加热溶解并混合均匀，用1mol/L NaOH调节pH至6.2-6.8，装于厌氧瓶中，装量为90％，并在厌氧瓶盖的橡胶塞上插1ml注射器针头，然后在118-121℃灭菌15-20min，灭菌后拔下注射器针头，并冷却至室温得培养基A，备用；
(2)将准确称取的抗坏血酸钠、山梨醇、谷氨酸、半胱氨酸盐酸盐及甜菜碱溶解于50ml蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌得滤液；
(3)在超净工作台中按照无菌操作要求，将滤液用无菌注射器与培养基A混合均匀，即得两歧双歧杆菌抗冻培养基。
上述两歧双歧杆菌抗冻培养基的应用方法，包括以下步骤：
将两歧双歧杆菌活化三次、检查无杂菌，且形态无异常后，按4％(v/v)的接种量接入抗冻培养基中于37℃恒温培养16-18h，然后7000r/min离心10-15min，弃去上清液，得到两歧双歧杆菌菌泥，并称量菌泥质量，然后向菌泥中加入pH6.8的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的加入有利于进一步提高冻干存活率，每克菌泥中加入1ml磷酸缓冲液，混合均匀后于-40℃预冻3-12h，然后放入冻干机于-56℃、4-6Pa下进行冷冻干燥18-24h，即得两歧双歧杆菌菌粉。
本发明所述两歧双歧杆菌抗冻培养基在现有培养基组分的基础上添加了甜菜碱，氯化钠，山梨醇等组分，各组分按照比例混合后形成抗冻培养基，与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：采用该抗冻培养基制备的两歧双歧杆菌冻干菌粉，冻干存活率＞58％，菌粉活菌数＞2.0×1011cfu/g，而以两歧双歧杆菌培养常用的商业培养基——MRS肉汤制备的菌粉冻干存活率最高仅为8.74％，活菌数最高为0.74×1011cfu/g；本发明所述两歧双歧杆菌抗冻培养基通过添加磷酸缓冲液作为保护剂制备的两歧双歧杆菌菌粉不含脱脂乳粉和海藻糖，解决了两歧双歧杆菌菌粉在贮存过程中存在的易吸水变潮等问题，方便了冻干菌粉在非乳制品如制剂及胶囊等中的使用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
(1)将准确称取的18g乳糖、4g酵母提取物、7g氯化钠、10g大豆蛋白胨、1.5g柠檬酸氢二铵、2.0g磷酸氢二钾、0.15g MgSO4和1.0ml吐温80溶解于950mL蒸馏水中，加热溶解并混合均匀，用1mol/L NaOH调节pH至6.2后装于厌氧瓶中，装量为90％，并在厌氧瓶盖的橡胶塞上插1ml注射器针头，然后在121℃灭菌15min，灭菌后拔下注射器针头，并冷却至室温得培养基A；(2)将准确称取的0.5g抗坏血酸钠、0.6g山梨醇、0.3g谷氨酸、4.0g半胱氨酸盐酸盐及0.3g甜菜碱溶解于50ml蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌得滤液；(3)在超净工作台中按照无菌操作要求，将滤液用无菌注射器与培养基A混合均匀，即得两歧双歧杆菌抗冻培养基。
将两歧双歧杆菌活化三次、检查无杂菌，且形态无异常后，按4％(v/v)的接种量分别接入上述抗冻培养基和商业MRS肉汤培养基(对照)中于37℃恒温培养18h，然后7000r/min离心10min，弃去上清液，得两歧双歧杆菌菌泥，并称量菌泥质量，向菌泥中加入pH6.8的磷酸缓冲液，每克菌泥中加入1ml磷酸缓冲液，混合均匀后于-40℃预冻4h，然后放入冻干机于-56℃、4Pa下进行冷冻干燥20h，即得两歧双歧杆菌菌粉，冻干存活率为58.86％(对照为8.38％)，菌粉活菌数为2.79×1011cfu/g(对照为0.62×1011cfu/g)。
实施例2
(1)将准确称取的20g乳糖、5g酵母提取物、6g氯化钠、8g大豆蛋白胨、2.0g柠檬酸氢二铵、1.0g磷酸氢二钾、0.2g MgSO4和1.0ml吐温80溶解于950mL蒸馏水中，加热溶解并混合均匀，用1mol/L NaOH调节pH至6.8后装于厌氧瓶中，装量为90％，并在厌氧瓶盖的橡胶塞上插1ml注射器针头，然后在118℃灭菌20min，灭菌后拔下注射器针头，并冷却至室温得培养基A；(2)将准确称取的0.8g抗坏血酸钠、0.8g山梨醇、0.4g谷氨酸、3.5g半胱氨酸盐酸盐及0.5g甜菜碱溶解于50ml蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌得滤液；(3)在超净工作台中按照无菌操作要求，将滤液用无菌注射器与培养基A混合均匀，即得两歧双歧杆菌抗冻培养基。
将两歧双歧杆菌活化三次、检查无杂菌，且形态无异常后，按4％(v/v)的接种量分别接入上述抗冻培养基和商业MRS肉汤培养基(对照)中于37℃恒温培养18h，然后7000r/min离心10min，弃去上清液，得两歧双歧杆菌菌泥，并称量菌泥质量，向菌泥中加入pH6.8的磷酸缓冲液，每克菌泥中加入1ml磷酸缓冲液，混合均匀后于-40℃预冻4h，然后放入冻干机于-56℃、6Pa下进行冷冻干燥24h，即得两歧双歧杆菌菌粉，冻干存活率为59.54％(对照为8.74％)，菌粉活菌数为2.83×1011cfu/g(对照为0.74×1011cfu/g)。
实施例3
(1)将准确称取的17g乳糖、3g酵母提取物、9g氯化钠、8g大豆蛋白胨、1.0g柠檬酸氢二铵、2.0g磷酸氢二钾、0.2g MgSO4和0.5ml吐温80溶解于950mL蒸馏水中，加热溶解并混合均匀，用1mol/L NaOH调节pH至6.5后装于厌氧瓶中，装量为90％，并在厌氧瓶盖的橡胶塞上插1ml注射器针头，然后在119℃灭菌18min，灭菌后拔下注射器针头，并冷却至室温得培养基A；(2)将准确称取的0.4g抗坏血酸钠、1.0g山梨醇、0.2g谷氨酸、5.0g半胱氨酸盐酸盐及0.4g甜菜碱溶解于50ml蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌得滤液；(3)在超净工作台中按照无菌操作要求，将滤液用无菌注射器与培养基A混合均匀，即得两歧双歧杆菌抗冻培养基。
将两歧双歧杆菌活化三次、检查无杂菌，且形态无异常后，按4％(v/v)的接种量分别接入上述抗冻培养基和商业MRS肉汤培养基(对照)中于37℃恒温培养16h，然后7000r/min离心15min，弃去上清液，得两歧双歧杆菌菌泥，并称量菌泥质量，向菌泥中加入pH6.8的磷酸缓冲液，每克菌泥中加入1ml磷酸缓冲液，混合均匀后于-40℃预冻12h，然后放入冻干机于-56℃、5Pa下进行冷冻干燥18h，即得两歧双歧杆菌菌粉，冻干存活率为58.54％(对照为8.32％)，菌粉活菌数为2.75×1011cfu/g(对照为0.71×1011cfu/g)。
实施例4
(1)将准确称取的16g乳糖、5g酵母提取物、8g氯化钠、12g大豆蛋白胨、0.5g柠檬酸氢二铵、2.5g磷酸氢二钾、0.1g MgSO4和0.5ml吐温80溶解于950mL蒸馏水中，加热溶解并混合均匀，用1mol/L NaOH调节pH至6.4后装于厌氧瓶中，装量为90％，并在厌氧瓶盖的橡胶塞上插1ml注射器针头，然后在120℃灭菌20min，灭菌后拔下注射器针头，并冷却至室温得培养基A；(2)将准确称取的0.6g抗坏血酸钠、0.7g山梨醇、0.5g谷氨酸、3.0g半胱氨酸盐酸盐及0.2g甜菜碱溶解于50ml蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌得滤液；(3)在超净工作台中按照无菌操作要求，将滤液用无菌注射器与培养基A混合均匀，即得两歧双歧杆菌抗冻培养基。
将两歧双歧杆菌活化三次、检查无杂菌，且形态无异常后，按4％(v/v)的接种量分别接入上述抗冻培养基和商业MRS肉汤培养基(对照)中于37℃恒温培养17h，然后7000r/min离心12min，弃去上清液，得两歧双歧杆菌菌泥，并称量菌泥质量，向菌泥中加入pH6.8的磷酸缓冲液，每克菌泥中加入1ml磷酸缓冲液，混合均匀后于-40℃预冻3h，然后放入冻干机于-56℃、4Pa下进行冷冻干燥22h，即得两歧双歧杆菌菌粉，冻干存活率为59.11％(对照为8.78％)，菌粉活菌数为2.81×1011cfu/g(对照为0.75×1011cfu/g)。
Claims (5)
1.一种两歧双歧杆菌抗冻培养基，其特征在于：该抗冻培养基的配方组成包括以下组分：16-20g乳糖、3-5g酵母提取物、6-9g氯化钠、0.6-1.0g山梨醇、0.2-0.5g谷氨酸，8-12g大豆蛋白胨、0.5-2.0g柠檬酸氢二铵、0.2-0.5g甜菜碱、1.0-2.5g磷酸氢二钾、0.4-0.8g抗坏血酸钠、0.1-0.2g MgSO4、0.5-1.0ml吐温80、3-5g半胱氨酸盐酸盐和1000ml蒸馏水。
2.根据权利要求1所述一种两歧双歧杆菌抗冻培养基，其特征在于：所述抗冻培养基的配方组成包括以下组分：18g乳糖、4g酵母提取物、7g氯化钠、0.6g山梨醇、0.3g谷氨酸，10g大豆蛋白胨、1.5g柠檬酸氢二铵、0.3g甜菜碱、2.0g磷酸氢二钾、0.5g抗坏血酸钠、0.15g MgSO4、1.0ml吐温80、4g半胱氨酸盐酸盐和1000ml蒸馏水。
3.根据权利要求1所述一种两歧双歧杆菌抗冻培养基，其特征在于：所述抗冻培养基的配方组成包括以下组分：20g乳糖、5g酵母提取物、6g氯化钠、0.8g山梨醇、0.4g谷氨酸，8g大豆蛋白胨、2.0g柠檬酸氢二铵、0.5g甜菜碱、1.0g磷酸氢二钾、0.8g抗坏血酸钠、0.2g MgSO4、1.0ml吐温80、3.5g半胱氨酸盐酸盐和1000ml蒸馏水。
4.根据权利要求1、2或3所述一种两歧双歧杆菌抗冻培养基，其特征在于：所述抗冻培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)将称取的乳糖、酵母提取物、氯化钠、大豆蛋白胨、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、MgSO4和吐温80溶解于950mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.2-6.8，然后在118-121℃灭菌15-20min，灭菌后冷却至室温得培养基A；
(2)将称取的抗坏血酸钠、山梨醇、谷氨酸、半胱氨酸盐酸盐及甜菜碱溶解于50ml蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌得滤液；
(3)将滤液与培养基A混合均匀，即得两歧双歧杆菌抗冻培养基。
5.一种如权利要求1所述两歧双歧杆菌抗冻培养基的应用方法，包括以下步骤：
将两歧双歧杆菌活化后按4％的接种量接入抗冻培养基中于37℃培养16-18h，然后7000r/min离心10-15min，得两歧双歧杆菌菌泥，向菌泥中加入pH6.8的磷酸缓冲液，每克菌泥中加入1ml磷酸缓冲液，混合均匀后于-40℃预冻3-12h，然后放入冻干机于-56℃、4-6Pa下进行冷冻干燥18-24h，即得两歧双歧杆菌菌粉。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: ENZYME ENGINEERING INST., SHAANXI PROV. Effective date: 20120509 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20120509 Address after: 710021 Shaanxi province Xi'an Weiyang University Park No. 1 Applicant after: Shaanxi Research Institute of Agricultural Products Processing Technology Co-applicant after: Enzyme Engineering Inst., Shaanxi Prov. Address before: 710021 Shaanxi province Xi'an Weiyang University Park No. 1 Applicant before: Shaanxi Research Institute of Agricultural Products Processing Technology |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130619 Termination date: 20161123 |
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