CN113308399A - 一种用于培养乳酸杆菌d1501的培养基、菌剂及应用 - Google Patents

一种用于培养乳酸杆菌d1501的培养基、菌剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于培养乳酸杆菌D1501的培养基、菌剂及应用；该培养基包括如下重量百分含量的组分：碳源3％～5％、氮源3％～5％、胡萝卜汁8％～12％，余量为UMRS培养基；所述碳源为D‑山梨醇和葡萄糖；所述氮源为牛肉膏和胰蛋白胨；上述培养基以UMRS培养基为基础，再辅以特定氮源、碳源以及西红柿汁和柠檬汁，能够有效促进乳酸杆菌D1501的增殖以及保障乳酸杆菌D1501的活性，大大缩短了菌株的培养时间并提高菌种的性能。

Description

一种用于培养乳酸杆菌D1501的培养基、菌剂及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种用于培养乳酸杆菌D1501的培养基、菌剂及应用。
背景技术
酸奶发酵剂是指具备分解乳糖产生乳酸能力，含菌量高，菌活性高，通常被用于生产干酪、酸奶等发酵产品的一类细菌培养物，是酸奶产香和产酸的主要原因。酸奶发酵剂能够使原材料产生乳酸，同时产生乙酸、乙醛等小分子风味物质，芳香化合物、细菌素等大分子物质，使发酵产品具有独特风味和卖点。发酵剂的品质高地直接影响乳制品的组织状态和口感。
目前，鼠李糖乳杆菌直投式发酵剂的研究和益生性植物乳杆菌C88直投式发酵剂的制备及其应用中，采用的菌种为鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌C88。但是该发酵剂不适合发酵驼乳；具体因为驼奶本身含有溶菌酶，抑菌效果强，现有市售发酵菌剂用于发酵驼奶活性会受到抑制，导致发酵时间较长以及产品质量较差。同时，市售菌剂中菌株对酸和胆盐的耐受能力差，耐消化道消化液溶解破坏能力也弱一点，益生功能的菌落数量必然会低一些。
此外，在发酵菌剂制备过程中，采用不同的培养基，培养得到的菌株活性不同，进而直接影响发酵菌剂的发酵性能；因此获得一种能够有效提高发酵菌株活性的培养基尤为关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于培养乳酸杆菌D1501的培养基、菌剂及应用，该培养基能够促进乳酸杆菌D1501生长发育，并能够提高其活性；此外，通过该培养基制备得到的含有乳酸杆菌D1501的菌剂能够更好的适应驼奶的发酵，保障了发酵产品的品质并缩短了发酵时间。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种用于培养乳酸杆菌D1501的培养基，所述培养基包括如下重量百分含量的组分：
碳源3％～5％、氮源3％～5％、胡萝卜汁8％～12％，余量为UMRS培养基；
所述碳源为D-山梨醇和葡萄糖；
所述氮源为牛肉膏和胰蛋白胨。
本发明上述培养基以UMRS培养基为基础，再辅以特定氮源、碳源以及胡萝卜汁，能够有效促进乳酸杆菌D1501的增殖以及保障乳酸杆菌D1501的活性，大大缩短了菌株的培养时间并提高菌种的性能。
乳酸杆菌D1501属于乳酸杆菌中的一种，可以通过购买得到，也可以通过分离得到，优选地，从酸驼奶样品中分离得到；具体地，可以通过如下方法得到：
从阿拉善牧人家获取的酸驼奶样品选择稀释浓度梯度为10-5进行涂布在普通MRS固体培养基进行培养,然后在MRS培养基上进行划线纯化四次后，进行气味、颜色等评定。并对这两种平板进行形态学观察和分析。然后在MRS液体种子培养基中37℃120rpm进行摇床培养16h，利用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，利用16SrDNA通用引物对乳酸菌基因组进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并送到北京华大基因公司测序，序列在NCBI中进行BLAST比对，即确定筛选到的菌株为乳酸杆菌D1501。
优选地，所述D-山梨醇和葡萄糖的质量比为1∶(0.9～1.1)。
优选地，所述牛肉膏和胰蛋白胨的质量比为3∶(4.5～5.5)。
优选地，所述培养基还包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的添加终浓度为0.05mol/L～0.2mol/L，并且磷酸氢二钠与磷酸二氢钾的摩尔比为1∶(12～13)。
优选地，所述培养基的碳氮比为3∶(3.5～4.5)，pH值为6.4～6.6。
在本发明中，通过对氮源、碳源以及中和剂(碳酸钠缓冲液)原料以及配比的限定，能够更好的促进乳酸杆菌D1501的增殖，提高了活菌量和活力。
本发明第二方面提供一种含有乳酸杆菌D1501的菌剂，所述菌剂通过如下方法制得：
(a)在上述培养基中接种乳酸杆菌D1501并进行培养，得到培养物；
(b)在培养物中添加保护剂制成菌悬液、冷冻干燥，既得所述菌剂。
优选地，所述乳酸杆菌D1501的接种量为(1.2～1.5)×1012CFU/L；
优选地，所述培养温度为33～38℃，培养时间为22～26h；
优选地，所述保护剂包括如下百分含量的组分：
脱脂乳15％～16％、乳糖6％～7％、海藻糖6％～7％，余量为生理盐水；
优选地，所述保护剂与所述培养物的体积比为1∶(0.9～1.1)。
本发明上述菌剂具有活菌数高、体积小、便于储存和运输等特点；其中活菌数达到1.136×1010CFU/g以上，而且具有优异的储存稳定性，储藏3个月后，活菌数依然高达4×109CFU/g以上。
本发明第三方面提供一种上述菌剂在驼奶发酵中的应用。
本发明第四方面提供一种驼奶的发酵方法，所述发酵方法包括将上述菌剂添加到驼奶中进行发酵。
优选地，所述菌剂的添加终浓度为0.8～1.2g/L；
优选地，所述发酵温度为35～39℃，发酵时间为15～25h。
本发明上述菌剂通过直投，能够快速实现驼奶的发酵，发酵得到的酸奶活菌数在109CFU/mL以上，色泽上较均匀、乳黄色，口感纯正；较酸；甜味较淡；乳味很重；此外，发酵后的酸奶在-20℃存放1年以上，活菌存活率在90％以上。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明培养基以UMRS培养基为基础，再辅以特定氮源、碳源以及胡萝卜汁，能够有效促进乳酸杆菌D1501的增殖以及保障乳酸杆菌D1501的活性，大大缩短了菌株的培养时间并提高菌种的性能。
本发明菌剂具有活菌数高、体积小、便于储存和运输等特点；其中活菌数达到1.1×1010CFU/g以上，而且具有优异的储存稳定性，-20℃储藏3个月后，活菌数依然高达4×109CFU/g以上。
本发明菌剂通过直投，能够快速实现驼奶的发酵，发酵得到的酸奶活菌数在109CFU/mL以上，色泽上较均匀、乳黄色，口感纯正；较酸；甜味较淡；乳味很重；此外，发酵后的酸奶在-20℃存放1年以上，活菌存活率在90％以上。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本实施例为一种用于培养乳酸杆菌D1501的培养基，该培养基包括如下重量百分含量的组分：
碳源3％、氮源5％、胡萝卜汁12％、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，余量为UMRS培养基，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的添加终浓度为0.2mol/L，并且磷酸氢二钠与磷酸二氢钾的摩尔比为1∶13；
碳源为质量比为1∶1.1的D-山梨醇和葡萄糖；
氮源为质量比为3∶5.5的牛肉膏和胰蛋白胨。
实施例2
本实施例为一种用于培养乳酸杆菌D1501的培养基，该培养基包括如下重量百分含量的组分：
碳源5％、氮源3％、胡萝卜汁8％、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，余量为UMRS培养基，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的添加终浓度为0.05mol/L，并且磷酸氢二钠与磷酸二氢钾的摩尔比为1∶12；
碳源为质量比为1∶0.9的D-山梨醇和葡萄糖；
氮源为质量比为3∶4.5的牛肉膏和胰蛋白胨。
实施例3
本实施例为一种用于培养乳酸杆菌D1501的培养基，该培养基包括如下重量百分含量的组分：
碳源4％、氮源4％、胡萝卜汁10％、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，余量为UMRS培养基，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的添加终浓度为0.1mol/L，并且磷酸氢二钠与磷酸二氢钾的摩尔比为1∶12.5；
碳源为质量比为1∶1的D-山梨醇和葡萄糖；
氮源为质量比为3∶5的牛肉膏和胰蛋白胨。
实施例4
本实施例为一种含有乳酸杆菌D1501的菌剂，该菌剂通过如下方法制得：
(a)在实施例3的培养基中接种乳酸杆菌D1501并进行培养，得到培养物，其中，乳酸杆菌D1501的接种量为2.5％；培养温度为33℃，培养时间为26h；
(b)按照保护剂与培养物的体积比为1∶0.9，在培养物中添加保护剂并制成菌悬液、冷冻干燥，既得上述菌剂；
其中，保护剂由如下百分含量的组分构成：
脱脂乳15％、乳糖7％、海藻糖6％，余量为生理盐水。
实施例5
本实施例为一种含有乳酸杆菌D1501的菌剂，该菌剂通过如下方法制得：
(a)在实施例3的培养基中接种乳酸杆菌D1501并进行培养，得到培养物，其中，乳酸杆菌D1501的接种量为3.5％；培养温度为38℃，培养时间为22h；
(b)按照保护剂与培养物的体积比为1∶1.1，在培养物中添加保护剂并制成菌悬液、冷冻干燥，既得上述菌剂；
其中，保护剂由如下百分含量的组分构成：
脱脂乳16％、乳糖6％、海藻糖7％，余量为生理盐水。
实施例6
本实施例为一种含有乳酸杆菌D1501的菌剂，该菌剂通过如下方法制得：
(a)在实施例3的培养基中接种乳酸杆菌D1501并进行培养，得到培养物，其中，乳酸杆菌D1501的接种量为3％；培养温度为35℃，培养时为24h；
(b)按照保护剂与培养物的体积比为1∶1，在培养物中添加保护剂并制成菌悬液、冷冻干燥，既得上述菌剂；
其中，保护剂由如下百分含量的组分构成：
脱脂乳15.25％、乳糖6.92％、海藻糖6.95％，余量为生理盐水。
实施例7
本实施例为一种驼奶的发酵方法，该发酵方法包括：
将上述实施例6中的菌剂添加到驼奶中进行发酵，其中，菌剂的添加终浓度为1.2g/L；发酵温度为39℃，发酵时间为16h。
实施例8
本实施例为一种驼奶的发酵方法，该发酵方法包括：
将上述实施例6中的菌剂添加到驼奶中进行发酵，其中，菌剂的添加终浓度为1g/L；发酵温度为37℃，发酵时间为24h。
实验例1
以实施例3中的培养基为基础，将实施例3中的碳源替换为如下表1中的不同碳源得到不同的培养基1～6，具体如表1所示：
表1培养基1～6中的碳源
Figure BDA0003077770430000061
Figure BDA0003077770430000071
获得实施例3的培养基以及培养基1～6，然后，按照1.33×1012CFU/L的接种量进行接种，然后，于37℃培养16h；分别测定OD600，测定结果如表2所示：
表2不同培养基培养结束后的OD600值
组别 培养基 培养基1 培养基2 培养基3 培养基4 培养基5 培养基6
OD600 0.871 0.150 0.209 0.230 0.203 0.210 0.215
上表中培养基即实施例3的培养基；
由表2数据可知：本申请碳源为D-山梨醇和葡萄糖时，能够显著促进乳酸杆菌D1502的增殖。
实验例2
以实施例3中的培养基为基础，将实施例3培养基中的氮源替换如下表3中的不同氮源得到不同的培养基7～12，具体如表1所示：
表3培养基7～12中的碳源
Figure BDA0003077770430000072
获得实施例3的培养基以及培养基7～12，然后，按照1.33×1012CFU/L的接种量进行接种，然后，于37℃培养16h；分别测定OD600，测定结果如表4所示：
表4不同培养基培养结束后的OD600值
组别 培养基7 培养基8 培养基9 培养基10 培养基11 培养基12
OD600 0.169 0.179 0.32 0.160 0.157 0.152
由表2数据可知：本申请氮源为牛肉膏和胰蛋白胨时，能够显著促进乳酸杆菌D1502的增殖。
实验例3
以实施例3中的培养基为基础，将实施例3培养基中胡萝卜汁(增殖因子)替换为如下表5中对应的组分，分别得到不同的培养基13～18，具体如表5所示：
表5培养基13～18中的增殖因子
Figure BDA0003077770430000081
获得实施例3的培养基以及培养基13～18，然后，1.33×1012CFU/L的接种量进行接种，然后，于37℃培养16h；分别测定OD600，测定结果如表6所示：
表6不同培养基培养结束后的OD600值
组别 培养基13 培养基14 培养基15 培养基16 培养基17 培养基18
OD600 0.642 0.736 0.751 0.688 0.578 0.690
由表6数据可知：本申请通过10％胡萝卜汁的添加，能够显著促进乳酸杆菌D1502的增殖。
实验例4
首先分别制得菌剂1～3；
菌剂1与实施例6中的菌剂基本相同，区别仅在于，实施例6中的保护剂由如下百分含量的组分构成：
脱脂乳15.25％、海藻糖13.87％，余量为生理盐水。
菌剂2与实施例6中的菌剂基本相同，区别仅在于，实施例6中的保护剂由如下百分含量的组分构成：
脱脂乳12％、乳糖6.92％、海藻糖10.2％，余量为生理盐水。
菌剂3与实施例6中的菌剂基本相同，区别仅在于，实施例6中的保护剂为生理盐水。
分别选取实施例6中的菌剂(记为菌剂0)以及菌剂1～3；
采用稀释平板涂布法分别检测菌剂0～3中的活菌数量；然后将菌剂0～3在-20℃下储藏3个月，然后，再检测活菌数量；检测结果如表7所示；
表7储藏前后菌剂中的活菌数量
组别 储藏前活菌数(CFU/g) 储藏后活菌数(CFU/g)
菌剂0 1.136×10<sup>10</sup> 4.2×10<sup>9</sup>
菌剂1 9.0×10<sup>9</sup> 1.2×10<sup>8</sup>
菌剂2 8.7×10<sup>9</sup> 3.3×10<sup>8</sup>
菌剂3 6.6×10<sup>9</sup> 3.1×10<sup>6</sup>
由表7可知；本申请实施例制备得到的菌剂活菌数高达1.1×1010CFU/g以上；-20℃保存3个月后仍可维持在4.2×109CFU/g以上；而且采用不同的保护剂对菌剂的保藏活性具有显著影响。
实验例5
按照实施例7和8中的发酵方法分别得到酸驼奶；
然后采用稀释平板涂布法检测酸驼奶的活菌数、pH值，并对酸驼奶的感官进行评价；检测和评价结果如表8所示；
将实施例7和实施例8得到的酸驼奶在-20℃存放1年，然后，测定酸驼奶的活菌量，测定结果如表8所示；
表8酸驼奶的检测结果
Figure BDA0003077770430000091
Figure BDA0003077770430000101
由表8数据可知：
本发明菌剂发酵得到的酸驼奶具有优异的感官，而且能够保障酸驼奶中菌种的存活时间，显著提高了菌种储存存活率。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (10)

1.一种用于培养乳酸杆菌D1501的培养基，其特征在于，包括如下重量百分含量的组分：
碳源3％～5％、氮源3％～5％、胡萝卜汁8％～12％，余量为UMRS培养基；
所述碳源为D-山梨醇和葡萄糖；
所述氮源为牛肉膏和胰蛋白胨。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述D-山梨醇和葡萄糖的质量比为1∶(0.9～1.1)。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述牛肉膏和胰蛋白胨的质量比为3∶(4.5～5.5)。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，还包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的添加终浓度为0.05mol/L～0.2mol/L，并且磷酸氢二钠与磷酸二氢钾的摩尔比为1∶(12～13)。
5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的碳氮比为3∶(3.5～4.5)，pH值为6.4～6.6。
6.一种含有乳酸杆菌D1501的菌剂，其特征在于，通过如下方法制得：
(a)在权利要求1～5任一所述培养基中接种乳酸杆菌D1501并进行培养，得到培养物；
(b)在培养物中添加保护剂制成菌悬液、冷冻干燥，既得所述菌剂。
7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于，所述乳酸杆菌D1501的接种量为(1.2～1.5)×1012CFU/L；
所述培养温度为33～38℃，培养时间为22～26h；
所述保护剂包括如下百分含量的组分：
脱脂乳15％～16％、乳糖6％～7％、海藻糖6％～7％，余量为生理盐水；
所述保护剂与所述培养物的体积比为1∶(0.9～1.1)。
8.权利要求6～7任一所述的菌剂在驼奶发酵中的应用。
9.一种驼奶的发酵方法，其特征在于，包括将权利要求6～7任一所述菌剂添加到驼奶中进行发酵。
10.根据权利要求9所述的发酵方法，其特征在于，所述菌剂的添加终浓度为0.8～1.2g/L；
所述发酵温度为35～39℃，发酵时间为15～25h。
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