CN105361062B

CN105361062B - 一种提高乳杆菌耐盐能力的方法

Info

Publication number: CN105361062B
Application number: CN201510852881.4A
Authority: CN
Inventors: 韩雪; 张兰威; 冯镇; 张莉丽; 易华西; 张英春; 杜明; 王学良
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2035-11-30
Also published as: CN105361062A

Abstract

本发明公开了一种提高乳杆菌耐盐能力的方法，其步骤如下：一、将活化好的目的菌株或直投发酵剂按要求接入到待发酵物质中，混均；二、所用乳杆菌耐盐保护物质为一类相容性溶质的混合物，将相容性溶质用去离子水或待发酵液溶解，所述相容性溶质为四氢嘧啶、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、组氨酸或脯氨酸；三、将步骤二中的各种相容性溶质进行两两互配或多种组合互配，加入到步骤一中的待发酵物中，使得各种相容性溶质在最终待发酵物中的浓度为4.5‑7.5mmol/L，然后按待发酵物发酵条件进行发酵。加入本发明确定的相容性溶质混合物及添加量，可使乳酸菌在亚致死浓度下活菌菌数提高1倍左右。

Description

一种提高乳杆菌耐盐能力的方法

技术领域

本发明属于乳酸发酵食品技术领域，涉及一种在含盐浓度较高的发酵食品中提高其中乳杆菌耐盐性的方法。

背景技术

乳酸菌发酵食品是我国食品工业的重要组成部分，在食品发酵过程中，常用盐来抑制微生物的生长，高盐浓度是乳酸菌在发酵时遇到的一个主要环境应力。由高盐浓度引起的溶液渗透压增高，细胞内水分外流，使得发酵品中菌体细胞质壁分离，抑制其生长，甚至死亡，大大降低了发酵食品的营养价值，限制了其快速发展。

由于不同乳酸菌的耐盐能力不同，即使是同属不同种，甚至不同亚种的乳酸菌，其耐盐能力也有所不同。因此在许多腌渍发酵制品中往往需筛选耐盐性较强的菌株，但即使相对耐盐性较高的菌株也无法避免其随发酵进行活菌数逐渐降低的问题，如发酵蔬菜、干酪等，其限制了腌渍发酵食品的发展。此外在乳酸菌直投发酵剂的生产中，高密度培养是其必要过程，然而在其高密度培养中目前常采用流加碱液来中和乳酸菌代谢产生的乳酸，产生大量的盐，对乳酸菌又产生了盐胁迫。因此开发提高乳酸菌的耐盐能力的方法，不但可丰富腌渍发酵食品中乳酸菌菌种同时还可满足乳酸菌高密度生长的要求，从而增加乳酸菌直投发酵剂中的活菌数，对乳酸菌发酵食品的研究具有重要的实际意义。因此乳酸菌在高渗环境中存活、生长、代谢的能力对于工业生产至关重要。

溶液盐浓度增加会导致溶液渗透压的升高，而菌体为维持正常膨压，往往会启动自身的抗逆保护性物质，这类物质被称为相容性溶质，是一类极性的、易溶的、生理值条件下不带电荷并且可以在细胞内高浓度积累（能达到1mol/kg）而不影响细胞的主要功能和蛋白质分子的正确折叠的小分子有机物质。目前这种物质在嗜盐菌中被广泛研究，然而乳酸菌在盐胁迫下是否转运相容性溶质，转运的相容性溶质是否对其具有抗盐胁迫作用及它们是否有交互作用，还未见报导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使乳酸菌在亚致死盐浓度条件下提高其活菌数，即提高乳酸菌耐盐性的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种提高乳杆菌耐盐能力的方法，包括以下步骤：

一、将活化好的目的菌株或直投发酵剂按要求接入到待发酵物质中，混均；

二、所用乳杆菌耐盐保护物质为一类相容性溶质的混合物，将相容性溶质用去离子水或待发酵液溶解，温度不得超过50℃，然后过0.2µm滤膜，所述相容性溶质为四氢嘧啶、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、组氨酸或脯氨酸；

三、将步骤二中的各种相容性溶质进行两两互配或多种组合互配，加入到步骤一中的待发酵物中，使得各种相容性溶质在最终待发酵物中的浓度为4.5-7.5mmol/L，然后按待发酵物发酵条件进行发酵。

本发明中，所述目的菌株为乳杆菌属和双歧杆菌属，例如：保加利亚乳标菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等，其中：保加利亚乳杆菌在2%浓度下活菌数仅为4.33×10⁶CFU/mL，而加入抗渗保护性相容性溶质后，活菌数可达5.71×10⁸CFU/mL，可显著增加该菌的抗盐性。

以乳酸菌为例，本发明按照要求将活化好的乳酸菌接入到含有一定盐的食物当中按该食物发酵培养条件进行发酵，该盐浓度不能超过其亚致死浓度，在该亚致死盐浓度下，菌体仍能缓慢生长，但生长速度和活菌数较低，通过对乳杆菌细胞膜的通透性、完整性等一系列的研究，开发出一种增加乳杆菌抗盐能力的方法，其具有如下优点：

1、本发明可使乳杆菌在高渗溶液下与非盐胁迫保持近似的细胞膨压、Zeta电位、细胞膜通透性及流动性，从而保持了细胞膜的稳定性，增加了乳杆菌抗盐能力，使其在亚致死条件下仍能保持很高的活性。

2、本发明的应用使得一些盐敏感性菌株也可应用到腌渍品中，大大提高我国腌渍品的种类提高其营养价值。

3、本发明还可应用到直投发酵剂生产中，提高菌体活菌数，可降低直投发酵剂的使用量，节约生产成本。

4、加入本发明确定了可增加乳杆菌的耐盐能力的物质为相容性溶质，该种相容性溶质混合物及添加量，可使乳杆菌在亚致死浓度下活菌菌数提高1倍左右，所添加的相容性溶质属氨基酸及嘧啶类相容性溶质，在提高菌体耐盐能力同时可补充氨基酸及嘧啶，所用相容性溶质加入到食品中无毒无害，其中四氢嘧啶还有一定抗炎功效。

附图说明

图1为不同条件发酵白菜pH变化；

图2为加盐加相容性溶质后发酵白菜中菌体生长变化；

图3为双歧杆菌在加相容性溶质的恒定pH发酵中菌体生长变化；

图4为200倍激光共聚焦显微镜下的德式乳杆菌保加利亚亚种荧光染色结果（只加盐）；

图5为200倍激光共聚焦显微镜下的德式乳杆菌保加利亚亚种荧光染色结果（不加盐）；

图6为200倍激光共聚焦显微镜下的德式乳杆菌保加利亚亚种荧光染色结果（加入相容性溶质组合）；

图7为不同培养条件下德式乳杆菌保加利亚亚种细胞膜完整性比例变化，图中a、b、*、**、A、B表示差异显著性，不同字母代表显著性差异（P<0.05），相同字母代表不显著性差异（P>0.05）；

图8为不同培养条件下德式乳杆菌保加利亚亚种细胞膜流动性的变化，P为偏振度，η为细胞膜微粘度。图中a、b、c、*、**表示差异显著性。不同字母代表显著性差异（P<0.05），相同字母代表不显著性差异（P>0.05）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1：

本实施例提供了一种提高乳杆菌耐盐能力的方法，该方法可在发酵酸菜中应用，具体方法如下：

白菜原料经洗净、漂烫、晾干后，进行切分，再用10％的盐水浸泡10min后，放入灭菌容器中。添加质量为蔬菜重量2倍的2%NaCl灭菌溶液，接入发酵蔬菜用的德式乳杆菌保加利亚亚种和副干酪乳杆菌，比例为1：1 （V/V），总接种量为2％；所用耐盐保护相容性溶质为甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸及脯氨酸，分别将各种相容性溶质溶于部分蔬菜汁溶液中溶解，溶解温度不超50℃，混均后过0.2µm滤膜，然后将各相容性溶质按发酵液重量加入，使甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸及脯氨酸在待发酵蔬菜中的浓度分别为5.2 mmol/kg、6.4mmol/kg、4.7mmol/kg、5.7mmol/kg，封口之后在厌氧环境中发酵。相容性溶质的加入降低了菌体因盐浓度导致的活菌数及生长活力下降的问题，加快了菌体产酸速度，大大缩短了发酵生产周期。

由图1可知：加入相容性溶质后菌体在高盐浓度下仍可继续快速代谢产酸，发酵5天后pH开始缓慢下降，说明加入该发明的相容性溶质可以增加菌体的抗盐能力，不影响菌体生长，仍可正常代谢产酸，而不加相容性溶质的菌体发酵蔬菜产酸速度缓慢，发酵8天后pH仍在缓慢下降，说明菌体在该盐浓度不加任何抗盐保护物质菌体生长代谢受到了抑制。

实施例2：

本实施例提供了一种提高乳杆菌耐盐能力的方法，该方法在发酵泡菜中应用，具体方法如下：

将准备腌制的原料如：胡萝卜、白萝卜、卷心菜等洗净、漂烫、晾干后，进行切分，将原料用20%-25%的食盐溶液预泡一定时间后取出沥干，放入泡菜坛中，装至距坛口7cm左右，接入发酵泡菜用菌株，随即注入所配制的泡菜盐水，使用盐水将蔬菜浸没后密封坛口。经20℃发酵3天后，制品仍含很高的菌体密度，可增加产品的营养价值，且主要风味物质双乙酰及总酯含量与不加相容性溶质的对照样无显著差别。

发酵泡菜用菌株处理：将培养24h后的嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌发酵液在3000 r/min离心15min后，用生理盐水清洗2次菌体然后接入到盐水浸泡的蔬菜中（总接菌量为3%V/W）。

泡菜水的配制：泡菜水含盐量以6%-8% （v/v）为宜，同时加入发酵泡菜菌株的耐盐保护物质——相容性溶质，该相容性溶质由甲硫氨酸、组氨酸组成，分别将其溶于部分泡菜水中，溶解后过0.2µm滤膜，然后依次加入到待发酵的蔬菜中混均，使甲硫氨酸、组氨酸在待发酵蔬菜中的浓度为5.2 mmol/L、4.9mmol/L。

表1 加相容性溶质后双乙酰含量

表2加相容性溶质后总酯含量

由表1和2可以看到，相容性溶质的加入与否并不影响发酵蔬菜中风味物质双乙酰和酯的形成。在加相容性溶质的泡菜汁中风味物质双乙酰和总酯含量反而略高于对照样。

从图2菌体生长曲线也可看出在加相容性溶质的发酵泡菜中，菌体密度值不受加盐影响，仍能保持很高生长量，而不加相容性溶质的发酵泡菜菌体生长缓慢且菌体密度不高，说明发酵泡菜中由于加入盐，渗透压增高使得菌体生长受到了抑制。

实施例3：

本实施例提供了一种提高乳杆菌耐盐能力的方法，该方法所用的耐盐保护物质为相容性溶质，可在直投式方酵剂生产过程中的高密度培养中应用，将长双歧杆菌按4%的量接种于MRS-WP培养基中。

MRS-WP液体培养基配方为：葡萄糖20g，胰酶水解酪蛋白（Tryptone）10g，牛肉膏10g，酵母浸汁5g，柠檬酸钠5g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4.4H2O0.25g，吐温80 1ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.005，无水碳酸钠0.002，10%牛乳清（WP），用蒸馏水补足至1000ml，115℃，15min灭菌。

取少量MRS-WP培养基，所用相容性溶质由组氨酸、四氢嘧啶、脯氨酸组成，将组氨酸、四氢嘧啶、脯氨酸分别溶于37℃的高密度培养基中混均后过0.2µm滤膜，然后依次加入到高密度培养基中混均，使组氨酸、四氢嘧啶、脯氨酸在高密度培养基中的浓度分别为5.6mmol/L、6.5mmol/L、7.0mmol/L，在发酵罐中控制温度37℃、转速为110rpm，用10%的氢氧化钠中和恒定发酵液pH值在5.6-6.0，发酵培养24小时。由图3可知，发酵16后活菌数可达2.24×10⁹CFU/mL，而不加相容性溶质的对照样菌数为9.54×10⁸CFU/mL，菌数较未加相容性溶质提高了1.35倍。

实施例4：

本实施例提供了一种提高乳杆菌耐盐能力的方法，该方法可在直投式方酵剂生产过程中应用，具体方法如下：

将德式乳杆菌保加利亚亚种接种到由8-12%的脱脂乳粉、4-6%的胰蛋白酶水解乳清粉、3-6%的番茄汁、3-6%的麦芽糖、1-3%乳糖、0.5-0.7%的酵母膏或粉、40-80毫克/公斤甲酸和余量的水组成的增菌培养基中，混均后，取少量培养基，加入乳杆菌的耐盐保护性相容性溶质——甲硫氨酸、四氢嘧啶、赖氨酸的混合物，将各相容性溶质分别溶于37℃该培养基中混均后过0.2µm滤膜，将全部滤过液加入到增菌培养基中，使甲硫氨酸、四氢嘧啶、赖氨酸在高密度培养基中的浓度为5.0mmol/L、7.2mmol/L、5.6mmol/L，在发酵罐中控制温度41.5-43.5℃、用10%的氢氧化钠中和恒定发酵液pH值在5.6-6.0，发酵培养4.0-4.7小时；发酵液在0-20℃、转数为6000-15000转/分钟的条件下离心处理，得到离心沉淀物；按离心沉淀物重量的1-2倍添加冻干保护剂，冻干保护剂由10-20%奶粉、1-3%甘油、1-2%维生素C、0.5-1%谷氨酸或甘氨酸、5%蔗糖、1%海藻糖和余量的水组成，冻干保护剂与菌体离心沉淀物在无菌条件下均匀混合。加入相容性溶质冻干后的菌粉活力要高于未加相容性溶质的菌体活力，发酵乳时间明显缩短，说明相容性溶质不但可以在高密度培养中提高菌密度还可以增加菌体抗冻干保护性。冻干后干粉活菌数比没加相容性溶质的活菌数提高2.46倍。

表3

表3的说明：将生产出的直投发酵剂以0.003‰（W/V）的比例接种于灭菌的乳中，42℃发酵，测定凝乳时间及产酸几乎终止的时间，由表3可以看到加入相容性溶质生产出的发酵剂发酵乳产酸速度快，产酸终止时间短，说明菌体活力高代谢产酸速度快，再次证明生产直投式方酵剂，在菌体高密度培养中加入相容性溶质可提高菌体对不良环境的抗性，增强菌体活性。

实施例5：加入相容性溶质对细胞膜通透性变化影响

一、采用激光共聚焦显微图像法对菌体在不同培养条件下活菌比例的变化进行观察，见图4-6。其中具有较为完整细胞膜的菌体呈现绿色，而菌体细胞膜被破坏的菌体呈现红色。通过图4-6可知，加盐加相容性溶质组合后菌数较只加盐的情况下有显著增加且活菌比例更高，与正常MRS培养基下培养的情况相比菌数相差不显著且活菌比例差别也不显著。说明盐胁迫下通过添加相容性溶质确实可以缓解盐胁迫对德式乳杆菌保加利亚亚种生长的抑制作用，并且提高了盐胁迫下德式乳杆菌保加利亚亚种菌体的活菌比例。

二、采用流式细胞仪对不同培养条件下德式乳杆菌保加利亚亚种菌体细胞膜完整性的变化趋势观察，如图7所示。由图7分析可知，加入相容性溶质后Q4区域的荧光响应（占总响应量的77.6%）比只加盐情况（占总响应量的22.8%）显著提高（P<0.05）且与正常培养条件下（占总响应量的81.6%）差异不显著（P>0.05）。与此同时，Q2区域的荧光响应（占总响应量的5.4%）显著（P<0.05）低于只加盐情况（占总响应量的16.3%）且与正常培养条件下（占总响应量的5.3%）差异不显著（P>0.05）。

三、对不同培养条件（MRS、MRS加0.2 M NaCl、MRS加0.2 M NaCl和相容性溶质组合）下德式乳杆菌保加利亚亚种细胞膜流动性的变化如图8所示。

由图8分析可知，三种不同的培养条件下，加入优化后的相容性溶质组合后菌体细胞膜的偏振度（P值）和细胞膜微粘度（η值）与只加盐情况相比显著减小且与正常培养条件下相比差异不显著。由于P值和η值越小细胞膜流动性越好，盐胁迫下乳酸菌的细胞膜膜蛋白双分子层流动性降低。加入优化后的相容性溶质组合后细胞膜的流动性较只加盐情况下有显著提高且与正常培养条件下细胞膜的流动性差异不显著。这说明加入优化后的相容性溶质组合后细胞膜流动性恢复到正常水平，菌体细胞膜正常生理功能显著提升，盐胁迫得到显著缓解。

Claims

1.一种提高乳杆菌耐盐能力的方法，其特征在于所述方法步骤如下：

一、将活化好的目的菌株或直投发酵剂按要求接入到待发酵物质中，混均；所述目的菌株为乳杆菌属或双歧杆菌属；

二、所用乳杆菌耐盐保护物质为一类相容性溶质的混合物，将相容性溶质用去离子水或待发酵液溶解，所述相容性溶质为四氢嘧啶、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、组氨酸或脯氨酸；所述相容性溶质的溶解温度不得超过50℃，然后过0.2μm滤膜；

2.根据权利要求1所述的提高乳杆菌耐盐能力的方法，其特征在于所述乳杆菌属为保加利亚乳标菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的一种或几种。