CN110172427A - 一种提高狄氏副拟杆菌冻干存活率的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高狄氏副拟杆菌冻干存活率的方法及其应用，属于微生物工程技术领域。本发明为一种通过添加蔗糖溶液从而减少拟杆菌在冷冻干燥过程中的细胞死亡的方法。主要包括蔗糖的添加和拟杆菌的冷冻干燥。通过整套方法，可以在3‑5天内快速的得到拟杆菌冻干菌粉。蔗糖作为冷冻干燥保护剂的添加，有效提高了拟杆菌在冷冻干燥过程的存活率，减少了拟杆菌冻干过程中的死亡率，增加拟杆菌制剂在其之后的使用过程中的适用能力及活性。此外，由于蔗糖对人畜安全无害，这一思路可以用于直接食用冻干菌粉的制作过程。

Description

一种提高狄氏副拟杆菌冻干存活率的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种提高狄氏副拟杆菌冻干存活率的方法，属于微生物工程技术领域。
背景技术
狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)具有广泛的胆酸转化功能，能够改善脂代谢紊乱、修复肠壁完整性、激活肠道糖异生，从而调节食欲，促进肝脏糖原合成，改善宿主糖代谢紊乱。其主要是通过产生琥珀酸、次级胆酸来激活不同的信号通路，发挥多靶点整体调节作用，是一种潜在的、新型抗代谢综合征益生菌。以狄氏副拟杆菌为代表的下一代益生菌的产品开发、加工和利用将成为一个新的研究热点。在市场上，益生菌产品主要以两种形式销售：食品和膳食补充剂。其中还有益生菌的食品几乎都是奶制品。而含益生菌的膳食补充剂产品品种较多，剂型有胶囊、粉剂、口服液、片剂等。
真空冻干是目前菌粉生产中的常用工艺流程。培养得到的活菌经过离心得到菌泥，重悬后低温冷冻，在真空条件下，低温使冰直接升华，实现冷冻干燥。在此过程中，菌体受到低温胁迫、冻结应力损伤等，导致细胞膜通透性改变、蛋白质变性失活、pH的动态平衡被破坏等。因此真空冻干对微生物活性有较大的影响，在真空冻干前，需要加入特定的冻干保护剂。
常用的冻干保护剂包括甘油、蔗糖、海藻糖、脱脂乳粉、谷氨酸钠等。不同菌株由于生理特性及菌体表面特性差异，所用的保护剂不尽相同，故而大部分菌体保护剂具有专一性，无法直接应用于其他菌株的冻干技术中。比如，在ChIFN酿酒酵母工程菌冻干保护剂的优化实验中，用半乳糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、半胱氨酸盐、β-环状糊精和脱脂奶粉进行单一和复配实验，单一保护剂对细胞存活率的影响结果表明，脱脂奶粉、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、聚乙二醇对工程菌的保护效率分别为43.73％、37.78％、30.60％、29.25％、28.94％、28.45％；而获得的蔗糖(144.4g/L)+脱脂奶粉(100.8g/L)+聚乙二醇(11.1g/L)配比的复合保护剂对工程菌保护作用达到最大，保护效率为80.81％(见文献：张冬生,刘宗,宋莉,et al.ChIFN酿酒酵母工程菌冻干保护剂的优化[J].山地农业生物学报,2018,37(1):90-94.)。
蔗糖为小分子膜外保护剂，适当浓度的蔗糖可以降低膜外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量，缓解胞内结冰情况。蔗糖在干燥中抑制了细胞膜的相变，即在冻干脱水时，由于蔗糖具有水置换作用，蔗糖分子羟基与磷脂上磷酸基团连接形成氢键，从而阻止和限制细胞膜因脱水造成融合，并降低相变温度，使脂膜不向凝胶相转变而保持液晶相，增加膜流动性，使干燥脂膜与水合质膜生理特性相同。
目前市场上没有用于狄氏副拟杆菌的冷冻干燥保护剂，狄氏副拟杆菌的冻干保护剂是一项尚待开发的工作。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种狄氏副拟杆菌冻干粉的制备方法，所述方法包括：
(1)狄氏副拟杆菌的前处理，(2)冷冻干燥的预处理，(3)冷冻干燥；所述步骤(1)具体为：
a)将狄氏副拟杆菌单菌落接种到BHI培养液中培养；
b)将步骤a)所得培养液离心去上清液后，洗涤所获得的菌泥；
c)重悬洗涤后的菌体，获得菌悬液；
所述步骤(2)是在步骤c)的菌悬液中添加质量体积浓度为10-30％的蔗糖溶液作为保护剂，转移至冻干瓶；
(3)冷冻干燥。
在本发明的一种实施方式中，将菌悬液与蔗糖溶液混合，菌悬液与保护剂的体积比为1:2-2:1，菌悬液中含3×1010-5×1010CFU/mL狄氏副拟杆菌细胞。
在本发明的一种实施方式中，步骤(a)所述培养条件为：35-38℃静置培养10-30h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(a)所述培养包括：以1-5％的接种量将狄氏副拟杆菌进行第一次扩培，扩培体积为100mL，培养条件为35-38℃、10-15h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(a)所述培养包括：以1-5％的接种量将狄氏副拟杆菌进行第二次扩培，扩培体积为1L，培养条件为35-38℃、10-15h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(a)中狄氏副拟杆菌的接种量为1-5％(V/V)。
在本发明的一种实施方式中，冷冻干燥条件为：在-55～-45℃下预冻3-5h，在-35～-25℃一次干燥17-19h，再升温到20～30℃，13-15h之后取出冻干瓶密封，得到干燥的菌粉。
在本发明的一种实施方式中，步骤(b)所述洗涤是用生理盐水洗涤两次，步骤(c)所述重悬是用生理盐水重悬。
在本发明的一种实施方式中，步骤(c)中将菌泥与生理盐水按照1:1(g/mL)的比例混合。
在本发明的一种实施方式中，所述狄氏副拟杆菌包括狄氏副拟杆菌ATCC 8503或狄氏副拟杆菌ATCC BAA-1295。
本发明的第二个目的是提供一种提高狄氏副拟杆菌冻干存活率的方法，是利用质量体积浓度为10-30％的蔗糖溶液作为冻干保护剂，将菌悬液与保护剂按体积比为1:2-2:1混合，菌悬液中含3×1010-5×1010CFU/mL狄氏副拟杆菌细胞。
本发明的第三个目的是提供上述方法在制备益生菌产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述方法制备的益生菌产品。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种提高狄氏副拟杆菌冻干存活率的方法，以增强拟杆菌制剂在后续使用过程中的应用效能。主要包括蔗糖的添加和狄氏副拟杆菌的冷冻干燥。通过整套方法，可以在3-5天内快速得到狄氏副拟杆菌冻干菌粉。添加蔗糖溶液作为冷冻干燥保护剂，狄氏副拟杆菌在冷冻干燥过程的存活率达到13.89％，减少了菌株冻干过程中的死亡率，增加狄氏副拟杆菌制剂在其之后的使用过程中的适用能力及活性。此外，由于蔗糖对人畜安全无害，这一思路可以用于直接食用冻干菌粉的制作过程。
附图说明
图1：菌株添加保护剂后的冻干存活率。
具体实施方式
相关培养基及试剂：
BHI液体培养基：38.5g/L脑心浸液培养基，1g/L半胱氨酸盐酸盐，1mL/L维生素K，10mL/L血晶质，调节PH至7.0，115℃灭菌20分钟；
BHI固体培养基：38.5g/L脑心浸液培养基，1g/L半胱氨酸盐酸盐，1mL/L维生素K，10mL/L血晶质，15g/L琼脂粉，调节PH至7.0，115℃灭菌20分钟；
血晶质溶液(1mg/mL)：0.28gKOH、25.0mL无水乙醇、100mg血晶质固体，加水至100mL，保存于4℃；
维生素K1溶液(2mg/mL)：140mg维生素K、20mL无水乙醇，保存于4℃。
实施例1单因素冻干保护剂的筛选
(1)配置10种保护剂：甘油、MgSO4、NaCl、乳糖、海藻糖、蔗糖、乳清蛋白、脱脂乳粉、甘露醇、山梨醇，保护剂配制成质量浓度为20％的水溶液，调节pH至7.0，115℃灭菌20分钟。其中两种蛋白质类保护剂(乳清蛋白及脱脂乳粉)采用巴氏杀菌方式，即：75℃，20min。
(2)保护剂的添加：将10g菌泥与10mL生理盐水混匀，涡旋震荡充分混匀，调pH至7.0，各取2mL菌悬液分装到含1mL各种保护剂溶液的5mL EP管里，共3mL，继续涡旋震荡充分混匀。
(3)冻干前活菌计数：采用菌落平板计数法，即在无菌操作条件下，取0.5mL步骤(2)中的混液加入到分装了4.5mL生理盐水的EP管中，制成1:10的均匀稀释液，再依次进行10倍梯度稀释，至适当稀释度10-7、10-8、10-9后，分别取各稀释浓度1mL于固体培养皿中，与已融化并冷却至45℃左右的BHI固体培养基约15mL混合，使菌体分散均匀，待凝固后倒置，放入厌氧培养箱中培养14h，记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每毫升原始样品中所含细菌菌落总数，来表示活菌数。每个稀释度做4个平行。
(4)冷冻干燥：取1mL步骤(2)中含保护剂的菌液分别加入每个冻干瓶中。每个保护剂做两个平行。经过-40℃预冻30min，在-25℃升华30h，再阶梯式升温到30℃，共20h，得到干燥的菌粉。
(5)细菌复水及活菌计数：将冷冻干燥后的样品加入1mL生理盐水复水，涡旋震荡充分混匀，采用菌落平板计数法，即在无菌操作条件下，取0.5mL复水后的菌液加入到分装了4.5mL生理盐水的EP管中，制成1:10的均匀稀释液，再依次进行10倍梯度稀释，至适当稀释度10-8、10-9后，分别取各稀释浓度1mL于固体培养皿中，与已融化并冷却至45℃左右的BHI固体培养基约15mL混合，使菌体分散均匀，待凝固后倒置，放入厌氧培养箱中培养14h，记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每毫升原始样品中所含细菌菌落总数，来表示活菌数。每个稀释度做4个平行。
表1.菌株添加保护剂后冻干存活率
注：表1中0.00％的结果是代表存活率小于0.0092％
实验结果如图1和表1所示。蔗糖作为一种冻干效果较佳的保护剂，存活率达到了13.89％。与此相比，空白对照组的存活率仅有0.0083％，不到0.01％，说明这株菌抗冻抗干燥能力较弱。对乳酸菌冻干保护效果较好的蛋白质类保护剂脱脂乳粉的存活率仅为0.09％，蔗糖与其保护效果相比提高了13.8％的存活率。与同类保护剂相比，添加蔗糖后菌株的存活率也明显高于乳糖与海藻糖，分别提高了6.3％、13.01％。说明本发明保护剂对于冻干狄氏副拟杆菌菌株的保护作用具有明显的优势。
对比例1
添加质量体积浓度为40％的蔗糖溶液作为保护剂，其余条件同实施例1，菌株的冻干存活率为7.06％。
对比例2
添加菌悬液和蔗糖溶液的体积比为3:1，其余条件同实施例1，菌株的冻干存活率为8.11％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种狄氏副拟杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)狄氏副拟杆菌的前处理，(2)冷冻干燥的预处理，(3)冷冻干燥；所述步骤(1)具体为：
a)将狄氏副拟杆菌单菌落接种到BHI培养液中培养；
b)将步骤a)所得培养液离心去上清液后，洗涤所获得的菌泥；
c)重悬洗涤后的菌体，获得菌悬液；
所述步骤(2)是在步骤c)的菌悬液中添加质量体积浓度为10-30％的蔗糖溶液作为保护剂，转移至冻干瓶；
(3)冷冻干燥。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将菌悬液与蔗糖溶液混合，菌悬液与保护剂的体积比为1:2-2:1，菌悬液中含3×1010-5×1010CFU/mL狄氏副拟杆菌细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述培养条件为：35-38℃静置培养10-30h。
4.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，步骤(a)中狄氏副拟杆菌的接种量为1-5％(V/V)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，冷冻干燥条件为：在-55～-45℃下预冻3-5h，在-35～-25℃一次干燥17-19h，再升温到20～30℃，13-15h之后取出冻干瓶密封，得到干燥的菌粉。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述洗涤是用生理盐水洗涤两次，步骤(c)所述重悬是用生理盐水重悬。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中将菌泥与生理盐水按照1:1(g/mL)的比例混合。
8.一种提高狄氏副拟杆菌冻干存活率的方法，其特征在于，是利用质量体积浓度为10-30％的蔗糖溶液作为冻干保护剂，将菌悬液与保护剂按体积比为1:2-2:1混合，菌悬液中含3×1010-5×1010CFU/mL狄氏副拟杆菌细胞。
9.权利要求1-8任一所述方法在制备益生菌产品中的应用。
10.权利要求1～7任一所述方法制备的益生菌产品。
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Application publication date: 20190827

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