CN115252655A

CN115252655A - 用于改善阴道炎症的益生菌后生元制品及制备方法和应用

Info

Publication number: CN115252655A
Application number: CN202210826508.1A
Authority: CN
Inventors: 包维臣; 张建军; 刘晓军; 其木格苏都
Original assignee: Jinhua Yinhe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Scitop Bio Tech Co ltd; Jinhua Yinhe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-07-14
Filing date: 2022-07-14
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2042-07-14
Also published as: CN115252655B

Abstract

用于改善阴道炎症的益生菌后生元制品及制备方法和应用，其中，一种益生菌后生元制品，包括：益生菌经发酵后的灭活菌体及其代谢产物；所述益生菌至少包括副干酪乳杆菌Probiosci‑92，格氏乳杆菌G098和鼠李糖乳杆菌R7041；所述副干酪乳杆菌Probiosci‑92的保藏号为CGMCC No.25086，所述格氏乳杆菌G098的保藏编号为CGMCC No.22909，所述鼠李糖乳杆菌R7041的保藏编号为CGMCC No.25101。本发明通过三种菌株的相互配合，可以更加有效地将培养基底物转化为抑菌效果更为优秀的若干种有机酸和短链脂肪酸，提高益生菌后生元制品的抑菌效果，尤其是明显提高对加德纳菌和绿脓杆菌的抑制效果，进一步提高对阴道炎症的治疗效果。

Description

用于改善阴道炎症的益生菌后生元制品及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于改善阴道炎症的益生菌后生元制品及制备方法和应用。

背景技术

阴道微生态是由阴道内的微生态菌群、机体的内分泌调节和解剖结构共同构成。正常健康女性阴道内的微生态菌群（vaginal microbiota, VMB）包括革兰阳性需氧菌、革兰阴性需氧菌、厌氧菌、支原体及假丝酵母菌等，它们与宿主、环境之间构成了彼此制约、相互协调的动态平衡。

阴道炎即阴道炎症，是导致外阴阴道症状如瘙痒、灼痛、刺激和异常流液的一组病症。正常健康妇女阴道由于解剖组织的特点对病原体的侵入有自然防御功能。如阴道口的闭合，阴道前后壁紧贴，阴道上皮细胞在雌激素的影响下的增生和表层细胞角化，阴道酸碱度保持平衡，使适应碱性的病原体的繁殖受到抑制，而颈管黏液呈碱性，当阴道的自然防御功能受到破坏时，病原体易于侵入，导致阴道炎症。

正常情况下有需氧菌及厌氧菌寄居在阴道内，形成正常的阴道菌群。任何原因将阴道与菌群之间的生态平衡打破，均可形成条件致病菌。临床上常见有：

细菌性阴道病（占有症状女性22%~50%），正常阴道内以产生过氧化氢的乳杆菌占优势；细菌性阴道病时，由阴道内乳杆菌减少，加德纳菌、绿脓杆菌及厌氧菌等增加所致的内源性混合感染。念珠菌性阴道炎（17%~39%），80%~90%病原体为白假丝酵母菌，酸性环境易于生长，为双相菌（酵母相、菌丝相）。滴虫性阴道炎（4%~35%），阴道毛滴虫适宜在温度25℃~40℃、pH5.2~6.6的潮湿环境中生长，月经前后阴道pH改变，月经后接近中性，滴虫易繁殖。老年性阴道炎，绝经后妇女因卵巢功能衰退，雌激素水平降低，阴道壁萎缩，黏膜变薄，阴道内pH增高，局部抵抗力降低，其他致病菌过度繁殖或容易入侵引起炎症，以需氧菌为主。幼女性阴道炎，因婴幼儿外阴发育差、雌激素水平低及阴道内异物等造成激发感染所致，常见病原体有大肠埃希菌及葡萄球菌、链球菌等。

现有公开的治疗阴道炎的益生菌后生元大多只对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌有明显的抑制效果，而对于加德纳菌及绿脓杆菌入侵引起的炎症，其治疗效果并不理想，主要体现在现有的益生菌后生元对加德纳菌及绿脓杆菌的抑制效果并不十分显著，采用琼脂扩散法进行试验时，现有1%益生菌后生元粉复溶液对菌浓度为1×10⁸ CFU/mL左右的加德纳菌和绿脓杆菌进行抑制时，24 h时检测得到的抑菌圈直径均无法达到15 mm以上，尤其是对绿脓杆菌进行试验时，抑菌圈直径仅仅只有11 mm左右，导致其对阴道炎的治疗效果无法进一步提升。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中公开的益生菌后生元产品对加德纳菌及绿脓杆菌的抑制效果并不十分显著的缺陷，从而提供一种既能显著抑制常见病原体大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌，也能显著抑制加德纳菌及绿脓杆菌的用于改善阴道炎症的益生菌后生元制品及制备方法和应用。

一种益生菌后生元制品，包括：益生菌经发酵后的灭活菌体及其代谢产物；所述益生菌至少包括副干酪乳杆菌Probiosci-92，格氏乳杆菌G098和鼠李糖乳杆菌R7041。

所述副干酪乳杆菌Probiosci-92的保藏号为CGMCC No.25086，分类命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei，保藏时间为2022年06月13日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路西路1号院3号，经保藏中心于2022年06月13日检测为存活菌株。本发明产品中包含的副干酪乳杆菌Probiosci-92分离自云南省香格里拉藏区酸牦牛乳，保藏号为：CGMCC No.25086。具有较好的人工胃液、肠液和胆盐耐受能力，能调节肠道菌群，平衡机体免疫力。

所述格氏乳杆菌G098的保藏编号为CGMCC No.22909，分类命名为格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri，保藏时间为2021年7月16日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路西路1号院3号，经保藏中心于2021年7月16日检测为存活菌株。本发明产品中包含的格氏乳杆菌G098分离自西藏自治区拉萨市城关区，保藏号为：CGMCC No.22909。试验研究表明：格氏乳杆菌G098具有优异的耐受胃酸、肠液和胆盐能力，可显著缓解炎症性肠病（IBD）症状。

所述鼠李糖乳杆菌R7041的保藏编号为CGMCC No.25101，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏时间为2022年06月16日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路西路1号院3号，经保藏中心于2022年06月16日检测为存活菌株。本发明中产品中包含的鼠李糖乳杆菌R7041分离自新疆帕米尔高原酸驼奶样品。保藏号为：CGMCC No. 25101。对肠道病原菌如绿脓杆菌、埃希氏大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏痢疾杆菌拮抗作用显著，具有调节肠道菌群稳态、抗肿瘤活性。

所述代谢产物中包含180mg/g以上的有机酸、40mg/g以上的短链脂肪酸。

所述有机酸包括苯乳酸、4-羟基苯乳酸、乳酸、柠檬酸、水杨酸、苹果酸、琥珀酸、苯甲酸中的一种或多种；

优选的，乳酸的含量为20mg/g以上，柠檬酸的含量为150mg/g以上。

所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸中的一种或多种；

优选的，所述乙酸的含量为30mg/g以上，丙酸的含量为8mg/g以上。

所述代谢产物中还包括高活性物质，所述高活性物质包括：甲氧基查耳酮、罗他霉素、异硬脂酸、咖啡酸、青黛酮、维生素B2、柠檬黄素、赤鲜酮糖、茶碱、丹酚酸和皮质醇中的一种或多种。

所述发酵所用的培养基按质量百分数计，其组成包括：全脂豆粉1.5%-7%、脱脂乳粉11%-18%、柠檬酸钠0.05%-0.5%，余量为水。

一种益生菌后生元制品的制备方法，包括：

获取上述的一种益生菌后生元制品中的益生菌菌种和培养基；

将益生菌菌种接种到灭菌后的培养基中，在33-37℃恒温发酵，至pH为4.5-4.6停止，灭活并干燥后获得益生菌后生元制品。

所述培养基配置完成之后以及在灭菌之前还包括均质的步骤；

优选的，均质的温度为55-60℃、压力为18~20.0 Mpa；

所述培养基灭菌时的温度为95℃，灭菌的时间为60 min；

所述发酵之后、灭活之前还包括均质的步骤，均质的温度为55-60℃、一级压力为18~20.0 Mpa、二级压力为5.0 Mpa；

所述干燥为喷雾干燥。

上述的一种益生菌后生元制品或上述的制备方法制备得到的一种益生菌后生元制品在制备改善阴道炎症产品中的应用。

所述改善阴道炎症产品包括但不限于女性私护用品、保健品或药品。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种益生菌后生元制品，优化了发酵用的益生菌菌株，选择不同来源、不同种类和不同益生特性的益生菌菌株，该益生菌菌株至少包含副干酪乳杆菌Probiosci-92，格氏乳杆菌G098和鼠李糖乳杆菌R7041；通过三种菌株的相互配合，可以更加有效地将培养基底物转化为抑菌效果更为优秀的若干种有机酸和短链脂肪酸，提高益生菌后生元制品的抑菌效果，尤其是明显提高对加德纳菌和绿脓杆菌的抑制效果，进一步提高对阴道炎症的治疗效果。

2.本发明提供的一种益生菌后生元制品中，代谢产物中包含180mg/g以上的有机酸、40mg/g以上的短链脂肪酸；相比现有公开的益生菌后生元制品而言，其中有机酸和短链脂肪酸的含量更高，能够具有更好的抑菌效果。其中，有机酸和短链脂肪酸中的柠檬酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量明显显著提高，其不仅仅能够达到显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、加德纳菌及绿脓杆菌等致病菌的目的，并且，这些抑菌物质还能在一定水平使结肠细胞保持稳定，从而可防止或抑制癌变，调节肠道菌群失调和治疗肠易激综合征、抗生素相关性肠炎、急慢性腹泻等疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1 是本发明试验例2中实施例1制备得到的益生菌后生元粉对三株致病菌活菌数检测结果图；

图2 是本发明试验例2中实施例2制备得到的益生菌后生元粉对三株致病菌活菌数检测结果图；

图3 是本发明试验例2中实施例3制备得到的益生菌后生元粉对三株致病菌活菌数检测结果图。

具体实施方式

实施例1

一种益生菌后生元制品，其制备方法如下：

1)培养基称料：将全脂豆粉5%、脱脂乳粉15%、柠檬酸钠0.25%和水79.75%按比例需求混合；

2)化料：58℃化料，得到料液；

3)均质：58℃，压力为19.0 Mpa；

4)杀菌：上述3）均质后的料液进行95℃、60 min杀菌；

5)冷却：杀菌后的料液冷却至35℃；

6)添加菌种和乳糖酶：料液中加入质量比为1: 1: 1的菌种副干酪乳杆菌Probiosci-92，格氏乳杆菌G098和鼠李糖乳杆菌R7041，料液中菌种的接种量为6×10⁶CFU/mL。按生产需求添加0.5g/1000g的乳糖酶，可通过酶解为益生菌提供碳源；

7)恒温发酵：35℃进行恒温发酵，至pH4.5-4.6停止，此发酵步骤大约需要18-19h，此实施例中发酵18h，发酵终点的pH值为4.6；

8)灭活：按生产需求混合10g/1000g的麦芽糊精（为喷雾干燥提供理想的液体分散），预热至58℃，经一级压力19.0 Mpa、二级压力5.0 Mpa均质后，进行杀菌灭活，杀菌灭活的参数条件为75℃、15min；

9)喷雾干燥：将灭活的菌悬液经喷雾干燥（进风温度160℃，出风温度45℃）得到益生菌后生元粉。

实施例2

本实施例的一种益生菌后生元制品，与实施例1的区别在于，培养基组成不同，本实施例中培养基组成为：全脂豆粉1.5%、脱脂乳粉18%、柠檬酸钠0.05%，余量为水。

步骤2）中的化料温度为55℃；

步骤3）中的均质温度为55℃，压力为20.0 Mpa；

步骤7）中的发酵时间为19h，发酵终点的pH为4.5；

步骤8）中的均质温度为60℃，一级压力为18.0 Mpa。

实施例3

本实施例的一种益生菌后生元制品，与实施例1的区别在于，培养基组成不同，本实施例中培养基组成为：全脂豆粉7%、脱脂乳粉11%、柠檬酸钠0.5%，余量为水。

步骤2）中的化料温度为60℃；

步骤3）中的均质温度为60℃，压力为18 Mpa；

步骤7）中的发酵时间为19h，发酵终点的pH为4.5；

步骤8）中的均质温度为55℃，一级压力为20.0 Mpa。

试验例1

将实施例1、实施例2和实施例3制备得到的益生菌后生元粉分别采用高效液相色谱法测定益生菌后生元中含有的抑菌物质。高效液相色谱法测定的方法包括以下步骤：

（1）样品溶液制备；

（2）对照品溶液制备；

（3）高效液相色谱测定：取对照品溶液和样品溶液在以下色谱条件下进行测定分析，色谱柱为GL InterSustain-C18（4.6 mm×250 mm, 5μm）,流动相为磷酸调节pH=2.0的0.03 mol·L^-1（NH₄）H₂PO₄缓冲液和甲醇，体积比为97:3，流速为0.8 mL·min^-1，柱温30℃，检测波长为210 nm。

在该方法条件下，益生菌后生元中草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等同时得到了有效分离，且方法学结果均符合分析测定要求。本发明实施例中的试验方法和条件如无特别说明均为常规方法。

实施例1-3得到的益生菌后生元粉测定结果如下表1-3所示。表1为实施例1的益生菌后生元粉测定结果，表2为实施例2的益生菌后生元粉测定结果，表3为实施例3的益生菌后生元粉测定结果。

表1

表2

表3

实施例2和实施例3检测得到的各成分的含量与实施例1无显著性差异。

由上述表1-3的数据可知，共鉴定出16种抑菌物质，其中柠檬酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量较高。即，益生菌后生元中含有足量抗菌物质（有机酸），能短时高效抑制可引起阴道炎症的代表性菌株如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。并且，这类抑菌物质一定水平能够使结肠细胞保持稳定，从而可防止或抑制癌变，调节肠道菌群失调和治疗肠易激综合征、抗生素相关性肠炎、急慢性腹泻等疾病。

试验例2

验证实施例1、实施例2和实施例3制备得到的益生菌后生元粉对病原菌的抑制作用，其中病原菌包括:大肠杆菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、白色念珠菌(ATCC 10231)、加德纳菌（ATCC 14018）及绿脓杆菌（ATCC 27853）。

将益生菌后生元粉分别与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌进行共培养，益生菌后生元粉的添加量均为1wt%，对其抑制作用进行评价。具体实现过程为：依据GB15979 附录 C 配制病原菌菌悬液，本试验例中病原菌菌悬液中含菌量为1×10⁶CFU/mL~9×10⁶ CFU/mL ，取样计数时间为 0 h、0.5 h、1h、2 h、3 h和 6 h。存活率计算方法如下所示：

存活率=所选时间点活菌数/初始活菌数。

注:本实验中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌初始活菌数含量高于1.0×10⁶CFU/mL，设置3个重复。

同时，加德纳菌和绿脓杆菌的抑制评价采用琼脂扩散法，与对照组进行抑制能力对比。取100 nL指示菌菌液(浓度约为1×10⁸ CFU/mL)均匀涂布于含脱纤维羊血固体TSA培养基上，放置牛津杯并加入1wt%浓度的益生菌后生元粉复溶液，37℃厌氧培养24 h后测量抑菌圈直径。

1、实施例1制备得到的益生菌后生元粉对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的检测结果如图1所示。对加德纳菌和绿脓杆菌的抑制评价结果如表4所示。

表4

由图1的检测结果可知,添加1 %益生菌后生元粉末抑制能力测定结果如图 1 所示：在0.5 h 时对三株病原菌的平均抑制率超过60 %。在0.5 h时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制率分别为60.13 %和89.71%，白色念珠菌抑制率为46.30%。在共培养期间，益生菌后生元对致病菌具有持续稳定的抑制效果，6h时对三株潜在致病菌抑制率均高于99.0%，表明对所述致病菌具有较强、较稳定的抑制作用。

通过上述表4中的实验结果显示，益生菌后生元粉溶液对加德纳菌和绿脓杆菌具有较强的抑制效果，抑菌圈直径分别为（17.3±0.03）mm和（16.4±0.02）mm（打孔直径为7mm，牛津杯直径7mm），其效果明显优于现有公开的益生菌后生元对加德纳菌和绿脓杆菌的抑制效果。

2、采用实施例2益生菌后生元制品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制检测结果如图2所示；对加德纳菌和绿脓杆菌的抑制效果如表5所示。

表5

实施例2益生菌后生元制品进行相同实验检测得到的抑菌效果与实施例1无显著差异。

3、采用实施例3益生菌后生元制品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制检测结果如图3所示；对加德纳菌和绿脓杆菌的抑制效果如表6所示。

表6

实施例3益生菌后生元制品进行相同实验检测得到的抑菌效果与实施例1无显著差异。

试验例3

试验采用为患有阴道炎症的志愿者提供添加益生菌后生元的凝胶，进行为期2个月的治疗。检测样本为采集志愿者实验前后的白带样本。实验时间为：2020.01-2020.03，地点：呼和浩特妇幼保健医院。

具体试验过程为：

试验共招募18-55岁之间，患阴道炎症的女性70人，为其提供添加了实施例1中制备的益生菌后生元的凝胶，凝胶中益生菌后生元的添加量为1%，用于治疗阴道炎症，进行为期2个月的临床试验。

记录2月前后白带量、气味、性状、颜色的变化情况，并对其进行评价，其中：

有效：使用后白带量、气味、性状、颜色朝向正常方向变化，相比初始有明显好转；

无效：与初始相比无变化甚至更严重。

使用添加了益生菌后生元凝胶等志愿者阴道炎症具有有效缓解的人数为65人，有效率高达93%。

由上述试验例1-3的结果可知，本发明益生菌后生元中含有足量抗菌物质（有机酸），能短时高效抑制可引起阴道炎症的代表性菌株如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。特别地，在凝胶中添加益生菌后生元，可使阴道炎患者白带的量、性状、颜色和气味均趋于正常。微观上，阴道菌群中特征指示有害菌数量下降，特征指示有益菌数量增多。因此，本发明在治疗女性阴道炎、维护女性阴道微生态平衡和局部皮肤粘膜屏障功能完整性方面都可提供足够的协同促进作用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种益生菌后生元制品，其特征在于，包括：益生菌经发酵后的灭活菌体及其代谢产物；所述益生菌至少包括副干酪乳杆菌Probiosci-92，格氏乳杆菌G098和鼠李糖乳杆菌R7041；所述副干酪乳杆菌Probiosci-92的保藏号为CGMCC No.25086，所述格氏乳杆菌G098的保藏编号为CGMCC No.22909，所述鼠李糖乳杆菌R7041的保藏编号为CGMCC No.25101。

2.根据权利要求1所述的益生菌后生元制品，其特征在于，所述代谢产物中包含180mg/g以上的有机酸、40mg/g以上的短链脂肪酸。

3.根据权利要求2所述的益生菌后生元制品，其特征在于，所述有机酸包括苯乳酸、4-羟基苯乳酸、乳酸、柠檬酸、水杨酸、苹果酸、琥珀酸、苯甲酸中的一种或多种；

4.根据权利要求2所述的益生菌后生元制品，其特征在于，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸中的一种或多种；

5.根据权利要求1-4任一项所述的益生菌后生元制品，其特征在于，所述代谢产物中还包括高活性物质，所述高活性物质包括：甲氧基查耳酮、罗他霉素、异硬脂酸、咖啡酸、青黛酮、维生素B2、柠檬黄素、赤鲜酮糖、茶碱、丹酚酸和皮质醇中的一种或多种。

6.根据权利要求1-5任一项所述的益生菌后生元制品，其特征在于，所述发酵所用的培养基按质量百分数计，其组成包括：全脂豆粉1.5%-7%、脱脂乳粉11%-18%、柠檬酸钠0.05%-0.5%，余量为水。

7.一种益生菌后生元制品的制备方法，其特征在于，包括：

获取权利要求1-6任一项所述的一种益生菌后生元制品中的益生菌菌种和培养基；

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述培养基配置完成之后以及在灭菌之前还包括均质的步骤；

优选的，均质的温度为55-60℃、压力为18~20.0 Mpa；

所述培养基灭菌时的温度为95℃，灭菌的时间为60 min；

所述干燥为喷雾干燥。

9.根据权利要求1-6任一项所述的一种益生菌后生元制品或权利要求7-8任一项制备方法制备得到的一种益生菌后生元制品在制备改善阴道炎症产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述改善阴道炎症产品包括但不限于女性私护用品、保健品或药品。