CN101028290A - 用于降低人或禽畜血清胆固醇的益生菌制剂及工艺 - Google Patents

Abstract

用于降低人或禽畜血清胆固醇的益生菌制剂及工艺，按重量称取屎链球菌5－15份，双歧杆菌5－15份，嗜酸乳杆菌20－30份，乳糖或低聚果糖或其他辅料10000－20000份；上述3种菌经30－45℃分别发酵，24hr－36hr，离心分离菌体，加冻干保护剂，冷冻干燥获得干燥菌粉，按比例添加到玉米粉或水苏糖中，制备粉剂或胶囊剂，能调节肠内菌群，降低血清胆固醇。

Description

用于降低人或禽畜血清胆固醇的益生菌制剂及工艺

技术领域：本发明涉及用于改善肠道微生态平衡，降低人或禽畜血清胆固醇的益生菌制成的制剂或饲料添加剂及制备这种制剂或添加剂的工艺。

背景技术：已有的益生菌的研究也只限于对单个菌种的研究，没有针对益生菌群相互促进、共生，协调促进改善降低人或禽畜血清胆固醇的研究，也没有协调促进降低人或禽畜血清胆固醇的益生菌群制剂、饲料添加剂及工艺。

发明内容：

本发明主要是利用从动物体内分离出具有生理作用的3种益生菌菌株经发酵分离菌体、干燥经合理组方混合成具有降低人体或动物血清胆固醇的益生菌活菌制剂，同时提供一种益生菌制剂的的制造工艺。

本发明益生菌制剂含有益生菌标准菌粉，益生菌有屎链球菌(Enterococcus faecium)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。其中的屎链球菌5-15份，双歧杆菌5-15份，嗜酸乳杆菌20-30份，乳糖或低聚果糖或其他辅料10000-20000份。按以上配方制成的益生菌制剂，每克含有益生菌数20-50亿/g。配制成粉剂或胶囊剂型。

本发明的益生菌制剂的的制造工艺。按重量称取益生菌标准菌粉，其中的屎链球菌5-15份，双歧杆菌5-15份，嗜酸乳杆菌20-30份，乳糖或低聚果糖或其他辅料10000-20000份。配制成粉剂或胶囊剂型。其中，单一菌粉制备工艺如下：

(1)屎肠球菌菌粉的制备：屎肠球菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏、0.1-0.5％Na₂HPO₄、0.1-0.5％KH₂PO₄的培养液中经32℃-38℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量23-45％的菌体加入含有100-200mM海藻糖和含有重量3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置2-4小时，冷冻干燥后即可得到屎肠球菌菌粉。

(2)嗜酸乳杆菌菌粉的制备：嗜酸乳杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏培养基中经32℃-36℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量30-45％的菌体加入100-200mM海藻糖和含有3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置2-4小时，冷冻干燥后即可得到嗜酸乳杆菌菌粉。

(3)青春双歧杆菌菌粉的制备：青春双歧杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量0.5-1.5％酵母浸膏、1-2.5％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨培养液基中经35℃-38℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量30-45％的菌体加入含有100-200mM海藻糖和含有重量3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置2-4小时，冷冻干燥后即可得到青春双歧杆菌菌粉菌粉。

本发明所述的3种益生菌已通过毒理学和药理学试验研究，证明每一菌株都是安全和无毒副作用的。组合后特有的优点是：乳酸菌降胆固醇机制有多种方式，如：1.对3-羟基-3-甲基戊二酰COA还酶的抑制作用该酶是胆固醇体内生物合成的限速酶；2.通过胆盐水解酶的作用，将部小肠内的胆盐水解，水解后的胆盐能与食物中的胆固醇发生共沉淀作用，从而促进食源中的胆固醇向粪便中转移；3.菌体对胆固醇的同化作用，直接分解胆固醇。屎链球菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌三种菌分别在人或动物的不同肠段上定植，其降胆固醇的作用机制也不同，将三种菌组合起来可以发挥他们在各自肠段以不同机制共同发挥作用，优势互补。

在对屎肠球菌降胆固醇作用研究中，我们从142份健康儿童粪便中分离出一株具有在体外降解胆固醇作用的菌株，经中科院微生物研究所鉴定为屎肠球菌。通过药效学研究证明与饲以高脂饲料的对照组大鼠相比，在实验的第14、28天分别测定大鼠血清TC浓度低与对照组，并有显著性差异(p＜0.05)。通过计算显示高中剂量组HDL/TC比值高与对照组、动脉硬化指数低与对照组并有显著性差异(p＜0.05)。(见表1、表2、表3、表4)。根据《保健食品功能学评价程序和检验方法》的判定标准，可以认为屎肠球菌具有调节大鼠血脂的作用。本通过人体实验证明本菌具有同样的作用(见表5)。药理学研究证明本菌无毒、无害、安全。是人体内一种具有调节胆固醇代谢作用的正常生理性细菌。生产工艺研究表明，屎肠球菌DM891129菌株经筛选、驯化后，采用发酵、浓缩、冷冻干燥等工艺可制成稳定的微生态调节剂。并可投入工业化生产。

表1  实验前后各组大鼠体重变化(g，M±SD，n＝10)

组别	初始体重(g)	14天(g)	28天(g)
				对照组低剂量组中剂量组高剂量组	160.6±7.4163.4±7.1158.2±6.4162.4±9.8	304.1±23.6300.9±19.9297.4±13.6304.8±28.1	366.0±37.3354.9±24.8359.7±16.9357.0±33.3

注：三个实验组给于受试物屎肠球菌菌粉，剂量分别为：低剂量组225mg/kg.BW，中剂量组450mg/kg.BW，高剂量组900mg/kg.BW，分别相当于人体推荐量摄入量的5、10、20倍。

表2  实验前后各组大鼠血清TC浓度(mg/dl、M±SD，n＝10)

组别	初始TC(mg/kg)	14天	28天
				对照组低剂量组中剂量组高剂量组	80.8±4.580.4±5.481.6±3.983.8±5.3	95.2±17.865.1±3.6*67.9±5.8*66.0±6.4*	108.0±47.269.0±5.8*70.0±6.3*65.1±5.7*

表3各组大鼠血清HDL-C/TC比值(％，M±SD)

组别	动物数	14天	28天
				对照组低剂量组中剂量组高剂量组	10101010	0.43±0.060.64±0.05*0.67±0.12*0.68±0.09*	0.34±0.110.48±0.09*0.43±0.05*0.49±0.11*

注：*与对照组相比P＜0.05

表4  各组大鼠动脉硬化指数(AI(M±SD)

组别	动物数	14天	28天
				对照组低剂量组中剂量组高剂量组	10101010	1.37±0.410.55±0.14*0.52±0.23*0.52±0.22*	2.39±1.541.19±0.43*1.32±0.27*1.15±0.47*

注：动脉硬化指数(AI)是反应心血管疾病易患程度的一个指标，由

计算而来，该指数越高，心血管疾病的易患程度越高，从表6可以看出高、中、低剂量组，在第14天及28天时均低于对照组(P＜0.05)。

表5  人体试验血清胆固醇、甘油三酯水平(mmol/L)

时间	开始	第4周	第8周	第12周
					对照组TC试验组TC对照组TG试验组TG	4.2±0.91(5)6.65±0.54(11)2.17±1.85(5)1.61±0.19(11)	4.12±0.81(5)5.56±0.72(10)1.41±0.49(5)1.50±0.33(10)	5.4±0.82(5)5.61±0.84(11)2.09±1.52(5)1.52±0.21(11)	4.5±1.32(5)5.0±0.62(11)2.02±2.11(5)1.44±0.21(11)

注：1、正常对照组及第1组服药4周，停药4周，再继续服药4周，共观察12周，每阶段服药前后各查一次各项指标；2、TC第8w时血TC水平略有上升，此为第一阶段结束，第二阶段服药前的结果，但其数值仍在正常范围之内，第二阶段服药后又略下降，与服药前水平相近。可见此制剂对正常血TC水平及TG水平无明显影响，各阶段相应指标比较无显著意义(P＞0.05)。

嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌是我们分离到的两株具有同化胆固醇能力的乳酸菌，体外试验试验表明：嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌均对低胆固醇或正常水平胆固醇的同化降解能力不显著，而对高水平胆固醇的同化降解作用比较明显。结果见表6、表7。

表6  嗜酸乳杆菌对不同浓度胆固醇的同化能力

培养基中胆固醇水平	0小时	12小时	18小时	24小时
					高浓度(mmol/L)中浓度(mmol/L)低浓度(mmol/L)	8.2±0.35.2±0.42.1±0.5	4.3±0.44.1±0.72.0±0.4	3.7±0.33.6±0.41.9±0.4	3.4±0.5.3.4±0.52.0±0.4

注：将三浓度胆固醇加入MRS培养基中，接入10％嗜酸乳杆菌种子液，在不同时间测定培养液中胆固醇含量，以确定胆固醇被同化的数量。

表7  双歧杆菌对不同浓度胆固醇的同化能力

培养基中胆固醇水平	0小时	12小时	18小时	24小时
					高浓度(mmol/L)中浓度(mmol/L)低浓度(mmol/L)	8.1±0.55.2±0.42.1±0.4	3.7±0.53.1±0.62.0±0.5	3.2±0.33.3±0.42.2±0.5	3.3±0.63.1±0.42.0±0.5

注：将三浓度胆固醇加入BS培养基中，接入10％双歧杆菌种子液，在不同时间测定培养液中胆固醇含量，以确定胆固醇被同化的数量。

青春双歧杆菌、屎场球菌和嗜酸乳杆菌都是人体正常菌群，在维护人体生态平衡、抑制腐败型细菌及各种肠内有毒物质发挥重要作用。将三种菌联合应用于降血清胆固醇可发挥其三菌不同降胆固醇机制，全方位调节人体血清胆固醇水平。

具体实施方式：

实施例1  屎链球菌5g，双歧杆菌10g，嗜酸乳杆菌30g，玉米粉或麦麸粉20kg。按以上配方制成的益生菌制剂，每克含有益生菌数20-50亿/g。配制成粉剂，添加剂与饲料比为1∶100。即每kg平脂生添加剂可配制100kg饲料。可用于低胆固醇鸡或猪的饲养。菌粉制备工艺如下：

(1)屎肠球菌菌粉的制备：屎肠球菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量1％葡萄糖、1％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％Na₂HPO₄、0.5％KH₂PO₄的培养液中经32℃-38℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量45％的菌体加入含有200mM海藻糖和含有重量3％谷氨酸钠的冻于保护液中混合，放置4小时，冷冻干燥后即可得到屎肠球菌菌粉。

(2)嗜酸乳杆菌菌粉的制备：嗜酸乳杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量1％葡萄糖、1％蛋白胨、1％酵母浸膏培养基中经32℃-36℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量45％的菌体加入200mM海藻糖和含有3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置4小时，冷冻干燥后即可得到嗜酸乳杆菌菌粉。

(3)青春双歧杆菌菌粉的制备：青春双歧杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量0.5％酵母浸膏、1.8％葡萄糖、1.5％蛋白胨培养液基中经35℃-38℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量45％的菌体加入含有200mM海藻糖和含有重量3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置4小时，冷冻干燥后即可得到青春双歧杆菌菌粉菌粉。

实施例2  屎链球菌10g，双歧杆菌15g，嗜酸乳杆菌20g，乳糖或葡萄糖15kg。按以上配方制成的益生菌制剂，每克含有益生菌数20-50亿/g。以1∶1000比例添加到饮用水中，直接供禽畜饮用。可用于低胆固醇鸡或猪的饲养。菌粉制备工艺如下：

(1)屎肠球菌菌粉的制备：屎肠球菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量2％葡萄糖、1.5％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.3％Na₂HPO₄、0.3％KH₂PO₄的培养液中经32℃-38℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量34％的菌体加入含有150mM海藻糖和含有重量3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置3小时，冷冻干燥后即可得到屎肠球菌菌粉。

(2)嗜酸乳杆菌菌粉的制备：嗜酸乳杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量2％葡萄糖、1.5％蛋白胨、0.5％酵母浸膏培养基中经32℃-36℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量38％的菌体加入150mM海藻糖和含有3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置3小时，冷冻干燥后即可得到嗜酸乳杆菌菌粉。

(3)青春双歧杆菌菌粉的制备：青春双歧杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量1％酵母浸膏、2.5％葡萄糖、0.5％蛋白胨培养液基中经35℃-38℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量38％的菌体加入含有150mM海藻糖和含有重量3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置3小时，冷冻干燥后即可得到青春双歧杆菌菌粉菌粉。

实施例3  屎链球菌15g，双歧杆菌5g，嗜酸乳杆菌25g，水苏糖或低聚木糖10kg。按以上配方制成的益生菌粉剂，分装1号或0号胶囊。用于高血脂人群。成人每日服用量4-8粒。菌粉制备工艺如下：

(1)屎肠球菌菌粉的制备：屎肠球菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量3％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.8％酵母浸膏、0.1％Na₂HPO₄、0.1％KH₂PO₄的培养液中经32℃-38℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量23％的菌体加入含有100mM海藻糖和含有重量3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置2小时，冷冻干燥后即可得到屎肠球菌菌粉。

(2)嗜酸乳杆菌菌粉的制备：嗜酸乳杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量3％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.8％酵母浸膏培养基中经32℃-36℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量30％的菌体加入100mM海藻糖和含有3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置2-4小时，冷冻干燥后即可得到嗜酸乳杆菌菌粉。

(3)青春双歧杆菌菌粉的制备：青春双歧杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量1.5％酵母浸膏、1％葡萄糖、1％蛋白胨培养液基中经35℃-38℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量30％的菌体加入含有100mM海藻糖和含有重量3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置2小时，冷冻干燥后即可得到青春双歧杆菌菌粉菌粉。

Claims (3)

1、一种用于降低人或禽畜血清胆固醇的益生菌制剂，其特征在于：有按重量配比的屎链球菌5-15份，双歧杆菌5-15份，嗜酸乳杆菌20-30份。

2、如权利要求1所说的益生菌制剂，其特征在于：还有乳糖或低聚果糖或其他辅料10000-20000份。

3、一种用于降低人或禽畜血清胆固醇的益生菌制剂生产工艺，按重量称取屎链球菌5-15份，双歧杆菌5-15份，嗜酸乳杆菌20-30份，乳糖或低聚果糖或其他辅料10000-20000份，配制成粉剂或胶囊剂型，屎链球菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌的菌粉制备如下：

(1)屎肠球菌菌粉的制备：屎肠球菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏、0.1-0.5％Na₂HPO₄、0.1-0.5％KH₂PO₄的培养液中经32℃-38℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量23-45％的菌体加入含有100-200mM海藻糖和含有重量3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置2-4小时，冷冻干燥后即可得到屎肠球菌菌粉。

(2)嗜酸乳杆菌菌粉的制备：嗜酸乳杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量1％-3％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏培养基中经32℃-36℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量30-45％的菌体加入100-200mM海藻糖和含有3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置2-4小时，冷冻干燥后即可得到嗜酸乳杆菌菌粉。

(3)青春双歧杆菌菌粉的制备：青春双歧杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量0.5-1.5％酵母浸膏、1-2.5％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨培养液基中经35℃-38℃厌氧发酵后，离心分离出菌体，将占保护液重量30-45％的菌体加入含有100-200mM海藻糖和含有重量3％谷氨酸钠的冻干保护液中混合，放置2-4小时，冷冻干燥后即可得到青春双歧杆菌菌粉菌粉。