CN116649578A - 一种后生元及其制备方法和在抑菌产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种后生元及其制备方法和在抑菌产品中的应用。所述后生元为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)RH03147、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)HCS03‑001、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)HCS02‑001三种乳酸菌的灭活菌体、菌体裂解物和代谢物的混合物。本发明所述的后生元具有优秀的抑菌能力，能够抑制白色念珠菌、阴道加德纳菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。

Description

一种后生元及其制备方法和在抑菌产品中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种后生元及其制备方法和在抑菌产品中的应用。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高，人们不止于满足生活的基本需求，越来越意识到健康的重要性，对满足于身体健康的功能性食品、保健食品及其他改善身体不适症状的生物制剂表现出强烈兴趣，从而加快了益生菌产业的发展。益生菌是指对宿主产生健康益处的活性微生物，具有多种益生功能，应用在食品、医药等各领域。然而，益生菌的生物效应必须基于菌株的生存能力，在加工及贮存过程中其活性必须保持在108～109CFU/g以上，至此具有能够模拟益生菌的益生作用且不要求活力的后生元进入人们的研究视野。
国际益生菌和益生元科学协会(ISAPP)于2021年5月发表了后生元(Postbiotics)的共识声明：后生元是指对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂。根据研究者们的发现，表现出促进健康作用的非活菌组分包括灭活的菌体细胞、菌体死亡后溶解释放的成分，以及细胞的代谢产物，其中菌体成分包括脂磷壁酸、细胞表面蛋白、肽聚糖、菌毛、鞭毛等，代谢产物包括酶、多肽类、短链脂肪酸、多糖(如胞外多糖)等。目前公开的后生元的益生功能主要有免疫调节作用、改善过敏症状、调节肠道功能、抗氧化作用、抗炎症作用、降低空腹血糖水平等。
但现有的后生元制剂产品较少，且没有具备同时能够抑制白色念珠菌和阴道加德纳菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌功能的后生元，因此亟需开发具备抑菌作用广且抑菌性强的后生元，满足应用需求。
发明内容
针对现有问题，本发明目的在于提供一种抑制白色念珠菌、阴道加德纳菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌功能性强的后生元及其制备方法和应用，尤其在食品、药品中的应用。
一种后生元，所述后生元为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)RH03147、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)HCS02-001三种乳酸菌的灭活菌体、菌体裂解物和代谢物的混合物。
上述的一种后生元，植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)RH03147已于2022年09月23日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNO.25775。
上述的一种后生元，植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)HCS03-001已于2018年08月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC NO.16258。
上述的一种后生元，罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)HCS02-001已于2020年04月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC NO.19746。
上述的一种后生元，按质量比，植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)RH03147：植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)HCS03-001：罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)HCS02-001为2:1:1。
上述的一种后生元的制备方法，包括如下步骤：将植物乳植杆菌RH03147、植物乳植杆菌HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-001菌株分别进行复苏、活化、扩培，按比例接种于同一培养基进行发酵、分离、浓缩、灭菌得后生元液，经喷雾干燥得后生元粉。
上述的一种后生元的制备方法，将植物乳植杆菌RH03147、植物乳植杆菌HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-001分别按照以下操作进行菌种复苏、活化和扩培；取存于低温冰箱内的菌种冻存管，立即放入37℃水浴锅内15～30s，至冻存管内液体全部融化进行菌种复苏；按照8～12％接种量，将复苏好的菌种接种至培养基A中，37℃培养箱恒温静置培养16～18h获得种子液；按照4～6％接种量，将种子液接种至培养基A中，37℃培养箱恒温静置培养16～18小时得培养液，4℃冰箱贮存备用。
上述的一种后生元的制备方法，所述发酵为二级发酵法，采用培养基为培养基B，以接种量2～6％将培养液接种到培养基B中，35℃搅动培养，搅拌速度60rpm，一级发酵时间16～18h，二级发酵时间36～48h，得发酵液。
上述的一种后生元的制备方法，过滤分离，经过滤所得滤液为无色至浅黄色透明液体；将其浓缩2倍，浓缩液状态为浅黄色透明液体，均匀无杂质；蒸煮杀菌30min获得后生元液；所述干燥，是将后生原液添加6～12％的麦芽糊精，进行喷雾干燥，得到后生元粉。
上述的一种后生元的制备方法，培养基A包括：酵母蛋白胨10.0～15.0g/L、葡萄糖20.0～30.0g/L、酵母浸出物5.0～9.0g/L、乙酸钠5.0～9.0g/L、一水柠檬酸2.0～4.0g/L、磷酸二氢钾2.0～4.0g/L、吐温80 0.2～0.6g/L、硫酸镁0.6～1.0g/L、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，115℃下灭菌30min，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20-6.80。
上述的一种后生元的制备方法，所述的培养基B包括：酵母蛋白胨3.0～7.0g/L、葡萄糖10～20.0g/L、酵母浸出物3.0～7.0g/L、乙酸钠2.0～4.0g/L、一水柠檬酸2.0～4.0g/L、磷酸二氢钾1.0～3.0g/L、吐温80 0.2～0.6g/L、硫酸镁0.6～1.0g/L、硫酸锰0.1～0.5g/L、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，115℃下灭菌30min，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20-6.80。
上述的一种后生元在制备抑菌产品中的应用。
上述的应用，述的抑菌是抑制阴道加德纳菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中的一种或二种以上。
本发明中所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)HCS03-001已在专利号为“201910207822.X”的专利文件中公开。罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillusreuteri)HCS02-001已在申请号为“202210572722.9”的专利申请中公开。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、本发明后生元具有优秀的抑菌能力，能够抑制白色念珠菌、阴道加德纳菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，应用性广；
2、本发明后生元菌株，植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)RH03147分离自传统发酵食品泡菜中，植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)HCS03-001分离自婴儿粪便中，罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)HCS02-001分离自食品原料奶豆腐中，应用安全性高；
3、菌种活化及发酵过程的培养基及中和剂采用的组分原料均为食品级，安全性高，可用于食品、药品等应用；
4、本发明后生元采用混合二次发酵模式，菌体代谢充分且能源消耗低，产生的生物活性物质含量高；
5、本发明后生元常温保存即可，无需冷藏或冷冻，运输方便，稳定性强；
6、本发明后生元含较高含量的生物活性物质，包括有机酸和小分子活性肽。
附图说明
图1为后生元工艺流程图。
图2为后生元抑制阴道加德纳菌的抑菌图谱。
本发明所述的后生元，所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)RH03147，该菌株已于2022年09月23日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC NO.25775。
所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)HCS03-001，该菌株已于2018年08月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNO.16258。
所述罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)HCS02-001，该菌株已于2020年04月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNO.19746。
具体实施方式
实施例1后生元的制备
本实施例所述的后生元制备步骤如图1所示：
步骤1、取存于低温冰箱内的植物乳植杆菌RH03147、植物乳植杆菌HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-001菌种冻存管，分别立即放入37℃水浴锅内15～30s，至冻存管内液体全部融化进行菌种复苏；按照10％接种量，分别将复苏好的菌种接种至不同的培养基A中，37℃培养箱恒温静置培养17h获得种子液；按照5％接种量，将种子液接种至不同的培养基A中，37℃培养箱恒温静置培养17h得三个菌种的培养液；
步骤2、将植物乳植杆菌RH03147、植物乳植杆菌HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-001培养液按照2:1:1的比例接种至同一培养基B中，接种量2％，35℃搅动培养17h，得一级发酵液；
步骤3、步骤2结束后立即将一级发酵液以6％的接种量再次转接至培养基B中，35℃搅动培养36h，得二级发酵液；
步骤4、将二级发酵液过滤得到滤液，滤液无色至浅黄色透明无杂质；将滤液进行2倍加热浓缩，蒸煮杀菌30min，得后生元液；
步骤5、向后生元液中添加8％的麦芽糊精，混合搅拌至完全溶解，环境湿度≤50％，置于喷雾干燥机中进行喷雾干燥，进风温度180℃，出风温度110℃，得后生元粉。
所述的培养基A的配制：酵母蛋白胨12.0g/L、葡萄糖25.0g/L、酵母浸出物8.0g/L、乙酸钠8.0g/L、一水柠檬酸3.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、吐温80 0.2g/L、硫酸镁0.8g/L、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，115℃下灭菌30min，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.60；
所述的培养基B的配制：酵母蛋白胨5.0g/L、葡萄糖15.0g/L、酵母浸出物5.0g/L、乙酸钠3.0g/L、一水柠檬酸3.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、吐温80 0.2g/L、硫酸镁0.8g/L、硫酸锰0.2g/L、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，115℃下灭菌30min，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20；
实施例2后生元抑制阴道加德纳菌试验
一、采用双层琼脂扩散法验证后生元对阴道加德纳菌的抑菌能力：
1、将保藏于-80℃的菌株冻存管取出后按实施例1步骤制备后生元液，于4℃保存备用；
2、将2％的水琼脂培养基倒入无菌平板中，使水琼脂刚刚没过皿底，待琼脂凝固；
3、取一支阴道加德纳菌冻存管解冻，按照1％的接种量接种到10mLTSB(含5％脱纤维羊血)液体培养基中，37℃，微厌氧产气包培养(5％CO2)培养18～24h；在水琼脂平皿上平均放置4个牛津杯，取100μL阴道加德纳菌菌液(浓度约为1×108CFU/mL)与10mL1.2％的TSB(含5％脱纤维羊血)琼脂培养基混匀倒入平皿中，使平皿中的致病菌菌液浓度约为1×106CFU/mL，待琼脂凝固，取走牛津杯，形成直径为8mm的加样孔；
4、平板中3个加样孔加入100μL的后生元液，其余1个孔中加入3倍浓缩的MRS灭菌培养基作为空白对照，小心放置于培养箱中37℃，微厌氧产气包培养(5％CO2)培养18～24h。如图2，用游标卡尺测量抑菌圈直径，加入后生元液的牛津杯抑菌圈可达22.5mm。
所述的TSB(含5％脱纤维羊血)培养基：胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，固体培养基加琼脂粉20g/L，pH 7.3±0.2，灭菌、冷却后加入5％无菌脱纤维羊血；
所述的MRS培养基：酵母蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，酵母浸出物4g/L，磷酸二氢钾2g/L，一水柠檬酸2g/L，乙酸钠5g/L，无水葡萄糖20g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温80 0.6g/L，番茄汁1％(v/v)，pH 6.5。
二、采用悬液定量抑菌试验测定后生元对阴道加德纳菌的抑菌率：
1、取后生元粉样品用无菌生理盐水进行5倍稀释，完全溶解后备用；
2、取一支阴道加德纳菌冻存管解冻，按照1％的接种量接种到10mLTSB(含5％脱纤维羊血)液体培养基中，37℃微需氧产气包(5％CO2)培养18～24h，得阴道加德纳菌菌液；
3、将5倍稀释的后生元样品与培养后的阴道加德纳菌菌液按照1:10的比例加入到无菌小试管中(保留两个混菌比例，视最终产品抑菌效果而定；样品:阴道加德纳菌＝0.2mL:2.0mL)，以无菌生理盐水加阴道加德纳菌菌液作为空白对照，以无菌生理盐水作为阴性对照，于37℃培养箱中孵育4h(培养过程中放置微需氧产气包)备用。
4、取0.5mL孵育液10倍梯度稀释，取适宜稀释度的菌液1mL加入平皿中(对照组取104和105，样品取101、102和103)，再向平皿中倾注15～20mL含12g/L琼脂的TSB(含5％脱纤维羊血)固体培养基，每个稀释度2次重复，37℃倒置培养48h后计数(培养过程中放置微需氧产气包)，对平板上的致病菌进行活菌计数，计算抑菌率。计算公式：
式中：
X—抑菌率，％；
A0—空白对照组回收菌量，单位为CFU/mL；
A1—试验组回收菌量，单位为CFU/mL。
后生元对阴道加德纳菌抑菌率能够达到99.489％。
所述的TSB(含5％脱纤维羊血)培养基：胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，固体培养基加琼脂粉12g/L，pH 7.3±0.2，灭菌、冷却后加入5％无菌脱纤维羊血；
实施例3后生元抑制白色念珠菌试验
实施例1得到的后生元抑制白色念珠菌功能验证如下：
1、取实施例1制备的后生元粉样品用无菌生理盐水进行5倍稀释，完全溶解后备用，
2、取一支白色念珠菌冻存管解冻，按照1％的接种量接种到10mLSB液体培养基中，28℃摇床培养18～24h。
3、将5倍稀释的后生元样品与培养后的白色念珠菌菌液按照1:2的比例加入到无菌小试管中(样品:白色念珠菌＝0.8mL:1.6mL，小试管中液面高度适宜，便于后续试验过程中重悬和吸取)，以无菌生理盐水加白色念珠菌菌液作为空白对照，以无菌生理盐水作为阴性对照，于37℃培养箱中孵育24h备用。
4、取0.5mL孵育液10倍梯度稀释，取适宜稀释度的菌液1mL加入平皿中(空白对照组取106和107，样品组取105和106)，再向平皿中倾注15～20mL含12g/L琼脂的SB固体培养基，每个稀释度2次重复，28℃倒置培养48h后进行活菌计数，计算抑菌率。计算公式：
式中：
X—抑菌率，％；
A0—空白对照组回收菌量，单位为CFU/mL；
A1—试验组回收菌量，单位为CFU/mL。
后生元抑制白色念珠菌的抑菌率达92.3％。
所述的SB培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，固体培养基加琼脂粉12g/L，pH 5.6±0.2；
实施例4后生元抑制大肠杆菌能力试验
后生元抑制大肠杆菌功能验证如下：
1、取实施例1制备的后生元粉样品用无菌生理盐水进行5倍稀释，完全溶解后得到后生元液备用。
2、取大肠杆菌冻存管解冻，按照1％的接种量接种到液体培养基中，37℃恒温培养20h，用0.03mol/L磷酸盐缓冲液(以下简称PBS)稀释至约5.0×105～4.5×106CFU/mL菌悬液备用，阳性对照回收菌落数在1.0×104～9.0×104CFU/mL之间。
3、取后生元液和对照样液(无菌水)各5mL，取大肠杆菌菌悬液，分别在每个被试样液内滴加0.1mL，均匀混合，开始计时，室温作用5min、6h和24h备用，每个被试样液设置2个平行试验。
4、分别吸取0.5mL混合样品液，每个样品液接种2个平皿，倾注LB固体培养基，36℃±1℃培养48h，对平板上的大肠杆菌进行活菌计数，计算抑菌率。
计算公式：
式中：
X—抑菌率，％；
A0—空白对照组回收菌量，单位为CFU/mL；
A1—试验组回收菌量，单位为CFU/mL。
后生元液与大肠杆菌作用5min、6h和24h后抑菌率分别为99.55％、99.74％、99.94％。
所述的LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，20g/L琼脂粉，pH 7.4。
实施例5后生元抑制金黄色葡萄球菌能力试验
后生元抑制金黄色葡萄球菌功能验证如下：
1、取实施例1制备的后生元粉样品用无菌生理盐水进行5倍稀释，完全溶解后得到后生元液备用。
2、取金黄色葡萄球菌冻存管解冻，按照1％的接种量接种到液体培养基中，37℃恒温培养20h，用0.03mol/L磷酸盐缓冲液(以下简称PBS)稀释至约5.0×105～4.5×106CFU/mL菌悬液备用，阳性对照回收菌落数在1.0×104～9.0×104CFU/mL之间。
3、取后生元液和对照样液(无菌水)各5mL，取金黄色葡萄球菌菌悬液，分别在每个被试样液内滴加0.1mL，均匀混合，开始计时，室温作用5min、6h和24h备用，每个被试样液设置2个平行试验。
4、分别吸取0.5mL混合样品液，每个样品液接种2个平皿，倾注LB固体培养基，36℃±1℃培养48h，对平板上的金黄色葡萄球菌进行活菌计数，计算抑菌率。
计算公式：
式中：
X—抑菌率，％；
A0—空白对照组回收菌量，单位为CFU/mL；
A1—试验组回收菌量，单位为CFU/mL。
后生元液与金黄色葡萄球菌作用5min、6h和24h后抑菌率分别为30.32％、98.78％、99.91％。
所述的LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，20g/L琼脂粉，pH 7.4。
实施例6菌种不同比例对比
按照实施例1的步骤制备后生元，在步骤2中调整植物乳植杆菌RH03147、植物乳植杆菌HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-001不同接种量，制备后生元后按照实施例2～实施例5的方法测定不同接种量制备的后生元对各致病菌的抑菌率，结果见下表。A组至D组表示，随着植物乳植杆菌RH03147接种量的增加，对四种致病菌的抑菌率均越来越大，而D组与G组对比时，植物乳植杆菌HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-001的接种量为0时，即单独接种植物乳植杆菌RH03147，制备的后生元对四种致病菌的抑菌率均小于D组。E组和F组结果菌小于D组，所以需同时接种三个菌种，且以植物乳植杆菌RH03147为主，进行实施例1组试验，结果最好，对四种致病菌的抑菌能力最强。
表1不同接种量制备的后生元对各致病菌的抑菌率
实施例7后生元制备方法对比
后生元制备的发酵培养基B中部分培养基组份及不同培养条件对比列举如表2和表3，表2中其余组分及含量与实施例1中培养基B中相同，表3中在初始pH或培养温度或培养时间一定的情况下，其余培养条件同实施例1。培养基中氮源的选择及微量元素的使用，及不同培养条件都影响后生元的最终抑菌效果。
表2后生元培养基不同组份抑菌效果对比
表3后生元不同培养条件抑菌率对比
实施例8后生元特征性成分
按照实施例1方法制备后生元液，测定后生元液中的部分功能成分，结果见表4，乳酸、苹果酸及柠檬酸含量较高。有机酸具有较强的抑菌作用，可通过与细胞膜上的脂多糖等成分结合破坏菌膜稳定性，达到抑菌作用，或通过降低胞内pH影响致病菌代谢活动而达到抑菌目的等。如乳酸可通过破坏细胞膜使胞内蛋白泄漏，抑制大肠杆菌等生长。另外有机酸还可与其他抗菌物质协同作用增强抑菌能力，如柠檬酸与抗菌肽联合对大肠杆菌的超微结构能够呈现协同破坏作用。后生元液中小分子活性肽含量能达到98.77％，小分子活性肽不仅能够通过与细胞壁中的脂多糖和磷壁酸结合破坏细胞壁、与阴离子脂多糖的静电作用破坏细胞膜达到抑菌的作用，还能进入细胞内和目标分子如DNA或RNA作用，从而影响细菌的代谢导致致病菌体细胞死亡。
表4后生元特征性成分含量

Claims (10)

1.一种后生元，其特征在于，所述后生元为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)RH03147、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillusreuteri)HCS02-001三种乳酸菌的灭活菌体、菌体裂解物和代谢物的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种后生元，其特征在于，植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)RH03147已于2022年09月23日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNO.25775；植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)HCS03-001已于2018年08月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNO.16258；罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillusreuteri)HCS02-001已于2020年04月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNO.19746。
3.权利要求1所述的一种后生元的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将植物乳植杆菌RH03147、植物乳植杆菌HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-001菌株分别进行复苏、活化、扩培，按比例接种于同一培养基进行发酵、分离、浓缩、灭菌得后生元液，经喷雾干燥得后生元粉。
4.根据权利要求3所述的一种后生元的制备方法，其特征在于，将植物乳植杆菌RH03147、植物乳植杆菌HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-001分别按照以下操作进行菌种复苏、活化和扩培；取存于低温冰箱内的菌种冻存管，立即放入37℃水浴锅内15～30s，至冻存管内液体全部融化进行菌种复苏；按照8～12％接种量，将复苏好的菌种接种至培养基A中，37℃培养箱恒温静置培养16～18h获得种子液；按照4～6％接种量，将种子液接种至培养基A中，37℃培养箱恒温静置培养16～18小时得培养液，4℃冰箱贮存备用。
5.根据权利要求4所述的一种后生元的制备方法，其特征在于，所述发酵为二级发酵法，采用培养基为培养基B，以接种量2～6％将培养液接种到培养基B中，35℃搅动培养，搅拌速度60rpm，一级发酵时间16～18h，二级发酵时间36～40h，得发酵液。
6.根据权利要求5所述的一种后生元的制备方法，其特征在于，经过滤所得滤液为无色至浅黄色透明液体；将其浓缩2倍，浓缩液状态为浅黄色透明液体，均匀无杂质；蒸煮杀菌30min获得后生元液；所述干燥，是将后生原液添加6～12％的麦芽糊精，进行喷雾干燥，得到后生元粉。
7.根据权利要求6所述的一种后生元的制备方法，其特征在于，培养基A包括：酵母蛋白胨10.0～15.0g/L、葡萄糖20.0～30.0g/L、酵母浸出物5.0～9.0g/L、乙酸钠5.0～9.0g/L、一水柠檬酸2.0～4.0g/L、磷酸二氢钾2.0～4.0g/L、吐温80 0.2～0.6g/L、硫酸镁0.6～1.0g/L、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，115℃下灭菌30min，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20-6.80。
8.根据权利要求7所述的一种后生元的制备方法，其特征在于，所述的培养基B包括：酵母蛋白胨3.0～7.0g/L、葡萄糖10～20.0g/L、酵母浸出物3.0～7.0g/L、乙酸钠2.0～4.0g/L、一水柠檬酸2.0～4.0g/L、磷酸二氢钾1.0～3.0g/L、吐温80 0.2～0.6g/L、硫酸镁0.6～1.0g/L、硫酸锰0.1～0.5g/L、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，115℃下灭菌30min，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20-6.80。
9.权利要求1所述的一种后生元在制备抑菌产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的抑菌是抑制阴道加德纳菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中的一种或二种以上。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117100773A (zh) * 2023-10-25 2023-11-24 山东威曼宠物食品有限公司 一种植物乳植杆菌King07后生元制剂及其应用
CN118303634A (zh) * 2024-03-18 2024-07-09 仁仁微生物科技研究(沈阳)有限公司 具有增强免疫力功能的后生元及其制备方法和应用
CN118452275A (zh) * 2024-07-09 2024-08-09 西南林业大学 一种核桃保鲜剂及保鲜方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957530A (zh) * 2019-03-19 2019-07-02 汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司 一种植物乳杆菌及其应用
CN112342175A (zh) * 2021-01-09 2021-02-09 南京北极光生物科技有限公司 一种阴道健康益生菌组合物及其应用
CN113699071A (zh) * 2021-08-30 2021-11-26 天津科技大学 一种植物乳杆菌及在制备感染性阴道病治疗药物中的应用
US20220193157A1 (en) * 2020-12-23 2022-06-23 Church & Dwight Co., Inc. Lactobacillus compositions and methods for prevention and treatment of microbial infection
CN114990011A (zh) * 2022-05-25 2022-09-02 江西仁仁健康产业有限公司 一种能够降胆固醇及抑制加德纳菌的罗伊氏乳杆菌和应用
CN115088835A (zh) * 2022-06-13 2022-09-23 江西仁仁健康产业有限公司 一种具有多功能黑枸杞酵素原液及其制备工艺
CN115252655A (zh) * 2022-07-14 2022-11-01 金华银河生物科技有限公司 用于改善阴道炎症的益生菌后生元制品及制备方法和应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957530A (zh) * 2019-03-19 2019-07-02 汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司 一种植物乳杆菌及其应用
US20220193157A1 (en) * 2020-12-23 2022-06-23 Church & Dwight Co., Inc. Lactobacillus compositions and methods for prevention and treatment of microbial infection
CN112342175A (zh) * 2021-01-09 2021-02-09 南京北极光生物科技有限公司 一种阴道健康益生菌组合物及其应用
CN113699071A (zh) * 2021-08-30 2021-11-26 天津科技大学 一种植物乳杆菌及在制备感染性阴道病治疗药物中的应用
CN114990011A (zh) * 2022-05-25 2022-09-02 江西仁仁健康产业有限公司 一种能够降胆固醇及抑制加德纳菌的罗伊氏乳杆菌和应用
CN115088835A (zh) * 2022-06-13 2022-09-23 江西仁仁健康产业有限公司 一种具有多功能黑枸杞酵素原液及其制备工艺
CN115252655A (zh) * 2022-07-14 2022-11-01 金华银河生物科技有限公司 用于改善阴道炎症的益生菌后生元制品及制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
国家卫生健康委员会: "解读关于《可用于食品的菌种名单》和《可用于婴幼儿食品的菌种名单》更新的公告", 饮料工业, vol. 25, no. 5, 31 May 2022 (2022-05-31), pages 3 - 4 *
朱秀敏;曹萌;: "灭活益生菌的研究进展", 中国微生态学杂志, no. 02, 28 February 2010 (2010-02-28) *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117100773A (zh) * 2023-10-25 2023-11-24 山东威曼宠物食品有限公司 一种植物乳植杆菌King07后生元制剂及其应用
CN117100773B (zh) * 2023-10-25 2024-02-09 山东威曼宠物食品有限公司 一种植物乳植杆菌King07后生元制剂及其应用
CN118303634A (zh) * 2024-03-18 2024-07-09 仁仁微生物科技研究(沈阳)有限公司 具有增强免疫力功能的后生元及其制备方法和应用
CN118452275A (zh) * 2024-07-09 2024-08-09 西南林业大学 一种核桃保鲜剂及保鲜方法
CN118452275B (zh) * 2024-07-09 2024-09-27 西南林业大学 一种核桃保鲜剂及保鲜方法

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