CN111269849A

CN111269849A - 一种植物乳酸杆菌及其应用

Info

Publication number: CN111269849A
Application number: CN201911393585.7A
Authority: CN
Inventors: 姜波; 刘英华; 邱金培
Original assignee: Beijing Bojinyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Bojinyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN111269849B

Abstract

本发明提供一种植物乳酸杆菌及其应用，植物乳酸杆菌菌株保藏号为CGMCC No.16136，植物乳酸杆菌菌株MTB183的pheS序列如SEQ ID NO.1所示，16SrRNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供一种可降低牦牛腹泻发病率的植物乳杆菌微生态制剂，所述制剂的活性成分包括所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183，或者制剂的活性成分是所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183，所述微生态制剂通过发酵，离心，冻干，复配及喷雾干燥后制得。而本发明用于制备耗牛饲料，可有效降低耗牛腹泻几率，成本低廉，绿色环保。

Description

一种植物乳酸杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物乳酸杆菌及其应用。

背景技术

牦牛是高原地区主要的饲养畜种，是广大牧民世代经营赖以生存和发展的基础产业。在吴少华、冯泽莲等的报导中可知，由于高寒地区冬季饲草饲料严重不足，饲养管理粗放；牧民沿袭传统饲养方式，以家庭饲养为主，牲畜混群放牧，母牛挤奶过度，牛犊生长缓慢，饲草饲料储备意识差，抗御自然灾害的能力弱，幼畜成活率低，成畜死亡率高，在寒冷冬春季节因营养不良导致腹泻是造成死亡率高的原因之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物乳酸杆菌及其应用，要解决牛犊易因在寒冷冬春季节，因营养不良导致腹泻，继而导致死亡的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种植物乳酸杆菌菌株MTB183，其特征在于：其保藏号为CGMCC No.16136。

进一步优选地，所述植物乳酸杆菌菌株MTB183的pheS序列如SEQ ID NO.1所示，16SrRNA序列如SEQ ID NO.2所示。

一种可降低牦牛腹泻发病率的植物乳杆菌微生态制剂，其特征在于：所述制剂的活性成分包括权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183。

一种可降低牦牛腹泻发病率的植物乳杆菌微生态制剂，其特征在于：所述制剂的活性成分是权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183。

更加优选地，所述微生态制剂通过发酵，离心，冻干，复配及喷雾干燥后制得。

植物乳酸杆菌菌株MTB183在制备降低牦牛腹泻发病率制剂的用途，其特征在于：所述制剂的活性成分包括权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183。

一种牦牛饲料添加剂，其特征在于，所述牦牛饲料添加剂的活性成分包括权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183。

一种牦牛饲料添加剂，其特征在于，所述牦牛饲料添加剂的活性成分是权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183。

一种牦牛饲料，其特征在于，含有如权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183作为活性成分的饲料添加剂。

与现有技术相比本发明具有以下特点和有益效果：

本发明发现某地区天然无公害饮用水，动物饮用此水后，腹泻率明显低于其它地区，以该饮用水作为样品进行培养，挑选光滑、凸园、边缘整齐、白色或乳白色菌落镜检。对疑似菌落按上述步骤在MRS培养基中进行再此分离、纯化并进一步培养。最终筛选出一株菌株，经鉴定为乳酸杆菌属植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，该菌株对大肠杆菌有抑制性，用该菌制得的微生态制剂进行牦牛养殖饲喂试验，结果显示，试验组牦牛腹泻发病率明显低于对照组。

本发明还提供了采用所述植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株MTB183制备微生态制剂的方法，以及添加该微生态制剂的饲料，微生态制剂通过菌株发酵，离心，冻干，复配及喷雾干燥后制得，将上述微生态制剂加入饲料中后，牦牛犊牛及成牛的腹泻发病率均有明显降低，其中：牦牛牛犊的腹泻发病率由对照组的21.2％将至试验组的6.7％，试验组比对照组的腹泻发病率降低了68.4％；牦牛成的腹泻发病率由对照组的12.5％将至试验组的3.8％，试验组比对照组的腹泻发病率降低了69.6％。

所述植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株MTB183已送保藏，其保藏信息如下：

菌种保藏名称：MTB183

保藏号：CGMCC No.16136

拉丁名：Lactobacillus plantarum

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

地址；北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期:2018年7月20日

附图说明

图1植物乳杆菌MTB183在光学显微镜下的菌体形态图；

图2是植物乳杆菌MTB183发酵时间与对大肠杆菌抑菌性的比对图。

具体实施方式

本发明公开了一种植物乳杆菌MTB183及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述植物乳杆菌MTB183已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

本发明提供的一株植物乳杆菌MTB183(Lactobacillus plantarum)MTB183，来源于天然水样品中。

其中，植物乳杆菌MTB183的生理生化特性如下表1所示。

其中，菌体形态如图1所示。

其中，植物乳杆菌MTB183发酵时间与对大肠杆菌抑菌性的比对结果如图2所示。

其中，植物乳杆菌MTB183的pheS序列如SEQ ID NO.1所示，16S rRNA基因序列测定结果如SEQ ID NO.2所示。

植物乳杆菌MTB183对大肠杆菌的抑制率，发酵时间对抑菌性的影响，传代接种培养对抑菌性的影响，抑菌物质的热稳定性，不同发酵时间对抑菌性的影响，微生态制剂的制备方法及牦牛养殖饲喂试验结果如下。

1.植物乳杆菌MTB183的分离及鉴定

本试验所分离的菌株来源于某地水样品。据调查发现，该地区牦牛饮用该水后腹泻率明显低于其它地区，故对其进行研究。大肠杆菌是引起腹泻的原因之一，初步推断，饮用该水后腹泻率降低可能与水中的乳酸菌有关。因此，从该水中初步分离出1株乳酸杆菌。

1.1分离方法

吸取样品25ml至225ml无菌缓冲盐溶液中作为母液，震荡10min充分混匀，以无菌缓冲盐溶液做梯度稀释，选择三到五个合适的梯度，用接种针挑取适量稀释液于MRS培养基中进行划线分离，每个稀释梯度做两个重复。培养皿放入37℃培养箱中培养48～72小时后挑选光滑、凸园、边缘整齐、白色或乳白色菌落镜检。对疑似菌落按上述步骤在MRS培养基中进行再此分离、纯化，直到菌落完全纯化。

形态学鉴定：革兰氏染色，细胞形态，有无芽孢。

生理生化鉴定：接触酶，氧化酶，碳水化合物产酸。

分子生物学鉴定:pheS序列，16SrRNA序列分析。

1.2实验结果

1.2.1生理生化特性

生理生化特性结果参见下表1。

表1 MTB183的生理生化特性

1.2.2 PheS和16SrRNA基因序列测定

pheS序列如SEQ ID NO.1所示，16S rRNA基因序列测定结果如SEQ ID NO.2所示，由测序结果鉴定MTB183为植物乳杆菌MTB183。

1.2鉴定结果

结合以上鉴定结果，本发明的MTB183为植物乳杆菌MTB183。

2.植物乳杆菌MTB183发酵液对大肠杆菌的抑制效果测定

2.1材料与方法

2.1.1菌种

植物乳杆菌MTB183，大肠杆菌均来自于本实验室。

2.1.2培养基

MRS液体和固体培养基，营养肉汤固体和液体培养基

2.1.3菌种活化

植物乳杆菌MTB183活化：将置于低温冰柜的植物乳杆菌MTB183放到40～50℃水浴中解冻，在无菌条件下，按照1～5％的接种量转接到MRS液体培养基中，37℃恒温培养10～18h，活化1～3代。

大肠杆菌的活化：将置于冰箱内的大肠杆菌按照1～5％的接种量转接到液体营养肉汤培养基中，37℃恒温培养10～18h，活化1～3代。

2.1.4涂布营养琼脂平皿

将活化好的大肠杆菌用涂布法均匀的涂布到营养琼脂平板上，要求涂布时的活菌量在106cfu/ml。

2.1.5植物乳杆菌MTB183发酵液抑菌效果观察

牛津杯法：将铺好的指示菌的营养琼脂平板自然干燥30min，再在无菌条件下将牛津杯(内径为6mm)均匀放置于平板上，稍微下压，使其与平板培养基接触面无空隙，然后吸取0.2ml发酵液于杯中，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈的大小，并测定抑菌圈直径。每个样品做三个平行，结果取平均值。对照组在牛津杯中添加MRS液体培养基0.2ml，培养条件相同。

2.2实验结果

测定了植物乳杆菌MTB183发酵液对大肠杆菌的抑制效果，检测结果显示：植物乳杆菌MTB183发酵液对大肠杆菌有抑制效果，抑菌圈平均可达18.9mm。

植物乳杆菌MTB183发酵液对大肠杆菌的抑制效果详细检测结果见表2。

表2：植物乳杆菌MTB183发酵液对大肠杆菌的抑制率

试验组	对大肠杆菌的抑制率(mm)
		1	Φ＝19.0
2	Φ＝18.8
		3	Φ＝18.9

3.植物乳杆菌MTB183最佳培养时间确定

3.1材料与方法

3.1.1菌种

植物乳杆菌MTB183，大肠杆菌均来自于本实验室。

3.1.2培养基

MRS液体和固体培养基，营养肉汤固体和液体培养基。

3.1.3菌种活化

3.1.4涂布营养琼脂平皿

3.1.5植物乳杆菌MTB183发酵液的制备

设定发酵时间为0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h。并将发酵不同时间的植物乳杆菌MTB183发酵液进行对大肠杆菌抑菌性的测定。

3.1.6植物乳杆菌MTB183发酵液抑菌效果观察

牛津杯法：将铺好的指示菌的营养琼脂平板自然干燥30min，再在无菌条件下将牛津杯(内径为6mm)均匀放置于平板上，稍微下压，使其与平板培养基接触面无空隙，然后吸取0.2ml各组发酵上清液于杯中，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈的大小，并测定抑菌圈直径。每个样品做三个平行，结果取平均值。对照组在牛津杯中添加MRS液体培养基0.2ml，培养条件相同。

3.2实验结果

3.2.1植物乳杆菌MTB183不同发酵时间对大肠杆菌的抑制效果结果见表3。

表3:不同发酵时间对大肠杆菌的抑制效果

3.2.2不同发酵时间测定的OD600值如表4所示。

表4：不同发酵时间OD600值测定

3.2.3生长时间与抑菌效果比对结果如图2所示。

由上图结果可知，MTB183发酵15h后进入稳定期，对大肠杆菌的抑制效果也达到最大，为Φ＝18.57mm，此后抑菌活性稍有下降。因此，发酵15h为最佳发酵时间。

4.传代接种次数对植物乳杆菌MTB183发酵液抑菌性的影响

4.1材料与方法

4.1.1菌种

植物乳杆菌MTB183，大肠杆菌均来自于本实验室。

4.1.2培养基

MRS液体和固体培养基，营养肉汤固体和液体培养基。

4.1.3菌种活化

植物乳杆菌MTB183活化：将置于低温冰柜的植物乳杆菌MTB183放到40～50℃水浴中解冻，在无菌条件下，按照1～5％的接种量转接到MRS液体培养基中，37℃恒温培养10～18h，传代接种10次。

4.1.4涂布营养琼脂平皿

4.1.5植物乳杆菌MTB183发酵液抑菌效果观察

牛津杯法：将铺好的指示菌的营养琼脂平板自然干燥30min，再在无菌条件下将牛津杯(内径为6mm)均匀放置于平板上，稍微下压，使其与平板培养基接触面无空隙，然后吸取0.2ml发酵上清液于杯中，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈的大小，并测定抑菌圈直径。每个样品做三个平行，结果取平均值。对照组在牛津杯中添加MRS液体培养基0.2ml，培养条件相同。

4.2实验结果

植物乳杆菌MTB183不同传代接种次数的发酵液对大肠杆菌的抑制率结果见表5。

表5：不同传代接种次数对大肠杆菌的抑制率

试验结果显示，植物乳杆菌MTB183传代接种培养10次后其发酵液对大肠杆菌的抑制效果未出现明显的减弱趋势。说明植物乳杆菌MTB183发酵液，对大肠杆菌的抑制率不会随菌体的传代接种次数而改变。

5.植物乳杆菌MTB183发酵液中抑菌物质的热稳定性

经试验测得，植物乳杆菌MTB183抑制大肠杆菌的物质主要存在于上清液中，说明主要是代谢产物抑菌而并非是菌体抑菌。试验取适量上清液及冻干菌粉1倍稀释液分别测定对大肠杆菌的抑制率。

试验结果显示：MTB183上清液对大肠杆菌的抑制率为Φ＝18.87mm，而MTB183冻干菌粉1倍稀释液对大肠杆菌的抑制率则为Φ＝0mm。

因此，此次试验取上清液为试验材料，测定其在不同条件下对大肠杆菌的抑制效果。

5.1材料与方法

5.1.1菌种

植物乳杆菌MTB183，大肠杆菌均来自于本实验室。

5.1.2培养基

MRS液体和固体培养基，营养肉汤固体和液体培养基。

5.1.3菌种活化

5.1.4涂布营养琼脂平皿

5.1.5植物乳杆菌MTB183发酵上清液的制备

将活化好的植物乳杆菌MTB183发酵液采用低温离心的方法，制备发酵上清液，离心条件为：2～8℃，5000～8000rpm，5～10min。将离心好的发酵上清液分为8组，分别为CK对照组(未水浴处理)，50℃水浴10min，60℃水浴10min，70℃水浴10min，80℃水浴10min，90℃水浴10min，100℃水浴10min以及121℃高压灭菌10min。

5.1.6植物乳杆菌MTB183发酵液抑菌效果观察

5.2实验结果

不同温度水浴后MTB183上清液对大肠杆菌的抑制率结果见表6。

表6：不同温度水浴后MTB183上清液对大肠杆菌的抑制率

结果显示，植物乳杆菌MTB183抑菌物质的热稳定性很好，121℃高压灭菌10min后对大肠杆菌仍有Φ＝18.10mm的抑制率。

6.植物乳杆菌MTB183发酵培养基优化方法

6.1试验培养基

试验以MRS为基础发酵培养基，在此基础上进行培养基的优化，以植物乳杆菌MTB183在不同发酵培养基下的最大活菌数及对大肠杆菌的抑制效果为衡量标准，最终确定优化培养基。

MRS培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、KH2PO4 2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠2g、葡萄糖20g、Tween 80 1mL、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g，用蒸馏水定容至1L，调pH 6.2～6.4，121℃灭菌15min。

以MRS培养基为基础，按照试验设计添加不同生长因子，接种量2％～5％接入150mL液体培养基中，37℃静置培养24h，测其生长曲线。

6.2试验方法

6.2.1不同碳源、氮源、磷源的选择

在MRS液体培养基的基础上，分别添加2％(w/v)乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖作为不同碳源；分别加入2.5％(w/v)胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏作为的不同氮源；分别加入0.2％(w/v)K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4作为不同磷源，其他组分均相同。在培养基中接入活化后的植物乳杆菌，在37℃的条件下培养24h，稀释10倍后，在600nm波长下测定菌液OD600值，以MRS培养基为对照，比较不同的碳源、氮源及磷源对植物乳杆菌生长的影响。

6.2.2培养基的优化

采用正交试验设计优化碳源、氮源、磷源的用量，因素水平如表7所示。其中A因素为碳源，B因素为氮源，C因素为磷酸盐，测定菌液OD600值。

表7正交试验因素水平

6.2.3 OD600值测定

用722型分光光度计，将菌液稀释10倍后，以相同条件下的未接菌的培养基做参比，在600nm波长下测定菌液吸光度。

6.2.4菌落计数

以MRS固体培养基为计数培养基，采取适当的稀释倍数，倾注于平板上，37℃培养48h后计数。

6.3结果与分析

6.3.1碳源对植物乳杆菌生长的影响

经过对比四种不同碳源乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖对植物乳杆菌生长的影响，发现蔗糖的效果较为显著。

6.3.2氮源对植物乳杆菌生长的影响

以MRS培养基为对照，对比四种单一氮源：胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏，牛肉膏，对植物乳杆菌的生长影响。由实验结果可以看出，植物乳杆菌MTB183的生长在以酵母膏为单一氮源时，OD600值略高于对照，明显高于植物乳杆菌在其它单一氮源中的生长；植物乳杆菌MTB183在以胰蛋白胨为氮源时生长效果较差，单独添加时不利于植物乳杆菌的生长，不能很好的促进菌种生长。

6.3.3磷酸盐对植物乳杆菌MTB183生长的影响

检测四种单一磷酸盐K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4下植物乳杆菌的生长状况，对比检测结果，显示原基本培养基中的磷源KH2PO4的影响较为显著，作为生长因子能够很好的促进植物乳杆菌的生长。

6.4正交优化

根据单因素试验的结果，设计正交试验，因素A、B、C分别为蔗糖、酵母膏、K2HPO4，以吸光值(OD600nm)为评价指标，测定结果和相应的极差分析见表8。由表8可以看出，各因素对植物乳杆菌的生长影响次序依次是:酵母膏>蔗糖>K2HPO4。酵母膏的添加量是影响指标值的最主要因素，K2HPO4添加量对指标值影响最小。

表8正交试验因素水平

6.5活菌数及对大肠杆菌的抑菌性检测

检测植物乳杆菌MTB183在不同配方中的活菌数及对大肠杆菌的抑菌性，结果如表7所示。

表7：植物乳杆菌MTB183在不同配方中的活菌数及抑菌性

6.6小结

a.适合植物乳杆菌生长的培养基中，最佳碳源、氮源、磷源分别是蔗糖、酵母膏、K2HPO4。

b.采用正交试验优化后植物乳杆菌MTB183的活菌量检验为4.25×109cfu/ml，高于MRS的2.6×109cfu/ml，对大肠杆菌的抑制率由19.1mm增加至20.2mm。

7.植物乳杆菌MTB183微生态制剂制备方法

7.1试验菌种

植物乳杆菌MTB183。

7.2培养基及培养条件

7.2.1活化和计数培养采用MRS培养基

蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、KH2PO4 2g、柠檬酸二胺2g、乙酸钠2g、葡萄糖20g、Tween 80 1mL、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g，用蒸馏水定容至1L，调pH6.2～6.4，121℃灭菌15min。

7.2.2发酵培养基

酵母膏10～30g、K2HPO4 1～5g、柠檬酸二胺1～5g、乙酸钠1～5g、蔗糖5～30g、Tween 80 0.5～2mL、MgSO4·7H2O 0.5～3g、MnSO4·4H2O 0.05～1g、谷氨酸钠0.05～1g，用蒸馏水定容至1L，调pH 5.5～7.0，105℃～125℃灭菌5～20min。

7.2.3补料培养基

蔗糖5～30％、牛肉膏10～30％、酵母膏5～30％、柠檬酸三铵3～7％，配制400ml，105℃～125℃灭菌5～20min.

7.3培养方法

7.3.1甘油种子活化

取甘油保藏菌种接种到MRS液态试管中，(35℃～40℃)静置培养10～15小时.

7.3.2种子培养

按2％～5％的接种量，从活化菌液取适当量，接入装有150ml优化液体培养基的250ml三角瓶中，(35℃～40℃)静置培养.

7.3.3发酵培养

按2％～5％的接种量，接入装有培养基的发酵罐中，调节温度35℃～40℃、转速50～100r/min、初始PH6.5～7.0进行培养。

7.3.4补料调酸

6h～15h发酵培养后，调速至1～5ml/min补料400～500ml，PH控制在5.5～6.5范围内。

7.3.5终止发酵

当菌生长12～24h后，将发酵罐降温到20℃左右，下罐。

7.3.6离心

4摄氏度4000～8000转离心5～10min，取上清。

7.4微生态制剂制备方法

7.4.1载体加入

往植物乳杆菌MTB183上清液中加入20％-60％的载体及其他辅料，充分溶解，最终测得上清液中固形物含量为20％-60％。

7.4.2喷雾干燥机参数设定

将7.4.1所述的上清液进行喷雾干燥，将喷雾干燥机的进风温度设定为100℃-180℃；进料量设定为20rpm-100rpm，此时出风温度稳定在50℃-90℃之间。

7.4.2喷雾干燥后所得的粉剂即为所述微生态制剂，将微生态制剂收集至干净的包装袋中，存放于阴凉干燥处。

7.4.3微生态制剂收集

7.4.4微生态制剂微生物及水分检测

微生态制剂微生物及水分检测结果见表8。

表8：微生态制剂微生物及水分检测结果

乳酸菌数cfu/g	酵母菌数cfu/g	霉菌数cfu/g	大肠菌群MPN/g	水分％
					<10	<10	<10	<3	3.22

7.4.5微生态制剂对大肠杆菌的抑菌性及使用量确定

7.4.5.1微生态制剂对大肠杆菌的抑菌性试验结果见表9。

表9：微生态制剂不同稀释倍数下的抑菌性

稀释倍数	对大肠杆菌的抑制率，mm
		1倍	Φ＝21.0
10倍	Φ＝14.1
		100倍	Φ＝8.5
200倍	Φ<6.0
		500倍	Φ<6.0

由上表可知，微生态制剂在稀释倍数为100倍时，其对大肠杆菌仍有Φ＝8.5mm的抑菌圈；而当微生态制剂稀释超过200倍时，对大肠杆菌的抑菌性则不明显。因此，确定微生态制剂的使用量为按照1％的添加量加入到饲料中。

8.微生态制剂牦牛养殖饲喂试验

8.1实验方法

8.1.1牦牛牛犊饲喂试验

选择体重日龄相近、健康状况良好的牦牛犊牛100头，随机分成对照组和实验组，每组各50头进行饲喂实验，饲喂时间从3月20日至6月18日，累计90天，定期统计牦牛犊牛的总头数及腹泻发病头数。其中对照组饲喂基础日粮；试验组饲喂基础日粮+1％植物乳杆菌MTB183微生态制剂。

8.1.2牦牛成牛饲喂试验

选择体重日龄相近、健康状况良好的牦牛成牛100头，随机分成对照组和实验组，每组各50头进行饲喂实验，饲喂时间从3月20日至6月18日，累计90天，定期统计牦牛成牛的总头数及腹泻发病头数。其中对照组饲喂基础日粮；试验组饲喂基础日粮+1％植物乳杆菌MTB183微生态制剂。

8.2实验结果

试验结果表明，添加1％的植物乳杆菌MTB183微生态制剂后，牦牛犊牛及成牛的腹泻发病率均有明显降低，其中：牦牛牛犊的腹泻发病率由对照组的21.2％将至试验组的6.7％，试验组比对照组的腹泻发病率降低了68.4％；牦牛成的腹泻发病率由对照组的12.5％将至试验组的3.8％，试验组比对照组的腹泻发病率降低了69.6％，牦牛养殖饲喂试验结果见表10。

表10：牦牛养殖饲喂试验结果

	对照组腹泻发病率	试验组腹泻发病率
			犊牛	21.2％	6.7％
成牛	12.5％	3.8％

综上所述，本发明从健康原料中分离得到，经鉴定为植物乳杆菌MTB183。所述的植物乳杆菌MTB183对大肠杆菌有抑菌性，该抑菌物质不随传代培养次数的增加而减弱，经121℃高温高压处理10分钟后仍有抑菌活性。植物乳杆菌MTB183在接种发酵15小时后，其抑菌物质积累量达到最大，且在优化后的培养基中进一步提高了其对大肠杆菌的抑菌性能。由所述的植物乳杆菌MTB183上清液制得微生态制剂可用于牦牛腹泻发病率的防治。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING 1

<110> 北京博锦元生物科技有限公司

<120> 一种植物乳酸杆菌及其应用

<130> 20191213

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 435

<212> DNA/RNA

<213> 植物乳酸杆菌

<400> 1

agacgtgcta ctacgcacgc agacgtctgc tgatcagccg cggtcacttg aaaatcacga 60

tttttctaaa ggaccgctga aggtcttgtc acctggccgc gtttatcggc gtgatacgga 120

tgatgcaacc cattcccatc aatttcatca aattgaaggg ttagtcgtgg acaagcatat 180

tacgatggct gatttgaagg gcaccttaat tctggttgcc aagactttgt ttggcgatca 240

attcgatgtt cggctacggc caagcttctt tccattcacg gaaccatccg tagaagctga 300

tgtaacttgc tttaattgca atggcaaggg ctgtgcaatc tgtaagcaaa cgggttggat 360

cgaagtactg ggtgccggca tggttcaccc ccacgtgtta gaaatgtctg gcattgatcc 420

agaagaatat ggtgg 435

SEQUENCE LISTING 2

<110> 北京博锦元生物科技有限公司

<120> 一种植物乳酸杆菌及其应用

<130> 20191213

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 2

<211> 1442

<212> RNA

<213> 植物乳酸杆菌

<400> 1

tacatgcagt cgaacgaact ctggtattga ttggtgcttg catcatgatt tacatttgag 60

tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg aaacctgccc agaagcgggg gataacacct 120

ggaaacagat gctaataccg cataacaact tggaccgcat ggtccgagtt tgaaagatgg 180

cttcggctat cacttttgga tggtcccgcg gcgtattagc tagatggtgg ggtaacggct 240

caccatggca atgatacgta gccgacctga gagggtaatc ggccacattg ggactgagac 300

acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgaaagtctg 360

atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg taaaactctg ttgttaaaga 420

agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta ttgacggtat ttaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg 540

cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa agcyttcggc tcaaccgaag 600

aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta 720

actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag caaacaggat tagataccct ggtagtccat 780

accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg 840

cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat tagacgttcc cttcggggac atggatacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa gttgggcact ctggtgagac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgaactcgcg agagtaagct aatctcttaa 1260

agccattctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac atgaagtcgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg gtggggtaac cttttaggaa ccagccgcct 1440

aa 1442

Claims

1.一种植物乳酸杆菌菌株MTB183，其特征在于：其保藏号为CGMCC No.16136。

2.如权利要求1所述的一种植物乳酸杆菌菌株MTB183，其特征在于：所述植物乳酸杆菌菌株MTB183的pheS序列如SEQ ID NO.1所示，16SrRNA序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种可降低牦牛腹泻发病率的植物乳杆菌微生态制剂，其特征在于：所述制剂的活性成分包括权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183。

4.一种可降低牦牛腹泻发病率的植物乳杆菌微生态制剂，其特征在于：所述制剂的活性成分是权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183。

5.如权利要求3或4所述的一种可降低牦牛腹泻发病率的植物乳杆菌微生态制剂，其特征在于：所述微生态制剂通过发酵，离心，冻干，复配及喷雾干燥后制得。

6.权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183在制备降低牦牛腹泻发病率制剂的用途，其特征在于：所述制剂的活性成分包括权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183。

7.一种牦牛饲料添加剂，其特征在于，所述牦牛饲料添加剂的活性成分包括权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183。

8.一种牦牛饲料添加剂，其特征在于，所述牦牛饲料添加剂的活性成分是权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183。

9.一种牦牛饲料，其特征在于，含有如权利要求1所述的植物乳酸杆菌菌株MTB183作为活性成分的饲料添加剂。