KR20180125999A - 폴록사머의 정제 방법 - Google Patents
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- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C08G2650/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G2650/28—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule characterised by the polymer type
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
Abstract
본 발명은 세포 배양물 배지 첨가제로서 사용되기 위한 폴록사머의 정제에 관한 것이다. 활성화 탄소는 세포 배양물 첨가제로서 폴록사머의 효능을 감소시키는 소수성 고분자량 성분을 제거하기 위해 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 세포 배양물 배지 첨가제로서 사용되기 위한 폴록사머의 정제에 관한 것이다. 활성화 탄소는 세포 배양물 첨가제로서 폴록사머의 효능을 감소시키는 소수성 고분자량 성분을 제거하기 위해 사용될 수 있다.
폴록사머, 특히 폴록사머 188 은 다수의 산업 적용, 화장품 및 약학 분야에서 사용된다. 이는 또한 세포 배양물 배지 방법에서 사용된다. 폴록사머, 특히 폴록사머 188 의 세포 배양물 배지로의 첨가는 세포 생존능력을 유의하게 개선시킨다. 높은 세포 생존능력은 최적의 단백질 제조를 위해 중요하다. 왜 폴록사머가 세포 생존능력을 개선하는지는 완전히 이해되어 있지 않다. 폴록사머는 전단 응력을 감소시키고, 이러한 방식으로 세포를 손상으로부터 보호한다고 여겨진다. 비이온성 계면활성제인 폴록사머는 기체 버블/배지 계면에서 농축되고, 기체 버블에 대한 세포 부착을 방지할 수 있고, 이러한 방식으로 기체 버블이 파열되는 경우 세포 손상을 방지한다. 이는 또한 버블이 파열되는 경우, 충격을 감소시킬 수 있다. 일부 출원은 폴록사머가 기체에서 액체 상으로 산소 이동 속도를 개선한다고 주장하지만, 기타 출원은 이러한 발견을 반박한다. 또한, 폴록사머가 세포 막의 작은 결함을 "수선" 할 수 있다는 지적이 존재한다.
세포 배양물 배지에서 사용된 경우, 폴록사머 188 로트 (lot) 와 같은 시판 폴록사머에서 유의한 로트-투-로트 (lot-to-lot) 변이성이 관찰된다. 그 결과, 일부 로트는 손상/사멸로부터 세포를 충분히 보호하지 못하기 때문에, 세포 배양물에서 사용하기에 적합하지 않다. 이의 원인은 여전히 완전히 이해되어 있지 않다. 그 결과, 불량한 로트가 사용되는 경우, 세포 생존능력은 유의하게 더 낮다.
또한 기타 적용을 위해, 폴록사머는 때때로 정제될 필요가 있다.
여러 폴록사머의 정제 방법이 제안되었다.
WO12091361 에서, 오르가노금속 불순물이 확인되고, 활성화 탄소를 사용하여 폴록사머 로트로부터 제거된다. 오르가노금속 불순물의 제거는 약물 전달 시스템으로 사용되기 위한 멀티블록 공중합체를 사슬 연장에 의해 합성하는데 필요하다고 주장된다.
WO2002014380 에서, 폴록사머는 분별에 의해 정제된다. 보다 낮은 분자량 성분 (예컨대, 모노- 및 디블록 성분) 은 유해한 것으로 확인되고, 수성 2 상 추출 방법에 의해 제거된다.
WO2015148736 에서, 특히 성능이 불량한 로트에 대한 세포 배양물에서 폴록사머 성능을 개선하는 방법이 기재되어 있다. 성능이 불량한 로트의 성능을 개선하기 위한 온도 처리가 확인되었다. 왜 온도 처리가 로트를 개선시키는지 또는 어떤 불순물이 제거될 수 있을지에 대한 명확한 결론은 이끌어내지 못했다.
WO2014194137 은 폴록사머 188 과 같은 세포 배양물 첨가제의 로트 성능을 평가하는 방법을 기재한다. 상기 첨가제 중 고분자량 성분 및/또는 매우 소수성 성분의 존재 또는 부재가 세포 전단 손상을 방지하기 위한 첨가제의 효능의 지표이다.
여전히, 어떠한 폴록사머의 로트가 세포 배양물에서 세포를 충분히 보호하지 못하는지에 대한 불확실성이 존재하고, 그보다 더, 어떻게 이러한 성능이 불량한 로트가 처리되어 성능이 양호한 로트로 변경될 수 있는지에 대한 불확실성이 존재한다.
성능이 불량한 폴록사머 로트의 성능이 활성화 탄소로의 처리에 의해 증가될 수 있다는 것을 발견하였다. 추가로, 이러한 처리가 이러한 로트에서 고분자량 소수성 화합물의 양을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 활성화 탄소가 더 첨가될수록, 보다 많은 고분자량 성분이 제거되고 (SEC 데이터 참조), 세포 배양물 중 성능은 보다 더 양호하다 (세포 배양물 중 생존능력 증가 참조).
따라서, 본 발명은 하기 단계에 의한, 세포 배양물에서 세포 생존능력을 증가시키기 위한 폴록사머의 효능 증가 방법에 관한 것이다:
a)
효능이 개선되어야 할 폴록사머를 제공하는 단계
b)
단계 a) 의 폴록사머를 용매에 용해시키고, 이를 활성화 탄소와 접촉시키는 단계
c)
활성화 탄소 및 용매를 제거하여 개선된 효능을 갖는 폴록사머를 수득하는 단계.
최적의 효능을 보이는 로트가 추가로 개선될 수 없다는 것은 당업자에게 명백하다. 효능이 개선되어야 하는 폴록사머는 세포 배양물에서 세포 생존능력을 증가시키는 효능이 다른 폴록사머 로트에 비해 더 낮은 것이다. 이는, 예를 들어 세포 생존능력 검정에서 시험될 수 있다. 적합한 검정 및 이의 적용의 예가 실시예 6 에 제공된다.
바람직한 구현예에서, 용매는 물, 아세톤, THF 또는 에탄올 및 물의 혼합물이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 용해된 폴록사머는, 배치식 또는 플로우 스루식 (flow through) 으로 수행되는지 여부에 따라, 1 분 내지 24 시간 동안 활성화 탄소와 접촉한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 단계 c) 에서, 활성화 탄소는 원심분리 및/또는 여과에 의해 제거된다.
바람직한 구현예에서, 단계 a) 에서 제공된 폴록사머는 SEC 에 의해 측정된 분자량이 13.000 g/mol 초과인 성분을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188 에 대한 약전에 정의된 바와 같고, 프탈릭 무수물-피리딘 용액을 사용한 적정에 의해 약전에 따라 측정된 평균 분자량이 7680 내지 9510 g/mol 인 폴록사머이다.
또 다른 구현예에서, 활성화 탄소는 유기 중합체성 물질, 바람직하게는 폴리스티렌의 열분해에 의해 수득된 활성화 탄소이다.
본 발명은 추가로 폴록사머를 용매에 용해시키고, 용액을 활성화 탄소와 접촉시키는 것에 의한, 폴록사머로부터 소수성, 고분자량 성분의 제거 방법에 관한 것이다. 이후, 용매 및 활성화 탄소는 제거된다.
본 발명은 추가로 세포 배양물 배지에 폴록사머를 첨가하기 전, 상기 기재된 바와 같은 세포 배양물에서 세포 생존능력을 증가시키기 위한 폴록사머의 효능 증가 방법으로 처리된 폴록사머를 포함하는 수성 배양물 배지에서, 세포를 배양함으로써 세포 배양을 수행하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 세포 배양물 배지에 폴록사머를 첨가하기 전, 하기 단계로 처리된 폴록사머를 포함하는 수성 배양물 배지에서, 세포를 배양함으로써 세포 배양을 수행하는 방법에 관한 것이다:
a)
폴록사머를 용매에 용해시키고, 활성화 탄소와 접촉시키는 단계
b)
활성화 탄소 및 용매를 제거하는 단계.
바람직한 구현예에서, 용매는 물, 아세톤, THF 또는 에탄올 및 물의 혼합물이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 용해된 폴록사머는 1 분 내지 24 시간 동안 활성화 탄소와 접촉한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 단계 c) 에서, 활성화 탄소는 원심분리 및/또는 여과에 의해 제거된다.
바람직한 구현예에서, 단계 a) 에서 제공된 폴록사머는 SEC 에 의해 측정된 분자량이 13.000 g/mol 초과인 성분을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188 에 대한 약전에 정의된 바와 같고, 프탈릭 무수물-피리딘 용액을 사용한 적정에 의해 약전에 따라 측정된 평균 분자량이 7680 내지 9510 g/mol 인 폴록사머이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 활성화 탄소는 유기 중합체성 물질, 바람직하게는 폴리스티렌의 열분해에 의해 수득된 활성화 탄소이다.
도면
도 1: 성능이 불량한 로트 A 및 실시예 2 및 6b 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 0, 5, 10, 20, 40 및 100 wt% 활성화 탄소로 정제 후의 세포 생존능력. 0% 탄소는 블랭크 값에 해당한다. 로트 A 에 대한 블랭크 값의 작은 편차는 측정의 오류 마진 내에 있다.
도 2: 성능이 보통인 로트 B 및 실시예 2 및 6b 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 0, 10, 20, 40 및 100 wt% 활성화 탄소로 정제 후의 세포 생존능력. 0% 탄소는 블랭크 값에 해당한다. 로트 B 에 대한 블랭크 값의 작은 편차는 측정의 오류 마진 내에 있다.
도 3: 성능이 양호한 로트 D 및 실시예 2 및 6b 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 0, 10, 20, 40 및 100 wt% 활성화 탄소로 처리 후의 세포 생존능력. 0% 탄소는 블랭크 값에 해당한다. 로트 D 에 대한 블랭크 값의 작은 편차는 측정의 오류 마진 내에 있다.
도 4: 폴록사머 188 로트 A, B, C 및 D 의 크기 배제 크로마토그램 (I: 전체 크로마토그램, II: 확대함).
도 5: 성능이 불량한 로트 A (실선) 및 실시예 2 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 10, 20 및 100 wt% 활성화 탄소로 정제 후 (점선) 의 크기 배제 크로마토그램 (확대함).
도 6: 성능이 보통인 로트 B (실선) 및 실시예 2 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 10 및 100 wt% 활성화 탄소로 정제 후 (점선) 의 크기 배제 크로마토그램 (확대함).
도 7: 성능이 양호한 로트 D (실선) 및 실시예 2 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 10 및 40 wt% 활성화 탄소로 처리 후 (점선) 의 크기 배제 크로마토그램 (확대함). ~ 11 000 g/mol 에서 40% 활성화 탄소에 대해 관찰된 작은 편차는 잔류 활성화 탄소 (완전히 제거되지 않음) 에 기인할 수 있다.
도면에 관한 추가 세부사항은 실시예에서 확인될 수 있다.
정의
본 발명을 자세히 설명하기 전, 본 발명은 특정 조성물 또는 방법 단계에 제한되지 않고, 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바, 단수 형태는 문맥에서 달리 명백히 명시되지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것을 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "폴록사머" 에 대한 언급은 복수의 폴록사머들 등을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명에 관련된 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 목적을 위해 정의된다.
본원에 사용된 바, 용어 "바이오반응기 (bioreactor)" 는 생물학적 활성 환경을 지지하는 임의의 제조 또는 제작된 디바이스 또는 시스템을 의미한다. 일부 경우에, 바이오반응기는 유기체 또는 상기 유기체 유래의 생물학적 활성 물질을 수반하는, 세포 배양 방법이 수행되는 용기이다. 이와 같은 방법은 호기성 또는 혐기성일 수 있다. 일반적으로 사용된 바이오반응기는 통상적으로 리터 내지 입방 미터의 크기 범위의 원통형이고, 흔히 스테인리스 스틸로 만들어진다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 바이오반응기는 스틸 이외의 물질로 만들어진 일회용 구성요소를 함유할 수 있고, 이는 일회용이다. 일부 구현예에서, 이는 생물학적 활성 환경이 보존되는 일회용 백이다. 바이오반응기의 전체 부피는, 특정 방법에 따라, 100 mL 에서 10,000 리터 이상까지의 범위의 임의의 부피일 수 있다는 것이 고려된다.
본 발명에 따른 폴록사머에 포함된 고분자량, 소수성 성분 또는 화합물은 이들이 포함되어 있는 본 명세서에 따른 표적 폴록사머보다 더 소수성이고, 이들이 포함되어 있는 폴록사머의 평균 분자량보다 더 높은 분자량을 갖는 성분이다. 성분은 본 발명에 따른 활성화 탄소로의 처리에 의해 폴록사머로부터 제거되는 경우, 보다 소수성이다. 보다 높은 분자량은, 예를 들어 SEC 에 의해 확인될 수 있다.
바람직하게는, 고분자량, 소수성 성분은 예를 들어 폴록사머 188 과 같은 본 명세서에 따른 폴록사머보다 높은 분자량을 갖고, 보다 높은 PPO/PEO 비를 갖는 폴록사머이다. SEC-FTIR 측정은 고분자량 성분이 또한 통상적으로 폴록사머 유형 블록 공중합체라는 것을 확인하였다. 이는 세포 배양물에서 폴록사머 로트의 불량한 성능이 보다 소수성이고 보다 높은 분자량의 폴록사머 성분의 존재에 기인할 수 있다는 것을 보여준다 (예를 들어, 명세서에 따른 표적 폴록사머인 폴록사머 188 의 경우, 이는 폴록사머 188 보다 더 높은 PPO/PEO 비 및 보다 높은 분자량을 갖는 폴록사머임).
약전에 따른 평균 분자량은 프탈릭 무수물-피리딘 용액을 사용하는 적정에 의해 측정된다.
SEC 에 의해 측정된 평균 분자량은 하기에 따라 측정된다:
중량 평균 분자량: Mw = ∑i Ni Mi 2 / (∑i Ni Mi)
수 평균 분자량: Mn = ∑i Ni Mi / (∑i Ni)
피크 분자량: Mp = 최대 Ni 에서 분자량
Ni = 분획 i 의 중합체 종류의 수
Mi = 분획 i 의 중합체 종류의 분자량
SEC 조건:
보정 표준물: PEG (세부사항은 실시예 7 참조)
용리액: THF
유속: 1 ml/min
주입 부피: 100 μl
컬럼: 입자 크기 = 5 μm, 물질 = 스티렌-디비닐벤젠
온도: 40℃
도 1: 성능이 불량한 로트 A 및 실시예 2 및 6b 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 0, 5, 10, 20, 40 및 100 wt% 활성화 탄소로 정제 후의 세포 생존능력. 0% 탄소는 블랭크 값에 해당한다. 로트 A 에 대한 블랭크 값의 작은 편차는 측정의 오류 마진 내에 있다.
도 2: 성능이 보통인 로트 B 및 실시예 2 및 6b 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 0, 10, 20, 40 및 100 wt% 활성화 탄소로 정제 후의 세포 생존능력. 0% 탄소는 블랭크 값에 해당한다. 로트 B 에 대한 블랭크 값의 작은 편차는 측정의 오류 마진 내에 있다.
도 3: 성능이 양호한 로트 D 및 실시예 2 및 6b 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 0, 10, 20, 40 및 100 wt% 활성화 탄소로 처리 후의 세포 생존능력. 0% 탄소는 블랭크 값에 해당한다. 로트 D 에 대한 블랭크 값의 작은 편차는 측정의 오류 마진 내에 있다.
도 4: 폴록사머 188 로트 A, B, C 및 D 의 크기 배제 크로마토그램 (I: 전체 크로마토그램, II: 확대함).
도 5: 성능이 불량한 로트 A (실선) 및 실시예 2 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 10, 20 및 100 wt% 활성화 탄소로 정제 후 (점선) 의 크기 배제 크로마토그램 (확대함).
도 6: 성능이 보통인 로트 B (실선) 및 실시예 2 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 10 및 100 wt% 활성화 탄소로 정제 후 (점선) 의 크기 배제 크로마토그램 (확대함).
도 7: 성능이 양호한 로트 D (실선) 및 실시예 2 에 기재된 바와 같이 에탄올/물 중 10 및 40 wt% 활성화 탄소로 처리 후 (점선) 의 크기 배제 크로마토그램 (확대함). ~ 11 000 g/mol 에서 40% 활성화 탄소에 대해 관찰된 작은 편차는 잔류 활성화 탄소 (완전히 제거되지 않음) 에 기인할 수 있다.
도면에 관한 추가 세부사항은 실시예에서 확인될 수 있다.
정의
본 발명을 자세히 설명하기 전, 본 발명은 특정 조성물 또는 방법 단계에 제한되지 않고, 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바, 단수 형태는 문맥에서 달리 명백히 명시되지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것을 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "폴록사머" 에 대한 언급은 복수의 폴록사머들 등을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명에 관련된 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 목적을 위해 정의된다.
본원에 사용된 바, 용어 "바이오반응기 (bioreactor)" 는 생물학적 활성 환경을 지지하는 임의의 제조 또는 제작된 디바이스 또는 시스템을 의미한다. 일부 경우에, 바이오반응기는 유기체 또는 상기 유기체 유래의 생물학적 활성 물질을 수반하는, 세포 배양 방법이 수행되는 용기이다. 이와 같은 방법은 호기성 또는 혐기성일 수 있다. 일반적으로 사용된 바이오반응기는 통상적으로 리터 내지 입방 미터의 크기 범위의 원통형이고, 흔히 스테인리스 스틸로 만들어진다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 바이오반응기는 스틸 이외의 물질로 만들어진 일회용 구성요소를 함유할 수 있고, 이는 일회용이다. 일부 구현예에서, 이는 생물학적 활성 환경이 보존되는 일회용 백이다. 바이오반응기의 전체 부피는, 특정 방법에 따라, 100 mL 에서 10,000 리터 이상까지의 범위의 임의의 부피일 수 있다는 것이 고려된다.
본 발명에 따른 폴록사머에 포함된 고분자량, 소수성 성분 또는 화합물은 이들이 포함되어 있는 본 명세서에 따른 표적 폴록사머보다 더 소수성이고, 이들이 포함되어 있는 폴록사머의 평균 분자량보다 더 높은 분자량을 갖는 성분이다. 성분은 본 발명에 따른 활성화 탄소로의 처리에 의해 폴록사머로부터 제거되는 경우, 보다 소수성이다. 보다 높은 분자량은, 예를 들어 SEC 에 의해 확인될 수 있다.
바람직하게는, 고분자량, 소수성 성분은 예를 들어 폴록사머 188 과 같은 본 명세서에 따른 폴록사머보다 높은 분자량을 갖고, 보다 높은 PPO/PEO 비를 갖는 폴록사머이다. SEC-FTIR 측정은 고분자량 성분이 또한 통상적으로 폴록사머 유형 블록 공중합체라는 것을 확인하였다. 이는 세포 배양물에서 폴록사머 로트의 불량한 성능이 보다 소수성이고 보다 높은 분자량의 폴록사머 성분의 존재에 기인할 수 있다는 것을 보여준다 (예를 들어, 명세서에 따른 표적 폴록사머인 폴록사머 188 의 경우, 이는 폴록사머 188 보다 더 높은 PPO/PEO 비 및 보다 높은 분자량을 갖는 폴록사머임).
약전에 따른 평균 분자량은 프탈릭 무수물-피리딘 용액을 사용하는 적정에 의해 측정된다.
SEC 에 의해 측정된 평균 분자량은 하기에 따라 측정된다:
중량 평균 분자량: Mw = ∑i Ni Mi 2 / (∑i Ni Mi)
수 평균 분자량: Mn = ∑i Ni Mi / (∑i Ni)
피크 분자량: Mp = 최대 Ni 에서 분자량
Ni = 분획 i 의 중합체 종류의 수
Mi = 분획 i 의 중합체 종류의 분자량
SEC 조건:
보정 표준물: PEG (세부사항은 실시예 7 참조)
용리액: THF
유속: 1 ml/min
주입 부피: 100 μl
컬럼: 입자 크기 = 5 μm, 물질 = 스티렌-디비닐벤젠
온도: 40℃
본 발명의 요지는 세포 생존능력의 인핸서로서 폴록사머의 적합성이 소수성, 고분자량 화합물의 존재 또는 부재에 의존하고, 상기 소수성, 고분자량 화합물이 활성화 탄소와 가용화된 폴록사머를 접촉시킴으로써 제거될 수 있다는 발견이다.
활성화 탄소는 광범위한 비-특이적 흡착 특성을 갖는 물질이고, 화학물질 및 식품의 제조, 하수 또는 폐수 처리, 물 여과 및 소분자 약물의 제조와 같은 산업 분야에서 흡착제 또는 탈색제로서 사용된다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 바, 용어 "활성 탄소" 또는 "활성화 탄소" 또는 "활성화 차콜" 은 이의 포어 구조를 강화시키기 위한 방법에 적용된 탄소질 물질을 의미한다. 활성화 탄소는 매우 높은 표면적을 갖는 다공성 고체이다. 이는 석탄, 목재, 코코넛 껍질, 넛쉘 (nutshell), 토탄 및 또한 유기 중합체를 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 활성화 탄소는 제어된 분위기 하 가열을 수반하는 물리적 활성화 또는 강한 산, 염기, 또는 산화제를 사용하는 화학적 활성화를 사용하여, 이러한 물질로부터 제조될 수 있다. 활성화 방법은 높은 표면적을 갖는 다공성 구조를 생성하고, 이는 활성화 탄소에 불순물 제거를 위한 높은 용량을 제공한다. 활성화 방법은 표면의 산성을 제어하기 위해 변경될 수 있다.
유기 중합체로부터 수득된 활성화 탄소가 또한 본 발명에 따른 소수성, 고분 자량 화합물을 제거하는데 적합하다는 것이 발견되었다. 유기 중합체는 임의의 합성의, 화학적으로 정의된 유기 중합체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리메틸펜텐, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리비닐 또는 폴리프로필렌이다.
활성화 탄소는 구형 활성 탄소 입자를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 이는 본질적으로 모든 세 공간 차원에서 유사한 익스텐션 (extension) 을 갖는다는 것을 의미한다. 두 상이한 공간 차원에서 익스텐션이 3배 초과 차이나지 않는 (바람직하게는 2배 미만) 경우, 구형 이외에, 입방체, 평행육면체 또는 실린더형이 고려가능하다.
유기 중합체로부터 수득된 활성화 탄소는 구형 유기 물질, 예를 들어 폴리스티렌의 열분해에 의해 제조될 수 있다. 그러나, Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 4, 2009, pages 1063 - 1073 에 기재된 바와 같이, 또한 글루코오스 용액을 열분해할 수 있다. 구형 활성화 탄소의 제조는 US 20060148645 및 US 2008171648 에 추가 개시되어 있다.
상기 활성 탄소 중합체 입자의 제조의 예시적 방식은 중합체 볼 (ball), 특히 이온 교환 볼 (이의 중합체 구조는, 유리체로서, 분리가능한 관능기, 특히 술포닐 기 및/또는 카르복실 기를 함유함) 을 사용하는 것이다. 다공성 중합체 볼은 열분해되고, 임의로 열분해된 중합체 볼은 활성화 단계에 적용된다. 관능기의 분리는 바람직하게는 5% 내지 15% 의 잔류 함량 (사용된 관능기의 중량 분율에 대해) 까지 발생한다. 이러한 제 1 열 처리의 온도는 적합하게는 10 min 내지 60 min 동안 200℃ 내지 350℃ 범위이다. 원칙적으로 분위기는 임의적이다. 이후의 열분해 단계는 본질적으로 제 1 열 처리의 최종 온도에 상응하는 온도에서 개시되고, 바람직하게는 600℃ 내지 800℃ 에서 종료된다. 가열 속도는 적합하게는 5 K/min 내지 0.5 K/min 범위이고, 이로부터 열분해 단계의 지속기간이 즉시 계산될 수 있다. 활성화 단계는 중요하지 않고, 종래의 방식으로 수행된다.
적합한 활성화 탄소는 예를 들어 CAS 7440-44-0 이고, 적합한 구형 활성화 탄소는 AK 1500 (Felgentraeger) 이다.
적합한 구형 활성화 탄소는 또한 SARATECH (TM) 100562, SARATECH (TM) 100772 및 SARATECH (TM) 101373 (Blucher GmbH, Erkrath, Germany) 로서 입수가능하다.
활성화 탄소는 표면적이 바람직하게는 10 내지 10 000 ㎡/g, 보다 바람직하게는 100 내지 5000 ㎡/g, 가장 바람직하게는 300 내지 2000 ㎡/g 이다.
활성화 탄소의 평균 입자 크기는 바람직하게는 2 μm 이상, 보다 바람직하게는 2 내지 800 μm 이다.
입자의 특징분석은 당업계에 알려져 있고, 바람직하게는 체질에 의해 수행된다. 이는 하기에 기재되어 있다: I. C. Edmundson, Particle-size analysis, H. S. Bean, A. H. Beckett and J. E. Carles (eds): Advances in Pharmaceutical Sciences vol.2, Academic Press, London 1967, 95-174.
생성물 분획의 평균 입자 크기는 EDANA 권장 시험 방법 No. WSP 220.2-05 "입자 크기 분포" 에 의해 측정될 수 있고, 여기서 스크린 분획의 질량 비율은 겹침 형태로 플롯팅되고, 평균 입자 크기는 그래프로 측정된다. 여기서 평균 입자 크기는 메쉬 (mesh) 크기의 값이고, 이는 누적 50 중량% 를 발생시킨다.
특정한 입자 크기 범위, 예를 들어 2 내지 800 μm 를 갖는 활성화 탄소의 비율은 전체 활성화 탄소의 바람직하게는 90 중량% 이상, 보다 바람직하게는 95 중량% 이상, 가장 바람직하게는 98 중량% 이상이다.
폴록사머는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)/폴리프로필렌 글리콜 (PPG) 트리 블록 공중합체이다.
폴록사머, CAS 번호 9003-11-6 은 일반식 I 을 갖는다:
I
[식 중, x 및 z 는 바람직하게는 독립적으로 5 내지 150 이고, y 는 바람직하게는 15 내지 67 임].
이는 시판된다 (Pluronics® 또는 Lutrole®, 예를 들어 Pluronic® 용액, 겔, 또는 고체, 예컨대 Pluronic® F-68). 대안적으로, 폴록사머는 당업계에 알려진 방법에 따라 원료로부터 만들어질 수 있다 (예를 들어, U.S. 특허 No. 3,579,465 및 3,740,421 참조).
폴록사머에 관한 추가의 정보는 Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, volume 9 "Stoffe P-Z", 1994, pages 282 내지 284 에서 확인될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 정제되고 사용되는 폴록사머는 폴록사머 188 이다. 폴록사머 188 은 평균 분자량이 7680 내지 9510 g/mol 이다 (약전에 따라 정의 및 측정됨). 화학식 I 에서, 폴록사머 188 에 대해, x 및 z 는 약 80 이고, y 는 약 27 이다. 이러한 화합물은 폴록사머 188, Pluronic® F 68, Kolliphor® P 188, Lutrol® F 68, SYNPERONIC™ PE/F 68 또는 PLONON #188P 로서 시판된다.
당업자는 세포 배양물 배지의 성분으로서 어떻게 폴록사머를 사용하는지 알고 있다. 당업자는 사용하기에 적합한 양과 형태를 인지하고 있다. 그러나 때때로, 심지어 표준 절차 및 레시피에 따라 제조된 경우라도, 세포 배양물은 통상적으로 수행되는 것만큼 양호하게 수행되지 못한다. 이는 폴록사머로 인한 것일 수 있다는 것이 확인되었다. 이와 같은 경우, 최근까지 폴록사머의 전체 로트는 폐기되어야 했다. 본 발명은 상기 불량한 로트를 정제하는 간단하고 효율적인 방법을 제공하여, 이들이 정제 후 세포 배양물 성분으로서 사용될 수 있도록 한다.
예상만큼 수행되지 못하는 폴록사머의 로트의 확인은, 예를 들어 세포 배양물에서 수행될 수 있다. 폴록사머를 포함하는 세포 배양물이 예상된 세포 생존능력 및 성능을 나타내지 못하는 경우, 사용 전 폴록사머를 본 발명에 따른 활성화 탄소와 인큐베이팅하여 정제함으로써 이를 개선하기 위한 시도를 할 수 있다.
예상만큼 수행되지 못하는 임의의 세포 배양물은 본 발명에 따른 폴록사머의 정제를 유발할 수 있다. 또한, 실제 세포 배양 이전에 세포 배양 시험을 할 수 있다. 세포 배양물의 성능을 조사하기 위한 실험 셋업은 하기와 같을 수 있다:
적합한 실험 셋업은 Haofan Peng et al., Biotechnol. Prog., 2014, Vol. 30 (6), 1411 - 1418 에 기재된 소규모 배플 셰이크 플라스크 모델 (baffled shake flask model) 이다. 추가 세부사항은 실시예 6 에서 확인될 수 있다.
숙련인에게, 하기는 자명하다:
- 상이한 농도의 폴록사머가 사용될 수 있다 (통상적으로 0.1 내지 5 g/L)
- 임의의 유형의 CHO 세포 또는 다른 세포가 사용될 수 있다
- 선택된 세포주에 적합한 임의의 유형의 세포 배양물 배지가 사용될 수 있다
- 배양은 바람직하게는 오비탈 셰이커에서 수행되고, 속도 및 스로우 (throw) 는 선택된 세포주 및 배양 조건에 대해 조정될 필요가 있을 수 있다.
- 상기 기재된 선택된 파라미터에 따라, 생존능력 저하는 2 시간 내지 5 일 사이의 적합한 시점에서 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 생존능력의 정의는, 예를 들어 Beckman-Coulter ViCell XR 또는 유사물에서 트리판 블루 검정에 의해 측정된 바와 같은, 용액 중 살아있는 세포의 백분율이다.
불량한 성능의 원인이 되는 성분이 고분자량, 소수성 성분임을 발견함에 따라, 또한 각각의 폴록사머의 로트를 이의 사용 전 분석할 수 있다. 고분자량, 소수성 성분이 존재하는 경우, 로트는 사용 전 본 발명에 따른 활성화 탄소와 인큐베이팅함으로써 정제된다. 분석은 예를 들어 SEC (크기 배제 크로마토그래피) 에 의해 수행될 수 있다.
활성화 탄소와의 접촉을 위해, 폴록사머는 용매에 용해될 필요가 있다.
폴록사머, 특히 폴록사머 188 을 용해시키고, 이후 제거될 수 있는 임의의 용매 또는 용매 혼합물이 사용될 수 있고, 이는 적합한 용매이다. 투명한 용액이 수득되어야 하지만 약간의 탁도는 허용가능하다. 용매는 이후 제거되어야 하기 때문에 쉽게 증발할 수 있는 용매를 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 용매로서 물의 경우, 폴록사머는 동결건조 또는 분무 건조될 수 있다. 바람직한 용매는 아세톤, 아세토니트릴, DMSO, 에탄올, 메탄올, THF, 아세토니트릴 및 물 또는 이의 혼합물, 예컨대 물 및 에탄올의 혼합물이다.
소량의 물의 기타 용매로의 첨가는 폴록사머의 용해도를 개선할 수 있다. 또한, 폴록사머의 양에 비해 더 많은 양의 용매를 사용하여, 탁도, 점도 등을 감소시킬 수 있다. 폴록사머가 충분히 용해되면, 통상적으로 용매의 양은 중요하지 않은데, 이는 활성화 탄소로의 처리 후 제거되기 때문이다.
하기에서, 적합한 용매의 몇몇 예 및 필요한 양이 제시된다.
폴록사머 188 의 g 당 사용될 필요가 있는 용매의 최소 양은 폴록사머를 용해시키는데 필요한 최소 양으로 정의된다.
1 g 의 폴록사머 188 을 용해시키기 위해 필요한 통상적인 양 및 용매의 예는 하기와 같다:
물:
≥ 6.5 ml (6.5 ml/g 에서 매우 점성임 -> 더 많은 양의 물이 점도를 감소시키기 위해 권장됨)
THF:
50 ml/g -> 투명 용액
메탄올:
80 ml/g -> 투명 용액
아세토니트릴:
30 ml/g -> 약간의 탁도
40 ml/g -> 투명 용액
DMSO:
60 ml/g -> 약간의 탁도
(60 ml DMSO + 800 μl 물)/g -> 투명 용액
아세톤:
60 ml/g -> 약간의 탁도
(60 ml 아세톤 + 800 μl 물)/g -> 투명 용액
에탄올:
(50 ml 에탄올 + 1 ml 물)/g -> 투명 용액
프로판올:
(120 ml 프로판올 + 6 ml 물)/g -> 투명 용액
1-부탄올:
(150 ml 1-부탄올 + 8 ml 물)/g -> 투명 용액
2-부탄올:
(150 ml 2-부탄올 + 9 ml 물)/g -> 투명 용액
2-메틸-1-프로판올: (150 ml 2-메틸-1-프로판올 + 7 ml 물)/g -> 투명 용액
용해된 폴록사머를 포함하는 용액은 이후 활성화 탄소와 접촉한다. 또한, 활성화 탄소와 용매를 먼저 혼합한 후, 폴록사머를 첨가할 수 있다. 활성화 탄소와 가용화된 폴록사머의 인큐베이션은 배치식 또는 연속식으로 수행될 수 있다.
용매, 폴록사머 및 활성화 탄소를 포함하는 혼합물의 접촉 시간은 통상적으로 1 분 내지 24 시간이다. 인큐베이션이 배치 방식으로 수행되는 경우, 바람직하게는 3 시간 내지 15 시간으로 수행된다.
접촉이 활성화 탄소를 통해 폴록사머를 함유하는 액체를 흐르게 함으로써 연속적으로 수행되는 경우, 접촉 시간은 통상적으로 1 분 내지 30 분이다. 이를 위해, 활성화 탄소는 컬럼, 카트리지, 필터 또는 임의의 기타 적합한 디바이스에 패킹될 수 있다. 바람직하게는, 디바이스의 액체의 체류 시간은 1 내지 10 분이다. 연속식 정제를 수행하기에 적합한 시스템은 Stax AKS Sytem (Pall) 이다.
인큐베이션이 배치식으로 수행되는 경우, 성분은 혼합되고, 혼합물은 바람직하게는 접촉 시간 중, 예를 들어 교반 또는 셰이킹에 의해 진탕된다. 통상적으로, 현탁액의 인큐베이션은 실온에서 수행된다.
활성화 탄소의 양은 제거되어야 하는 고분자량 성분의 양에 따라 조정될 수 있다. 더 많은 고분자량 성분이 제거되어야 할수록, 더 많은 활성화 탄소가 사용되어야 한다는 것을 발견하였다. 통상적으로, 활성화 탄소는 1:1 내지 1:10 (활성화 탄소의 중량 : 폴록사머의 중량) 의 양으로 사용된다.
이후, 활성화 탄소는 현탁액으로부터 제거된다. 활성화 탄소로부터 액체를 분리하는 것은 예를 들어 침강, 원심분리 및/또는 바람직하게는 여과에 의해 수행될 수 있다. 통상적으로, 둘 이상의 여과 단계가 사용되어 가능한 완전히 활성화 탄소를 제거한다. 당업자는 활성화 탄소의 입자 크기에 대해 필터의 포어 크기를 조정할 수 있다.
활성화 탄소 제거 후, 액체는 폴록사머를 포함하는 용액으로부터 제거된다. 이는 예를 들어, 증발, 분무 건조 또는 동결건조에 의해 수행될 수 있다.
증발은 바람직하게는 보통의 온도에서 감압 하 수행된다. 증발은 통상적으로 증류형 장비를 이용하여 수행된다. 소규모에서, 이는 회전 농축기를 이용하여 용이하게 수행된다.
통상적인 조건은 예를 들어 다음과 같다:
아세톤: 555 hPa, 40℃
아세토니트릴: 240 hPa, 40℃
THF: 355 hPA, 40℃
에탄올: 175 hPa, 40℃
메탄올: 335 hPa, 40℃
물: 70 hPA, 40℃
온도가 40℃ 미만 또는 초과인 경우, 압력은 이에 따라 조정되어야 한다. 50℃ 초과의 온도에 대한 연장된 노출은 회피되어야 한다.
필요한 경우, 부가적인 건조가 오븐 또는 진공 오븐에서 수행될 수 있다.
동결건조 또는 얼림 건조 (freeze drying) 를 위해, 물질은 예를 들어 액체 질소에서 얼려지고, 용매는 주변 압력을 감소시킴으로써 승화된다.
정제 및 건조된 폴록사머는 이후 세포 배양물에서 사용될 수 있다. 이의 입자 크기가 조정되어야 하는 경우, 세포 배양물 배지에 이를 첨가하기 전 임의로 밀링 (mill) 될 수 있다.
세포 배양물은 세포가 배양되는 임의의 셋업이다.
세포 배양은 세포의 배양에 적합한 임의의 컨테이너, 예컨대 페트리 디쉬, 접촉 플레이트, 바틀, 튜브, 웰, 용기, 백, 플라스크 및/또는 탱크에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 이는 바이오반응기에서 수행된다. 통상적으로, 컨테이너는 사용 전 멸균된다. 배양은 통상적으로 외부 미생물이 환경으로부터 오염되는 것을 제한하는, 적합한 온도, 삼투압, 통기, 진탕 등과 같은 적합한 조건 하 수성 세포 배양물 배지에서 세포를 인큐베이션함으로써 수행된다. 당업자는 세포의 생장/배양을 지지 또는 보존하기에 적합한 인큐베이션 조건을 인지하고 있다.
본 발명에 따른 세포 배양물 배지 (사용되는 동의어: 배양물 배지) 는 세포의 생체 외 생장을 보존 및/또는 지지하고/하거나 특정 생리학적 상태를 지지하는 성분의 임의의 혼합물이다. 또한, 이는 보존 배지로서 사용뿐 아니라 예비-농축 배양물로 적합하다.
바람직하게는, 이는 화학적으로 정의된 배지이다. 세포 배양물 배지는 세포의 생체 외 생장을 보존 및/또는 지지하거나, 개별적으로 첨가되는 추가의 성분 (배지 보충물) 과 조합되거나 조합되지 않은 선택된 성분의 첨가를 위해 사용되기 위해 필요한 모든 성분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세포 배양물 배지는 세포의 생체 외 생장을 보존 및/또는 지지하는데 필요한 모든 성분을 포함한다.
세포의 생체 외 생장을 보존 및/또는 지지하는데 필요한 모든 성분을 포함하는 세포 배양물 배지는 통상적으로 적어도 하나 이상의 당류 성분, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민 또는 비타민 전구체, 하나 이상의 염, 하나 이상의 완충 성분, 하나 이상의 공동-인자 및 하나 이상의 핵산 성분 (질산함유 염기) 또는 이의 유도체를 포함한다. 이는 또한 재조합 단백질, 예를 들어 r인슐린, rBSA, r트랜스페린, r시토킨 등과 같은 화학적으로 정의된 바이오화학물질을 포함할 수 있다.
세포 배양물 배지는 물 또는 수성 완충액에 용해되기 위해 사용되는 건조 분말 형태 또는 수성 액체 형태일 수 있다.
당업자는 구체적인 고안된 목적을 위해 적합한 세포 배양물 배지를 선택할 수 있다.
실험 데이터는, 단지 폴록사머 188 보다 더 소수성인 (통상적으로 보다 높은 PPO/PEO 비로 인해), 고분자량 성분을 갖는 폴록사머 188 로트만이 세포 생존능력에 대해 부정적인 영향을 가지며, 활성화 탄소에 의해 제거될 수 있다는 것을 보여준다.
유사한 소수성 성질을 갖는, 분자량이 약 13000 내지 50000 g/mol 인 고분자량 성분, 예를 들어 폴록사머 188 (유사한 PPO/PEO 비) 은 세포 생존능력에 대해 부정적인 영향을 갖지 않으며, 활성화 탄소에 의해 제거될 수 없다 (도 3 및 7).
폴록사머가 중앙에 두 소수성 블록 및 친수성 블록을 갖는 양친매성 중합체라는 사실을 고려할 때, 활성화 탄소가 실제적으로 보다 소수성이고, 보다 높은 분자량 폴록사머 성분을 선택적으로 흡착할 수 있는 한편, 실제 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188) 의 흡착은 훨씬 덜 하다는 것은 다소 놀랍다. 이는 양호한 수율의 세포 배양에 적합한 폴록사머의 성공적인 정제를 허용한다.
사용되는 활성화 탄소의 양을 기준으로, 특히 활성화 탄소가 과량으로 사용되는 경우, 본 발명의 방법은 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 소수성, 고분자량 성분을 폴록사머로부터 제거하기에 적합한 한편, 통상적으로 80% 초과, 바람직하게는 90% 이상의 표적 폴록사머가 활성화 탄소로의 처리 후 다시 수득될 수 있다.
상기 및 하기에 인용된 모든 출원, 특허 및 공개물, 및 또한 2016년 3월 17일 출원된 대응 특허 출원 EP 16160811.2 의 전체 개시물은 본원에 참조 인용된다.
실시예
실시예 1: 물 중 활성화 탄소로의 폴록사머의 정제.
활성화 탄소를 195 g 의 탈염수 (첨가된 활성화 탄소의 양에 대해 하기 표 참조) 에 첨가하였다. 5.0 g 폴록사머 188, 각각을 현탁액에 첨가하였다 (하기 표 참조). 밤새 현탁액을 혼합한 후, 활성화 탄소를 제거하기 위해 Pall VacuCap® (0.2 μm) 을 통해 이를 여과하였다. 여과물을 동결건조하였다.
실시예 2: 에탄올/물 중 활성화 탄소로의 정제.
5.0 g 폴록사머 188 을 195 g 에탄올에 각각 첨가하였다. 2.5 wt% 물, 각각을 첨가하여 폴록사머 188 을 용해시켰다. 혼합 1 시간 후, 활성화 탄소를 첨가하였다 (하기 표 참조):
밤새 현탁액을 혼합한 후, 이를 2.5 μm 필터 (Art-Nr. 1005-070, Whatman, 2.5 μm 포어 크기) 를 갖는 프릿 (frit) P4 를 통해 여과하였다. 여과물 중 잔류 탄소를 2.5 μm 필터 (Art-Nr. 1005-070, Whatman, 2.5 μm 포어 크기) 를 갖는 석션 필터를 사용하여 두번째 여과에 의해 제거하였다. 용매를 폴록사머가 건조될 때까지 회전 농축기에서 증발시켰다.
실시예 3: 에탄올/물 중 구형 활성화 탄소로의 정제.
에탄올/물 (97.5 : 2.5) 중 5.0 g 폴록사머 188 의 용액에, 하기 양의 구형 활성화 탄소 (Felgentraeger, 표면적: 1000 - 2000 ㎡/g, 입자 크기: 0.3 - 0.8 mm) 를 첨가하였다 (하기 표 참조):
밤새 혼합한 후, 현탁액을 2.5 μm 필터 (Art-Nr. 1005-070, Whatman, 2.5 μm 포어 크기) 를 갖는 프릿 P4 를 통해 여과하였다. 하나의 여과 단계에서 구형 활성화 탄소가 쉽게 제거되었기 때문에, 두번째 여과는 필요하지 않았다. 용매를 폴록사머가 건조될 때까지 회전 농축기에서 증발시켰다.
실시예 4: THF 중 활성화 탄소로의 정제.
5.0 g 폴록사머 188 을 250 ml THF 에 용해시켰다. 하기 양의 활성화 탄소를 첨가하였다:
밤새 현탁액을 혼합한 후, 이를 2.5 μm 필터 (Art-Nr. 1005-070, Whatman, 2.5 μm 포어 크기) 를 갖는 프릿 P4 를 통해 여과하였다. 여과물 중 잔류 탄소를 2.5 μm 필터 (Art-Nr. 1005-070, Whatman, 2.5 μm 포어 크기) 를 갖는 석션 필터를 사용하여 두번째 여과에 의해 제거하였다. 용매를 폴록사머가 건조될 때까지 회전 농축기에서 증발시켰다.
실시예 5: 아세톤 중 활성화 탄소로의 정제.
5.0 g 폴록사머 188 을 300 ml 아세톤에 용해시켰다. 하기 양의 활성화 탄소를 첨가하였다:
밤새 현탁액을 혼합한 후, 이를 2.5 μm 필터 (Art-Nr. 1005-070, Whatman, 2.5 μm 포어 크기) 를 갖는 프릿 P4 를 통해 여과하였다. 여과물 중 잔류 탄소를 2.5 μm 필터 (Art-Nr. 1005-070, Whatman, 2.5 μm 포어 크기) 를 갖는 석션 필터를 사용하여 두번째 여과에 의해 제거하였다. 용매를 폴록사머가 건조될 때까지 회전 농축기에서 증발시켰다.
실시예 6: 소규모 세포 검정으로 측정된 세포 생존능력.
Haofan Peng et al., Biotechnol. Prog., 2014, Vol. 30 (6), 1411 - 1418 과 유사하게 세포 검정을 수행하였다. 잠재적으로 세포를 손상시키는 전단력을 유도하기 위해 배플 셰이크 플라스크에서 세포 배양을 수행한다. CHO-S 세포 및 Cellvento™ CHO-220 배지를 사용한다. 폴록사머 농도는 1 g/L 이다. 세포 배양물 배지를, 약 백만 세포/mL 의 생존가능한 세포 밀도로 선택된 세포로 접종한다. 오비탈 셰이커에서 셰이크된 인큐베이터에서 배양을 수행한다. 세포 생존능력 (용액 중 살아있는 세포의 백분율) 을 Beckman-Coulter ViCell XR 에서 트리판 블루 검정에 의해 4 h 후 측정한다. 각각의 로트는 3회 측정된다. 하기 평균 세포 생존능력은 폴록사머 188 로트 A, B, C 및 D 에 대해 측정되었다:
폴록사머 188 로트 A 및 C 는 매우 성능이 불량한 로트이고, 로트 B 는 성능이 보통인 로트이고, 로트 D 는 성능이 양호한 로트이다. 일반적으로, > 90% 가 충분히 양호한 생존능력으로 간주된다.
실시예 6a: 실시예 1 에 기재된 정제된 폴록사머 로트를 사용하는 세포 생존능력
세포 검정을 실시예 6 에 기재된 바에 따라 수행하였다. 실시예 1 에 기재된 정제된 폴록사머 로트의 성능:
* 측정의 오류 마진 내에 있음.
원래 로트의 성능이 보다 불량할수록 (보다 낮은 세포 생존능력), 물 중 20 wt% 활성화 탄소를 사용한 정제 후 세포 생존능력의 개선은 보다 두드러진다. 성능이 불량한 로트 A 및 C 에 대한 세포 생존능력은 각각 45% 및 138% 로 개선된다. 성능이 보통인 로트 B 에 대한 세포 생존능력은 14% 로 개선된다. 성능이 양호한 로트 D 의 20 wt% 활성화 탄소로의 처리는, 정제할 것이 없으므로 아무런 효과가 없다.
실시예 6b: 실시예 2 에 기재된 정제된 폴록사머 로트를 사용하는 세포 생존능력
검정을 실시예 6 에 기재된 바에 따라 수행하였다. 실시예 2 에 기재된 정제된 폴록사머 로트의 성능:
* 측정의 오류 마진 내에 있음.
세포 배양물의 원래 로트의 성능이 보다 불량할수록 (보다 불량한 세포 생존능력), 보다 활성화된 탄소가 > 90% 의 양호한 세포 생존능력을 달성하기 위한 정제에 요구된다. 성능이 매우 불량한 로트 A (49% 생존능력) 에 대해, 100 wt% 활성화 탄소가 > 90% 의 세포 생존능력을 충분히 달성하기 위한 로트 정제에 요구된다 (또한 도 1 참조). 성능이 보통인 로트 B (87% 생존능력) 에 대해, 단지 20 wt% 활성화 탄소가 > 90% 의 세포 생존능력을 달성하기 위한 정제에 사용될 필요가 있다 (또한 도 2 참조). 로트 D 의 성능은 96% 생존능력으로 매우 양호하다. 활성화 탄소로의 처리는 로트의 성능에 아무런 영향도 없다 (샘플 사이의 작은 편차는 측정의 오류 내에 있음, 또한 도 3 참조). 이는 폴록사머 로트 D 의 고분자량 성분이 소수성이 아니며, 이에 따라 활성화 탄소에 의해 제거되지 않는다는 것을 의미한다. SEC 데이터는 이러한 발견을 지지한다 (도 7).
실시예 6c: 실시예 3 에 기재된 정제된 폴록사머 로트를 사용하는 세포 생존능력
검정을 실시예 6 에 기재된 바에 따라 수행하였다. 실시예 3 에 기재된 정제된 폴록사머 로트의 성능:
활성화 탄소로의 처리를 통한 성능이 불량한 폴록사머 로트의 개선은 구형 활성화 탄소 및 표준 활성화 탄소에 대해 유사하다 (실시예 6b 참조). 100 wt% 구형 활성화 탄소를 사용한 정제는 로트 A 및 B 에 대해 각각 99 및 98% 의 세포 생존능력을 유도한다. 이는 로트 B 에 대해 13% 및 로트 A 에 대해 100% 초과의 개선에 해당한다.
실시예 6d: 실시예 4 에 기재된 정제된 폴록사머 로트를 사용하는 세포 생존능력
검정을 실시예 6 에 기재된 바에 따라 수행하였다. 실시예 4 에 기재된 정제된 폴록사머 로트의 성능:
성능이 매우 불량한 로트 A 의 THF 중 100 wt% 활성화 탄소로의 정제는 예를 들어 물 또는 에탄올/물 중 수행된 정제와 유사하게, 세포 생존능력의 유의한 개선을 유도한다 (실시예 6a-6c 참조).
실시예 6e: 실시예 5 에 기재된 정제된 폴록사머 로트를 사용하는 세포 생존능력
검정을 실시예 6 에 기재된 바에 따라 수행하였다. 실시예 5 에 기재된 정제된 폴록사머 로트의 성능:
성능이 매우 불량한 로트 A 의 아세톤 중 활성화 탄소로의 정제는 세포 생존능력의 유의한 개선을 유도하지만, 예를 들어 물, 에탄올/물 또는 THF 중에서 나타난 바와 같지는 않다 (실시예 6a-d 참조).
실시예 7:
모든 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 측정을 하기에 따라 수행한다:
보정 표준물: PEG (Mp: 430, 982, 1960, 3020, 6690, 12300, 26100 및 44 000 g/mol)
용리액: THF
유속: 1 ml/min
주입 부피: 100 μl
컬럼: 입자 크기 = 5 μm, 물질 = 스티렌-디비닐벤젠
온도: 40℃
검출기: 굴절률 (RI)
실시예 7a:
폴록사머 188 로트 A, B, C 및 D 의 크기 배제 크로마토그래피 측정 (도 4). 고분자량 성분은 ~ 13 000 내지 40 000 g/mol (도 4II) 에서 관찰된다.
실시예 7b:
실시예 2 에 기재된 바와 같은, 에탄올/물 중 10, 20 및 100 wt% 활성화 탄소로 정제된 성능이 불량한 로트 A 의 크기 배제 크로마토그래피 측정 (도 5 참조). 정제는 ~29 000 g/mol 의 소수성 고분자량 성분을 제거한다. 100 wt% 활성화 탄소를 이용하여, 소수성 고분자량 성분을 완전히 제거한다. 그 결과, 폴록사머 로트가 세포 배양물에서 사용되기에 적합하도록 세포 생존능력은 유의하게 개선된다 (실시예 6b 및 도 1).
실시예 7c:
실시예 2 에 기재된 바와 같은, 에탄올/물 중 10 및 100 wt% 활성화 탄소로 정제된 성능이 보통인 로트 B 크기 배제 크로마토그래피 측정 (도 6 참조). 정제는 ~16 000 g/mol 의 고분자량 성분의 소수성 부분을 제거하고, 이는 ~ 16 000 g/mol 에서 고분자량 피크의 강도의 유의한 감소를 유도한다. 그 결과, 정제된 로트가 세포 배양물에서 사용되기에 적합하도록 세포 생존능력은 유의하게 개선된다 (실시예 6b 및 도 2).
실시예 7d:
실시예 2 에 기재된 바와 같은, 에탄올/물 중 10, 20 및 40 wt% 활성화 탄소로 처리된 성능이 양호한 로트 D (점선) 의 크기 배제 크로마토그래피 측정 (도 7 참조). 활성화 탄소로의 처리 후 고분자량 피크 (~15 000 g/mol) 에서 유의한 변화는 관찰되지 않는다. ~ 11 000 g/mol 에서 40% 활성화 탄소에 대해 관찰된 작은 편차는 잔류 활성화 탄소 (완전히 제거되지 않음) 에 기인할 수 있다. 이는 로트 D 의 고분자량 성분이 폴록사머 188 보다 높은 소수성을 갖지 않고, 이에 따라 제거되지 않는다는 것을 의미한다. 폴록사머 188 과 유사한 소수성 성질을 갖는 고분자량 성분 (유사한 PPO/PEO 비) 은 세포 생존능력에 부정적인 영향을 갖지 않으며, 활성화 탄소에 의해 제거될 수 없다 (로트 D, 실시예 6b 및 도 3).
실시예 8: 플로우 스루식으로의, 아세톤 중 활성화 탄소로의 폴록사머의 정제
5.0 g 구형 활성화 탄소 (Felgentraeger, 표면적 1000 - 2000 ㎡/g, 입자 크기 0.3 - 0.8 mm) 를 하단 끝에 프릿을 갖는 유리 컬럼 (높이 190 mm, 내부 직경 10 mm) 에 채웠다. 하단 끝에서 컬럼을 밀봉하고, 아세톤으로 채우고, 공기 버블을 제거하기 위해 조심스럽게 회전시켰다. 컬럼의 활성화 탄소 베드를 밤새 정치시켰다. 5.0 g 폴록사머 188 로트 A 를 300 ml 아세톤 중 용해시켰다. 폴록사머 용액을 컬럼에 붓고, 하단 밀봉부를 제거하였다. 4.6 ml/min 의 유속으로 컬럼을 통과한 후의 폴록사머 용액을 수집하였다. 용매를 폴록사머가 건조될 때까지 회전 농축기에서 증발시켰다.
세포 검정을 실시예 6 에 기재된 바에 따라 수행하였다. 정제된 폴록사머 로트의 성능:
* 실시예 6 에서 기재된 폴록사머 로트 A 에 대해 측정된 세포 생존능력 (49%) 을 기준으로 계산된 생존능력의 개선.
플로우 스루식으로의, 아세톤 중 활성화 탄소로의 성능이 매우 불량한 로트 A 의 정제는 세포 생존능력의 유의한 개선을 유도한다. 개선은 표준 활성화 탄소를 사용하는 배치 방식보다 더 양호하다 (실시예 6e 참조).
실시예 9: 보다 짧은 혼합 시간을 사용하는 활성화 탄소로의 정제:
폴록사머 188 로트 A 의 정제를 실시예 2 에 기재된 바에 따라 수행하였으나, 현탁액을 단지 15 분 동안 혼합하였다.
* 실시예 6 에서 기재된 폴록사머 로트 A 에 대해 측정된 세포 생존능력 (49%) 을 기준으로 계산된 생존능력의 개선.
15 분의 혼합 시간으로, 에탄올/물 중 100 wt% 활성화 탄소로의 성능이 매우 불량한 로트 A 의 정제는, 밤새 혼합하여 수행된 정제와 유사하게, 세포 생존능력의 유의한 개선을 유도한다 (실시예 6b 참조).
Claims (15)
- 하기 단계에 의한, 세포 배양물에서 세포 생존능력을 증가시키기 위한 폴록사머의 효능 증가 방법:
a) 효능이 개선되어야 할 폴록사머를 제공하는 단계
b) 단계 a) 의 폴록사머를 용매에 용해시키고, 이를 활성화 탄소와 접촉시키는 단계
c) 활성화 탄소 및 용매를 제거하여 개선된 효능을 갖는 폴록사머를 수득하는 단계. - 제 1 항에 있어서, 용매가 물, 아세톤, THF 또는 에탄올 및 물의 혼합물인 것을 특징으로 하는 폴록사머의 효능 증가 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 용해된 폴록사머가 1 분 내지 24 시간 동안 활성화 탄소와 접촉하는 것을 특징으로 하는 폴록사머의 효능 증가 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c) 에서, 활성화 탄소가 여과 및/또는 원심분리에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 폴록사머의 효능 증가 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 에서 제공된 폴록사머가 13.000 g/mol 초과의 분자량을 갖는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴록사머의 효능 증가 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머가 7680 내지 9510 g/mol 의 평균 분자량을 갖는 폴록사머인 것을 특징으로 하는 폴록사머의 효능 증가 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 탄소가 유기 중합체성 물질의 열분해에 의해 수득된 활성화 탄소인 것을 특징으로 하는 폴록사머의 효능 증가 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 탄소가 2 내지 800 μm 의 중간 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 폴록사머의 효능 증가 방법.
- 폴록사머를 용매에 용해시키고, 이를 활성화 탄소와 접촉시킨 후, 활성화 탄소 및 용매를 제거하는 것에 의한, 폴록사머로부터의 소수성, 고분자량 성분 제거방법.
- 세포 배양물 배지에 폴록사머를 첨가하기 전, 하기 단계로 처리된 폴록사머를 포함하는 수성 배양물 배지에서 세포를 배양하는 것에 의한, 세포 배양 수행 방법:
a) 폴록사머를 용매에서 용해시키고, 이를 활성화 탄소와 접촉시키는 단계
b) 활성화 탄소 및 용매를 제거하는 단계. - 제 10 항에 있어서, 용해된 폴록사머가 2 내지 24 시간 동안 활성화 탄소와 접촉하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 수행 방법.
- 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 단계 c) 에서, 활성화 탄소가 여과 및/또는 원심분리에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 수행 방법.
- 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 에서 제공된 폴록사머가 13.000 g/mol 초과의 분자량을 갖는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 수행 방법.
- 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머가 7680 내지 9510 g/mol 의 평균 분자량을 갖는 폴록사머인 것을 특징으로 하는 세포 배양 수행 방법.
- 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 탄소가 2 내지 800 μm 의 중간 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 수행 방법.
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