CN115088835A - 一种具有多功能黑枸杞酵素原液及其制备工艺 - Google Patents
一种具有多功能黑枸杞酵素原液及其制备工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种具有多功能黑枸杞酵素原液及其制备工艺。包括以下重量份数的原料：水82‑95g/L，黑枸杞3.0‑6.0g/L，桑椹1.0‑4.0g/L，低聚异麦芽糖1.0‑5.0g/L，低聚果糖0.1‑3.0g/L。制备方法包括如下步骤，原料预处理：将低聚异麦芽糖、低聚果糖投入到水中，灭菌，冷却；将无菌的黑枸杞、桑椹，在无菌的条件下投入灭菌后的料液中，搅拌；将植物乳杆菌HCS03‑001、罗伊氏乳杆菌HCS02‑001、鼠李糖乳杆菌HCS01‑013以0.06％的接种量接种于活化培养基，进行培养；将活化的菌液接种到料液中，搅拌进行发酵；粗过滤，离心，过滤除杂，过滤除菌得黑枸杞酵素原液。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种具有多功能黑枸杞酵素原液及其制备工艺。
背景技术
现代生活节奏快，人们生活压力大，不规则的饮食习惯及熬夜等不规律的生活，身体大多处于亚健康状态，免疫力低。相关的研究结果表明，肾虚能导致免疫功能紊乱，而补肾类中药能调节与体液免疫、细胞免疫相关的各项指标，改善肾虚患者的免疫功能。
脱发给人们生活带来不小的影响，严重影响人们的正常生活和心情，目前针对脱发的产品大多是外用形式且针对脂溢性皮炎、毛囊炎等疾病引起的脱发，很少有从由内而外的角度调节身体而解决脱发的问题。
目前的酵素生产工艺一般经过热水浸提、萃取再经发酵等工艺得到的发酵混合液。酵素多采用高温杀菌进行灭菌，高温导致酵素产品内成分被破坏，花青素等有效成分发生降解，有效成分利用率大大降低。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种能够平调阴阳，滋补肝肾而预防脱发，同时能够起到增强免疫力作用的黑枸杞酵素原液。酵素是以动物、植物、菌类等为原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分(包括多糖类、寡糖类、蛋白质及多肽、氨基酸类、维生素类)的产品。
为提高黑枸杞酵素产品功效，本发明采用了独特的冷工艺技术，不仅充分利用了原料成分功效，发酵产生的有益成分功效也能得到充分发挥。
本发明采用的技术方案如下，一种多功能的黑枸杞酵素原液，包括以下重量份数的原料：水82-95g/L，黑枸杞3.0-6.0g/L，桑椹1.0-4.0g/L，低聚异麦芽糖1.0-5.0g/L，低聚果糖 0.1-3.0g/L。
上述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，包括如下步骤：
1)原料预处理：将低聚异麦芽糖、低聚果糖投入到水中，物料全部溶解后115℃灭菌 30min，冷却至37℃；
2)投料：按照权利要求1所述的重量份数，将无菌的黑枸杞、桑椹，在无菌的条件下投入灭菌后的料液中，搅拌均匀，确保原料全部浸湿；
3)菌种活化：将植物乳杆菌HCS03-001、罗伊氏乳杆菌HCS02-001、鼠李糖乳杆菌HCS01-013以0.06％的接种量接种于活化培养基，装液量为50～80％，进行培养；
4)发酵：将步骤3)得到的活化的菌液接种到步骤2)所得的料液中，接种量为5％，装液量为50～75％；搅拌进行发酵；发酵进行45h开始，每小时监控发酵液pH值，当接连两次pH值相差＜0.10，发酵结束；发酵终点时pH值＜3.40；
5)发酵液粗过滤：将步骤4)得到的发酵液离心过滤收集滤液；
6)发酵液离心：将步骤5)中所得发酵液进行离心；
7)发酵液过滤除杂：将步骤6)中得到的料液打入错流膜过滤器中，进行过滤除杂；
8)发酵液过滤除菌：将步骤7)的发酵液采用高分子材料微孔膜除菌设备进行常温除菌，得黑枸杞酵素原液。
优选地，上述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，步骤2)中，投料顺序为黑枸杞、桑椹。
优选地，上述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，步骤3)中，按质量比，植物乳杆菌HCS03-001：罗伊氏乳杆菌HCS02-001：鼠李糖乳杆菌HCS01-013＝10:9:1。
优选地，上述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，步骤3)中，所述的活化培养基：无水葡萄糖40g/L、酵母浸出物15g/L、酵母蛋白胨10g/L、L-苹果酸3g/L、一水柠檬酸2g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、硫酸锰0.01g/L，调pH至 6.60；115℃，30min灭菌。
优选地，上述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，步骤3)中，培养条件为37℃培养16±1h，菌液活菌数达1.0×109CFU/mL以上停止培养。
优选地，上述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，步骤4)中，发酵时的搅拌速度：60-80r/min；通气量为0；初始气压0.02-0.03MPa；在37℃下发酵47±2h。
一种多功能的黑枸杞酵素，将上述的黑枸杞酵素原液置于容器中，加入麦芽糖醇液，木糖醇，苹果粉，三氯蔗糖，搅拌、静置，除菌得到黑枸杞酵素。
优选地，上述的一种多功能的黑枸杞酵素，按重量份数，黑枸杞酵素原液947.86份，麦芽糖醇液25份，木糖醇25份，苹果粉2份，三氯蔗糖0.14份。
黑枸杞是一种药食同源的功能性原料，含有蛋白质、脂肪、有机酸、糖类、维生素类和多种微量元素。另外富含多种功能性成分，如黄酮类物质、花青素、原花青素、花色苷和多糖类物质，具有较高的营养物质和保健功能。枸杞入药首载于《神农本草经》，列为上品，养肝，滋肾，润肺。《本草汇言》：“润肺生津，补肾添精”。枸杞子归肝、肾、肺经，不仅可以养肝益肾，更可以润肺生津，精血、津液充足则毛发得以濡养荣润，不易脱落。
桑椹，为桑树的果实，富含多种营养物质，有丰富的活性蛋白、维生素、矿物质、氨基酸、花青素等成份，能显著提高人体免疫力、补肝益肾、滋阴补血、黑发明目等功效。《中药大辞典》：“桑椹入肝、肾经，功能主治补肝，益肾，熄风，滋液。”《滇南本草》：“益肾脏而固精，久服黑发明目。”《随息居饮食谱》：“滋肝肾，充血液，祛风湿，健步履，息虚风，清虚火。”
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、本发明酵素原料应用药食同源原料，选用的乳酸菌均分离自人源粪便，应用安全性高。
2、本发明酵素应用冷工艺制备技术，利用特定益生菌进行发酵，有效的保留活性成分，发酵产生的有益成分也能得到够充分利用。
3、本发明酵素能够滋补肝肾，由内而外调节身体，预防脱发和增强人体免疫力，且见效较快，食用一周即可见脱发量减少。
4、本发明酵素原料采用黑枸杞，黑枸杞味甘、性平，富含蛋白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、矿物质、微量元素等多种营养成分。还含有丰富的天然原花青素，原花青素 OPC是最有效的天然水溶性自由基清除剂，有较强的抗氧化能力。
5、本发明酵素原料采用桑椹，其含有多种微量元素和多种功能性成分，如芦丁、花青素、白黎芦醇等，具有良好的防癌、抗衰老、缓解疲劳、黑发明目等作用。
具体实施方式
实施例1一种具有多功能黑枸杞酵素原液及其制备工艺
一种多功能的黑枸杞酵素原液，包括以下重量份数的原料：水82g/L，黑枸杞6.0g/L，桑椹4.0g/L，低聚异麦芽糖5.0g/L，低聚果糖3.0g/L。
制备工艺如下：
1、原料预处理：按配方称量原料，将低聚异麦芽糖、低聚果糖投入到发酵重量105％的水中，物料全部溶解后115℃灭菌30min，冷却至37℃；
2、投料：将无菌的黑枸杞、桑椹，在无菌的条件下投入灭菌后的料液中，搅拌均匀，确保原料全部浸湿；
优选的，投料先后顺序：黑枸杞、桑椹；
3、菌种活化：将植物乳杆菌HCS03-001、罗伊氏乳杆菌HCS02-001、鼠李糖乳杆菌HCS01-013(三种菌质量比例为10:9:1)以0.06％的接种量接种于活化培养基，装液量 50～80％，37℃条件下培养16±1h，菌液活菌数达1.0×109CFU/mL以上；
所述的活化培养基：无水葡萄糖40g/L、酵母浸出物15g/L、酵母蛋白胨10g/L、L-苹果酸3g/L、一水柠檬酸2g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、硫酸锰0.01g/L，调pH至6.60；115℃，30min灭菌。
4、发酵：将活化的菌种接种到步骤2所得的料液中，接种量为5％，装液量为50～75％；搅动培养，搅拌速度：60-80r/min；通气量为0；初始气压0.02-0.03MPa；37℃下培养47±2h；发酵进行45h开始，每小时监控发酵液pH值，当接连两次pH值相差＜0.10，发酵结束；发酵终点pH值＜3.40(发酵液温度为常温)；发酵液感官状态：深紫色(稀释 10倍为浅紫色)，具有黑枸杞的特有滋气味，略带有桑椹的香气，口感偏酸。
5、发酵液粗过滤：将步骤4的发酵液离心过滤收集滤液，包括发酵罐底部残留发酵液，降低损耗。滤液无明显残渣，深紫色，口感偏酸，略有桑椹的香气，且收率达到93％以上。
所述的收率计算公式为：
6、发酵液离心：将步骤5中所得发酵液进行离心，离心机转速为13000r/min(频率43.95Hz)，蠕动泵流速300r/min(流速约1.5L/min)；离心后产品外观保持深紫色液体，溶液均一，无杂质，收率达96％以上。
所述的收率计算公式为：
7、发酵液膜过滤除杂：将步骤6中得到的料液打入错流膜过滤器中，进行过滤除杂；滤膜清洗更换时间根据出料顺畅程度进行调整，直至澄清，深紫色(比粗过滤颜色要浅一些，稀释10倍为浅紫色)，溶液均一，无杂质，收率达95％以上。
所述的收率计算公式为：
8、发酵液过滤除菌：将步骤7的发酵液采用膜孔径0.22μm、材质为有机高分子材料的微孔膜除菌设备进行常温除菌，得黑枸杞发酵原液。
实施例2一种具有多功能黑枸杞酵素原液不同工艺对比
热工艺制备：以实施例1所述原料配方生产黑枸杞酵素原液。将黑枸杞、桑椹浸没于水中100℃蒸煮30～50min后，再投入到灭菌的低聚果糖和低聚异麦芽糖的料液中，经益生菌发酵离心后采用131℃超高温杀菌15s的方式进行杀菌，无菌灌装后进行巴氏杀菌。
检测酵素原液的部分有益成分：采用热工艺制备的黑枸杞酵素和采用实施例1中冷工艺制备的黑枸杞酵素的有益成分对比分析见表1。冷工艺制备的黑枸杞酵素中有机酸、粗多糖、多酚含量均高于热加工艺制备的酵素。粗多糖可提升人体免疫功能，多酚类物质可阻断致癌物与细胞脱氧核糖核酸的共价结合，防止DNA单链断裂，提高肌体的细胞免疫功能。有机酸具有抑菌、利胆、消炎、降血糖、抗氧化以及调节机体免疫等作用，能够软化血管、促进钙、铁元素的吸收。
表1不同工艺制备的黑枸杞酵素原液的有益成分对比分析
对肾虚模型大鼠的肾功能作用：SPF级健康雄性成年SD大鼠实验动物适应性饲养1周后，按体质量随机分为2组：正常组20只，造模组50只。正常组灌胃0.5％羧甲基纤维素钠溶液10mL·kg-1·d-1，造模组灌胃150mg·kg-1腺嘌呤悬液连续2周后，将造模组随机分为4组：模型组20只，热工艺酵素原液组10只，冷工艺酵素原液组10只，灌胃龟鹿二仙膏 10g·kg-1的阳性对照组10只。模型组、酵素原液组每隔1日上午给予150mg·kg-1腺嘌呤灌胃维持模型，同时酵素原液组于每日下午灌胃20mg·kg-1，进行4周。
试验后各组大鼠血清中肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、促肾上腺皮质激素 (ACTH)，睾酮(T)，三碘甲状腺原氨酸(T3)含量见表2。造模6周后，模型组大鼠的血清肌酐和尿素氮的含量比正常组均显著上升，促肾上腺皮质激素、睾酮、三碘甲状腺原氨酸含量比正常组显著下降，说明大鼠肾功能及肾上腺、性腺、甲状腺功能减弱。当灌胃黑枸杞酵素原液4周后，与模型组比，冷工艺黑枸杞酵素原液组的尿素氮和肌酐的含量显著降低， ACTH、T和T3的含量显著升高，热工艺黑枸杞酵素原液组的尿素氮升高，肌酐显著升高，ACTH含量显著升高，T和T3的含量升高。说明黑枸杞酵素原液对肾虚模型大鼠的肾功能及腺体激素水平具有良好的调节作用，且冷工艺组的效果更好。
表2不同工艺制备的黑枸杞酵素原液的大鼠肾功能指标
实施例3一种具有多功能的黑枸杞酵素原液产品的制备
将实施例1中得到的黑枸杞酵素原液进行调配，将黑枸杞酵素947.86g打入调配罐中，称取麦芽糖醇液25g，木糖醇25g，苹果粉2g，三氯蔗糖0.14g投进调配罐中，搅拌至完全溶解，搅拌时间50min，静置10min。将料液进行过滤除菌，除菌初期可舍去部分料液，除菌后料液状态：澄清，深紫色(比除菌前颜色要浅一些，稀释10倍为浅紫色)，溶液均一，无杂质。拥有黑枸杞的特有滋气味，略有桑椹的香气，气味较除菌之前偏淡，口感酸甜，取样检测结果无杂菌，进行无菌灌装，180mL/瓶。
实施例4一种具有多功能的黑枸杞酵素防脱发功能试验
试验筛选由于肝肾功能不足导致脱发问题出现的人群，共计61人，平均年龄31周岁。根据《中药新药临床研究指导原则》的中医诊断标准，制定入选人员判定标准，如表3。
表3试验入选人员判定标准
试验患者排除标准：
(1)合并有内分泌、心、脑、肝、肾和造血功能等严重原发疾病或继发者，精神病患者；
(2)近两个月参加过其他治疗雄激素性脱发的临床试验者；
(3)曾手术植发者。
试验患者剔除与脱落标准：
(1)治疗过程中，擅自使用其他与本病相关药物的患者；
(2)因受试者依从性差不能遵医嘱用药者，对疗效判定及安全性评定造成障碍者；
(3)实验过程中未按要求食用本产品；
(4)不愿意继续参与临床试验者。
受试人群服用黑枸杞酵素产品，食用量每日一瓶(180mL/瓶)，试验周期一个月。结合临床实际对掉发数、油腻度、瘙痒感、头屑、新发再生进行评分，并通过试验后有效率评判治疗效果。判定标准见表4。
表4症状评分
评分结果：
0-10分：效果不佳；
11-20分：效果一般；
21-30分：效果显著。
一种具有多功能的黑枸杞酵素原液产品防脱发功效试验，具体结果见表5。
表5一种具有多功能的黑枸杞酵素原液产品防脱发功效试验
备注：有效率＝(效果显著人数+效果一般人数)/参与人数*100％
试验结果如表4所示，实验人员食用黑枸杞酵素产品一周即有明显掉发减少效果，随着服用黑枸杞酵素服用周期的延长，防脱发有效率提升。试验过程中出现受试人员未按要求食用本产品，剔除部分数据，第4周人员有效数据45人，此时防脱发有效率达到93.33％，本发明黑枸杞酵素明显防脱发功能。
实施例5一种具有多功能的黑枸杞酵素液增强免疫力功能试验
1、试验小鼠造模
将40只SD雄性大鼠随机分成对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，共5组，每组10只。对照组每天给予10mL/kg的生理盐水；其余组均给予雷公藤多苷片 (20mg/kg)连续30天制造大鼠肾精亏虚模型，每日灌胃雷公藤多苷片4h后模型组给予 10mL/kg的生理盐水，黑枸杞酵素液低剂量组每天灌胃10mL/kg，中剂量组每天灌胃 15mL/kg，高剂量组每天灌胃20mL/kg，连续灌胃4周。
2、血清免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素Ⅵ(IL-6)、白细胞介素Ⅱ(IL-2)含量测定
在末次灌胃2h后，股动脉取血1.5mL，静置30min后，3000r·min-1离心15min，取上层血清，4℃保存待测。使用ELISA试剂盒，酶标仪450nm处测定吸光值。
3、全血CD3 +、CD3 +CD4 +、CD3 +CD8 +、CD4/CD8百分比测定
在末次灌胃2h后，股动脉取血2mL，加入含有肝素钠的采血管中摇匀。加入100μL抗凝血于流式管中，分别添加Mouse Anti-Rat CD4、Mouse Anti-Rat CD8 a和Mouse Anti-RatCD3抗体各5μL，4℃环境下避光染色30min；加入2ml 1X溶血素，室温保持10min；离心 5min后弃去上清液，重复2次。再加入400μL的PBS液漩涡混匀后，采用CytoFlex流式细胞仪进行样品分析，结果采用Kaluza软件进行分析。
4、测定结果
血清免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素Ⅵ(IL-6)、白细胞介素Ⅱ(IL-2)的含量测定结果如表6所示，与模型组相比，服用黑枸杞本草酵素的不同剂量组测定数值均有变化。高剂量组的IgG含量明显升高为3204.49μg/mL，IL-6含量显著降低为11.18pg/mL，IL-2含量显著提升为18.84pg/mL。对比三组不同剂量的黑枸杞酵素，高剂量组效果最显著。
表6黑枸杞酵素对肾精亏虚模型大鼠血清IL-2、IL-6、IgG含量的影响
小鼠服用黑枸杞酵素后，对T淋巴细胞的影响结果如表7所示。与模型组相比，各剂量组小鼠CD3 +、CD3 +CD4 +、CD4/CD8比例显著提升，CD3 +CD8 +比例显著下降，且剂量越高效果越显著。
表7黑枸杞酵素对肾精亏虚模型大鼠全血样品CD3 +、CD3 +CD4 +、CD3 +CD8 +、CD4/CD8比例的影响
黑枸杞酵素能够使上述指标向正常水平恢复，改善肾精亏虚模型小组的免疫功能，补肾益气，调节细胞免疫和体液免疫等相关指标，进而改善肾虚患者的免疫功能。
Claims (9)
1.一种多功能的黑枸杞酵素原液，其特征在于，包括以下重量份数的原料：水82-95g/L，黑枸杞3.0-6.0g/L，桑椹1.0-4.0g/L，低聚异麦芽糖1.0-5.0g/L，低聚果糖0.01-3.0g/L。
2.权利要求1所述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)原料预处理：将低聚异麦芽糖、低聚果糖投入到水中，物料全部溶解后115℃灭菌30min，冷却至37℃；
2)投料：按照权利要求1所述的重量份数，将无菌的黑果枸杞、桑椹，在无菌的条件下投入灭菌后的料液中，搅拌均匀，确保原料全部浸湿；
3)菌种活化：将植物乳杆菌HCS03-001、罗伊氏乳杆菌HCS02-001、鼠李糖乳杆菌HCS01-013以0.06％的接种量接种于活化培养基，装液量为50～80％，进行培养；
4)发酵：将步骤3)得到的活化的菌液接种到步骤2)所得的料液中，接种量为5％，装液量为50～75％；搅拌进行发酵；发酵进行45h开始，每小时监控发酵液pH值，当接连两次pH值相差＜0.10，发酵结束；发酵终点时pH值＜3.40；
5)发酵液粗过滤：将步骤4)得到的发酵液离心过滤收集滤液；
6)发酵液离心：将步骤5)中所得发酵液进行离心；
7)发酵液过滤除杂：将步骤6)中得到的料液打入错流膜过滤器中，进行过滤除杂；
8)发酵液过滤除菌：将步骤7)的发酵液采用高分子材料微孔膜除菌设备进行常温除菌，得黑枸杞酵素原液。
3.根据权利要求2所述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，其特征在于，步骤2)中，投料顺序为黑枸杞、桑椹。
4.根据权利要求2所述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，其特征在于，步骤3)中，按质量比，植物乳杆菌HCS03-001：罗伊氏乳杆菌HCS02-001：鼠李糖乳杆菌HCS01-013＝10:9:1。
5.根据权利要求2所述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的活化培养基：无水葡萄糖40g/L、酵母浸出物15g/L、酵母蛋白胨10g/L、L-苹果酸3g/L、一水柠檬酸2g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、硫酸锰0.01g/L，调pH至6.60；115℃，30min灭菌。
6.根据权利要求2所述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，其特征在于，步骤3)中，培养条件为37℃培养16±1h，菌液活菌数达1.0×109CFU/mL以上停止培养。
7.根据权利要求2所述的一种多功能的黑枸杞酵素原液的制备方法，其特征在于，步骤4)中，发酵时的搅拌速度：60-80r/min；通气量为0；初始气压0.02-0.03MPa；在37℃下发酵47±2h。
8.一种多功能的黑枸杞酵素，其特征在于，将权利要求1所述的黑枸杞酵素原液置于容器中，加入麦芽糖醇液，木糖醇，苹果粉，三氯蔗糖，搅拌、静置，除菌得到黑枸杞酵素。
9.根据权利要求8所述的一种多功能的黑枸杞酵素，其特征在于，按重量份数，黑枸杞酵素原液947.86份，麦芽糖醇液25份，木糖醇25份，苹果粉2份，三氯蔗糖0.14份。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 331200 Zhangshu North Economic and Technological Development Zone, Yichun City, Jiangxi Province Applicant after: Jiangxi Renren Health Microecological Technology Co.,Ltd. Address before: 331208 Chengbei economic and Technological Development Zone, Zhangshu City, Yichun City, Jiangxi Province Applicant before: Jiangxi Renren Health Industry Co.,Ltd. |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220923 |