CN112401077B - 一种胆汁酸复合菌剂在用于制备猪饲料添加剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胆汁酸复合菌剂在用于制备母猪饲料添加剂中的应用。所述胆汁酸复合菌剂包括狄氏副拟杆菌菌悬液、多形拟杆菌菌悬液、胆汁酸和多苞桉桉树精油，其体积质量比为2‑3:2‑4:2‑3:1。所述狄氏副拟杆菌菌悬液由保藏编号为CGMCC No.20820的狄氏副拟杆菌LCG‑06制备而成；所述多形拟杆菌菌悬液由保藏编号为CGMCC No.20818的多形拟杆菌GL‑02制备而成。本发明的复合菌剂成分天然，无毒副作用，能够显著增加恢复母猪肠道健康，提高其自身非特异性免疫，促进体内毒素的排出，增加母猪的泌乳量，还可以增强仔猪体质，增加其存活率，修复其肝胆损伤，提高养殖收益。

Description

一种胆汁酸复合菌剂在用于制备猪饲料添加剂中的应用

技术领域

本发明属于禽畜养殖领域，具体涉及一种胆汁酸复合菌剂在用于制备猪饲料添加剂中的应用。

技术背景

现在猪的养殖一般都是大规模化养殖，养殖户为了收获更高的收益，会选择过量养殖、投喂过量的饲料，而这些问题是会造成猪养殖环境混乱，同时影响养殖猪的健康状况。目前，养殖猪的主要问题集中在机体中毒状态，以及营养不良、免疫抑制、炎症等。尤其是对于临产前的母猪，养殖环境等问题会引起母猪体内毒素蓄积，进而出现代谢病、中毒病，导致其机体自净能力降低，也会影响母猪所产的仔猪体质变弱、出现腹泻等问题；仔猪的腹泻会导致肝脏和肾脏等脏器的病变，导致仔猪的存活率降低。而目前多使用抗生素来解决母猪和仔猪内毒素蓄积、腹泻等问题，但抗生素会使机体产生抗药性，并不利于猪的养殖。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷和不足，本发明提供了一种胆汁酸复合菌剂在用于制备猪饲料添加剂中的应用。所述胆汁酸复合菌剂能够显著的提高母猪的免疫力以及恢复仔猪的肝肠健康。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明一种胆汁酸复合菌剂在用于制备猪饲料添加剂中的应用。

进一步的，所述胆汁酸复合菌剂包括狄氏副拟杆菌菌悬液、多形拟杆菌菌悬液、胆汁酸和多苞桉桉树精油。

进一步的，所述狄氏副拟杆菌菌悬液、多形拟杆菌菌悬液、胆汁酸和多苞桉桉树精油的体积质量比为2-3:2-4:2-3:1。

进一步的，所述狄氏副拟杆菌菌悬液由保藏编号为CGMCC No.20820的狄氏副拟杆菌LCG-06制备而成。

进一步的，所述狄氏副拟杆菌LCG-06菌悬液的制备方法为：将所述狄氏副拟杆菌LCG-06于营养液体培养基中，37℃厌氧环境下活化48h；在活化菌液中加入质量浓度为20％的蔗糖溶液，混合均匀后离心，在沉淀物中添加质量浓度为10％的蔗糖溶液重悬，即得到狄氏副拟杆菌LCG-06菌悬液。

进一步的，所述狄氏副拟杆菌LCG-06菌悬液的菌含量不少于2×10⁹CFU/g。

进一步的，所述多形拟杆菌菌悬液由保藏编号为CGMCC No.20818的多形拟杆菌GL-02制备而成。

进一步的，所述胆汁酸复合菌剂的总菌含量不少于6×10⁸CFU/mL。

进一步的，所述胆汁酸复合菌剂的使用方法为：将所述胆汁酸复合菌剂直接添加到产前母猪养殖饲料中，每日3次，一直投喂到母猪产仔。

进一步的，所述产前母猪为产前25-30天的母猪。

进一步的，所述胆汁酸复合菌剂的添加量为2-2.5L/t养殖饲料。

进一步的，所述胆汁酸复合菌剂用水以1:1-2的体积比稀释后，直接将胆汁酸复合菌剂稀释液灌服患病仔猪，每日1次，连续灌服8-12天。

进一步的，所述胆汁酸复合菌剂稀释液的用量为6-10mL/头仔猪。

进一步的，所述胆汁酸复合菌剂能够恢复母猪肠道健康。

进一步的，所述胆汁酸复合菌剂能够减轻肝源性腹泻的症状。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明从猪粪便中分别筛选出一株狄氏副拟杆菌LCG-06和多形拟杆菌GL-02，其不会对动物人体造成伤害，并将两株菌株发酵制备成菌悬液，与胆汁酸和多苞桉桉树精油共同制备得到复合菌剂，该复合菌剂成分天然，无毒副作用，能够显著恢复临产母猪的肠道健康及自身非特异性免疫，恢复其机体自净能力，促进体内毒素的排出，保障母猪的健康，从而减低仔猪由于母源毒素感染而发生腹泻的问题，而且还能够有效增加母猪的泌乳量，保障哺乳仔猪营养的摄入。所述的胆汁酸复合菌剂还可以直接给患病仔猪灌服，增强其体质，增加仔猪存活率和饮奶量，恢复其肝肠功能，进而保肝护胆和修复肝胆损伤，同时具有抗菌消炎驱虫的作用，使仔猪皮红毛亮，进而提高猪养殖收益，因此具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为所述狄氏副拟杆菌LCG-06的菌落图片。

图2为所述多形拟杆菌GL-02的菌落图片。

图3为仔猪腹泻粪便呈黄色稀粥样。

图4为仔猪腹泻粪便呈白色稀粥样。

图5为脱水死亡的仔猪。

图6为死亡仔猪的解剖肝肠图。

图7为使用所述胆汁酸复合菌剂的母猪和其所产仔猪。

图8为所述胆汁酸复合菌剂对患猪泪斑母猪的影响；左图为患有猪泪斑的母猪，右图为使用后胆汁酸复合菌剂的母猪。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

一、狄氏副拟杆菌LCG-06的筛选和鉴定

1、狄氏副拟杆菌LCG-06的筛选

从猪肠道内取肠内粪便，将10g粪便和100mL无菌水混匀，过滤去除杂质后制成粪便稀释液，然后继续向稀释液中添加无菌水，制备成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释液；再分别取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释液涂布至大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)上，在含有80％N₂、10％CO₂和10％H₂的厌氧环境下，37℃培养4d，选取明显的菌落进行多次纯化后得到单菌落，并将其命名为LCG-06，然后置于大豆酪蛋白琼脂斜面培养基中冷藏保存。所述的TSA培养基的配方为：胰蛋白胨15.0g，大豆胨5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，无菌水1000mL，pH 7.3±0.2。

如图1所示，所述菌株LCG-06在TSA培养基的菌落生物学特征为：圆形或类圆形，乳白色或米白色，扁平，直径0.2-1.8mm，表面光滑无光泽，半透明，边缘较整齐。

2、狄氏副拟杆菌LCG-06的鉴定

提取所述菌株LCG-06的基因组DNA，并以此为模板，使用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，获得16S rRNA扩增序列后测序，然后将该序列进行Blast比对，结果显示菌株LCG-06与GenBank基因库中的狄氏副拟杆菌Parabacteroides distasonis同源性最高，因此判定菌株LCG-06为狄氏副拟杆菌。

将筛选到的狄氏副拟杆菌LCG-06进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年09月25日；狄氏副拟杆菌Parabacteroides distasonis的保藏编号为CGMCC No.20820。

3、狄氏副拟杆菌LCG-06菌悬液的制备

(1)将保存的狄氏副拟杆菌LCG-06挑取至营养液体培养基(配方为胰蛋白胨15.0g，大豆胨5.0g，氯化钠5.0g，无菌水1000mL，pH 7.4)中，37℃厌氧环境下活化培养48h，得到狄氏副拟杆菌LCG-06菌液；

(2)在菌液中以1:1的体积比加入质量浓度为20％的蔗糖溶液，混合均匀后10000rpm/min离心5min，得到菌株沉淀物；

(3)用质量浓度为10％的蔗糖溶液重新溶解上述菌株沉淀物，而蔗糖溶液的体积与菌株沉淀物的质量的比例为2:1，混匀后得到狄氏副拟杆菌LCG-06菌悬液，该菌悬液的菌含量不少于2×10⁹CFU/mL。

二、多形拟杆菌GL-02的筛选和鉴定

1、多形拟杆菌GL-02的筛选

取10g健康猪粪便和100mL无菌水混匀，过滤去除杂质后制成粪便稀释液，然后继续向稀释液中添加无菌水，制备成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释液；再分别取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释液涂布至GAM琼脂培养基中，在含有80％N₂、10％CO₂和10％H₂的厌氧环境下，35℃培养48h，选取明显的菌落进行多次纯化后得到单菌落，将得到的单菌落命名为GL-02，冷冻保藏。其中，GAM琼脂培养基配方为：10.0g蛋白胨，3.0g大豆胨，10.0g月示胨，13.5g血清消化粉，2.2g牛肉浸粉，5.0g酵母浸粉，1.2g牛肝浸粉，3.0g葡萄糖，3.0g氯化钠，2.5g磷酸二氢钾，5.0g可溶性淀粉，0.3g L-半胱氨酸，0.15g硫乙醇酸钠，15.0g琼脂，1mL 0.1％维生素K1溶液，3mL氯化血红素溶液，100mg卡那霉素，1000mL蒸馏水，pH 7.1。如图2所示，所述菌株GL-02在GAM琼脂培养基上的菌落呈圆形或类圆形，黄色，直径0.5-2.5mm，表面光滑无光泽，中间微凸，不透明，边缘较整齐。

2、多形拟杆菌GL-02的鉴定

提取所述菌株GL-02的基因组DNA，并以此为模板，使用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，获得16S rRNA扩增序列后测序，然后将该序列进行Blast比对，结果显示菌株GL-02与GenBank基因库中的多形拟杆菌Bacteroides thetaiotaomicron同源性最高，因此判定菌株GL-02为多形拟杆菌。

将筛选到的多形拟杆菌GL-02进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年09月25日；多形拟杆菌Bacteroides thetaiotaomicron的保藏编号为CGMCC No.20818。

3、多形拟杆菌GL-02菌悬液的制备

将保存的多形拟杆菌GL-02挑取至GAM液体培养基(在GAM琼脂培养基配方上减少琼脂即可)，35℃厌氧环境下活化48h，将得到的活化菌液取1mL再次接种到50mL GAM液体培养基中培养24-76h，将培养液10000rpm/min离心5min后，将菌株沉淀物用其质量10-12倍体积的无菌生理盐水重悬，再次10000rpm/min离心5min，使用其质量5倍体积的无菌生理盐水二次重悬，此时要确保重悬液中多形拟杆菌GL-02的菌含量不小于1×10⁹CFU/mL。

三、胆汁酸的制备

所述胆汁酸的制备工艺步骤如下：

(1)皂化：将粉碎过40目筛的1kg猪胆粉加入反应釜中，再加入质量浓度为10％的氢氧化钠溶液10L，加热搅拌至沸腾，并保持沸腾状态搅拌14h，然后将反应生成的皂化液冷却至固液分层，去除上清液，剩余固体即为胆汁酸皂化品；

(2)脱色：向胆汁酸皂化品中加6L水，加热至80℃使胆汁酸皂化品完全溶解，然后将其打入脱色罐中，加入300mL双氧水搅拌均匀后，常温反应24h，然后将反应溶液过滤至酸化槽中，得到滤液；

(3)酸化：将滤液冷却至室温，缓慢加入10％盐酸溶液，边加入边搅拌，待溶液pH值在3时停止加酸，离心过滤得到白色固形物；

(4)纯化：将白色固形物不断加水冲洗，将附着在白色固形物表面的水溶性杂质去除，待滤出的水检测呈中性后结束水洗；将离心过滤后的白色固形物放入烘箱中，100℃干燥至水分少于10％，得胆汁酸粗品；

(5)重结晶：将胆汁酸粗品投入萃取罐中，加入胆汁酸粗品重量10倍体积的乙酸乙酯搅拌至完全溶解，再加入0.08g无水硫酸钠脱水，过滤收集过滤液，将过滤液进行减压浓缩并回收乙酸乙酯，得到液体胆汁酸；

(6)干燥：将液体胆汁酸放入烘箱，在100℃下干燥至水分不超过1％时，得到成品胆汁酸。

成品胆汁酸中包含了78.6％的猪胆酸和猪去氧胆酸以及20.0％的鹅去氧胆酸。

四、多苞桉桉树精油的制备

将澳大利亚多苞桉桉树叶放入水洗塔清洗后，放到烘干机中烘干，再于粉碎机中粉碎后分别进入水蒸气蒸馏釜、冷凝器和油水分层器中分离油相和水相，其中水相进入乙醚萃取器分离出废水，含有乙醚的液体进入乙醚回收塔中回收乙醚，将回收的乙醚和油相液体添加到固体床吸附干燥器进一步去除油相中的水分，最后将油相液体加入到减压精馏塔中精馏以此去除杂质油后便得到多苞桉桉树精油。制备出的多苞桉桉树精油保存在密封、不透光的容器中并避光放置。

五、胆汁酸复合菌剂的制备

将上述制备的胆汁酸、多苞桉桉树精油、多形拟杆菌GL-02菌悬液和狄氏副拟杆菌LCG-06菌悬液以2:1:2:2的质量体积比均匀混合，即可得到复合菌剂；复合菌剂中的总菌含量不少于6×10⁸CFU/mL。

实施例2

广西某养殖场有200头母猪存栏，产房的仔猪在刚出生前几天就发生了腹泻问题，如图3和图4所示，仔猪排出的粪便呈黄色或白色稀粥样，没有特异恶臭味，没有过多的气泡，没有眼观的血液成分，经兽医诊断仔猪是由于母源毒素感染以及奶水不足导致的细菌性腹泻。这些仔猪在腹泻前多发生呕吐，呕吐物为黄白色凝乳块，腹泻开始了呕吐就会停止，而且在腹泻的过程中，仔猪精神不好，体温保持在40℃左右，此外，仔猪腹泻后脱水加快，再加上吃奶量少，发生仔猪脱水死亡(图5)，解剖死亡仔猪发现其肝脏肿大，肾脏变形，肠道充血(图6)。

为了提高仔猪的存活率和健康程度，本实施例选择分“两步走”：一是以2L/t饲料的添加量将所述胆汁酸复合菌剂拌入母猪养殖饲料中，投喂给临产前25天的母猪，每日3次，一直投喂到母猪产仔；二是以1:1的体积比稀释所述胆汁酸复合菌剂，并将6-10mL/头稀释液的用量直接给发病仔猪灌服，每日1次，连续灌服10天。如图7所示，在服用3天后，仔猪的粪便恢复正常，灌服10天后，仔猪不再拉稀，且饮奶量增加，肝肠功能恢复正常。此外，投喂含胆汁酸复合菌剂饲料的临产母猪所产的仔猪在哺乳期也没有出现腹泻的问题，与未使用复合菌剂的母猪所产的仔猪相比，其体质明显增强，存活率增加，活力和体质均得到明显改善，且肠道功能正常，而且使用复合菌剂的母猪的泌乳量更高。以上说明本发明的胆汁酸复合菌剂能够提高母猪的自身非特异性免疫，恢复其机体自净能力，促进体内毒素的排出，保障母猪的健康，从而减低仔猪由于母源毒素感染而发生腹泻的问题，而且还能够有效增加母猪的泌乳量，保障哺乳仔猪营养的摄入，恢复并增加仔猪的肝肠健康，具有很好的杀菌驱虫的效果，对仔猪的肝源性腹泻具有很好的治疗效果，且该胆汁酸复合菌剂安全可靠，不会对母猪和仔猪产生任何的不良影响。

实施例3

山东莱州某养殖猪厂，养殖规模536头猪。在养殖期间，发现有怀孕母猪出现猪泪斑的问题(图8)，选取其中的30头进行胆汁酸复合菌剂效果实验。猪泪斑只是母猪的表象症状，实际上是猪体内因病毒或细菌而引起感染、滥用抗生素等原因造成的体内中毒、肝脏损伤等，并引起自身免疫力下降反应在猪的眼部。

将这30头母猪分栏进行养殖，并在其饲料中以2L/吨饲料的用量均匀混入胆汁酸复合菌剂，每日3次，连续投喂20天。如图8所示，20天后，母猪泪斑明显减轻，有的甚至已经消失，在20天后继续在饲料中以1L/吨饲料的用量均匀混入胆汁酸复合菌剂，巩固效果，直至母猪产仔。与未使用胆汁酸复合菌剂的母猪相比，实验的母猪产仔后的奶水质量明显改善，且产奶量增加。母猪所产仔猪健康程度也明显提高，与其他新生仔猪相比活力更强，皮红毛亮，说明本发明的胆汁酸复合菌剂安全效果好，能够有效的治疗母猪的猪泪斑问题，不会为母猪和仔猪带来负面影响，且由于所用成分天然、属于内源性物质，因此本发明的胆汁酸复合菌剂会随着胆汁的肝肠循环在猪体内重复利用，效果稳定，且不易被分解代谢出体外。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种胆汁酸复合菌剂在用于制备猪饲料添加剂中的应用，其特征在于，所述胆汁酸复合菌剂包括狄氏副拟杆菌菌悬液、多形拟杆菌菌悬液、胆汁酸和多苞桉桉树精油；所述狄氏副拟杆菌菌悬液、多形拟杆菌菌悬液、胆汁酸和多苞桉桉树精油的体积质量比为2-3:2-4:2-3:1；所述多形拟杆菌菌悬液由保藏编号为CGMCC No. 20818的多形拟杆菌GL-02制备而成。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述狄氏副拟杆菌菌悬液由保藏编号为CGMCC No. 20820的狄氏副拟杆菌LCG-06制备而成。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胆汁酸复合菌剂的总菌含量不少于6×10⁸ CFU/mL。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胆汁酸复合菌剂的使用方法为：将所述胆汁酸复合菌剂直接添加到产前母猪养殖饲料中，每日3次，一直投喂到母猪产仔。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述胆汁酸复合菌剂的添加量为2-2.5 L/t养殖饲料。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胆汁酸复合菌剂用水以1:1-2的体积比稀释后，直接将胆汁酸复合菌剂稀释液灌服患病仔猪，每日1次，连续灌服8-12天。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胆汁酸复合菌剂稀释液的用量为6-10mL/头仔猪。

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