CN102220260B

CN102220260B - 一种植物乳杆菌的冻干工艺

Info

Publication number: CN102220260B
Application number: CN 201110103701
Authority: CN
Inventors: 季海峰; 张董燕; 刘辉; 王四新; 王雅民; 王晶; 单达聪
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2011-04-25
Filing date: 2011-04-25
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2031-04-25
Also published as: CN102220260A

Abstract

本发明一种植物乳杆菌的冻干工艺，属于微生物制剂制备工艺。一种植物乳杆菌的冻干工艺，工艺参数为：冻干保护剂pH为7.0～7.5，菌泥与保护剂平衡时间为20～40分钟，-80℃条件下预冻2.0～2.5小时，采用磷酸缓冲液配制保护剂，冻干存活率可达90％以上，活菌数可达4.0×10¹⁰cfu/g以上，与常规方法相比，显著提高了植物乳杆菌冻干存活率。

Description

一种植物乳杆菌的冻干工艺

技术领域

本发明涉及微生物制剂制备工艺，特别是涉及一种由植物乳杆菌组成的直接饲喂动物的活菌制剂的冻干工艺。

背景技术

乳酸菌是人和动物肠道的正常菌群，已有众多研究证明，该菌在抑制病原菌(如沙门氏菌、志贺氏杆菌、螺杆菌等)的生长繁殖，促进机体对营养物质的消化吸收，提高机体免疫力等方面具有重要的生物学功能。近年来，随着人们对抗生素诸多弊端的逐步认识，以及世界各国相继禁止抗生素在饲料中的使用，乳酸菌类益生菌制剂作为一种新型的绿色饲料添加剂正在越来越多地受到人们的重视，也有着良好的发展前景。

然而，乳酸菌对营养条件要求高，对外界的抵抗力差，难以制备和长期保存，严重影响其对动物益生作用的发挥。而真空冷冻干燥法采用低温、干燥、与空气隔绝的过程将乳酸菌进行保存，并可将其直接投入生产，其优点在于：(1)添加保护剂，以减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，增加冻干样品结构的牢固性和保藏期间蛋白质及细胞的稳定性；(2)不同于从液相直接干燥，在冻干过程中很少引起细胞的收缩；(3)利于储存、加工和运输，可延长贮存期，提高稳定性。因此，真空冷冻干燥法被认为是目前保存和制备乳酸菌制剂的最有效方法之一。一般认为，乳酸菌在冷冻干燥过程中，保护剂是影响菌种冻干存活率重要的外部因素，这方面的研究较多，并已证实了单糖或多糖、氨基酸、维生素、脱脂乳等类物质对乳酸菌冻干存活率具有积极的影响。人们在进行乳酸菌冷冻干燥时，往往将研究集中于保护剂的筛选工作上，而忽视冻干工艺这方面的研究，到目前为止，关于乳酸菌冻干工艺的研究较少。

植物乳杆菌是广泛应用的菌种，众多研究表明该菌在抑制病原菌(如沙门氏菌、志贺氏杆菌、螺杆菌等)的生长繁殖，促进机体对营养物质的消化吸收，提高机体免疫力等方面具有重要的生物学功能，是我国农业部允许使用的饲料级微生物菌种之一。目前，在植物乳杆菌现有的冻干工艺中，对于保护剂酸碱度、预冻时间，平衡时间等因素，很少见到有专门的优化这方面的研究，但本发明的试验发现，这些因子对于植物乳杆菌的冻干存活率有着非常重要的影响。为了提高植物乳杆菌的冻干存活率，找到高效、实用的植物乳杆菌冻干工艺，对于菌剂生产、保存以及添加到动物饲料中后的饲喂效果均有积极的意义。

发明内容

本发明根据上述领域的空白和需求，提供一种植物乳杆菌冻干工艺，与现有冻干工艺相比，能够显著提高乳酸菌冻干存活率。

一种植物乳杆菌冻干工艺，步骤如下：

(1)将发酵液离心取菌泥，

(2)将菌泥加入到pH7.0～7.5保护剂中混匀，平衡时间为20～40分钟，并分装于冻干托盘中，

(3)预冻：将冻干托盘置于-80℃，预冻2.0～2.5小时，

(4)抽真空冷冻干燥。

所述保护剂的pH为7.0。

所述平衡时间为30分钟。

所述预冻条件为-80℃，预冻2小时。

所述保护剂采用磷酸缓冲液配制。

所述保护剂配方为14％脱脂奶粉、2％甘油、4％蔗糖、0.15％谷氨酸钠、10％糊精。

上述冻干工艺制备得到的植物乳杆菌冻干制剂。

本发明提供的冻干工艺基于保护剂pH，菌泥与保护剂平衡时间，预冻时间等几个因子来选择最适合植物乳杆菌的冻干工艺产生。对比试验发现本发明所提高的工艺，能够明显提高植物乳杆菌的冻干存活率。

如实施例1所示，其它条件相同的情况下，保护剂的pH值在7.0～7.5之间，比其它pH值范围的冻干工艺的冻干存活率高，这主要是由于：在冻干前，乳酸菌菌体细胞存在着外部pH值和内部pH值，两者之差为pH值梯度(ΔpH)，此值是质子移动的动力(pmf)，可以作为横跨膜运输过程的能量来源，而冻干会造成pH值梯度(ΔpH)的破坏，导致乳酸菌细胞的功能性损伤，造成菌体死亡，而通过调节保护剂的pH值可以改变菌体的外部环境，使之尽可能达到冻干前的ΔpH平衡，从而减少菌株由于冻干造成的损伤。

菌泥与保护剂平衡时间为20～40分钟，平衡时间太短不利于保护剂充分渗入菌体内以提高抗冻能力，时间太长，保护剂对菌体的抗冻性保护能力会降低甚至产生副作用。

预冻时间的选择上，选择预冻2.0～2.5小时，预冻时间是影响整个冻干周期的重要因素，在预冻过程中，由于菌体细胞内水分外渗，溶质浓度不断增高，而胞内冰晶的形成均匀增加，因此，预冻时间过长，不仅会使得胞内冰晶刺伤菌体，还会造成能耗的浪费；而预冻时间过短，则会造成产品没有完全冻结，抽真空时会引起起泡、收缩、喷瓶等不可逆变化的发生，影响冻干存活率。

在本发明的优选实施例中，还进一步提高了上述因子的最佳参数，保护剂pH为7.0，菌泥与保护剂平衡30分钟，-80℃预冻2.0小时，本发明进一步还优选采用磷酸缓冲液配制保护剂，在这个参数下与1.2初始设置的常规植物乳杆菌常规冻干工艺对比，植物乳杆菌的冻干存活率高出8个百分点。

附图说明

图1保护剂pH值的对比试验，

横坐标PH，纵坐标冻存率(％)。

图2保护剂与菌泥平衡时间的对比试验

横坐标平衡时间(分钟)，纵坐标冻存率(％)

图3预冻时间对比试验

横坐标预冻时间(分钟)，纵坐标冻存率(％)

图4生理盐水和磷酸盐缓冲液对植物乳杆菌冻干存活率的影响

横坐标：保护剂基质，纵坐标冻存率(％)

图5本发明的冻干工艺与原有技术条件下植物乳杆菌冻干存活率比较

横坐标组别，纵坐标冻存率(％)

具体实施方法

以下通过具体实施方式证明本发明的技术效果。

实施例1保护剂pH对比试验。

1.1材料

植物乳杆菌，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所动物营养与繁育研究室保存，从60日龄断奶仔猪盲肠黏膜分离得到，由中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

冻干保护剂：14％脱脂奶粉+2％甘油+4％蔗糖+0.15％谷氨酸钠+10％糊精。

计数培养基(MRS培养基)：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，无水乙酸钠5.0g，柠檬酸二氨2.0g，吐温-801.0ml，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.19g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH为6.5，121℃灭菌20min。

1.2冻干步骤

冻干基本参数采用植物乳杆菌常规冻干常规参数：具体如下：

将发酵液离心取菌泥后，加入到与发酵液等体积的保护剂(蒸馏水配制，pH6.0)中，待菌泥完全混合均匀后(即平衡时间为10分钟)，然后分装于冻干托盘中，置于低温冰箱中(-80℃)预冻1小时，而后置于真空冷冻干燥机进行抽真空冷冻干燥24小时。其冻干存活率采用以下公式进行：

冻干存活率(％)＝(冻干前样品活菌总数/冻干后样品的活菌总数)×100％

1.3保护剂pH对冻干存活率的影响

设置6个处理，每个处理采用的保护剂pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，其它参数同1.2节，测定冻干粉中活菌数，计算冻干存活率，结果如表1所示。

表1保护剂pH值对植物乳杆菌冻干存活率的影响

由结果可知，保护剂不同pH值对植物乳杆菌冻干存活率具有一定的影响，在保护剂pH较低时，植物乳杆菌冻干存活率随着pH的升高而增加。当保护剂pH持续升高到7.0时，植物乳杆菌的冻干存活率达到最大值，而后开始下降。这主要是由于：在冻干前，乳酸菌菌体细胞存在着外部pH值和内部pH值，两者之差为pH值梯度(ΔpH)，此值是质子移动的动力(pmf)，可以作为横跨膜运输过程的能量来源，而冻干会造成pH值梯度(ΔpH)的破坏，导致乳酸菌细胞的功能性损伤，造成菌体死亡，而通过调节保护剂的pH值可以改变菌体的外部环境，使之尽可能达到冻干前的ΔpH平衡，从而减少菌株由于冻干造成的损伤。

实施例2.菌泥与保护剂平衡时间对冻干存活率的影响

将菌泥离心后加入到保护剂中，设置5个处理，5个处理中菌泥与保护剂平衡时间依次为10，20，30，40，50分钟，其它参数同1.2节，而后进行冷冻干燥，测定冻干粉中活菌数，计算冻干存活率，结果如表2所示。

表2保护剂与菌泥平衡时间对植物乳杆菌冻干存活率的影响

由结果可知，随着保护剂与菌泥的平衡时间的延长，植物乳杆菌的冻干存活率逐渐增加，当平衡时间为30分钟时，菌体冻干存活率达到最高，而后又呈现下降趋势。分析原因是因为：适当延长保护剂与菌泥混合时间，有利于保护剂成分充分扩散分布到乳酸菌菌体的细胞间隙，最大程度上发挥其保护作用，从而提高菌体的抗冻能力。

实施例3.预冻时间对冻干存活率的影响

设置6个处理，将菌泥与保护剂混合后，预冻时间分别采取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0小时，其它参数同1.2节，测定冻干粉中活菌数，计算冻干存活率。结果发现，预冻时间较短时，植物乳杆菌的冻干存活率呈上升趋势，预冻时间为2.0小时，菌株冻干存活率效果最好，而后随着时间的延长，其冻干存活率开始下降。综合考虑时间效率和冻干存活率，1.5～2.5小时之间是比较优选的参数，见表3。

表3预冻时间对植物乳杆菌冻干存活率的影响

预冻影响整个冻干周期的重要因素，在预冻过程中，由于菌体细胞内水分外渗，溶质浓度不断增高，而胞内冰晶的形成均匀增加，因此，预冻时间过长，不仅会使得胞内冰晶刺伤菌体，还会造成能耗的浪费；而预冻时间过短，则会造成产品没有完全冻结，抽真空时会引起起泡、收缩、喷瓶等不可逆变化的发生，影响冻干的品质。因此，选择适宜的预冻时间至关重要。

实施例4.生理盐水和磷酸盐缓冲液对冻干存活率的影响

设置三个处理，采用的保护剂分别为蒸馏水、0.90％生理盐水、pH＝7.0磷酸盐缓冲液配制，将菌体离心取菌泥后分别加入到上述三种不同基质配制的保护剂中，其它参数同1.2节，进行冷冻干燥，测定冻干粉中活菌数，计算冻干存活率。结果如表5所示。

表4生理盐水和磷酸盐缓冲液对植物乳杆菌冻干存活率的影响

在三种保护剂中，植物乳杆菌冻干存活率由高到低的顺序为：pH＝7.0磷酸盐缓冲液＞0.90％生理盐水＞蒸馏水。分析原因：菌体细胞内外存在着渗透压，当用蒸馏水配制保护剂时，会造成细胞内的离子浓度大于外界，渗透压不相等，菌体细胞会不断吸水直至胀裂，造成菌体死亡，而采用生理盐水和磷酸盐缓冲液配制保护剂时，细胞内部的渗透压与环境(生理盐水或缓冲液)相等，水分进出细胞膜的量相等。另外，冻干过程必定对菌体细胞膜上的某些关键酶造成损伤，使细胞代谢受阻，进而造成整个细胞代谢紊乱，以致菌体死亡。而菌体细胞的大部分酶类等蛋白质物质，在一定的盐离子浓度，一定的pH范围内会保持其稳定性，因此，本试验中采用pH7.0磷酸盐缓冲液配制保护剂时，对于提高植物乳杆菌冻干存活率的效果最好。

实施例5.与原有技术的对比试验

试验分为2组，

第1组，采用本试验最佳冻干工艺参数：采用pH＝7.0磷酸盐缓冲液配制的保护剂，保护剂pH为7.0，将菌泥与保护剂平衡30分钟，-80℃预冻2.0小时。

第2组，采用实施例1中1.2节的基本参数，蒸馏水配制的保护剂(pH6.0)，平衡时间为10分钟，-80℃低温冰箱中预冻1小时。

其它同实施例1的1.1～1.2节，其结果见表5。

表5植物乳杆菌冻干存活率的比较

由结果可知，1组效果较好，在本发明提供的冻干参数条件下，植物乳杆菌冻干的冻干存活率最高。

Claims

1.一种植物乳杆菌的冻干工艺，步骤如下：

（1）将发酵液离心取菌泥，

（2）将菌泥加入到pH7.0～7.5保护剂中混匀，平衡时间为20～40分钟，并分装于冻干托盘中，

（3）预冻：将冻干托盘置于-80℃,2.0～2.5小时，

（4）抽真空冷冻干燥，

所述保护剂采用磷酸缓冲液配制，

所述保护剂配方为14%脱脂奶粉、2%甘油、4%蔗糖、0.15%谷氨酸钠、10%糊精。

2.根据权利要求1所述的冻干工艺，所述保护剂的pH为7.0。

3.根据权利要求1所述的冻干工艺，所述平衡时间为30分钟。

4.根据权利要求1所述的冻干工艺，所述预冻条件为-80℃，2小时。