CN111647538A - 一种酪酸梭菌冻干粉、制备方法及其应用 - Google Patents

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CN111647538A CN202010583055.5A CN202010583055A CN111647538A CN 111647538 A CN111647538 A CN 111647538A CN 202010583055 A CN202010583055 A CN 202010583055A CN 111647538 A CN111647538 A CN 111647538A
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Abstract

本发明涉及生物制品的技术领域，更具体地，本发明涉及一种酪酸梭菌冻干粉、制备方法及其应用。所述酪酸梭菌冻干粉，其包括酪酸梭菌和复合保护剂，按重量份计，所述复合保护剂包括15～35份脱脂奶粉、5～23份碳水化合物、1～5份抗坏血酸。本发明提供的酪酸梭菌冻干粉的抗冻能力强，‑45℃冻干40h仍能保持较高的活性，存活率高于79％，冻干粉活菌数大于8.6×108cfu/g，提高了酪酸梭菌的保藏期，有利于后期产品的加工、储藏及运输。

Description

一种酪酸梭菌冻干粉、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物制品的技术领域，更具体地，本发明涉及一种酪酸梭菌冻干粉、制备方法及其应用。
背景技术
近年来，益生菌在功能性乳制品、保健食品、微生态制剂及医疗等领域得到广泛应用，具体是指一类对宿主有功能性健康益处的活性微生物，具有调节人体免疫功能、改善肠道菌群微生态平衡、降低血脂胆固醇、促进营养物质消化与吸收等优点。常见的益生菌有乳酸菌、双歧杆菌、酪酸梭菌及酵母菌等。酪酸梭菌作为机体肠道中最重要的生理性细菌，与人体的生长、新陈代谢密切相关，在人体健康和疾病方面起着重要的作用。
酪酸梭菌，又名丁酸梭菌，属于严格的革兰氏阳性芽孢杆菌。菌体呈直杆状或稍有弯曲，单个或成对存在，两端钝圆，芽孢偏心或次端生，呈圆形或椭圆形，发酵产酸，主要是丁酸、乙酸。研究表明，酪酸梭菌属专性厌氧，在贮存过程中活菌数量下降很快，4℃条件下冷藏也只能保藏5～7d，因此制备高活性酪酸梭菌菌粉至关重要，有利于后期产品的加工、储藏及运输。真空冷冻干燥技术是制备和保存酪酸梭菌最有效的方法之一，可以很好的保持菌体的生物活性。然而，酪酸梭菌在真空冷冻干燥技术中其抗冻性还有待提高，同时在保证抗冻性的前提下，其单位质量菌粉的活菌数也无法保证。
发明内容
针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种酪酸梭菌冻干粉，其包括酪酸梭菌和复合保护剂，按重量份计，所述复合保护剂包括15～35份脱脂奶粉、5～23份碳水化合物、1～5份抗坏血酸。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述碳水化合物选自蔗糖、麦芽糖、乳糖、麦芽三糖、海藻糖中一种或多种。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述碳水化合物包括蔗糖和海藻糖，其重量比为1：(0.3～7.5)。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述复合保护剂还包括2～10重量份菊粉。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述酪酸梭菌冻干粉中酪酸梭菌的存活率大于79％，活菌含量大于8.6×108cfu/g。
本发明第二个方面提供了一种所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法，其包括下面步骤：
(1)菌种培养：培养酪酸梭菌至对数生长期末期或稳定期初期，芽孢率大于80％，获得酪酸梭菌发酵液；
(2)收集菌体：将酪酸梭菌发酵液沉淀，获得湿菌泥；
(3)添加复合保护剂：按照湿菌泥：复合保护剂为(1～0.2)：(0.1～1)的重量比将湿菌泥和复合保护剂混合得到混合物；
(4)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-45℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法，其包括下面步骤：
(1)菌种活化：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭菌菌种溶解在20～30mL无菌生理盐水中，振荡混匀后按照体积比为2％～6％的接种量接种于梭菌增菌液体培养基中，35～38℃条件下厌氧培养7～12h，再按照相同接种量、培养条件在梭菌增菌液体培养基中连续活化2代，获得第3代液体活化培养物；
(2)扩大培养：将得到的第3代活化培养物进行一级种子培养和二级种子培养获得二级种子液体培养物；
(3)菌种培养：将二级种子液体培养物按照体积比为2％～6％的接种量接种于液体发酵培养基中，35～38℃厌氧培养16～28h后，获得生长至对数生长期末期或稳定期初期且芽孢率大于80％的酪酸梭菌发酵液；
(4)收集菌体：将酪酸梭菌发酵液沉淀，获得湿菌泥；
(5)添加复合保护剂：按照湿菌泥：复合保护剂为(1～0.2)：(0.1～1)的重量比将湿菌泥和复合保护剂混合得到混合物；
(6)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-45℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述液体发酵培养基的成分包括8～15g胰蛋白胨、4～6g酵母浸粉、8～12g牛肉膏、1～5g硫酸铵、5～15g葡萄糖、1～5g可溶性淀粉、5～15g消化血清粉、1～5g醋酸钠、1～5g磷酸氢二钾、1～5g磷酸二氢钾、0.01～0.05g硫酸镁、1～5g碳酸钙、0.2～0.8g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述液体发酵培养基的成分还包括抗冻因子，所述抗冻因子选自甘露醇、谷氨酸钠、氯化钠中一种或多种。
本发明第三个方面提供了一种所述酪酸梭菌冻干粉在保健食品、医疗生物制剂中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明提供的酪酸梭菌冻干粉的抗冻能力强，在-45℃冻干40h仍能保持较高的活性，存活率高于79％，冻干粉活菌数大于8.6×108cfu/g，提高了酪酸梭菌的保藏期，有利于后期产品的加工、储藏及运输。
具体实施方式
以下通过具体实施方式说明本发明，但不局限于以下给出的具体实施例。
本发明第一个方面提供了一种酪酸梭菌冻干粉，其包括酪酸梭菌和复合保护剂。
酪酸梭菌
酪酸梭菌(Clostridium butyricum)又称酪酸梭状芽孢杆菌，酪酸杆菌，酪酸菌，丁酸梭状芽孢杆菌，丁酸梭菌，丁酸杆菌，酪酸梭菌是人的正常肠道菌之一，严格厌氧，为革兰阳性菌。由于产生的酪酸又叫丁酸，所以也被称为丁酸梭菌，丁酸杆菌或丁酸菌。
复合保护剂
真空冷冻干燥技术是制备和保存酪酸梭菌最有效的方法之一，可以很好的保持菌体的生物活性。在制备菌粉过程中，水分在真空和低温条件下不经过液态直接升华，菌株要经受冷冻和干燥两种激烈因素的作用，若是在不添加保护剂的情况下直接冷冻干燥，会造成微生物细胞膜通透性和流动性发生变化、胞内的动态平衡被破坏、酶蛋白分子钝化等，这势必会导致菌体的死亡，有研究表明，若是直接冷冻干燥，菌体存活率仅10％～30％左右。冷冻干燥过程中，影响微生物冻干存活率及菌粉活菌数的因素复杂，主要有菌株生理特性、培养基成分、培养条件、收获期、预冻条件、初始菌悬液浓度、冻干保护剂及其pH值、冷冻速率、残留水分、复水条件及亚致死处理等。其中，冻干保护剂是最复杂、最难选择的一个关键因素，目前，关于提高酪酸梭菌冻干存活率的方法也多集中在这一方面。冻干保护剂种类多样，按分子大小分为低分子和高分子化合物，根据其性质又可分为多元醇类、糖类、氨基酸类、蛋白质、肽类、聚合物类及其他类型的保护剂等。
在一种实施方式中，按重量份计，所述复合保护剂包括15～35份脱脂奶粉、5～23份碳水化合物、1～5份抗坏血酸。
在一种实施方式中，所述复合保护剂还包括2～10重量份菊粉。
在一种优选地实施方式中，按重量份计，所述复合保护剂包括18～30份脱脂奶粉、8～19份碳水化合物、1.5～4份抗坏血酸、4～8份菊粉。
在一种更优选地实施方式中，按重量份计，所述复合保护剂包括28份脱脂奶粉、12份碳水化合物、3份抗坏血酸、8份菊粉。
在一种实施方式中，所述复合保护剂还包括100重量份磷酸盐缓冲液。
在一种实施方式中，所述复合保护剂的制备方法包括：
(1)取100重量份磷酸盐缓冲液，将其平均分成三份，将脱脂奶粉溶解于一份磷酸盐缓冲液中，107℃灭菌15min，得A液；
(2)将海藻糖、菊粉、蔗糖溶解于另一份磷酸盐缓冲液中，110℃灭菌15min，得B液；
(3)将抗坏血酸溶解于剩余磷酸盐缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤除菌，得C液；
(4)将所制备的A液、B液及C液在无菌条件下混合，即得。
在一种实施方式中，得到的复合保护剂的pH为6.0～8.5。
<脱脂奶粉>
脱脂奶粉是将鲜牛奶脱去脂肪再干燥而成，除脂肪可降低至1％左右外，其他变化不大。脱脂奶粉为乳白色或淡黄色，具温和乳香且带甜味，不可有变质焦味及异臭，粉末状。
<碳水化合物>
碳水化合物(carbohydrate)是由碳、氢和氧三种元素组成，自然界存在最多、具有广谱化学结构和生物功能的有机化合物。可用通式Cx(H2O)y来表示。由于它所含的氢氧的比例为二比一，和水一样，故称为碳水化合物。它可以为人体提供热能的。食物中的碳水化合物分成两类：人可以吸收利用的有效碳水化合物和人不能消化的无效碳水化。
在一种实施方式中，所述碳水化合物选自蔗糖、麦芽糖、乳糖、麦芽三糖、海藻糖中一种或多种。
优选地，所述碳水化合物包括蔗糖和海藻糖。
优选地，所述蔗糖和海藻糖的重量比为1：(0.3～7.5)；进一步优选地，所述蔗糖和海藻糖的重量比为1：(0.7～4)；更优选地，所述蔗糖和海藻糖的重量比为1：2。
<抗坏血酸>
维生素C的结构类似葡萄糖，是一种多羟基化合物，其分子中第2及第3位上两个相邻的烯醇式羟基极易解离而释出H+，故具有酸的性质，又称抗坏血酸。维生素C具有很强的还原性，很容易被氧化成脱氢维生素C，但其反应是可逆的，并且抗坏血酸和脱氢抗坏血酸具有同样的生理功能，但脱氢抗坏血酸若继续氧化，生成二酮古乐糖酸，则反应不可逆而完全失去生理效能。
本申请人意外地发现，按重量份计，所述复合保护剂包括15～35份脱脂奶粉、5～25份碳水化合物、1～5份抗坏血酸，且碳水化合物包括蔗糖和海藻糖，其重量比为1：(0.3～7.5)，此时得到的酪酸梭菌在-45℃冻干40h仍能保持较高的活性，本申请人猜测可能的原因是海藻糖、蔗糖和抗坏血酸均含有较多的羟基，能够与酪酸梭菌表面的自由基结合，避免了其菌体暴露在环境中，且这些复合保护剂组分含有的羟基数呈阶梯变化，通过水合作用结合更多的羟基，降低了游离水的含量，延缓了冰晶核的生长，并使所形成的冰晶更小，降低了对菌体的破坏作用，从而起到保护作用。同时由于海藻糖、蔗糖和抗坏血酸之间存在不同维度的羟基数，能够与脱脂奶粉中的蛋白质形成稳定而密集的氢键，增强了其稳定性，使其更加充分地发挥作用。
<菊粉>
菊粉是植物中储备性多糖，主要来源于植物，已发现有36000多种，包括双子叶植物中的菊科、桔梗科、龙胆科等11个科及单子叶植物中的百合科、禾木科。例如，在菊芋、菊苣的块茎、天竺牡丹(大理菊)的块根、蓟的根中都含有丰富的菊粉，其中菊芋的菊粉含量是最高的。
菊粉分子约由31个β-D-呋喃果糖和1～2个吡喃菊糖残基聚合而成，果糖残基之间能通过β-2，1-键连接，是由D-果糖经β(1→2)糖苷键链接而成的线性直链多糖，末端常带有一个葡萄糖残基，聚合度(DP)为2～60，其中平均聚合度DP≤9的菊粉又称为短链菊粉，从天然植物中提取的菊粉同时含有长链与短链。菊粉的分子式表示为GFn，其中G代表终端葡萄糖单位，F代表果糖分子，n代表果糖的单位数。
本申请人意外地发现当复合保护剂添加2～10重量份菊粉时，在进一步提高抗冻性的基础上，还能够增强益生保健的功能，本申请人猜测可能的原因是菊粉的添加，能够调节肠道菌群平衡，同时维持酪酸梭菌细胞膜的通透性和完整性，防止胞内蛋白的泄露，还能使酪酸梭菌利用菊粉产生大量的生理活性物质-酪酸，激活了过氧化物酶系统，预防或治疗高血压、高血脂或肿瘤等，进一步提高了酪酸梭菌菌粉的益生保健功能。
本发明第二个方面提供了一种所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法，其包括下面步骤：
(1)菌种培养：培养酪酸梭菌至对数生长期末期或稳定期初期，芽孢率大于80％，获得酪酸梭菌发酵液；
(2)收集菌体：将酪酸梭菌发酵液沉淀，获得湿菌泥；
(3)添加复合保护剂：按照湿菌泥：复合保护剂为(1～0.2)：(0.1～1)的重量比将湿菌泥和复合保护剂混合得到混合物；
(4)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-45℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
在一种实施方式中，所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法，其包括下面步骤：
(1)菌种活化：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭菌菌种溶解在20～30mL无菌生理盐水中，振荡混匀后按照体积比为2％～6％的接种量接种于梭菌增菌液体培养基中，35～38℃条件下厌氧培养7～12h，再按照相同接种量、培养条件在梭菌增菌液体培养基中连续活化2代，获得第3代液体活化培养物；
(2)扩大培养：将得到的第3代活化培养物进行一级种子培养和二级种子培养获得二级种子液体培养物；
(3)菌种培养：将二级种子液体培养物按照体积比为2％～6％的接种量接种于液体发酵培养基中，35～38℃厌氧培养16～28h后，获得生长至对数生长期末期或稳定期初期且芽孢率大于80％的酪酸梭菌发酵液；
(4)收集菌体：将酪酸梭菌发酵液沉淀，获得湿菌泥；
(5)添加复合保护剂：按照湿菌泥：复合保护剂为(1～0.2)：(0.1～1)的重量比将湿菌泥和复合保护剂混合得到混合物；
(6)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-45℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
步骤(1)
在一种实施方式中，所述步骤(1)包括：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭菌菌种溶解在25mL无菌生理盐水中，振荡混匀后按照体积比为4％的接种量接种于梭菌增菌液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h，再按照相同接种量、培养条件在梭菌增菌液体培养基中连续活化2代，获得第3代液体活化培养物。
优选地，所述梭菌增菌液体培养基的成分包括：5～15g胰蛋白胨、5～15g牛肉膏、1～5g酵母浸粉、5～15g葡萄糖、1～5g玉米淀粉、2～6g氯化钠、1～5g乙酸钠、0.1～1g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
更优选地，所述梭菌增菌液体培养基的成分包括：10g胰蛋白胨、10g牛肉膏、3g酵母浸粉、10g葡萄糖、2g玉米淀粉、5g氯化钠、3g乙酸钠、0.5g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
步骤(2)
在一种实施方式中，所述步骤(2)包括：将第3代液体活化培养物按照体积比为2％～6％的接种量接种于一级种子液体培养基中，35～38℃条件下厌氧培养7～12h后，终止培养，得到一级种子液体培养物；将一级种子液体培养物按照体积比为2％～6％的接种量接种于二级种子液体培养基中，35～38℃条件下厌氧培养7～12h后，终止培养，得到二级种子液体培养物。
优选地，所述步骤(2)包括：将第3代液体活化培养物按照体积比为4％的接种量接种于一级种子液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h后，终止培养，得到一级种子液体培养物；将一级种子液体培养物按照体积比为4％的接种量接种于二级种子液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h后，终止培养，得到二级种子液体培养物。
在一种实施方式中，所述一级种子液体培养基的成分和二级种子液体培养基的成分可以相同也可以不同，其分别独立地包括：8～15g胰蛋白胨、4～8g酵母浸粉、5～15g牛肉膏、5～15g葡萄糖、1～5g硫酸铵、2～6g氯化钠、1～5g磷酸氢二钾、0.01～0.05g硫酸镁、0.1～1g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
优选地，所述一级种子液体培养基的成分和二级种子液体培养基的成分相同，包括：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g牛肉膏、10g葡萄糖、2g硫酸铵、4g氯化钠、3g磷酸氢二钾、0.02g硫酸镁、0.5g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
步骤(3)
在一种实施方式中，所述步骤(3)包括：将二级种子液体培养物按照体积比为4％的接种量接种于液体发酵培养基中，37℃厌氧培养24h后，获得生长至对数生长期末期或稳定期初期且芽孢率大于80％的酪酸梭菌。
在一种实施方式中，所述液体发酵培养基的成分包括：8～15g胰蛋白胨、4～6g酵母浸粉、8～12g牛肉膏、1～5g硫酸铵、5～15g葡萄糖、1～5g可溶性淀粉、5～15g消化血清粉、1～5g醋酸钠、1～5g磷酸氢二钾、1～5g磷酸二氢钾、0.01～0.05g硫酸镁、1～5g碳酸钙、0.2～0.8g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
优选地，所述液体发酵培养基的成分包括：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g牛肉膏、2g硫酸铵、10g葡萄糖、2g可溶性淀粉、10g消化血清粉、2.5g醋酸钠、3g磷酸氢二钾、3g磷酸二氢钾、0.02g硫酸镁、2g碳酸钙、0.5g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
在一种实施方式中，所述液体发酵培养基的成分还包括抗冻因子，所述抗冻因子选自甘露醇、谷氨酸钠、氯化钠中一种或多种。
优选地，所述抗冻因子包括甘露醇、谷氨酸钠以及氯化钠。
在一种实施方式中，按重量份计，所述抗冻因子包括0.05～4份甘露醇、0.02～1.8份谷氨酸钠、0.25～10份氯化钠。
优选地，按重量份计，所述抗冻因子包括0.08～4份甘露醇、0.04～1.2份谷氨酸钠、0.5～10份氯化钠；更优选地，所述抗冻因子包括3份甘露醇、1份谷氨酸钠、8份氯化钠。
在一种实施方式中，将甘露醇、谷氨酸钠和氯化钠溶解于50mL蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌后，在无菌室中，再加入到液体发酵培养基中。
本申请人发现需要添加过多的复合保护剂才能提高酪酸梭菌的存活率，然而复合保护剂的添加量越多，单位质量冻干粉活菌数就越低，而本申请人意外的发现添加一定量的抗冻因子，特别是抗冻因子包括甘露醇、谷氨酸钠、氯化钠，且按重量份计，抗冻因子包括0.05～4份甘露醇、0.02～1.8份谷氨酸钠、0.25～10份氯化钠时，可以使得在湿菌泥和复合保护剂的重量比为(1～0.2：(0.1～1)时保证了酪酸梭菌在-45℃冻干40h的存活率，还能保证了单位质量冻干粉中活菌数。本申请人认为可能的原因是一方面氯化钠提高了培养基的渗透压，改变了罗酸梭菌细胞膜的物理性能，提高其抗冻效果，而谷氨酸钠有效抑制杂菌的生长繁殖，促进芽孢的产生，另一方面甘露醇的存在，使得湿菌泥在冻干的过程中，与海藻糖共同作用，提高脱脂奶粉的稳定性，另外通过束缚水分子，降低“共晶点”温度，减少冰晶体的形成量，隔离和减缓蛋白质聚集，防止蛋白质凝聚变性，使得在冻干过程中，整体体系处于稳定的状态，从而使得抗冻因子和复合保护剂对酪酸梭菌产生协同保护作用，解决了开发高活性酪酸梭菌冻干菌粉过程中的关键技术问题。
步骤(4)
在一种实施方式中，所述步骤(4)包括：在离心机上于4℃、6500rpm转速条件下离心酪酸梭菌发酵液，离心时间为10～20min，弃上清，获得湿菌泥。
优选地，所述步骤(4)包括：在离心机上于4℃、6500rpm转速条件下离心酪酸梭菌发酵液，离心时间为15min，弃上清，获得湿菌泥。
步骤(5)
在一种实施方式中，所述步骤(5)包括：按照湿菌泥：复合保护剂为1：1的重量比将湿菌泥和复合保护剂混合得到混合物。
步骤(6)
在一种实施方式中，所述步骤(6)包括：将混合物于37℃平衡35min，-45℃预冻6h，然后在5Pa下冷冻干燥22h，即得。
本发明得到的所述酪酸梭菌冻干粉中酪酸梭菌的存活率大于79％，活菌含量大于8.6×108cfu/g。
本发明第三个方面提供了一种所述酪酸梭菌冻干粉在保健食品、医疗生物制剂中的应用。
本发明所述重量份标准相同。
实施例
在下文中，通过实施例对本发明进行更详细地描述，但应理解，这些实施例仅仅是示例的而非限制性的。如果没有其它说明，下面实施例所用原料都是市售的。
实施例1
本发明的实施例1提供了一种酪酸梭菌冻干粉，其包括酪酸梭菌和复合保护剂。
按重量份计，所述复合保护剂为20份脱脂奶粉、11份碳水化合物、3.5份抗坏血酸、8份菊粉、100份磷酸盐缓冲液。
所述保护剂的pH为7。
所述碳水化合物为蔗糖和海藻糖，其重量比为1：0.83。
所述复合保护剂的制备方法为下面步骤：
(1)取100重量份磷酸盐缓冲液，将其平均分成三份，将脱脂奶粉溶解于一份磷酸盐缓冲液中，107℃灭菌15min，得A液；
(2)将海藻糖、菊粉、蔗糖溶解于另一份磷酸盐缓冲液中，110℃灭菌15min，得B液；
(3)将抗坏血酸溶解于剩余磷酸盐缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤除菌，得C液；
(4)将所制备的A液、B液及C液在无菌条件下混合，即得。
所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法，其包括下面步骤：
(1)在无菌室中，将低温保存的酪酸梭菌菌种溶解在25mL无菌生理盐水中，振荡混匀后按照体积比为4％的接种量接种于梭菌增菌液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h，再按照相同接种量、培养条件在梭菌增菌液体培养基中连续活化2代，获得第3代液体活化培养物；
(2)将第3代液体活化培养物按照体积比为4％的接种量接种于一级种子液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h后，终止培养，得到一级种子液体培养物；将一级种子液体培养物按照体积比为4％的接种量接种于二级种子液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h后，终止培养，得到二级种子液体培养物；
(3)将二级种子液体培养物按照体积比为4％的接种量接种于液体发酵培养基中，37℃厌氧培养24h后，获得生长至对数生长期末期且芽孢率大于80％的酪酸梭菌；
(4)在离心机上于4℃、6500rpm转速条件下离心酪酸梭菌发酵液，离心时间为15min，弃上清，获得湿菌泥；
(5)按照湿菌泥：按照湿菌泥：复合保护剂为3：1的重量比将湿菌泥和复合保护剂混合得到混合物；
(6)将混合物于37℃平衡35min，-45℃预冻6h，然后在5Pa下冷冻干燥20h，即得。
所述梭菌增菌液体培养基的成分为：10g胰蛋白胨、10g牛肉膏、3g酵母浸粉、10g葡萄糖、2g玉米淀粉、5g氯化钠、3g乙酸钠、0.5g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
所述一级种子液体培养基的成分和二级种子液体培养基的成分相同，分别为：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g牛肉膏、10g葡萄糖、2g硫酸铵、4g氯化钠、3g磷酸氢二钾、0.02g硫酸镁、0.5g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
所述液体发酵培养基的成分为：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g牛肉膏、2g硫酸铵、10g葡萄糖、2g可溶性淀粉、10g消化血清粉、2.5g醋酸钠、3g磷酸氢二钾、3g磷酸二氢钾、0.02g硫酸镁、2g碳酸钙、0.5g L-半胱氨酸、2.5g甘露醇、0.5g谷氨酸钠、4g氯化钠，蒸馏水1000mL。
将甘露醇、谷氨酸钠和氯化钠溶解于50mL蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌后，在无菌室中，再加入到液体发酵培养基中。
所述酪酸梭菌冻干粉可应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例2
本发明的实施例2提供了一种酪酸梭菌冻干粉，其包括酪酸梭菌和复合保护剂。
按重量份计，所述复合保护剂为28份脱脂奶粉、12份碳水化合物、3份抗坏血酸、8份菊粉、100份磷酸盐缓冲液。
所述保护剂的pH为7。
所述碳水化合物为蔗糖和海藻糖，其重量比为1：2。
所述复合保护剂的制备方法为下面步骤：
(1)取100重量份磷酸盐缓冲液，将其平均分成三份，将脱脂奶粉溶解于一份磷酸盐缓冲液中，107℃灭菌15min，得A液；
(2)将海藻糖、菊粉、蔗糖溶解于另一份磷酸盐缓冲液中，110℃灭菌15min，得B液；
(3)将抗坏血酸溶解于剩余磷酸盐缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤除菌，得C液；
(4)将所制备的A液、B液及C液在无菌条件下混合，即得。
所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法，其包括下面步骤：
(1)在无菌室中，将低温保存的酪酸梭菌菌种溶解在25mL无菌生理盐水中，振荡混匀后按照体积比为4％的接种量接种于梭菌增菌液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h，再按照相同接种量、培养条件在梭菌增菌液体培养基中连续活化2代，获得第3代液体活化培养物；
(2)将第3代液体活化培养物按照体积比为4％的接种量接种于一级种子液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h后，终止培养，得到一级种子液体培养物；将一级种子液体培养物按照体积比为4％的接种量接种于二级种子液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h后，终止培养，得到二级种子液体培养物；
(3)将二级种子液体培养物按照体积比为4％的接种量接种于液体发酵培养基中，37℃厌氧培养24h后，获得生长至对数生长期末期且芽孢率大于80％的酪酸梭菌；
(4)在离心机上于4℃、6500rpm转速条件下离心酪酸梭菌发酵液，离心时间为15min，弃上清，获得湿菌泥；
(5)按照湿菌泥：按照湿菌泥：复合保护剂为1：1的重量比将湿菌泥和复合保护剂混合得到混合物；
(6)将混合物于37℃平衡35min，-45℃预冻6h，然后在5Pa下冷冻干燥22h，即得。
所述梭菌增菌液体培养基的成分为：10g胰蛋白胨、10g牛肉膏、3g酵母浸粉、10g葡萄糖、2g玉米淀粉、5g氯化钠、3g乙酸钠、0.5g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
所述一级种子液体培养基的成分和二级种子液体培养基的成分相同，分别为：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g牛肉膏、10g葡萄糖、2g硫酸铵、4g氯化钠、3g磷酸氢二钾、0.02g硫酸镁、0.5g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
所述液体发酵培养基的成分为：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g牛肉膏、2g硫酸铵、10g葡萄糖、2g可溶性淀粉、10g消化血清粉、2.5g醋酸钠、3g磷酸氢二钾、3g磷酸二氢钾、0.02g硫酸镁、2g碳酸钙、0.5g L-半胱氨酸、3g甘露醇、1g谷氨酸钠、8g氯化钠，蒸馏水1000mL。
将甘露醇、谷氨酸钠和氯化钠溶解于50mL蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌后，在无菌室中，再加入到液体发酵培养基中。
所述酪酸梭菌冻干粉可应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例3
本发明的实施例3提供了一种酪酸梭菌冻干粉，其包括酪酸梭菌和复合保护剂。
按重量份计，所述复合保护剂为25份脱脂奶粉、13份碳水化合物、2份抗坏血酸、5份菊粉、100份磷酸盐缓冲液。
所述保护剂的pH为7。
所述碳水化合物为蔗糖和海藻糖，其重量比为1：3.3。
所述复合保护剂的制备方法为下面步骤：
(1)取100重量份磷酸盐缓冲液，将其平均分成三份，将脱脂奶粉溶解于一份磷酸盐缓冲液中，107℃灭菌15min，得A液；
(2)将海藻糖、菊粉、蔗糖溶解于另一份磷酸盐缓冲液中，110℃灭菌15min，得B液；
(3)将抗坏血酸溶解于剩余磷酸盐缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤除菌，得C液；
(4)将所制备的A液、B液及C液在无菌条件下混合，即得。
所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法，其包括下面步骤：
(1)在无菌室中，将低温保存的酪酸梭菌菌种溶解在25mL无菌生理盐水中，振荡混匀后按照体积比为4％的接种量接种于梭菌增菌液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h，再按照相同接种量、培养条件在梭菌增菌液体培养基中连续活化2代，获得第3代液体活化培养物；
(2)将第3代液体活化培养物按照体积比为4％的接种量接种于一级种子液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h后，终止培养，得到一级种子液体培养物；将一级种子液体培养物按照体积比为4％的接种量接种于二级种子液体培养基中，37℃条件下厌氧培养8h后，终止培养，得到二级种子液体培养物；
(3)将二级种子液体培养物按照体积比为4％的接种量接种于液体发酵培养基中，37℃厌氧培养24h后，获得生长至对数生长期末期且芽孢率大于80％的酪酸梭菌；
(4)在离心机上于4℃、6500rpm转速条件下离心酪酸梭菌发酵液，离心时间为15min，弃上清，获得湿菌泥；
(5)按照湿菌泥：按照湿菌泥：复合保护剂为1：2的重量比将湿菌泥和复合保护剂混合得到混合物；
(6)将混合物于37℃平衡35min，-45℃预冻6h，然后在5Pa下冷冻干燥24h，即得。
所述梭菌增菌液体培养基的成分包括：10g胰蛋白胨、10g牛肉膏、3g酵母浸粉、10g葡萄糖、2g玉米淀粉、5g氯化钠、3g乙酸钠、0.5g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
所述一级种子液体培养基的成分和二级种子液体培养基的成分相同，分别为：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g牛肉膏、10g葡萄糖、2g硫酸铵、4g氯化钠、3g磷酸氢二钾、0.02g硫酸镁、0.5g L-半胱氨酸、4g甘露醇、0.8g谷氨酸钠、10g氯化钠，蒸馏水1000mL。
所述液体发酵培养基的成分为：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g牛肉膏、2g硫酸铵、10g葡萄糖、2g可溶性淀粉、10g消化血清粉、2.5g醋酸钠、3g磷酸氢二钾、3g磷酸二氢钾、0.02g硫酸镁、2g碳酸钙、0.5g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
将甘露醇、谷氨酸钠和氯化钠溶解于50mL蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌后，在无菌室中，再加入到液体发酵培养基中。
所述酪酸梭菌冻干粉可应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例4
本发明的实施例4提供了一种酪酸梭菌冻干粉，其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，所述复合保护剂无菊粉。
所述复合保护剂的制备方法其具体实施方式同实施例2。
所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例2。
实施例5
本发明的实施例5提供了一种酪酸梭菌冻干粉，其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，所述复合保护剂中碳水化合物为海藻糖。
所述复合保护剂的制备方法其具体实施方式同实施例2。
所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例2。
实施例6
本发明的实施例6提供了一种酪酸梭菌冻干粉，其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，所述复合保护剂无抗坏血酸。
所述复合保护剂的制备方法其具体实施方式同实施例2。
所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例2。
实施例7
本发明的实施例7提供了一种酪酸梭菌冻干粉，其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，所述液体发酵培养基中无抗冻因子。
所述复合保护剂的制备方法其具体实施方式同实施例2。
所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例2。
实施例8
本发明的实施例8提供了一种酪酸梭菌冻干粉其具体实施方式同实施例2。
所述复合保护剂的制备方法其具体实施方式同实施例2。
所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，所述液体发酵培养基中抗冻因子无谷氨酸钠。
实施例9
本发明的实施例9提供了一种酪酸梭菌冻干粉其具体实施方式同实施例2。
所述复合保护剂的制备方法其具体实施方式同实施例2。
所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，所述液体发酵培养基中抗冻因子无甘露醇。
实施例10
本发明的实施例10提供了一种酪酸梭菌冻干粉，其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，所述复合保护剂无磷酸盐缓冲液。
所述复合保护剂的制备方法其具体实施方式同实施例2。
所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例2。
实施例10
本发明的实施例10提供了一种酪酸梭菌冻干粉，其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，无复合保护剂。
所述复合保护剂的制备方法其具体实施方式同实施例2。
所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例2，不同之处在于，所述液体发酵培养基中无抗冻因子。
性能评估
1.冻干粉活菌数：分别将实施例1～10得到的冻干粉样品混匀，各取1g冻干粉使用灭菌生理盐水依次连续稀释至10-8，分别取100μL稀释液涂布至酪酸梭菌固体培养基上，37℃条件下进行厌氧培养24h，然后计算每克活菌数(cfu/g表示)，其中，酪酸梭菌固体培养基的成分为：胰蛋白胨10.0g、大豆胨3.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏5.0g、消化血清粉13.5g、葡萄糖3.0g、磷酸二氢钾2.5g、氯化钠3.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g、硫乙醇酸钠0.3g、琼脂粉18g，蒸馏水1000mL，酪酸梭菌固体培养基成分在115℃灭菌15min后使用。
2.存活率：实施例1～10得到的冻干粉的存活率按照下面公式进行计算：存活率(％)＝冻干后活菌数/冻干前活菌数×100％。
3.产酸能力：分别将实施例1～10得到的冻干粉样品混匀，各取1g冻干粉使用灭菌生理盐水依次连续稀释至10-8，分别取100μL稀释液涂布至酪酸梭菌固体培养基上，于37℃条件下厌氧培养24h，测定产酸的含量，根据其含量，产酸能力以A、B、C、D四个等级计，产酸能力依次递减，其中酪酸梭菌固体培养基的成分同冻干粉活菌数测试中的酪酸梭菌固体培养基的成分。
表1
Figure BDA0002553163950000171
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种酪酸梭菌冻干粉，其特征在于，其包括酪酸梭菌和复合保护剂，按重量份计，所述复合保护剂包括15～35份脱脂奶粉、5～23份碳水化合物、1～5份抗坏血酸。
2.根据权利要求1所述酪酸梭菌冻干粉，其特征在于，所述碳水化合物选自蔗糖、麦芽糖、乳糖、麦芽三糖、海藻糖中一种或多种。
3.根据权利要求2所述酪酸梭菌冻干粉，其特征在于，所述碳水化合物包括蔗糖和海藻糖，其重量比为1：(0.3～7.5)。
4.根据权利要求1所述酪酸梭菌冻干粉，其特征在于，所述复合保护剂还包括2～10重量份菊粉。
5.根据权利要求1～4任一项所述酪酸梭菌冻干粉，其特征在于，所述酪酸梭菌冻干粉中酪酸梭菌的存活率大于79％，活菌含量大于8.6×108cfu/g。
6.一种根据权利要求1～5任一项所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法，其特征在于，其包括下面步骤：
(1)菌种培养：培养酪酸梭菌至对数生长期末期或稳定期初期，芽孢率大于80％，获得酪酸梭菌发酵液；
(2)收集菌体：将酪酸梭菌发酵液沉淀，获得湿菌泥；
(3)添加复合保护剂：按照湿菌泥：复合保护剂为(1～0.2)：(0.1～1)的重量比将湿菌泥和复合保护剂混合得到混合物；
(4)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-45℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
7.根据权利要求6所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法，其特征在于，其包括下面步骤：
(1)菌种活化：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭菌菌种溶解在20～30mL无菌生理盐水中，振荡混匀后按照体积比为2％～6％的接种量接种于梭菌增菌液体培养基中，35～38℃条件下厌氧培养7～12h，再按照相同接种量、培养条件在梭菌增菌液体培养基中连续活化2代，获得第3代液体活化培养物；
(2)扩大培养：将得到的第3代活化培养物进行一级种子培养和二级种子培养获得二级种子液体培养物；
(3)菌种培养：将二级种子液体培养物按照体积比为2％～6％的接种量接种于液体发酵培养基中，35～38℃厌氧培养16～28h后，获得生长至对数生长期末期或稳定期初期且芽孢率大于80％的酪酸梭菌发酵液；
(4)收集菌体：将酪酸梭菌发酵液沉淀，获得湿菌泥；
(5)添加复合保护剂：按照湿菌泥：复合保护剂为(1～0.2)：(0.1～1)的重量比将湿菌泥和复合保护剂混合得到混合物；
(6)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-45℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
8.根据权利要求7所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述液体发酵培养基的成分包括：8～15g胰蛋白胨、4～6g酵母浸粉、8～12g牛肉膏、1～5g硫酸铵、5～15g葡萄糖、1～5g可溶性淀粉、5～15g消化血清粉、1～5g醋酸钠、1～5g磷酸氢二钾、1～5g磷酸二氢钾、0.01～0.05g硫酸镁、1～5g碳酸钙、0.2～0.8g L-半胱氨酸，蒸馏水1000mL。
9.根据权利要求8所述酪酸梭菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述液体发酵培养基的成分还包括抗冻因子，所述抗冻因子选自甘露醇、谷氨酸钠、氯化钠中一种或多种。
10.一种根据权利要求1～5任一项所述酪酸梭菌冻干粉在保健食品、医疗生物制剂中的应用。
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