CN102757923B - 一种制备高活菌数两歧双歧杆菌菌粉的方法 - Google Patents

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一种高活菌数两歧双歧杆菌菌粉的制备方法，本发明采用先于低温环境中冷休克、再于酸性环境中酸休克处理，前者诱导菌体内产生抗冻蛋白并改变其细胞脂肪酸的组成，后者使其在不利条件下合成蛋白，这种亚致死处理能增强两歧双歧杆菌的抗逆能力，从而显著提高两歧双歧杆菌的冻干存活率及菌粉活菌数。实验结果表明：采用本发明方法的两歧双歧杆菌冻干存活率为75％以上、菌粉活菌数大于2×1011cfu/g，未经亚致死处理的两歧双歧杆菌冻干存活率为48％左右，菌粉活菌数为1010cfu/g左右。本发明具有方法简单、操作容易、成本低廉、容易实现规模产业化的优点。

Description

一种制备高活菌数两歧双歧杆菌菌粉的方法
技术领域
本发明属于生物菌剂制品技术领域，具体涉及一种提高两歧双歧杆菌冻干存活率的制备方法。
背景技术
益生菌(Probiotics)是指当摄入足够的数量，能对宿主产生一种或多种特殊且经验证的功能性健康益处的微生物，这些健康益处主要包括增加营养价值(促进维生素、矿物质的吸收)，治疗轮状病毒引起的腹泻、旅游者腹泻和抗生素引起的腹泻，降低血清胆固醇含量，缓解乳糖不耐症、过敏性皮炎、缓解肠易激综合症，以及调节人体免疫功能和肠道微生态平衡等。益生菌主要包括双歧杆菌属、乳酸杆菌、链球菌及酵母等，益生菌产品中常用的菌株为嗜酸乳杆菌、双歧杆菌(Bifidobateria)及干酪乳杆菌等。目前我国卫生部批准的可用于保健食品的益生菌菌种有：嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、青青双歧杆菌、保加利亚杆菌、嗜热乳链球菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等。
目前益生菌大部分应用于乳制品中，包括发酵乳、乳酸菌饮料、干酪、酸奶、冷冻酸奶、乳饮料、奶粉、冰淇淋、豆奶及发酵豆奶等产品，也有用于点心、糖果、糕饼、蔬果汁等。近年来，为防止菌体飞散，取食便利及延长保质期等因素，产品形式扩展为以胶囊、粉包、颗粒状包装的菌体和发酵(乳)制品的干燥或冻干粉末。各国都开发了大量的益生菌产品，如：日本含益生菌的制品非常盛行，所有大的乳品企业都有这样的产品(如Yakult及Lola等)；法国所销售酸奶的11％都含有双歧杆菌，如达能的含有双歧杆菌的Yoplait和Dannon两大品牌广为人知；欧盟的益生菌产品有Naturebifidus及Natural bio yoghurt等；美国的产品有Future biotic及LosArgeles等。
我国也有一些益生菌制剂和益生菌乳制品，益生菌制剂如金双歧、丽珠肠乐和贝飞达，乳制品如蒙牛的“冠益乳”、光明的“AB100”、三元的“益菌多”、伊利的“轻果激扬”、龙丹的“益加菌酸牛奶”等。与国外相比，国内的益生菌制剂品种少，且使用的菌株少，主要原因是高活性益生菌菌粉的制备存在一定难度。益生菌乳制品主要为酸奶等液态乳制品，奶粉中含益生菌的产品各企业尚未商品化，原因是益生菌非常娇气，对高温、热干燥过程等的抵抗性差、易死亡。因此，高活性益生菌菌粉是益生菌产品生产的关键，所以制备常用的两歧双歧杆菌菌粉很有必要。
目前两歧双歧杆菌(Bifidobateria bifidum)菌粉的制备主要采用真空冷冻干燥的方法。而冷冻干燥和喷雾干燥对微生物都具有破坏作用，尤其是细菌细胞膜。益生菌若直接进行冷冻干燥，死亡率将达90％以上。冻干过程中影响益生菌存活率及菌粉活菌数的主要因素有菌株种类、培养基、培养条件、菌龄、预冻条件、菌悬液浓度、冻干保护剂、细胞膜成分、细胞内蛋白质种类、水分含量及亚致死处理等。目前提高双歧杆菌菌粉冻干存活率的方法多集中在冻干保护剂的筛选，主要从糖类、盐类、蛋白质、氨基酸等物质中得到各种复合保护剂。复合保护剂的添加量越多，导致单位质量菌粉活菌数越低。因此，从改变菌株自身抗冻能力来减少保护剂的添加量很有必要。
发明内容
针对现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种高活菌数两歧双歧杆菌菌粉的制备方法，能显著提高两歧双歧杆菌的冻干存活率及菌粉活菌数。
本发明提供的高活菌数两歧双歧杆菌菌粉的制备方法，具体方法如下：先将两歧双歧杆菌在含有0.5g/L半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤中37℃培养18～24h，再将培养液在8～10℃静置2～4h，然后以5000～7000rpm离心10～15min，弃去上清液，获得两歧双歧杆菌菌泥；加入2倍菌泥重量的含有1g/L蛋白胨的无菌生理盐水，调菌悬液pH至3.5～5，静置0.5～1h后，以5000～6000rpm离心10～15min，弃上清液获得两歧双歧杆菌菌泥；按菌泥等重量加入含有100～200g/L脱脂乳粉的pH为6.8的磷酸缓冲液，混合均匀后在-40℃下预冻8～12h，最后在4～6Pa下冷冻干燥18～24h，即获得两歧双歧杆菌菌粉。
本发明方法中所加入的脱脂乳粉可以通过稳定细胞膜的组成来防止细胞损伤，在冷冻干燥过程中形成多孔结构，使脱水更容易，而且脱脂乳粉本身所含蛋白质可为细胞提供保护层的作用；磷酸缓冲液可防止细胞蛋白质凝结和改变细胞膜的物理性质，从而减少其在的冷冻干燥中死亡率。
本发明将两歧双歧杆菌先置于低温环境中冷休克，再置于酸性环境中酸休克处理，前者诱导菌体内产生抗冻蛋白并改变其细胞脂肪酸的组成，后者使其在不利条件下合成蛋白，这种亚致死处理能增强两歧双歧杆菌的抗逆能力，从而显著提高两歧双歧杆菌的冻干存活率及菌粉活菌数。实验结果表明：采用本发明方法的两歧双歧杆菌冻干存活率为75％以上、菌粉活菌数大于2×1011cfu/g，未经亚致死处理的两歧双歧杆菌冻干存活率为48％左右，菌粉活菌数为1010cfu/g左右。本发明具有方法简单、操作容易、成本低廉、容易实现规模产业化的优点。
具体实施方式
以下结合具体实例详细说明本发明技术方案的实施方式和效果。
实施例1、
将MRS肉汤在118℃下灭菌后冷却至室温，按无菌操作加入过滤除菌的半胱氨酸盐酸盐溶液，使半胱氨酸盐酸盐的终浓度为0.5g/L；按5％(V/V)接种量接入两歧双歧杆菌，37℃培养22h后，将培养液在9℃静置2.5h，再以6500rpm离心10min，弃去上清液，获得两歧双歧杆菌菌泥；称重菌泥，加入2倍菌泥重量的含有1g/L蛋白胨的无菌生理盐水，混匀后用硫酸溶液调菌悬液pH至5.0，静置0.5h，以5500rpm离心10min，弃上清液获得两歧双歧杆菌菌泥；再加入菌泥等重量的含有200g/L脱脂乳粉的pH为6.8的磷酸缓冲液，混合均匀后在-40℃下预冻8h，再置入冷冻干燥机在4～6Pa下冻干18h，即获得两歧双歧杆菌菌粉。经检测，两歧双歧杆菌冻干存活率为89.28％，菌粉活菌数为2.71×1011cfu/g；以未经休克处理为对照，对照组的存活率为48.11％，菌粉活菌数为1.24×1010cfu/g。
实施例2、
将MRS肉汤在118℃下灭菌后冷却至室温，按无菌操作加入过滤除菌的半胱氨酸盐酸盐溶液，使半胱氨酸盐酸盐的终浓度为0.5g/L；按5％(V/V)接种量接入两歧双歧杆菌，37℃培养20h后，将培养液在10℃静置3h，再以5500rpm离心10min，弃去上清液，获得两歧双歧杆菌菌泥；称重菌泥，加入2倍菌泥重量的含有1g/L蛋白胨的无菌生理盐水，混匀后用硫酸溶液调菌悬液pH至4.0，静置0.75h，以5000rpm离心12min，弃上清液获得两歧双歧杆菌菌泥；再加入菌泥等重量的含有150g/L脱脂乳粉的pH为6.8的磷酸缓冲液，混合均匀后在-40℃下预冻12h，再置入冷冻干燥机在4～6Pa下冻干21h，即获得两歧双歧杆菌菌粉。经检测，两歧双歧杆菌冻干存活率为78.53％，菌粉活菌数为2.42×1011cfu/g；以未经休克处理为对照，对照组的存活率为48.27％，菌粉活菌数为1.13×1010cfu/g。
实施例3、
将MRS肉汤在118℃下灭菌后冷却至室温，按无菌操作加入过滤除菌的半胱氨酸盐酸盐溶液，使半胱氨酸盐酸盐的终浓度为0.5g/L；按5％(V/V)接种量接入两歧双歧杆菌，37℃培养18h后，将培养液在8℃静置2h，再以6000rpm离心10min，弃去上清液，获得两歧双歧杆菌菌泥；称重菌泥，加入2倍菌泥重量的含有1g/L蛋白胨的无菌生理盐水，混匀后用硫酸溶液调菌悬液pH至4.0，静置0.85h，以6000rpm离心15min，弃上清液获得两歧双歧杆菌菌泥；再加入菌泥等重量的含有100g/L脱脂乳粉的pH为6.8的磷酸缓冲液，混合均匀后在-40℃下预冻12h，再置入冷冻干燥机在4～6Pa下冻干20h，即获得两歧双歧杆菌菌粉。经检测，两歧双歧杆菌冻干存活率为78.13％，菌粉活菌数为2.37×1011cfu/g；以未经休克处理为对照，对照组的存活率为47.32％，菌粉活菌数为1.18×1010cfu/g。

Claims (1)

1.一种高活菌数两歧双歧杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，具体方法为：先将两歧双歧杆菌在含有0.5g/L半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤中37℃培养18～24h，再将培养液在8～10℃静置2～4h，经离心弃去上清液，获得两歧双歧杆菌菌泥；加入2倍菌泥重量的含有1g/L蛋白胨的无菌生理盐水，调菌悬液pH至3.5～5，静置0.5～1h后，离心弃上清液，获得两歧双歧杆菌菌泥；按菌泥等重量加入含有100～200g/L脱脂乳粉的pH为6.8的磷酸缓冲液，混合均匀后在-40℃下预冻8～12h，最后在4～6Pa下冷冻干燥18～24h，即获得两歧双歧杆菌菌粉。
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