CN104928206B - 一株具有高胆酸盐水解酶活性的嗜酸乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株具有高胆酸盐水解酶活性的嗜酸乳杆菌及其应用，所述的嗜酸乳杆菌命名为KLDS1015，分类命名为嗜酸乳杆菌(Lactobacilus acidophilus)，微生物保藏号为CGMCC No.10436。本发明筛选出的嗜酸乳杆菌具有较高的胆酸盐水解酶活性，其降胆固醇能力也很强，可广泛用于食品工业领域，为进一步研究嗜酸乳杆菌的降胆固醇机理和开发具有降胆固醇功能的乳酸菌制品奠定了基础。

Description

一株具有高胆酸盐水解酶活性的嗜酸乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株具有高胆酸盐水解酶活性的嗜酸乳杆菌，以及该菌株在胆固醇去除中的应用，属于食品生物技术领域。

背景技术

随着科技的进步，人民膳食结构发生了改变，饮食营养越来越丰富，但随之而来的负面作用也越来越严重，尤其是冠心病、高血压等心血管疾病的发病率不断增长。人体血清中胆固醇含量的升高被认为是导致许多心血管疾病的重要因素。血清中胆固醇含量增加1％，，患有高血压等心血管疾病的概率会增加3％。大量国内外研究表明，血清中胆固醇含量的高低直接影响到人类的健康，因此，抑制体内胆固醇的合成、促进胆固醇的分解代谢已成为众多专家学者的研究课题。

益生菌是一种对人体健康有益的活体微生物，它包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌等。他们能促进乳糖消化，增强免疫调节，对肠道致病菌产生拮抗作用，调节血脂，和降低胆固醇含量等功效，常被用于乳品、肉品、水产品工业方面。近年来，大量研究证明乳酸菌具有降低血清中胆固醇的功效。Shimada等人发现在人体肠道中存在着许多细菌，他们可以降解结合胆盐，从而促进了体内胆固醇的分解代谢。因此，胆酸盐水解酶走进了人们的视野，对益生菌降胆固醇的作用机理具有重要的意义。

BSH(胆盐水解酶)是微生物生长代谢过程中产生的一种代谢产物，主要由乳酸菌产生，能将结合态甘氨酸胆盐、牛磺酸胆盐水解成游离胆酸和氨基酸残基。BSH是一种胞内酶，属于甘氨酸水解酶家族，N-端是半胱氨酸残基，在氨基酸序列中的第一位半胱氨酸的巯基是BSH分解的基础，研究表明，BSH中这个半胱氨酸残基的位点是十分保守的。BSH可以分别通过固醇类核团和氨基酸集团识别胆酸，因此具有底物特异性，导致不同种属的菌水解结合胆盐的类型不同，能力也各不相同。

乳酸菌中的胆酸盐水解酶，除了具有降低血清中胆固醇的作用外，还能维护肠道菌群平衡，抵抗胆盐毒性，因此，筛选出具有高胆酸盐水解酶活性的乳酸菌是非常必要的。本发明筛选出的嗜酸乳杆菌具有较高的胆酸盐水解酶活性，降胆固醇能力也很强，可广泛用于食品工业领域。

发明内容

本发明通过茚三酮显色法筛选出一株具有高胆酸盐水解酶活性的嗜酸乳杆菌，命名为KLDS1015，分类命名为嗜酸乳杆菌(Lactobacilus acidophilus)，该菌株是从传统乳制品中分离的乳酸菌中筛选出的，于2015年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏号为CGMCC No.10436，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明菌株KLDS1015的16SrDNA序列与Lactobacilus acidophilus序列相似性达95％以上，根据16SrDNA序列分析，菌株KLDS1015被鉴定为嗜酸乳杆菌(Lactobacilusacidophilus)，其16SrDNA序列如核苷酸序列中SEQ ID NO：1所示，其以16SrDNA全序列为基础的系统发育树如图1所示。

本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacilus acidophilus)KLDS1015具有较高的胆酸盐水解酶活力，其以牛磺脱氧胆酸盐为底物下的比酶活可达到63.71U/mg，同时该菌株具有较高的降胆固醇的能力，其胆固醇去除率达到了57.9％。

因此，本发明进一步地提供了嗜酸乳杆菌(Lactobacilus acidophilus)KLDS1015在胆固醇去除中的应用；及

嗜酸乳杆菌(Lactobacilus acidophilus)KLDS1015在制备具有降血脂功能的发酵乳制品中的应用；及

嗜酸乳杆菌(Lactobacilus acidophilus)KLDS1015在制备具有辅助降血脂功能的活菌制剂中的应用。

在本发明中，优选的，所述菌株单独或与其他菌株混合发酵用于制备具有降血脂功能的发酵乳制品。

本发明筛选出的嗜酸乳杆菌KLDS1015具有较高的胆酸盐水解酶活力和降胆固醇的能力，为进一步研究嗜酸乳杆菌的降胆固醇机理和开发具有降胆固醇功能的乳酸菌制品奠定了基础。

附图说明

图1为嗜酸乳杆菌(Lactobacilus acidophilus)KLDS1015的系统发育树；

图2为牛磺酸浓度的标准曲线图；

图3为蛋白质浓度的标准曲线图；

图4为胆固醇浓度的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

材料与试剂

出发菌株：KLDS1.1003和KLDS1015均分离自内蒙古传统稀奶油或酸化奶油，由乳品科学教育部重点实验室菌种保藏中心(KLDS-DICC)保藏，菌种使用前用MRS培养基活化以上菌株，以1％接种量在37℃下培养15h，以备实验使用。

培养基：MRS培养基；高胆固醇MRS液体培养基。

MRS培养基配制：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温-801ml/L，pH6.3±0.1，121℃、15分钟灭菌；

高胆固醇MRS液体培养基配制：MRS液体培养基中添加0.2％巯基乙酸钠，0.3％的牛胆汁和100ug/ml的胆固醇。

主要试剂：牛胆汁、牛磺脱氧胆酸钠：Sigma公司；胆固醇：Amresco公司；邻苯二甲醛：中国医药(集团)上海化学试剂公司；正己烷：分析纯；巯基乙酸钠：中国医药(集团)上海化学试剂公司。

主要仪器：JY92-2D超声破碎粉碎机：SCIENTZ公司；厌氧箱Forma Anaerobicsystem 1029：THERMO ELECTRON CORPORATION公司；DU800型紫外分光光度计：BECKMANCOULTER；GL-21M型低温冷冻离心机：上海市离心机械研究所。

实施例1茚三酮显色法筛选高产胆酸盐水解酶活性的乳酸菌

(1)显色液的配制

茚三酮显色液的配制：100mL茚三酮显色液由0.5g水和茚三酮、0.3g果糖、6g磷酸二氢钾、10g磷酸氢二钾配制而成。

蛋白质显色液：100mg考马斯亮蓝G250，50mL95％乙醇，100mL85％磷酸，用蒸馏水混合定容到1L配制而成。

(2)胆酸盐水解酶活力的定量检测方法

取10mL在MRS培养基中培养15h的乳酸菌培养液，在4℃、10000r/min离心10min，菌体用0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(pH7.0)冲洗2次，再用1mLVc磷酸缓冲液(每毫升磷酸缓冲液加10ul 1M Vc))悬浮，细菌悬浮液加入500ul 20mg/ml的溶菌酶溶液，37℃水浴30分钟，再于冰浴中进行超声波破碎15min(100W，15min,50％工作时间)。之后，4℃、10000r/min离心10min。其上清液即为胆盐水解酶液。0.1mL的上清液中加入10.8mL 0.1mol/L的磷酸钠缓冲溶液(pH6.0)和0.1mL的50mM的牛磺脱氧胆酸盐溶液，这些混合物37℃温浴30min后冰浴，加入三氯乙酸(15％，w/v)，静置3min终止酶反应，混合物离心后，在上清液中加入1.5mL的茚三酮显色液，这些混合物漩涡震荡后，煮沸15min。冷却后测定其在570nm处的吸光度值。标准曲线利用牛磺酸制作，牛磺酸浓度的标准曲线见图2。

蛋白质浓度的测定采用牛血清白蛋白作为标准品。蛋白质浓度的测定：称量1g牛血清白蛋白，溶解并定容到1L，配成1g/L的标准溶液。稀释成浓度为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35g/L，分别吸取300ul各浓度标准溶液和粗酶液至干净试管，加入3ml蛋白质显色液，充分混匀，常温放置2min后迅速测量在595nm波长下的吸光度。蛋白质浓度的标准曲线见图3。

比酶活计算公式为：

比酶活＝[Aa(mM)]×V_{反应液体积}(ml)/0.1(ml)×30(min)×[protein(mg/ml)].其中，[Aa(mM)]比较标准曲线得到，V_{反应液体积}(ml)为最终显色液体积，30(min)为反应时间，[protein(mg/ml)]为蛋白质浓度。

(3)定量检测结果

表1菌株在以牛磺脱氧胆酸盐为底物下的比酶活

从表1可以看出，菌株KLDS1015的BSH比酶活很高。文献中已知，嗜酸乳杆菌La-XH1的比酶活为10.71U/mg，嗜酸乳杆菌ATCC4356的BSH比酶活为1.31U/mg，嗜酸乳杆菌FTCC0291的BSH比酶活为1.04U/mg，与之相比，本发明筛选出的嗜酸乳杆菌KLDS1015的BSH活性很高，对牛磺脱氧胆酸盐表现出了很高的胆酸盐水解酶活性。

实施例2乳酸菌菌株体外去除胆固醇的作用

(1)显色剂的配制

显色剂的配制：显色剂为邻苯二甲醛溶液，称取50mg邻苯二甲醛，用冰乙酸溶解并定容至100ml。现用现配。

(2)乳酸菌菌株体外去除胆固醇能力的测定方法

将活化好的乳酸菌菌株以2％接种量接种于高胆固醇MRS液体培养基中，37℃培养24h，同时保留未接菌的高胆固醇MRS液体培养基作为空白对照。分别测定上清液、菌体洗涤液、菌体破碎液中胆固醇的含量。

利用胆固醇标准溶液制作标准曲线，操作方法为：首先配制100ug/ml的胆固醇标准溶液，分别吸取0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml于10ml试管中，60℃氮吹挥发尽溶剂，加入显色剂2ml，浓硫酸1ml，混匀后在10-90分钟内测定550nm下的吸光值并绘制标准曲线。胆固醇浓度的标准曲线见图4。

分别取菌体上清液、菌体洗涤液和菌体破碎液4ml加到干净试管中，加33％KOH溶液3ml和95％乙醇3ml，充分混匀，于60℃水浴15min，待冷却到室温后加入3ml正己烷和2ml蒸馏水，混匀，静置20min后，取2ml正己烷层液体于干净试管中，60℃氮吹挥发尽溶剂，加入显色剂2ml，浓硫酸1ml，混匀后在10-90分钟内测定550nm下的吸光值。

上清液：菌株在高胆固醇培养基中37℃厌氧培养24h后，于4℃、12,000g离心10min的上清液；将倾出上清液的菌体细胞加入5.0ml 0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液，混匀后于4℃、12,000g离心10min，取上清液即为菌体洗涤液；倾出菌体洗涤液，再加入5.0ml 0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液，置冰浴在细胞超声波破碎仪破碎15min(100W，15min，50％工作时间)后，在4℃、12,000g离心10min，上清液即为菌体破碎液。其中上清液中的胆固醇含量为未被乳酸菌去除的胆固醇；菌体洗涤液中的胆固醇是通过BSH去除的，菌体破碎液中的胆固醇为菌体吸收的。

乳酸菌对胆固醇的去除率＝(C-C′)/C

式中：C为未接种乳酸菌的培养液离心上清液中胆固醇的实测浓度；

C′为接种乳酸菌的培养液离心上清液中胆固醇的实测浓度。

(3)测定结果

表2为乳酸菌体外去除胆固醇能力的测定结果(包括菌体吸收量和沉淀量)

从表2可以看出，菌株KLDS1015和菌株KLDS1.1003这2株乳酸菌的胆固醇去除能力都很强，都超过了50％，其中KLDS1015胆固醇去除率高于KLDS1.1003，两株菌共沉淀量都高于菌体吸收量。

经过以上筛选，最终确定菌株KLDS1015为以后的研究菌株，此菌株具有较高的胆酸盐水解酶活力和较高的胆固醇去除率。经过16SrDNA鉴定，它与Lactobacilusacidophilus核苷酸序列相似性达95％以上。根据16SrDNA序列分析，菌株KLDS1015被鉴定为嗜酸乳杆菌，命名为KLDS1015，分类命名为嗜酸乳杆菌(Lactobacilus acidophilus)，于2015年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏号为CGMCC No.10436，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；其16SrDNA序列如核苷酸序列中SEQ ID NO：1所示，其以16SrDNA全序列为基础的系统发育树如图1所示。

Claims (5)

1.一株具有高胆酸盐水解酶活性的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，命名为KLDS1015，微生物保藏号为CGMCC No.10436，保藏日期为2015年01月26日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在制备具有去除胆固醇功能的发酵乳制品中的应用。

3.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在制备具有降血脂功能的发酵乳制品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的嗜酸乳杆菌单独或与其他菌株混合发酵用于制备具有降血脂功能的发酵乳制品。

5.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在制备具有辅助降血脂功能的活菌制剂中的应用。