JP6898357B2 - 生体高分子複合体の精製のための方法 - Google Patents
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Description
今日、タンパク質およびより大きい複合体を精製させる、様々な方法およびツールが提供される。これらの方法のほとんどが、好適なカラムを使用して精製させるクロマトグラフィーステップに基づく。しかし、カラムまたはクロマトグラフィーに基づく精製は、多くの時間と労力を要し、費用がかかる。その上、これらの種類の精製方法は、したがって、所望の機能性生体高分子複合体を単純で迅速に精製させる適切な方法とならない。適切な分離または精製方法としては、いくつかの異なる方法、例えば、沈殿および透析技術、クロマトグラフィー法ならびに電荷/質量の比によって支配される移動度による分子の分離を使用するゲル電気泳動が挙げられる。電気泳動は、広く使用され、多孔質母材、例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル中で通常実施される。しばしば、分子は、移動度に関連する一次元目の電場および、その後、一次元目の分離のために使用された電場とは方向が異なる電場への適用によって分離され、そのようにして、二次元ゲル電気泳動を作り出す。しかし、ゲル電気泳動は、機能性高分子の精製のための最適な方法ではない。つまり、ネイティブ電気泳動は可能であるが、典型的に、電気泳動は、変性条件を提供する必要がある。しかし、クロマトグラフィー単離と同様に、電気泳動は、多孔質母材に起因して、サイズにかかわらず、正味電荷に基づく。
WO2013/034160において、したがって、生体高分子複合体の集合、均一性および/または熱力学的安定性の判定に基づき、前記複合体を分析するための方法が提供される。しかし、そこに記載された方法を実施するには、したがって、精製された高分子複合体を提供することが必要である。
a)生体高分子複合体を含有する粗試料を用意するステップ、
b)25,000から35,000×gでの細胞残屑の分離のための第1の遠心分離ステップを行うステップ、
c)0%から25%(w/v)の量のオスモライト、ならびにシステインをチオール−アルキル化および/または還元させる化合物を含有する、第1の遠心分離ステップから得られた上清を補うステップ、
d)50,000から150,000×g、例えば、80,000から120,000×gでの遠心分離による、第2の遠心分離ステップを行うステップ、
e)沈殿のために、第2の遠心分離ステップから得られた上清を、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートで処理するステップ、
f)前記ポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールを含有しないバッファー中での再懸濁後に、ポリマーをベースとする沈殿物、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿物を有するオスモライトを使用して、密度勾配遠心分離を行うステップ、
g)ステップe)およびf)を1回または複数回、任意に繰り返すステップ、
h)生体高分子複合体の水溶性ポリマーをベースとする沈殿、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿による、濃縮のステップ
を含む、生体高分子複合体の精製のための方法を提供する。
最後に、本発明は、個体の免疫プロテアソームを含む20Sプロテアソームを阻害するための候補化合物の適合性を判定するための方法であって、
− 本発明による候補化合物を含有する、前記個体の免疫プロテアソームを含む20Sプロテアソームの結晶化のための方法のステップ、または本発明による候補化合物を含有する、結晶化された20Sプロテアソームを用意するステップ、
− 2.2Å以下の分解能での回折分析によって、免疫プロテアソームを含む20Sプロテアソームの結晶構造を決定するステップ、
− 前記分析に基づいて、個体の免疫プロテアソームを含む20Sプロテアソームの阻害剤としての候補化合物の適合性を判定するステップ
を含む、方法を提供する。
a)生体高分子複合体を含有する粗試料を用意するステップ、
b)25,000から35,000×gでの細胞残屑の分離のための第1の遠心分離ステップを行うステップ、
c)0%から25%(w/v)の量のオスモライト、およびシステインのチオール−アルキル化を可能にする化合物を、第1の遠心分離ステップから得られた上清に補うステップ、
d)50,000から150,000×g、例えば、80,000から120,000×gでの遠心分離による、第2の遠心分離ステップを行うステップ、
e)沈殿のために、第2の遠心分離ステップから得られた上清を、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートで処理するステップ、
f)前記ポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールを含有しないバッファー中での再懸濁後に、ポリマーをベースとする沈殿物、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿物を有するオスモライトを使用して、密度勾配遠心分離を行うステップ、
g)ステップe)およびf)を1回または複数回、任意に繰り返すステップ、
h)生体高分子複合体の水溶性ポリマーをベースとする沈殿、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿による、濃縮のステップ
を含む、生体高分子複合体の精製のための方法に関する。
本明細書で使用するとき、用語「高分子複合体」および特に用語「生体高分子複合体」は、本発明にしたがってサブユニットから作られた、任意の集合体を意味する。サブユニットは通常、高分子複合体の最小単位であり、高分子複合体の特徴的構造または特性の原因となる。サブユニットは、例えば、タンパク質モノマー、DNA−またはRNA−高分子である。述べた通り、高分子複合体は、異なるまたは同一の部分またはサブユニットの超分子集合体である。複合体は、少なくとも500kDa以上の大きさの高分子複合体を形成する、少なくとも2つの同一のまたは異なるサブユニットから、通常なる。多くの同一のサブユニットが結合して、高分子複合体を形成する場合、ホモオリゴマー高分子複合体と称される。ホモオリゴマー複合体のための一般的な例は、未変性分子量850kDaを有するシャペロニンGroELである。高分子複合体が複数の非同一のサブユニットによって形成される場合、ヘテロオリゴマー高分子複合体と称される。ヘテロオリゴマー複合体のための一般的な例は、未変性分子量750kDaを有する、真核生物の20Sプロテアソームである。かかる高分子複合体の構造的複雑さは、球状から細長い繊維状構造体までにわたり得る。高分子複合体のための大きさの上限は、現在、未知であり、核膜孔複合体およびいつくかのウイルスなどの構造体は、大きさが100MDaを超えることが知られている。
典型的に、生体高分子複合体は、粗試料、例えば、細胞培養から得られた細胞または生体高分子複合体を発現する細胞の培養から得られた上清の中に存在する。
本発明のステップc)による、言及された化合物での上清の処理は、好ましくは室温で行われるが、10分から1時間、例えば30分などの十分な時間、最初のステップにおいて、4℃から25℃の間の範囲内で実行してよい。いくつかの実施形態において、インキュベーションを、十分な時間、例えば、50分から2時間、振とうさせながら、最初の温度より高い温度、例えば、25℃から37℃の間で、継続する。
添え字x、y、zおよびwのそれぞれは、整数0、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から、独立して選択される。
必要な場合、したがって、沈殿再懸濁および密度勾配遠心分離を、繰り返して、精製された生体高分子複合体に到達する。最後の密度勾配遠心分離の後で、生体高分子複合体は、精製された生体高分子複合体を得るために、水溶性ポリマーをベースとする沈殿によって濃縮される。
さらに、任意に濾過をうけてもよい、第2の遠心分離ステップの後で得られた上清は、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレート、特に、ポリエチレングリコールでの示差沈殿に供し、この示差沈殿は、生体高分子複合体が上清中に維持される、より低い濃度の水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートでの第1の沈殿ステップを含み、生体高分子複合体を沈殿させるための、より高い濃度の水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートでのさらなる沈殿ステップを有する。
精製ならびに密度勾配の画分は、SDS−page分析によって制御されてよい。当業者は、したがって、精製を制御する適切な方法を熟知している。
つまり、本発明による生体高分子複合体の結晶化のための方法は、任意に、相互作用する化合物で浸漬された多数の結晶を提供させる。したがって、化合物ライブラリーでの浸漬実験および、最終的に、最も適切な相互作用物質、例えば、活性化剤または阻害剤または化合物に影響を与えるその他の生体高分子複合体の決定を可能にする。例えば、免疫プロテアソームを含む、20Sプロテアソームまたは26Sプロテアソームの場合、化合物ライブラリーは、プロテアソーム複合体を阻害するための候補化合物から構成されてよい。個別化医療の場合、免疫プロテアソームを含む20Sプロテアソームまたは任意のその他の生体高分子複合体は、本発明による方法によって結晶化されてよく、その後、候補化合物は、結晶と共にインキュベートされ、したがって、結晶と相互作用させ、それによって前記複合体の相互作用物質として前記候補化合物の適合性を判定する。例えば、20Sプロテアソームの阻害剤の場合、個体を治療するための最も適切な阻害剤が、決定される。さらに、この方法は、個体が第一選択の阻害剤、例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ジヒドロエポノマイシン(Dihydroeponomicin)、エポノマイシン(Eponomicin)、マリゾミブ、イキサゾミブ、デランゾミブ、ONX−912(オプロゾミブ)またはONX−0914に耐性がある場合、20Sプロテアソームの阻害剤として活性のある化合物を同定するのに適切である。
下に示された実施例は、本発明を、さらに限定することなく、説明する。
材料
標準化学物質を、Sigma Aldrich(Taufkirchen、ドイツ)から得た。プロテアソーム阻害剤であるオプロゾミブ、エポキソマイシンおよびジヒドロエポネマイシンを、ApexBio(Houston、USA)から購入し、MLN9708およびボルテゾミブを、Selleck Chemicals(Munich、ドイツ)から、Z−LLY−ケトアルデヒドを、Bachem(Bubendorf、スイス)から得、100mM濃度で、DMSO中で再懸濁した。洗浄剤を、Anatrace(Maumee、USA)から、結晶化プレートを、Hampton Research(Aliso Viejo、USA)から、Litholoopsを、Molecular Dimensions(Suffolk、UK)およびJena Bioscience(Jena、ドイツ)から得た。
表S1:タンパク質精製、結晶化、結晶安定化、結晶脱水のためのバッファーおよび酵素アッセイ
精製バッファー:BisTris0.05M pH6.5、KCl 0.05M、MgCl2 0.01M、βグリセロリン酸0.01M
結晶化バッファー:BisTris0.1M pH6.5、MgCl2 0.2M、PEG3350 10%(w/v)
結晶安定化バッファー:BisTris0.1M pH6.5、MgCl2 0.2M、PEG3350 20%(w/v)
結晶脱水バッファー:BisTris0.1M pH6.5、MgCl2 0.2M、PEG3350 25%(w/v)、MPD20%(v/v)
図2で表されたヒト20Sプロテアソームの精製
S30HeLa細胞質抽出物を、わずかに変更を加えたDignamら、(20)にしたがって、低張性溶解により調製した。低張性溶解および遠心分離により核を収集した後で、上清(粗細胞質抽出物)を、4℃で30分間30,000×gで遠心分離し、液体窒素中、40mlアリコートで急速冷凍し、さらに使用するまで、−80℃で貯蔵した。S30HeLa細胞質抽出物を、37℃での水浴で解凍し、10×ストックから1×濃度まで精製バッファーを補って、続いて、スクロース粉末を20%(w/v)まで、オクチルグルコースネオペンチルグリコール(OGNG、水中10%(w/v)のストック溶液から)0.1%(w/v)まで、ヨードアセトアミドを10mMまで、N−エチルマレイミドを10mMまで、およびベンズアミジンクロリドを10mMまで加えた。抽出物を、30分間マグネチックスターラーで室温にてインキュベートし、続いて、1時間140rpmで振とうさせて、30℃でインキュベートした。処理された抽出物を、4℃で2時間100,000×gで遠心分離した。遠心分離の後で、上清を、チーズクロスおよびミラクロスのそれぞれ3層を通し濾過して、S100HeLa細胞質抽出物を得た。
ヒト20Sプロテアソームを、結晶化バッファーの500μlリザーバーの上のChryschemシッティングドロップ蒸気拡散プレート(Hampton Research、Aliso Viejo、USA)において、タンパク質0.5μl+結晶化バッファー0.5μlを混合することによって、タンパク質濃度7.5mg/mlで結晶化する。これらの条件下、ヒト20Sプロテアソームは、単位細胞定数、a=114Å、b=202Å、c=302Å、α=β=γ=90°を有する空間群P212121において結晶化する。上記の精製手順は、したがって、5000超の結晶化装置において典型的に実施するのに適切である。現在同定された結晶化条件のさらなる利点としては、それぞれの結晶化装置が典型的に、10〜15の結晶を産生することが挙げられ、結晶は、150×150×200μm3の大きさである。結晶のフルサイズまでの結晶化は、インキュベーション20時間以内で達成される(図1参照)。それ故に、約50000個の結晶を、抽出物調製72時間以内に作製でき、その結晶の全ては、分解能2Å未満まで典型的に回折する。
上記の手順によって得られたヒト20Sプロテアソーム結晶は、制御された様式で安定化および脱水される必要があり、分解能2Å未満まで再現性よく回折する。本発明者らは、再現性のある手順を確立するために多大な努力を払って、これを達成した。3つのステップが関与する。1)最初に18℃で成長させたヒト20S結晶を含有する結晶化トレイを、スタイロフォームの箱の中へ入れ、4℃まで移行させる。典型的に、トレイを、8時間インキュベートする。2)結晶を、4℃で、安定化し、脱水する。最初に、シールを除去し、リザーバー溶液1μlを加える。次に、結晶安定化バッファー2μlを、結晶化ドロップに加える。同時に、リザーバー溶液を、結晶脱水バッファーに交換する。次に、ドロップを、再密封し、4℃で8時間超の蒸気拡散によって、新しいリザーバー溶液に対して平衡化させる。3)プロテアソーム阻害剤を、ドロップに結晶脱水バッファー4μlを加えることにより、結晶中へ浸漬し、バッファーは、5mMの最適なプロテアソーム阻害剤をさらに含有する(最終濃度、2.5mM)。次に、ドロップを、再密封し、12時間超で平衡化させる。結晶安定化、脱水およびリガンド浸漬の手順の全体は、したがって、30時間以内で終了する。
ヒト20Sプロテアソームの精製に関する上記の方法と同様に、免疫プロテアソームは、当技術分野で記載されている通り、提供された粗試料を、72時間、200U/μlインターフェロンガンマで培養された細胞培養から得る、同じアプローチにしたがって精製する。
酵母脂肪酸シンターゼ(FAS)の精製
手短に言えば、酵母Fasの精製は、以下の通り行われる。
1)粉砕された酵母細胞(S.セレビシエ(S.cerevisiae)またはC.テルモフィルム(C.thermophilum))770gを、30分37℃で、スターラーにより解凍した。
2)以下を加える。
・1×標準バッファー(SB)(アセテート)(168ml×2)
・PMSF(溶液)5mM
・ベンズアミジン10mM
・ベータグリセロリン酸10mM
・DTT20mM
・スクロース20%(w/v)
3)RTで30分間、インキュベートする。
4)30分間30000gで、遠心分離し、ミラクロスおよびチーズクロス(それぞれ3層)を使用して、上清を濾過する。
5)上清にOGNG(溶液)0.2%を加え、1時間30℃で、インキュベートする。
6)37krpm、1時間、遠心分離する(Ti45Beckmann−Coulter)。
7)ミラクロスおよびチーズクロスの3層を使用して、上清を濾過する。
8)18℃で30分間、1×SB(アセテート)中に、20%のPEG400で沈殿させ、25分間27,500gで、遠心分離する。
9)ペレットを廃棄し、18℃で30分間、1×SB(アセテート)中に、30%のPEG400で、上清を沈殿させ、25分間27,500gで、遠心分離する。
10)ペレットを保持し、上清を廃棄する。
11)再懸濁バッファー(スクロース2%、1×SBアセテートバッファー、DTT10mM、ベータ−ガラクトシダーゼ10mM、LMNG(ラウロイルマルトシドネオペンチルグリコール(Lauroylmaltosideneopentylglycol))0.01%)中で、ペレットを再懸濁する。
12)SW30、10〜45%の勾配を有する6バイアルに再懸濁されたペレットを負荷し、16時間30,000rpmで稼働させる(勾配は、スクロース、1×SBアセテートバッファー、DTT10mMおよびベータグリセロリン酸10mMを含有する)。
13)FAS画分)を、プールし、濾過し、18℃、1時間でSBアセテートバッファー中に40%のPEG400を使用して、沈殿させた。FAS画分を、1時間27,500gで遠心分離した。
14)ペレットを、再懸濁バッファー(スクロース2%、1×SBアセテートバッファー、DTT10mM、ベータ−ガラクトシダーゼ10mM、LMNG0.01%)中で再懸濁した。
15)再懸濁されたペレットを、12バイアルのSw40、10〜45%の勾配に負荷した、そして16時間25000rpmで稼働させる。
16)FAS画分を、プールし、濾過し、18℃、1時間で、SBアセテートバッファー中に40%のPEG400を使用して、沈殿させた。FAS画分を、25分間27,500gで、遠心分離した。
17)ペレットを、約4.2mlの体積の再懸濁バッファー(スクロース2%、1×SBアセテートバッファー、DTT10mM、LMNG0.01%)中で再懸濁した。
18)再懸濁されたペレットを、12×Sw40、10〜45%の勾配に負荷した、そして16時間22000rpmで稼働させる。
19)FAS画分を、プールし、18℃、1時間で、SBアセテートバッファー中に40%のPEG400を使用して、沈殿させた。FAS画分を、25分間27,500gで、遠心分離した。
20)ペレットを、再懸濁バッファー(スクロース20%、1×SBアセテートバッファー、DTT10mM、LMNG0.01%)中で再懸濁した。最終濃度は、1.1mlに対して15mg/mlであった。
本発明は、下記の態様も包含する。
態様1
精製された生体高分子複合体を得るための、
a)生体高分子複合体を含有する粗試料を用意するステップ、
b)25,000から35,000×gでの細胞残屑の分離のための第1の遠心分離ステップを行うステップ、
c)0%から25%(w/v)の量のオスモライト、およびシステインのチオール−アルキル化を可能にする化合物を、第1の遠心分離ステップから得られた上清に補うステップ、
d)50,000から150,000×g、例えば、80,000から120,000×gでの遠心分離による、第2の遠心分離ステップを行うステップ、
e)沈殿のために、第2の遠心分離ステップから得られた上清を、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートで処理するステップ、
f)前記ポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールを含有しないバッファー中での再懸濁後に、ポリマーをベースとする沈殿物、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿物を有するオスモライトを使用して、密度勾配遠心分離を行うステップ、
g)ステップe)およびf)を1回または複数回、任意に繰り返すステップ、
h)生体高分子複合体の水溶性ポリマーをベースとする沈殿、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿による、濃縮のステップ
を含む、生体高分子複合体の精製のための方法。
態様2
ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール、特に、ポリエチレングリコール400から20,000、例えば、400から6000である、態様1に記載の方法。
態様3
第1の遠心分離ステップが、S30画分を得る遠心分離である、および/または第2の遠心分離ステップが、S100画分を得る遠心分離である、態様1または2に記載の方法。
態様4
オスモライト勾配が、10から40%(w/v)スクロースのスクロースをベースとする勾配である、態様1から3のいずれか一項に記載の方法。
態様5
第2の遠心分離ステップの後で、上清が、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールアミン、もしくはポリカルボキシレート、特に、ポリエチレングリコールでの示差沈殿をうけ、前記示差沈殿が、より低い濃度の水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートでの第1の沈殿ステップを含み、それにより生体高分子複合体が上清中に維持され、生体高分子複合体を沈殿させるための、より高い濃度の水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートでのさらなる沈殿ステップを有する、態様1から4のいずれか一項に記載の方法。
態様6
生体高分子複合体が、プロテアソーム、例えば、20Sプロテアソームまたは26Sプロテアソーム、脂肪酸シンターゼ、例えば、酵母脂肪酸シンターゼである、態様1から5のいずれか一項に記載の方法。
態様7
粗試料が、細胞の低張性溶解によって得られる、または凍結粉砕によって得られるサイトゾル抽出物である、態様1から6のいずれか一項に記載の方法。
態様8
生体高分子複合体が、免疫プロテアソームであり、方法が、免疫プロテアソームの発現を誘導するのに十分な時間、サイトカイン、特にIFNγを有する細胞を培養するステップを含む、態様6または7に記載の方法。
態様9
水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有する、リザーバー溶液中での結晶化のステップをさらに含む、態様1から8のいずれか一項に記載の生体高分子複合体の精製のための方法を含む、生体高分子複合体の結晶化のための方法。
態様10
タンパク質濃度が、結晶化のために少なくとも5mg/mlである、態様9に記載の方法。
態様11
結晶化のステップが、最初は、15℃を超える温度で、その後は、8℃以下の温度である、態様9または10に記載の方法。
態様12
結晶の安定化および脱水が、8℃以下の温度で実行される、態様9から11のいずれか一項に記載の方法。
態様13
態様1から8のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な、精製された生体高分子複合体。
態様14
少なくとも2つの異種または相同タンパク質サブユニットから構成される、または核酸分子とタンパク質との組合せである、態様13に記載の精製された生体高分子複合体。
態様15
回折分析によって決定して、3Å以下、例えば、2.2Å以下の分解能を有する、態様9から12のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な、結晶化された生体高分子複合体。
態様16
個体の20Sプロテアソームを阻害するための候補化合物の適合性を判定するための方法であって、
態様9から12のいずれか一項に記載の候補化合物を含有する、前記個体の20Sプロテアソームの結晶化のための方法のステップ、または態様15に記載の候補化合物を含有する、結晶化された20Sプロテアソームを用意するステップ、
− 2.2Å以下の分解能での回折分析によって、20Sプロテアソームの結晶構造を決定するステップ、
− 前記分析に基づいて、個体の20Sプロテアソームの阻害剤としての候補化合物の適合性を判定するステップ
を含む、方法。
態様17
個体が、20Sプロテアソームの第1の阻害剤、例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ジヒドロエポネマイシン(Dihydroeponomycin)、エポノマイシン(Eponomycin)、マリゾミブ、イキサゾミブ、デランゾミブ、ONX−912またはONX−0914に応答しない個体である、態様16に記載の方法。
Claims (27)
- 精製された生体高分子複合体を得るための、
a)生体高分子複合体を含有する粗試料を用意するステップ、
b)25,000から35,000×gでの細胞残屑の分離のための第1の遠心分離ステップを行うステップ、
c)オスモライトの不存在下で、または0.5%から25%(w/v)の量のオスモライトと共に、システインのチオール−アルキル化を可能にする化合物を、第1の遠心分離ステップから得られた上清に補うステップ、
d)50,000から150,000×gでの遠心分離による、第2の遠心分離ステップを行うステップ、
e)沈殿のために、第2の遠心分離ステップから得られた上清を、水溶性ポリマーで処理するステップ、
f)前記ポリマーを含有しないバッファー中での再懸濁後に、前記ポリマーをベースとする沈殿物を有するオスモライトを使用して、密度勾配遠心分離を行うステップ、
g)ステップe)およびf)を1回または複数回、任意に繰り返すステップ、
h)生体高分子複合体の水溶性ポリマーをベースとする沈殿による、濃縮のステップ
を含む、生体高分子複合体の精製のための方法。 - 遠心分離による第2の遠心分離ステップが、80,000から120,000×gで行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマーである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール400から20,000である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール400から6000である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の遠心分離ステップが、S30画分を得る遠心分離である、および/または第2の遠心分離ステップが、S100画分を得る遠心分離である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- オスモライト勾配が、10から40%(w/v)スクロースのスクロースをベースとする勾配である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の遠心分離ステップの後で、前記上清が、水溶性ポリマーでの示差沈殿をうけ、前記示差沈殿が、より低い濃度の水溶性ポリマーでの第1の沈殿ステップを含み、それにより生体高分子複合体が上清中に維持され、生体高分子複合体を沈殿させるための、より高い濃度の水溶性ポリマーでのさらなる沈殿ステップを有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 生体高分子複合体が、プロテアソームまたは脂肪酸シンターゼである、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- プロテアソームが、20Sプロテアソームまたは26Sプロテアソームである、請求項11に記載の方法。
- 脂肪酸シンターゼが、酵母脂肪酸シンターゼである、請求項11に記載の方法。
- 粗試料が、細胞の低張性溶解によって得られる、または凍結粉砕によって得られるサイトゾル抽出物である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 生体高分子複合体が、免疫プロテアソームであり、方法が、免疫プロテアソームの発現を誘導するのに十分な時間、サイトカインを有する細胞を培養するステップを含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- サイトカインが、IFNγである、請求項15に記載の方法。
- 水溶性ポリマーを含有する、リザーバー溶液中での結晶化のステップをさらに含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の生体高分子複合体の精製のための方法を含む、生体高分子複合体の結晶化のための方法。
- タンパク質濃度が、結晶化のために少なくとも5mg/mlである、請求項17に記載の方法。
- 結晶化のステップが、最初は、15℃を超える温度で、その後は、8℃以下の温度である、請求項17または18に記載の方法。
- 結晶の安定化および脱水が、8℃以下の温度で実行される、請求項17から19のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な、精製された生体高分子複合体。
- 少なくとも2つの異種または相同タンパク質サブユニットから構成される、または核酸分子とタンパク質との組合せである、請求項21に記載の精製された生体高分子複合体。
- 回折分析によって決定して、3Å以下の分解能を有する、請求項17から20のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な、結晶化された生体高分子複合体。
- 分解能が2.2Å以下である、請求項23に記載の結晶化された生体高分子複合体。
- 個体の20Sプロテアソームを阻害するための候補化合物の適合性を判定するための方法であって、
請求項17から20のいずれか一項に記載の候補化合物を含有する、前記個体の20Sプロテアソームの結晶化のための方法のステップ、または請求項23または24に記載の候補化合物を含有する、結晶化された20Sプロテアソームを用意するステップ、
− 2.2Å以下の分解能での回折分析によって、20Sプロテアソームの結晶構造を決定するステップ、
− 前記分析に基づいて、個体の20Sプロテアソームの阻害剤としての候補化合物の適合性を判定するステップ
を含む、方法。 - 個体が、20Sプロテアソームの第1の阻害剤に応答しない個体である、請求項25に記載の方法。
- 20Sプロテアソームの第1の阻害剤が、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ジヒドロエポネマイシン(Dihydroeponomycin)、エポノマイシン(Eponomycin)、マリゾミブ、イキサゾミブ、デランゾミブ、ONX−912またはONX−0914である、請求項26に記載の方法。
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CN1900115A (zh) * | 2006-07-11 | 2007-01-24 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 抗o型口蹄疫病毒的单克隆抗体制备方法及抗体和用途 |
KR20100017594A (ko) * | 2007-05-04 | 2010-02-16 | 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 | 바이러스 정제를 위한 연속 초원심분리용 당 용액의 제조 |
BRPI0911249A2 (pt) * | 2008-04-16 | 2017-05-23 | Biogen Idec Inc | método de isolamento de biomacromoléculas usando polialquileno glicol e metais de transição |
JP5843615B2 (ja) * | 2009-02-06 | 2016-01-13 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 密度勾配超遠心分離によるウイルスまたはウイルス抗原の精製 |
US8524458B2 (en) * | 2009-11-09 | 2013-09-03 | Abbvie Inc. | Secretory protein biomarkers for high efficiency protein expression |
CN101817869B (zh) * | 2010-04-15 | 2012-05-30 | 西北工业大学 | 以聚乙二醇作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选96条件试剂盒 |
EP2551276A1 (en) * | 2011-07-26 | 2013-01-30 | Ares Trading S.A. | Method for purification of immunoproteasomes |
WO2013034160A1 (en) | 2011-09-06 | 2013-03-14 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. | Methods for analyzing biological macromolecular complexes and use thereof |
JP2014532184A (ja) * | 2011-10-12 | 2014-12-04 | ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルThe University Of North Carolina At Chapel Hill | 多重化キナーゼ阻害剤ビーズ及びその使用 |
CN104250300A (zh) * | 2013-06-27 | 2014-12-31 | 胡国良 | 一种鸡载脂蛋白aⅱ的分离纯化及鉴定方法 |
EP3240575A4 (en) * | 2014-12-31 | 2018-07-25 | Dr. Reddy's Laboratories Ltd. | Co-crystal of carfilzomib with maleic acid and process for the preparation of pure carfilzomib |
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