CN108779242A

CN108779242A - 纯化泊洛沙姆的方法

Info

Publication number: CN108779242A
Application number: CN201780017940.3A
Authority: CN
Inventors: A.利希特; A.拉普; J.冯哈根
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2017-02-20
Publication date: 2018-11-09
Anticipated expiration: 2037-02-20
Also published as: US20190085125A1; KR20180125999A; EP3430072A1; JP2019511606A; WO2017157505A1; US11180610B2; JP7037495B2; DK3430072T3; CN108779242B; EP3430072B1

Abstract

本发明涉及用作细胞培养基添加剂的泊洛沙姆的纯化。活性碳可用于去除降低泊洛沙姆作为细胞培养添加剂的功效的疏水性高分子量组分。

Description

纯化泊洛沙姆的方法

发明背景

泊洛沙姆，特别是泊洛沙姆188，用于许多工业应用、化妆品和药品中。它们还用于细胞培养基过程。向细胞培养基中添加泊洛沙姆，尤其是泊洛沙姆188显著改善了细胞活力。高细胞活力对于最佳蛋白质生产至关重要。泊洛沙姆改善细胞活力的原因尚未完全理解。据信泊洛沙姆降低剪切应力，以此方式保护细胞免受损伤。作为非离子表面活性剂的泊洛沙姆可能在气泡/培养基界面浓缩，并可防止细胞附着于气泡，以此方式防止在气泡破裂时细胞损伤。它也可以减少当气泡破裂时的冲击。一些出版物声称泊洛沙姆改善从气体到液相中的氧气转移速率，但其他出版物与这些发现相矛盾。还有指出泊洛沙姆可以“修复”细胞膜中的小缺陷。

当在细胞培养基中使用时，在商业上可获得的泊洛沙姆如泊洛沙姆188批次中观察到显著的批次间变异性。因此，一些批次不适合用于细胞培养，因为它们并不充分保护细胞免受损伤/死亡。其原因尚不完全理解。因此，当使用不良批次时，细胞活力显著较低。

另外对于其他应用，泊洛沙姆有时需要纯化。已经提出了几种纯化泊洛沙姆的方法。

WO12091361中，有机金属杂质被鉴定并使用活性碳从泊洛沙姆批次中除去。据称有机金属杂质的去除对于通过链延长合成多嵌段共聚物以用作药物递送系统而言是必需的。

在WO2002014380中，通过分馏纯化泊洛沙姆。较低分子量组分(例如单和二嵌段组分)被鉴定为有害的并且通过水性两相萃取方法除去。

在WO2015148736中，描述了改善泊洛沙姆在细胞培养中的性能的方法，尤其是对于性能差的批次。确定温度处理改善性能差的批次的性能。没有得出明确的结论关于为什么温度处理改善该批次或者可以消除哪些杂质。

WO2014194137描述了评估细胞培养添加剂如泊洛沙姆188的批次性能的方法。在这些添加剂中存在或不存在高分子量组分和/或高疏水性组分指示添加剂用于防止细胞剪切损伤的功效。

尽管如此，仍然不确定哪些批次泊洛沙姆在细胞培养中不能充分保护细胞，更进一步地，那些性能差的批次能够如何处理以将它们变成性能好的批次。

已经发现，通过用活性碳处理可以提高性能差的泊洛沙姆批次的性能。进一步发现，该处理减少了那些批次中高分子量疏水性化合物的量。添加的活性碳越多，去除的高分子量组分越多(参见SEC数据)，在细胞培养中的性能越好(参见细胞培养中的活力增加)。

因此，本发明涉及增加泊洛沙姆在细胞培养中增加细胞活力的功效的方法，该方法通过以下方式进行：

a)提供其功效要被改善的泊洛沙姆

b)将步骤a)的泊洛沙姆溶解在溶剂中并使它们与活性碳接触

c)除去活性碳和溶剂以获得具有改善功效的泊洛沙姆。

对于本领域技术人员显而易见的是，不能进一步改善显示最佳功效的批次。其功效要被改善的泊洛沙姆是其在细胞培养中增加细胞活力的功效低于其他泊洛沙姆批次功效的那些泊洛沙姆。这可以例如在细胞活力测定中测试。实施例6中提供了合适的测定及其应用的实例。

在优选的实施方案中，溶剂是水、丙酮、THF或乙醇和水的混合物。

在另一个优选的实施方案中，溶解的泊洛沙姆与活性碳接触1分钟至24小时，这取决于是以流通方式进行还是分批进行。

在另一个优选的实施方案中，在步骤c)中，通过离心和/或过滤除去活性碳。

在优选的实施方案中，步骤a)中提供的泊洛沙姆包含通过SEC确定的分子量超过13.000g/mol的组分。

在优选的实施方案中，泊洛沙姆是平均分子量为7680至9510g/mol的泊洛沙姆，如药典中对于泊洛沙姆188所定义的，并根据药典使用邻苯二甲酸酐-吡啶溶液通过滴定来确定。

在另一个实施方案中，活性碳是通过热解有机聚合物材料，优选聚苯乙烯而获得的活性碳。

本发明还涉及通过将泊洛沙姆溶解在溶剂中并使溶液与活性碳接触而从泊洛沙姆中除去疏水性高分子量组分的方法。然后除去溶剂和活性碳。

本发明还涉及通过在含有泊洛沙姆的水性培养基中培养细胞进行细胞培养的方法，在将泊洛沙姆加入细胞培养基之前，所述泊洛沙姆已经通过如上所述的增加泊洛沙姆在细胞培养中增加细胞活力的功效的方法进行处理。

因此，本发明还涉及通过在含有泊洛沙姆的水性培养基中培养细胞进行细胞培养的方法，在将泊洛沙姆加入细胞培养基之前，所述泊洛沙姆已经通过以下方式处理：

a)将泊洛沙姆溶解在溶剂中并将它们与活性碳接触

b)除去活性碳和溶剂。

在另一个优选的实施方案中，将溶解的泊洛沙姆与活性碳接触1分钟至24小时。

在另一个优选实施方案中，活性碳是通过热解有机聚合物材料，优选聚苯乙烯而获得的活性碳。

附图

图1：性能差的批次A和在乙醇/水中用0、5、10、20、40和100重量%活性碳纯化后的细胞活力，如实施例2和6b所述。0%碳对应于空白值。空白值与批次A的微小偏差在测量的误差范围内。

图2：性能中等的批次B和在乙醇/水中用0、10、20、40和100重量%活性碳纯化后的细胞活力，如实施例2和6b所述。0%碳对应于空白值。空白值与批次B的微小偏差在测量的误差范围内。

图3：性能好的批次D和在乙醇/水中用0、10、20、40和100重量%活性碳处理后的细胞活力，如实施例2和6b所述。0%碳对应于空白值。空白值与批次D的微小偏差在测量的误差范围内。

图4：泊洛沙姆188批次A、B、C和D的尺寸排阻色谱图(I：全色谱图，II：放大)。

图5：如实施例2中所述的性能差的批次A(实线)和在乙醇/水中用10、20和100wt.%活性碳纯化后(虚线)的尺寸排阻色谱图(放大)。

图6：如实施例2中所述的性能中等的批次B(实线)和在乙醇/水中用10和100 wt.%活性碳纯化后(虚线)的尺寸排阻色谱图(放大)。

图7：如实施例2中所述的性能好的批次D(实线)和在乙醇/水中用10和40 wt.%活性碳处理后(虚线)的尺寸排阻色谱图(放大)。在~11000g/mol对40%活性碳观察到的小偏差可归因于残留的活性碳(未完全除去)。

关于附图的进一步细节可以在实施例中找到。

定义

在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定的组合物或方法步骤，因为这些可以变化。必须注意的是，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“泊洛沙姆”包括多种泊洛沙姆等。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。以下术语是为了本文所述的本发明的目的而定义的。

如本文所用，术语“生物反应器”是指支持生物活性环境的任何制造或工程化装置或系统。在一些情况下，生物反应器是其中进行细胞培养过程的容器，其涉及有机体或源自这些有机体的生物化学活性物质。这种过程可以是需氧的或厌氧的。普遍使用的生物反应器通常是圆柱形的，尺寸范围从升到立方米，并且常由不锈钢制成。在本文所述的一些实施方案中，生物反应器可包含由不同于钢的材料制成的一次性组件并且是一次性的。在一些实施方案中，其是在其中保持生物活性环境的一次性袋。预期生物反应器的总体积可以是100mL至最大10,000升或更大的任何体积，这取决于具体的过程。

根据本发明的泊洛沙姆中包含的高分子量疏水组分或化合物是比根据说明书的包含该组分或化合物的目标泊洛沙姆更疏水并且具有比包含该组分或化合物的泊洛沙姆的平均分子量更高的分子量的组分。如果组分通过根据本发明用活性碳处理而从泊洛沙姆中除去，则该组分更疏水。可以例如由SEC显示更高的分子量。

优选地，高分子量疏水性组分是具有比根据本说明书的泊洛沙姆例如泊洛沙姆188更高的分子量和更高的PPO/PEO比的泊洛沙姆。SEC-FTIR测量确定了高分子量组分通常也是泊洛沙姆型嵌段共聚物。这表明泊洛沙姆批次在细胞培养中的差的性能可归因于存在更疏水和更高分子量的泊洛沙姆组分(例如，在泊洛沙姆188作为根据说明书的目标泊洛沙姆的情况下，它是具有比泊洛沙姆188更高的分子量和更高的PPO/PEO比的泊洛沙姆)。

根据药典的平均分子量通过使用邻苯二甲酸酐-吡啶溶液的滴定来确定。

由SEC测定的平均分子量如下测定：

重均分子量：M_w = Ʃ_i N_i M_i ² / (Ʃ_i N_iM_i)

数均分子量：M_n = Ʃ_i N_i M_i / (Ʃ_i N_i)

峰值分子量：Mp=最大N_i时的分子量

N_i=部分i的聚合物种类数

M_i=部分i的聚合物种类的分子量

SEC条件：

校准标准：PEG(详见实施例7)

洗脱液：THF

流速：1ml/min

注射体积：100μl

柱：粒度=5μm，材料=苯乙烯-二乙烯基苯

温度：40℃

发明详述

本发明的要点是发现泊洛沙姆作为细胞活力增强剂的适用性取决于疏水性高分子量化合物的存在与否，并且那些疏水性高分子量化合物可通过使溶解的泊洛沙姆与活性碳接触而除去。

活性碳是具有广泛的非特异性吸附性质的材料，在工业领域中用作吸附剂或脱色剂，所述工业领域例如化学品和食品的生产，污水或废水处理，水过滤，和小分子药物的生产。术语“活性的碳”或“活性碳”或“活性炭”，在本文中可互换使用，是指已经受增强其孔结构的方法的碳质材料。活性碳是具有非常高表面积的多孔固体。它们可以来自各种来源，包括煤、木材、椰子壳、坚果壳、泥炭以及有机聚合物。活性碳可以使用包括在受控气氛下加热的物理活化或使用强酸、碱或氧化剂的化学活化由这些材料制备。活化过程产生具有高表面积的多孔结构，高表面积赋予活性碳高的杂质去除能力。可以修改活化过程以控制表面的酸度。

已经发现，从有机聚合物获得的活性碳也适用于根据本发明除去疏水性高分子量化合物。有机聚合物是任何合成的、化学上确定的有机聚合物，例如聚苯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚甲基戊烯、聚乙烯、聚酯、聚乙烯基或聚丙烯。

活性碳可包含球形活性碳颗粒或由球形活性碳颗粒组成。这意味着它们在所有三个空间维度上具有基本相似的延伸。除了球形外，可以想象立方体、平行六面体或圆柱形，只要两个不同空间维度的延伸相差不超过3倍，优选小于2倍。

从有机聚合物获得的活性碳可以通过球形有机材料(例如聚苯乙烯)的热解来生产。然而，也可以热解葡萄糖溶液，如Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 4, 2009, 1063至1073页中所述。球形活性碳的制造在US 20060148645和US 2008171648中进一步公开。

制造这种活性碳聚合物颗粒的示例性方法是使用聚合物球，特别是离子交换球，其聚合物结构含有可分离的官能团，特别是磺酰基和/或羧基，作为离析物。将多孔聚合物球热解，并任选地使热解的聚合物球经受活化步骤。官能团的分离优选发生直至残余含量(指所用官能团的重量份额)为5%至15%。该第一热处理的温度合适地在200℃至350℃的范围内持续10分钟至60分钟。气氛原则上是任意的。随后的热解步骤在一定温度下开始，该温度基本上对应于第一热处理的最终温度，并且优选在600℃至800℃结束。加热速率合适地在5K/min至0.5K/min的范围内，由此可以立即计算热解步骤的持续时间。活化步骤是不关键的并且以常规方式发生。

合适的活性碳例如是CAS 7440-44-0，合适的球形活性碳是AK 1500 (Felgenträger)。

合适的球形活性碳也可作为SARATECH (TM) 100562、SARATECH (TM) 100772和SARATECH (TM) 101373 (Blücher GmbH, Erkrath, Germany)获得。

活性碳的表面积优选为10至10000m²/g，更优选为100至5000m²/g，最优选为300至2000m²/g。

活性碳的平均粒度优选为至少2μm，更优选为2至800μm。

颗粒的表征在本领域中是已知的，并且优选通过筛分进行。这由以下描述：I. C.Edmundson, Particle-size analysis (粒度分析), H. S. Bean, A. H. Beckett和J.E. Carles (eds) in: Advances in Pharmaceutical Sciences (药物科学进展) vol.2,Academic Press, London 1967, 95-174。

产物级分的平均粒度可通过EDANA推荐的测试方法No. WSP 220.2-05“粒度分布”测定，其中筛分级分(screen fraction)的质量比例以累积形式作图，平均粒度由图确定。这里的平均粒度是产生累积50%重量的网眼尺寸的值。

具有一定粒度范围例如2至800 µm的活性碳的比例为全部活性碳的优选至少90%重量，更优选至少95%重量，最优选至少98%重量。

泊洛沙姆是聚乙二醇(PEG)/聚丙二醇(PPG)三嵌段共聚物。

泊洛沙姆，CAS号9003-11-6，具有通式I

I

x和z优选独立地为5至150，y优选为15至67。

它们是可商购的(Pluronics®或Lutrole®，例如Pluronic®溶液、凝胶或固体，例如Pluronic® F-68)。或者，泊洛沙姆可以根据本领域已知的方法由原料制成(参见例如，美国专利No. 3,579,465和3,740,421)。

关于泊洛沙姆的更多信息可以在Hagers Handbuch der PharmazeutischenPraxis, volume 9 “Stoffe P-Z”, 1994, 282至284页中找到。

在优选的实施方案中，待根据本发明纯化和使用的泊洛沙姆是泊洛沙姆188。泊洛沙姆188的平均分子量为7680至9510g/mol(根据药典定义和测定)。在式I中，对于泊洛沙姆188，x和z为约80，y为约27。该化合物可以作为Poloxamer 188, Pluronic® F 68,Kolliphor® P 188, Lutrol® F 68, SYNPERONIC^TM PE/F 68或PLONON #188P商购。

本领域技术人员知道如何使用泊洛沙姆作为细胞培养基中的成分。他知道适当的用量和使用方式。但有时，细胞培养，即使是按照标准程序和配方制备，也不如通常那样性能好。已经发现这可能是由泊洛沙姆引起的。在这种情况下，直到现在，必须丢弃全部批次的泊洛沙姆。本发明提供了简单有效的纯化这种差批次的方法，使它们可以在纯化后用作细胞培养成分。

性能不如预期的泊洛沙姆批次的鉴定可以例如在细胞培养中完成。如果包含泊洛沙姆的细胞培养未显示出如预期的细胞活力和性能，则可以尝试通过在使用前通过将泊洛沙姆与根据本发明的活性碳一起温育来纯化泊洛沙姆以改善这一点。

任何性能不如预期的细胞培养都可以引发根据本发明的泊洛沙姆的纯化。也可以在实际细胞培养之前进行细胞培养测试。用于研究细胞培养性能的实验装置可以如下：

合适的实验装置是小型挡板摇瓶模型，描述于Haofan Peng et al., Biotechnol.Prog., 2014, Vol. 30 (6), 1411 – 1418。进一步的细节可以在实施例6中找到。

对于技术人员来说，很明显：

-可以使用不同浓度的泊洛沙姆(通常在0.1和5g/L之间)

-可以使用任何类型的CHO细胞或其他细胞

-可以使用适合所选细胞系的任何类型的细胞培养基

-培养优选地在轨道振摇器上发生，并且可能需要根据所选择的细胞系和培养条件调节速度和偏移度(throw)。

-取决于上述选择的参数，可以在2小时和5天之间的合适时间点测量活力下降。

根据本发明的细胞活力的定义是溶液中活细胞的百分比，例如通过Beckman-Coulter ViCell XR等中的台盼蓝试验测定。

由于我们已经发现，导致性能差的组分是高分子量疏水性组分，也可以在使用之前分析每批泊洛沙姆。如果存在高分子量的疏水性组分，则在使用前通过将其与根据本发明的活性碳一起温育来纯化该批次。分析可以是例如由SEC(尺寸排阻色谱法)进行。

为了与活性碳接触，泊洛沙姆需要溶解在溶剂中。

溶解泊洛沙姆，特别是泊洛沙姆188，并且可以随后除去的任何溶剂或溶剂混合物可以被使用，并且是合适的溶剂。应该获得澄清的溶液，但可以接受轻微的浑浊。建议选择可易于蒸发的溶剂，因为之后需要将其除去。在例如水作为溶剂的情况下，泊洛沙姆可以冷冻干燥或喷雾干燥。优选的溶剂是丙酮、乙腈、DMSO、乙醇、甲醇、THF、乙腈和水或其混合物，如水和乙醇的混合物。

向其他溶剂中加入少量水可以改善泊洛沙姆的溶解度。还可以使用与泊洛沙姆的量相比更高量的溶剂以降低浊度，降低粘度等。只要泊洛沙姆充分溶解，溶剂的量通常不是关键的，因为在用活性碳处理后将其除去。

在下文中给出了合适溶剂的一些实例和所需的量。

每g泊洛沙姆188需要使用的最小溶剂量由溶解泊洛沙姆所需的最小量来限定。溶解1g泊洛沙姆188所需的溶剂和通常量的实例如下：

水：≥6.5ml(6.5 ml/g时非常粘稠，->建议使用更大量的水来降低粘度)

THF：50ml/g->澄清溶液

甲醇：80ml/g->澄清溶液

乙腈：30ml/g->轻微浑浊 40ml/g->澄清溶液

DMSO：60ml/g->轻微浑浊

(60ml DMSO+800μl水)/g->澄清溶液

丙酮：60ml/g->轻微浑浊

(60ml丙酮+800μl水)/g->澄清溶液

乙醇：(50ml乙醇+1ml水)/g->澄清溶液

丙醇：(120ml丙醇+6ml水)/g->澄清溶液

1-丁醇：(150ml 1-丁醇+8ml水)/g->澄清溶液

2-丁醇：(150ml 2-丁醇+9ml水)/g->澄清溶液

2-甲基-1-丙醇：(150ml 2-甲基-1-丙醇+7ml水)/g->澄清溶液

然后使包含溶解的泊洛沙姆的溶液与活性碳接触。也可以首先将活性碳与溶剂混合，然后加入泊洛沙姆。溶解的泊洛沙姆与活性碳的温育可以分批或连续进行。包含溶剂、泊洛沙姆和活性碳的混合物的接触时间通常为1分钟至24小时。如果以分批模式进行温育，则优选在3小时至15小时之间进行。

如果通过使含有泊洛沙姆的液体流过活性碳连续进行接触，则接触时间通常为1分钟至30分钟。为此，活性碳可以填装在柱、筒、过滤器或任何其他合适的装置中。优选地，液体在装置中的停留时间为1至10分钟。用于进行连续纯化的合适系统是Stax AKS Sytem(Pall)。

如果分批进行温育，则将组分混合并优选在接触时间内搅动混合物，例如，通过搅拌或摇动。通常，悬浮液的温育在室温下进行。

可以根据需要除去的高分子量组分的量来调节活性碳的量。已经发现需要除去的高分子量的组分越多，需要使用的活性碳越多。通常，活性碳的使用量为1:1至1:10(活性碳的重量:泊洛沙姆的重量)。

然后，从悬浮液中除去活性碳。将液体与活性碳分离可以例如通过沉降、离心和/或优选过滤进行。通常，使用两个或更多个过滤步骤尽可能完全地除去活性碳。本领域技术人员能够按活性碳的粒度调节过滤器的孔径。

除去活性碳后，从含有泊洛沙姆的溶液中除去液体。这可以例如通过蒸发、喷雾干燥或冷冻干燥进行。

蒸发优选在中等温度下在减压下进行。蒸发通常用蒸馏型设备进行。在小规模中，易于用旋转蒸发器进行蒸发。

通常的条件是例如：

丙酮: 555 hPa, 40 ℃

乙腈: 240 hPa, 40 ℃

THF: 355 hPA, 40 ℃

乙醇: 175 hPa, 40 ℃

甲醇: 335 hPa, 40 ℃

水: 70 hPA, 40 ℃

如果温度低于或高于40℃，则需要相应调整压力。应避免长时间暴露在高于50℃的温度下。

如果需要，可以在烘箱或真空烘箱中进行额外的干燥。

为了冻干或冷冻干燥，将材料在例如液氮中冷冻，通过降低周围压力使溶剂升华。

然后可将纯化和干燥的泊洛沙姆用于细胞培养。如果需要调节其粒度，可以在将其加入细胞培养基之前任选地进行研磨。

细胞培养是在其中培养细胞的任何设置。

细胞培养可以在适于细胞培养的任何容器中进行，所述容器例如培养皿、接触板、瓶、管、孔、器皿、袋、烧瓶和/或罐。优选地，它在生物反应器中进行。通常，容器在使用前进行灭菌。培养通常通过在例如合适的温度、渗透度、通气、搅动等适当条件下将细胞在水性细胞培养基中培养来进行，该条件限制来自环境的外来微生物的污染。本领域技术人员知道用于支持或维持细胞生长/培养的合适培养条件。

根据本发明的细胞培养基(同义使用：培养基)是维持和/或支持细胞体外生长和/或支持特定生理状态的任何组分混合物。它也适用于预富集培养以及用作维持培养基。

优选地，它是化学上明确的培养基。细胞培养基可包含维持和/或支持细胞体外生长所必需的所有组分，或用于连同或者不连同单独添加的其他组分(培养基补充剂)添加所选组分。优选地，细胞培养基包含维持和/或支持细胞体外生长所必需的所有组分。

包含维持和/或支持细胞体外生长所必需的所有组分的细胞培养基通常包含至少一种或多种糖类组分，一种或多种氨基酸，一种或多种维生素或维生素前体，一种或多种盐，一种或多种缓冲组分，一种或多种辅因子和一种或多种核酸组分(氮碱)或其衍生物。它还可以包含化学上明确的生物化学物质，例如重组蛋白质，例如rInsulin, rBSA,rTransferrin, rCytokines等。

细胞培养基可以是水性液体形式或要使用时溶于水或水性缓冲液中的干粉形式。本领域技术人员能够针对特定设想的目的选择合适的细胞培养基。

实验数据显示，只有具有比泊洛沙姆188更疏水的高分子量组分(通常由于更高的PPO/PEO比)的泊洛沙姆188批次对细胞活力具有负面影响，可以用活性碳除去。

分子量在约13000-50000g/mol之间具有与例如泊洛沙姆188类似的疏水性(类似的PPO/PEO比)的高分子量组分对细胞活力没有负面影响，并且不能通过活性碳除去(图3和7)。考虑到泊洛沙姆是两亲性聚合物，具有两个亲水性嵌段和中间的疏水性嵌段这一事实，有点令人惊讶的是，活性碳实际上能够选择性地吸附更疏水、更高分子量的泊洛沙姆组分，同时实际的泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)的吸附明显更少发生。这允许以良好的产率成功纯化适合细胞培养的泊洛沙姆。

基于所使用的活性碳的量，特别是如果过量使用活性碳，本发明的方法适合于从泊洛沙姆除去至少50%，优选至少75%，最优选至少90%的疏水性高分子量组分，同时通常超过80%，优选至少90%的目标泊洛沙姆可以在用活性碳处理后重新获得。

以上和以下引用的所有申请、专利和出版物以及2016年3月17日提交的相应的专利申请EP 16160811.2的全部公开内容通过引用并入本文。

实施例

实施例1：在水中用活性碳纯化泊洛沙姆。

将活性碳加入195g去离子水中(参见下表中加入的活性碳量)。将各5.0g泊洛沙姆188加入到悬浮液中(参见下表)。将悬浮液混合过夜后，将其通过Pall VacuCap® (0.2 µm)过滤以除去活性碳。将滤液冻干。

实施例2：在乙醇/水中用活性碳纯化。

将5.0g泊洛沙姆188分别加入195g乙醇。各加入2.5重量%水以溶解泊洛沙姆188。混合1小时后，加入活性碳(见下表)：

将悬浮液混合过夜后，将其过滤通过玻璃料P4，其具有2.5μm过滤器(Art-Nr. 1005-070, Whatman , 2.5 μm孔径)。使用具有2.5μm过滤器(Art-Nr. 1005-070, Whatman ,2.5 μm孔径)的吸滤器通过第二次过滤除去滤液中的残余碳。在旋转蒸发器上蒸发溶剂直至泊洛沙姆干燥。

实施例3：在乙醇/水中用球形活性碳纯化。

向5.0g泊洛沙姆188在乙醇/水(97.5:2.5)中的溶液中加入以下量的球形活性碳(Felgenträger, 表面积: 1000-2000 m²/g, 粒度: 0.3-0.8 mm)(见下表)：

混合过夜后，将悬浮液过滤通过玻璃料P4，其具有2.5μm过滤器(Art-Nr. 1005-070,Whatman , 2.5 μm孔径)。不需要第二次过滤，因为在一个过滤步骤中容易除去球形活性碳。在旋转蒸发器上蒸发溶剂直至泊洛沙姆干燥。

实施例4：在THF中用活性碳纯化。

将5.0g泊洛沙姆188溶于250ml THF中。添加以下量的活性碳：

实施例5：在丙酮中用活性碳纯化。

将5.0g泊洛沙姆188溶于300ml丙酮中。添加以下量的活性碳：

实施例6：用小规模细胞试验测定的细胞活力。

细胞试验类似于Haofan Peng et al., Biotechnol. Prog., 2014, Vol. 30(6), 1411 – 1418进行。在带挡板的摇瓶中进行细胞培养以诱导可能损伤细胞的剪切力。使用CHO-S细胞和Cellvento^TM CHO-220培养基。泊洛沙姆浓度为1g/L。以约1百万细胞/mL的活细胞密度用选择的细胞接种细胞培养基。培养在轨道摇动的培养箱中进行。细胞活力(溶液中活细胞的百分比)在4小时后在Beckman-Coulter ViCell XR中通过台盼蓝试验测定。每批次一式三份进行测量。对泊洛沙姆188批次A、B、C和D测定了以下的平均细胞活力：

泊洛沙姆188批次A和C是性能很差的批次，批次B是性能中等的批次，批次D是性能好的批次。通常，>90%被认为是足够好的活力。

实施例6a：使用实施例1中描述的纯化的泊洛沙姆批次的细胞活力

如实施例6中所述进行细胞试验。实施例1中描述的纯化的泊洛沙姆批次的性能：

*在测量误差范围内

原始批次的性能越差(细胞活力越低)，在水中使用20重量%活性碳纯化后细胞活力的改善越显著。性能差的批次A和C的细胞活力分别改善了45%和138%。性能中等的批次B的细胞活力改善了14%。用20重量%活性碳处理性能好的批次D没有效果，因为没有什么要纯化的。

实施例6b：使用实施例2中描述的纯化的泊洛沙姆批次的细胞活力

如实施例6中所述进行试验。实施例2中描述的纯化的泊洛沙姆批次的性能：

*在测量误差范围内

原始批次在细胞培养中的性能越差(细胞活力越差)，为获得>90%的良好活力纯化所需的活性碳越多。对于性能非常差的批次A(49%活力)，需要100重量%的活性碳来充分纯化该批次以实现>90%的细胞活力(也参见图1)。对于性能中等的批次B(87%活力)，仅需要使用20重量%的活性碳进行纯化以实现>90%的细胞活力(也参见图2)。批次D的性能非常好，具有96%的活力。用活性碳处理对批次的性能没有影响(样品之间的微小偏差在测量误差范围内)，也参见图3。这意味着泊洛沙姆批次D中的高分子量组分不是疏水性的，因此不会被活性碳除去。SEC数据支持这些发现(图7)。

实施例6c：使用实施例3中描述的纯化的泊洛沙姆批次的细胞活力

如实施例6中所述进行试验。实施例3中描述的纯化的泊洛沙姆批次的性能：

通过用活性碳处理，性能差的泊洛沙姆批次的改善对于球形活性碳和标准活性碳(参见实施例6b)是类似的。使用100重量%球形活性碳的纯化分别导致批次A和B的99%和98%的细胞活力。这相当于批次A的改善超过100%，批次B的改善为13%。

实施例6d：使用实施例4中描述的纯化的泊洛沙姆批次的细胞活力

如实施例6中所述进行试验。实施例4中描述的纯化的泊洛沙姆批次的性能：

在THF中用100重量%的活性碳纯化性能非常差的批次A导致细胞活力的显著改善，类似于在例如水或乙醇/水中进行的纯化(参见实施例6a-6c)。

实施例6e：使用实施例5中描述的纯化的泊洛沙姆批次的细胞活力

如实施例6中所述进行试验。实施例5中描述的纯化的泊洛沙姆批次的性能：

在丙酮中用活性碳纯化性能非常差的批次A，导致细胞活力的显著改善，但不如在例如水、乙醇/水或THF中显著(参见实施例6a-d)。

实施例7：

所有尺寸排阻色谱(SEC)测量如下进行：

校准标准品：PEG (Mp: 430, 982, 1960, 3020, 6690, 12300, 26100和44 000 g/mol)

洗脱液：THF

流速：1ml/min

注射体积：100μl

柱：粒度=5μm，材料=苯乙烯-二乙烯基苯

温度：40℃

检测器：折射率(RI)

实施例7a：

泊洛沙姆188批次A、B、C和D的尺寸排阻色谱测量(图4)。观察到在~13000和40000g/mol之间的高分子量组分(图4II)。

实施例7b：

如实施例2中所述，在乙醇/水中用10、20和100重量%活性碳纯化的性能差的批次A的尺寸排阻色谱测量(参见图5)。纯化去除了在～29000g/mol的疏水性高分子量组分。使用100重量%的活性碳，完全除去了疏水性高分子量组分。结果，细胞活力显著改善，使得纯化的批次适合用于细胞培养(实施例6b和图1)。

实施例7c：

如实施例2中所述，在乙醇/水中用10和100重量%活性碳纯化的性能中等的批次B的尺寸排阻色谱测量(参见图6)。纯化去除了在～16000g/mol的疏水部分的高分子量组分，导致在～16000g/mol的高分子量峰的强度显著降低。结果，细胞活力显著改善，使得纯化的批次适合用于细胞培养(实施例6b和图2)。

实施例7d：

如实施例2中所述，在乙醇/水中(虚线)用10、20和40重量%活性碳处理的性能好的批次D的尺寸排阻色谱测量(参见图7)。用活性碳处理后未观察到高分子量峰(～15000g/mol)的显著变化。对于40%活性碳在～11000g/mol观察到的小偏差可归因于残留的活性碳(未完全除去)。这意味着批次D中的高分子量组分不具有比泊洛沙姆188更高的疏水性，因此不被除去。具有与泊洛沙姆188类似的疏水性(类似的PPO/PEO比)的高分子量组分对细胞活力没有负面影响并且不能通过活性碳除去(批次D，实施例6b和图3)。

实施例8：以流通方式在丙酮中用活性碳纯化泊洛沙姆

将5.0g球形活性碳(Felgenträger, 表面积1000-2000 m²/g, 粒度0.3-0.8 mm)填充到底端有玻璃料的玻璃柱(高190mm，内径10mm)中。将柱在底端密封，用丙酮填充并小心旋转以除去气泡。将柱中的活性碳床静置过夜。将5.0g泊洛沙姆188批次A溶解在300毫升丙酮中。将泊洛沙姆溶液倒入柱中并除去底部密封。在以4.6ml/min的流速通过柱后收集泊洛沙姆溶液。在旋转蒸发器上蒸发溶剂直至泊洛沙姆干燥。

如实施例6中所述进行细胞试验。纯化的泊洛沙姆批次的性能：

*基于对在实施例6中描述的泊洛沙姆批次A测定的细胞活力(49%)计算活力的改善。

以流通方式在丙酮中用活性碳纯化性能非常差的批次A导致细胞活力的显著改善。该改善优于使用标准活性碳的分批模式(参见实施例6e)。

实施例9：使用较短的混合时间用活性碳纯化：

泊洛沙姆188批次A的纯化如实施例2中所述进行，但悬浮液仅混合15分钟。

在乙醇/水中用100重量%活性碳纯化性能非常差的批次A且用15分钟的混合时间导致细胞活力的显著改善，类似于混合过夜进行的纯化(参见实施例6b)。

Claims

1. 增加泊洛沙姆在细胞培养中增加细胞活力的功效的方法，该方法通过以下方式进行：

a)提供其功效要被改善的泊洛沙姆

b)将步骤a)的泊洛沙姆溶解在溶剂中并使它们与活性碳接触

c)除去活性碳和溶剂以获得具有改善功效的泊洛沙姆。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于溶剂是水、丙酮、THF或乙醇和水的混合物。

3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于溶解的泊洛沙姆与活性碳接触1分钟至24小时。

4.根据权利要求1-3中一项或多项的方法，其特征在于在步骤c)中，通过过滤和/或离心除去活性碳。

5.根据权利要求1-4中一项或多项的方法，其特征在于步骤a)中提供的泊洛沙姆包含分子量超过13.000g/mol的组分。

6.根据权利要求1-5中一项或多项的方法，其特征在于泊洛沙姆是平均分子量为7680至9510g/mol的泊洛沙姆。

7.根据权利要求1-6中一项或多项的方法，其特征在于活性碳是通过热解有机聚合材料获得的活性碳。

8.根据权利要求1-7中一项或多项的方法，其特征在于活性碳具有2至800μm的中值粒度。

9.一种从泊洛沙姆中除去疏水性高分子量组分的方法，该方法是通过将它们溶解在溶剂中并使它们与活性碳接触，然后除去活性碳和溶剂。

10. 通过在含有泊洛沙姆的水性培养基中培养细胞进行细胞培养的方法，在将泊洛沙姆加入细胞培养基之前，所述泊洛沙姆已经通过以下方式处理：

a)将泊洛沙姆溶解在溶剂中并使它们与活性碳接触

b)除去活性碳和溶剂。

11.根据权利要求10的方法，其特征在于溶解的泊洛沙姆与活性碳接触2至24小时。

12.根据权利要求10或11的方法，其特征在于，在步骤c)中，通过过滤和/或离心除去活性碳。

13.根据权利要求10-12中一项或多项的方法，其特征在于步骤a)中提供的泊洛沙姆包含分子量超过13.000g/mol的组分。

14.根据权利要求10-13中一项或多项的方法，其特征在于泊洛沙姆是平均分子量为7680至9510g/mol的泊洛沙姆。

15.根据权利要求10-14中一项或多项的方法，其特征在于活性碳具有2至800μm的中值粒度。