CN110387330A - 利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，包括：菌种活化，得单菌落；将单菌落接种培养，得种子液；将种子液转接至MRS液体培养基中扩大培养，得扩大培养液；将扩大培养液离心，得菌体沉淀；菌体沉淀经PBS缓冲液洗涤后重悬于复合保护剂溶液中，转移至容器中，冷冻干燥，其中，菌种为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1，复合保护剂包含大豆多糖及小分子糖，小分子糖为蔗糖、海藻糖或甘露醇中的任意一种或任意多种。本发明大豆多糖与小分子糖组成的复合保护剂有效避免了植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1在冷冻干燥过程中受到的细胞膜损伤，提高了植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1的细胞存活率。

Description

利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法
技术领域
本发明属于冷冻干燥领域，具体涉及一种利用复合保护剂提高植 物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法。
背景技术
植物乳杆菌属于益生菌，能有效定植于人体肠道中，不仅能抑制 有害菌的增殖，保护肠道等作用，还能有效降低胆固醇、提高免疫力 等功能。因此目前植物乳杆菌不仅广泛应用于发酵产品中，在功能性 食品及临床应用方面也具有巨大潜力。但植物乳杆菌的储存是面临的 难点。为了稳定益生菌类的不稳定的产品，必须降低储存样品中的水 含量使其达到休眠状态。
冷冻是一种可以将水分冻结的单元操作，从而降低样品中的水含 量使其达到休眠状态。然而，在冷冻状态下维持和运输样品是昂贵的， 且可能导致产品的价值损失。或者，样品可通过高加工温度在空气中 干燥，但是传统干燥方式会引起样品物理和化学性质的变化。而冷冻 干燥正好结合了冷冻和干燥的优点，提供干燥、活性高、耐贮存和易 溶解的产品。现在冷冻干燥被广泛用于保存乳酸菌，成为保藏生物材 料最有效的方法之一。
冷冻干燥虽有许多优点，但由于细胞暴露于极端环境的胁迫，会 造成一定的生理损伤，从而降低细胞活力和功能活性。冷冻干燥过程 中的主要损害可归因于细胞膜完整性的变化，流动性，以及敏感蛋白 质的结构等等。细胞体积小、比表面积大的特性，决定了细胞膜水渗 透率高的特点。在冷冻干燥过程中，当温度降低以及真空度增大时， 细胞内水分冻结及蒸发，胞内溶质、电解质等也逐渐被浓缩，导致细 胞过度失水，严重皱缩变形，甚至死亡；另外，在当电解质被高度浓 缩时，细胞内的一些对电解质敏感的蛋白的高级结构会发生改变，特 别是与代谢相关的关键酶，会丧失其生理功能，使生理代谢调控失常， 进而导致细胞冷冻干燥存活率的下降。
为提高细胞对冷冻干燥的抗性，通常会通过使用保护剂以减轻冷 冻干燥带来的损伤。保护剂的种类有很多，而且目前仍然以单保护剂 为主。但往往单保护剂的作用往往是有限的，益生菌尤其植物乳杆菌 冷冻干燥后的存活率仍然不高，亟需研究新的策略。所以近年来一些 研究者对保护剂进行了复配以提高细胞冷冻干燥存活率。譬如，马丽、 刘会平等人通过响应面法得到了鼠李糖乳杆菌复配保护剂的最佳配 方：脱脂乳86.2g/L，海藻糖27.8g/L，谷氨酸钠6.74g/L，可显著提 高鼠李糖乳杆菌的冷冻干燥存活率。Chen等人通过响应面法将280 g/L脱脂乳，240g/L乳糖和48g/L抗坏血酸钠进行复配，显著提高了 保加利亚乳杆菌在冷冻干燥存活率等等。但目前关于植物乳杆菌的复 合保护剂的研究较少，而且目前的复合保护剂中，基本上全部是小分 子化合物之间的复合，很少有大分子和小分子之间复合形成的复合保 护剂。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种利用复 合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法。
本发明提供了一种利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷 冻干燥方法，具有这样的特征，包括如下步骤：步骤1，菌种活化， 得单菌落；步骤2，将单菌落接种培养，得种子液；步骤3，将种子 液转接至MRS液体培养基中扩大培养，得扩大培养液；步骤4，将 扩大培养液离心，得菌体沉淀；步骤5，菌体沉淀经PBS缓冲液洗涤 后重悬于复合保护剂溶液中，转移至容器中，冷冻干燥，其中，菌种 为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1，步骤5中复合保护剂包 含大豆多糖及小分子糖，小分子糖为蔗糖、海藻糖或甘露醇中的任意 一种或任意多种。
在本发明提供的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻 干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，大豆多糖的浓度为1％， 蔗糖的浓度为10％。
在本发明提供的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻 干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，大豆多糖的浓度为1％， 海藻糖的浓度为10％。
在本发明提供的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻 干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，大豆多糖的浓度为1％， 蔗糖的浓度为10％，海藻糖的浓度为10％，甘露醇的浓度为10％， 菌种为植物乳杆菌WCFS1。
在本发明提供的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻 干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，菌种活化的方法为将植 物乳杆菌通过固体MRS培养基中反复划线活化2～5次。
在本发明提供的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻 干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，单菌落接种培养的方法 为挑取已经活化好的单菌落接种培养12h～16h。
在本发明提供的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻 干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤3中扩大培养的条 件为在35℃～40℃下培养12h～16h。
在本发明提供的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻 干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，冷冻干燥的参数为：预 冷温度-45℃～-35℃，预冷时间2h～4h，以0.8℃/min～1.5℃/min的速 率升温至-30℃～-25℃以进行一次干燥，时间持续700min～900min， 然后以0.8℃/min～1.5℃/min的速率升温至20℃～25℃进行二次干燥，时间持续2h～3h，冷阱温度-85℃～-70℃左右，真空度10Pa～30Pa。
本发明还提供了一种复合保护剂在提高植物乳杆菌冷冻干燥存 活率中的应用，其特征在于，菌种为植物乳杆菌AR113或植物乳杆 菌WCFS1，复合保护剂包含大豆多糖及小分子糖，小分子糖为蔗糖、 海藻糖或甘露醇中的任意一种或任意多种。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的 冷冻干燥方法，因为采用大豆多糖与至少一种小分子糖进行复配作为 复合保护剂，有效避免了植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1 在冷冻干燥过程中受到的细胞膜损伤，所以大豆多糖与小分子糖组成 的复合保护剂有效提高了植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1 的细胞存活率。
此外，大豆多糖属于多糖，来源广泛，价格便宜。
附图说明
图1是本发明的实施例中利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的 冷冻干燥方法的流程图；
图2是本发明的实施例1～5及对照例1～2中的植物乳杆菌AR113的 存活率示意图；以及
图3是本发明的实施例6～10及对照例3～4中的植物乳杆菌WCFS1 的存活率示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于 明白了解，以下结合实施例及附图对本发明利用复合保护剂提高植物 乳杆菌存活率的冷冻干燥方法作具体阐述。
实施例及对照例中所有化学试剂均为化学纯，均购自国药集团化 学试剂有限公司。
图1是本发明的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方 法的流程图。
如图1所示，一种利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方 法包括如下步骤：
步骤1，菌种活化，得单菌落。其中，菌种活化的方法为将植物 乳杆菌通过固体MRS培养基中反复划线活化2～5次。
具体操作为：将菌种通过固体MRS培养基中反复划线活化3次， 得单菌落。其中，菌种为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1。
步骤2，将单菌落接种培养，得种子液。
具体操作为：挑取已经活化好的单菌落接种培养12h～16h，得 种子液。
步骤3，将种子液转接至MRS液体培养基中扩大培养，得扩大 培养液。扩大培养的条件为在35℃～40℃下培养12h～16h。
具体操作为：将1％接种量的种子液转接至50mL的MRS液体 培养基中扩大培养，在37℃下扩大培养12h～16h，得扩大培养液。
步骤4，将扩大培养液离心，得菌体沉淀。
具体操作为：使用酶标仪调节扩大培养液菌浓，使其OD600＝1， 在离心力为4000rpm的条件下用1.5ML的离心管离心5min收集菌 体沉淀，每管收集2mL菌体沉淀。
步骤5，菌体沉淀经PBS缓冲液洗涤后重悬于复合保护剂溶液中， 转移至容器中，冷冻干燥。其中，复合保护剂包含大豆多糖及至少一 种小分子糖，小分子糖为蔗糖、海藻糖或甘露醇。大豆多糖的浓度为 1％，蔗糖的浓度为10％，海藻糖的浓度为10％，甘露醇的浓度为10％。
冷冻干燥的参数为：预冷温度-45℃～-35℃，预冷时间2h～4h， 以0.8℃/min～1.5℃/min的速率升温至-30℃～-25℃以进行一次干燥， 时间持续700min～900min，然后以0.8℃/min～1.5℃/min的速率升温 至20℃～25℃进行二次干燥，时间持续2h～3h，冷阱温度-85℃～-70℃ 左右，真空度10Pa～30Pa。
具体操作为：菌体沉淀经无菌PBS缓冲液洗涤2次后分别重悬 于不同的保护剂溶液中，菌悬液浓度109cfu/mL，再转移到西林瓶中 用于立即放入冷冻干燥设备进行冷冻干燥。冷冻干燥程序设置为：预 冷温度-40℃，预冷时间3h，以1℃/min的速率升温至-30℃以进行一 次干燥，时间持续800min，然后以1℃/min的速率升温至25℃进行 二次干燥，时间持续2h，冷阱温度-80℃左右，真空度20Pa。
在下述实施例及对照例中使用到的菌种来源如下：
植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AR113菌株已于2017年 03月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其编号为CGMCC No.13909。
植物乳杆菌WCFS1：购自ATCC(American type culture collection)。
在下述实施例及对照例中使用到的MRS培养基成分如下：
MRS培养基：蛋白胨10.0g、磷酸氢二钾2.0g、牛肉浸出粉10.0 g、酵母膏5.0g、硫酸锰0.25g、无水乙酸钠5.0g、葡萄糖20.0g、 柠檬酸二胺2.0g、硫酸镁0.58g、吐温801mL、去离子水1000mL。 其中，固体培养基需在此基础上加2％的琼脂，液体培养基则不加。
培养基在使用前均在115℃下灭菌20min。
在下述实施例或对照例中使用到的溶液配方如下：
PBS缓冲溶液：磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠 8g，氯化钾0.2g，用水定容至1000mL。
上述保护剂中，蔗糖、海藻糖及甘露醇属于小分子糖类保护剂； 大豆多糖属于多糖保护剂。
<实施例1>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂为大豆多糖与蔗 糖复配(组别1)，其中大豆多糖的浓度为1％，蔗糖的浓度为10％。
<实施例2>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂为大豆多糖与海 藻糖复配(组别2)，其中大豆多糖的浓度为1％，海藻糖的浓度为10％。
<实施例3>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂为大豆多糖与甘 露醇及蔗糖复配(组别3)，其中大豆多糖的浓度为1％，甘露醇的浓 度为10％，蔗糖的浓度为10％。
<实施例4>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂为大豆多糖与甘 露醇及海藻糖复配(组别4)，其中大豆多糖的浓度为1％，甘露醇的 浓度为10％，海藻糖的浓度为10％。
<实施例5>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂为大豆多糖与甘 露醇、海藻糖及蔗糖复配(组别5)，其中大豆多糖的浓度为1％，甘 露醇的浓度为10％，海藻糖的浓度为10％，蔗糖的浓度为10％。
<实施例6>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂为大豆多糖与 蔗糖复配(组别1)，其中大豆多糖的浓度为1％，蔗糖的浓度为10％。
<实施例7>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂为大豆多糖与 海藻糖复配(组别2)，其中大豆多糖的浓度为1％，海藻糖的浓度为 10％。
<实施例8>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂为大豆多糖与 甘露醇及蔗糖复配(组别3)，其中大豆多糖的浓度为1％，甘露醇的 浓度为10％，蔗糖的浓度为10％。
<实施例9>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂为大豆多糖与 甘露醇及海藻糖复配(组别4)，其中大豆多糖的浓度为1％，甘露醇 的浓度为10％，海藻糖的浓度为10％。
<实施例10>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂为大豆多糖与 甘露醇、海藻糖及蔗糖复配(组别5)，其中大豆多糖的浓度为1％， 甘露醇的浓度为10％，海藻糖的浓度为10％，蔗糖的浓度为10％。
以下为本发明中的对照例，除菌种和保护剂的种类不同外，其余 与实施例中完全相同。
<对照例1>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂为大豆多糖(组 别6)，其中大豆多糖的浓度选用1％。
<对照例2>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂为蔗糖(组别7)， 其中蔗糖的浓度选用1％。
<对照例3>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂为大豆多糖(组 别6)，其中大豆多糖的浓度选用1％。
<对照例4>
本实施例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂为蔗糖(组别 7)，其中蔗糖的浓度选用1％。
<测试例>
冷冻48h后，将实施例1～14冷冻干燥后的菌粉加PBS复水；再 将菌液稀释至适宜梯度后涂布，于37℃培养36h后计数。试验重复 3次，每次3个平行。根据N2/N0×100％计算冷冻干燥存活率，N0是 冷冻前细胞数，N2为冷冻干燥后细胞数。测试结果见图2、图3及 表1。
图2是本发明的实施例1～5及对照例1～2中的植物乳杆菌AR113 的存活率示意图。
图3是本发明的实施例6～10及对照例3～4中的植物乳杆菌 WCFS1的存活率示意图。
表1冷冻干燥后复水细胞存活率
数据以平均值±标准偏差(n＝3)的形式进行表示。不同字母表 示差异显著(p<0.05，Duncan)。
如图2、图3及表1所示，对于植物乳杆菌AR113而言，保护剂 通过复配后都能将细胞的存活率提高到50％及以上。其中，海藻糖和 大豆多糖进行复配后对植物乳杆菌AR113的保护效果最显著，可使 冷冻干燥存活率提高到85.4％。其次是蔗糖+大豆多糖及海藻糖+蔗糖 +甘露醇+大豆多糖，二者都能达到70％以上。蔗糖+甘露醇+大豆多 糖及海藻糖+甘露醇+大豆多糖稍差，但也都使得一半及以上的细胞存 活。分别用没有复配的大分子保护剂大豆多糖及小分子糖作为保护 液，植物乳杆菌AR113细胞的存活率分别为45.7％和55.9％。可见， 经过复配后，大豆多糖与小分子糖组成的复合保护剂能够有效提高植 物乳杆菌AR113的存活率。
对植物乳杆菌WCFS1而言，5种复合保护剂也都能将其冷冻干 燥存活率提高到50％以上。其中，最佳复合保护剂是海藻糖+大豆多 糖，能将存活率显著提高的90％以上(90.8％)。其次是蔗糖+大豆多 糖，存活率达83.0％。蔗糖+大豆多糖和海藻糖+蔗糖+甘露醇+大豆多 糖两种复配保护剂的保护效果也不错，将冷冻干燥存活率提高到70％ 以上，分别为77％和77.7％以上。甘露醇+海藻糖+大豆多糖效果最差， 冷冻干燥存活率只有56.6％。分别用没有复配的大分子保护剂大豆多 糖及小分子糖作为保护液，植物乳杆菌WCFS1细胞的存活率分别为 44.2％和77.8％。可见，经过复配后，大豆多糖与小分子糖组成的复 合保护剂能够有效提高植物乳杆菌WCFS1的存活率。
实施例的作用与效果
根据本发明的实施例所涉及的利用复合保护剂提高植物乳杆菌 存活率的冷冻干燥方法，因为采用大豆多糖与至少一种小分子糖进行 复配作为复合保护剂，有效避免了植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌 WCFS1在冷冻干燥过程中受到的细胞膜损伤，所以大豆多糖与小分 子糖组成的复合保护剂有效提高了植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌 WCFS1的细胞存活率。
此外，大豆多糖属于多糖，来源广泛，价格便宜。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护 范围。

Claims (9)

1.一种利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，菌种活化，得单菌落；
步骤2，将所述单菌落接种培养，得种子液；
步骤3，将所述种子液转接至MRS液体培养基中扩大培养，得扩大培养液；
步骤4，将所述扩大培养液离心，得菌体沉淀；
步骤5，所述菌体沉淀经PBS缓冲液洗涤后重悬于复合保护剂溶液中，转移至容器中，冷冻干燥，
其中，所述菌种为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1，
所述步骤5中所述复合保护剂包含大豆多糖及小分子糖，
所述小分子糖为蔗糖、海藻糖或甘露醇中的任意一种或任意多种。
2.根据权利要求1所述的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于：
其中，所述大豆多糖的浓度为1％，
所述蔗糖的浓度为10％。
3.根据权利要求1所述的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于：
其中，所述大豆多糖的浓度为1％，
所述海藻糖的浓度为10％。
4.根据权利要求1所述的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于：
其中，所述大豆多糖的浓度为1％，
所述蔗糖的浓度为10％，
所述海藻糖的浓度为10％，
所述甘露醇的浓度为10％，
所述菌种为植物乳杆菌WCFS1。
5.根据权利要求1所述的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于：
其中，所述菌种活化的方法为将植物乳杆菌通过固体MRS培养基中反复划线活化2～5次。
6.根据权利要求1所述的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于：
其中，所述单菌落接种培养的方法为挑取已经活化好的单菌落接种培养12h～16h。
7.根据权利要求1所述的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于：
其中，所述步骤3中扩大培养的条件为在35℃～40℃下培养12h～16h。
8.根据权利要求1所述的利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于：
其中，所述冷冻干燥的参数为：预冷温度-45℃～-35℃，预冷时间2h～4h，以0.8℃/min～1.5℃/min的速率升温至-30℃～-25℃以进行一次干燥，时间持续700min～900min，然后以0.8℃/min～1.5℃/min的速率升温至20℃～25℃进行二次干燥，时间持续2h～3h，冷阱温度-85℃～-70℃左右，真空度10Pa～30Pa。
9.一种复合保护剂在提高植物乳杆菌冷冻干燥存活率中的应用，其特征在于，所述菌种为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1，所述复合保护剂包含大豆多糖及小分子糖，所述小分子糖为蔗糖、海藻糖或甘露醇中的任意一种或任意多种。
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