CN104854233B

CN104854233B - 制备团聚的微生物培养基及其组合物的方法

Info

Publication number: CN104854233B
Application number: CN201380042226.1A
Authority: CN
Inventors: 刘杰; 夏文胜
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Current assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2013-07-22
Publication date: 2018-11-27
Anticipated expiration: 2033-07-22
Also published as: KR20150038573A; JP2015524280A; CN104854233A; WO2014025514A1; EP2882842A1; EP2882842B1; EP3505617A1; KR102058491B1; BR112015002686A2; JP2019071890A; JP6739512B2; US20150225691A1; JP6488233B2

Abstract

本公开提供了一种制备可流动的团聚营养培养基的方法。该方法包括通过将粉状营养物质放置到流化床型团聚腔室中，使流化气体流过腔室并且在团聚腔室中使粉状营养物质与团聚液体的气溶胶喷雾接触来形成营养培养基组合物；以及从腔室中收集组合物。营养组分促进微生物的生长。由该方法形成的组合物包含团聚营养培养基颗粒的群体和任选地非团聚的粉状营养物质。该群体包含至少约30重量百分比的具有约250‑400微米的有效粒径的团聚营养物质颗粒。本公开还提供了组合物、薄膜培养装置和包含可流动的干燥团聚营养培养基的试剂盒。

Description

制备团聚的微生物培养基及其组合物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求在2012年8月7日提交的美国临时专利申请61/680,449和在2013年3月7日提交的美国临时专利申请61/773,852的权益，所述临时专利申请全文以引用方式并入本文。

背景技术

已使用营养培养基制剂培养包括动物、植物和微生物细胞的多个细胞类型。在培养基中培养的细胞，代谢可用的营养物质并且产生有用的生物物质，诸如单克隆抗体、激素、生长因子、病毒等。此类产物具有治疗应用并且随着重组DNA技术的出现，细胞可被工程改造以产生大量的这些产物。因此，体外培养细胞的能力不仅对细胞生理学的研究是重要的，而且对原本可能不能通过成本有效的手段获得的有用物质的生产是必要的。

微生物培养基的典型组分可包括蛋白质水解产物、无机盐、维生素、痕量金属和碳水化合物，所述物质的类型和量可根据所给定的微生物菌种的特定要求而变化。因为这些组分趋于在脱水形式时更加稳定，所以它们经常提供为干燥的粉状制剂。将粉状制剂添加到水中，并且任选地，在使用前灭菌。

通常以液体形式或以粉状形式生产培养基。这些形式中的每个都具有特定的优点和缺点。

例如，液体培养基具有的优点在于其以即用型形式被提供(除非必须用营养物质或其它组分补充)，并且已针对特定细胞类型对制剂进行优化。然而，液体培养基具有的缺点在于它们可能需要添加补充剂(例如，维生素或辅因子以及抗生素)以在培养特定微生物时性能最佳。此外，大多数液体培养基需要一些类型的灭菌(例如高压灭菌、过滤)，这可为耗时和/或昂贵的过程。

为了克服一些缺点，可以浓缩形式制备液体培养基；可在使用之前将浓缩物稀释至工作浓度。相比于使用标准培养基，此方法提供了制备更大并且可变的批量大小的能力，并且浓缩的培养基制剂或其组分通常具有更长的保质期。美国专利5,474,931涉及培养基浓缩技术并且全文以引用方式并入本文。然而，除了这些优点，浓缩的液体培养基仍具有需要添加补充剂的缺点，并且经济地灭菌可能是困难的。

作为液体培养基的替代形式，通常使用粉状培养基。此方法具有的优点在于可生产较大的批量大小，粉状培养基通常具有比液体培养基更长的保质期，并且在配制后，可通过照射(例如，γ或紫外线照射)或环氧乙烷渗透将培养基灭菌。但是，粉状培养基具有若干缺点。例如，在冻干时，粉状培养基的一些组分变得不溶解或聚集，使得再溶解是困难或不可能的。此外，粉状培养基通常包含细尘颗粒，这可使得它们尤其难以在没有一些材料损耗的情况下转移和/或复水，并且这还可使得在一些环境中使用它们是不切实际的。

尽管在可再水化的培养基中取得了进展，但仍存在对快速溶解营养复合的稳定干燥粉状营养培养基和培养基补充剂的需要，所述培养基和培养基补充剂可以可变的大批量制备，并且可适于灭菌。

发明内容

本公开一般涉及用于促进微生物(例如，细菌、酵母、霉菌)生长的营养培养基。具体地，本公开提供团聚一种或多种粉状营养组分以产生干燥的团聚营养培养基的方法。该方法包括工艺条件，所述工艺条件提供具有所选择的化学组成、尺寸、密度、水含量或前述特性中任何两种或更多种的组合的团聚颗粒。在另一方面，本公开还提供一种包含根据本文所公开的任何方法制备的干燥的团聚营养培养基的组合物。在另一方面，本公开提供了包含本文所公开的任何干燥团聚营养组合物的制品和试剂盒。

有利地，本公开的组合物具有有利于通过含水溶剂润湿颗粒表面的化学组成。更有利地，本公开的组合物具有经过选择以有利于颗粒浸没在含水溶剂中的密度(例如，堆密度)。甚至更有利地，本公开的干燥团聚的营养培养基具有经过选择以有利于颗粒快速溶解于含水溶剂中的粒度分布。

在一个方面，本公开提供一种制备可流动的团聚营养培养基的方法。该方法可包括通过将粉状营养物质放置到流化床型团聚腔室中，使流化气体流过腔室并且在团聚腔室中使粉状营养物质与团聚液体的气溶胶喷雾接触来形成营养培养基组合物；以及从腔室中收集组合物；其中组合物包含团聚的营养培养基颗粒群体和任选地非团聚的粉状营养物质；其中群体包含至少约30重量百分比的具有约250-400微米的有效粒径的团聚营养物质颗粒。粉状营养物质包含促进微生物生长的营养组分。在该方法的任何实施例中，群体中至少约70重量百分比的颗粒可具有约105-841微米的有效粒径。在以上实施例的任一个中，群体中少于10重量百分比的颗粒可具有约105微米或更小的有效粒径。

在以上实施例的任一个中，该方法还可包括分离团聚营养培养基颗粒的亚群，该亚群具有预定的有效粒径。在一些实施例中，分离亚群可包括分离具有约149微米至约841微米的有效粒径的亚群。在以上实施例的任一个中，团聚液体可包含具有粘结剂和/或促进溶解于其中的微生物的生长的营养物质的溶剂。在以上实施例的任一个中，放置粉状营养物质可包括放置预定质量的粉状营养物质。在以上实施例的任一个中，使粉状营养物质与团聚液体的气溶胶喷雾接触可包括使粉状营养物质与预定体积的团聚液体接触。在以上实施例的任一个中，团聚营养培养基颗粒的群体可具有约5.5重量百分比或更少的平均水含量。

在以上实施例的任一个中，团聚营养培养基颗粒的群体可具有约0.2至约0.5克/立方厘米的松散的堆密度。在以上实施例的任一个中，一种或多种粉状营养物质可包含选自蛋白质水解产物、碳水化合物、盐以及上述粉状营养物质中任何两种或更多种的混合物的营养物质。在以上实施例的任一个中，该方法还可包括使干燥团聚的营养培养基经受减少干燥团聚的营养培养基中活微生物数目的处理。在一些实施例中，使干燥团聚的营养培养基经受减少活微生物数目的处理可包括将干燥团聚的营养培养基暴露于电离辐射或环氧乙烷蒸气。在以上实施例的任一个中，粉状营养物质可选自：再水化时形成缓冲蛋白胨水培养基的粉末的混合物；再水化时形成胰酪胨大豆液体培养基(trypticase soy broth)的粉末的混合物；以及再水化时形成乳糖液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成UVM改良的李斯特氏菌属富集液体培养基(UVM modified Listeria enrichment broth)的粉末的混合物；再水化时形成李斯特氏菌属富集液体培养基(Listeria Enrichment broth)的粉末的混合物；再水化时形成胰酪胨大豆酵母提取物液体培养基(Trypticase soy yeastextract broth)的粉末的混合物；再水化时形成氯化镁孔雀绿富集液体培养基(Rappaport-Vassiliadis enrichment broth)的粉末的混合物；再水化时形成氯化镁孔雀绿R10液体培养基(Rappaport-Vassiliadis R10broth)的粉末的混合物；再水化时形成亚硒酸盐-胱氨酸液体培养基(Selenite-Cystine broth)的粉末的混合物；再水化时形成EC液体培养基(EC broth)的粉末的混合物；再水化时形成营养液体培养基(Nutrient broth)的粉末的混合物；再水化时形成Letheen液体培养基(Letheen broth)的粉末的混合物；再水化时形成Dey/Engley中和液体培养基(Dey/Engley Neutralizing broth)的粉末的混合物；再水化时形成中和液体培养基(Neutralizing broth)的粉末的混合物；再水化时形成亚硒酸盐液体培养基(Selenite broth)的粉末的混合物；再水化时形成脑心浸萃液体培养基(Brain Heart Infusion broth)的粉末的混合物；再水化时形成半强度Demi-Fraser液体培养基(half-strength Demi-Fraser broth)的粉末的混合物；再水化时形成Fraser液体培养基(Frasier broth)的粉末的混合物；以及再水化时形成Demi-Fraser液体培养基(Demi-Fraser broth)的粉末的混合物。

在另一方面，本公开提供了一种组合物。该组合物可包含通过以上方法中的任一个生产的可流动的干燥团聚营养培养基。在组合物的任何实施例中，指定质量的干燥团聚营养培养基比相等质量的由其制备团聚营养培养基的粉状营养物质在含水溶剂中溶解得更快。

在另一方面，本公开提供一种组合物。该组合物可包含团聚的营养培养基，所述培养基包含当与含水介质混合时形成促进微生物生长的混合物的团聚颗粒，其中群体中至少约30重量百分比的颗粒具有约250-400微米的有效粒径，其中堆颗粒密度为约0.2至约0.5克/立方厘米。在任何实施例中，群体中至少约70重量百分比的颗粒可具有约105-841微米的有效直径。

在组合物的以上实施例的任一个中，团聚的营养培养基可包含粉状营养物质，其中粉状营养物质选自：再水化时形成缓冲蛋白胨水培养基的粉末的混合物；再水化时形成胰酪胨大豆液体培养基的粉末的混合物；以及再水化时形成乳糖液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成UVM改良的李斯特氏菌属富集液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成缓冲李斯特氏菌属富集液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成胰酪胨大豆酵母提取物液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成氯化镁孔雀绿富集液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成氯化镁孔雀绿R10液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成亚硒酸盐-胱氨酸液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成EC液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成营养液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成Letheen液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成Dey/Engley中和液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成中和液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成亚硒酸盐液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成脑心浸萃液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成半强度Demi-Fraser液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成Fraser液体培养基的粉末的混合物；以及再水化时形成Demi-Fraser液体培养基的粉末的混合物。

在另一方面，本公开提供了一种包含以上实施例的任一个的组合物的胶囊、片剂或小袋。

在另一方面，本发明提供一种试剂盒。该试剂盒可包括以上实施例中的任一个的胶囊、片剂、小袋和/或组合物。在试剂盒的任何实施例中，组合物可设置在包含预定质量的干燥团聚的营养培养基的包装中，其中预定质量经过选择以与9.9mL、10mL、90mL、99mL、100mL、225mL、1.0L或3.375L的含水稀释剂混合以产生能够促进微生物生长的复水的培养基。在以上实施例的任一个中，试剂盒还可包括选自袋、瓶和样品采集装置的制品。在以上实施例的任一个中，试剂盒还可包含选择剂/或指示试剂。

在另一方面，本公开提供一种薄膜培养装置。薄膜培养装置可包括具有第一主表面和第二主表面的自支承防水基材；设置在第一主表面的至少一部分上的粘合剂层；包含以上实施例中任一个的组合物的涂层，所述组合物设置在粘合剂层的至少一部分上；以及被定位用于与营养培养基流体接触的干燥的冷水可溶性胶凝剂。在薄膜培养装置的以上实施例的任一个中，装置还可包括联接至基材的至少一部分的覆盖片，覆盖片具有面向第一主表面的第一侧。

词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施例。然而，在相同的情况或其它情况下，其它实施例也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的表述并不暗示其它实施例不是可用的，并且并非旨在从本发明的范围中排除其它实施例。

当术语“包括”及其变型在说明书和权利要求书中出现时，这些术语并不具有限制性含义。

如本文所用，“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种或多种(一个或多个)”可互换使用。因此，例如“一种(个)”颗粒可被解释为意指“一种或多种(一个或多个)”颗粒。

术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或更多个的组合。

另外，本文通过端点表述的数值范围包括范围内包含的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

本发明的上述发明内容并不旨在描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方式。以下描述更具体地例示了示例性实施例。在本专利申请全文的若干地方，通过实例列表提供指导，实例可用于多种组合中。在每一种情形下，所列举的列表仅仅作为代表性群组，而不应被理解为排他性列表。

下面将结合附图和具体实施方式介绍这些及其它实施例的更多细节。通过具体实施方式、附图和权利要求书，其它特征、对象和优点将变得明显。

附图说明

图1为根据本公开的薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。

具体实施方式

在详细说明本公开的任何实施例之前，应当理解，本发明的应用并不限于在下文提及的构造细节和部件布置。本发明可以具有其它实施例，并且能够以各种方式实践或实施。还应当理解，本文所用的措辞和术语的目的在于描述，而不应当被视作具有限制性。本文中所用的“包括”、“包含”或“具有”以及它们的变化形式意在涵盖其后所列举的项目及其等同项目以及附加项目。应理解，其它的实施例也可采用，并且可在不偏离本发明范围的情况下作出结构变化或逻辑变化。

如本文所用，术语“堆密度”、“松散的堆密度”和“表观密度”可互换地指未夯实的堆密度值。本文所指的堆密度和表观密度可通过用于测定未夯实的堆密度的常规方法诸如例如本文实例中描述的“松散的堆密度”方法来测量。

如本文所用，术语“团聚颗粒”是指由初级颗粒接合或粘结在一起形成的颗粒，所述初级颗粒的初始身份(identity)在最终团聚形式中仍可辨别。

本文所指的所有有效粒度(即“有效粒径”)是基于由美国标准局制定的美国标准筛制规范(参见例如http://www.wirecloth.com/howto/convert/ussieve.html)。因此，例如，具有约400微米的有效粒径的颗粒将穿过具有400微米的指定开口的40目筛网，并且将被具有354微米的指定开口的45目筛网保留。

一般来讲，本公开涉及由水溶性粉末制成的可流动的干燥团聚颗粒以及一种制备所述团聚物的方法。在一些实施例中，该方法可用于制备用于促进微生物生长的营养培养基。与由其制备团聚颗粒的粉末的至少一种相比，并且与其它团聚颗粒组合物相比，本发明的团聚颗粒群体有利地具有两个高度期望的特性：1)当被倾倒到含水液体的表面上时，团聚颗粒快速(即，立即或几乎立即)并且基本上定量地沉到含水液体的表面下方，以及2)团聚颗粒快速溶解于含水液体中。不受理论的约束，据信，这些高度期望的特性是由平均尺寸、孔隙率、表面积、密度和/或存在于根据本公开生产的团聚颗粒的群体中的上述物理属性中两种或更多种的独特组合造成的。因此，在一个方面，本公开提供一种营养培养基，该营养培养基在几乎没有或没有手动或机械搅拌的情况下，快速分散并溶解于含水液体中。

因此，本公开提供一种用于制备团聚营养培养基的方法，该团聚培养基适于促进微生物的恢复和/或生长，该方法包括通过i)将粉状营养物质放置到流化床型团聚腔室中，并且ii)在团聚腔室中使粉状营养物质与团聚液体的气溶胶喷雾接触来形成营养培养基组合物。该方法还包括从腔室中收集组合物。在形成营养培养基组合物之后，组合物包含团聚营养培养基颗粒的群体和任选地非团聚的粉状营养物质，并且该群体包含至少约30重量百分比的具有约250-400微米的有效粒径的团聚营养物质颗粒。根据本公开的方法，营养组分(例如，至少一种粉状营养物质)促进微生物的生长。

已发现将团聚液体和润湿成团的粉状营养物质施加到流化床中得到适用于制备可流动的干燥营养培养基的团聚颗粒的群体。

可用于本发明方法的合适的设备包括由Srivastava和Mishra(“Fluid BedTechnology:Overview and Parameters for Process Selection”；Int.J.Pharma.Sci.and Drug Res.；2010；Vol.2,pp.236-246；)(“流化床技术：工艺选择的概述和参数”；国际制药科学和药物研究杂志；2010；第2卷，第236-246页；)描述的流化床团聚器，该文献全文以引用方式并入本文。尤其合适的设备包括其中所述的“顶部喷雾”和“切向喷雾”型设备。

通常，在顶部喷雾团聚工艺中，将一定质量(例如，预定质量)的粉末组分(例如，一种或多种粉状营养物质)装载到制粒腔室中。通过使流化气体(例如，空气、氮气)经过粉末组分以形成粉末组分的流化床来流化粉末组分。在粉末被流化的同时，将团聚液体喷雾到团聚腔室中，在该团聚腔室中，该团聚液体接触流化的粉末组分和/或团聚的营养培养基颗粒。在接触时，团聚液体可在粉末组分的颗粒表面的至少一部分上形成涂层，该涂层可与另一个粉末颗粒接触以形成团聚颗粒。随后和/或同时，流化气体有利于团聚液体的蒸发，从而干燥团聚颗粒。因此，不受理论的约束，通过以下机制中的一个或多个发生团聚：1)颗粒的表面上固定的团聚液体在两个或更多个颗粒之间形成桥(例如，由于粘合和内聚力)，2)移动的团聚液体(例如，通过相邻颗粒之间的界面和/或毛细管力移动)在两个或更多个颗粒之间形成桥，以及3)由于在干燥期间所溶解物质(例如，在团聚液体接触颗粒表面时溶解于团聚液体中)的结晶，在两个或更多个颗粒之间形成固体桥。

本领域普通技术人员将认识到，装载于团聚腔室的粉末组合物的质量以及流化气体的流速和团聚液体的流速可根据所采用设备的尺寸而改变。

使用根据本公开的方法来制备团聚的营养培养基(例如，干燥、润湿团聚的营养培养基)。团聚的营养培养基可为促进微生物(例如，细菌、酵母、霉菌)生长的团聚的微生物营养培养基。本公开的方法包括将粉状营养物质放置到流化床型团聚腔室中。粉状营养物质包含支持微生物生长的营养组分。在任何实施例中，将粉状营养物质放置到流化床型团聚腔室中可包括将预定质量的粉状营养物质放置到团聚腔室中。营养组分可为本文所述的任何合适的营养组分。在任何实施例中，营养组分可包含两种或更多种粉状营养物质的基本上均匀的混合物。

在任何实施例中，本公开的方法包括在团聚腔室中使粉状营养物质与团聚液体的气溶胶喷雾接触。在任何实施例中，使粉状营养物质与团聚液体接触可包括使粉状营养物质(例如，预定质量的粉状营养物质)与预定体积的团聚液体接触。本领域普通技术人员将认识到，可调节某些工艺参数(例如，粉末颗粒的量、颗粒的流化、雾化压力、团聚腔室的温度、团聚液体体积与粉状营养物质质量的比率、以及团聚液体的流速)，以促进其上设置有团聚液体的颗粒之间的接触增加，并且从而有利于形成较大的团聚物。相反地，本领域普通技术人员将认识到，可调节包括以上列出的那些的某些工艺参数，以降低其上设置有团聚液体的颗粒之间的接触，并且从而有利于形成较小的团聚物。具体地，可增加团聚液体的雾化压力，以便增加通过团聚工艺形成的组合物中较小团聚物(例如，约105至约400微米的有效直径)的百分比。

虽然可使用对正在团聚的粉末呈惰性的任何其它气体，例如氮气，但是进料至流化床的流化气体通常为空气。通常在约0℃至约140℃，优选地约20℃至约140℃的入口温度下将流化气体引入团聚腔室中(例如，通过一个或多个入口)。优选的是，引入团聚腔室中的流化气体被加热至例如约50℃至约140℃，优选地约50℃至约90℃。

在任何实施例中，可在将团聚液体引入腔室中之前，将用于制备根据本公开的团聚颗粒的粉末成分在团聚腔室中(例如，在室温下)共混预定义的时间段(例如，20分钟)。有利地，此共混步骤可得到相应粉末成分的更均匀的混合物，该混合物在团聚时可获得团聚颗粒的基本均匀性，如本文所述的实例11所证实的那样。

通常，在团聚过程期间，流化气体通过并且离开团聚腔室。因此，团聚腔室通常具有一个或多个出口，流化气体通过该一个或多个出口离开团聚腔室。在流化气体通过团聚腔室时，造成团聚液体的蒸发并且从而造成其温度下降。因此，在任何实施例中，流化气体离开团聚腔室时的温度可低于流化气体在进气口处的温度。在任何实施例中，流化气体离开团聚腔室时的温度可为约35℃至约50℃。

在任何实施例中，可通过调节流化气体的入口温度并且保持团聚液体的喷雾速率来控制团聚过程，以保持流化气体的第二温度(例如，在团聚腔室的喷雾区内)在预定的温度范围内(例如，约35℃至约50℃)。

引入团聚腔室中的团聚液体的体积和流速也是便于将团聚液体正确施加至润湿成团的粉状营养物质的重要参数。通常，通过一个或多个气溶胶喷嘴将团聚液体喷雾在组合物上。本领域的技术人员将认识到，可调节液体流速，例如通过控制喷嘴处的液体压力。在任何实施例中，可控制液体流速以保持流化气体的预定出口温度。在任何实施例中，在团聚腔室中使粉状营养物质(例如，预定质量的粉状营养物质)与团聚液体的气溶胶喷雾接触可包括使粉状营养物质与预定体积的团聚液体接触。

任选地，在从团聚腔室中去除后，团聚营养培养基可在合适的干燥腔室中经受干燥。干燥腔室可间歇或连续运行，并且任选地，可被分隔为两个或更多个独立控制的干燥区，这些区在不同的温度下运行。在任何实施例中，可选择干燥条件(例如，温度、时间以及气体或空气流)以生产具有预选的平均水含量和/或预选范围的水含量的团聚的营养培养基颗粒。

在以上实施例的任一个中，本公开的方法还可包括使干燥团聚的营养培养基经受减少干燥团聚营养培养基中活微生物数目的处理。在任何实施例中，根据本领域中已知的方法，可用环氧乙烷蒸气处理干燥团聚的营养培养基，以便减少活微生物的数目。在用环氧乙烷蒸气处理之后，可在使用前使营养培养基通风，以便减少或消除环氧乙烷处理过的团聚培养基中残余的环氧乙烷。在任何实施例中，根据本领域中已知的方法，可用电离辐射(例如，γ辐射)或紫外线光源处理干燥团聚的营养培养基，以便减少活微生物的数目。可将干燥团聚的培养基暴露于γ辐射源，如美国专利6,383,810中所述，该专利全文以引用方式并入本文。

营养组分

本公开的方法包括在团聚腔室中使粉状营养物质与团聚液体的气溶胶喷雾接触的步骤。粉状营养物质包含促进微生物(例如，细菌、酵母、霉菌)生长的至少一种营养组分。在任何实施例中，营养组分可包含促进微生物生长的两种或更多种营养物质的混合物。合适的营养物质的非限制性例子包括碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、低聚糖或多糖)、蛋白质、蛋白质水解产物、细胞提取物(例如，酵母提取物)、盐、缓冲组分、选择剂(例如，抗生素)以及上述营养物质中任何两种或更多种的组合。

在任何实施例中，营养组分可为基本上干燥的制剂(例如，基本上干燥的粉末)。通常通过经由混合工艺例如球磨混合培养基的干燥组分或通过冻干预制的液体培养基来生产粉状培养基。在本公开的方法中使用的示例性营养培养基为缓冲蛋白胨水，其可以粉末形式从多种来源商购获得，包括例如3M保健公司(圣保罗，明尼苏达州)(3M Health Care(St.Paul,MN))、牛津有限公司(汉普郡，英国)(Oxoid Limited(Hampshire,UK))和西格玛奥德里奇公司(圣路易斯，密苏里州)(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))。

可根据本公开团聚的其它粉状营养培养基制剂包括胰酪胨大豆液体培养基、乳糖液体培养基、UVM改良的李斯特氏菌属富集液体培养基、缓冲李斯特氏菌属富集液体培养基、胰酪胨大豆酵母提取物液体培养基、氯化镁孔雀绿富集液体培养基、再水化时形成氯化镁孔雀绿R10液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成亚硒酸盐-胱氨酸液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成EC液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成营养液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成Letheen液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成Dey/Engley中和液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成中和液体培养基的粉末的混合物；亚硒酸盐液体培养基、脑心浸萃液体培养基、半强度Demi-Fraser液体培养基、Frasier液体培养基、Demi-Fraser液体培养基、以及其它微生物营养培养基制剂。

进料至流化床的粉状成分通常具有在5至200μm范围内的平均粒径，但是可使用具有甚至更大粒度(例如，最高至300μm或甚至400μm)的粉状成分。以干重计，进料至流化床的粉状成分通常形成至少60重量％的团聚营养培养基并且通常高于80％，最高至95重量％或100重量％的团聚营养培养基。

团聚液体

将团聚液体喷雾到团聚腔室中，以有利于将营养组分的较小的单独颗粒(例如，粉状颗粒)团聚成较大的团聚颗粒。在任何实施例中，团聚液体可包含水(例如，蒸馏水和/或去离子水)。在任何实施例中，团聚液体可基本上由水(例如，蒸馏水和/或去离子水)组成。在任何实施例中，团聚液体可由水(例如，蒸馏水和/或去离子水)组成。在任何实施例中，团聚液体可包含有机溶剂(例如，乙醇、异丙醇)。

在任何实施例中，团聚液体可包含溶解的材料(例如，营养物质、营养培养基和/或粘结剂，如下文所讨论)。在任何实施例中，在被注入团聚腔室中时，团聚液体可例如处于0℃或20℃，最高至100℃或110℃的温度下。当团聚液体不包含溶解材料(例如，以有助于团聚)时，可优选的是，将团聚液体(例如，水)加热至例如50-110℃。在促进团聚方面，蒸汽通常至少与热水一样有效。

任选地，在任何实施例中，粘结剂，尤其是水溶性粘结剂，可用于促进营养组分的团聚。可将粘结剂添加(例如，以基本上干燥颗粒的形式，诸如粉末，例如)至营养组分或者可将其溶解或悬浮于团聚液体中。

任选地，在任何实施例中，团聚液体还可包含润湿剂(例如，表面活性剂，诸如TWEEN)以有利于团聚颗粒的溶解(例如，至少部分溶解)。

合适的粘结剂的非限制性例子包括生物相容的聚合物(例如，蛋白质、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖类、糊精、麦芽糖糊精、微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、淀粉、以及上述聚合物中任一个的生物相容的衍生物)和糖类(例如，右旋糖、果糖、葡萄糖、肌醇、赤藓醇、异麦芽、乳糖醇、乳糖、麦芽糖醇、麦芽糖、甘露糖醇、山梨醇、蔗糖、塔格糖、海藻糖、以及木糖醇)。在任何实施例中，粘结剂可为促进微生物生长的物质(例如，完全培养基或包含至少一种营养物质的稀释剂)。以举例的方式，用于团聚的缓冲蛋白胨水培养基的合适的团聚液体可为1-50重量百分比的缓冲蛋白胨水的溶液，并且用于团聚的胰酪胨大豆液体培养基的合适的团聚液体可为1-50重量百分比的胰酪胨大豆培养基的水溶液。

包含营养物质的组合物中粘结剂的浓度可根据所采用的特定的粘结剂而在大范围内变化，但是通常在约0.1％w/w至约40％w/w之间，诸如例如约0.2％w/w至约35％w/w、约0.3％w/w至约30％w/w、或约0.4％w/w至约25％w/w、或约0.4％w/w至约24.2％w/w。就山梨醇而言，浓度通常为约20-30％w/w，并且就除山梨醇之外的糖醇类而言；浓度通常在更高的范围内，诸如约30％w/w至约40％w/w。

优选地，团聚液体为含水介质。在其中团聚液体包括粘结剂的情况下，通过将粘结剂溶于水来制备团聚液体。另选地，粘结剂可以干燥的形式混合至粉末中。

在任何实施例中，团聚液体可包含促进微生物生长的营养培养基。例如，在一个实施例中，团聚液体可包含缓冲蛋白胨水液体培养基(水、10.0g/L蛋白胨、5.0g/L氯化钠、9.0g/L 12H₂O正磷酸氢二钠、以及1.5g/L正磷酸二氢钾)。

在该方法的任何实施例中，团聚液体可包含促进微生物生长的至少一种溶解的营养物质。溶解的营养物质可包含蛋白质(例如，蛋白质、经纯化的蛋白质和/或蛋白质水解产物的混合物)。在一个实施例中，团聚液体包含缓冲蛋白胨水。

本领域普通技术人员将认识到，至少一些工艺条件(例如，工艺中使用的营养物质粉末的质量、工艺中使用的团聚液体的质量、团聚液体的喷雾速率、和/或团聚腔室中的温度)可影响通过本公开的方法生产的所得团聚营养培养基颗粒的理化特性中的一个或多个。这些理化特性包括但不限于平均有效粒径、颗粒形状、平均颗粒质量、平均颗粒含水量、有效粒径的范围、颗粒质量的范围、和/或颗粒含水量的范围。理化特性中的一个或者任何两个或更多个的组合可影响干燥团聚的营养培养基颗粒的流体动力学特性(例如，在含水液体中的颗粒下沉速率、在含水液体中的颗粒溶解时间)。

在任何实施例中，根据本公开的方法产生具有平均有效粒径和第一粒度分布范围的干燥团聚的营养培养基颗粒的群体。在任何实施例中，第一粒度分布范围可包括具有约105微米至约2000微米的有效粒径的团聚颗粒。在任何实施例中，第一粒度分布范围可包括具有约105微米至约1000微米的有效粒径的团聚颗粒。

在任何实施例中，使用本公开的方法生产的团聚颗粒的组合物可包含团聚颗粒的群体，其中至少约70重量百分比的团聚颗粒具有约105微米至约841微米的有效粒径。在任何实施例中，使用本公开的方法生产的团聚颗粒可包含团聚颗粒的第一群体，其中少于10重量百分比的团聚颗粒具有约105微米或更小的有效粒径。

在任何实施例中，可选择用于根据本公开的方法的工艺条件，以限制在根据本公开的方法生产的组合物中相对较大(例如，具有>841微米的有效粒径)颗粒的重量百分比。例如，该工艺可产生具有少于4重量百分比的具有>841微米的有效粒径的颗粒的团聚颗粒群体。

在任何实施例中，可选择用于根据本公开的方法的工艺条件，以提高具有400-841微米(包括端值在内)的有效粒径的颗粒的比例。例如，可选择工艺条件以产生具有约1.5重量百分比至约40重量百分比的具有400-841微米(包括端值在内)的有效粒径的团聚颗粒的团聚颗粒群体。

在任何实施例中，可选择用于根据本公开的方法的工艺条件，以提高具有250-400微米(包括端值在内)的有效粒径的颗粒的比例。例如，可选择工艺条件以产生具有约35重量百分比至约55重量百分比的具有250-400微米(包括端值在内)的有效粒径的团聚颗粒的团聚颗粒群体。

在任何实施例中，可选择用于根据本公开的方法的工艺条件，以提高具有105-250微米(包括端值在内)的有效粒径的颗粒的比例。例如，可选择工艺条件以产生具有约15重量百分比至约55重量百分比的具有105-250微米(包括端值在内)的有效粒径的团聚颗粒的团聚颗粒群体。

在任何实施例中，可选择用于根据本公开的方法的工艺条件，以限制根据本公开的方法生产的组合物中相对较小(例如，具有<105微米的有效粒径)颗粒的重量百分比。例如，该工艺可产生具有少于5重量百分比的具有<105微米的有效粒径的颗粒的团聚颗粒群体。在一些实施例中，该工艺可产生具有少于1重量百分比的具有<105微米的有效粒径的颗粒的团聚颗粒群体。

因此，在优选实施例中，可选择用于根据本公开的方法的工艺条件，以产生具有以下的团聚颗粒群体：约0-4重量百分比的具有>841微米的有效粒径的颗粒；约1.5-40重量百分比的具有400-841微米(包括端值在内)的有效粒径的颗粒；约35-50重量百分比的具有250-400微米(包括端值在内)的有效粒径的颗粒；约15-55重量百分比的具有105-250微米(包括端值在内)的有效粒径的颗粒；以及<5重量百分比的具有<105微米的有效粒径的颗粒。

在任何实施例中，该方法还可包括分离干燥团聚的营养培养基颗粒的亚群，该亚群具有预选的平均有效粒径和/或具有落在第二粒度分布范围内的有效粒径。可使用本领域已知的粒度选择方法分离亚群(例如，使用允许具有预定有效粒径的颗粒保留或通过的筛)。在任何实施例中，亚群可包括具有约105微米至约841微米(包括端值在内)的有效粒径的团聚颗粒。在任何实施例中，亚群可包括具有约105微米至约400微米(包括端值在内)的有效粒径的团聚颗粒。在任何实施例中，亚群可包括具有约125微米至约400微米(包括端值在内)的有效粒径的团聚颗粒。在任何实施例中，亚群可包括具有约150微米至约250微米(包括端值在内)的有效粒径的团聚颗粒。

在另一方面，本公开还提供一种组合物。该组合物包含可流动的团聚营养培养基。可使用本文所公开的方法的任何实施例来制备该组合物。该组合物可用于制备营养培养基以促进样品(例如，临床样品、环境样品、食物样品、饮料样品、水样品)中微生物的恢复和/或生长。此外，该组合物可在用于培养微生物的制品中使用。

有利地，本公开的组合物为可流动的(例如，可从一个容器倾倒到另一个容器中)、基本上不含粉尘的(例如，由其制备团聚培养基的营养物质的较小颗粒)，并且当团聚培养基由包括至少一种水溶性粉末的基本上干燥的原料制成时，团聚培养基可比原料基本上更快地溶于水。

在该方法的任何实施例中，组合物的干燥团聚的营养培养基颗粒可具有有利于组合物在含水溶剂中的分散和溶解的选定的平均水含量(例如，以重量百分比水表示)。例如，可使用卡尔费歇尔滴定法测量平均水含量。在任何实施例中，平均重量百分比水可预选为少于约5重量百分比水。在任何实施例中，平均重量百分比水可预选为少于或等于约3重量百分比水。本领域普通技术人员将认识到，可例如通过控制用于将团聚颗粒润湿成团的水的量和/或通过控制团聚过程期间和/或之后的干燥条件来调节平均水含量。

在该方法的任何实施例中，干燥团聚的营养培养基颗粒可具有有利于团聚颗粒在含水溶剂中的分散的松散堆密度。可测量干燥团聚的营养培养基颗粒的松散堆密度，例如通过将预定义体积(例如，20mL)的颗粒倾倒到50-mL带刻度的量筒中并且测量重力堆积的颗粒的质量以便计算平均密度。在任何实施例中，松散的堆密度可为约0.2克/立方厘米至约0.5克/立方厘米。

有利地，本公开的组合物在含水溶剂中快速分散和溶解。当通过将2.55克至4.44克的干燥团聚的营养培养基(例如，用于制备缓冲蛋白胨水、胰酪胨大豆液体培养基、或改良的李斯特氏菌属恢复培养基的干燥团聚的营养培养基，例如)倾倒到包含100mL去离子水的容器中，并且将容器保持在室温下并且不搅拌来测量溶解时间时，干燥团聚的培养基可在少于5分钟内溶解。在一些实施例中，干燥团聚的培养基可在少于4分钟内溶解。在一些实施例中，干燥团聚的培养基可在少于3分钟内溶解。在一些实施例中，干燥团聚的培养基可在少于2分钟内溶解。在一些实施例中，干燥团聚的培养基可在少于1分钟内溶解。

本公开示出了可通过调节工艺条件和/或使用任选的分离工艺(例如，筛分法)获得具有特定有效粒径的组合物来选择营养培养基的团聚颗粒的组合物的溶解时间。例如，当用于制备团聚BPW营养培养基的粉末的混合物需要>10分钟以溶解于室温下的水时；具有在400和841微米之间(包括端值在内)的有效粒径的团聚的缓冲蛋白胨水培养基可在约90-120秒内溶解于室温下的水，如实例8中所示；具有在250和400微米之间(包括端值在内)的有效粒径的团聚的缓冲蛋白胨水培养基可在约30秒内溶解于室温下的水，如实例8中所示；具有在105和250微米之间(包括端值在内)的有效粒径的团聚的缓冲蛋白胨水培养基可在约15秒内溶解于室温下的水，如实例8中所示；具有<105微米的有效粒径的团聚的缓冲蛋白胨水培养基可在约90-120秒内溶解于室温下的水，如实例8中所示。

在一个优选的实施例中，本公开的组合物由可复水以形成恢复培养基(即，可用于允许微生物从化学和/或环境胁迫恢复的含水介质)的粉末制成。在一些实施例中，恢复培养基可用于培养微生物(例如，使微生物生长)。另选地或者另外地，恢复培养基可用作稀释剂。特别优选以促进经受胁迫的微生物的恢复和/或生长的恢复培养基为缓冲蛋白胨水(BPW)培养基，该培养基包含蛋白质水解产物、盐和调节至pH 7.2的磷酸盐缓冲体系。指定质量的团聚BPW培养基可在短至15秒内溶解，如本文实例中所示。

在任何实施例中，根据本领域已知的方法，可使用根据本公开的团聚营养培养基的组合物来制备胶囊、片剂或小袋。有利地，胶囊、片剂或小袋可提供将预定质量(例如，“单位剂量”)的组合物递送至容器的便利手段，在该容器中，组合物将被水化以形成复水的营养培养基。

在另一方面，本公开提供了一种用于培养微生物的制品。根据本公开的制品的非限制性例子为与美国专利4,565,783和5,089,413中描述的带粉末涂层的装置相似的薄膜培养装置；所述专利全文以引用方式并入本文中。本公开的干燥团聚的营养培养基可被用来代替薄膜培养装置中的粉状营养物质。

图1示出了根据本公开的薄膜培养装置的一个实施例。培养装置10包括主体构件，该主体构件包括具有上表面和下表面的自支承防水基材12。基材12优选地为诸如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯的材料的相对刚性的膜，该材料将不吸收水或不以其它方式受水影响。已发现大约0.004至0.007英寸(0.1至0.18mm)厚的聚酯膜、大约0.004至0.008英寸(0.1至0.2mm)厚的聚丙烯膜和大约0.015英寸(0.38mm)厚的聚苯乙烯膜极为奏效。其它合适的基材包括具有聚乙烯涂层或其它防水涂层的纸材。合适的聚乙烯涂覆的纸质基材的例子为“Schoeller Type MIL”影印纸材(可从纽约州纽约的舒乐普拉斯基公司(SchoellerPulaski,New York,NY)商购获得)。基材12可为透明或不透明的，这取决于是否希望透过基材观察细菌菌落。为了有利于细菌菌落的计数，基材12优选地具有印在其上的正方形网格图案，例如如美国专利4,565,783中所述。

基材12在其上表面上涂有粘合剂14的层，该粘合剂14的层用于保持呈均匀单层形式的干燥胶凝剂和/或营养物质，以便于水化。粘合剂14应为水不溶性的并且对微生物的生长是非抑制性的。优选地，粘合剂在润湿时是充分透明的，以使得能够透过涂有粘合剂的膜观察细菌菌落。优选的是粘合剂14是压敏的。然而，还可使用热活化粘合剂，其中较低熔点物质涂于较高熔点物质上。诸如粘胶之类的水活化粘合剂也可能是有用的。

粘合剂14应以优选小于粉状胶凝剂和/或营养物质的颗粒的直径的厚度涂到基材12上。目的是施加足够的粘合剂以将颗粒粘附到基材，但又不能太多而造成颗粒完全嵌在粘合剂中。期望粉末16的均匀单层具有足够的暴露于水化作用的表面积。一般来讲，厚度范围为0.0002至0.0005英寸的粘合剂层是合适的。可将包括本公开的干燥团聚的营养培养基的粉末涂到粘合剂层上，例如如美国专利4,565,783中所述。

附着到主体构件的垫片18的一个边缘的是任选的覆盖片22。覆盖片22优选地为透明的，以有利于细菌菌落的计数，并且对细菌和水蒸气是基本上不可渗透的。如说明书和权利要求中所用，“细菌和湿气基本上不可渗透的”指代这样的覆盖片：在装置的储存和使用期间其防止脱水培养基的不期望污染，并且将提供将在温育期期间支持微生物生长的环境。一般来讲，它将具有与基材12相同的特性，但不一定是刚性的。

虽然图1的所示实施例包括附接至装置的覆盖片22，但在本发明范围内还设想到，含粉末的实施例可在储存和温育期间不被覆盖，并且只是放置在无菌环境中。任选地，覆盖片22还可包括粘合剂层(未示出)和粉末(未示出)。附着到覆盖片的粘合剂和粉末可具有与上述粘合剂14和粉末16相似(或相同)的特性和/或组成，并且可以与将粘合剂14和粉末16施加至基材12相同的方式来施加至覆盖片。

在另一方面，本公开提供一种试剂盒。该试剂盒可包含任何下述组合物，所述组合物包含本文所述的干燥团聚的营养培养基。在任何实施例中，试剂盒可包括用于使用干燥团聚的营养培养基的说明。在任何实施例中，试剂盒还可包括用于获得样品、处理样品和/或用于培养微生物的制品。制品可选自袋、瓶、样品采集装置(例如，移液管、拭子、海绵)和上述制品中任何两种或更多种的组合。

在以上实施例的任一个中，试剂盒还可包括有利于使一种类型的微生物生长得优于另一种类型的微生物的选择剂(例如，抗生素)。在任何实施例中，选择剂可以溶液或基本上干燥的形式提供。在任何实施例中，可以可添加至预定体积的样品的单位剂型(例如，片剂、管或安瓿)提供选择剂。

在任何实施例中，试剂盒还可包括用于检测样品中微生物的存在或不存在的指示试剂。合适的指示试剂包括例如，pH指示剂(例如，酚红、氯酚红、甲基红、中性红、溴百里酚蓝、溴甲酚紫)、氧化还原指示剂(例如，氯化三苯基四唑、亚甲蓝)、显色酶底物(例如，用以检测糖苷酶酶活性、磷酸酶酶活性、脂肪酶酶活性、或氨肽酶酶活性的显色酶底物)、或荧光底物酶底物(例如，用以检测糖苷酶酶活性、磷酸酶酶活性、脂肪酶酶活性、或氨肽酶酶活性的荧光底物酶底物)。

在以上实施例的任一个中，试剂盒可包括包含预定质量的干燥团聚的营养培养基的包装。在任何实施例中，预定质量可为足以与预定体积(例如，9.9mL、10mL、90mL、99mL、100mL、225mL、1.0L、或3.375L)的含水稀释剂混合以产生能够促进微生物生长的复水的培养基的量。在任何实施例中，可以胶囊、片剂或小袋的形式在试剂盒中提供预定质量的组合物。

本公开的方法、组合物、制品和试剂盒的某些实施例在以下实施例列表中列出。

实施例

实施例A为一种制备可流动的团聚营养培养基的方法，所述方法包括：

通过以下步骤形成营养培养基组合物：

将粉状营养物质放置到流化床型团聚腔室中；

其中粉状营养物质包含促进微生物生长的营养组分；

使流化气体流过腔室；

在团聚腔室中使粉状营养物质与团聚液体的气溶胶喷雾接触；以及

从腔室中收集组合物；

其中组合物包含团聚的营养培养基颗粒群体和任选地非团聚的粉状营养物质；

其中群体包含至少约30重量百分比的具有约250-400微米的有效粒径的团聚营养物质颗粒。

实施例B为根据实施例A所述的方法，其中群体中至少约70重量百分比的颗粒具有约105-841微米的有效粒径。

实施例C为根据实施例A或实施例B所述的方法，其中群体中少于10重量百分比的颗粒具有约105微米或更小的有效粒径。

实施例D为根据前述实施例中任一个所述的方法，该方法还包括分离团聚营养培养基颗粒的亚群，所述亚群具有预定的有效粒径。

实施例E为根据实施例D所述的方法，其中分离亚群包括分离具有约149微米至约841微米的有效粒径的亚群。

实施例F为根据前述实施例中任一个所述的方法，其中团聚液体由水组成。

实施例G为根据实施例A至E中任一个所述的方法，其中团聚液体包含具有粘结剂和/或促进溶解于其中的微生物生长的营养物质的溶剂。

实施例H为根据实施例G所述的方法，其中粉状营养物质包含两种或更多种粉状营养物质的基本上均匀的混合物。

实施例I为根据前述实施例中任一个所述的方法，其中放置粉状营养物质包括放置预定质量的粉状营养物质。

实施例J为根据前述实施例中任一个所述的方法，其中使粉状营养物质与团聚液体的气溶胶喷雾接触包括使粉状营养物质与预定体积的团聚液体接触。

实施例K为根据前述实施例中任一个所述的方法，其中流化气体在进入团聚腔室时具有第一温度，其中流化气体的第一温度为约50℃至约90℃。

实施例L为根据实施例J所述的方法，其中流化气体在团聚腔室的喷雾区具有第二温度，其中流化气体的第二温度为约35℃至约50℃。

实施例M为根据前述实施例中任一个所述的方法，其中团聚的营养培养基颗粒的群体具有约5.5重量百分比或更少的平均水含量。

实施例N为根据前述实施例中任一个所述的方法，其中团聚营养培养基颗粒的群体具有约0.2至约0.5克/立方厘米的松散的堆密度。

实施例O为根据前述实施例中任一个所述的方法，其中一种或多种粉状营养物质包含选自蛋白质水解产物、碳水化合物、盐和上述粉状营养物质中任何两种或更多种的混合物的营养物质。

实施例P为根据前述实施例中任一个所述的方法，该方法还包括使干燥团聚的营养培养基经受减少干燥团聚营养培养基中活微生物数目的处理的步骤。

实施例Q为实施例P的方法，其中使干燥团聚的营养培养基经受减少活微生物数目的处理包括将干燥团聚的营养培养基暴露于电离辐射或环氧乙烷蒸气。

实施例R为根据前述实施例中任一个所述的方法，其中粉状营养物质选自：再水化时形成缓冲蛋白胨水培养基的粉末的混合物；再水化时形成胰酪胨大豆液体培养基的粉末的混合物；以及再水化时形成乳糖液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成UVM改良的李斯特氏菌属富集液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成缓冲李斯特氏菌属富集液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成胰酪胨大豆酵母提取物液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成氯化镁孔雀绿富集液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成氯化镁孔雀绿R10液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成亚硒酸盐-胱氨酸液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成EC液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成营养液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成Letheen液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成Dey/Engley中和液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成中和液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成亚硒酸盐液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成脑心浸萃液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成半强度Demi-Fraser液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成Fraser液体培养基的粉末的混合物；以及再水化时形成Demi-Fraser液体培养基的粉末的混合物。

实施例S为一种组合物，其包含通过前述实施例中任一个的方法生产的可流动的干燥团聚营养培养基。

实施例T为根据实施例S所述的组合物，其中指定质量的干燥团聚的营养培养基比相等质量的由其制备团聚营养培养基的粉状营养物质在含水溶剂中溶解得更快。

实施例U为一种组合物，其包含团聚营养培养基，所述培养基包含当与含水介质混合时形成促进微生物生长的混合物的团聚颗粒，其中群体中至少约30重量百分比的颗粒具有约250-400微米的有效粒径，其中堆颗粒密度为约0.2至约0.5克/立方厘米。

实施例V为根据实施例U所述的组合物，其中群体中至少约70重量百分比的颗粒具有约105-841微米的有效直径。

实施例W为根据实施例U或实施例V所述的组合物，其中团聚的营养培养基包含粉状营养物质，其中粉状营养物质选自：再水化时形成缓冲蛋白胨水培养基的粉末的混合物；再水化时形成胰酪胨大豆液体培养基的粉末的混合物；以及再水化时形成乳糖液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成UVM改良的李斯特氏菌属富集液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成缓冲李斯特氏菌属富集液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成胰酪胨大豆酵母提取物液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成氯化镁孔雀绿富集液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成氯化镁孔雀绿R10液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成亚硒酸盐-胱氨酸液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成EC液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成营养液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成Letheen液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成Dey/Engley中和液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成中和液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成亚硒酸盐液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成脑心浸萃液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成半强度Demi-Fraser液体培养基的粉末的混合物；再水化时形成Fraser液体培养基的粉末的混合物；以及再水化时形成Demi-Fraser液体培养基的粉末的混合物。

实施例X为一种胶囊、片剂或小袋，其包含根据实施例S至W中任一个所述的组合物。

实施例Y为一种试剂盒，其包含根据实施例S至X中的任一个所述的胶囊、片剂、小袋和/或组合物。

实施例Z为根据实施例Y所述的试剂盒，其中组合物设置在包含预定质量的干燥团聚营养培养基的包装中，其中预定质量经过选择以与9.9mL、10mL、90mL、99mL、100mL、225mL、1.0L或3.375L的含水稀释剂混合以产生能够促进微生物生长的复水的培养基。

实施例AA为根据实施例Y或实施例Z所述的试剂盒，其还包括选自袋、瓶和样品采集装置的制品。

实施例BB为根据实施例Y至AA中任一个所述的试剂盒，其还包含选择剂和/或指示试剂。

实施例CC为一种薄膜培养装置，其包括：

具有第一主表面和第二主表面的自支承防水基材；

设置在第一主表面的至少一部分上的粘合剂层；

包含设置在粘合剂层的至少一部分上的实施例S至W中任一个的组合物的涂层；和

被定位用于与营养培养基流体接触的干燥的冷水可溶性胶凝剂。

实施例DD为根据实施例CC所述的薄膜培养装置，其还包括联接至基材的至少一部分的覆盖片，所述覆盖片具有面向第一主表面的第一侧。

实施例EE为根据实施例DD所述的薄膜培养装置，其中胶凝剂附着至覆盖片的第一侧。

本发明的目的和优点进一步通过以下实例来说明，但这些实例中列举的特定材料及其量，以及其它条件和细节不应解释为对本发明的不当限制。

实例

表1：材料

测试方法

团聚样品的粒度测定：

对于实例1-6和实例9，使团聚样品穿过20、40、60和140目的筛网。对于每个筛选操作，对不能穿过筛网的材料的级分进行收集并且称重。

松散的堆密度：

将样品材料倾倒到50mL带刻度的量筒中至20mL标记处。记录所添加材料的净重并且松散的堆密度作为样品重量与样品体积(g/mL)的比率进行测定。对每个样品一式两份进行测量并且将堆密度记录为平均值。

溶解时间：

对于BPW(ISO)样品，将固体材料(2.55g)一次性添加至包含100mL保持在室温下的去离子水的玻璃广口瓶(4cm的直径)中。不对液体提供搅拌。整个样品溶解(如通过目测所测定)所需的时间记录为溶解时间。对每个样品一式两份进行测量并且将溶解时间记录为平均值。

对TSB和mLRB团聚样品使用相同的操作，除了对于TSB，使用了3.4g样品，并且对于mLRB，使用了4.4g样品。

含水量：

通过卡尔费歇尔分析，针对含水量(％水)对样品进行分析。通过将0.1g的样品材料添加至包含10mL无水甲醇的小瓶(宾夕法尼亚州森特瓦利的艾万拓公司(AvantorPerformance Materials,Center Valley,PA))中来制备测试样品。将小瓶密封并且储存在干燥操作手套箱(处于氮气气氛下)中过夜。对于每个样品，一式两份制备小瓶。从每个小瓶中取出提取物的等分试样(0.1至0.3g)并且将其注入756KF型库仑计(瑞士海利桑的万通集团(Metrohm AG,Herisau,Switzerland))中。Coulomat A(马萨诸塞州比尔里卡的EMD米利波尔)用作分析物溶液。对于每个小瓶，一式三份进行含水量的测量。因为一式两份制备测试样品，所以对于每个样品进行的测量总数为六。使用NIST SRM 2890认证的水标准1.00(1.001mg/g+/-0.003mg/g，密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO))将测试方法标准化。

实例1

将缓冲蛋白胨水(ISO)粉末(50g)装载到已使用65℃的入口空气温度在130升/分钟(LPM)的气流设定下预热的VFC-Lab Micro (爱荷华州马里昂的Freund-Vector公司(Freund-Vector Corporation,Marion,IA))的团聚腔室中。喷雾端口安装在流化床系统的顶部并且将去离子水用作团聚液体。使用以下仪器设定进行团聚：气流＝120LPM；喷雾器喷嘴气压＝265mbar；初始入口温度＝65℃；初始排气温度＝41℃；过滤器脉冲＝1秒；初始泵送速度＝5rpm。在团聚过程期间，调节入口温度和泵送速度以保持39-42℃的排气温度。在使用30.1g的去离子水后停止去离子水喷雾。将所得团聚样品在流化床中干燥，直到排气温度达到45℃(约5-10分钟)。然后使干燥产品通过筛网筛分以测定粒度分布(表2)。针对松散的堆密度和溶解时间，对所收集的在20-140目之间的材料进行测试(表3)。

表2：团聚BPW(ISO)的粒度分布(实例1)

表3：BPW(ISO)样品的比较

实例2

将缓冲蛋白胨水(ISO)粉末(50g)装载到已使用65℃的入口温度在130升/分钟(LPM)的气流设定下预热的VFC-Lab Micro(爱荷华州马里昂的Freund-Vector公司)的团聚腔室中。将喷雾端口安装在流化床系统的顶部。5％(重量体积比)BPW的去离子水溶液用作团聚液体。使用以下仪器设定进行团聚：气流＝131LPM；喷雾器喷嘴气压＝315mbar；初始入口温度＝65℃；初始排气温度＝41℃；过滤器脉冲＝1秒；初始泵送速度＝5rpm。在团聚过程期间，调节入口温度和泵送速度以保持39-42℃的排气温度。在使用20.0g的5％BPW溶液后停止喷雾。将所得团聚样品在流化床中干燥，直到排气温度达到45℃(约5-10分钟)。然后使干燥产品通过筛网筛分以测定粒度分布(表4)。针对松散的堆密度，对所收集的在20-140目之间的材料进行测试(表5)。

表4：团聚BPW(ISO)的粒度分布(实例2)

表5：BPW(ISO)样品的比较

实例3

然后进行与实例2所述的相同的操作，除了使用7.5％(重量体积比)BPW的去离子水溶液作为团聚液体，而不是5％溶液。粒度分布记录于表6中。针对松散的堆密度，对所收集的在20-140目之间的材料进行测试(表7)。

表6：团聚BPW(ISO)的粒度分布(实例3)

表7：BPW(ISO)样品的比较

实例4

将胰酶大豆液体培养基粉末(50g)装载到已使用65℃的入口温度在130升/分钟(LPM)的气流设定下预热的VFC-Lab Micro(爱荷华州马里昂的Freund-Vector公司)的团聚腔室中。将喷雾端口安装在流化床系统的顶部并且将去离子水用作团聚液体。使用以下仪器设定进行团聚：气流＝170LPM；喷雾器喷嘴气压＝250mbar；初始入口温度＝65℃；初始排气温度＝41℃；过滤器脉冲＝1秒；初始泵送速度＝5rpm。在团聚过程期间，调节入口温度和泵送速度以保持39-42℃的排气温度。在使用30.0g的去离子水后停止去离子水喷雾。将所得团聚样品在流化床中干燥，直到排气温度达到45℃(约5-10分钟)。然后使干燥产品通过筛网筛分以测定粒度分布(表8)。针对松散的堆密度和溶解时间，对所收集的在20-140目之间的材料进行测试(表9)。

表8：团聚TSB的粒度分布(实例4)

表9：TSB样品的比较

实例5

将改良的李斯特氏菌属恢复液体培养基粉末(50g)装载到已使用65℃的入口温度在130升/分钟(LPM)的气流设定下预热的VFC-Lab Micro(爱荷华州马里昂的Freund-Vector公司)的团聚腔室中。将喷雾端口安装在流化床系统的顶部并且将去离子水用作团聚液体。使用以下仪器设定进行团聚：气流＝190LPM；喷雾器喷嘴气压＝250mbar；初始入口温度＝65℃；初始排气温度＝43℃；过滤器脉冲＝1秒；初始泵送速度＝5rpm。在团聚过程期间，调节入口温度和泵送速度以保持40-43℃的排气温度。在使用30.0g的去离子水后停止去离子水喷雾。将所得团聚样品在流化床中干燥，直到排气温度达到45℃(约5-10分钟)。然后使干燥产品通过筛网筛分以测定粒度分布(表10)。针对松散的堆密度和溶解时间，对所收集的在20-140目之间的材料进行测试(表11)。

表10：团聚mLRB的粒度分布(实例5)

表11：mLRB团聚物与mLRB粉末的比较

实例6

将来自实例1的团聚BPW(ISO)产品(2.55g的20-140目样品)快速地一次性添加到包含100mL保持在室温下的去离子水的150mL玻璃烧杯(6cm的直径)中。在没有任何搅拌的情况下静置30秒后，使用布氏漏斗，使烧杯的内容物真空过滤通过Whatman^TM#54滤纸(55mm直径)。将回收的固体材料在烘箱(60℃)中干燥三小时，然后称重。

使用粉状BPW(ISO)和粒状BPW(ISO)进行相同的操作。实例1的团聚BPW(ISO)产品与粉状BPW(ISO)和粒状BPW(ISO)相比较的溶解效率的结果记录于表12中。

表12：BPW样品的溶解效率

实例7

将来自实例5的团聚的胰酶大豆液体培养基(TSB)产品(1.5g的20-140目样品)快速地一次性添加至包含50mL保持在室温下的去离子水的150mL玻璃烧杯(6cm的直径)中。在没有任何搅拌的情况下静置30秒后，使用布氏漏斗，使烧杯的内容物真空过滤通过Whatman^TM#54滤纸(55mm直径)。将回收的固体材料在烘箱(60℃)中干燥三小时，然后称重。

使用粒状TSB和粉状TSB进行相同的操作。实例4的团聚TSB产品与粉状TSB和粒状TSB相比较的溶解效率的结果记录于表13中。

表13：TSB样品的溶解效率

实例8

将缓冲蛋白胨水(ISO)粉末(1Kg)装载到已使用70℃的入口温度在62LPM的气流设定下预热的Vector FL-M-1(爱荷华州马里昂的Freund-Vector公司)的团聚腔室中。除了标准底部筛网，使用了第二细目荷兰织网(Dutch weave screen)，以便防止粉末跨过流化床。将喷雾端口安装在流化床系统的顶部并且将去离子水用作团聚液体。使用以下仪器设定进行团聚：气流＝108LPM；喷雾器喷嘴气压＝827mbar；初始入口温度＝70℃；初始排气温度＝41℃；初始泵送速度＝8-10rpm；过滤器脉冲＝10-20秒。在团聚过程期间，监测排气温度并且通过调节入口温度和泵送速度将其保持在39-42℃。在使用450g的去离子水后，停止去离子水喷雾。将所得团聚样品在流化床中干燥，直到排气温度达到43℃(约5分钟)。干燥团聚的产品的松散的堆密度为0.40g/mL。然后使干燥团聚的产品通过筛网筛分以测定粒度分布(表14)。使用上述测试方法测定团聚产品以及通过筛分法制备的各种级分的溶解时间。结果示于表15中。

表14：团聚BPW(ISO)的粒度分布(实例8)

表15：来自实例8的团聚产品的溶解时间

实例9

使用以上描述的测试方法测定以下材料中每个的平均含水量(％水)：团聚BPW(ISO)材料(来自实例1、2和8)；团聚TSB材料(来自实例4)；BPW(ISO)粉末(来源于3M公司)；以及TSB粉末(来源于碧迪公司)。结果示于表16中。

表16：含水量

实例10

通过将实例1的团聚BPW(ISO)产品(2.56g的20-140目样品)在蒸馏水(100mL)中稀释来制备培养介质液体培养基(Culture Media Broth)。通过过滤通过0.2微米注射过滤器(密歇根州安娜堡的颇尔生命科学公司(Pall Life Sciences,Ann Arbor,MI))对所得溶液灭菌。溶液的pH测量为约7.0(BeckmanФ350pH计)。细菌菌株大肠杆菌(E.coli)0157:H7(ATCC 700728)、大肠杆菌(ATCC 25922)、肠炎沙门氏菌(S.enteriditis)(ATCC13076)、伤寒沙门菌(S.typhi)(ATCC14028)以及铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(ATCC27853)获自弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心。通过将微生物的纯培养物接种到胰酶大豆液体培养基(新泽西州富兰克林湖的碧迪公司)中并且在37℃下温育过夜来制备细菌悬浮液。然后使用Butterfield氏稀释剂(明尼苏达州圣保罗的3M公司)将各个细菌菌株悬浮液中的每个稀释至约10⁵cfu/mL的浓度。

使用Falcon^TM透光的96孔Microtest^TM板(碧迪公司)，将25微升的各个细菌稀释液(105cfu/mL)添加至225微升的培养介质液体培养基中(对每种细菌菌株做四次重复)。将微量滴定板在37℃下在PowerWave^TM微板读数器(佛蒙特州威努斯基的宝特公司(BioTekCorporation,Winooski,VT))中温育24小时。通过测量1小时间隔时的吸光度(在640nm下)来测定每种细菌菌株的生长速率。在每次测量之前，将微量滴定板摇动5秒。将细菌菌株中每个的吸光度读数记录于表17-21中。

出于比较的目的，使用与以上相同的操作，对细菌菌株中的每个进行相似的生长研究，除了使用BPW(ISO)粉末(来源3M公司)制备培养介质液体培养基，而不是团聚BPW(ISO)。这些比较研究的结果也示于表17-21中。数据指示每种微生物在复水的团聚BPW培养基中与其在复水的粉状BPW中生长得大致一样快。

表17：大肠杆菌0157:H7(ATCC 700728)的生长速率

表18：大肠杆菌(ATCC 25922)的生长速率

表19：肠炎沙门氏菌(ATCC 13076)的生长速率

表20：伤寒沙门菌(ATCC 14028)的生长速率

表21：铜绿假单胞菌(ATCC 27853)的生长图表

实例11

从各个组分开始来制备团聚的缓冲蛋白胨水。所有组分均为粉状形式(粉末细得足以穿过100目筛网)。将磷酸二氢钾(15g)、磷酸氢二钠(30g)、氯化钠(50g)、蛋白胨(100g，来自马里兰州巴尔的摩的Alpha Biosciences(Alpha Biosciences,Baltimore,MD))以及示踪染料酚红(0.6g，来自西格玛奥德里奇公司)装载到VFC-Lab Micro(爱荷华州马里昂的Freund-Vector公司)的团聚腔室中。在70LPM的气流下，将材料在团聚腔室中在室温下共混20分钟。在共混步骤之后，材料以与实例1中描述的过程相似的方式被团聚。使用85℃的入口温度在90LPM的气流设定下加热该单元。将喷雾端口安装在流化床系统的顶部并且将去离子水用作团聚液体。使用以下仪器设定进行团聚：气流＝90LPM；喷雾器喷嘴压力＝265mbar；初始入口温度＝85℃；初始排气温度＝45℃；初始泵送速度＝16rpm；过滤器脉冲＝1秒。在团聚过程期间，监测排气温度并且通过调节入口温度和泵送速度将其保持在42-45℃。在使用50g的去离子水后，停止去离子水喷雾。将所得团聚样品在流化床中干燥，直到排气温度达到45℃(约5-10分钟)。针对团聚材料中各个组分的均匀分布，对团聚产品进行评价。从堆积材料中随机选择三份样品(1g)。每份样品在水中溶解至0.1g/mL的浓度，并且使用UV可见分光光度计在550nm下测量吸光度值。三份样品的平均吸光度测量结果为0.520，标准偏差为0.009，指示了各个组分在堆积产品中的均匀分布。

实例12

使用基于样品吸光度的测试方法来测定通过实例1的团聚方法制备的团聚产品以及通过筛分法制备的各种级分的溶解时间。将包含50mL去离子水(23℃水温)的100mL烧杯放置在手动实验室千斤顶(在竖直方向上的可变高度调节装置)的平台上。将具有16.5英寸不锈钢篮轴(basket shaft，目录号11010-006，宾夕法尼亚州拉德诺的VWR Scientific(VWR Scientific,Radnor,PA))的IKA RW 20数字顶置式搅拌器(北卡罗莱纳州威尔明顿的仪科公司(IKA Works Inc.,Wilmington,NC))定位在烧杯上方。将团聚材料(2.0g)小心添加到100目不锈钢篮(目录号89049-188，VWR Scientific)中并且使用轴上弹簧式夹子将篮附接至轴的末端。将搅拌轴设定为在450rpm下旋转，并且将实验室千斤顶快速升高，使得旋转篮的整个网片部分浸没在水中(确保整个样品浸没在水中)。在篮接触水的瞬间开始记录时间。在30、60、120、180、300和600秒的时间点，从烧杯中取出等分试样(500微升)。将每份样品分配到透光的96孔板的孔中，并且用BioTek Synergy MX微板读数器(佛蒙特州威努斯基的宝特美国公司(BioTek US,Winooski,VT))在310nm下进行吸光度测量。溶解的结果记录于表22中。用指示样品的最大测量吸光度的吸光度值1.0将每个时间点的吸光度标准化。

还使用粉状BPW(ISO)和粒状BPW(ISO)进行相同的操作。

表22：

实例13

将使用实例1的操作制备的团聚BPW(ISO)产品(2.55g的20-140目样品)快速地一次性添加到包含100mL保持在室温下的去离子水的150mL玻璃烧杯(6cm的直径)中。在没有任何搅拌的情况下静置30秒后，使用配有预称重的Whatman^TM#54滤纸片(55mm直径)的布氏漏斗对烧杯的内容物真空过滤。在少于5秒内完成真空过滤步骤。小心地从漏斗中移除具有回收的团聚BPW(ISO)产品的滤纸，在烘箱(80℃)中干燥15小时，接着在干燥器中冷却至室温。将具有干燥产品的滤纸称重并且从该值中减去滤纸的重量以提供未溶解的团聚BPW(ISO)产品的重量。

对团聚BPW(ISO)产品的六个另外筛分级分(<20目、20-40目、40-60目、60-100目、100-140目以及>140目)进行相同的操作。另外使用粉状BPW(ISO)和粒状BPW(ISO)进行相同的操作。团聚BPW(ISO)产品与粉状BPW(ISO)和粒状BPW(ISO)相比较的溶解效率的结果记录于表23中。

表23：BPW样品的溶解效率

本文引用的所有专利、专利申请、出版物和电子文献的全部公开内容以引用方式并入。在本专利申请的公开内容和以引用方式并入本文的任何文件的公开内容之间存在任何矛盾的情况下，应以本专利申请的公开内容为准。给出上述详细说明及实例仅为清楚地理解本发明。这些说明和实例不应被理解成对本发明进行不必要的限制。而且，本发明并不局限于本文所显示及所描述的具体细节，本发明的各种变化对于本领域技术人员来说是显而易见的，这些变化都包括在本发明由权利要求书所界定的范围内。

所有的标题是为了阅读者方便，而不应该被用于限制该标题后面的正文的含义，除非是这么规定的。

在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可以进行各种修改。这些和其它实施例均在以下权利要求书的范围内。

Claims

1.一种制备可流动的团聚营养培养基的方法，所述方法包括：

通过以下步骤形成营养培养基组合物：

将粉状营养物质放置到流化床型团聚腔室中；

其中所述粉状营养物质包含促进微生物生长的营养组分；

使流化气体流过所述腔室；

在所述团聚腔室中使所述粉状营养物质与团聚液体的气溶胶喷雾接触；以及

从所述腔室收集所述组合物；

其中所述组合物包含团聚营养培养基颗粒的群体和任选地非团聚的粉状营养物质；

其中所述群体包含至少30重量百分比的具有250-400微米的有效粒径的团聚营养物质颗粒，

所述方法还包括分离团聚营养培养基颗粒的亚群，其中分离亚群包括分离具有149微米至841微米的有效粒径的亚群。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述群体中少于10重量百分比的颗粒具有105微米或更小的有效粒径。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述团聚液体包含具有粘结剂和/或促进溶解于其中的微生物的生长的营养物质的溶剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述流化气体在进入所述团聚腔室时具有第一温度，其中所述流化气体的第一温度为50℃至90℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述团聚营养培养基颗粒的群体在分离所述亚群之后具有5.5重量百分比或更少的平均水含量。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述团聚营养培养基颗粒的群体在分离所述亚群之后具有0.2至0.5克/立方厘米的松散的堆密度。