CN104250300A - 一种鸡载脂蛋白aⅱ的分离纯化及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法，它涉及生物技术领域，它的分离纯化方法为：鸡血清的收集，HDL粗品的制备，HDL粗制品的脱脂，脱脂HDL的溶解，脱脂HDL溶液的透析和浓缩，载脂蛋白AⅡ的提取，DEAESepharoseCL-6B柱层析，SephadexG-150柱层析，上述方法准备SephadexG-150层析柱，之后将过DEAESepharoseCL-6B后含有apoAⅡ的蛋白溶液加至凝胶柱的上方，待蛋白液与胶体齐平后用洗脱液进行洗脱，用蔗糖进行浓缩后存待分析。它方法简单，实用性强，帮助人们进一步的了解apoAⅡ的生理功能，使它能应用在流行病学和临床研究中。

Description

一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法。
背景技术：
载脂蛋白AⅡ的研究程度不如载脂蛋白AⅠ。它也是血清高密度脂蛋白中第二种主要的载脂蛋白，约占高密度脂蛋白中蛋白总量的20～25%。在HDL2中占15%，而在HDL3中占25%。在乳糜微粒中它的含量可达总载脂蛋白的7～10%。在极低密度脂蛋白中也有少量apoAⅡ存在。血清中apoAⅡ的浓度也较高，仅次于apoAⅠ（1.00～1.50g/L）和apoB100(0.8～1.00g/L)为：0.35～0.50g/L。在哺乳动物体内，apoAⅡ也主要由肝脏及小肠合成，是由77个氨基酸组成的单链多肽，常以二聚体形式存在，分子量大概为8，700da，等电点为5.05。
ApoAⅡ的生理功能到目前为止还没有完全阐明，除参与维持HDL的结构外，可能还具有抑制卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）活性的功能，从而阻碍细胞内胆固醇的运出，酯化和转移。亦有人认为apoAⅡ还参与肝脏甘油三脂脂肪酶的激活。同时还有助于HDL受体的识别和低密度脂蛋白（LDL）受体的调节，因此，apoAⅡ在脂代谢调控中起着十分重要的作用。此外，还有报道：apoAⅡ可部分拮抗低密度脂蛋白对内皮细胞的损伤作用，从而保持内皮细胞膜的完整性。在人类医学界，大量流行病学和临床研究表明：血清中apoAⅡ的含量与冠心病和动脉粥样硬化的发生率呈显著负相关，因此鸡载脂蛋白AⅡ研究具有重要的意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法，它方法简单，操作方便，实用性强，帮助人们进一步的了解apoAⅡ的生理功能，使它能应用在流行病学和临床研究中。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明采用以下技术方案：它的分离纯化方法为：
1 鸡血清的收集：翅下静脉采血，采血后，拿去针头，轻轻注入试管中。为防止血细胞的破裂，清洗干净和消毒好的注射器和试管预先用0.85%生理盐水浸润，防止血凝块与玻璃管壁粘连，造成血清析出不良。试管45°角静置37℃温箱1 h，再置4℃冰箱内静置3～4 h，待血液凝固血块收缩后用毛细滴管吸取血清，再以1000×g离心10 min，取上清血清分装后置-20℃冰箱中加NaN3保存备用。
2 HDL粗品的制备--磷钨酸沉淀法：取血清1.0 ml加入1.0 ml沉淀剂Ⅰ，混匀，静置10 min，1000×g离心15 min，吸出上清约1.8 ml加入0.42 ml沉淀剂Ⅱ，混匀，静置5 min，1000×g离心10min弃上清，沉淀溶于0.1 ml 12% NaCl 及1.0 ml 0.02mol/L Tris-HCl液中，加入0.26 ml沉淀剂Ⅱ静置5 min，1000×g离心10min弃上清，对沉淀进行重复溶解，沉淀和再溶解过程一次，最后得到含有HDL的粗制品溶液。
3 HDL粗制品的脱脂：将所制得HDL溶液在不断搅拌有机溶剂的情况下，用移液枪缓慢滴入待脱脂的HDL溶液，HDL溶液逐滴加入于60 ml丙酮/乙醇混合有机溶液中后，-20℃脱脂2.5h，1000×g离心15 min弃上清，再同样条件下再脱脂一次，-20℃冰箱中2.5 h后1000×g离心15 min弃上清，最后加入50 ml乙醚脱脂2.5 h离心弃上清所得白色沉淀为脱脂后HDL制品。
4 脱脂HDL的溶解：将脱脂后的HDL溶于100ml 6mol/L尿素-10mmol/L Tris-HCl-10mmol/L二硫苏糖醇溶液中，4℃过夜。
5 脱脂HDL溶液的透析和浓缩：将上述HDL溶液对6mol/L尿素-10mmol/L Tris-HCl -1mmol/L EDTA pH:8.0溶液进行透析，以除去其中的有机溶剂，之后用50%的聚乙二醇6000浓缩至2～3 ml以提高HDL溶液的浓度。
6 载脂蛋白AⅡ的提取：
6.1 DEAE Sepharose CL-6B 柱层析：柱床体积1.5×40 cm ，DEAE Sepharose CL-6B装柱后用0.03 mol/L Tris-6 mol/L(pH:8.0)溶液平衡，样品约10 ml上柱后，先用相当于两倍床体积的0.03mol/L Tris-6mol/L洗柱，然后用0～0.5 mol/L NaCl进行梯度洗脱，洗速1ml/min，每管收集6ml，梯度液成分：A液0.03mol/L Tris-HCL- 6mol/LUrea（pH:8.0）500ml。B液：0.03mol/LTris-HCL-6mol/L Urea 0.5mol/L NaCl（pH:8.0）500ml，280 nm紫外检测仪检测，流速3 ml/h ，6ml每管部分收集，合并各峰顶附近几管，用蔗糖进行浓缩后-20℃冰箱贮存待分离。
6.2 Sephadex G-150柱层析：上述方法准备Sephadex G-150层析柱，之后将过DEAE Sepharose CL-6B后含有apoAⅡ的蛋白溶液2～3 ml加至凝胶柱的上方，待蛋白液与胶体齐平后用洗脱液进行洗脱，流速9 ml/h，每管3 ml，280 nm紫外检测仪检测，合并各峰顶附近几管，用蔗糖进行浓缩后-20℃冰箱贮存待分析。
7 它的鉴定方法方法为：采用Urea-SDS-PAGE电泳对apoAⅡ纯度进行鉴定：分离胶：T=15%、C=2.6% pH:8.8，水用8 mol/L的尿素代替；浓缩胶：T=5% C=2.6% pH:6.8。电极缓冲液1 L中含有3g Tris，14.4g 甘氨酸，1g SDS，pH:8.3。开始电泳时浓缩胶使用160V稳压，进入分离胶后使用320V稳压，当溴酚兰迁移带到达电泳槽底部时，关闭电源，小心取出电泳胶后在预热60℃的0.1%考马斯亮蓝R-250染色液中染色10 min，随之用脱色液多次更换加热脱色至背景干净为止。
所述沉淀剂Ⅰ是将磷钨酸0.44g，MgCl2·6H2O 1.1 g，1 mol/L NaOH 1.3 ml，双蒸水加至100 ml，混匀，调节pH为6.2。
所述的沉淀剂Ⅱ是将磷钨酸4.4 g，MgCl2·6H2O 11.0 g，1mol/L NaOH 13.0 ml，双蒸水加至100 ml，混匀，调节pH为6.2。
所述的脱色液是将250 ml 95%乙醇，80 ml冰醋酸用蒸馏水加至1000 ml配制而成。
本发明具有以下有益效果：它方法简单，操作方便，实用性强，帮助人们进一步的了解apoAⅡ的生理功能，使它能应用在流行病学和临床研究中。
具体实施方式：
本具体实施方式采取以下技术方案，它的分离纯化方法为：
1 鸡血清的收集：翅下静脉采血，采血后，拿去针头，轻轻注入试管中。为防止血细胞的破裂，清洗干净和消毒好的注射器和试管预先用0.85%生理盐水浸润，防止血凝块与玻璃管壁粘连，造成血清析出不良。试管45°角静置37℃温箱1 h，再置4℃冰箱内静置3～4 h，待血液凝固血块收缩后用毛细滴管吸取血清，再以1000×g离心10 min，取上清血清分装后置-20℃冰箱中加NaN3保存备用。
2 HDL粗品的制备--磷钨酸沉淀法：取血清1.0 ml加入1.0 ml沉淀剂Ⅰ，混匀，静置10 min，1000×g离心15 min，吸出上清约1.8 ml加入0.42 ml沉淀剂Ⅱ，混匀，静置5 min，1000×g离心10min弃上清，沉淀溶于0.1 ml 12% NaCl 及1.0 ml 0.02mol/L Tris-HCl液中，加入0.26 ml沉淀剂Ⅱ静置5 min，1000×g离心10min弃上清，对沉淀进行重复溶解，沉淀和再溶解过程一次，最后得到含有HDL的粗制品溶液。
3 HDL粗制品的脱脂：将所制得HDL溶液在不断搅拌有机溶剂的情况下，用移液枪缓慢滴入待脱脂的HDL溶液，HDL溶液逐滴加入于60 ml丙酮/乙醇混合有机溶液中后，-20℃脱脂2.5h，1000×g离心15 min弃上清，再同样条件下再脱脂一次，-20℃冰箱中2.5 h后1000×g离心15 min弃上清，最后加入50 ml乙醚脱脂2.5 h离心弃上清所得白色沉淀为脱脂后HDL制品。
4 脱脂HDL的溶解：将脱脂后的HDL溶于100ml 6mol/L尿素-10mmol/L Tris-HCl-10mmol/L二硫苏糖醇溶液中，4℃过夜。
5 脱脂HDL溶液的透析和浓缩：将上述HDL溶液对6mol/L尿素-10mmol/L Tris-HCl -1mmol/L EDTA pH:8.0溶液进行透析，以除去其中的有机溶剂，之后用50%的聚乙二醇6000浓缩至2～3 ml以提高HDL溶液的浓度。
6 载脂蛋白AⅡ的提取：
6.1 DEAE Sepharose CL-6B 柱层析：柱床体积1.5×40 cm，DEAE Sepharose CL-6B装柱后用0.03 mol/L Tris-6 mol/L溶液平衡，样品约10ml上柱后，先用相当于两倍床体积的0.03 mol/L Tris-6 mol/L洗柱，然后用0～0.5 mol/L NaCl进行梯度洗脱，洗速1 ml/min，每管收集6 ml，梯度液成分：A液0.03 mol/L Tris-HCL-6mol/L Urea 500 ml，B液：280 nm紫外检测仪检测，流速3 ml/h ，6ml每管部分收集，合并各峰顶附近几管，用蔗糖进行浓缩后-20℃冰箱贮存待分离。
6.2 Sephadex G-150柱层析：上述方法准备Sephadex G-150层析柱，之后将过DEAE Sepharose CL-6B后含有apoAⅡ的蛋白溶液2～3 ml加至凝胶柱的上方，待蛋白液与胶体齐平后用洗脱液进行洗脱，流速9 ml/h，每管3 ml，280 nm紫外检测仪检测，合并各峰顶附近几管，用蔗糖进行浓缩后-20℃冰箱贮存待分析。
7 它的鉴定方法方法为：采用Urea-SDS-PAGE电泳对apoAⅡ纯度进行鉴定：分离胶：T=15%、C=2.6% pH:8.8，水用8mol/L的尿素代替；浓缩胶：T=5% C=2.6% pH:6.8，电极缓冲液1L中含有3g Tris，14.4g 甘氨酸，1g SDS，pH:8.3，开始电泳时浓缩胶使用160V稳压，进入分离胶后使用320V稳压，当溴酚兰迁移带到达电泳槽底部时，关闭电源，小心取出电泳胶后在预热60℃的0.1%考马斯亮蓝R-250染色液中染色10min，随之用脱色液多次更换加热脱色至背景干净为止。
所述沉淀剂Ⅰ是将磷钨酸0.44 g，MgCl2·6H2O 1.1g，1 mol/L NaOH 1.3 ml，双蒸水加至100 ml，混匀，调节pH为6.2。
所述的沉淀剂Ⅱ是将磷钨酸4.4 g，MgCl2·6H2O 11.0 g，1mol/L NaOH 13.0 ml，双蒸水加至100 ml，混匀，调节pH为6.2。
所述的脱色液是将250 ml 95%乙醇，80 ml冰醋酸用蒸馏水加至1000 ml配制而成。
本具体实施方式具有以下有益效果：它方法简单，操作方便，实用性强，帮助人们进一步的了解apoAⅡ的生理功能，使它能应用在流行病学和临床研究中。

Claims (7)

1.一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法，其特征在于它的分离纯化方法为：（1）鸡血清的收集：翅下静脉采血，采血后，拿去针头，轻轻注入试管中。
2.为防止血细胞的破裂，清洗干净和消毒好的注射器和试管预先用0.85%生理盐水浸润，防止血凝块与玻璃管壁粘连，造成血清析出不良。
3.试管45°角静置37℃温箱1 h，再置4℃冰箱内静置3～4 h，待血液凝固血块收缩后用毛细滴管吸取血清，再以1000×g离心10 min，取上清血清分装后置-20℃冰箱中加NaN3保存备用；
（2） HDL粗品的制备--磷钨酸沉淀法：取血清1.0 ml加入1.0 ml沉淀剂Ⅰ，混匀，静置10 min，1000×g离心15 min，吸出上清约1.8 ml加入0.42 ml沉淀剂Ⅱ，混匀，静置5 min，1000×g离心10min弃上清，沉淀溶于0.1 ml 12% NaCl 及1.0 ml 0.02mol/L Tris-HCl液中，加入0.26 ml沉淀剂Ⅱ静置5 min，1000×g离心10min弃上清，对沉淀进行重复溶解，沉淀和再溶解过程一次，最后得到含有HDL的粗制品溶液；
（3） HDL粗制品的脱脂：将所制得HDL溶液在不断搅拌有机溶剂的情况下，用移液枪缓慢滴入待脱脂的HDL溶液，HDL溶液逐滴加入于60 ml丙酮/乙醇，体积比为1：1混合液中，-20℃脱脂2.5h，1000×g离心15 min弃上清，再同样条件下再脱脂一次，-20℃冰箱中2.5 h后1000×g离心15 min弃上清，最后加入50 ml乙醚脱脂2.5 h离心弃上清所得白色沉淀为脱脂后HDL制品；
（4）脱脂HDL的溶解：将脱脂后的HDL溶于100ml 6mol/L尿素-10mmol/L Tris-HCl-10mmol/L二硫苏糖醇溶液中，4℃过夜；
（5）脱脂HDL溶液的透析和浓缩：将上述HDL溶液对6mol/L尿素-10mmol/L Tris-HCl -1mmol/L EDTA pH:8.0溶液进行透析，以除去其中的有机溶剂，之后用50%的聚乙二醇6000浓缩至2～3 ml以提高HDL溶液的浓度；
（6）载脂蛋白AⅡ的提取：DEAE Sepharose CL-6B 柱层析：柱床体积1.5×40 cm ，DEAE Sepharose CL-6B装柱后用0.03 mol/L Tris-6 mol/L溶液平衡，样品约10ml上柱后，先用相当于两倍床体积的0.03 mol/L Tris-6 mol/L洗柱，然后用0～0.5 mol/L NaCl进行梯度洗脱，洗速1 ml/min，每管收集6 ml，梯度液成分：A液0.03 mol/L Tris-HCL-6 mol/L Urea 500 ml，B液：280 nm紫外检测仪检测，流速3 ml/h ，6ml每管部分收集，合并各峰顶附近几管，用蔗糖进行浓缩后-20℃冰箱贮存待分离；Sephadex G-150柱层析：上述方法准备Sephadex G-150层析柱，之后将过DEAE Sepharose CL-6B后含有apoAⅡ的蛋白溶液2～3 ml加至凝胶柱的上方，待蛋白液与胶体齐平后用洗脱液进行洗脱，流速9 ml/h，每管3 ml，280 nm紫外检测仪检测，合并各峰顶附近几管，用蔗糖进行浓缩后-20℃冰箱贮存待分析。
4.根据权利要求1所述一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法，其特征在于它的鉴定方法方法为：采用Urea-SDS-PAGE电泳对apoAⅡ纯度进行鉴定：分离胶：T=15%、C=2.6% pH:8.8，水用8mol/L的尿素代替；浓缩胶：T=5% C=2.6% pH:6.8，电极缓冲液1L中含有3g Tris，14.4g 甘氨酸，1g SDS，pH:8.3，开始电泳时浓缩胶使用160V稳压，进入分离胶后使用320V稳压，当溴酚兰迁移带到达电泳槽底部时，关闭电源，小心取出电泳胶后在预热60℃的0.1%考马斯亮蓝R-250染色液中染色10min，随之用脱色液多次更换加热脱色至背景干净为止。
5.根据权利要求1所述一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法，其特征在于所述沉淀剂Ⅰ是将磷钨酸0.44g，MgCl2·6H2O 1.1g，1mol/L NaOH 1.3ml，双蒸水加至100ml，混匀，调节pH为6.2。
6.根据权利要求1所述一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法，其特征在于所述的沉淀剂Ⅱ是将磷钨酸4.4 g，MgCl2·6H2O 11.0g，1mol/L NaOH 13.0 ml，双蒸水加至100 ml，混匀，调节pH为6.2。
7.根据权利要求1所述一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法，其特征在于所述的脱色液是将250 ml 95%乙醇，80 ml冰醋酸用蒸馏水加至1000 ml配制而成。
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胡国良等: "蛋鸡血清载脂蛋白 AⅡ的分离纯化及其抗血清的制备", 《中国动物检疫》 *

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