JP2009166041A - ミクロ流体タンパク質結晶法 - Google Patents

ミクロ流体タンパク質結晶法 Download PDF

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ソマー モーテン
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Abstract

【課題】ミクロ流体構造体を使用して、タンパク質の結晶化のハイスループットスクリーニングを可能にすることを課題とする。
【解決手段】本発明は、上記課題を、１つの実施形態において、一体化された組み合わせ混合チップによって解決した。この混合チップにおいて、可能な結晶形成がチップ上で観察される、多数の潜在的な結晶化条件を迅速に作製するための、試薬の正確な計量供給を可能にする。代替の実施形態において、ミクロ流体構造体は、特定のタンパク質結晶化剤の組み合わせの位相空間条件を調査するために利用され得、これによって、確実な条件を同定し、そして引き続いて、結晶成長を得る集中した試みを可能にする。
【選択図】なし

Description

（関連出願の引用）
本願は、米国非仮特許出願番号１０／１１７，９７８（２００２年４月５日出願）の一部継続出願であり、これは、米国仮特許出願番号６０／３２３，５２４（２００１年９月１７日出願）に基づく非仮特許出願であるとの優先権を主張し、また、米国非仮特許出願０９／８８７，９９７（２００１年６月２２日出願）の一部継続出願であり、この一部継続出願は、さらに、米国非仮特許出願０９／８２６，５８３（２００１年４月６日出願）の一部継続出願である。本特許出願はまた、米国非仮特許出願番号１０／２６５，４７３（２００２年１０月４日出願）の一部継続出願である。本出願は、米国仮出願番号６０／４４７，１５７号（２００３年２月１２日出願）、米国仮特許出願番号６０／４３３，１６０（２００２年１２月１３日出願）に基づく優先権をさらに主張する。これらの特許出願は、本明細書において、全ての目的にために参考として援用され得る。
（アメリカ合衆国連邦支援による研究および開発の下でなされた発明に対する権利についての陳述）
本明細書中に記載された研究は、ＮＳＦ（チッププログラムにおけるｘｙｚ）；米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）助成金ＣＡ ７７３７３；ＮＳＥＲＣ（Ｊｕｌｉｅ Ｐａｙｅｔｔｅ研究奨励金）；Ｄａｖｉｄ Ｈ．＆Ｌｕｃｉｌｌｅ Ｍ．Ｐａｃｋａｒｄ基金；Ｇ．
Ｈａｒｏｌｄ ａｎｄ Ｌｅｉｌａ Ｙ．母親慈善基金によって、部分的に、支援された。本明細書中で記載された研究はまた、部分的に、米国国立科学技術助成金番号ＣＴＳ
００８８６４９、米国国立衛生研究所助成金番号ＣＡ ７７３７３およびＨＧ １６４２−０２、ならびにＤＡＲＰＡにより授与された陸軍科学研究局助成金番号ＤＡＡＤ１９−００−１−０３９２に部分的に支援された。したがって、米国合衆国政府は、本発明における一定の権利を有する。
（発明の背景）
結晶化は、生物学的分野および化学分野に対する重要な技術である。具体的には、標的化合物の高質結晶は、標的の正確な三次元構造を製造するために、Ｘ線回折技術によって分析され得る。次いで、この三次元構造情報は、標的の機能性および挙動を予測するために利用され得る。
理論上、結晶化プロセスは単純である。純粋な形態の標的化合物は、溶媒に溶解される。次いで、溶解した標的物質の化学環境が変更されて、その結果、この標的は不溶性となり、結晶形態にある固相に転じる。化学環境におけるこの変化は、代表的には、標的物質を不溶性にする結晶化剤を導入することによって達成されるが、温度および圧力における変化はまた、標的物質の溶解度に影響を及ぼし得る。
しかし、実際には、高質結晶の形成は、一般に困難で時折不可能であり、研究者の一部に、多くの試行および誤りおよび忍耐を必要とする。具体的には、単純な生物学的化合物ですら、その高度に複雑な構造は、それらが高度に秩序立った結晶構造を形成するのに敏感ではない。それ故に、研究者は、実際に結晶が多少なりとも得られ得る場合、高質結晶を得るために、結晶化のための多数の条件を用いて実験し、サンプル濃度、溶媒型、対溶媒型、温度、および持続時間のようなパラメーターを変更するよう、忍耐強くかつ几帳面でなければならない。
従って、標的物質の結晶化のハイスループットスクリーニングを実施するための方法および構造が、当該分野で必要とされる。
（発明の要旨）
ミクロ流体構造体の使用は、タンパク質結晶化のハイスループットスクリーニングを可能にする。１つの実施形態において、一体化された組み合わせ混合チップは、可能な結晶形成がチップ上で観察される、多数の潜在的な結晶化条件を迅速に作製するための、試薬の正確な計量供給を可能にする。代替の実施形態において、ミクロ流体構造体は、特定のタンパク質結晶化剤の組み合わせの位相空間条件を調査するために利用され得、これによって、確実な条件を同定し、そして引き続いて、結晶成長を得る集中した試みを可能にする。したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）
一定の数の入口から複数の化学混合物を調製する方法であって、該方法は、以下：
第一の入口からミクロ流体混合構造体までの第一の化学物質の体積を計量供給する工程；
第二の入口から該ミクロ流体混合構造体までの第二の化学物質の体積を計量供給して、該第一の化学物質および第二の化学物質を含有する第一の混合物を生成する工程；
該第一の混合物を、該ミクロ流体混合構造体から流出させる工程；
再度、該第一の入口から該ミクロ流体混合構造体までの該第一の化学物質の体積を計量供給する工程；ならびに
第三の入口から該ミクロ流体混合構造体までの第三の化学物質の体積を計量供給して、該第一の化学物質および第三の化学物質を含有する第二の混合物を生成する工程、
を包含する、方法。
（２）
前記第一の混合物および第二の混合物の特性を観察する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（３）
前記第一の混合物および第二の混合物の特性が、前記ミクロ流体混合構造体内で観察される、項目２に記載の方法。
（４）
前記第一の混合物および第二の混合物を、それぞれの貯蔵位置までし、そして該第一の混合物および第二の混合物の特性を、該それぞれの貯蔵チャンバ内で観察する工程、
をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（５）
前記第一の化学物質を計量供給する工程が、既知の濃度の高分子溶液を流す工程を包含し；
前記第二の化学物質を計量供給する工程が、第一の濃度の結晶化剤溶液を流す工程を包含し；
前記第三の化学物質溶液を計量供給する工程が、第二の濃度の該結晶化剤溶液を流す工程を包含し；そして
前記第一の混合物および第二の混合物の特性を観察する工程が、固体材料の形成を観察する工程を包含する、
項目２に記載の方法。
（６）
前記第一の化学物質を計量供給する工程が、既知の濃度の結晶化剤溶液を流す工程を包含し；
前記第二の化学物質を計量供給する工程が、第一の濃度の高分子溶液を流す工程を包含し；
前記第三の化学物質溶液を計量供給する工程が、第二の濃度の該高分子溶液を流す工程を包含し；そして
前記第一の混合物および第二の混合物の特性を観察する工程が、固体材料の形成を観察する工程を包含する、
項目２に記載の方法。
（７）
前記第一の化学物質を計量供給する工程が、既知の濃度の結晶化剤溶液を流す工程を包含し；
前記第二の化学物質を計量供給する工程が、第一の濃度の緩衝溶液を流す工程を包含し；そして
前記第三の化学物質溶液を計量供給する工程が、第二の濃度の該緩衝溶液を流す工程を包含し；
前記方法が、前記第一の混合物および第二を計量供給する工程、高分子溶液の体積を計量供給する工程、ならびに該第一の混合物および第二の混合物における固体材料の形成を観察する工程をさらに包含する、
項目２に記載の方法。
（８）
前記第一の化学物質を計量供給する工程が、既知の濃度の高分子溶液を流す工程を包含し；
前記第二の化学物質を計量供給する工程が、第一の濃度の緩衝溶液を流す工程を包含し；そして
前記第三の化学物質溶液を計量供給する工程が、第二の濃度の該緩衝溶液を流す工程を包含し；
前記方法が、前記第一の混合物および第二を計量供給する工程、結晶化剤溶液の体積を計量供給する工程、ならびに該第一の混合物および第二の混合物における固体材料の形成を観察する工程をさらに包含する、
項目２に記載の方法。
（９）
前記第一の化学物質および第二の化学物質を計量供給する工程のうちの少なくとも一方が、該第一の化学物質および第二の化学物質のうちの一方を含むミクロ流体チャネル内に偏向されたエラストマー膜の蠕動ポンピング作用によって計量供給する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（１０）
前記第二の化学物質および第三の化学物質を計量供給する工程が、マルチプレクサの作動による、エラストマー膜のミクロ流体フローチャネル内への作動を包含する、項目１に記載の方法。
（１１）
前記第一の混合物および第二の混合物の各々の体積が、約２０ｎＬ以下を構成する、項目１に記載の方法。
（１２）
前記混合構造体内でさらなる混合物を繰り返し調製して、化学的応答または生物学的応答を、該混合物の組成の関数として系統的に特徴付ける工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（１３）
高分子の溶解度が特徴付けられる、項目１２に記載の方法。
（１４）
前記第一の化学物質が、膜タンパク質を含有し、そして前記第二の化学物質が、対応する検出可能なリガンドを含有し、前記混合する工程が、細胞膜において見出されるような形状にフォールディングされた該膜タンパク質の溶解度を決定することを可能にする、項目１３に記載の方法。
（１５）
前記第一の化学物質および第二の化学物質を混合する工程、ならびに前記第一の化学物質および第三の化学物質を混合する工程が、可溶性条件と沈殿条件との間の中間の溶解度限界の検出を可能にし、前記方法が、以下：
該溶解度限界に近い条件を有する、バッチ結晶化実験を実施する工程、
をさらに包含する、項目１３に記載の方法。
（１６）
前記バッチ結晶化実験の条件が、以下：
ＩＳＳ＝（ＰＣ−ＩＭＣ）／ＩＭＣ
によって定義される中間過飽和（ＩＳＳ）条件の約±５０％以内であり、ここで、
ＰＣは、高分子濃度であり；そして
ＩＭＣは、前記高分子を前記結晶化剤に最初に曝露してから１分以内に、固体形成を生じない最大高分子濃度である、
項目１５に記載の方法。
（１７）
前記バッチスクリーニング高分子結晶化実験の条件が、高分子と混合された緩衝剤を含有する第一の混合物と、結晶化剤と混合された緩衝剤を含有する第二の混合物との間でのフリー界面拡散によって達成される、項目１５に記載の方法。
（１８）
前記バッチスクリーニング高分子結晶化実験が、１０μＬ以下の高分子溶液を消費する、５０以上の混合物を含む、項目１５に記載の方法。
（１９）
高分子溶解度の特徴付けおよび前記バッチスクリーニング実験が、単一のミクロ流体デバイスにおいて実施される、項目１５に記載の方法。
（２０）
高分子溶解度の特徴付けおよび前記バッチスクリーニング実験が、異なるミクロ流体デバイスにおいて実施される、項目１５に記載の方法。
（２１）
装置であって、以下：
第一のエラストマー層に形成されたミクロ流体チャネルネットワークであって、該ミクロ流体チャネルネットワークは、接合部および試薬供給源と流体連絡する第一のセットの入口分枝、該接合部および緩衝剤供給源と流体連絡する第二のセットの入口分枝、ならびに該接合部および出口と流体連絡する混合構造体を備える、ミクロ流体フローチャネルネットワーク；
該第一のエラストマー層に隣接する第二のエラストマー層に形成された第一の制御チャネルネットワークであって、該第一の制御チャネルネットワークは、該第一の入口分枝セットに隣接して、選択試薬が該接合部に流れるように構成された第一のマルチプレクサ構造体を規定する、第一の制御チャネルネットワーク；ならびに
該第二のエラストマー層に形成された第二の制御チャネルネットワークであって、該第二の制御チャネルネットワークは、該第二の入口分枝セットに隣接して、選択緩衝剤の流れを該接合部に流すように構成された第二のマルチプレクサ構造体を規定する、第二の制御チャネルネットワーク、
を備える、装置。
（２２）
前記接合部が、ある距離によって分離された第一の地点および第二の地点で第一のフローチャネルと交差する、第二のフローチャネルを備える、項目２１に記載の装置。
（２３）
前記第一のフローチャネルが、該距離に沿って分枝している、項目２２に記載の装置。
（２４）
前記混合構造体が、前記接合部および前記出口から隔離されるように構成された閉回路を備える、項目２１に記載の装置。
（２５）
前記混合構造体が、実質的に円形の形状を有する、項目２１に記載の装置。
（２６）
前記フローチャネルネットワークが、前記混合構造体と流体連絡する注入器チャネルをさらに備える、項目２１に記載の装置。
（２７）
前記第二のエラストマー層が、少なくとも３つの制御チャネルを規定し、該少なくとも３つの制御チャネルは、前記フローチャネルネットワークの上に重なって、流体を前記第一の入口分枝セット、第二の入口分枝セット、および前記閉回路のうちの１つに通して流すように構成された蠕動ポンピング構造体を規定する、項目２１に記載の装置。
（２８）
サンプル貯蔵構造体をさらに備え、該サンプル貯蔵構造体は、前記出口と流体連絡しており、そして前記混合構造体からサンプルを保持するように構成されている、項目２１に記載の装置。
（２９）
前記サンプル貯蔵構造体が、細長フローチャネルを備える、項目２８に記載の装置。
（３０）
前記細長フローチャネルが、行き止まりを有する、項目２９に記載の装置。
（３１）
前記細長フローチャネルの、前記入口の反対側の端部が、弁によって開閉される、項目３０に記載の装置。
（３２）
前記細長フローチャネルへの流体アクセスを支配するマルチプレクサ構造体をさらに備える、項目３１に記載の装置。
（３３）
前記貯蔵構造体が、フローチャネルの行および列によって接続される貯蔵容器のアレイを備える、項目２９に記載の装置。
（３４）
前記貯蔵容器のアレイが、弁付き接続チャネルを通して流体連絡する、対になった容器を備える、項目３３に記載の装置。
（３５）
結晶化を導く条件を同定する方法であって、以下：
第一の濃度で溶媒およびサンプルを含有する、第一の溶液を調製する工程；
該第一の溶液と、結晶化剤を含有する第二の溶液とを混合する工程；
該混合物において最初に固相が出現する第一の条件を記録する工程；
さらなる溶媒を該混合物に添加する工程；
該混合物において固相が消失する第二の条件を記録する工程；ならびに
該第一の条件と第二の条件との間のヒステリシスを同定する工程、
を包含する、方法。
（３６）
前記第一の条件および第二の条件が、サンプルおよび結晶化剤の濃度を規定する、項目３５に記載の方法。
（３７）
前記結晶化剤が、前記サンプルを含む閉回路ミクロ流体チャネルに導入され；そして
次いで、前記溶媒が、該閉回路ミクロ流体チャネルに導入される、
項目３５に記載の方法。
（３８）
前記結晶化剤および前記溶媒のうちの少なくとも一方が、エラストマーマクのポンピング作用によって導入される、項目３７に記載の方法。
（３９）
前記第一の条件および第二の条件が、前記サンプルおよび前記結晶化剤を含有するミクロ流体フローチャネルの光学問い合わせによって決定される、項目３５に記載の方法。
（４０）
エラストマーから微細製造される前記ミクロ流体構造体が、光学的に問い合わせられる、項目３５に記載の方法。
（４１）
結晶化を導く条件を同定する方法であって、以下：
結晶化剤がサンプルを含有する溶液と混合される際の光の散乱を検出する工程；
該検出された散乱光を、タンパク質結晶含有溶液に特徴的な既知の範囲の第二のビリアル係数で補正する工程、
を包含する、方法。
（４２）
前記結晶化剤が、サンプルを含有する閉回路ミクロ流体チャネルに流入する際に、前記散乱が決定される、項目４１に記載の方法。
（４３）
前記結晶化剤が、エラストマー膜の作用によって、前記閉回路ミクロ流体チャネル内にポンピングされる、項目４１に記載の方法。
（４４）
ミクロ流体デバイスを通る流れを制御する方法であって、以下：
流体をフローチャネルに入れる工程；
該フローチャネルに隣接し、かつ該フローチャネルから分離されている制御チャネルに、圧力を付与して、介在するエラストマー膜を該フローチャネル内に偏向させる工程；および
該フローチャネル内の流体のベースライン圧力を、５ｐｓｉｇより大きく維持し、一方で、該制御チャネルに扶養される圧力を緩和して、該エラストマー膜を該フローチャネルの外に付勢する工程、
を包含する、方法。
（４５）
前記圧力が、前記制御チャネルに、ある体積の空気のフラックスの形態で付与され、その結果、前記フローチャネル内に維持される上昇した圧力が、該フローチャネル内の気泡の形成を減少させる、項目４４に記載の方法。
（４６）
前記エラストマー膜が、５０Ｈｚ以上の周波数で、前記フローチャネルの内外に作動され得る、項目４４に記載の方法。
（４７）
前記フローチャネルが、閉回路を備え、そして前記エラストマー膜の作用が、約４Ｈｚの周波数で、該閉回路に通して流体を流し得る、項目４４に記載の方法。
（４８）
膜タンパク質の可溶化を導く条件を同定する方法であって、該方法は、以下：
固体膜タンパク質を、ミクロ流体閉回路混合構造体に導入する工程；
両親媒性部分を、該ミクロ流体閉回路混合構造体に導入する工程；
該膜タンパク質および該両親媒性部分の混合物を、検出可能なリガンドに曝露する工程であって、得該検出可能なリガンドは、膜に折り畳まれる場合の該膜タンパク質の形態のみと結合するように構成されている、工程；ならびに
該リガンドを検出して、溶液中での該膜タンパク質の折り畳まれた形態を同定する工程、
を包含する、方法。
（４９）
前記混合物が、ミクロ流体閉回路混合構造体内で、前記検出可能なリガンドに曝露される、項目４８に記載の方法。
（５０）
前記混合物が、前記ミクロ流体閉回路混合構造体から流れを受け取るミクロ流体フローチャネル内で、前記検出可能なリガンドに曝露される、項目４８に記載の方法。
（５１）
前記タンパク質が、前記リガンドへの曝露の前にタグ化され；そして
該可溶性タグか膜タンパク質が、前記ミクロ流体フローチャネル内で、表面に結合する、
項目５０に記載の方法。
（５２）
２つの流体を混合する方法であって、以下：
第一の静止流体を配置する工程；
第二の流体を該第一の静止流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程；
該第一の流体および第二の流体の対流を抑制し、その結果、該界面を横切る該第一の流体と第二の流体との間の混合が、実質的に拡散のみによって起こる、工程；
を包含する、方法。
（５３）
前記第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程が、前記界面における該第一の流体および第二の流体の一部分を、第一の次元に制限する工程を包含する、項目５２に記載の方法。
（５４）
前記第一の次元が、ミクロ流体チャネルの幅を含む、項目５３に記載の方法。
（５５）
前記対流が、前記チャネルの壁に存在する非スリップ層に起因して制限される、項目５４に記載の方法。
（５６）
前記第二の流体が、前記第一の流体と直接接触して配置される、項目５２に記載の方法。
（５７）
前記第一の流体が、前記フローチャネルの分枝内に配置される、項目５６に記載の方法。
（５８）
前記第一の流体が、対向圧力に起因して、前記分枝チャネル内で静止したままである、項目５７に記載の方法。
（５９）
前記分枝チャネルが、行き止まりを有する、項目５７に記載の方法。
（６０）
前記第一の流体が、閉鎖具の第一の側と接触して配置され；
前記第二の流体が、該閉鎖具の反対側と接触して配置され；そして
該閉鎖具が該チャネルから取り外されて、該流体界面を形成する、
項目５２に記載の方法。
（６１）
前記第一の流体および第二の流体が、ミクロ流体チャネル内に配置され；
前記閉鎖具が、該ミクロ流体チャネル内に存在するエラストマー膜を備え；そして
該エラストマー膜の一部分が、作動力に応答して該チャネルから偏向されることによって取り外される、
項目６０に記載の方法。
（６２）
前記ミクロ流体フローチャネルの幅が、該ミクロ流体フローチャネルをエラストマー材料に製造するために使用される鋳型の隆起特徴の幅によって規定される、項目６１に記載の方法。
（６３）
前記隆起特徴の幅が、フォトリソグラフィー技術を利用して規定される、項目６２に記載の方法。
（６４）
前記隆起特徴の幅が、線が配置されるべき領域の上のマスクをパターン付けすること、次いで、該マスクのいずれかの側の材料を除去することによって規定される、項目６２に記載の方法。
（６５）
前記ミクロ流体フローチャネルの幅が、エラストマー膜の層内に閉じ込められた犠牲材料の線の幅によって規定される、項目６１に記載の方法。
（６６）
前記犠牲材料の幅が、該犠牲材料の層を前記エラストマーの上に形成すること、および該犠牲材料を前記線のいずれかの側から除去することによって規定される、項目６５に記載の方法。
（６７）
前記第一の次元が、親水性経路の幅を含む、項目５３に記載の方法。
（６８）
前記親水性経路の幅が、親水性材料の沈着の間に露出される基板表面の領域の幅によって規定される、項目６７に記載の方法。
（６９）
前記親水性経路の幅が、親水性材料の沈着の間にマスクされる基板表面の領域の幅によって規定される、項目６７に記載の方法。
（７０）
２つの流体を混合する方法であって、以下：
全体積を有する第一の静止流体を提供する工程；
全体積を有する第二の静止流体を提供する工程；
該第一の静止流体の一部分を、該第二の静止流体の一部分と接触させて配置して、流体界面を形成する工程であって、その結果、該第一の流体および第二の流体の最小の体積が、該流体界面にすぐ沿って存在する、最も激しい濃度勾配に曝露される、工程、
を包含する、方法。
（７１）
前記界面に沿った、前記第一の流体および第二の流体の部分が、ミクロ流体フローチャネルの寸法によって制限される、項目７０に記載の方法。
（７２）
前記第一の流体が、第一のチャンバに入れられ、前記第二の流体が、第二のチャンバに入れられ、そして該第一のチャンバの断面積対該ミクロ流体フローチャネルの断面積の比が、５００と２５，０００との間であるように、前記ミクロ流体フローチャネルが、該チャンバを接続している、項目７１に記載の方法。
（７３）
流体系の特性を決定する方法であって、以下：
標的を含有する第一の静止流体を配置する工程；
第二の静止流体を該第一の流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程；
該第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、混合が、該界面を横切って、拡散のみによって起こり、物理的特性を明らかにする、工程、
を包含する、方法。
（７４）
前記第一の流体および第二の流体が同じであり、そして別の流体中の前記標的の拡散係数が既知であり、その結果、該第一の流体および第二の流体の粘度が決定され得る、項目７３に記載の方法。
（７５）
前記第二の流体が、前記標的に結合することが既知である分析物を含有し、その結果、前記標的の濃度が、該標的の非存在下での該分析物の予測される拡散挙動からの該分析物の観察される拡散挙動の偏差から決定され得る、項目７３に記載の方法。
（７６）
前記標的に対する前記分析物の親和性が既知であり、そして該標的の濃度が、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、該分析物の一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、項目７５に記載の方法。
（７７）
前記標的に対する前記分析物の親和性が既知であり、そして該標的の大きさが、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、該分析物の一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、項目７５に記載の方法。
（７８）
前記分析物および標的の濃度が既知であり、そして該標的に対する該分析物の親和性が、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、該分析物の一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、項目７５に記載の方法。
（７９）
前記第二の流体が、微生物を含有し、その結果、該微生物によって示される該標的に対する化学走性が分析され得る、項目７３に記載の方法。
（８０）
標的材料の特性を分析するための構造体であって、以下：
標的を含有する、ある体積の第一の静止流体を含むように構成された、第一の微小製造された領域；
該標的に結合することが既知である分析物を含有する、ある体積の第二の静止流体を含むように構成された、第二の微小製造された領域；
該体積の第一の流体を、フリーミクロ流体界面を横切って該体積の第二の流体と拡散連絡させて配置させるように作動可能な弁；および
該第一の微小さ製造された領域における該分析物の存在を検出するように構成された検出器、
を備える、構造体。
（８１）
前記第一の微小製造された領域が、第一のチャンバを備え、該第一のチャンバは、該第一のチャンバの次元に対して少なくとも１つの次元を制限された第一のチャネル部分と流体連絡しており；
前記第二の微小製造された領域が、第二のチャンバを備え、該第二のチャンバは、該第二のチャンバの次元に対して少なくとも１つの次元を制限された第二のチャネル部分と流体連絡しており；
前記弁が、該第一のチャネル部分と該第二のチャネル部分との間のチャネル内に偏向可能なエラストマー膜を備え；そして
前記検出器が、前記第一のチャンバ内の分析物の濃度の増加の速度を、経時的に検出するように構成されている、
項目８０に記載の構造体。
（８２）
前記第一の微小製造された領域が、少なくとも１つの次元を制限された第一の微小製造されたチャネル部分を備え；
前記第二の微小製造された領域が、少なくとも１つの次元を制限された第二の微小製造されたチャネル部分を備え；
前記弁が、該第一のチャネル部分と該第二のチャネル部分との間に微小製造されたチャネル内に偏向可能なエラストマー膜を備え；そして
前記検出器が、前記弁からの距離にわたって、前記第一のチャンバ内の該分析物の濃度を検出するように構成されている、
項目８０に記載の構造体。
（８３）
前記検出器が、蛍光、屈折率、非色分析、表面プラスモン共鳴、および伝導率のうちの少なくとも１つを検出するように構成されている、項目８０に記載の構造体。
（８４）
タンパク質サンプル中の低分子の濃度を減少させる方法であって、該方法は、以下：
該タンパク質サンプルを含有する第一の静止流体を、ミクロ流体チャネルに入れる工程；
低濃度の該低分子を有する第二の静止流体を、該第一の流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程；
該第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、該第一の静止流体からの該低分子が、拡散のみによって、該界面を横切って拡散し、該第一の静止流体中に存在する低分子の濃度を減少させる、工程、
を包含する、方法。
（８５）
リガンドと標的との間の反応を決定する方法であって、以下：
該リガンドを含有する第一の流体を、第一のチャンバに入れる工程；
該標的を含有する第二の流体を、第二のチャンバに入れる工程；
該第一のチャンバと第二のチャンバとを接続しているチャネル内において、該第一の流体と第二の流体との間のミクロ流体フリー界面を確立する工程；
該第一の流体と第二の流体との間の該ミクロ流体フリー界面を横切る拡散によって混合を起こさせる工程であって；その結果、該リガンドが該標的に結合し、そして該リガンドと該標的との間の反応性が、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、工程、
を包含する、方法。
（８６）
前記拡散プロフィールの偏差が、前記リガンド単独の拡散に対する、リガンド／標的の組み合わせの減少した拡散を反映する、項目８５に記載の方法。
（８７）
前記標的が、もとのリガンドに結合され；
前記リガンドが、競合物リガンドを表し；そして
前記拡散プロフィールの偏差が、該配置された元のリガンドの増強された拡散を反映し、そして該もとのリガンドの検出可能な物理特性によって明らかにされる、
項目８５に記載の方法。
（８８）
前記拡散プロフィールの偏差が、前記配置された元のリガンドからの蛍光信号の発光によって明らかにされる、項目８５に記載の方法。
（８９）
前記拡散プロフィールの偏差が、前記配置された元のリガンドからの蛍光信号のクエンチによって明らかにされる、項目８５に記載の方法。
（９０）
ある範囲の条件下で化学反応をサンプリングする方法であって、以下：
第一の反応物を含有する第一の流体と、第二の反応物を含有する第二の流体との間に、ミクロ流体フリー界面を形成する工程；
該第二の流体内への該第一の反応物の拡散を引き起こして、該第一の反応物の濃度勾配を作製する工程；および
該勾配に沿った種々の濃度での該第一の反応物と、第二の反応物との間の反応を観察する工程、
を包含する、方法。
（９１）
前記第二の反応物が、検出可能な生成物を生成するための反応を触媒する酵素を含有し；そして
前記第一の反応物が、該酵素のインヒビターを含有する、
項目９０に記載の方法。
（９２）
前記生成物が、蛍光、屈折率、比色分析、表面プラスモン共鳴、および導電率のうちの少なくとも１つをモニタリングすることによって検出される、項目９１に記載の方法。
（９３）
化学種の濃度勾配を作製する方法であって、以下：
該化学種を含有する第一の流体を配置する工程；
第二の静止流体を該第一の静止流体の近くに配置して、ミクロ流体フリー界面を形成する工程；
該第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、該ミクロ流体フリー界面を横切る該第一の流体と第二の流体との間の混合が、実質的に拡散のみによって起こり、そして該化学酒の濃度勾配が作製される、工程、
を包含する、方法。
（９４）
前記第一の化学種が、前記第二の流体と流体連絡する細胞のための栄養を含有する、項目９３に記載の方法。
（９５）
第二の化学種を含有する第三の流体を、前記第二の流体の近くに配置して、第二のミクロ流体フリー界面を形成する工程；
該第二の流体および第三の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、該第二のミクロ流体フリー界面を横切る該第二の流体と第三の流体との間の混合が、実質的に拡散のみによって起こり、そして該第二の化学種の第二の濃度勾配が、前記第一の化学種の濃度勾配に重ねられる、工程、
をさらに包含する、項目９３に記載の方法。
（９６）
前記第一の化学種の濃度勾配の方向が、前記第二の化学種の濃度勾配の方向と平行ではない、項目９５に記載の方法。
（９７）
前記第一の化学種の濃度勾配の方向が、前記第二の化学物質の濃度勾配に対しておよそ垂直であり、その結果、該第一の化学種の濃度条件および第二の化学種の濃度条件のアレイが作製される、項目９６に記載の方法。
（９８）
前記第一の化学種および第二の化学種の拡散が、浅いチャンバ内で起こる、項目９７に記載の方法。
（９９）
前記第一の化学種および第二の化学種の拡散が、直交して配向したミクロ流体フローチャネルのセットにおいて起こる、項目９７に記載の方法。
（１００）
薬物を被験体に導入する方法であって、以下：
該薬物を含有する第一の静止流体を、ミクロ流体デバイスに入れる工程；
該第一の静止流体と該被験体との間の該ミクロ流体デバイスに、第二の流体を入れる工程；
該第一の流体と該第二の流体との間に、ミクロ流体フリー界面を確立する工程であって、その結果、予め決定された量の該薬物が拡散して、予め決定された時間の後のみに該被験体に達する、工程、
を包含する、方法。
（１０１）
前記被験体への前記薬物の拡散の時間が、該被験体と前記第一の流体との間に配置された前記ミクロ流体デバイス内のチャネルの寸法によって決定される、項目１００に記載の方法。
（１０２）
化学反応の間の反応物の濃度を制御する方法であって、以下：
第一の反応物を含有する第一の静止流体を、ミクロ流体構造体に入れる工程；
該第一の静止流体の近くで、第二の流体を該ミクロ流体構造体に入れる工程であって、該第二の静止流体が、第二の反応物を含有する、工程；
該第一の流体と第二の流体との間に、ミクロ流体フリー界面を確立する工程；
該ミクロ流体フリー海面を横切る、該第一の流体と第二の流体との間での拡散を可能に
して、該第一の反応物と第二の反応物との相対濃度を決定する工程、
を包含する、方法。
本発明に従う、複数の化学混合物を一定の数の入口から調製するための方法の実施形態は、第一の入口からミクロ流体混合構造体までのある体積の第一の化学物質を計量供給する工程、ならびに第二の入口からミクロ流体混合構造体までの第二の体積の第二の化学物質を計量供給して、第一の化学物質および第二の化学物質を含有する第一の混合物を生成する工程を包含する。この第一の混合物は、ミクロ流体混合構造体から流出され、そして第一の化学物質の体積が、第一の入口からミクロ流体混合構造体まで、再度計量供給される。第三の入口からミクロ流体混合構造体までの、ある体積の第三の化学物質が計量供給されて、第一の化学物質および第三の化学物質を含有する第二の混合物が生成される。
本発明に従う装置の実施形態は、第一のエラストマー層に形成されたミクロ流体フローチャネルネットワークを備え、このミクロ流体フローチャネルネットワークは、接合部および試薬供給源と流体連絡する、第一のセットの入口分枝を備える。第二のセットの入口分枝が、接合部および緩衝剤居急減と流体連絡している。混合構造体が、接合部および出口と流体連絡している。第一の制御チャネルネットワークが、第一のエラストマー層に隣接する第二のエラストマー層に形成され、この第一の制御チャネルネットワークは、第一の入口分枝セットに隣接して、選択試薬を接合部に流すように構成された第一のマルチプレクサ構造体を規定する。第二の制御チャネルネットワークが、第二のエラストマー層に形成され、この第二の制御チャネルネットワークは、第二の入口分枝セットに隣接して、選択緩衝剤を接合部に流すように構成された第二のマルチプレクサ構造体を規定する。
本発明に従う、結晶化を導く条件を同定するための方法の実施形態は、溶媒およびサンプルを第一の濃度で含有する第一の溶液を調製する工程、および第一の溶液と、結晶化剤を含有する第二の溶液とを混合する工程を包含する。この混合物において固相が最初に出現する第一の条件が、記録される。さらなる溶媒がこの混合物に添加され、そしてこの混合物における固相が消失する第二の条件が記録される。第一の条件と第二の条件との間のヒステリシスが同定される。
本発明に従う、結晶化を導く条件を同定する方法の実施形態は、結晶化剤がサンプルを含有する溶液と混合される際の光散乱を検出する工程、および検出された散乱光を、タンパク質結晶含有溶液に特徴的な既知の範囲の第二のビリアル係数で補正する工程を包含する。
本発明に従う、ミクロ流体デバイスを通る流れを制御するための方法の実施形態は、フローチャネルに流体を入れる工程、およびこのフローチャネルに隣接しかつこのフローチャネルから離れた制御チャネルに圧力を付与して、介在するエラストマー膜をフローチャネル内に偏向させる工程を包含する。このフローチャネル中の流体のベースライン圧力は、５ｐｓｉｇより高く維持され、一方で、制御チャネルに付与される圧力は緩和されて、このエラストマー膜を、フローチャネルの外に付勢する。
本発明に従う、２つの流体を混合するための方法の実施形態は、第一の静止流体を配置する工程、および第二の流体をこの第一の静止流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程を包含する。第一の流体および第二の流体の対流が抑制され、その結果、この界面を横切る、第一の流体と第二の流体との間の混合は、実質的に、拡散のみによって起こる。
本発明に従う、２つの流体を混合するための方法の別の実施形態は、全体積を有する第一の静止流体を提供する工程、および全体積を有する第二の静止流体を提供する工程を包含する。第一の静止流体お一部分が、第二の静止流体の一部分と接触して配置されて、流体界面を形成し、その結果、最良体積の第一の流体および第二の流体が、流体界面にすぐ沿って存在する最も激しい濃度勾配に曝露される。
本発明に従う、流体系の特性を決定するための方法の実施形態は、標的を含有するだいいちのっ性知る謡を配置する工程、および第二の静止流体をこの第一の流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程を包含する。第一の流体および第二の流体の対流が抑制され、その結果、この界面を横切る混合は、拡散のみによって起こり、物理特性を明らかにする。
本発明に従う、標的材料の特性を分析するための構造体は、標的を含有するある体積の第一の静止流体を含むように構成された、第一の微小製造された領域を備える。第二の微小製造された領域は、この標的に結合することが公知である分析物を含有する、ある体積の第二の静止流体を含むように構成される。弁が、フリーミクロ流体界面を横切って、第一の流体の体積を第二の流体の体積と拡散連絡させて配置するように作動可能である。検出器は、第一の微小製造された領域における分析物の存在を検出するように構成される。
本発明に従う、タンパク質サンプル中の低分子の濃度を減少させるための方法の実施形態は、タンパク質サンプルを含有する第一の静止流体を、ミクロ流体チャネルに入れる工程を包含する。低濃度の低分子を有する第二の静止流体が、第一の流体の近くに配置されて、流体界面を形成する。第一の流体および第二の流体の対流が抑制され、その結果、第一の静止流体からの低分子が、拡散のみによって、この界面を横切って拡散し、第一の静止流体中に存在する低分子の濃度を減少させる。
本発明に従う、リガンドと標的との間の反応を決定するための方法は、リガンドを含有する第一の流体を第一のチャンバに入れる工程、および標的を含有する第二の流体を第二のチャンバに入れる工程を包含する。ミクロ流体フリー界面が、第一の流体と第二の流体との間で、第一のチャンバと第二のチャンバとを接続しているチャネル内に確立される。混合が、第一の流体と第二の流体との間のミクロ流体仮面を横切る拡散によって起こり、その結果、リガンドが標的に結合して、リガンドと標的との間の反応性が、標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、一時的な拡散プロフィールおよび空間拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって、決定され得る。
一連の条件下で化学反応をサンプリングする方法は、第一の反応物を含有する第一の流体と、第二の反応物を含有する第二の流体との間に、ミクロ流体フリー界面を形成する工程、およびこの第一の反応物を第二の流体中に拡散させて、第一の反応物の濃度勾配を生成する工程を包含する。この勾配に沿った種々の濃度の第一の反応物と、第二の反応物との間の反応が観察される。
本発明に従う、化学種の濃度勾配を生成する方法の実施形態は、この化学種を含有する第一の流体を配置する工程、および第二の静止流体をこの第一の静止流体の近くに配置して、ミクロ流体フリー界面を形成する工程を包含する。第一の流体および第二の流体の対流が抑制され、その結果、ミクロ流体フリー界面を横切る第一の流体と第二の流体との間での混合が、実質的に拡散のみによって起こり、そして化学種の濃度勾配が生成される。
本発明に従う、薬物を被験体に導入するための方法の実施形態は、この薬物を含有する第一の静止流体をミクロ流体デバイスに入れる工程、およびこの第一の静止流体と被験体との間のミクロ流体デバイスに、第二の流体を配置する工程を包含する。ミクロ流体フリー界面が、第一の流体と第二の流体との間に確立され、その結果、予め決定された量の薬物が拡散して、予め決定された時間の後のみに、被験体に達する。
本発明に従う、化学反応の間の反応物の濃度を制御するための方法の実施形態は、第一の反応物を含有する第一の静止流体をミクロ流体構造体に入れる工程、および第二の流体を、この第一の静止流体の近くで、ミクロ流体構造体に入れる工程を包含し、この第二の静止流体は、第二の反応物を含有する。ミクロ流体フリー界面が、第一の流体と第二の流体との間に確立される；このミクロ流体フリー界面を横切って、第一の流体と第二の流体との間で拡散させて、第一の反応物と第二の反応物との相対濃度を決定する。本発明のこれらおよび他の実施形態、ならびにその利点および特徴は、以下の本文および添付の図面とあわせてより詳細に記載される。
図１は、微細機械加工鋳型の上部に形成された第１のエラストマー層の概略図である。 図２は、微細機械加工鋳型の上部に形成された第２のエラストマー層の概略図である。 図３は、微細機械加工鋳型から取り外され、図１のエラストマー層の上部の上に配置された、図２のエラストマー層の概略図である。 図４は、図３に対応する概略図であるが、第１のエラストマー層の上部の上に配置された第２のエラストマー層を示す。 図５は、図４に対応する概略図であるが、一緒に結合した第１および第２のエラストマー層を示す。 図６は、図５に対応する概略図であるが、取り外された第１の微細機械加工した鋳型および適切な位置に配置された平面基板を示す。 図７Ａは、図６に対応する概略図であるが、平面基板上に密封されたエラストマー構造体を示す。 図７Ｂは、図７Ａに対応する正面断面図であり、開口フローチャネルを示す。 図７Ｃは、分離したエラストマー層から形成される膜を有するエラストマー構造体を形成するための方法の工程を示す概略図である。 図７Ｄは、分離したエラストマー層から形成される膜を有するエラストマー構造体を形成するための方法の工程を示す概略図である。 図７Ｅは、分離したエラストマー層から形成される膜を有するエラストマー構造体を形成するための方法の工程を示す概略図である。 図７Ｆは、分離したエラストマー層から形成される膜を有するエラストマー構造体を形成するための方法の工程を示す概略図である。 図７Ｇは、分離したエラストマー層から形成される膜を有するエラストマー構造体を形成するための方法の工程を示す概略図である。 図７Ｈは、作動した状態の図７Ｂのバルブを示す正面断面図である。 図８Ａは、種々のフローチャネルについての、バルブ開口 対 加えられた圧力を示す。 図８Ｂは、種々のフローチャネルについての、バルブ開口 対 加えられた圧力を示す。 図９は、１００μｍ×１００μｍ×１０μｍ ＲＴＶミクロバルブの時間応答を示す。 図１０は、膜の作動を示す図７Ｂのバルブの正面断面図である。 図１１は、湾曲した上面を有するフローチャネルを有するバルブの代替の実施形態の正面図である。 図１２Ａは、オン／オフバルブの上部概略図である。 図１２Ｂは、図１２Ａにおける線２３Ｂ−２３Ｂに沿った断面立面図である。 図１３Ａは、蠕動ポンピングシステムの上部概略図である。 図１３Ｂは、図１３Ａにおける線２４Ｂ−２４Ｂに沿った断面立面図である。 図１４は、図１３の蠕動ポンピングシステムの１実施形態についての、実験的に達成されたポンピング速度 対 周波数を示すグラフである。 図１５Ａは、複数のフローラインを同時に作動する１つの制御ラインの上部概略図である。 図１５Ｂは、図１５Ａの線２６Ｂ−２６Ｂに沿った断面立面図である。 図１６は、種々のチャネルを通って流れ得るように適合された多重システムの概略図である。 図１７Ａは、本発明に従った組合せ混合デバイスの１つの実施形態の平面図を示す。 図１７Ｂは、図１７Ａの組合せ混合デバイスの一部分の拡大平面図を示す。 図１８は、注入スラグの数に対する注入体積をプロットする。 図１９は、注入スラグの数に対する濃度のプロットを示す。 図２０Ａは、切替可能なフローアレイのエラストマーの第１の層（すなわち、フローチャネル層）の底面図である。 図２０Ｂは、切替可能なフローアレイの制御チャネル層の底面図である。 図２０Ｃは、図２０Ｂの第２の層のエラストマー内に一組の制御チャネルを有する、図２０Ａの第１の層のエラストマーの整列を示す。 図２０Ｄは、図２０Ｂの第２の層のエラストマー内に他の組の制御チャネルを有する、図２０Ａの第１の層のエラストマーの整列を示す。 図２１は、本発明に従った回転ミキサ構造体の１つの実施形態の平面図を示す。 図２２は、本発明に従った組合せ混合ミキサ構造体のアレイの平面図を示す。 図２３は、図２２に記載の組合せ混合構造体のアレイの拡大図を示す。 図２４は、タンパク質および沈殿化剤の混合物の位相空間を示す。 図２５は、タンパク質および沈殿化剤の位相空間におけるヒステリシス効果を示す。 図２６Ａは、本発明に従うセルペン構造体の１実施形態の操作を示す平面図を示す。図２６Ｂは、本発明に従うセルペン構造体の１実施形態の操作を示す平面図を示す。図２６Ｃは、本発明に従うセルペン構造体の１実施形態の操作を示す平面図を示す。図２６Ｄは、本発明に従うセルペン構造体の１実施形態の操作を示す平面図を示す。 図２７Ａは、本発明に従うセルケージ構造体の１実施形態の操作を示す平面図を示す。図２７Ｂは、本発明に従うセルケージ構造体の１実施形態の操作を示す断面図を示す。 図２８Ａは、本発明の実施形態に従う交差チャネル注入を利用する配線構造体の操作の平面図を示す。図２８Ｂは、本発明の実施形態に従う交差チャネル注入を利用する配線構造体の操作の平面図を示す。図２８Ｃは、本発明の実施形態に従う交差チャネル注入を利用する配線構造体の操作の平面図を示す。図２８Ｄは、本発明の実施形態に従う交差チャネル注入を利用する配線構造体の操作の平面図を示す。 図２９Ａ〜Ｄは、本発明の実施形態に従ったミクロ流体フリー界面を横切って拡散する際の２つの流体に対する、濃度と距離をプロットする簡略化した概略図である。 図３０Ａ〜Ｂは、キャピラリーチューブにおけるミクロ流体フリー界面の意図的に形成することの簡略した断面図を示す。 図３１Ａ〜Ｂは、圧力によって駆動されたポアズイユ流の放物線上の速度分布から生じる、キャピラリーチューブ中の第１の溶液と第２の溶液との間の対流による混合の簡略化した断面図を示す。 図３２Ａ〜Ｃは、第１の溶液と第２の溶液との間のキャプラリーチューブにおける相互作用の簡略化した断面図を示し、ここで、その第１の溶液の密度は、その第２の溶液の密度よりも大きい。 図３３Ａは、本発明の実施形態に従ったミクロ流体フリー界面の簡略化した断面図を示す。 図３３Ｂは、従来の非ミクロ流体界面の簡略化した断面図を示す。 図３４は、フローチャネルの開始および本発明の実施形態に従ったミクロ流体フリー界面の形成の平面図を示す。 図３５は、ミクロ流体フリー界面をつくる「ブレイクスルー」バルブの使用の簡略した概略図を示す。 図３６Ａは、タンパク質結晶が、従来型のマクロスコピックフリー界面拡散技術を利用して形成されることの簡略化した概略図を示す。 図３６Ｂは、タンパク質結晶が、本発明の実施形態に従ったミクロ流体フリー界面を利用して形成されることの簡略化した概略図を示す。 図３７Ａは、別個に作動される界面バルブのいずれかの側面上に位置づけられたジグザグ型の制御チャネルによって間隔をあけて重ねあわされたフローチャネルが、複数のチャンバ（Ａ〜Ｇ）を規定することの簡略化した平面図を示す。 図３７Ｂ〜Ｄは、図３７Ａにおいて示されたフローチャネルについての様々な時間における溶媒濃度をプロットする。図３７Ｂ〜Ｄは、図３７Ａにおいて示されたフローチャネルについての様々な時間における溶媒濃度をプロットする。 図３７Ｂ〜Ｄは、図３７Ａにおいて示されたフローチャネルについての様々な時間における溶媒濃度をプロットする。 図３８Ａは、異なる長さのミクロチャネルによって接続されたチャンバ対の３つのセットを示す。 図３８Ｂは、「平衡時間」対「チャネル長」をプロットものである。 図３９は、４対のチャンバを示し、このチャンバの各々は、ミクロチャネルを接続する様々な配置を有する。 図４０Ａは、本発明に従ったミクロ流体構造体の簡単な実施形態の平面図を示す。 図４０Ｂは、図４０Ａの構造体についての、「濃度」対「距離」の簡単なプロットである。 図４１は、「図４０のレザバのうちの１つにおける濃度が最終平衡濃度である０．６に達するための時間」対「チャネル長」をプロットする。 図４２は、「図４０のレザバのうちの１つにおける濃度が最終平衡濃度である０．６に達するための時間（Ｔ０．６）の逆数」対「図４０の流体界面の面積」を示す。 図４３は、流体Ａと流体Ｂとの間の位相空間を示す相図を提示し、そして、その位相空間における経路が、レザバ中を横断し、その流体が図４０に記載のミクロ流体フリー界面を横切って拡散するときに、その位相空間における経路が横切ることを示す挿図を提供する。 図４４は、本発明に従ったチップホルダーの１実施形態の拡大図を示す。 図４５Ａは、実験結果を得るために使用したチップの代替的実施形態のの簡略化した平面図を示す。 図４５Ｂは、図４５Ａにおいてい示されたチップの３化合物ウェルのセットの簡略化した拡大平面図を示す。 図４５Ｃは、図４５Ａ〜Ｂの化合物ウェルの簡略化した断面図を示す。 図４６は、流れる流体と一端が閉じた分岐チャネルとの間にミクロ流体フリー界面の生成の平面図を示す。 図４７は、異なる次元で２つの異なる種の拡散勾配を生成するための本発明に従ったミクロ流体構造体の１つの実施形態の簡略化した平面図を示す。 図４８は、異なる次元で２つの異なる種の拡散勾配を生成するための本発明に従ったミクロ流体構造体の代替的実施形態の簡略化した平面図を示す。 図４９は、本発明の実施形態に従った貯蔵デバイスの簡略化した平面図を示す。 図５０は、本発明に従った交差フロー注入システムの１つの実施形態について、「Ｌｏｇ（Ｒ／Ｂ）」対「注入されたスラグの数」をプロットする。 図５１は、本発明に従った交差フロー注入構造体の１つの実施形態の、操作の間の、「注入された体積」対「注入サイクル」をプロットする。 図５２は、本発明に従ったミクロ流体チップを利用する結晶化ヒットのプロットを示す。 図５３Ａ〜Ｂは、本発明の１実施形に従った結晶成長／回収チップの１実施形態の平面図および断面図を示す。 図５４Ａは、本発明に従った組合せ混合／貯蔵構造体の１つの実施形態の平面図を示す。 図５４Ｂは、図５４Ａの構造体の混合部分の拡大図を示す。 図５４Ｃは、図５４Ａの構造体の貯蔵アレイの拡大図を示す。 図５４Ｄは、図５４Ｃの構造体の貯蔵アレイの１つのセルの拡大図を示す。 図５５は、ある種の高分子溶媒の組合せの位相空間の一部分を規定するための、「高分子濃度」対「溶媒濃度」をプロットする。 図５６Ａ〜Ｆは、図５５に示された位相空間の種々の領域におけるギブス自習エネルギー図である。 図５７は、多くの結晶化アプローチによって達成された図５５に示される位相空間におけるトラジェクトリーをプロットしたものである。 図５８Ａ〜Ｄは、開閉蛇行型貯蔵ラインを利用する貯蔵技術の概略図を例示する。 図５８Ａ〜Ｄは、開閉蛇行型貯蔵ラインを利用する貯蔵技術の概略図を例示する。 図５９は、マルチプレクサが並列貯蔵チャネルに実験条件の各々を指向させるために使用される実施形態の概略図を例示する。 図６０は、反応条件の各々が、貯蔵ラインの一端に対して満たされた閉じた一端である実施形態の概略図を例示する。 図６１Ａ〜図６１Ｆは、膜タンパク質を溶解するための本発明に従った方法の実施形態の概略図を示す。 図６１Ａ〜図６１Ｆは、膜タンパク質を溶解するための本発明に従った方法の実施形態の概略図を示す。 図６２Ａは、本発明に従った拡散分析を実施するためのミクロ流体構造体の１つの実施形態の簡略化した平面図を示す。 図６２Ｂは、図４５Ａにおいて示された構造体についての、予測された、「シグナル強度」対「拡散時間」、ならびに観察された、「シグナル強度」対「拡散強度」をプロットする。 図６３Ａは、本発明に従った拡散分析を実施するためのミクロ流体構造体の代替的実施形態の簡略化した平面図を示す。 図６３Ｂにおいて、図４６Ａに示された構造体に関する、予測された、「シグナル強度」対「拡散距離」、ならびにその観察された「シグナル強度」対「拡散距離」がプロットされる。 図６４は、セルケージへまたセルケージからの栄養および廃物質のミクロ流体フリー界面を横切る拡散の平面図を示す。 図６５は、競合結合アッセイを実施するための本発明に従ったミクロ流体構造体の１つの実施形態の簡略化した平面図を示す。 図６６は、競合結合アッセイを実施するための本発明に従ったミクロ流体構造体の代替的実施形態の簡略化した平面図を示す。 図６７は、基質代謝回転アッセイを実施するための本発明に従ったミクロ流体構造体の１つの実施形態の簡略化した平面図を示す。
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．微細製作（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）の概説）
以下の考察は、米国特許出願０９／８２６，５８５号（２００１年４月６日出願）、同第０９／７２４，７８４号（２０００年１１月２８日出願）、および同第０９／６０５，５２０号（２０００年６月２７日出願）に一般的に記載される、エラストマー材料を利用した、微細製作された流体デバイスの形成に関する。これらの特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
（１．製造方法）
本発明の例示的な製造方法を本明細書中に提供する。本発明は、これらの方法のうちの１つまたは他のものによる製造に限定されないことが理解されるべきである。むしろ、本発明の微細構造の他の適切な製造方法（本発明を改変することを含む）もまた意図される。
図１〜図７Ｂは、本発明の微細構造（これは、ポンプまたはバルブとして用いられ得る）の第一の好ましい製造方法の連続工程を図示する。図８〜図１８は、本発明の微細構造（これもまた、ポンプまたはバルブとして用いられ得る）の第二の好ましい製造方法の連続工程を図示する。
説明するように、図１〜図７Ｂの好ましい方法は、集められて結合される事前硬化エラストマー層を用いることを含む。代替方法では、エラストマーの各層は、「適所で」硬化され得る。以下の説明では、「チャネル」とは、エラストマー構造中の、流体または気体の流れを含み得る溝をいう。
図１を参照して、第一の微細加工鋳型１０が提供される。微細加工鋳型１０は、多数の従来のシリコン加工方法（写真平板、イオンミリングおよび電子ビームリソグラフィーを含むがこれらに限定されない）によって製造され得る。
見られ得るように、微細加工鋳型１０は、それに沿って延びる、隆起線または突出部１１を有する。第一エラストマー層２０は、示されるように、第一溝２１（溝２２は、突出部１１に寸法が対応する）が、エラストマー層２０の下表面に形成されるように、鋳型１０の上部に鋳造される。
図２に見られ得るように、それに沿って延びる隆起した突出部１３を有する第二の微細加工鋳型１２もまた提供される。第二エラストマー層２２は、溝２３が、突出部１３の寸法に対応するその下表面に形成されるように、示されるように、鋳型１２の上部に鋳造される。
図３および図４に図示した連続工程において見られ得るように、次いで、第二エラストマー層２２は鋳型１２から取り出され、そして第一エラストマー層２０の上部に配置される。見られ得るように、第二エラストマー層２２の下表面に沿って延びる溝２３は、フローチャネル３２を形成する。
図５を参照して、次いで、別個の第一エラストマー層２０および第二エラストマー層２２（図４）は、一緒に結合されて、一体型（すなわち、モノリシック）エラストマー構造２４が形成される。
図６および図７Ａの連続工程において見られ得るように、次いで、エラストマー構造２４は、鋳型１０から取り出され、そして平面基板１４の上部に配置される。図７Ａおよび図７Ｂにおいて見られ得るように、エラストマー構造２４がその下表面で平面基板１４に対してシールされた場合、溝２１は、フローチャネル３０を形成する。
本発明のエラストマー構造は、ほぼ任意の平滑平面基板と可逆的気密シールを形成する。このようにしてシールを形成することに対する利点は、エラストマー構造が、はがされ得、洗浄され得、そして再使用され得ることである。好ましい局面では、平面基板１４はガラスである。ガラスを使用することのさらなる利点は、ガラスは透明であって、エラストマーチャネルおよびレザバの光学的な取り調べ（ｏｐｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）を可能にすることである。あるいは、エラストマー構造は、上記と同じ方法によって平坦なエラストマー層へと結合されて、永続的かつ高強度の結合を形成し得る。これは、より高い背圧が用いられる場合の利点を証明し得る。
図７Ａおよび図７Ｂにおいて見られ得るように、フローチャネル３０およびフローチャネル３２は好ましくは、フローチャネル３０の上部をフローチャネル３２の下部と分離する、基板２４の小さな膜２５と、互いにある角度で配置される。
好ましい局面では、平面基板１４はガラスである。ガラスを用いることの利点は、本発明のエラストマー構造がはがされ得、洗浄され得、そして再使用され得ることである。ガラスを用いることのさらなる利点は、光学検知が用いられ得ることである。あるいは、平面基板１４は、より高い背圧が用いられる場合、有益であると判明し得る、エラストマー自体であり得る。
ここに記載した製造方法は、デバイスのチャネルの壁を形成する材料とは異なるエラストマー材料から構成される膜を有する構造を形成するように改変され得る。この異なる製造方法を図７Ｃ〜図７Ｇに図示する。
図７Ｃを参照して、第一微細加工鋳型１０が提供される。微細加工鋳型１０は、それに沿って延びた、隆起線または突出部１１を有する。図７Ｄでは、第一エラストマー層２０は、第一エラストマー層２０の上部が隆起線または突出部１１の上部で洗い流されるよう
に、第一の微細加工鋳型１０の上部に鋳造される。これは、鋳型１０上に吐出されるエラストマー材料の容積を、隆起線１１の既知の高さに対して、注意深く制御することによって達成され得る。あるいは、所望の形状が、射出成形によって形成され得る。
図７Ｅでは、それに沿って延びた隆起した突出部１３を有する第二の微細加工鋳型１２もまた提供される。第二エラストマー層２２は、溝２３が、突出部１３の寸法に対応するその下表面に形成されるように、示されるように第二鋳型１２の上部に鋳造される。
図７Ｆでは、第二エラストマー層２２は、鋳型１２から取り出され、そして第三エラストマー層２２２の上部に配置される。第二エラストマー層２２は、第三エラストマー層２０に結合されて、以下に詳細に記載される技術を用いて、一体型エラストマーブロック２２４が形成される。このプロセスのこの点では、隆起線１３によって以前は占められていた溝２３が、フローチャネル２３を形成する。
図７Ｇでは、エラストマーブロック２２４は、第一微細加工鋳型１０および第一エラストマー層２０の上部に配置される。次いで、エラストマーブロックおよび第一エラストマー層２０は一緒に結合されて、別のエラストマー層２２２から構成される膜を有する一体型（すなわち、モノリシック）エラストマー構造２４を形成する。
エラストマー構造２４が、その下表面で、図７Ａに関して上記で記載した様式で平面基板にシールされている場合、隆起線１１によって以前占められていた溝は、フローチャネル３０を形成する。
図７Ｃ〜図７Ｇに関連して上記で図示した別の製造方法は、膜部分が、その構造の残部のエラストマー材料とは別の材料から構成されるのを可能にするという利点を提供する。これは、重要である。なぜなら、膜の厚さおよび弾性特性は、デバイスの操作において重要な役割を果たすからである。さらに、この方法は、別のエラストマー層が、エラストマー構造に取り込まれる前にコンディショニングに容易に供されるのを可能にする。以下に詳細に考察するように、潜在的に望ましい条件の例としては、膜の作動および／またはその弾性を変更するための膜へのドーパントの導入を可能にする磁気伝導種または電気伝導種の導入が挙げられる。
上記の方法は、微細加工鋳型の上部での複製成形によって形成される種々の成形エラストマー層を形成することに関して例示されたが、本発明は、この技術に限定されない。他の技術を用いて、一緒に結合されるべき成形エラストマー材料の個々の層を形成し得る。例えば、エラストマー材料の成形層は、レーザー切断もしくは射出成形によって、または第二の例示的な方法に関連して以下に考察されるとおりの化学エッチングおよび／もしくは犠牲材料を利用する方法によって、形成され得る。
代替的な方法は、エラストマー材料内にカプセル化されたフォトレジストの現像を利用する、パターン形成エラストマー構造を製造する。しかし、本発明による方法は、フォトレジストを利用することに限定されない。他の材料（例えば、金属）もまた、周囲のエラストマー材料に対して選択的に除去されるべき犠牲材料として役立ち得、そしてこの方法は、本発明の範囲内にある。例えば、金金属は、適切な化学混合物を利用してＲＴＶ ６１５エラストマーに対して選択的にエッチングされ得る。
（２．層およびチャネルの寸法）
微細製作されたとは、本発明の実施形態に従って製造されたエラストマー構造の特徴の大きさをいう。一般に、微細製作された構造の少なくとも１つの寸法におけるバリエーションは、ミクロンレベルまで制御され、少なくとも１つの寸法は、微視的（すなわち、１０００μｍ未満）である。微細製作は代表的に、顕微鏡レベルの特徴寸法を生じるために設計された、半導体またはＭＥＭＳ製造技術（例えば、写真平板および回転被覆（ｓｐｉｎｃｏａｔｉｎｇ））を含み、微細製作された構造の寸法の少なくともいくつかは、この構造を合理的に解明／画像化するために顕微鏡を必要とする。
好ましい局面では、フローチャネル３０、３２、６０および６２は好ましくは、約１０：１の幅：深さ比を有する。本発明の実施形態に従った幅：深さ比の他の範囲の非限定的リストは、０．１：１〜１００：１、より好ましくは１：１〜５０：１、より好ましくは２：１〜２０：１、そして最も好ましくは３：１〜１５：１である。例示的な局面では、フローチャネル３０、３２、６０および６２は、約１〜１０００ミクロンの幅を有する。本発明の実施形態に従ったフローチャネルの幅の他の範囲の非限定的リストは、０．０１〜１０００ミクロン、より好ましくは０．０５〜１０００ミクロン、より好ましくは０．２〜５００ミクロン、より好ましくは１〜２５０ミクロン、そして最も好ましくは１０〜２００ミクロンである。例示的なチャネル幅としては、以下が挙げられる：０．１μｍ、１μｍ、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍ、２３０μｍ、２４０μｍおよび２５０μｍ。
フローチャネル３０、３２、６０および６２は、約１〜１００ミクロンの深さを有する。本発明の実施形態に従ったフローチャネルの深さの他の範囲の非限定的リストは、０．０１〜１０００ミクロン、より好ましくは０．０５〜５００ミクロン、より好ましくは０．２〜２５０ミクロン、そしてより好ましくは１〜１００ミクロン、より好ましくは２〜２０ミクロン、そして最も好ましくは５〜１０ミクロンである。例示的なチャネル深さとしては、以下が挙げられる：０．０１μｍ、０．０２μｍ、０．０５μｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、７．５μｍ、１０μｍ、１２．５μｍ、１５μｍ、１７．５μｍ、２０μｍ、２２．５μｍ、２５μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、および２５０μｍ。
これらのフローチャネルは、上記で与えたこれらの特定の寸法範囲および例に限定されず、そして、図２７に関連して以下に詳細に考察したとおりに膜を反らせるために必要な大きさの力に影響を与えるために幅が変化し得る。例えば、０．０１μｍの桁の幅を有する極めて狭いフローチャネルは、以下に詳細に考察したとおり、光学的適用および他の適用において有用であり得る。上記よりもさらに大きな幅のチャネルを有する部分を含むエラストマー構造もまた、本発明によって意図され、そしてこのようなより幅の広いフローチャネルを利用する適用の例としては、流体レザバおよびチャネル構造の混合が挙げられる。
これらのエラストマー層は、機械的安定性のために厚く鋳造され得る。例示的な実施形態では、図１のエラストマー層２２は、５０ミクロン〜数センチメートルの厚さであり、そしてより好ましくは約４ｍｍの厚さである。本発明の他の実施形態に従ったエラストマー層の厚さの範囲の非限定的リストは、約０．１ミクロン〜１０ｃｍ、１ミクロン〜５ｃｍ、１０ミクロン〜２ｃｍ、１００ミクロン〜１０ｍｍの間である。
従って、図７Ｂの、フローチャネル３０とフローチャネル３２とを分離する膜２５は、約０．０１ミクロンと約１０００ミクロンとの間、より好ましくは０．０５〜５００ミクロン、より好ましくは０．２〜２５０、より好ましくは１〜１００ミクロン、より好ましくは２〜５０ミクロン、そして最も好ましくは５〜４０ミクロンの間の代表的厚さを有する。その結果、エラストマー層２２の厚さは、エラストマー層２０の厚さの約１００倍である。例示的な膜の厚さとしては、以下が挙げられる：０．０１μｍ、０．０２μｍ、０．０３μｍ、０．０５μｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、５μｍ、７．５μｍ、１０μｍ、１２．５μｍ、１５μｍ、１７．５μｍ、２０μｍ、２２．５μｍ、２５μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、７５０μｍ、および１０００μｍ。
（３．ソフトリソグラフィー結合）
好ましくは、エラストマー層は、パターン形成エラストマー層を含むポリマーに固有である化学を用いて化学的に一緒に結合される。最も好ましくは、結合は、二成分「添加硬化（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｃｕｒｅ）」結合を含む。
好ましい局面では、エラストマーの種々の層は、層が異なる化学的性質を有する不均一結合で一緒に結合される。あるいは、全ての層が同じ化学的性質のものである均一結合が用いられ得る。第三に、それぞれのエラストマー層は、必要に応じて、その代わりに、接着剤によって一緒に貼り付けられ得る。第四の局面では、エラストマー層は、加熱によって一緒に結合される熱硬化性エラストマーであり得る。
均一結合の１つの局面では、エラストマー層は、同じエラストマー材料から構成され、１つの層における同じ化学実体は、他の層における同じ化学実体と反応して、これらの層を一緒に結合する。１つの実施形態では、同様のエラストマー層のポリマー鎖の間の結合は、光、熱または別個の化学種との化学反応に起因した架橋剤の活性化から生じ得る。
あるいは、不均質な局面では、エラストマー層は、異なるエラストマー材料から構成され、１つの層における第一の化学実体は、別の層における第二の化学実体と反応する。１つの例示的な不均一局面では、それぞれのエラストマー層を一緒に結合するために用いられる結合プロセスは、ＲＴＶ ６１５シリコーンの２つの層を一緒に結合することを含み得る。ＲＴＶ ６１５シリコーンは、二部添加硬化シリコーンゴムである。Ａ部は、ビニル基および触媒を含む；Ｂ部は、水素化ケイ素（Ｓｉ−Ｈ）基を含む。ＲＴＶ ６１５についての従来の比は、１０Ａ：１Ｂである。結合に関して、１つの層は、３０Ａ：１Ｂ（すなわち、過剰なビニル基）で作製され得、そして他方は、３Ａ：１Ｂ（すなわち、過剰なＳｉ−Ｈ基）で作製され得る。各層は、別々に硬化される。この２つの層を接触させて、高温で加熱した場合、これらは、不可逆的に結合して、モノリシックエラストマー基板を形成する。
本発明の例示的な局面では、Ｓｙｌｇａｒｄ １８２、１８４もしくは１８６、または脂肪族ウレタンジアクリレート（例えば、ＵＣＢ ＣｈｅｍｉｃａｌからのＥｂｅｃｒｙｌ ２７０またはＩｒｒ ２４５（しかしこれらに限定されない））を利用して、エラストマー構造が形成される。
本発明に従った１つの実施形態では、純粋なアクリレート化Ｕｒｅｔｈａｎｅ Ｅｂｅ
２７０から２層エラストマー構造を製造した。薄い下層を、８０００ｒｐｍで１５秒間、１７０℃で回転被覆した。上層および下層を、Ｅｌｅｃｔｒｏｌｉｔｅ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造されるＭｏｄｅｌ ＥＬＣ ５００デバイスを利用して、紫外光下で窒素下にて１０分間、最初に硬化させた。次いで、組立てられた層を、さらに３０分間かけて硬化させた。反応は、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓによって製造されたＩｒｇａｃｕｒｅ ５００の０．５％ ｖｏｌ／ｖｏｌ混合物によって触媒された。得られたエラストマー材料は、中程度の弾性およびガラスへの接着を示した。
本発明に従った別の実施形態では、２層エラストマー構造は、薄い下層については２５％ Ｅｂｅ ２７０／５０％ Ｉｒｒ２４５／２５％イソプロピルアルコール、そして上層としての純粋なアクリレート化Ｕｒｅｔｈａｎｅ Ｅｂｅ ２７０の組合せから製造された。薄い下層を、紫外光下で窒素下にて、Ｅｌｅｃｔｒｏｌｉｔｅ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造されるＭｏｄｅｌ ＥＬＣ ５００デバイスを利用して、最初に５分間かけて硬化させ、そして上層を最初に１０分間かけて硬化させた。次いで、組立てられた層を、さらに３０分間かけて硬化させた。反応は、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓによって製造されたＩｒｇａｃｕｒｅ ５００の０．５％ ｖｏｌ／ｖｏｌ混合物によって触媒された。得られたエラストマー材料は、中程度の弾性を示し、そしてガラスへ接着した。
あるいは、例えば、接触して配置した場合にエラストマー層／基板が結合するように、プラズマ曝露によってエラストマー表面を活性化することを含め、他の結合方法を用い得る。例えば、同じ材料から構成されるエラストマー層を一緒に結合するための１つの可能なアプローチは、本明細書中に参考として援用される、Ｄｕｆｆｙら，「Ｒａｐｉｄ Ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ Ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８），７０，４９７４−４９８４によって示される。この論文は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層を酸素プラズマに曝露することが、表面の酸化を引き起こし、２つの酸化層が接触するように配置された場合、不可逆的結合が生じると考察する。
エラストマーの連続層を一緒に結合するためのなお別のアプローチは、未硬化エラストマーの接着特性を利用することである。特に、未硬化のエラストマー（例えば、ＲＴＶ ６１５）の薄層は、第一の硬化エラストマー層の上部に適用される。次に、第二の硬化エラストマー層は、未硬化のエラストマー層の上部に配置される。次いで、未硬化のエラストマーの薄い中間層を硬化させて、モノリシックエラストマー構造が生成される。あるいは、未硬化のエラストマーは、第一の硬化エラストマー層の下に適用され得、第一の硬化エラストマー層は、第二の硬化エラストマー層の上に配置される。ここでも、中間の薄いエラストマー層を硬化させることは、モノリシックエラストマー構造の形成をもたらす。
犠牲層のカプセル化を用いて、エラストマー構造を製造する場合、連続エラストマー層の結合は、予め硬化されたエラストマー層およびその上にパターン形成された任意の犠牲材料上に未硬化のエラストマーを注ぐことによって達成され得る。エラストマー層間の結合は、未硬化のエラストマー層のポリマー鎖と硬化エラストマー層のポリマー鎖との相互浸透および反応に起因して生じる。エラストマー層のその後の硬化は、エラストマー層の間に結合を作製し、そしてモノリシックエラストマー構造を作製する。
図１〜図７Ｂの第一方法を言及して、第一エラストマー層２０は、微細製作された鋳型１２にＲＴＶ混合物を２０００ｒｐｍで３０秒間にわたって回転被覆して、約４０ミクロンの厚みを生じることによって作製され得る。第二エラストマー層２２は、微細製作された鋳型１１上にＲＴＶ混合物を回転被覆することによって作製され得る。層２０および層２２は両方とも、約８０℃で１．５時間かけて別々に焼かれ得るかまたは硬化され得る。第二エラストマー層２２は、第一エラストマー層２０上に約８０℃で約１．５時間かけて結合され得る。
微細加工鋳型１０および１２は、シリコンウェーハ上のパターン形成フォトレジストであり得る。例示的な局面では、Ｓｈｉｐｌｅｙ ＳＪＲ ５７４０フォトレジストを、２０００ｒｐｍで回転させ、マスクとして高解像度の透明フィルムを用いてパターン形成され、次いで現像されて、約１０ミクロンの高さの逆チャネルが得られた。約２００℃で約３０分間かけて焼かされた場合、フォトレジストは再度流動し、そして逆チャネルが丸くなる。好ましい局面では、鋳型は、シリコーンゴムの接着を防止するために、各使用の前にトリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）蒸気で約１分間かけて処理され得る。
（４．適切なエラストマー材料）
Ａｌｌｃｏｃｋら、Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版は、エラストマーを、それらのガラス転移温度と液化温度との間の温度で存在するポリマーとして一般的に記載する。エラストマー材料は、弾性特性を示す。なぜなら、ポリマー鎖は、力に応答して骨格鎖のほぐれを可能にするねじれ運動を容易に受け、この力の非存在下では骨格鎖は巻き戻されて以前の形状をとるからである。一般に、エラストマーは、力がかけられた場合に変形するが、次いで、その力が取り除かれたときはその元の形状に戻る。エラストマー材料によって示される弾性は、ヤング率によって特徴付けられ得る。約１Ｐａ〜１ＴＰａの間、より好ましくは約１０Ｐａ〜１００ＧＰａの間、より好ましくは約２０Ｐａ〜１ＧＰａの間、より好ましくは約５０Ｐａ〜１０ＭＰａの間、そしてより好ましくは約１００Ｐａ〜１ＭＰａの間のヤング率を有するエラストマー材料は、本発明に従って有用であるが、これらの範囲外のヤング率を有するエラストマー材料もまた、特定の適用の必要性に依存して利用され得る。
本発明のシステムは、広範な種々のエラストマーから製造され得る。例示的な局面では、エラストマー層は、好ましくはシリコーンゴムから製造され得る。しかし、他の適切なエラストマーもまた使用され得る。
本発明の例示的な局面では、本発明のシステムは、エラストマーポリマー（例えば、ＧＥ ＲＴＶ ６１５（調合物）（ビニルシラン架橋（型）シリコーンエラストマー（ファミリー））から製造される。しかし、本発明のシステムは、この１つの処方にも、型にも、このファミリーのポリマーにさえ制限されない；むしろ、ほぼ任意のエラストマーポリマーが適切である。本発明のミクロバルブの製造の好ましい方法についての重要な必要条件は、複数の層のエラストマーを一緒に結合する能力である。複数層ソフトリソグラフィーの場合、エラストマーの層を別々に硬化させ、次いで一緒に結合させる。このスキームは、硬化された層が、一緒に結合するに充分な反応性を有することを必要とする。いずれかの層は、同じ型のものであり得、そしてそれら自体を結合し得るか、または２つの異なる型のものであり得、そして互いに結合し得る。他の可能性としては、層の間での接着剤の使用および熱硬化性エラストマーの使用が挙げられる。
ポリマーの化学的性質、前駆体、合成方法、反応条件および潜在的添加剤の途方もなく大きな多様性を考慮すると、モノリシックエラストマーミクロバルブおよびポンプを作製するために用いられ得る、莫大な数の可能なエラストマーシステムが存在する。用いられる材料におけるバリエーションは、特定の材料の特性（すなわち、溶剤耐性、剛性、気体透過性または温度安定性）についての必要性によって支配される可能性が最も高い。
非常に多くの種類のエラストマーポリマーが存在する。比較的「標準的な」ポリマーを用いてさえ、結合についての多くの可能性が存在することを示すことを意図して、最も一般的なクラスのエラストマーの簡単な説明を本明細書中に提示する。一般的なエラストマーポリマーとしては、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロプレン、ポリイソブチレン、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、ポリウレタン、およびシリコーンが挙げられる。
（ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロプレン：）
ポリイソプレン、ポリブタジエン、およびポリクロロプレンは全て、ジエンモノマーから重合され、それゆえ、重合した場合に１つのモノマーあたり１つの二重結合を有する。この二重結合は、このポリマーが、加硫（本質的に、硫黄を用いて、加熱によって二重結合の間に架橋が形成される）によってエラストマーへと変換されるのを可能にする。これは、層の不完全な加硫によって均一な複数層ソフトリソグラフィーが結合されるのを容易に可能にする；フォトレジストカプセル化は、類似の機構によって可能である。
（ポリイソブチレン：）
純粋なポリイソブチレンは、二重結合を有さないが、エラストマーとして使用するために、少量（約１％）のイソプレンを重合時に含めることによって架橋される。イソプレンモノマーは、ポリイソブチレン骨格にペンダント二重結合を与え、次いで、これは、上記のとおりに加硫され得る。
（ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）：）
ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）は、活発（ｌｉｖｉｎｇ）アニオン重合（すなわち、反応中に天然の鎖終結工程は存在しない）によって生成され、それゆえ、「活発な」ポリマー末端が、硬化したポリマー中に存在し得る。これにより、このポリマーは、本発明のフォトレジストカプセル化システムについての天然の候補となり、ここで、硬化した層の上に注がれた液体層中に多数の未反応モノマーが存在する。不完全硬化は、均一な複数層ソフトリソグラフィー（ＡとＡとの結合）を可能にする。この化学的性質もまた、（不均質な複数層ソフトリソグラフィーについては）過剰なブタジエンおよびカップリング剤を有する１つの層（「Ａ」）およびブタジエン不足を有する他の層（「Ｂ」）が作製されるのを容易にする。ＳＢＳは、「熱硬化性エラストマー」であり、特定の温度より上では、これが溶けて（弾性とは対照的に）可塑性になり；温度を下げると、このエラストマーが再度得られることを意味する。従って、層は、加熱によって一緒に結合され得る。
（ポリウレタン）
ポリウレタンは、ジ−イソシアネート（ｄｉ−ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ）（Ａ−Ａ）およびジ−アルコール（ｄｉ−ａｌｃｏｈｏｌｓ）またはジ−アミン（ｄｉ−ａｍｉｎｅｓ）（Ｂ−Ｂ）から生成される；非常に種々のジ−イソシアネートおよびジ−アルコール／アミンが存在するため、異なるタイプのポリウレタンの数は膨大である。しかし、ポリマーのＡ対Ｂの性質により、このポリウレタンは、ちょうどＲＴＶ ６１５のように、一方の層において過剰のＡ−Ａを、そして他方の層において過剰のＢ−Ｂを使用することにより、不均一多層軟質リゾグラフィーについて有用になる。
（シリコーン）
シリコーンポリマーは、おそらく、最も多くの構造多様性を有し、そしてほとんどが必ず、最多数の市販の処方物を有する。ビニル−（Ｓｉ−Ｈ）架橋のＲＴＶ ６１５（これは不均一多層軟質リゾグラフィーおよびフォトレジストカプセル化の両方を可能にする）は、すでに議論されているが、これは、シリコーンポリマー化学において使用されるいくつかの架橋方法のうちのわずか１つである。
（５．デバイスの操作）
図７Ｂおよび７Ｈは、共に、第２のフローチャネルを加圧することにより第１のフローチャネルを閉じることを示し、図７Ｂ（対応する図７Ａにおけるフローチャネル３２を通して切られた前断面図）は、開いている第１のフローチャネル３０を示し、図７Ｈは、第２のフローチャネル３２を加圧することにより閉じられた第１のフローチャネル３０を示す。
図７Ｂを参照すると、第１のフローチャネル３０および第２のフローチャネル３２が示される。膜２５は、フローチャネルを分離し、第１のフローチャネル３０の上部および第２のフローチャネル３２の底部を形成する。見られ得るように、フローチャネル３０は、「開いて」いる。
図７Ｈにおいて見られ得るように、フローチャネル３２の加圧（その中に導入された気体または液体のいずれかによって）は、膜２５を下向に反らせ、それによりフローチャネル３０を通過する流れＦを締める。従って、チャネル３２内の圧力を変更することにより、直線的に作動可能なバルブシステムが提供され、その結果、フローチャネル３０は、膜２５を必要に応じて動かすことにより、開閉され得る。（例示目的のみのために、図７Ｇのチャネル３０は、「完全に閉じられた」位置ではなく「ほとんど閉じられた」位置で示される。）
このようなバルブは、チャネル自体のルーフを移動（すなわち、膜２５を移動）させることにより作動されるので、この技術により製造されるバルブおよびポンプは、正確にゼロの死容積を有し、そしてこの技術により作製される切り換えバルブは、バルブの有効容積にほぼ等しい死容積（例えば、約１００×１００×１０μｍ＝１００ｐＬ）を有する。膜を移動することにより消費されるこのような死容積および面積は、公知の従来のマイクロバルブよりも約２オーダー小さい。より小さいバルブおよび切り換えバルブならびにより大きいバルブおよび切り換えバルブが、本発明において意図され、そして死容積の範囲の非限定的な列挙としては、１ａＬ〜１μＬ、１００ａＬ〜１００ｎＬ、１ｆＬ〜１０ｎＬ、１００ｆＬ〜１ｎＬ、および１ｐＬ〜１００ｐＬが挙げられる。
本発明に従うポンプおよびバルブにより送達され得る非常に小さい容積は、実質的な利点を示す。詳細には、手動で測定可能な流体の最小の既知の容積は、約０．１μｌである。自動化システムにより測定可能な最小の既知の容積は、約１０倍大きい（１μｌ）。本発明に従うポンプおよびバルブを使用すると、１０ｎｌ以下の液体の容積が、慣用的に測定され得、そして分配され得る。本発明により可能にされる非常に小さい容積の流体の正確な測定は、多数の生物学的用途（診断試験およびアッセイを含む）において非常に価値がある。
式１は、均一な厚みを有する矩形で線形の弾性の等方性のプレートの、適用された圧力による変形の非常に単純化された数学的モデルを表す：
（１）ｗ＝（ＢＰｂ４）／（Ｅｈ３）
ここで、
ｗ＝プレートの変形；
Ｂ＝形状係数（長さ対幅、およびプレートの縁部の支持に依存する）；
Ｐ＝適用される圧力；
ｂ＝プレートの幅
Ｅ＝ヤング率；および
ｈ＝プレートの厚み。
従って、この非常に単純化された式においてでさえ、圧力に応答するエラストマー膜の変形は、以下の関数である：この膜の長さ、幅および厚み、この膜の可撓性（ヤング率）、ならびに適用される作動力。これらのパラメーターの各々は、本発明に従う特定のエラストマーデバイスの実施の寸法および物理的組成に依存して大きく異なるので、広範な膜の厚みおよび弾性、チャネル幅、および作動力が、本発明によって意図される。
一般的に、膜は均一な厚みを有さず、膜厚は長さおよび幅と比較して小さい必要はなく、そして変形は、この膜の長さ、幅または厚みと比較して小さい必要はないので、すぐ上で示された式は近似に過ぎないことが理解されるべきである。それにもかかわらず、この式は、変形 対 適用される力の所望の応答を達成するために有用なパラメーターを調整するための有用なガイドとしてはたらく。
図８Ａおよび８Ｂは、１００μｍ幅の第１のフローチャネル３０、および５０μｍ幅の第２のフローチャネル３２についてのバルブ開口 対 適用される圧力を例示する。このデバイスの膜を、約３０μｍの厚みおよび約７５０ｋＰａのヤング率を有するＧｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ ＲＴＶ ６１５の層により形成した。図２１ａおよび２１ｂは、バルブの開口の程度が適用される圧力の範囲のほとんどにわたって実質的に直線的であることを示す。
空気圧を、外径０．０２５インチおよび内径０．０１３インチのステンレス鋼皮下チューブの２５ｍｍの部品に取り付けられた外径０．０２５インチを有するプラスチックチューブの１０ｃｍ長の部品を通して、このデバイスの膜に適用した。このチューブを、制御チャネルに対して垂直な方向で、エラストマーブロックに挿入することによって、この制御チャネルと接触させた。空気圧を、Ｌｅｅ Ｃｏ．製の外部ＬＨＤＡ小型ソレノイドバルブから皮下チューブに適用した。
デバイスを通る材料の流れの制御は、従来、適用される気体圧を使用することが記載されているが、他の流体は使用できなかった。
例えば、空気は、圧縮可能であり、従って、外部ソレノイドバルブによる圧力の適用の時間とこの圧力が膜により経験される時間との間にある程度の有限の遅れを被る。本発明の代替の実施形態において、圧力は、外部供給源から非圧縮可能流体（例えば、水または水硬性油）に適用され得、その結果、膜に適用された圧力のほぼ即時の伝達が生じる。しかし、バルブの移動流体が大きいかまたは制御チャネルが狭い場合、より高い粘度の制御流体が、作動の遅延に寄与し得る。従って、圧力を伝達するために最適な媒体は、特定の用途およびデバイスの構成に依存し、そして気体媒体および液体媒体の両方が、本発明により意図される。
上記のような外部適用圧力は、圧力調整器および外部小型バルブを介してポンプ／タンクシステムにより適用されるが、外部圧力を適用する他の方法（ガスタンク、圧縮機、ピストンシステムおよび液体のカラム）もまた本発明において意図される。例えば、生きた生物内に見出されるような天然に存在する圧力供給源（例えば、血圧、胃圧、能脊髄液に存在する圧力、眼内空間に存在する圧力、および通常の湾曲の間の筋肉により及ぼされる圧力）の使用もまた、意図される。外部圧力を調節する他の方法（例えば、小型バルブ、ポンプ、巨視的蠕動ポンプ、ピンチバルブおよび当該分野で公知の他のタイプの流体調節機器）の使用もまた意図される。
見られ得るように、本発明の実施形態に従うバルブの応答は、最小のヒステリシスで、その移動範囲の大部分にわたってほとんど完全な線形であることが実験的に示されている。従って、本発明のバルブは、ミクロ流体測定および流体制御のために理想的に適している。バルブ応答の線形性は、個々のバルブが、フックの法則のバネとして十分にモデリングされていることを示す。さらに、フローチャネル内の高圧（すなわち、背圧）は、単に作動圧力を増加することによって打ち勝たれ（ｃｏｕｎｔｅｒｅｄ）得る。実験的に、本発明者らは、７０ｋＰａの背圧でバルブの閉鎖を達成したが、より高い圧力もまた意図される。以下は、本発明により包含される圧力範囲の非排他的な列挙である：１０Ｐａ〜２５ＭＰａ；１００Ｐａ〜１０ＭＰａ、１ｋＰａ〜１ＭＰａ、１ｋＰａ〜３００ｋＰａ、５ｋＰａ〜２００ｋＰａ、および１５ｋＰａ〜１００ｋＰａ。
バルブおよびポンプは、開閉するために線形作動を必要としないが、線形応答により、バルブは、測定デバイスとしてより容易に使用され得る。本発明の一実施形態において、バルブの開放は、公知の閉鎖の程度まで部分的に作動されることによって、流速を制御するために使用される。線形バルブ作動により、バルブを所望の閉鎖の程度まで閉じるのに必要な作動力の量を決定することが容易になる。線形作動の別の利点は、バルブの作動に必要な力が、フローチャネル内の圧力から容易に決定され得ることである。作動が線形である場合、フローチャネル内の圧力の増加は、同じ圧力（単位面積あたりの力）をバルブの作動部分に加えることにより、打ち勝たれ得る。
バルブの線形性は、構造、組成およびバルブ構造の作動方法に依存する。さらに、線形性がバルブにおける所望の特徴であるか否かは、用途に依存する。従って、線形および非線形の作動可能バルブが、本発明において意図され、そしてバルブが線形作動可能である圧力範囲は、特定の実施形態に伴って変化する。
図９は、上記のように、チップから空気圧式バルブに接続された１０ｃｍ長の空気チューブを有する１００μｍ×１００μｍ×１０μｍのＲＴＶマイクロバルブの時間応答（すなわち、適用される圧力の変化に応答する時間の関数としてのバルブの閉鎖）を例示する。
デジタル制御シグナルの２つの期間、チューブの末端における実際の空気圧およびバルブの開口が、図９に示される。制御ラインに適用される圧力は、１００ｋＰａであり、これは、バルブを閉鎖するのに必要な約４０ｋＰａよりも実質的に高い。従って、閉鎖する場合、バルブは、必要な圧力よりも６０ｋＰａ高い圧力で、押し閉じられる。しかし、開く場合、バルブは、そのバネ直（４０ｋＰａ以下）によりその静止位置まで戻される。従って、τｃｌｏｓｅは、τｏｐｅｎよりも小さいことが予想される。圧力を制御するために使用される小型バルブの制限に起因して、制御シグナルと制御圧力応答との間のずれもまた存在する。このようなずれをｔ、１／ｅ時間定数をτと呼ぶと、値は、ｔｏｐｅｎ＝３．６３ｍｓ、τｏｐｅｎ＝１．８８ｍｓ、ｔｃｌｏｓｅ＝２．１５ｍｓ、τｃｌｏｓｅ＝０．５１ｍｓである。３つのτの各々が、開閉を可能にする場合、このバルブは、水溶液で満たされた場合、７５Ｈｚにおいて最適に作動する。
開口および閉鎖のずれを受けなかった別の作動方法を使用する場合、このバルブは、約３７５Ｈｚで作動する。膜厚を変えることによってバネ定数が調節され得ることもまた注意のこと。これは、速い開口および速い閉鎖の最適化を可能にする。バネ定数はまた、膜にドーパントを導入することによってまたは膜として働く異なるエラストマー材料を使用することによって（図７Ｃ〜７Ｈと共に上で示される）とおそらく同様に、膜の弾性（ヤング率）を変えることによって調節され得る。
図９に例示されるように、バルブ特性を実験的に測定する場合、バルブの開口を蛍光によって測定した。この実験において、フローチャネルを、緩衝液（ｐＨ≧８）中のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の溶液で満たし、そして、チャネルの中心の約３分の１を占めるある平方面積の蛍光を、１０ｋＨｚのバンド幅を有する光電子増倍管を備えるエピ蛍光顕微鏡でモニタリングする。この圧力を、ほとんど同じ空気圧式接続を介する制御ラインと同時に加圧される、Ｗｈｅａｔｓｔｏｎｅ−ｂｒｉｄｇｅ圧力センサ（ＳｅｎＳｙｍＳＣＣ１５ＧＤ２）を用いてモニタリングした。
（６．フローチャネルの断面）
本発明のフローチャネルは、必要に応じて、異なる断面サイズおよび形状で設計され得、それらの所望の用途に依存して、異なる利点を与える。例えば、下部フローチャネルの断面形状は、その長さ全体に沿ってかまたは上部交差チャネルの下に配置される領域中に湾曲上部表面を有し得る。このような湾曲上部表面は、以下のように、バルブのシーリングを容易にする。
図１０を参照すると、フローチャネル３０および３２を通る断面図（図７Ｂの断面図と類似）が示される。見られ得るように、フローチャネル３０は、矩形の断面形状である。本発明の代替の好ましい局面において、図１０に示されるように、フローチャネル３０の断面は、上部湾曲表面を有する。
最初に図１０を参照すると、フローチャネル３２が加圧される場合、フローチャネル３０および３２を分離しているエラストマーブロック２４の膜部分２５は、破線２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ、２５Ｄおよび２５Ｅにより示される連続的な部分に向かって下向きに動く。見られ得るように、おそらく、不完全なシーリングが、平面基材１４に隣接するフローチャネル３０の縁部において生じ得る。
図１１の代替の好ましい実施形態において、フローチャネル３０ａは、湾曲上部壁２５Ａを有する。フローチャネル３２が加圧される場合、膜部分２５は、破線２５Ａ２、２５Ａ３、２５Ａ４および２５Ａ５により示される連続した位置まで下向きに動き、膜の縁部分は、最初にフローチャネルに向かって動き、次いで、上部膜部分に向かって動く。このような湾曲上部表面を膜２５Ａにおいて有することの利点は、より完全なシールが、フローチャネル３２が加圧される場合に提供されることである。詳細には、フローチャネル３０の上部壁は、平面基材１４に対して連続的に接触する縁部を提供し、それにより、壁２５と図１０に示されるフローチャネル３０の底部との間に見られる接触の「島（ｉｓｌａｎｄ）」を回避する。
湾曲上部フローチャネル表面を膜２５Ａにおいて有することの別の利点は、この膜が、作動に応答して、フローチャネルの形状および容積により容易に適合し得ることである。詳細には、矩形のフローチャネルが用いられる場合、全周囲（２×フローチャネルの高さ＋フローチャネルの幅）が、このフローチャネルに押しつけられなければならない。しかし、アーチ形のフローチャネルが使用される場合、材料のより小さい周囲（半円のアーチ形部分のみ）が、このチャネルに押しつけられなければならない。このように、膜は、作動のために周囲の小さい変化しか必要とせず、従って、フローチャネルをブロックするために適用される作動力により応答性である。
代替の局面（図示せず）、フローチャネル３０の底部は丸く、その結果、この湾曲した表面は、上記の図２０において見られるように、湾曲上部壁２５Ａと一致する。
まとめると、作動時に膜により受ける実際の構造変化は、特定のエラストマー構造の構成に依存する。詳細には、この構造変化は、膜の長さ、幅および厚みのプロフィール、その残りの構造への付着、フローチャネルおよび制御チャネルの高さ、幅および形状、ならびに使用されるエラストマーの材料特性に依存する。この構造変化はまた、適用される圧力に応答する膜の作動が、磁力または静電力に応答する作動とは幾分か異なる場合に、作動方法に依存する。
さらに、膜における所望の構造変化はまた、エラストマー構造についての特定の用途に依存して変わる。上記の最も単純な実施形態において、バルブは、バルブの閉鎖の程度を制御するために、測定しながら開かれるかまたは閉じられるかのいずれかであり得る。しかし、他の実施形態において、より複雑な流れの調節を達成するために、膜および／またはフローチャネルの形状を変更することが望まれ得る。例えば、このフローチャネルに、膜部分の下の隆起した突出部が設けられ得、その結果、作動時において、この膜は、フローチャネルを通る流れのある割合のみを遮断し、適用された作動力に非感受性の流れの割合がブロックされる。
多くの膜圧プロフィールおよびフローチャネルの断面（矩形、台形、円形、楕円形、放物線形、双曲線形および多角形、ならびに上記の形状の部分を含む）が、本発明によって意図される。より複雑な断面形状（例えば、すぐ上で議論された突出物を有する実施形態
またはフローチャネル中に凹部を有する実施形態）もまた、本発明により意図される。
さらに、本発明は、フローチャネルの壁部および天井部がエラストマーから形成され、そしてこのチャネルの床部が下にある基材から形成されている実施形態と共に、主に上で記載されているが、本発明は、この特定の配向に限定されない。チャネルの壁部および床部はまた、下にある基材中に形成され得、フローチャネルの天井部のみがエラストマーから構築される。このエラストマーフローチャネルの天井部は、適用される作動力に応答して、チャネルに向かって下向きに突出し、それにより、このフローチャネルを通る材料の流れを制御する。一般に、本願の他の場所で記載されるようなモノリシックエラストマー構造は、ミクロ流体用途に好ましい。しかし、このような配置が利点を提供する場合、基材中に形成されたチャネルを用いることが有用であり得る。例えば、光導波管を備える基材が構築され、その結果、この光導波管は、光を、特にミクロ流体チャネルの側面に方向付ける。
（７．相互接続システム）
図１２Ａおよび１２Ｂは、上記のシステム（例えば、図７Ａにおけるシステム）と同一の、単一オン／オフバルブの図を示す。図１３Ａおよび１３Ｂは、図１２において見られるように、複数の単一アドレス可能オン／オフバルブから構成されるが、一緒に相互接続された蠕動ポンプシステムを示す。図１４は、図１３の蠕動ポンプシステムについての実験的に達成されるポンプ速度 対 振動数を示すグラフである。図１５Ａはおよび１５Ｂは、単一制御ラインにより制御可能な複数のフローチャネルの概略図を示す。このシステムはまた、一緒に多重化された図１２の複数の単一アドレス可能オン／オフバルブから構成されるが、図１２のシステムとは異なる配置である。図１６は、選択したチャネルを通る流体の流れを可能にするよう適合された多重化システムの概略図であり、これは、一緒に連結または相互接続された、図１２の複数の単一オン／オフバルブから構成される。
図１２Ａおよび１２Ｂを初めに参照すると、フローチャネル３０および３２の概略が示される。フローチャネル３０は、好ましくは、これを通る流体（または気体）の流れＦを有する。フローチャネル３２（これは、本明細書中ですでに説明されたように、フローチャネル３０の上を横切る）は、加圧され、その結果、このフローチャネルを分離する膜２５は、説明されたように、フローチャネル３０の通路に押し下げられ得、そこを通る流れＦの通路を遮断する。このように、「フローチャネル」３２はまた、「制御ライン」とも呼ばれ得、これは、フローチャネル３０中の単一バルブを作動する。図１２〜１５において、複数のこのようなアドレス可能バルブが、種々の配置で一緒に連結または相互接続されて、蠕動ポンピング可能なポンプ、および他の流体理論的適用を生成する。
図１３Ａおよび１３Ｂを参照すると、蠕動ポンピングのためのシステムが、以下のように提供される。フローチャネル３０は、その上を通過する複数のほぼ平行なフローチャネル（すなわち、制御ライン）３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃを有する。制御ライン３２Ａを加圧することによって、フローチャネル３０を通る流れＦは、制御ライン３２Ａおよびフローチャネル３０の交差部において、膜２５Ａの下で遮断される。同様に、（図示しないが）制御ライン３２Ｂを加圧することによって、フローチャネル３０を通る流れＦは、制御ライン３２Ｂおよびフローチャネル３０の交差部において膜２５Ｂの下で遮断される。以下同様である。
各制御ライン３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃは個別にアドレス可能である。従って、蠕動は、３２Ａおよび３２Ｃを一緒に作動させる様式によって作動され得、３２Ａによって作動され、３２Ａおよび３２Ｂによって一緒に作動され、３２Ｂによって作動され、３２ＢおよびＣによって一緒に作動される、などがある。このことは、継続的な「１０１、１００、１１０、０１０、０１１、００１」の様式に一致し、この場合、「０」は「バルブ開」を示し、そして「１」は「バルブ閉」を示す。この蠕動様式はまた、１２０°様式として知られる（３つのバルブ間の作動のフェーズ角度に関連している）。他の蠕動様式は等価的に可能であり、６０°および９０°の様式を含む。
本発明者らによって実施された実験において、２．３５ｎＬ／ｓのポンプ速度は、作動圧力４０ｋＰａの下で１００×１００×１０μｍのバルブを有する細管（内径０．５ｍｍ）中の１カラムの水が移動する距離を測定することによって、測定される。このポンプ速度は、約７５Ｈｚまでの作動周波数に伴って増加し、それから約２００Ｈｚ以上までほぼ一定であった。バルブおよびポンプはまた、かなり耐久性があり、そしてエラストマー膜も制御チャンネルもボンドも、全く破損が観察されなかった。本発明者らによって実施された実験において、本明細書中に記載される蠕動ポンプの全てのバルブは、４００万回以上の作動後に摩耗の徴候も消耗の徴候も全く示さない。これらの耐久性に加えて、これらはまた軟質性でもある。チャンネルを通って汲み出され、そして生存率が試験されたＥ．ｃｏｌｉ溶液は、９４％の生存率を示した。
図１４は、図１３の蠕動ポンプシステムについて、実験的に達成された蠕動速度 対 蠕動周波数を示すグラフである。
図１５Ａおよび図１５Ｂは、図１２のアドレス可能な複数のバルブの、別の組み立て方法を図示する。具体的には、複数の並行なフローチャンネル３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃが提供される。フローチャンネル（すなわち、制御ライン）３２は、フローチャンネル３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃを横断して通じる。制御ライン３２の加圧は、制御ライン３２ならびにフローチャンネル３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃの交差部分に位置する膜２５Ａ、２５Ｂおよび２５Ｃを押し下げることによって、フローＦ１、Ｆ２およびＦ３を同時に閉じる。
図１６は、以下のように、流体が選択されたチャンネルを通って選択的に流れ得るように適合された、多重化システムの模式図である。膜（例えば、図１５Ａおよび図１５Ｂ中の膜２５Ａ、２５Ｂおよび２５Ｃ）上を通過する制御ラインからそれぞれのフローチャンネルを分ける膜の下向きの偏向は、膜の大きさに強く依存する。従って、図１５Ａおよび１５Ｂ中のフローチャンネル制御ライン３２の幅を変化することによって、制御ラインを複数のフローチャンネルを越えて通過させ得、さらに所望のフローチャンネルのみを作動（すなわち、遮断）させ得る。図１６は、以下の通り、このようなシステムの概略図を示す。
複数の並行フローチャンネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅおよび３０Ｆは、複数の並行制御ライン３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄ、３２Ｅおよび３２Ｆの下に配置される。コントロールチャンネル３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄ、３２Ｅおよび３２Ｆは、上記の任意のバルブシステムを使用して、以下の変形を備える、並行フローチャンネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅおよび３０Ｆを通過する流体フローＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５およびＦ６を遮断するように適合される。
各制御ライン３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄ、３２Ｅおよび３２Ｆは、幅広部分および狭部分の両方を有する。例えば、制御ライン３２Ａは、フローチャンネル３０Ａ、３０Ｃおよび３０Ｅの上方に配置される位置で広がる。同様に、制御ライン３２Ｂは、フローチャンネル３０Ｂ、３０Ｄおよび３０Ｆの上方に配置される位置で広がり、そして制御ライン３２Ｃは、フローチャンネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｅおよび３０Ｆの上方に配置される位置で広がる。
それぞれの制御ラインが広がる位置において、その制御ラインの加圧はフローチャンネルと制御ラインとを分ける膜（２５）がフローチャンネル内へと有意に押し下げさせて、これによってその場所を通るフローの通過を妨げる。対照的に、それぞれの制御ラインが狭い位置において、膜（２５）もまた狭い。従って、同程度の加圧では、膜（２５）がフローチャンネル（３０）内へ押し下がることを生じない。従って、流体のその場所の通過は、妨げられない。
例えば、制御ライン３２Ａが加圧される場合、これはフローチャンネル３０Ａ、３０Ｃおよび３０Ｅの中のフローＦ１、Ｆ３およびＦ５を妨げる。同様に、制御ライン３２Ｃが加圧される場合、これはフローチャンネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｅおよび３０Ｆの中のフローＦ１、Ｆ２、Ｆ５およびＦ６を妨げる。理解され得るように、１本より多い制御ラインは同時に作動され得る。例えば、制御ライン３２Ａおよび３２Ｃは加圧されて、Ｆ４を除く全ての流体フローを同時に妨げる（３２ＡがＦ１、Ｆ３およびＦ５を妨げ、そして３２ＣがＦ１、Ｆ２、Ｆ５およびＦ６を妨げる）。
異なる制御ライン（３２）を、一緒に、そして様々な順序の両方で選択的に加圧することによって、大規模（ｄｅｇｒｅｅ）な流体フローコントロールを達成し得る。さらに、本システムを６より多い並行フローチャンネル（３０）および４より多い並行フローチャンネル（３２）に拡張することによって、そして制御ラインの幅広領域および狭領域の位置を変化させることによって、非常に複雑な流体フローコントロールシステムを組み立て得る。このようなシステムの特徴は、２（ｌｏｇ２ｎ）本のみの制御ラインを有するｎ本のフローチャンネルのうちの任意の１つのフローチャンネルを作動させることが可能であることである。
（８．切り換え可能なフローアレイ）
なお別の新規な実施形態において、流体の通行は２つの直交方向のどちらか一方に流れるように選択的に導かれ得る。このような「切り換え可能なフローアレイ」システムの例を、図２０Ａ〜２０Ｄに提供する。図２０Ａは、固体支柱９２のアレイ（各支柱はその周りにフローチャンネルを通過させる）によって規定されるフローチャンネルグリッドを形成するレセスの様式で底部表面を有する、エラストマー９０（または任意の他の適切な基材）の第１層の底面図を示す。
好ましい局面において、エラストマーのさらなる層を、層９０の表面上に結合して、その結果、流体フローが方向Ｆ１または直行方向Ｆ２のどちらかに移動するよう選択的に導かれ得る。図２０は、エラストマー９５の第２層の底部表面の底面図であり、交互性の「垂直」制御ライン９６および「水平」制御ライン９４の形に形成されたレセスを示す。「垂直」制御ライン９６は、エラストマー層に沿って同じ幅を有するが、一方で「水平」制御ライン９４は、示されるように、交互性の幅広部分および狭部分を有する。
エラストマー層９５は、エラストマー層９０の上方に位置し、その結果、「垂直」制御ライン９６は図２０Ｃ中に示されるように支柱９２の上方に配置され、そして「水平」制御ライン９４は、図２０Ｄ中に示されるように、支柱９２の間に幅広部分を用いて配置される。
図２０Ｃ中に示されるように、「垂直」制御ライン９６が加圧される場合、領域９８において層９０と９５との間に初期配置されるエラストマー層によって形成される統合構造体の膜は、フローチャンネルのアレイの上方で、下方向に歪められ、その結果、示されるように、流入フロー（ｆｌｏｗ ｉｎ）はフロー方向Ｆ２（すなわち、垂直方向）でのみ通過し得る。
図２０Ｄ中に見られ得るように、「水平」制御ライン９４が加圧される場合、領域９９において層９０と９５との間に初期配置されるエラストマー層によって形成される統合構造体の膜は、フローチャンネルのアレイの上方で（しかし、それらが最も幅広い領域でのみ）、下方向に歪められ、その結果、示されるように、流入フローはフロー方向Ｆ１（すなわち、水平方向）でのみ通過し得る。
図２０Ａ〜Ｄ中に示される設計によって、切り換え可能なフローアレイが、異なるエラストマー層において制御ライン間に通じる垂直の偏向（ｖｉａｓ）を全く必要とせずに、２つのみのエラストマー層から構築され得る。全ての垂直フロー制御ライン９４が接続される場合、これらのラインは１つの入力から加圧され得る。すべての水平フロー制御ライン９６についても、同じことが成立する。
（９．セルペン／セルケージ）
本発明のなおさらなる適用において、エラストマー構造体を利用して、生物体または他の生物学的な材料を操作し得る。図２６Ａ〜２６Ｄは、本発明に従うセルペン構造体の１つの実施形態の平面図を示す。
セルペンアレイ（ｃｅｌｌ ｐｅｎ ａｒｒａｙ）４４００は、直交に配向されたフローチャネル４４０２のアレイを特徴とし、交互したフローチャネルの交差点にて、細長「ペン」構造４４０４を有する。バルブ４４０６が、各ペン構造４４０４の入口および出口に配置される。蠕動ポンプ構造４４０８が、各水平フローチャネルおよびセルペン構造を欠く垂直フローチャネル上に配置される。
図２６Ａのセルペンアレイ４４００は、先に区別したセルＡ〜Ｈを装填している。図２６Ｂ〜２６Ｃは、個々に貯蔵されたセルＣの、以下の１）〜３）によるアクセスおよび除去を示す：１）隣接したペン４４０４ａおよび４４０４ｂのいずれかの側へバルブ４４０６を操作する、２）水平フローチャネル４４０２ａをポンピングして、セルＣとＧとを置換する、次いで、３）垂直フローチャネル４４０２ｂをポンピングして、セルＣを除去する。図２６Ｄは、水平フローチャネル４４０２ａを通る液体の流れの方向を反転させることによって、第二セルＧがセルペンアレイ４４００の以前の位置に戻ることを示している。
上記のセルペンアレイ４４０４は、アクセスできるような、選択されたアドレス可能な位置内で材料を貯蔵し得る。しかしながら、細胞のような生存生体は、生存可能なままでいるために、食物の連続的な取り込みおよび廃棄物の排出を必要とし得る。従って、図２７Ａおよび２７Ｂは、本発明に従うセルケージ構造の１つの実施形態の、それぞれ平面図および（線４５Ｂ−４５Ｂ’に沿った）断面図を示す。
セルケージ４５００は、基材４５０５と接触して、エラストマーブロック４５０３内でフローチャネル４５０１の細長部分４５００ａとして形成される。セルケージ４５００は、セルケージ４５００の端部４５００ｂおよび４５００ｃが内部領域４５００ａを完全には閉鎖していないことを除いては、図２６Ａ〜２６Ｄにおいて上記のような個々のセルペンと類似している。むしろ、ケージ４５００の端部４５００ａおよび４５００ｂは、格納可能な複数のピラー４５０２により形成されている。ピラー４５０２は、図２１Ａ〜２１Ｊとともに広範に上記したように、通常は閉鎖されたバルブ構造の膜構造体の一部であり得る。
詳細には、コントロールチャネル４５０４が、ピラー４５０２を覆っている。コントロールチャネル４５０４の圧力が減少された場合、エラストマーピラー４５０２は、コントロールチャネル４５０４内に上向きに引き込まれ、それによって、セルケージ４５００の端４５００ｂが開き、細胞が侵入するのを可能にする。コントロールチャネル４５０４の圧力が上昇した場合、ピラー４５０２は、基材４５０５に対して下向きに緩み、細胞がケージ４５００から出るのを防止する。
エラストマーピラー４５０２は、ケージ４５００から細胞が移動するのを防止するのに十分な大きさおよび数のものであるが、貯蔵される細胞を維持するためにケージ内部４５００ａ内への栄養素の流動を可能にするギャップ４５０８もまた備える。対向する端部４５００ｃ上のピラー４５０２は、第二のコーティングチャネル４５０６の下に同様に配置され、ケージの開口および所望の細胞の取り出しを可能にする。
図２６Ａ〜２６Ｄに示される、例示される直交流チャネルアーキテクチャを使用して、まさに記載されるセルペン以外の機能を達成し得る。例えば、この直交硫チャネルアーキテクチャは、混合適用の際に利用される。
これは、図２８Ａ〜Ｂに示されており、この図は、本発明の別の実施形態に従う微細製作（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）構造によって達成される混合工程の平面図を示す。詳細には、微細製作混合構造の一部７４００は、第二フローチャネル７４０４と直交しかつこのチャネルと交差した、第一フローチャネル７４０２を備える。コントロールチャネル７４０６が、フローチャネル７４０２および７４０４を覆い、そして各交差点７４１２を取り囲むバルブ対７４０８ａ〜ｂおよび７４０８ｃ〜ｄを形成する。
図２８Ａに示されるように、バルブ対７４０８ｃ〜ｄをはじめに開放し、他方バブル対７４０８ａ〜ｂを閉めると、流体サンプル７４１０は、フローチャネル７４０４を通って交差点７４１２に流れる。次いで、バルブ対７４０８ａ〜ｂを作動させ、交差点７４１２にて流体サンプル７４１０を捕捉する。
次に、図２８Ｂに示されるように、バルブ対７４０８ｃ〜ｄを閉じ、７４０８ａ〜ｂおよびを開くと、その結果、流体サンプル７４１０は、交差点７４１２から、流体の直交流を運搬する流体チャネル７４０２内に注入される。図２８Ａ〜Ｂに示されるプロセスは、任意の数の流体サンプルを直交流チャネル７４０２に正確に分配するように繰り返され得る。
図２８Ａ〜２８Ｂに示されるプロセスチャネルフロー注入構造体（ｐｒｏｃｅｓｓ−ｃｈａｎｎｅｌ ｆｌｏｗ ｉｎｊｅｃｔｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の実施形態には、単一のジャンクションで交差するチャネルを特徴付けるが、これは、本発明によって必須ではない。したがって、図２８Ｃは、本発明に従った注入構造体の別の実施形態の簡略化した平面図を示し、ここで、交差フローチャネル７４５２の間のジャンクション７４５０は、さらなる体積容量を提供することが当然のこととして期待される。図２８Ｄは、本発明に従う注入構造体の更なる実施形態の簡略化した平面図を示し、ここで、交差フローチャネル７４６２の間の細長ジャンクションは、さらに多くの体積容量を提供する。
図２８Ａ〜２８Ｄに接続した上で示したかまたは記載された実施形態が、そのフローチャネル交差の反対側において連結されたバルブを利用するが、これは、本発明にとって必須ではない。他の配置（交差点の隣接したバルブの連結法、または交差点の周囲のバルブの各々の独立した作動法を含む）が、その所望するフロー特徴を提供するために可能である。しかし、その独立バルブの作動アプローチを用いる場合、別個の制御構造体が、各々のバルブについて用いられるので、デバイスレイアウトが複雑化することが認識されるべきである。
図５０は、本発明に従った交差フロー注入システムの１つの実施形態にとって注入されたスラグ数に対するＬｏｇ（Ｒ／Ｂ）をプロットする。流体抵抗のようなプロセスパラメ
ータからの、交差フロー注入による合流の再現性および相対的独立性は、図５１によってさらに明示される。この図５１は、種々の流体条件の下での交差チャネルフロー注入の関する注入周期の数に対して注入体積をプロットする。交差フロー注入技術によって計量供給された体積は、注入周期の連続に亘って線形基底に基づいて増加することを示している。体積と注入周期の数との間の線形関係は、流体粘度の上昇（２５％グリセロールの添加によって与えられる）およびフローチャネルの長さ（１．０〜２．５ｃｍ）のような流体抵抗パラメータから相対的に独立している。
（１０．回転混合構造体）
本発明の実施形態に従ったミクロ流体制御およびフローチャネルは、閉回路フローチャネルに流体を循環させる回転ポンプデザインに関し得る。本明細書中で使用される場合、用語「閉回路」とは、当該分野で公知である意味を有し、そして、この用語は、円形である配置および長円体および楕円体のようなそれらのバリエーション、ならびに三角形、長方形またはそれらよりも複雑な形状であるような角を有する流体回路をいう。
図２１において示されるように、フローチャネル２１００を有する層は、複数のサンプル入口２１０２、混合Ｔジャンクション２１０４、中央循環ループ２１０６（すなわち、実質的に円形のフローチャネル）、および出口チャネル２１０８を有している。制御チャネルとフローチャネルとの重ね合わせによって、マイクロバルブが形成され得る。これは、その制御チャネルとフローチャネルが、薄いエラストマー性膜によって分離され、その膜が、そのフローチャネル方向に偏向しているか、それらから収縮され得るからである。
その実質的に円形の中央ループおよびそれと交差している制御チャネルが、その回転ポンプの中心部分を形成している。その実質的に円形のフローチャネルに液体を流すことが引き起こすポンプは、互いに隣接してその実質的に円形の分岐流体チャネル２１０６（すなわち、中央ループ）に交差する少なくとも３つの制御チャネル２１１０ａ〜ｃのセットからなる。
一連のオン／オフ作動系列（例えば、００１、０１１、０１０、１１０、１００、１０１）が、その制御チャネルに適用されるときに、その中央ロープ内の流体は、時計周りまたは反時計周りのいずれかの選択された方向に蠕動的にポンプで注入され得る。蠕動的ポンプ作動によって、そのフローチャネルの内または外側へと、その制御チャネルとフローチャネルを分離している膜の連続的な偏向を生じる。
一般的に、その作動周期が高ければ高いほど、その流体がその中央ループ内で速く回転する。しかし、その周期の上昇が、流速の上昇を生じない飽和点に、ついに、達し得る。これは、主に、その膜が作動不能な位置に戻され得るような速度の限界に起因する。図１７Ａ〜１７Ｂにおいて示されるような連結混合デバイスと合わせて以下に記載されるように、種々の技術が、作動する速度上昇とフロー／混合の周期の上昇との関係を維持するために、種々の技術が採用され得る。
図２１に示されるシステムは、２つのセットのポンプ（すなわち、実質的に円形のフローチャネルの上に重なる３つの制御チャネルのうちの２つ）を示し、単一のポンプ（すなわち、その実質的に円形のフローチャネルの単一のセット）が使用され得る。さらに、ポンプの各々は３つの制御チャネルを備えるものとして示されるが、様々な数の制御チャネルが、使用され得、交差点を有する単一の蛇行型の制御チャネルが使用され得る。
中央ループと流体連絡している種々の異なる付属的なフローチャネルが、その中央ループからサンプルを導入し、そして、反応溶液を引き抜くために使用され得る。同様に、その中央ループと流体連絡している１以上の出口フローチャネルまたは吹き出し口フローチャネルが、その中央ループから溶液を取り出すために使用され得る。例えば、制御バルブが、その引込口および吹出し口で使用され、その中央ループから溶液が流入することまたは流出することを防止し得る。
フローチャネルのサイズおよび形状は、変化し得る。特定のデバイスにおいて、そのチャネルの直径は、約１ｍｍ〜２ｃｍの範囲にある傾向があるが、その直径は、特定のデバイスにおいては著しく大きい（例えば、４ｃｍ、６ｃｍ、８ｃｍ、または１０ｃｍ）である。その円形フローチャネルの直径がどのくらいまで小さいかという制限は、主に、マルチレイヤーソフトリソグラフィーによることろの限界に関係ある。チャネル幅は、（フローチャネルまたは制御チャネルのいずれにおいても）通常は、約３０μｍと２５０μｍとの間で変化する。しかし、いくつかのデバイスにおけるチャネル幅は、１μｍぐらいの狭さである。大きい幅のチャネルも使用され得るが、一般的チャネルは、そのフローチャネル中になんらかの構造的支持体が必要とされる。チャネル高は、一般に、５μｍと５０μｍとの間で変化する。１００μｍ以下の幅を有するフローチャネルにおいて、そのチャネル高は、１μｍ以下であり得る。そのフローチャネルは、代表的には、そのチャネルにその膜が偏向したするとそのチャネルの完全な遮断が可能になるように丸められている。いくつかのデバイスにおいては、それらのチャネルは、八角形または六角形のような形状を有する。あるデバイスにおいては、そのフローチャネルは、丸められ、そして、１００μｍ幅かつ１０μｍ高であり、制御チャネルは、１００μｍ幅かつ１０μｍ高である。特定の研究において使用される１つのシステムは、直径２ｃｍを有する中央ループ、１００μｍ幅で１０μｍの深さを有するフローチャネルを備えている。
それらのチャネルは、代表的には、上述のサイズおよび形状を有しており、本明細書中で提供されるデバイスが、それらのサイズおよび形状に限定されるないことが認識されるべきである。例えば、閉回路フローチャネルで存在する分枝は、その分散を制御する役割を果たし、したがって、その中で流れる物質を混合し得る。
（ＩＩ．組合せ混合）
上述したような種々のミクロ流体エレメントが、組み合わされて、ミクロ流体チップ上の任意の組合せの流入溶液の正確かつ迅速な混合を可能にするミクロ流体でデバイスを作り上げられ、したがって、比較的少ない基礎成分から多くの異なる溶液の製造を可能にし得る。
（１．組合せ混合構造体）
図１７Ａは、本発明に従った組合せ混合デバイスの１実施形態の平面図を示す。図１７Ｂは、図１７Ａの組合せ混合デバイスのある領域の拡大図を示す。
組合せ混合デバイス１７００は、フローチャネルネットワーク１７０２を備え、このフローチャネルネットワーク１７０２は、緩衝液取り込みフローライン（ＢＦ１−ＢＦ１６）および試薬流入フローライン（ＲＦ１−ＲＦ１６）を備え、分岐した交差フロー注入構造体１７０４で交差し、これは、順に、その回転混合構造体１７０６と流体連絡する。
制御チャネルネットワーク１７１０は、制御ラインＣ１−Ｃ２４を備える。制御ラインＣ１−Ｃ８は、緩衝液流入フローラインＢＦ１−ＢＦ１６と交差して、第１のマルチプレクサ構造体１７２０をつくり、交差注入器１７０４への緩衝液の計量供給を管理し得る。
制御ラインＣ９−Ｃ１１は、マインフローチャネル１７５０と相互作用して、交差フロー注入構造体１７０４へ流し込む役割を担う第１の蠕動ポンプ１７５２をつくりあげる。試薬が、外圧の影響下で、流入フローラインＲＦ１−ＲＦ１６を介して流れ込む。
最も右のフローチャネル１７５５は、別の制御ライン（Ｃ１２）によって制御され、そして、それらのマルチプレクサ流入口を水／緩衝液で流して、そのチャネル内での相互汚染および不溶性の塩形成を避けるために使用される。この洗浄工程の前に、制御ラインＣ１−Ｃ８内の圧力は、そのポンプ作用を提供するために変化され得る。
具体的には、これらのラインを選択的に作動させることによって、選択したチャネルのみにポンプ作用を与えるか、または全てのチャネルに対して一緒に、同時にポンプ作用を与えることが可能である。さらに、この一連のポンプ作用は、特定の体積の流体を順方向なたは逆方向にポンプで送るように設計され得る。逆方向の流体ポンプ作用は、異なるラインに属する２種の流体の順方向での混合を防ぐように使用され得る。
逆方向流体ポンプ作用が重要であるひとつの例は、隣接するライン中の異なる可溶性塩の順方向に混合して、そのフローチャネルを遮断してしまう不溶性塩の形成を防ぐことである。このような順方向の混合は、以下のような様式で防止され得る。
実験の最初において、緩衝液は、マルチプレクサの入口から僅かに下流に位置する。
第１の塩を含むチャネルは、そのマルチプレクサから選択され、そして、その交差注入ジャンクションは洗浄された後に、制御ライン（例えば、Ｃ１２）が、水または緩衝液をそのマルチプレクサ出口に通して流すように開放される。流水式洗浄工程は、そのマルチプレクサ出口の付近からその塩の大部分を除去する。しかし、少量の塩が近くの入口から拡散され得る。
したがって、ついで、このマルチプレクサが、同時に、その入口ラインへ向けてポンプ作用するように使用されて、その緩衝液／水がそのマルチプレクサ出口を通って動くことによって残留した塩溶液がはき出されるようにする。ついで、このマルチプレクサが使用されて、逆方向にポンプ作用して、その結果、流した緩衝液が、全てのライン向かって戻る。このように、ラインが選択され、そして、所望の試薬がその選択されたラインを通して流れ込むまで、緩衝溶液がそのマルチプレクサの各々のライン中に存在する。このフロープロセスは、それらの試薬の所望しない混合に対抗することを確実にする。まさにここで記載したフラッシュ／バックフロー法を使用して、１週間を超える間に亘る連続した操作が、両立しない塩（例えば、リン酸カリウムおよび塩化マグネシウム）が、望まない混合または不溶性塩の形成のいずれをも伴わずに、隣接したラインで使用され得ること示した。
制御ラインＣ１３は、交差フロー注入器１７０４への試薬流入の開閉を担う。制御ラインＣ１４およびＣ１７は、回転ミキサ１７０６の流出入の開閉を担う。制御ラインＣ１５、Ｃ１６およびＣ１８は、回転ミキサ１７０６と相互作用して、そのミキサ内の円形フローをつくり出すための第３の蠕動ポンプをつくりあげる。
第１の出口チャネル１７７０は、交差注入器１７０４と直接的に流体連絡しており、そして、代表的には、第１の出口１７９０に廃物質を運搬する。第２の出口チャネル１７７２は、交差フロー注入器構造体１７０４と回転ミキサ１７０６を介して流体接続しており、したがって、第２の出口１７９２に廃物質を運搬する。
図１７Ａ〜１７Ｂにおいて示された組合せミキサは、第２の出口フローチャネルに隣接する代替的な蛇行型出口チャネル１７８１をさらに備える。この蛇行型チャネル１７８１の目的は、以下である。その入口、交差ジャンクション。混合リング、および出口は、流体として連続しており、その流体イピーダンスは、その成分のインピーダンスの和である。交差ジャンクションのインピーダンスが、入口または出口のインピーダンスと比較して小さい場合、交差注入器（ｃｒｏｓｓ−ｉｎｊｅｃｔｉｖｅ）中の流体の粘度を変化することは、その影響は極微であり、それによって、その計測感度の減少が所望されるように生じる。この理由により、チャネル１７８１は、（屈折部分を多く伴って）長いものであり、かつ小さな直径のものである。この組合せミキサの対する出口は、注入サイクルの間に、蛇行型チャネル１７１８へと切り換わる。
図１７Ａ〜１７Ｂで示されたデバイスの代表的な操作は、以下の通りである。フローは、交差注入エリア１７０４を介して水平方向に方向付けられる。第１のマルチプレクサ１７２０は、分岐交差注入器１７０４、回転ミキサ１７０６を介し、第２の出口チャネル１７７２をの外で、流れる緩衝液フローチャネル入口（ＢＦ１−ＢＦ１６）を選択するように使用される。
次いで、そのデバイスを介した緩衝液のフローは、蛇行型ポンプ１７５２のバルブを閉めることによって停止され、そして、フローは、その交差注入器１７０４を介して垂直方向に指向される。次いで、試薬が、第２のマルチプレクサを使用してその試薬フローチャネル入口（ＲＦ１−ＲＦ１６）から選択される。この試薬は、交差注入領域１７０４を介して流れ込み、ついで、第１の出口チャネル１７７０を介してで流出した。
次いで、フローが、再度、交差注入器１７０４を介して水平方向に指向され、そして、その蛇行型ポンプ１７５２が使用されて、正確な量の試薬を回転混合リング１７０６に送り込むように使用される。蛇行型ポンプ１７５２のサイクルの各々は、十分に規定された体積（約８０ｐＬ）を回転ミキサ１７０６に注入して、その結果、そのリングに注入された総体積が、注入サイクルの数によって制御され得る。
所望する量の第１の試薬が、回転ミキサ１７０６に注入されると、別の試薬が、チャネルライン（ＲＦＸ）が選択されて、その注入プロセスが、反復される。このように、任意の組合せの試薬が、その回転ミキサ１７０６に導入され得る。この回転ミキサは、総体積５ｎＬを有しており、その結果、その回転ミキサは、約６０注入体積の収容能力を有し得る。
それらの成分が、その回転ミキサ１７０６に注入されると、拡散性混合が、その混合物円形ミキサ１７０６の蛇行型ポンプ作用から生じるポアズイユ流によって生じる。一旦、混合が完全なものとなると、その混合物は、フローチャネル１７１１を介して第２の出口チャネル１７２２へと流れ、それは、貯蔵、分析および／またはさらなる処理のために、そのチップの別の領域または別のチップと完全に流体連絡し得る（これらは、図１７Ａ〜１７Ｂのいずれにも示されていない）。これらの工程は、連続する処理のために反復され得る。
図１７Ａ〜Ｂに示された組合せ混合デバイス１７００の特定の実施形態はまた、フローチャネル１７８２を介して回転ミキサ１７０６と流体連絡しているサンプルポート１７８０を備え、そのフローチャネル１７８２は、制御チャネルＣ１９−２１の存在によって規定される蠕動ポンプ１７８４と圧力連絡している。所望される場合、サンプルは、サンプル入口ポートを介して導入され得、次いで、蠕動ポンプを使用してそのミキサに注入され得る。以下に詳細に記載されるように、このサンプル注入器を利用する１つの可能な用途は、沈降による位相空間のハイスループットマッピングを実施することである。
上で記載されたような混合化チップは、それ自体で使用され得るか、またはより規模の大きいデバイスにおける重要な構成要素として組み込まれ得る。このチップは、任意の組合せの流体を混合または計測するために使用され得、これらの流体は、下流にある測定システムまたは貯蔵システムへと送達され得る。貯蔵エレメントまたは記録エレメントを付加することによって、この混合機能は、サンプルの大規模なスクリーニングまたは処理を可能にする。例えば、以下に議論されるように、そのリングの出口は、連続的に試薬を混合するために使用され得、次いで、それらを送って、貯蔵目的またはスクリーニング目的のための数千の反応チャンバのアレイを満たす。
上の記載は、組合せ混合の連続的な実施に関するものであるが、基礎的な混合得れ面ｔの並列した実施も可能である。例えば、図１７Ａ〜１７Ｂに示されるような複数の流体構造体のアレイは、単一チップ上に組み込まれ得る。
例えば、図２２は、本発明の１つの実施形態に従った組合せミキサのカラムの、全体の平面図を示し、そして図２３は、そのカラムの拡大図を示す。組合せ混合デバイス２２００は、フローネットワークチャネル２２０２を備え、それは、蠕動ポンプ構造体２２０４によって制御される入口フローチャネルＢＦ１−ＢＦ１０を備える。この蠕動ポンプ構造体は、制御チャネルＣ２−Ｃ４を重ねることによって形成される。緩衝液入口チャネルＢＦ１−ＢＦ１０は、混合構造体２２０８と別個の分岐交差チャネル注入器２２１０を介して流体連絡している。試薬フローラインから選択された試薬は、制御チャネルネットワークＣ１をかせね合わせることによってつくり出されるマルチプレクサ２２１２を利用して選択され得、次いで、交差フロー注入器２２１０へと流入される。
閉回路混合構造体に亘る、コントロールチャネルＣ７、Ｃ８、およびＣ１０の重ね合わせが、蠕動混合ポンプ２２１４を規定する。制御ラインＣ６とＣ９の重ね合わせによって、混合構造体のためのそれぞれのゲートバルブ２２１６が作られる。その混合構造体からの物質出口では、廃棄のための出口ライン２２１８を介して流れ出る。
高分子サンプルが、サンプルレザバ２２２２で共通の流体で連絡しているサンプル入口ライン２２２０から注入され得、具体的には、制御ラインＣ１１−Ｃ１３の重ね合わせによって規定される蠕動ポンプ作用構造体を利用する。一旦、高分子サンプルがその混合構造体に注入されると、その固相の形成が、光学的検査（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）によってモニタされ得、この光学的な検査は、通常の光源およびその混合構造体に近接して適当な位置に位置づけられた一連の検出器を利用する。あるいは、チップ上の複数の混合構造体が、電動化されたステージを利用して単一の検出器上でスキャンされ得る。
図２２〜２３において示されるように、混合成分の各々についての制御ラインが、接続されて、混合成分の全体のアレイが、制御することが複雑になることなく、走査され得る。１つの実施形態において、全ての緩衝液が、同じ試薬を用いて同時に使用され得る。あるいは、全てのリングが、同一の様式であるが異なるサンプルを用いて用意され得る。滋賀って、並列化された構造体が、（異なるｐＨを有する）異なる緩衝液を用いて、同じ試薬に対する１つのサンプルの同時スクリーニングを可能するか、または同一条件に対する多くの異なるサンプルのスクリーニングが可能となる。このようにして、このシステムのスループットが、その並列化の程度に比例して増大され得る。
例えば、本発明の実施形態従う組合せ混合構造体は、１日当たり約３０００タンパク質の溶解度アッセイを実施することが可能であり、その結果、１０の並列混合構造体を有する、図２２〜２３のデザインによって、１日当たり３０，０００の実験を実施し得る。これらの実験の各々は、１ｎＬのタンパク質サンプルの平均を必要として、その結果、総じて１００，０００の実験が、総体積にして約１００μＬのタンパク質サンプルを使用して３日間あまりの時間で実施され得る。
スループットを増大する別の方法は、その組合せ混合構造体を、一定の混合機能を十知るように設計された別の流体構造体に結合することである。例えば、その組み合わせ混合構造体は、流体混合マトリクスにマルチプレクサを介して結合され得る。その組合せ混合構造体は、特有の溶液を用いてそのＮ行のマトリクスを満たすために使用され、他方、その列は、Ｎ個の様々なサンプルに結合されている。このようにして、Ｎの混合操作が、Ｎ２の独自の反応を作り出すために使用され得る。
１つのアプローチにおいて、このような組合せ混合チップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するのに適したフローチャネルと流体連絡され得る。あるいは、流体構造体は、広範囲の混合比が、上述された形状計測スキームに基づいて同時に実行することを可能するように設計され得る。
組合せ混合デザインが、実行され、そして使用されて、異なる物理学的特性（イオン強度、ｐＨ、粘度、表面張力）を有する広範な流体の超精密計測が実施される。この計測および混合のシステムは、非常に正確で、頑強であり、その流体特性に対して反応しないものであることが実証された。流体が、約８０ｐＬの体積増分でそのリングに注入され得るが、誤差は、１％未満である。このシステムは、僅か５％の変化量を注入体積において伴って、１〜４００ｃＰの範囲の粘度を有する流体を計測し得る。
本発明の実施形態に従うミクロ流体構造体の実施形態のチャネルを介して流体を計測する速度は、以下の式（２）：
Ｑ＝（πａ４ΔＰ）／（８μＬ）
（ここで、
Ｑ＝チャネル内の体積流量（ｖｏｌ／ｓ）
ａ＝チャネルの寸法
Ｌ＝チャネル長
ΔＰ＝チャネル内の圧力変化
μ＝チャネル内の作動流体の粘度
）で十分に近似され、この式は、円形状交差部分を通る体積流量を記述する。
式（２）は、ミクロ流体内の流体の体積変化に影響得を与える能力を記載する。この流体が作動流体であり、かつそのミクロ流体チャネルが制御チャネルであるときに、この体積流量は、物質がその制御チャネルに隣接するフローチャネルを介して流れ得る速度を示す。
式（２）によると、作動／混合の速度増加を達成する１つの方法は、制御チャネルの寸法（ａ）を大きくすることである。図１７Ａ〜Ｂに記載の組合せ混合デバイスの実施形態において、これは、その制御チャネルの寸法を大きくして、それぞれ、その作動／脱作動された制御チャネルの内外に動く作動流体の体積の流れ抵抗を低減することによって達成された。具体的には、その制御チャネルの高さは、３０μｍ〜１０μｍに増大される。
作動／混合の速度増加を達成する別の方法は、ベースライン（グラウンド）圧力を大気圧よりも大きくすることである。具体的には、作動された膜は、速度限定因子であり得る。なぜならば、その圧力駆動収縮は、代表的には、ただ、ほぼ大気圧であるチャネル圧であり得るからである。したがって、その反発性は、しばしば、その膜の弾性にのみ起因し得る。そのグラウンド圧を上昇させることによって、本発明の実施形態に従うと、その膜はまた、その流れた流体による制御チャネルに戻り得る。特定の実施形態において、この基礎圧は、約６ｐｓｉであるが、そのベースライン圧が高ければ高いほど、そのバルブの応答は、速くなる。
さらに、式（２）によると、より迅速な作動の達成するためのなお別の方法は、その作動流体の粘度（μ）を低減することである。一般に、０．００１ｋｇ／ｍ・ｓの粘度を有する水、または０．００００１８ｋｇ／ｍ・ｓの粘度を有する空気は、作動流体として使用され得る。空気よりも水が、フローチャネルにおける気泡の形成を避けることが望まれるために、作動流体として使用されてきた。しかし、図１７Ａ〜Ｂにおいて示された組合せ混合デバイスの実施形態は、作動速度を上昇させるために空気で満たされた制御チャネルを利用する。さらに、圧力を挙げることによって、気泡の形成の発生確率が実質的に低減されることが発見された。
要約すると、１）より大きな周囲制御チャネル寸法、２）ベースライン圧の上昇、および３）作動流体としての空気の使用の組合せが、図１７Ａ〜１７Ｂの組合せ混合デバイスのバルブの作動の最大振動数を、約１０Ｈｚ〜約１００Ｈｚに増大し、その閉回路ミキサを通して流体を移動する得られた振動数は、約４Ｈｚである。
組合せ混合チップによって実施される計測および混合が、非常に高速であることが見出された。単一の混合配置が、１日につき３０００サンプルを処理し得る。単一のチップの上にこのような２０のミキサを並列に統合することによって、１日当たりおよそ６０，０００を処理することが可能であり、このデバイスが、ハイスループットスクリーニング用途のとって適切なものとなる。
以下の図１８および図１９は、チップ上で実施されるいくつかの計測実験の結果を示す。図１８は、「注入体積」対「２ｍＭブロモフェノールブルー（ｐＨ ８．１における０．１ Ｍ Ｔｕｓ−ＨＣｌ）の滴定に関する注入されたスラグ数」をプロットする。図１８の吸収測定は、その計測の精度および再現性を実証するものである。９つのクラスターのうちの各々は、１０時間の期間に亘って実施された１００の独立した計測実験のからなる。
図１９は、以下の表に要約されるように、「濃度」対「４つの異なる粘度を示すサンプルについての注入されたスラグ番号」をプロットする。
（表）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
サンプル グリセロール（％） 粘度（ｃＰ） スラグ体積（ｐＬ） Ｒ２
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
Ａ ０ １ ９０．７２ ０．９９９
Ｂ ７６ ４０ ８８．２ ０．９９７
Ｃ ８４ １００ ８４．８４ ０．９９８
Ｄ ９２ ４００ ８６．５２ ０．９９８
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
図１９において注入された体積によって実証された狭い偏差は、流体の特性に対する計測の非感受性、特に、広範な粘度に対する非感受性を示す吸収測定を実証する。
組合せ混合デバイスが、配合における最適な組合せを見出すことが必要である、生物学、化学、化学工学などの問題を解決するための処方ツールとしての種々の用途を見出し得る。このデバイスチップおよびそのれらの改変体は、これらの配合のパラメータにおける多くのバリーションを同時にスクリーニングするために使用され得、したがって、配合および処方を最適化するための迅速で安価な手段を提供する。使用の可能性ある分野としては、微生物学、化学合成、ハイスループットスクリーニング、薬物発見、医学的診断法、病原体同定、および酵素反応（ポリメラーゼ連鎖反応およびそれらの改変型が挙げられるが、それらに限定されない）が挙げられる。このデバイスはまた、種々のローション、クリーム、食料品、化学合成物などを処方する役割も果たし得る。
本発明に従うミクロ流体構造体の実施形態は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳＯ １／４４８６９（２００１年１１月１６日出願）により完全に記載され、そして、「細胞アッセイおよびハイスループットスクリーニング（Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙｓ ａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」と題されるような用途（本明細書中で全ての目的のために参考として援用される）のために、用いられ得る。このような用途を実施するのに適切なミクロ流体構造体の例としては、本明細書中で記載されるような構造体、ならびに米国非仮特許出願場番号１０／１１８，４６６である「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ」（代理人管理番号２０１７４Ｃ−００４４３０として、２００２年４月５日に出願）（本明細書中で全ての目的のために参考として援用される）に記載されるような他のものが挙げられる。
図１７Ａ〜Ｂに示されたかつ記載された１つの有望な用途は、膜タンパク質の可溶化である。
膜タンパク質は、代表的には、真核生物細胞において発現され、ここで、これらのタンパク質は、細胞膜内に組み込まれている。これら膜タンパク質の３次元構造は、結晶の形態でそのＸ線回折法によって決定され得る。
しかし、このような結晶化が実施される前に、タンパク質が細胞に細胞膜に取り込まれているときに保持する３次元的に折り畳まれた形状で溶液中のタンパク質を安定化することがまず、必要である。代表的には、界面活性剤を添加することによって達成され、これによって、両親媒性分子（その界面活性剤）の小さなエンベロープ中に膜タンパク質を包み込み、その細胞膜の環境を模倣して、変性を防止する。このような様式でそれらの膜タンパク質を安定化することは、代表的には、様々なｐＨ値、イオン強度での緩衝液を用いて、そして、様々な界面活性剤を用いて、タンパク質を可溶化することが必要である。したがって、膜タンパク質の可溶化が、本質的に、処方上の問題である。
それらの膜タンパク質は、代表的には、少量でのみ、研究者にとって利用可能であり、少量で、自動化様式で、溶解性研究を実施することが所望される。したがって、ここで記載したこの組合せ混合デバイスは、この問題に対して十分に適したものである。
図６１Ａ〜Ｇは、スクリーニング条件が膜タンパク質を可溶化することにおける成功に首尾がよいとして評価され得るアッセイの概略図である。この技術は、対応するレセプターまたは抗体が既知である膜タンパク質の可溶化のとって適切である。
図６１Ａは、その方法の第１の工程を示し、ここで、試験管６１０２中にあるセル６１００が、溶解されて、そして、遠心分離され、その試験管の底でのペレット６１０４中の膜タンパク質を含む膜を濃縮される。ペレットｐ６１０４は、その溶解物として参照される。
図６１Ｂは、その方法の第２の工程を示し、ここで、上記の溶解物中の膜タンパク質６１０６は、ヒスタジン（ＨＩＳ）６１０８でタグ化され、そのＨＩＳタグ化膜タンパク質６１１０は、ミクロ流体入口６１１２、さらに、閉回路混合構造体６１１４に流れ込む。図６１Ｃは、第３工程を示し、ここで、界面活性剤、緩衝液および塩の混合物６１１５が、混合構造体６１１４に注入され、そして、そのＨＩＳタグ化膜タンパク質６１１０と今後されて、その膜タンパク質を可溶化する。この段階において、その可溶化された膜タンパク質は、その細胞膜内で示される折り畳まれた３次元構造を示しても示さなくともよい。
図６１Ｄは、第４の工程を示し、ここで、その溶解した膜タンパク質混合物が、マルチプレクサ６１１９を介してその混合構造体６１１５の外に流れて、ニッケル基質６１１８上で第１のフローチャネル６１１６ａへと流れ、そのタンパク質を固定する。図６１Ｅは、第５の工程を示し、ここで、蛍光タグ化されたリガンドまたは抗体６１１８は、その固定化されたＨＩＳタグ化タンパク質サンプル６１１０上に流される。その対応するタグ化リンガンド／抗体は、その細胞膜中で同じように折り畳まれた形状を示す固定化されたタンパク質のみに結合する。
図６１Ｆに示されるように、そのニッケルを含むフローチャネルは、洗浄され、そして、源６１５０からチャネルの内容物に放射線を照射し、そして、検出器６１５２でその得られた放出された蛍光を検出することによって蛍光測定がなされる。その検出された蛍光シグナルの強度によって、所望の天然に存在する折り畳まれ方をする３次元構造の形状を示すタンパク質の数を明らかにした。この形状によって。その相補的な蛍光リガンド／抗体の結合を可能にする。その可溶化条件のその後のバリエーションが、所望の三次元折り畳み形状を伴って溶液に入るタンパク質分子の数を最適化し得る。その可溶化プロセスの最適化は、両親媒性部分または他の溶液成分の様々な濃度／強度を有する混合物から検出されるシグナルの大きさを比較することによって達成され得る。
１つの可溶化プロセスの結論において、その閉回路混合構造（ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｉｔ ｍｉｘｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、低ｐＨ緩衝液で洗浄されて、結合および標識されたタンパク質が溶出され得、別の可溶化実験が行われ得る。新たなニッケル表面が必要とされる場合、その次の混合物は、その混合構造から別の流動チャネルへと、マルチプレクサーによって方向付けられ得る。
上記の図６１Ａ〜Ｆと関連して例示されかつ議論された実施形態は、その閉回路ミクロ流体混合構造において混合した後に、その可溶化された膜タンパク質をその相補的な検出可能リガンドに曝すことを包含するが、これは、本発明に必須ではない。代替的実施形態に従って、その相補的リガンド／抗体は、その混合構造中のタグ化タンパク質と直接混合され得る。この代替的実施形態は、より正確な結果を提供し得、ここでニッケル基材へのタグ化タンパク質の結合は、タンパク質とその相補的リガンドとの間の結合を阻害し得る。
そして上記の図６１Ａ〜Ｆに関連して例示されかつ議論された実施形態は、平坦なニッケル基材上に可溶化タンパク質を固定化することを包含するが、これはまた、本発明に必須ではない。代替的実施形態は、所望の固定化機能を示す表面を有するビーズとともに充填された流動チャネルを利用し得る。
そして上記の図６１Ａ〜Ｆに関連して例示されかつ議論された実施形態は、その蛍光特性によって検出可能なリガンドの使用を包含するが、これもまた、本発明に必須ではない。代替的実施形態は、ＰＥＴ検出器を利用して検出可能な放射性型のリガンドを利用し得る。
図１７Ａ〜Ｂに関連して示されかつ記載された組み合わせデバイスののための別の特定の有望な適用は、高分子（例えば、可溶化がちょうど議論された膜タンパク質）の結晶化である。このような結晶化は、濃縮されかつ精製されたタンパク質または高分子のサンプルに対して多くの異なる試薬をの大規模スクリーニングを要する。タンパク質は、一般に、大量に獲得しかつ精製するのは困難であるので、スクリーニング試験においてサンプル消費を最小にすることは最も重要なことである。従来の手段は、１回のアッセイあたりマイクロリットルのサンプル容積を必要とする一方で、本発明は、ナノリットル未満の反応容積を実現し得る。
さらに、多くの数千もの特有の溶液がチップ上で直接混合され得るので、本発明は、タンパク質結晶化条件の徹底的なスクリーニングを行うために使用され得る。このスクリーニングは、無作為な様式または体系化された様式で行われ得る。一旦混合されると、結晶化反応は、例えば、以下により詳細に記載されるように、保存および調査のための位置探索デバイス（ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｄｅｖｉｃｅ）に送られ得る。
（２．保存構造）
組み合わせ混合構造の基本的な測定機能および混合機能を流体保存構造と組み合わせると、完全タンパク質結晶化ワークステーションをチップ上に実装することが可能になる。このようにして、研究者は、種々の化学におけるタンパク質の可溶性を探索し得、どれが最も有望な結晶化条件であるかを決定し得、次いで、結晶成長のための反応を設定し、インキュベートする。このようにして、スクリーニング、位相空間調査、最適化、およびインキュベーションは、単一のミクロ流体ワークステーションで達成され得る。保存のあり得る方法の非網羅的リストは、以下に提供される。
本発明の一実施形態に従って、反応は、予め混合された試薬（結晶化剤、添加剤、低温保護剤（ｃｒｙｏ−ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）．．．、サンプル）を保存チャネルへとポンプ輸送し、非混和性流体（例えば、パラフィン油）により実験を分離することによって保存され得る。図５８Ａ〜Ｃは、この保存技術の１つの実装の模式図である。
図５８Ａにおいて、サンプルは、環状混合デバイス５８００へと、直列バルブ５８０２ａ〜ｃの蠕動ポンプ輸送作用を介して流される。次いで、混合物５８０３が作り出され、横断連結（ｃｒｏｓｓ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ）５８０４へと流される。図５８Ｂにおいて、横断連結５８０４内のサンプルは、バルブ５８１０によって制御される端部５８０６ａを有する、蛇行した保存チャネル５８０６に送られる。図５８Ｃにおいて、そのバルブ構成は変更され、不活性分離流体５８０８（例えば、油）は、横断連結５８０４に流される。図５８Ｄにおいて、その分離流体５８０８は、保存チャネル５８０６へ流される。図５８Ａ〜Ｄに例示されるそのサイクルは、次いで、繰り返されて、保存ライン５８０６内に新たなサンプル容積が提供され得る。チャネル５８０６内に保存されたサンプルは、ゲートバルブ５８１０を通る端部５８０６ａを通じて、回収され得る。
その保存チャネルが１００μｍ幅×１００μｍ高の寸法を有するとすると、１ｎＬのサンプルが１００μｍに等しいチャネルの長さを満たす。そのチャネルが蛇行しておりかつ隣接するレッグが１００μｍだけ離れているとすると、１平方ｃｍの保存領域にフィットするチャネルの合計の長さは、約１ｃｍ×１００／２＝０．５ｍである。このことは、０．５ｍ／１００μｍ＝５０００反応の保存を可能にする。
流体の全長は、追加される毎に進まなければならないので、この流体の長さをポンプ輸送することは困難であることが分かり得る。この問題を避けるために、図５９は、反応／保存スキームの実施形態５９００の模式図を示し、ここでマルチプレクサー５９０２は、実験サンプルおよび不活性分離流体を、複数の並行保存チャネル５９０４のうちの１つに方向付けるために使用され得る。
なお別の代替的実施形態に従って、各反応物は、流体の縦列全体が一緒に動かされる必要が決してないように、保存ラインの端部に行き止まりになるまで充填され得る。図６０は、このようなアプローチの簡略化した模式図を示し、ここで保存チャネル６０００は、行き止まりにされている。
空気の流れは、そのサンプルおよび不活性分離流体を保存チャネルへと付勢するために利用され得、その空気は、最終的には、そのエラストマー材料を通ってチャネルから拡散する。このような実施形態において、行き止まりになるまで充填を行うために必要とされる比較的高い圧力は、外部圧力源を使用して達成され得、それによって、油ライン上の別個のポンプに対する必要性が排除される。この行き止まりまで充填する技術は、図５８Ａ〜Ｄに示される実施形態におけるように、単一の保存ライン、または図５９に示される実施形態におけるようにマルチプレクサーを介する多くの並行保存ラインを充填するために使用され得る。
図５８Ａ〜６０は、そのチップ上のチャネルとして平坦な様式で一体化されるように保存ラインを示すが、これは、本発明に必須ではない。本発明の代替的実施形態に従って、その試薬は、その垂直な方向に、チップから、例えば、ガラスキャピラリーへと除去され得る。
化合物を保存するためのなお別のアプローチは、拡散アッセイを利用することである。図５４Ａ〜Ｄは、組み合わせ混合構造５４００とアドレス指定可能保存アレイ５４０２とを組み合わせるデバイスの配置図を示す。アレイ５４０２は、２５６個の個々のバッチ実験または１２８個のフリー界面拡散実験のチップ上でのインキュベーションを可能にする。
図５４Ｂは、保存アレイ５４０２への入り口の誇張を示す。アレイ５４０２は、上記で議論されるその行き止まりの充填原理に取り組む。一旦その試薬が環５４０６中で混合されると、それらは、一時的保存のために蛇行したチャネル５４０８へとポンプ輸送される。保存アレイ入り口におけるマルチプレクサー５４１０は、次いで、１６個ののあり得る入り口のうちの１つを開放するように作動され、それによって、そのアドレス指定されるべきアレイの横列を選択し得る。
図５４Ｃは、図５４Ａの保存アレイの拡大図を示す。図５４Ｄは、図５４Ｄのアレイにおける単一のセルの拡大図を示す。
保存アレイの各横列は、保存チャンバ５４５６をチャネル入り口から分離するバルブ５４５４を作動する制御ライン５４５２、およびその保存アレイの縦列を分離する制御ライン５４５８を有する。単一の制御ライン５４６０は、流体により連結されたチャンバ５４６２ａ〜ｂのあらゆる対にさらに送られて、流体界面を作り出すことが望まれるまで、それらを分離する。
一旦その横列がマルチプレクサーによって選択されると、そのアレイ縦列５４７０は、対応する縦列バルブ５４７２を作動することによって選択される。このようにして、そのアレイの単一のチャンバは、充填するために選択される。
環の出口付近のバルブは、その蛇行した保存ラインをマルチプレクサー入り口に接続するように作動され、その保存された溶液は、その蛇行した保存ラインを出て圧縮空気によってマルチプレクサー領域へと押し戻される。この加圧は、その流体をその保存アレイの適切な横列に駆動し、保存アレイの前の空気を圧縮し、そのポリマーに拡散させる。
チャンバ入り口バルブは閉じたままである間、その流体は、チャンバに入らないが、むしろマルチプレクサーとその保存アレイとの間のデッドボリュームに（または部分的にこのボリュームにおよび部分的に保存アレイチャネルに）残る。そのマルチプレクサーの新たなラインは、次いで、選択され、その縦列バルブは、一時的に開放されて、相互汚染を避けるための予防措置として、新たな横列が緩衝液で洗い流されることを可能にする。マルチプレクサーのわずか１つのラインが開いているので、その保存アレイの他の横列は、固定されたままである。
この新たな横列は、次いで、空気をこの横列を通るように吹き込むことによって空にされ、次の溶液のための準備がされる。これらの工程は、全ての横列が固有の溶液で充填されるまで繰り返される。
その縦列バルブは、次いで、作動され、その入り口バルブが開放され、全ての横列が同時に加圧される。このことによって、その溶液がそれらそれぞれのチャンバへと駆動される。この全体のプロセスは、そのアレイが溶液で充填されるまで全ての縦列について繰り返され得る（潜在的には、全てのチャンバにおいて異なる溶液）。
その界面バルブが閉じたままである場合、図５４Ａ〜Ｄのアレイは、２５６個（８縦列×１６横列）のバッチ反応を収容する。ミクロ流体フリー界面を横断する拡散が望まれるタンパク質結晶学のような適用において、その界面バルブが開放されて、その反応が始められ得る。全ての溶液は、予め、その環において別個に混合されているので、実験者は、溶液に対する制御を有する。
例えば、結晶化についてのフリー−界面拡散実験が行われ得、その実験において以下のうちの１つ以上が変化される：沈澱剤の正体および／または初期濃度；結晶化された種の正体および／または初期濃度；添加物の正体および／または初期濃度；ならびに低温保護剤の正体および／または初期濃度。フリー界面拡散実験の前に、多くの異なる薬剤を少量のタンパク質溶液へと混合する能力は、従来の結晶化アプローチを超える重要なり点を提供し、ここで代表的には、標準的なタンパク質ストックが、異なる結晶化剤に対して使用される。上記のそのミクロ流体ネットワークは、このようにして、結晶化のための融通性の高いプラットフォームを提供する。
図５４Ａ〜Ｄのアレイもまた、サンプル回収、アドレス指定可能なウェル洗浄、および反応チャンバの再使用を可能にする。具体的には、サンプルを回収するために、またはウェルを洗浄するために、ウェルを空にする／洗浄する縦列上の適切な入り口バルブが開放される。マルチプレクサーの横列のうちの１つ（これは、洗浄されるべき対のチャンバのうちの１つとつながる）が選択される。
そのマルチプレクサーにおいて開放されていない対とつながるそのアレイの横列は、次いで、そのアレイの端部において開放され、マルチプレクサーにおいて開放されたその横列は、そのアレイの端部で閉鎖される。
この操作は、そのマルチプレクサーの選択された横列を通り、空にされ／洗浄されるべきチャンバ対を通って、その出口にて選択された横列を出る流体経路を生じ、開放する。このようにして、単一のチャンバ対は、アドレス指定され、洗浄され得る。
（ＩＩＩ．結晶化構造および結晶化方法）
標的物質の結晶化の高スループットスクリーニング、または結晶化による標的物質の少量のサンプルの精製は、既知の濃度で、標的物質の溶液を、微細製作流体デバイスの複数のチャンバに同時に導入することによって達成される。次いで、この微細製作流体デバイスは、チャンバ内の溶液条件を変化するように操作され、それによって、多数の結晶化環境が同時に提供される。溶媒条件の変化したコントロールは、種々の技術から生じ得、これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：容積排除によってか、微細製作構造の寸法によって決定される液体容積の捕捉によってか、または直交したフローチャネルが交差することによって規定される交差点のマトリクス内への交差チャネル注入によって、チャンバ内での結晶化因子の容積を測定する技術。
本発明の実施形態によって結晶化を生じる結晶は、Ｘ線結晶学に用いられ、三次元分子構造が決定され得る。あるいは、本発明の実施形態に従う高スループットスクリーニングが直接Ｘ線結晶学に十分なサイズの結晶を生成しない場合、結晶は、さらなる結晶化実験用の核結晶として用いられ得る。見込みのあるスクリーニング結果もまた、標準化された低密度マトリクス技術を使用するのと類似の様式で、狭いスペクトルの結晶化条件に焦点を当てたさらなるスクリーニングのための基準として使用され得る。
本発明の実施形態に従うシステムおよび方法は、より大きい生物学的高分子またはその凝集体（例えば、タンパク質、核酸、ウイルス、およびタンパク質／リガンドの複合体）を結晶化するのに特に適している。しかしながら、本発明に従う結晶化は、任意の特定の型の標的物質に制限されない。
以下の考察において用いられるように、用語「結晶化剤」は、標的物質の溶液に導入され、この標的物質の溶解度を低下させ、それによって結晶形成を誘導する、物質を記載する。結晶化剤としては、代表的に、標的が溶解度の減少を示す対溶媒（ｃｏｕｎｔｅｒｓｏｌｖｅｎｔ）が挙げられるが、溶液のｐＨに影響を及ぼす材料、またはポリエチレングリコールのような、標的物質に利用可能な溶媒の容積を効果的に減少させる材料もまた記載し得る。用語「対溶媒」は、「結晶化剤」と相互交換可能に使用される。
（１．容積捕捉による結晶化）
図４５Ａは、結晶化システムの一実施形態の簡略化した平面図を示し、ここで対溶媒の異なる容積の計量供給は、流動チャネルの形成の間のフォトリソグラフィーによって決定される。図４５Ｂは、図４５Ａのデバイスの３つの化合物ウェルのセットの簡略化した拡大平面図を示す。図４５Ｃは、図４５Ｂのウェルの線Ｃ−Ｃ’に沿ったウェルの簡略化した断面図を示す。このチップ設計は、容積捕捉技術を利用して、標的溶液および結晶化剤の計量供給を用いた。
具体的には、各チップ９１００は、４８個の異なるスクリーン条件の各々につき３つの化合物ウェル９１０２（１チップあたり計１４４アッセイ）を含む。化合物ウェル９１０２は、ガラス基板９１０４中にエッチングされ、微小チャネル９１０６を介して流体接続状態にある２つの隣接ウェル９１０２ａおよび９１０２ｂからなる。その化合物ウェル９１０２の各々において、そのタンパク質溶液は、隣接ウェル９１０２ａ〜ｂの相対サイズによって規定される比において、スクリーン溶液と合わせられる。図４５Ａ〜Ｃに示される特定の実施形態において、その３つの比は、（タンパク質：溶液）４：１、１：１、および１：４であった。各アッセイの総容積は、スクリーン溶液を含め、約２５ｎＬであった。しかし、本発明は、いかなる特定の容積にもまたは容積範囲にも限定されない。本発明に従う代替的実施形態は、１０ｎＬ未満、５ｎＬ未満、２．５ｎＬ未満、１．０ｎＬ未満、および０．５ｎＬ未満の総アッセイ容積を利用し得る。
そのチップ制御層９１０６は、界面制御ライン９１０８、閉じこめ制御ライン９１１０および２つの安全性制御ライン９１１２を含む。制御ライン９１０８、９１１０、および９１１２は、そのチップ内の湿潤な環境を維持し、かつ結晶化が行われるべき流動チャネルおよびチャンバの脱水を防止するために、空気よりむしろ水で充填される。
界面バルブ９１１４は、その化合物ウェル９１０２を二分し、充填が完了するまで、タンパク質をスクリーンから分離する。閉じこめバルブ９１１６は、各化合物ウェル９１０２のポートをブロックし、その実験の継続のための各条件を分離する。その２つの安全バルブ９１１８は、タンパク質充填の間に作動され、失敗した界面バルブの事象においてタンパク質溶液の漏れを防止する。
この実験において利用されるミクロ流体デバイスの製造を、標準的な多層ソフトリソグラフィー技術によって調製し、８０℃において５時間以上ベーキングすることによってエッチングされたスライドガラスにシールされる。そのガラス基材は、５７４０フォトレジストの１６μｍ層でマスクされ、標準的なフォトリソグラフィーによってを使用してパターン形成される。そのガラス基材は、次いで、１：１：１（ＢＯＥ：Ｈ２Ｏ：２Ｎ ＨＣｌ）の溶液中で６０分間エッチングされ、最大深さ約８０μｍを有するマイクロウェルが作り出される。
ちょうど記載されたチップ製造プロトコルは、本発明の可能な実施形態のほんの一例である。代替の実施形態に従って、結晶化チャンバおよびフローチャネルは、平坦な基板と、エラストマー部分の下部表面に全体に形成された凹部のパターンとの間に、規定され得る。なおさらに代替的に、結晶化チャンバおよびフローチャネルは、エラストマー部分の平坦な、特徴のない下部表面と、基板全体に形成された凹部のパターンとの間に規定され得る。
チップ上での結晶化は、以下のように設定される。チップ制御層９１０６におけるすべての制御ラインに、１５〜１７ｐｓｉの圧力で水を充填される。一旦、これらの制御ラインが満たされ、そして弁９１１４および９１１６が完全に作動されると、汚染物弁９１１６が解放され、そしてタンパク質が、約５〜７ｐｓｉを使用して、９１２０を介して、中心を通して充填される。このタンパク質溶液は、各化合物ウェル９１０２のタンパク質側を完全に満たす。破損した弁が存在する場合、同定され、そして減圧グリースが、対応するスクリーンバイアを覆って配置されて、引き続く加圧および残りの条件の可能な汚染を防止する。次いで、２．５〜４μＬのまばらなマトリックススクリーン（代表的に、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ Ｉ，１−４８）が、スクリーンバイア９１２２内にピペッティングされる。安全弁９１１８が解放され、そして特別に設計されたチップホルダ（以下に記載される）が、加圧された（５〜７ｐｓｉ）シールを、全４８のスクリーンバイア９１２２にわたって作製するために使用される。スクリーン溶液が、行き止まりに充填され、各化合物ウェルのスクリーン側を満たす。タンパク質および結晶のスクリーン試薬が、全てのウェルが充填されるまで、界面弁で別々に維持され、この時点で、汚染物弁が閉じられ、そして界面弁が開かれて、化合物ウェル９１０２の２つの半体に存在する液体の体積の間での拡散を可能にする。
これらの実験のために、実験を設定する際（制御ラインを充填することを含む）に費やされる平均時間は、約３５分であり、最も速い実験は、設定するために２０分しかかからなかった。この設定時間は、潜在的に、チップへの溶液のロボットピペッティングの使用を介して、または送達された溶液の充填およびプライムするための圧力の使用を介して、またはミクロ流体計量供給デバイス（例えば、先に記載されたコンビナトリアル混合構造体）の使用を介して、なおさらに減少され得る。
先に示されたように、本発明に従うミクロ流体デバイスの実施形態は、オンチップリザーバーまたはウェルを利用し得る。しかし、多数の溶液の充填を必要とするミクロ流体デバイスにおいては、各ウェルとインターフェースするための別々のピンを用いる、対応する多数の投入管の使用は、その流体デバイスの比較的小さい寸法を考慮して、非実用的であり得る。さらに、小さい体積の液体を分配するためのピペットの自動化された使用が公知であり、従って、チップの面上に存在するウェルに直接溶液をピペッティングするためにこのような技術を利用することは、最も容易であることを示し得る。
毛管作用は、特に、行き止まりチャンバが栄養分でプライムされる場合には、溶液をオンチップウェルからチップの活性領域に引くためには、十分ではないかもしれない。このような実施形態において、材料をチップ内に充填するための１つの様式は、外部加圧の使用を介する。また、しかし、多数の可能な材料供給源を結合されたデバイスの小さい寸法は、ピンまたはチュービングを通してここのウェルへと圧力を付与することを、非実用的にし得る。
従って、図４４は、本発明の１つの実施形態に従うチップホルダ１１０００の分解図である。チップホルダ１１０００の底部１１００２は、上昇した周囲の部分１１００４を備え、チップ１１００８の寸法に大きさが対応する凹部領域１１００６を囲み、ミクロ流体チップ１１００８がこの内部に配置されることを可能にする。周囲領域１１００４は、さらに、ねじ穴１１０１０を規定する。
ミクロ流体デバイス１１００８は、チップホルダ１１０００の底部１１００２の奥部領域１１００６内に位置決めされる。ミクロ流体デバイス１１００８は、活性領域１１０１１を備え、この領域は、第一の行１１０１２ａおよび第二の行１１０１２ｂ内に構成された、周囲ウェル１１０１２と流体連絡する。ウェル１１０１２は、デバイス１１００８が機能することを可能にするために十分な料の材料を保持する。ウェル１１０１２は、例えば、結晶化剤の溶液、標的材料の溶液、または染料のような他の化学試薬を含み得る。底部１１００２は、チップ１１００８の活性領域１１０１１が観察されることを可能にする、窓１１００３を備える。
チップホルダ１１０００の頂部１１０１４は、底部チップホルダ部分１１００２、およびその中に配置されるミクロ流体チップ１１００８の上にフィットする。図示を容易にするために、図８０において、チップホルダ部分１１０１４は、アセンブリにおけるその実際の位置に対して、反転されて示されている。頂部チップホルダ部分１１０１４は、下部ホルダ部分１１００２のねじ穴１１０１０と整列したねじ穴１１０１０を備え、その結果、ねじ１１０１６が、穴１１０１０を通して挿入され得、ホルダ１１０００の部分１１００２と１１０１４との間にチップを固定し得る。チップホルダ上部１１０１４は、チップ１１００８の活性領域１１０１１が観察されることを可能にする、窓１１００５を備える。
頂部ホルダ部分１１０１４の下部表面１１０１４ａは、凹部１１０２４および１１０２６をそれぞれ囲む、隆起した環状リング１１０２０および１１０２２を備える。チップホルダ１１０００の頂部１１０１４が、ねじ１１０１６を利用してチップ１１００８と接触されて圧迫される場合に、リング１１０２０および１１０２２は、チップ１１００８の頂部表面上の柔軟な弾性材料内に押し込まれ、その結果、凹部１１０２４が、ウェル１１０１２の頂部行１１０１２ａを覆う第一のチャンバを規定し、そして凹部１１０２６が、ウェル１１０１２の下部行１１０１２ｂを覆う第二のチャンバを規定する。頂部ホルダ部分１１０１４の側部の穴１１０３０および１１０３２は、それぞれ、凹部１１０２４および１１０２６と連絡しており、正圧が、穴１１０３０および１１０３２にそれぞれ挿入されたピン１１０３４を通してチャンバに付与されることを可能にする。従って、正圧は、行内の全てのウェルに同時に付与され得、各ウェルに対して別個の接続デバイスを利用する必要性を除く。
操作の際に、溶液が、ウェル１１０１２内にピペッティングされ、次いで、チップ１１００８が、ホルダ１１０００の底部１１００２に入れられる。頂部ホルダ部分１１０１４は、チップ１１００８を覆って配置され、そしてねじによって、下方に押される。頂部ホルダ部分１１０１４の下部表面の隆起した環状リング１１０２０および１１０２２が、ウェルが位置するチップの上部表面とのシールを作製する。ウェル内の溶液は、チャンバ内の正圧に曝露され、そしてこれによって、ミクロ流体デバイスの活性領域に押し込まれる。
チップホルダによって付与される下向きの圧力はまた、充填の間の、基板からのチップの層間剥離を防止するという利点を提示し得る。この層間剥離の防止は、より高いプライミング圧力の使用を可能にし得る。
図４４に示されるチップホルダは、本発明に従う構造体の１つのみの可能な実施形態を代表する。
（２．結晶化に影響を与える他の要因に対する制御）
上記結晶化構造体は、適切な結晶化薬剤の体積の導入を介して、標的材料の実施形態を変更することを記載するが、他の多くの要因が、結晶化に関連する。このようなさらなる要因としては、温度、圧力、溶液中の標的材料の濃度、平衡動力学、およびシード材料の存在が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の特定の実施形態において、結晶化の間の温度に対する制御は、先に記載された、複合エラストマー／シリコン構造体を利用して達成され得る。具体的には、Ｐｅｌｔｉｅｒ温度制御構造体が、結晶化チャンバがＰｅｌｔｉｅｒデバイスの近くに来るようにエラストマーがシリコンと整列している、下に重なるシリコン基板において製造され得る。適切な極性および規模の電圧の、Ｐｅｌｔｉｅｒデバイスへの印加は、チャンバ内の溶媒および対溶媒（ｃｏｕｎｔｅｒｓｏｌｖｅｎｔ）の温度を制御し得る。
あるいは、Ｗｕらによって「ＭＥＭＳ Ｆｌｏｗ Ｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ Ｎａｎｏ−ｆｌｕｉｄｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ａ ８９ １５２−１５９（２００１）に記載されるように、結晶化チャンバは、オーム熱を生じる微小機械加工されたレジスタ構造体に電流を選択的に印加することによって、加熱および冷却され得る。さらに、結晶化の温度は、ヒータの抵抗を経時的にモニタリングすることによって、検出され得る。Ｗｕらの論文は、全ての目的で、本明細書中に参考として援用される。
本発明に従う微小作製されたエラストマー結晶化構造体にわたって、温度勾配を確立することもまた、有用であり得る。このような温度勾配は、標的材料を、結晶化の間、広範な温度に曝露し、結晶化のための最適な温度の非常に正確な決定を可能にする。
結晶化の間に圧力を制御することに関して、体積排除による対溶媒の計量供給を使用する本発明の実施形態は、特に有用である。具体的には、一旦、チャンバが適切な体積の溶媒および対溶媒を充填されると、チャンバ入口弁が閉じて維持され、一方で、このチャンバの上に重なる膜が作動され、これによって、このチャンバ内の圧力を上昇させる。体積排除以外の技術を使用する、本発明に従う構造体は、フローチャネルおよび付随する膜を結晶化チャンバに隣接して備えることによって、圧力制御を付与し得、そして具体的には、チャネル内の圧力を制御するように格下げされる。
結晶化に影響を与える別の要因は、溶液中で利用可能な標的材料の量である。結晶形態の場合、この材料は、溶液中に残っている標的材料の量が連続した結晶成長を維持するために授受得分であり得るまで、溶液中で利用可能な標的材料のシンクとして働く。従って、十分に大きい結晶を成長させるためには、結晶化プロセスの間に、さらなる標的材料を提供することが必要であり得る。
従って、図２７Ａ〜２７Ｂに関して先に記載されたセルペン（ｃｅｌｌ ｐｅｎ）構造体は、本発明の実施形態に従う結晶化構造体において有利に使用されて、成長中の結晶をチャンバ内に閉じ込め得る。このことは、成長中の結晶を、さらなる標的材料を提供して
いるフローチャネルから洗い流して、成長中の結晶が廃液内に失われる危険性を除く。
さらに、図２７Ａ〜２７Ｂのセルペン構造体はまた、結晶道程のプロセスの間に有用であり得る。具体的には、塩が、しばしば、サンプルまたは対溶媒中に存在し、そしてこれらの塩は、結晶化の試みの間に、結晶を形成し得る。塩結晶の成長を目的の標的結晶から区別するための１つの一般的な方法は、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによって製造されるＩＺＩＴＴＭのような染色色素に曝露することによる。ＩＺＩＴＴＭ色素は、タンパク質結晶を青色に染色するが、塩結晶を染色しない。
しかし、ＩＺＩＴＴＭ色素を、結晶を保持している結晶化チャンバに流すプロセスにおいて、これらの結晶は、移動され得、一掃され得、そして失われ得る。従って、セルペン構造体が、本発明に従う結晶化構造体および方法においてさらに使用されて、染色プロセスの間、結晶を適所に固定し得る。
図４９は、セルペン概念に基づく、結晶のための選別デバイスの実施形態を示す。具体的には、種々の大きさの結晶８５０１が、選別デバイス８５００の上流のフローチャネル８５０２において形成され得る。選別デバイス８５００は、異なる距離で間隔を空けたピラー８５０６の連続的な行８５０４を備える。分枝チャネル８５１０の入口８５０８が、行８５０４の前方に位置決めされる。結晶８５０１がチャネル８５０２に沿って流れるにつれて、これらの結晶は、ピラー８５０６の行８５０４に遭遇する。最も大きい結晶は、第一の行８５０４ａのピラー８５０６の間のギャップＹの間を通過し得ず、そして行８５０４ａの前に蓄積する。より小さいサイズの結晶は、ピラーの間で連続的により小さくなる間隔を有する連続的な行の前に集められる。一旦、上記の様式で選別されると、先に記載されたような蠕動ポンプ８５１４を利用して、分枝チャネル８５１０を通して流体をポンピングすることによって、種々の大きさの結晶が、チャンバ８５１２内に収集され得る。この選別構造体によって収集される、より大きい結晶は、ｘ線結晶学分析に供され得る。この選別構造体によって収集される、より小さい結晶は、さらなる結晶化の試みにおいて、シード結晶として利用され得る。
結晶の成長に影響を与える別の要因は、シードを入れることである。シード結晶を標的溶液に導入することによって、溶液中の分子が整列し得る温度を提供することによって、結晶の形成が大いに増強され得る。シード結晶が利用可能ではない場合、本発明に従うミクロ流体結晶化方法およびシステムの実施形態は、類似の機能を実施するために、他の構造体を利用し得る。
例えば、上で議論されたように、本発明に従う構造体のチャネルおよびチャンバは、代表的に、微小製造された特徴を含むエラストマー層を、ガラスのような下に重なる基板と接触させては位置することによって、規定される。この基板は、平坦である必要がなく、むしろ、結晶形成を誘導するために計算された大きさおよび／または形状の突出部または奥部を備え得る。本発明の１つの実施形態に従って、下に重なる基板は、規則的な所望の形態を示す好物マトリックスであり得る。あるいは、下に重なる基板は、結晶形成を誘導するように計算された所望の形態または一連の形態を示すために、パターン付けされ得る（すなわち、従来の半導体リソグラフィー技術によって）。このような構造体の表面形態の最適な形態は、標的結晶についての以前の知識によって、決定され得る。
本発明に従う結晶化構造体および方法の実施形態は、従来のアプローチより優れた多数の利点を与える。１つの利点は、極度に小さい体積（ナノリットル／ナノリットル未満）のサンプルおよび結晶化剤が、比較的少量のサンプルを利用して、広範な種々の再結晶条件が使用されることを可能にすることである。
本発明の実施形態に従う結晶化構造体および方法の別の利点は、小さいサイズの結晶化チャンバが、何百、または何千さえもの異なるセットの条件下で、結晶化の試みが同時に実施されることを可能にすることである。再結晶の際に使用される小さい体積のサンプルおよび結晶化剤はまた、価値のある精製された標的材料の最小の廃棄を生じる。
本発明の実施形態に従う結晶化の更なる利点は、操作が比較的単純であることである。具体的には、平行な作動を利用する、流れに対する制御は、少数のみの制御ラインの存在を必要とし、サンプルおよび結晶化剤の導入は、微小加工されたデバイスの操作によって自動的に実施され、多数のサンプルについて、非常に迅速な調製時間を可能にし、サンプル溶液の少ない使用、設定の容易さ、十分に規定された流体界面の作製、平衡動力学に対する制御、およびハイスループットの平行実験を実施する能力というさらなる利点を伴う。これらの利点は、本発明の多数の特徴によって、可能にされる。
ミクロ流体力学は、ナノリットル未満の規模での流体の取り扱いを可能にする。その結果、大きい収容チャンバを使用する必要性がなく、従って、アッセイは、ナノリットルまたはナノリットル未満の規模で実施され得る。極端に小さい体積の利用は、１つの巨視的なフリー界面拡散実験のために必要とされるものと同じサンプル体積を消費して、何千ものアッセイが実施されることを可能にする。このことは、費用のかかる、時間を浪費する増幅工程および精製工程を減少させ、そして容易には発現されない、従って、多量のサンプルから精製されなければならないタンパク質のスクリーニングを可能にする。
ミクロ流体力学は、さらに、調製時間の節約を与える。なぜなら、何百、または何千ものアッセイが、同時に実施され得るからである。先に記載されたような、秤量可能な計量供給技術の使用は、並行実験が、制御機構の複雑さを増加させることなく実施されることを可能にする。
本発明の実施形態に従う結晶化システムのなお別の利点は、溶液並行速度を制御する能力である。結晶成長は、しばしば、非常にゆっくりであり、そしてこの溶液が、平衡化の途中で最適濃度を通過する場合、結晶が形成されない。従って、平衡化の速度を制御し、これによって、中間の濃度で結晶成長を促進することは、有利であり得る。従来の結晶化のアプローチにおいて、ゆっくりにされた平衡化は、蒸気拡散、ゆっくりした透析、および非常に小さい物理的界面のような技術を使用して、達成される。
しかし、本発明の実施形態に従う結晶化は、溶液平行の速度に対する制御を可能にする。体積排除によって結晶化剤を計量供給するシステムにおいて、上に重なる膜は、繰り返し変形し得、各寸法が、さらなる結晶化剤の導入を生じる。体積捕捉によって結晶化剤を計量供給するシステムにおいてサンプルを結晶化剤から分離する弁は、短時間にわたって開かれて、部分的な拡散混合を可能にし得、次いで、閉じられて、中間の濃度でのチャンバ平衡化を可能にする。このプロセスは、最終濃度が達成されるまで繰り返される。体積排除アプローチまたは体積捕捉アプローチのいずれも、中間濃度の全範囲が、単一の反応チャンバを利用して、１回の実験でスクリーニングされることを可能にする。以下に詳細に議論されるように、結晶化プロセスの速度論に対する制御は、サンプルおよび結晶化剤をそれぞれ含むリザーバー内の毛管接続の長さまたは断面積を変化させることによって、制御され得る。
溶液平衡の経時的な操作はまた、より小さい結晶化剤（例えば、塩）に対する高分子（例えば、タンパク質対）の拡散の差示的速度を利用する。大きいタンパク質分子は、塩よりずっとゆっくりと拡散し、界面の弁を迅速に開閉して、結晶化剤の濃度を優位に変化させ、同時に、非常に小さいサンプルは、拡散によって、より大きい体積の結晶化剤中に失われる。さらに、上記のように、すでに記載された多くの結晶化構造体は、異なる時点で同じ反応チャンバ内に異なる結晶化剤を導入することを可能にする。このことは、経時的に変化する溶媒条件を規定する結晶化プロトコルを可能にする。平衡に対する温度制御が、以下で詳細に議論される。
（３．チップ上のタンパク質からの結晶構造の分析）
そのチップの有用性は、低下したコストで高品質回折パターンを迅速に生成するその能力に最終的に依存する。チップ−対−タンパク質構造からの透明な経路は、それゆえに、非常に価値がある。チップ中の結晶から回折データまでのいくつからの経路は、以下で議論される。
チップについての１つのあり得る適用は、従来の技術を使用してその後に再現され得る都合のよい結晶化条件の決定である。そのチップと２つの従来技術（マイクロバッチおよび垂下小滴（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ）との間の対応は、様々である（４５％と８０％との間）ことが示された。しかし、この変動は、そのチップに特有の特徴ではない。これらの広く使用される結晶化技術は、周辺の対応のみを示し（例えば、リゾチームについての１６個の垂下小滴のヒットのうちの１４個は、マイクロバッチ中で存在しない）、しばしば、それらの技術自体の中で変動を示す。最初の結晶化条件をスクリーニングするためのツールとして、そのチップは、多くの有望な条件として同定され得る。
図５２は、３つの異なる技術を使用する、６つの異なるタンパク質サンプル（リゾチーム、グルコースイソメラーゼ、プロテイナーゼＫ、トポイソメラーゼＩＶのＢサブユニット、キシラナーゼ、およびウシ膵臓トリプシン）に対して生成されるヒット数の比較を示す。図５２において、結晶、微結晶、ロッドおよび針のみがヒットとして計数される一方で、球粒（ｓｐｈｅｒｕｌｉｔｅ）および沈澱は、計数されない。プロテイナーゼＫに関するデータは、ＰＭＳＦありまたはＰＭＳＦなしでの実験の合計であり、トポイソメラーゼＶＩのＢサブユニットに関するデータは、垂下小滴データがないので含めなかった（そのチップ（Ｃｈｉｐ）は、この場合においてマイクロバッチを遙かにしのぐにも拘わらず）。図５２を調べると、６つの場合のうちの４つにおいて、そのチップは、いずれの従来の方法よりもより多くのヒットをもたらしたことを示す。
そのチップの生産性のあり得る理由を同定するために、結晶化方法の間の差異を理解するために、本発明者らは、その３つの方法は、短時間スケールおよび長時間スケールの両方に対して異なる熱力学的条件をもたらすことを認識しなければならない。タンパク質結晶化を誘導するために、その結晶化をエネルギー的に好都合にされなければならず（過飽和条件）、これらの条件を結晶の成長が生じるに十分長く維持されなければならない。
過飽和の異なる程度もまた存在する。低い過飽和において、結晶の成長は、支持される傾向がある一方で、新たな結晶の核形成は、起こる可能性が比較的低い。高い過飽和において、核形成は迅速であり、多くの小さな低品質の結晶がしばしば形成され得る。ここで考慮されるその３つの方法において、その過飽和条件は、タンパク質および対溶媒（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｏｌｖｅｎｔ）の相対濃度および絶対濃度の操作を通じて達成される。
その３つの方法の位相空間の進展／平衡化の比較は、図５７に示される。そのマイクロバッチ技術に関して、２つの溶液の混合は、迅速であり、非透過性油層下で維持される場合、有意な濃縮は、時間がたってもほとんど起こらない。従って、マイクロバッチは、位相空間において単一の点のみをサンプリングする傾向があり、経時的にほぼ同じ条件を維持する。
垂下小滴は、２つの溶媒を迅速に混合して、マイクロバッチのように始まるが、次いで、より多くの濃縮された塩／沈澱物レザバを有する蒸気平衡化に起因して、より長い時間スケール（数時間から数日）で濃縮を受ける。その小滴の蒸発脱水の間に、タンパク質対沈殿剤の比は、一定のままである。
ミクロ流体フリー界面拡散（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｒｅｅ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）の記載において以下に詳細に記載されるように、短時間スケールにおいて、そのチップの動力学は、フリー界面拡散実験に最もよく似ている。混合は緩慢であり、種平衡化（タンパク質／沈澱剤／タンパク質／塩）の速度は、種の拡散定数に依存する。塩のような低分子は、より大きな拡散定数を有し、従って、迅速に平衡化する。高分子（例えば、タンパク質）は、小さな拡散定数を有し、よりゆっくりと平衡化する。
キャピラリー中のフリー界面拡散の結晶化技術は、そのチップ結果により近く匹敵し得る。伝統的に、この方法は、十分に規定された界面を信頼性高く設定する困難性に起因して、それほどの頻度では使用されない。しかし、ミクロ流体環境において、信頼性の高いフリー界面拡散実験を確立することは比較的容易である。ミクロ流体フリー界面の形成のさらなる議論は、以下に提示される。結晶化チップの別の適用において、結晶は、従来の方法を使用して回収するために成長させ得る。
高品質結晶がチップで成長され得、そのチップから抽出され得る場合、結晶化方法は、エクスポートされる必要はない。そのチップは、ガラス基材から除去され得るので、タンパク質結晶を抽出することは可能である。
上記で記載されるように、いったんタンパク質結晶が形成されると、その三次元構造についての情報は、その結晶によるｘ線の回折から得られ得る。しかし、非常にエネルギーが高い放射線をそのタンパク質に適用することによって、熱を発する傾向がある。Ｘ線はまたイオン化して、フリーラジカルおよび破壊された結合の生成を生じ得る。熱またはイオン化のいずれかが、結晶が入射ｘ線を回折する能力を破壊または分解し得る。
従って、結晶の形成に際して、低温物質は、代表的には、その結晶性物質をその変化した状態で保つために添加される。しかし、低温液体（ｃｒｙｏｇｅｎ）を突然添加すると、結晶を傷つけることもある。従って、本発明に従う結晶化チップの実施形態にとって、いったん結晶性物質がそこで形成された後に結晶化チャンバに低温液体を直接添加することを可能にすることは有利である。
さらに、タンパク質結晶は、非常に繊細であり、物理的外傷に応じて急激に砕け得るかまたは崩壊し得る。従って、チップの小さなチャンバから無傷の結晶を採取することによって、潜在的障害がその結晶性材料についての価値ある情報の獲得を引き起こす。
従って、本発明に従う結晶化チップの代替的実施形態にとって、チップ中に形成される結晶性材料のｘ線照射による直接的質問を可能にし、それによって、別個の結晶採取手順の必要性を完全に不要にすることもまた有利である。
従って、図５３Ａは、本発明に従う結晶成長チップの簡略化した実施形態の平面図を示す。図５３Ｂは、図５３Ａに示された結晶成長チップの実施形態の線Ｂ−Ｂ’に沿った簡略化した断面図を示す。
採取／成長チップ９２００は、ガラス基材９２０４を覆うエラストマー部分９２０２を含む。ガラス基材９２０４は、３つのエッチングされたウェル９２０６ａ、９２０６ｂおよび９２０６ｃを計算する。エラストマー部分９２０２をガラス基材９２０４の上に配置することによって、フローチャネル９２０８を通って違いと流体連絡状態にある３つの対応するチャンバが規定される。フローチャネル９２０８を通る物質の流れは、制御チャネル９２０８に制御ライン９２１２が重なり合うことによって規定されるバルブ９２１０によって制御される。
成長／採取チップ９２００の操作の間に、バルブ９２１０は、チャンバ９２０６ａ、９２０６ｂおよび９２０６ｃの内容間の接触を防止するように、最初に作動される。チャンバ９２０６ａ、９２０６ｂおよび９２０６ｃは、次いで、結晶化をもたらすために異なる物質で、ウェル９２１４を通って別個に充填される。例えば、チャンバ９２０６ａは、タンパク質溶液で充填され得、チャンバ９２０６ｂは、結晶化剤で充填され得、チャンバ９２０６ｃは、低温液体で充填され得る。
その第１の制御ライン９２１２は、次いで、バルブ９２１０ａを開放するように作動停止（ｄｅａｃｔｉｖａｔｅ）され得、それによって、タンパク質溶液および結晶化剤の拡散を可能にする。結晶９２１６の形成に際して、残りの制御ライン９２１２は、作動停止されて、チャンバ９２０６ｃからの低温液体の拡散が可能になり、結晶９２１６が保たれ得る。
次に、チップ全体９２００は、ｘ線回折装置に取り付けられ得、ｘ線ビーム９２１８が、供給源９２２０から結晶９２１６に対して適用され、検出器９２２２によって回折が検知される。図５３Ｂに示されるように、ウェル９２０６の普通の位置は、エラストマー部分９２０２および下にあるガラス部分９２０４の両方の厚みが減少した領域に対応する。このようにして、放射線ビーム９２１８は、結晶９２１６に遭遇する前およびその後に、最小量のエラストマーおよびガラス材料を横断することが必要であり、それによって、受容される回折シグナルに対するノイズの悪影響を低下させる。
タンパク質成長／採取チップの一例は、図５３Ａ〜Ｂに関連して上記で記載されているが、本発明に従う実施形態は、この特定の構造に限定されない。例えば、記載されているこの実施形態は、マイクロチャンバがエッチングされているガラス基材を利用するが、本発明に従うミクロ流体構造の製造は、ガラス基材の利用に限定されない。基材において外形を製造するためのあり得る選択肢としては、プラスチックの射出成形、プラスチック（例えば、ＰＭＭＡ）の熱エンボス加工または光硬化性ポリマー（例えば、ＳＵ８フォトレジスト）を利用するウェルの製作が挙げられる。
さらに、外形は、レーザー切除を利用して基材（例えば、ガラス）上に形成され得るか、または外形は、ガラス以外の基材（例えば、シリコン）の等方性（ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ）エッチングもしくは異方性（ａｎｉｏｓｏｔｒｏｐｉｃ）エッチングによって形成され得る。
代替の製造方法によって付与される潜在的な利点としては、より密な一体化を可能にする外形のより正確な規定、および製造（例えば、エンボス加工）が容易であることが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、特定の材料（例えば、炭素ベースのプラスチック）は、ｘ線の散乱の発生が少なく、それによって、チップから直接回折データを収集することが容易になる。
結晶採取についてのさらなる可能性は、チップから除去する（ｏｆｆ−ｌｏａｄ）方法を有することである。一旦結晶が形成された後に、または代わりにインキュベーションの前に、除去が行われ得る。これらの除去された結晶は、次いで、巨視的反応を導入するために使用され得るか、または抽出および低温ループに置かれ得る。テイオン流体の添加のための方法もまた開発されれば、その結晶は、急速凍結され得、ｘ線ビームに直接取り付けられ得る。
（４．平衡化に対する一時的制御）
結晶の成長および品質は、平衡化の間に調査される熱力学的条件のみならず、平衡化が起こる速度によっても決定される。従って、平行の動力学を制御することは潜在的に価値がある。
従来の結晶化方法の過程において、平衡化の動力学に対する制御のみが、最初の条件の操作を通じて利用可能であり得る。巨視的なフリー界面拡散について、一旦拡散が開始すると、実験者は、その後の平行加速度に対する制御を有さない。垂下小滴実験について、その平衡化速度は、最初の小滴の大きさ、レザバの全体のサイズ、またはインキュベーションの温度を変えることによって変更され得る。マイクロバッチ実験において、そのサンプルが濃縮される速度は、その小滴の大きさ、ならびに周辺の油の正体および量によって変化され得る。その平衡化速度は、これらのパラメーターに複雑な様式で依存するので、その平衡化の動力学は、精密でない様式で変化され得るに過ぎない。さらに、一旦その実験が開始してしまうと、その平衡化の動力学に対するさらなる制御は、不能である。
対照的に、ゲートが設けられた（ｇａｔｅｄ）４−Ｆｉｂ実験におけるその流体界面は、反応チャンバの寸法および接続チャネルの寸法の操作によって制御され得る。より良好な近似値になるまで、平衡化に要する時間は、必要とされる拡散の長さとして変化する。平衡化速度はまた、その接続チャネルの断面積に依存する。平衡化に必要とされる時間は、従って、その長さ、および接続チャネルの断面積の両方を変化させることによって制御され得る。
図３８Ａは、３セットの化合物チャンバ９８００、９８０２、および９８０４の対を示し、各対は、異なる長さΔｘのマイクロチャネル９８０６によって接続される。図３８Ｂは、平衡化時間 対 平衡化距離をプロットする。図３８Ｂは、図３８Ａのチャンバの平衡化に要する時間が、接続チャネルの長さに従って変化することを示す。
図３９は、４つの化合物チャンバ９９００、９９０２、９９０４、および９９０６を示し、各々、接続マイクロチャネル９９０８の異なる配置を有する。マイクロチャネル９９０８は、同じ長さを有するが、断面積および／または接続チャネルの数が異なる。平衡化の速度は、そのようにして、断面積を減少／増大させることによって（例えば、接続チャネルの数またはそれらのチャネルの寸法を減少／増大させることによって）、増大／減少され得る。
接続チャネルの外形を減価させることによって、平衡化の速度の変化は、結晶成長に対する平衡化動力学の効果を調査するために単一のデバイスで使用され得る。図３７Ａ〜Ｄは、微小自由化胃面からの２つの溶液の部分的拡散平衡により最初に確立された濃度勾配が、封じ込めバルブの作動によって維持され得る実施形態を示す。
図３７Ａは、別個に作動される界面バルブ１０００４のいずれかの側面に配置される複数のチャンバ（Ａ〜Ｇ）を規定するために、フォーク状制御チャネル１０００２によって間隔を空けて重なり合うフローチャネル１００００を示す。図３７Ｂは、界面バルブ１０００４が作動され、フローチャネルの最初の半分１００００ａが第２の溶液と混合され、そのフローチャネルの第２の半分１００００ｂに第２の溶液が入れられた場合の初期時間における溶媒濃度をプロットする。図３７Ｃは、制御チャネル１０００２が、その特定の時点での濃度勾配を捕捉するその７つのチャンバ（Ａ〜Ｇ）を規定するように作動される場合、その後の時間Ｔ１での溶媒濃度をプロットする。図３７Ｄは、時間Ｔ１でのでのチャンバ（Ａ〜Ｇ）の相対濃度をプロットする。
図３７Ａに示される実施形態において、フォーク状制御チャネルの作動は、その複数のチャンバＡ〜Ｇを同時に作り出す。しかし、これは必須ではなく、本発明の代替的実施形態において、複数の制御チャネルは、異なる時間間隔でチャンバＡ〜Ｇを独立して作り出し、それによって、最初のチャンバセットがフリー界面にすぐ隣接してつく理恵出された後にさらなる拡散を起こすことを可能にするように利用され得る。
２つの流体間の濃度勾配を捕捉する方法の一実施形態は、ミクロ流体チャネル内に存在するエラストマー膜の第１の側面に第１の流体を提供すること、およびそのエラストマー膜の第２の側面に第２の流体を提供することを包含する。そのエラストマー膜は、その第１の流体と第２の流体との間のミクロ流体フリー界面を規定するために、ミクロ流体チャネルから置き換えられる。その第１の流体およびその第２の流体は、ミクロ流体フリー界面を横断して拡散するようにされる。そのミクロ流体フリー界面からの増大する距離において流動チャネルに沿って配置されるエラストマーバルブの群は、その第１の流体および第２の流体の相対濃度が、ミクロ流体フリー界面を横断して拡散する時間を反映するチャンバの連続を規定するように作動される。
（５．標的物質）
結晶化のための標的は多様である。結晶化のための標的は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）成体高分子（サイトゾルタンパク質、細胞外タンパク質、膜タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの複雑な組み合わせ）、２）翻訳前に修飾された生体分子および翻訳後に修飾された生体分子（リン酸化、スルホン化、グルコシル化、ユビキチン化などのタンパク質、およびハロゲン化、脱塩基化（ａｂａｓｉｃ）、アルキル化などの核酸、が挙げられるが、これらに限定されない）；３）意図的に誘導した高分子（例えば、重原子で標識したＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質（およびそれらの複合体）、セレノメチオニンで標識したタンパク質および核酸（およびそれらの複合体）、ハロゲン化したＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質（およびそれらの複合体）、４）ウイルス全体または巨大な細胞粒子（例えば、リボソーム、レプリソーム、スプライセオソーム、チューブリンフィラメント、アクチンフィラメント、染色体など）、５）低分子化合物（例えば、薬物、リード化合物、リガンド、塩および有機化合物または金属有機化合物、ならびに６）低分子／生体高分子複合体（例えば、薬物／タンパク質複合体、酵素／基質複合体、酵素／産物複合体、酵素／レギュレーター複合体、酵素／インヒビター複合体およびそれらの組み合わせ）。このような標的は、生物学、生化学、物質科学、薬学、化学および物理学を含む広範な科学分野について研究の目標である。
可能なタンパク質修飾の非排他的な列挙は、以下の通りである：５’脱リン酸；デスモシン（リジンから）；分解されたカルボキシメチル化メチオニン；オルニチン（アルギニンから）；リシノアラニン（システインから）；ランチオニン（システインから）；デヒドロアラニン（システインから）；ＣＮＢｒ処理によってＭｅｔから形成されたホモセリン；脱水（−Ｈ２Ｏ）；Ｓ−γ−グルタミル（システインに架橋）；Ｏ−γ−グルタミル−（セリンに架橋）；セリンからデヒドロアラニン；アラニノヒスチジン（ヒスチジンのθ炭素またはπ炭素に架橋したセリン）；Ｇｌｎから形成されたピログルタミン酸；Ｎ−ピロリドンカルボニル（Ｎ末端）；Ｎα−（γ−グルタミル）−リジン；Ｎ−（β−アスパルチル）−リジン（架橋）；３，３’，５，５’−ＴｅｒＴｙｒ（架橋）；ジスルフィド結合形成（シスチン）；Ｓ−（２−ヒスチジル）−（システインに架橋）；Ｓ−（３−Ｔｙｒ）（システインに架橋）；３，３’−ＢｉＴｙｒ（架橋）；イソジＴｙｒ（架橋）；アリシン（リジンから）；アミド形成（Ｃ末端）；アスパラギンおよびグルタミンの、アスパラギン酸およびグルタミン酸への脱アミド化；シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）（アルギニンから）；シンデシン（ｓｙｎｄｅｓｉｎｅ）（リジンから）；メチル化（Ｎ末端、リジンのＮε、セリンのＯ、スレオニンまたはＣ末端、アスパラギンのＮ）；δ−ヒドロキシ−アリシン（リジンから）；ヒドロキシル化（リジンのδＣ、トリプトファンのβＣ、プロリンのＣ３またはＣ４、アスパラギン酸のβＣ）；メチオニンの酸化（スルホキシドに）；スルフェン酸（システインから）；ピルボイル−（セリン）；３，４−ジヒドロキシ−フェニルアラニン（チロシンから）（ＤＯＰＡ）；ナトリウム；エチル；Ｎ，Ｎジメチル化（アルギニンまたはリジン）；２，４−ビスＴｒｐ−６，７−ジオン（トリプトファンから）；ホルミル化（ＣＨＯ）；６，７ジオン（トリプトファンから）；３，４，６−トリヒドロキシ−フェニルアラニン（チロシンから）（ＴＯＰＡ）；３，４−ジヒドロキシル化（プロリン）；メチオニンの酸化（スルホンに）；３−塩素化（３５Ｃｌを用いてチロシン）；３−塩素化（３７Ｃｌを用いてチロシン）；カリウム；カルバミル化；アセチル化（Ｎ末端、リジンのＮε、セリンのＯ）（Ａｃ）；Ｎ−トリメチル化（リジン）；グルタミン酸のγカルボキシル化またはアスパラギン酸のβカルボキシル化；二ナトリウム；ニトロ（ＮＯ２）；ｔ−ブチルエステル（ＯｔＢｕ）およびｔ−ブチル（ｔＢｕ）；グリシル（−Ｇ−、−Ｇｌｙ−）；カルボキシメチル（システイン上）；ナトリウム＋カリウム；セレノシステイン（セリンから）；３，５−ジクロロ化（３５Ｃｌを用いてチロシン）；デヒドロアラニン（Ｄｈａ）；３，５−ジクロロ化（３５Ｃｌと３７Ｃｌとの混合物を用いてチロシン）；ピルビン酸；アクリルアミジルまたはアクリルアミド付加体；サルコシル；アラニル（−Ａ−、−Ａｌａ−）；アセトアミドメチル（Ａｃｍ）；３，５−ジクロロ化（３７Ｃｌを用いてチロシン）；Ｓ−ｓｎ−１−グリセリル）（システイン上）；グリセロールエステル（グルタミン酸側鎖上）；グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）；βメルカプトエタノール付加体；フェニルエステル（ＯＰｈ）（酸性）；３−ブロモ化（７９Ｂｒを用いてチロシン）；リン酸化（セリン、スレオニン、チロシンおよびアスパラギン酸のＯ、リジンのＮε）；３−ブロモ化（８１Ｂｒを用いてチロシン）；スルホン化（ＳＯ３Ｈ）（ＰＭＣ基）；硫酸化（チロシンのＯ）；シクロヘキシルエステル（ＯｃＨｅｘ）；ホモセリルラクトン；デヒドロアミノ酪酸（Ｄｈｂ）；γアミノブチリル；２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）；２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ジアミノプロピオニル；ｔ−ブチルオキシメチル（Ｂｕｍ）；Ｎ−（４−ＮＨ２−２−ＯＨ−ブチル）−（リジン）（ハイプシン）；セリル（−Ｓ−、−Ｓｅｒ−）；ｔ−ブチルスルフェニル（ＳｔＢｕ）；アラニン（Ａ、Ａｌａ）；サルコシン（Ｓａｒ）；アニシル；ベンジル（Ｂｚｌ）およびベンジルエステル（ＯＢｚｌ）；１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）；デヒドロプロリル；トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＮＳｕ、ＯＳｕ）；プロリル（−Ｐ−、−Ｐｒｏ−）；バリル（−Ｖ−、−Ｖａｌ−）；イソバリル（−Ｉ−、−Ｉｖａ−）；ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）；スレオイル（−Ｔ−、−Ｔｈｒ−）；ホモセリル（−Ｈｓｅ−）；シスチル（−Ｃ−、−Ｃｙｓ−）；ベンゾイル（Ｂｚ）；４−メチルベンジル（Ｍｅｂ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；ＨＭＰ（ヒドロキシメチルフェニル）リンカー；チオアニシル；チオクレシル；ジフタミド（ｄｉｐｈｔｈａｍｉｄｅ）（ヒスチジンから）；ピログルタミル；２−ピペリジンカルボン酸（Ｐｉｐ）；ヒドロキシプロリル（−Ｈｙｐ−）；ノルロイシル（−Ｎｌｅ−）；イソロイシル（−Ｉ−、−Ｉｌｅ−）；ロイシル（−Ｌ−、−Ｌｅｕ−）；オルニチル（−Ｏｒｎ−）；アスパラギル（−Ｎ−、−Ａｓｎ−）；ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；アスパルチル（−Ｄ−、−Ａｓｐ−）；スクシニル；バリン（Ｖ、Ｖａｌ）；ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル（ＨＯＢｔ）；ジメチルベンジル（ｄｉＭｅＢｚｌ）；トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；システイニル化；ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）；ｐ−メトキシベンジル（Ｍｏｂ、Ｍｂｚｌ）；４−ニトロフェニル、ｐ−ニトロフェニル（ＯＮｐ）；システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）；クロロベンジル（ＣｌＢｚｌ）；ヨウ素化（ヒスチジン［Ｃ４］またはチロシン［Ｃ３］）；グルタミル（−Ｑ−、−Ｇｌｎ−）；Ｎ−メチルリジル；リジル（−Ｋ−、−Ｌｙｓ−）；Ｏ−メチルアスパルタミル；グルタミル（−Ｅ−、−Ｇｌｕ−）；Ｎα−（γ−グルタミル）−Ｇｌｕ；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ヒドロキシアスパルタミル；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）；ｂｂ−ジメチルシステニル；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；メチオニル（−Ｍ−、−Ｍｅｔ−）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；ペントース（Ａｒａ、Ｒｉｂ、Ｘｙｌ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；Ｄｍｏｂ（ジメトキシベンジル）；ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）；アダマンチル（Ａｄａ）；ｐ−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）；ヒスチジル（−Ｈ−、−Ｈｉｓ−）；Ｎ−メチルグルタミル；Ｏ−メチルグルタミル；ヒドロキシリジル（−Ｈｙｌ−）；メチルメチオニル；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；アミノエチルシステニル；ペントシル；デオキシヘキソース（Ｆｕｃ、Ｒｈａ）；リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）；アミノエチルシステニル（−ＡＥＣｙｓ−）；４−グリコシルオキシ−（ペントシル、Ｃ５）（プロリン）；メチオニルスルホキシド；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；フェニルアラニル−（−Ｆ−、−Ｐｈｅ−）；ピリジルアラニル；フルオロフェニルアラニル；２−ニトロベンゾイル（ＮＢｚ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；３−メチルヒスチジル；２−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）；４−トルエンスルホニル（トシル、Ｔｏｓ）；３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；３，５−ジブロモ化（７９Ｂｒを用いてチロシン）；アルギニル（−Ｒ−、−Ａｒｇ−）；シトルリン；３，５−ジブロモ化（７９Ｂｒおよび８１Ｂｒの混合物を用いてチロシン）；ジクロロベンジル（Ｄｃｂ）；３，５−ジブロモ化（８１Ｂｒを用いてチロシン）；カルボキシアミドメチルシステニル；カルボキシメチルシステニル；メチルフェニルアラニル；ヘキソースアミン（ＧａｌＮ、ＧｌｃＮ）；カルボキシメチルシステイン（Ｃｍｃ）；Ｎ−グルコシル（リジンのＮ末端またはＮε）（アミノケトース）；Ｏ−グリコシル−（セリンまたはスレオニン）；ヘキソース（Ｆｒｕ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、Ｍａｎ）；イノシトール；メチオニルスルホン；チロシニル（−Ｙ−、−Ｔｙｒ−）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）；ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）；ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）；ホスホセリル；２−クロロベンジルオキシカルボニル（ＣＩＺ）；ナフチルアセチル（ｎａｐｔｈｙｌ ａｃｅｔｙｌ）；イソプロピルリジル；Ｎ−メチルアルギニル、エタンジチオール（ｅｔｈａｎｅｄｉｔｏｈｉｏｌ）／ＴＦＡ環式付加体；カルボキシグルタミル（Ｇｌａ）；アセトアミドメチルシステニル；アクリルアミジルシステニル；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；Ｎ−グルクロニル（Ｎ末端）；デルタ−グリコシルオキシ−（リジン）またはβ−グリコシルオキシ−（フェニルアラニンおよびチロシン）；４−グリコシルオキシ−（ヘキソシル、Ｃ６）（プロリン）；ベンジルセリル；Ｎ−メチルチロシニル；ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル（４Ｎｚ）；２，４，５−トリクロロフェニル；２，４，６−トリメチルオキシベンジル（Ｔｍｏｂ）；キサンチル（Ｘａｎ）；ホスホスレオニル；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；クロロフェニルアラニル；メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）；カルボキシメチルリジル；トリプトファニル（−Ｗ−、−Ｔｒｐ−）；Ｎ−リポイル−（リジン上）；マトリックスαシアノＭＨ＋；ベンジルスレオニル；ベンジルシステニル；ナフチルアラニル；スクシニルアスパルタミル；スクシンイミドフェニルカルボ・・・；ＨＭＰ（ヒドロキシメチルフェニル）／ＴＦＡ付加体；Ｎ−アセチルヘキソースアミン（ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；シスチン（（Ｃｙｓ）２）；ファルネシル化；Ｓ−ファルネシル−；ミリストレイル化（１つの二重結合を有するミリストイル）；ピリジルエチルシステニル；ミリストイル化；４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）；２−ブロモベンジルオキシカルボニル（ＢｒＺ）；ホルミルトリプトファニル；ベンジルグルタミル；アニソール付加グルタミル；Ｓ−システニルシステニル；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）；リポ酸（リジンへのアミド結合）；ビオチニル化（リジンへのアミド結合）；ジメトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）；Ｎ−ピリドキシル（リジン上）；ピリドキサルリン酸（リジンから形成されるシッフ塩基）；ニコチニルリジル；ダンシル（Ｄｎｓ）；２−（ｐ−ビフェニル）イソプロピル−オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）；パルミトイル化；「トリフェニルメチル（トリチル、Ｔｒｔ）」；チロシニルスルフェート；ホスホチロシニル；Ｐｂｆ（ペンタメチルジヒドロベンゾフランスルホニル）；３，５−ジヨード化（チロシン）；「３，５−ジ−Ｉ」；Ｎα−（γ−グルタミル）−Ｇｌｕ２；Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホリル化（セリン）；「２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）」；ステアロイル化；ゲラニルゲラニル化；Ｓ−ゲラニルゲラニル；５’ｐｈｏｓ ｄシチジニル；ヨードチロシニル；アルドヘキソシルリジル；シアリル；Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸、ＮｅｕＡｃ、ＮＡＮＡ、ＳＡ）；５’ｐｈｏｓ ｄチミジニル；５’ｐｈｏｓシチジニル；グルタチオン化；Ｏ−ウリジニル化（チロシン）；５’ｐｈｏｓウリジニル；Ｓ−ファルネシルシステニル；Ｎ−グリコールノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）；５’ｐｈｏｓ ｄアデノシル；Ｏ−パンテテインリン酸化（セリン）；ＳｕｃＰｈｅｎｃａｒｂリジル；５’ｐｈｏｓ ｄグアノシル；５’ｐｈｏｓアデノシニル；Ｏ−５’−アデノシル化（チロシン）；４’−ホスホパンテテイン；ＧＬ２；Ｓ−パルミチルシステニル；５’ｐｈｏｓグアノシル；ビオチニルリジル；Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ；Ｎα−（γ−グルタミル）−Ｇｌｕ３；ジオクチルフタレート；ＰＭＣリジル；アエダンス（Ａｅｄａｎｓ）システニル；ジオクチルフタレートナトリウム付加体；ジヨードチロシニル；ＰＭＣアルギニル；Ｓ−補酵素Ａ；ＡＭＰリジル；３，５，３’−トリヨードサイロニン；（チロシンから）；Ｓ−（ｓｎ−１−ジパルミトイル−グリセリル）−（システイン上）；Ｓ−（ＡＤＰ−リボシル）−（システイン上）；Ｎ−（ＡＤＰ−リボシル）−（アルギニン上）；Ｏ


−ＡＤＰ−リボシル化（グルタミン酸またはＣ末端上）；ＡＤＰ−リボシル化（ＮＡＤから）；Ｓ−フィコシアノビリン（システイン上）；Ｓ−ヘム（システイン上）；Ｎθ−（ＡＤＰ−リボシル）ジフタミド（ヒスチジン）；ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ；ＭＧＤＧ；Ｏ−８α−フラビン（［ＦＡＤ］）−（チロシン）；Ｓ−（６−フラビン［ＦＡＤ］）−（システイン上）；ＮθおよびＮπ−（８α−フラビン）（ヒスチジン上）；（Ｈｅｘ）３−ＨｅｘＮＡｃ−ＨｅｘＮＡｃ；（Ｈｅｘ）３−ＨｅｘＮＡｃ−（ｄＨｅｘ）ＨｅｘＮＡｃ。
可能な核酸改変（例えば、塩基特異的改変、糖特異的改変、またはリン特異的改変）の非排他的な一覧は、以下の通りである：ハロゲン化（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）：無塩基部位；アルキル化；架橋可能な付加物（例えば、チオールまたはアジド）；チオール化；脱アミド；蛍光基標識、およびグリコシル化。
可能な重原子誘導体化剤の非排他的な一覧は、以下の通りである：ヘキサクロロイリジウム酸（ＩＩＩ）カリウム；ヘキサクロロイリジウム酸（ＩＶ）カリウム；ヘキサクロロイリジウム酸（ＩＶ）ナトリウム；ヘキサクロロイリジウム酸（ＩＩＩ）ナトリウム；ヘキサニトリトイリジウム酸（ＩＩＩ）カリウム；ヘキサクロロイリジウム酸（ＩＩＩ）アンモニウム；塩化イリジウム（ＩＩＩ）；ヘキサニトラトイリジウム酸（ＩＩＩ）カリウム；臭化イリジウム（ＩＩＩ）；塩化バリウム（ＩＩ）；酢酸バリウム（ＩＩ）；硝酸カドミウム（ＩＩ）；ヨウ化カドミウム（ＩＩ）；硝酸鉛（ＩＩ）；酢酸鉛（ＩＩ）；塩化トリメチル鉛（ＩＶ）；酢酸トリメチル鉛（ＩＶ）；ヘキサクロロ鉛酸（ＩＶ）アンモニウム；塩化鉛（ＩＩ）；ヘキサクロロロジウム酸（ＩＩＩ）ナトリウム；酢酸ストロンチウム（ＩＩ）；チオマロナト金酸（Ｉ）二ナトリウム；ジシアノ金酸（Ｉ）カリウム；ジシアノ金酸（Ｉ）ナトリウム；チオスルファト金酸（ＩＩＩ）ナトリウム；テトラシアノ金酸（ＩＩＩ）カリウム；テトラクロロ金酸（ＩＩＩ）カリウム；テトラクロロ金酸（ＩＩＩ）水素；テトラクロロ金酸（ＩＩＩ）ナトリウム；テトラヨード金酸（ＩＩＩ）カリウム；テトラブロモ金酸（ＩＩＩ）カリウム；（アセタト−ｏ）メチル水銀；メチル（ニトラト−ｏ）水銀；クロロメチル水銀；ヨードメチル水銀；クロロエチル水銀；メチル水銀カチオン；トリエチル（ｍ３−ホスファト（３−）−Ｏ，Ｏ’，Ｏ’’）トリ水銀ｅｔｈ；［３［（アミノカルボニル）アミノ］−２−メトキシプロピル］クロム；１，４ジアセトキシ水銀２−３ジメトキシブタン；メトキシル（ｍｅｒｏｘｙｌ）マーキュヒドリン；テトラキス（アセトキシ水銀）−メタン；１，４ビス（クロロ水銀）−２，３−ブタンジオール；ジアセトキシ水銀クロロ酢酸エチル（ｄａｍｅ）；酸化水銀（ＩＩ）；メチル水銀−２−メルカプトエタノール；３，６ビス（水銀メチルジオキサン酢酸）；エチル水銀カチオン；Ｂｉｌｌｍａｎ’ｓ ｄｉｍｅｒｃｕｒｉａｌ；パラクロロ水銀フェニルアセテート（ｐｃｍａ）；水銀フェニルグリオキサル（ｍｐｇ）；Ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ、チオサリチル酸エチル水銀［ｅｍｔｓ］；４−クロロマーキュリベンゼンスルホン酸（４−ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；２，６ジクロロ水銀−４−ニトロフェノール（ｄｃｍｎｐ）；［３−［［２（カルボキシメトキシ）ベンゾイル］アミノ（ｍｉｎｏ）−２メトキシｐｒｏｐ；パラクロロ水銀ベンゾエート（ｐｃｍｂ），４−クロロ水銀；（アセタト−ｏ）フェニル水銀；安息香酸フェニル水銀（ｐｍｂ）；パラヒドロキシ水銀ベンゾエート（ｐｈｍｂ）；イミドコハク酸水銀／水銀スクシンイミド；３−ヒドロキシ水銀ベンズアルデヒド；２−アセトキシ水銀スルファニルアミド（ｓｕｌｈｐａｎｉｌａｍｉｄｅ）；３−アセトキシ水銀−４アミノベンゼンスルホンアミド；メチル水銀チオグリコール酸（ｔｈｉｏｃｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（ｍｍｔｇａ）；２−ヒドロキシ水銀−トルエン−４−スルホン酸（ｈｍｔｓ）；アセトアミノフェニル水銀アセテート（ａｐｍａ）；［３−［（アミノカルボニル）アミノ］−３−メトキシプロピル２−クロロ；パラ−ヒドロキシ水銀ベンゼンスルホネート（ｐｈｍｂｓ）；オルト−クロロ水銀フェノール（ｏｃｍｐ）；ジアセトキシ水銀ジプロピレンジオキシド（ｄｍｄｘ）；パラ−アセトキシ水銀アニリン（ｐａｍａ）；（４−アミノフェニル）クロロ水銀；アニリン水銀カチオン；３−ヒドロキシ−水銀−ｓスルホサリチル酸（ｍｓｓｓ）；３または５ヒドロキシ水銀サリチル酸（ｈｍｓａ）；ジフェニル水銀；２，６ジアセトキシ水銀メチル１−４チオキサン（ｄｍｍｔ）；２，５−ビス（ｂｌｓ）（クロロ水銀）フラン；オルトクロロ水銀ニトロフェノール（ｏｃｍｎｐ）；５−水銀デオキシウリジンモノ硫酸；サリチル酸水銀；［３−［［２−（カルボキシメトキシ）ベンゾイル］アミノ−２−メトキシｐｒｏ；３，３ビス（ヒドロキシ水銀）−３−ニトラト水銀ピルビン酸（ｐｙｒｕｖｉｃ）；３−クロロ水銀ピリジン；３，５ビスアセトキシ水銀メチルモルホリン；オルト−水銀フェノールカチオン；パラ−カルボキシメチルメルカプト水銀ベンゼンスルホニル；パラ−水銀ベンゾイルグルコサミン；３アセトオシ水銀（ａｃｅｔｅｔｏｘｙｍｅｒｃｕｒｉ）−５−ニトロサリチルアルデヒド（ｍｓａ）；テトラクロロ水銀（ＩＩ）アンモニウム；テトラチオシアナト水銀（ＩＩ）カリウム；テトラチオシアナト水銀（ＩＩ）ナトリウム；テトライソチオシアナト水銀（ＩＩ）カリウム；テトラヨード（ｔｅｔｒａｉｄｏ）水銀（ＩＩ）カリウム；テトラチオシアナト水銀（ＩＩ）アンモニウム；テトラブロモ水銀（ＩＩ）カリウム；テトラシアノ水銀（ＩＩ）カリウム；臭化水銀（ＩＩ）；チオシアン酸水銀（ＩＩ）；シアン化水銀（ＩＩ）；ヨウ化水銀（ＩＩ）；塩化水銀（ＩＩ）；酢酸水銀（ＩＩ）；酢酸水銀（Ｉ）；ジクロロジアミノ水銀（ＩＩ）；β水銀−メルカプトエチルアミン塩酸；硫酸水銀（ＩＩ）；水銀（ＩＩ）クロロａｎｉｌａｔｅ；酢酸二水銀；クロロ（２−オキソエチル）水銀；硝酸フェノール水銀；メルカプトエタノール水銀；塩化水銀メルカプトエチルアミン；チオグリコール酸水銀（ナトリウム塩）；ｏ−ヒドロキシ水銀−ｐ−ニトロフェノール／２−ヒドロキシ水銀−４−；パラクロロ水銀フェノール（ｐｃｍｐ）；チオサリチル酸アセチル水銀（ａｍｔｓ）；ヨウ素；ヨウ化カリウム（ヨウ素）；４−ヨードピラゾール；Ｏ−ヨードベンゾイルグルコサミン（Ｏ−ｉｏｄｏｂｅｎｚｏｙｌｇｌｕｃａｓａｍｉｎｅ）；Ｐ−ヨードベンゾイルグルコサミン（Ｐ−ｉｏｄｏｂｅｎｚｏｙｌｇｌｕｃａｓａｍｉｎｅ）；ヨウ化カリウム／クロラミンｔ；ヨウ化アンモニウム；３−イソチオシアナト−４−ヨードベンゼンスルホンネート；ヨウ化カリウム；３’−ヨードフェニルトリアジン（３’−ｉｏｄｏ ｐｈｅｎｙｌｔｒａｚｉｎｅ）；４’−ヨードフェニルトリアジン（４’−ｉｏｄｏ ｐｈｅｎｙｌｔｒａｚｉｎｅ）；ヨウ化ナトリウム／ヨウ素；硝酸銀；トリニトリドスルホキシル酸銀（）；Ｔｏｂｅｎａｍｅｄ；塩化サマリウム（ＩＩＩ）；塩化ツリウム（ＩＩＩ）；塩化ルテチウム（ＩＩＩ）；塩化ユーロピウム（ＩＩＩ）；塩化テルビウム（ＩＩＩ）；塩化ガドリニウム（ＩＩＩ）；塩化エルビウム（ＩＩＩ）；塩化ランタン（ＩＩＩ）；硝酸サマリウム（ＩＩＩ）；酢酸サマリウム（ＩＩＩ）；サマリウム（ＩＩＩ）カチオン；塩化プラセオジミウム（ＩＩＩ）；塩化ネオジミウム（ＩＩＩ）；塩化イッテルビウム（ＩＩＩ）；硫酸ツリウム（ＩＩＩ）；硫酸イッテルビウム（ＩＩＩ）；硫酸ガドリニウム（ＩＩＩ）；酢酸ガドリニウム（ＩＩＩ）；塩化ジスプロシウム（ＩＩＩ）；硝酸エルビウム（ＩＩＩ）；塩化ホルミウム（ＩＩＩ）；塩化ペンタアミノルテニウム（ＩＩＩ）；セシウムニトリドトリオキソ（ｎｉｔｒｉｄｏｔｉｒｏｘｏ）オスミウム（ｖｉｉｉ）；テトラオキソオスミウム酸カリウム；ヨウ化ヘキサアミノオスミウム（ＩＩＩ）；ヘキサクロロオスミウム酸（ＩＶ）アンモニウム；塩化オスミウム（ＩＩＩ）；ヘキサクロロオスミウム酸（ＩＶ）カリウム；トリクロロトリスカルボニルオスミウム酸（？）セシウム；ジニトリドジアミン白金（ＩＩ）；シスジクロロジメチルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｄｏ）白金（ＩＩ）；ジクロロジアンミン白金（ＩＩ）；ジブロモジアンミン白金（ＩＩ）；ジクロロエチレンジアミン白金（ＩＩ）；ジクロロジニトリト白金酸（ＩＩ）カリウム；ジエチレンジアミン（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｅｎｅ）白金（ＩＩ）；ジオキシラト白金酸（ＩＩ）カリウム；ジクロロビス（ピリジン）白金（ＩＩ）；カリウム（トリメチル ジベンジルアミン）白金（？）；テトラブロモ白金酸（ＩＩ）カリウム；テトラクロロ白金酸（ＩＩ）カリウム；テトラニトリト白金（ＩＩ）カリウム；テトラシアノ白金酸（ＩＩ）カリウム；テトラシアノ白金酸（ＩＩ）ナトリウム；テトラチオシアナト白金酸（ＩＩ）カリウム；テトラニトリト白金酸（ＩＩ）アンモニウム；テトライソシアナト白金酸（ＩＩ）カリウム；テトラシアノ白金（ＩＩ）アンモニウム；テトラクロロ白金酸（ＩＩ）アンモニウム；ジニトリトジオキサラト白金酸（ＩＶ）カリウム；ジクロロテトラアミノ（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｅｔｒａａｍｍｉｎｏ）白金（ＩＶ）；ジブロモジニトリトジアンミン白金（ＩＶ）；ヘキサニトリト白金酸（ＩＶ）カリウム；ヘキサクロロ白金酸（ＩＶ）カリウム；ヘキサブロモ白金酸（ＩＶ）カリウム；ヘキサクロロ白金酸（ＩＶ）ナトリウム；ヘキサヨード白金酸（ＩＶ）カリウム；ヘキサチオシアナト白金酸（ＩＶ）カリウム；テトラクロロビス（ピリジン）白金（ＩＶ）；ヘキサクロロ白金酸（ＩＶ）アンモニウム；ジ−μ−ヨードビス（エチレンジアミン）二白金（ＩＩ）ｎ；ヘキサイソチオシアナト白金酸（ＩＶ）カリウム；テトラヨード白金酸（ＩＩ）カリウム；２，２’，２’’ターピリジル白金（ＩＩ）；２ヒドロキシエタンチオレート（２，２’，２’’ターピリジン（ｔｅｒｐｙｅｉｄｉｎｅ））ｐｌａ；テトラニトロ白金酸（ＩＩ）カリウム；硝酸トリメチル白金（ＩＩ）；テトラオキソレニウム酸（ＶＩＩ）ナトリウム；テトラオキソレニウム酸（ＶＩ）カリウム；テトラオキソレニウム酸（ＶＩＩ）カリウム；ヘキサクロロレニウム（ＩＶ）カリウム；塩化レニウム（ＩＩＩ）；ヘキサクロロレニウム酸（ＩＶ）アンモニウム；二塩化ジメチルすず（ＩＩ）；硝酸トリウム（ＩＶ）；オキシ塩化ウラン（ＶＩ）；オキシ硝酸ウラン（ＶＩ）；オキシ酢酸ウラン（ＶＩ）；オキシピロリン酸ウラン（ＶＩ）；ペンタフルオロオキシウラン酸（ＶＩ）カリウム；ペンタフルオロオキシウラン酸（ＶＩ）ナトリウム；ナノフルオロジオキシウラン酸（ＶＩ）カリウム；トリ酢酸オキシウラン酸（ＶＩ）ナトリウム；オキシシュウ酸ウラン（ＶＩ）；セレノシアン酸アニオン；タングステン酸ナトリウム；１２−タングストリン酸ナトリウム；酢酸タリウム（Ｉ）；フッ化タリウム（Ｉ）；硝酸タリウム（Ｉ）；テトラクロロパラジウム酸（ＩＩ）カリウム；テトラブロモパラジウム酸（ＩＩ）カリウム；テトラシアノパラジウム酸（ＩＩ）カリウム；テトラヨードパラジウム酸（ＩＩ）カリウム；塩化コバルト（ＩＩ）。
チップを形成し得るＰＤＭＳ材料は、これらの標的の多く（特に、生物学的サンプル）に十分に適している。ＰＤＭＳは、そのような分子が可溶化状態でそれらの適切な形状、折り畳み、および活性を維持することを可能にする、非反応性で生物学的に不活性な化合物である。このマトリクスおよび系は、数百ダルトンからメガダルトンのレジーム（ｒｅｇｉｍｅ）の範囲の標的サイズおよび分子量に適応し得る。小タンパク質およびペプチドからウイルスおよび高分子複合体にわたる生物学的標的がこの範囲に含まれ、そして、一般的に、３〜１０ｋＤａから＞１〜２ＭＤａのいずれかの大きさである。
（６．溶質／試薬の型）
結晶化スクリーニングの間に、多くの化学化合物が使用され得る。これらの化合物としては、塩、低分子量有機化合物および高分子量有機化合物、緩衝液、リガンド、低分子薬剤、界面活性剤、ペプチド、架橋剤、ならびに誘導体化剤が挙げられる。合わせて、これらの化学物質は、液滴中のイオン強度、ｐＨ、溶質濃度、および標的濃度を変化させるために使用され得、そして標的を改変するためにさえも使用され得る。結晶化を達成するためのこれらの化学物質の所望の濃度は変化し得、そしてナノモル濃度からモル濃度の範囲であり得る。代表的な結晶化混合物は、固定されているが、経験的に決定された型および濃度の「沈殿剤」、緩衝液、塩、および他の化学添加物（例えば、金属イオン、塩、低分子化学添加物、凍結防止剤、など）のセットを含む。水は、多くの生物学的標的の結晶化試験において重要な溶媒である。なぜならば、これらの分子の多くは、活性および折り畳みを維持するために水和する必要があり得るからである。
加圧化ガスプライミング（ＰＯＰ）技術と結び付けて上述したように、気体に対するＰＤＭＳの浸透性、およびＰＤＭＳと溶媒との適合性は、使用する沈殿剤を決定する上で重要な因子であり得る。
「沈殿」剤は、標的を可溶状態から不溶状態への押し進めるよう作用し、そして容積の排除、溶媒の誘電率の変更、電荷遮蔽、および分子の集中化をもって作用し得る。このチップの特定の実施形態のＰＤＭＳ材料と適合性の沈殿剤としては、不揮発性塩、高分子量ポリマー、極性溶媒、水溶液、高分子量アルコール、二価金属が挙げられるがこれらに限定されない。
沈殿化合物（高分子量有機物質および低分子量有機物質、ならびに特定の塩が挙げられる）は、１％未満〜４０％より高い濃度、または＜０．５Ｍ〜４Ｍより高い濃度で使用され得る。水自体は、可溶性を維持するために特定レベルのイオン強度を必要とするサンプルに対して、沈殿様式で作用し得る。多くの沈殿剤はまた、結晶化スクリーニングの化学的多様性を増加させるために、互いに混合され得る。本明細書に記載されるミクロ流体デバイスは、広範囲のこのような化合物に容易に適合され得る。さらに、多くの沈殿剤（例えば、長鎖有機物質および短鎖有機物質）は、高濃度で非常に粘稠性であり、ほとんどの流体操作デバイス（例えば、ピペットまたはロボットシステム）に対して問題を引き起こす。本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスのポンプおよびバルブの作用により、粘稠性因子の操作が可能となる。
特定のエラストマー材料と適合性の溶媒／沈殿剤の調査は、最適な結晶化剤を同定するために実施され得、最適な結晶化剤は、標準的なスクリーニングよりも効率的な、チップ用に仕立てられた結晶化スクリーニング反応を開発するのに使用され得る。
沈殿剤として使用され得る塩の非排他的な一覧は、以下の通りである：酒石酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）；リン酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）；酢酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｚｎ、ＮＨ４）；蟻酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、Ｍｇ、ＮＨ４）；クエン酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）；塩化物塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｓ、Ｒｂ、ＮＨ４）；硫酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）；リンゴ酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）；グルタミン酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）。
沈殿剤として使用され得る有機性材料の非排他的な一覧は、以下の通りである：ＰＥＧ４００；ＰＥＧ１０００；ＰＥＧ１５００；ＰＥＧ２ｋ；ＰＥＧ３３５０；ＰＥＧ４ｋ；ＰＥＧ６ｋ；ＰＥＧ８ｋ；ＰＥＧ１０ｋ；ＰＥＧ２０ｋ；ＰＥＧ−ＭＭＥ５５０；ＰＥＧ−ＭＭＥ７５０；ＰＥＧ−ＭＭＥ２ｋ；ＰＥＧ−ＭＭＥ５ｋ；ＰＥＧ−ＤＭＥ２ｋ；ジオキサン；メタノール；エタノール；２−ブタノール；ｎ−ブタノール；ｔ−ブタノール；Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ Ｍ−６００；イソプロパノール；２−メチル−２，４−ペンタンジ
オール；１，６ヘキサンジオール。
溶液のｐＨは、緩衝化剤の含有により変更され得る；生物学的材料の代表的なｐＨ範囲は、３．５〜１０．５の値の間のいずれかであり、そして緩衝液の濃度は、一般的に、０．０１Ｍと０．２５Ｍとの間である。本明細書中に記載されるミクロ流体デバイスは、広範囲のｐＨ値（特に、生物学的標的に適したｐＨ値）に容易に適合され得る。
可能な緩衝剤の非排他的な一覧は、以下の通りである：酢酸ナトリウム；ＨＥＰＥＳ；カコジル酸ナトリウム；クエン酸ナトリウム；コハク酸ナトリウム；リン酸ナトリウムカリウム；ＴＲＩＳ；マレイン酸ＴＲＩＳ；マレイン酸イミダゾール；ビストリスプロパン；ＣＡＰＳＯ、ＣＨＡＰＳ、ＭＥＳ、およびイミジゾール（ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）。
添加物は、標的の溶解度および／または活性の挙動に影響を及ぼす低分子である。このような化合物は、結晶化スクリーニングを迅速化し得るか、または標的の代替の結晶形態を生成し得る。添加物は、化学物質のほぼ全ての考えられ得る形態を取り得るが、代表的には、一価塩または多価塩（無機または有機）、酵素リガンド（基質、生成物、アロステリックエフェクター）、化学架橋剤、界面活性剤および／または脂質、重金属、有機金属化合物、微量の沈殿剤、ならびに低分子量有機物質である。
以下は、可能な添加物の非排他的な一覧である：２−ブタノール；ＤＭＳＯ；ヘキサンジオール；エタノール；メタノール；イソプロパノール；フッ化ナトリウム；フッ化カリウム；フッ化アンモニウム；無水塩化リチウム；塩化マグネシウム六水和物；塩化ナトリウム；塩化カルシウム二水和物；塩化カリウム；塩化アンモニウム；ヨウ化ナトリウム；ヨウ化カリウム；ヨウ化アンモニウム；チオシアン酸ナトリウム；チオシアン酸カリウム；硝酸リチウム；硝酸マグネシウム六水和物；硝酸ナトリウム；硝酸カリウム；硝酸アンモニウム；蟻酸マグネシウム；蟻酸ナトリウム；蟻酸カリウム；蟻酸アンモニウム；酢酸リチウム二水和物；酢酸マグネシウム四水和物；酢酸亜鉛二水和物；酢酸ナトリウム三水和物；酢酸カルシウム水和物；酢酸カリウム；酢酸アンモニウム；硫酸リチウム一水和物；硫酸マグネシウム七水和物；硫酸ナトリウム十水和物；硫酸カリウム；硫酸アンモニウム；酒石酸二ナトリウム二水和物；酒石酸カリウムナトリウム四水和物；酒石酸二アンモニウム；リン酸二水素ナトリウム一水和物；リン酸水素二ナトリウム二水和物；リン酸二水素カリウム；リン酸水素二カリウム；リン酸二水素アンモニウム；リン酸水素二アンモニウム；クエン酸三リチウム四水和物；クエン酸三ナトリウム二水和物；クエン酸三カリウム一水和物；クエン酸水素二アンモニウム；塩化バリウム；塩化カドミウム二水和物；塩化コバルト二水和物；塩化銅二水和物；塩化ストロンチウム六水和物；塩化イットリウム六水和物；エチレングリコール；グリセロール無水物；１，６ヘキサンジオール；ＭＰＤ；ポリエチレングリコール４００；トリメチルアミンＨＣｌ；グアニジンＨＣｌ；尿素；１，２，３−ヘプタントリオール；ベンズアミジンＨＣｌ；ジオキサン；エタノール；イソ−プロパノール；メタノール；ヨウ化ナトリウム；Ｌ−システイン；ＥＤＴＡナトリウム塩；ＮＡＤ；ＡＴＰ二ナトリウム塩；Ｄ（＋）−グルコース一水和物；Ｄ（＋）−スクロース；キシリトール；スペルミジン；スペルミンテトラ−ＨＣｌ；６−アミノカプロン酸；１，５−ジアミノペンタンジＨＣｌ；１，６−ジアミノヘキサン；１，８−ジアミノオクタン；グリシン；グリシル−グリシル−グリシン；三塩化ヘキサミンコバルト；タウリン；ベタイン一水和物；ポリビニルピロリドンＫ１５；非界面活性剤スルホ−ベタイン１９５；非界面活性剤スルホ−ベタイン２０１；フェノール；ＤＭＳＯ；硫酸デキストランナトリウム塩；ｊｅｆｆａｍｉｎｅ Ｍ−６００；２，５ヘキサンジオール；（＋／−）−１，３ブタンジオール；ポリプロピレングリコールＰ４００；１，４ブタンジオール；ｔｅｒｔ−ブタノール；１，３プロパンジオール；アセトニトリル；γブチロラクトン；プロパノール；酢酸エチル；アセトン；ジクロロメタン；ｎ−ブタノール；２，２，２トリフルオロエタノール；ＤＴＴ；ＴＣＥＰ；ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、ノナエチレングリコールモノラウリルエーテル；ポリオキシエチレン（９）エーテル；オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノラウリルエーテル；ポリオキシエチレン（８）ラウリルエーテル；ドデシルβ−Ｄ−マルトピラノシド；ラウリル酸スクロースエステル；シクロヘキシル−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド；ノナエチレングリコールオクチルフェノールエーテル；臭化セチルトリメチルアンモニウム；Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン；デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ラウリルジメチルアミンオキシド；シクロヘキシル−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド；ｎ−ドデシルスルホベタイン、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパン−１−スルホネート；ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド；オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド，ＯＳＧ；Ｎ，Ｎ−ジメチルデシルアミン−β−オキシド；メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−ａ−Ｄ−グルコピラノシド；スクロースモノカプロイル酸；ｎ−オクタノイル−β−Ｄフルクトフラノシル−ａ−Ｄ−グルコピラノシド；ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ＯＧ；シクロヘキシル−プロピル−β−Ｄ−マルトシド；シクロヘキシルブタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；ｎ−デシルスルホベタイン、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパン−１−スルホネート；オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ＯＭＥＧＡ；ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド；Ｂｒｉｊ３５；Ｂｒｉｊ５８；ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４；ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５；ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５；Ｔｗｅｅｎ２０；Ｔｗｅｅｎ８０；ポリオキシエチレン（６）デシルエーテル；ポリオキシエチレン（９）デシルエーテル；ポリオキシエチレン（１０）ドデシルエーテル；ポリオキシエチレン（８）トリデシルエーテル；イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド；デカノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル；３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−ｌ−プロパンスルホネート；３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート；シクロヘキシルペンタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；ノナノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；シクロヘキシルプロパノール−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；オクタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；シクロヘキシルエタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム；ｎ−ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ドデシルポリ（エチレングリコエーテル）ｎ；ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート；ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−デシル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド；ｎ−ドデシルホスホコリン；ａ−Ｄ−グルコピラノシド、β−Ｄ−フルクトフラノシルモノデカン酸、スクロースモノカプリン酸；１−ｓ−ノニル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド（ｔｈｉｏｍａｌｔｏｙｒａｎｏｓｉｄｅ）；Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ（ｄｉｍｅｔｈｌａｍｍｏｎｉｏ））酪酸；ｎ−ノニル−β−Ｄ−マルトピラノシド；シクロヘキシル−ブチル−β−Ｄ−マルトシド；ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド；ｎ−デシルホスホコリン；ｎ−ノニルホスホコリン；ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド；１−ｓ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；ｎ−オクチルホスホコリン；シクロヘキシル−エチル−β−Ｄ−マルトシド；ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート；シクロヘキシル−メチル−β−Ｄ−マルトシド。
凍結溶媒は、寒剤（例えば、液体窒素、液体プロパン、液体エタン、または窒素ガスもしくはヘリウムガス）中での急速冷却（全て、約１００〜１２０°Ｋ）に対して標的結晶を安定化し、結晶が氷ではなくガラス質のガラス中に包埋されるようにする薬剤である。任意の数の塩または低分子量有機化合物が、凍結防止剤として使用され得、代表的な凍結防止剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＭＰＤ、ＰＥＧ−４００（ならびにＰＥＧ誘導体および高分子量ＰＥＧ化合物の両方）、グリセロール、糖（キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、スクロース、グルコースなど）、エチレングリコール、アルコール（短鎖および長鎖の両方、揮発性および不揮発性の両方）、ＬｉＯＡｃ、ＬｉＣｌ、ＬｉＣＨＯ２、ＬｉＮＯ３、Ｌｉ２ＳＯ４、Ｍｇ（ＯＡｃ）２、ＮａＣｌ、ＮａＣＨＯ２、ＮａＮＯ３など。繰り返すが、本発明に従うミクロ流体デバイスを構築する材料は、一定範囲のこのような化合物と適合性であり得る。
これらの化学物質の多くは、研究者が「疎行列（ｓｐａｒｓｅ ｍａｔｒｉｘ）」スクリーニング実験および「グリッド」スクリーニング実験の両方を実施するのを可能にする、種々の販売元（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ、ＣＡ、Ｅｍｅｒａｌｄ Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ
Ｉｓｌａｎｄ、ＷＡ、およびＪｅｎａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙが挙げられるがこれらに限定されない）からの予め規定されたスクリーニングキットにおいて獲得され得る。疎行列スクリーニングは、可能な限り少ない条件で可能な限り多くの沈殿剤、緩衝液、および添加剤化学物質の空間（ａｄｄｉｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｐａｃｅ）を無作為にサンプリングすることを試みる。グリッドスクリーニングは、代表的に、互いに対する２つまたは３つのパラメータ（例えば、沈殿剤濃度 対
ｐＨ）の体系的な変動で構成される。両方の型のスクリーニングの使用が、結晶化試験において成功しており、そしてこれらのスクリーニングにおいて使用される化学物質および化学的物質の組み合わせの大部分が、本発明の実施形態に従うチップ設計およびマトリクスと適合性である。
さらに、ミクロ流体デバイスの現在および将来の設計は、特定の標的または標的のセットに対する異なる化学物質のアレイの柔軟なコンビナトリアルスクリーニングを可能にし得る。これは、ロボットスクリーニングまたは手作業のスクリーニングのいずれによっても困難なプロセスである。この後者の局面は、初回スクリーニングによりなされる最初の成功を最適化するために特に重要である。
（７．結晶化のためのさらなるスクリーニングの変数）
化学的可変性に加えて、多数の他のパラメータは、結晶化スクリーニングの間に変更され得る。このようなパラメータとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：１）結晶化試験の容量、２）結晶化溶液に対する標的溶液の比率、３）標的濃度、４）二次的な低分子または高分子との標的の共結晶化、５）水和、６）インキュベーション時間、７）温度、８）圧力、９）接触表面、１０）標的分子に対する改変、および１１）重力。
結晶化試験の容量は、ピコリットルからミリリットルの範囲の全ての考えられ得る値の容量であり得る。代表的な値としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：０．１、０．２、０．２５、０．４、０．５、０．７５、１、２、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１２５０、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２５０、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、７５００、８０００、９０００、および１００００ｎＬ。先に記載されたミクロ流体デバイスは、これらの値を使用し得る。
特に、結晶化試験についての低容量範囲（＜１００ｎＬ）の使用は、本発明の実施形態に従うミクロ流体チップの実施形態の明確な利点である。なぜならば、このような低容量の結晶化チャンバが容易に設計および構築され得、多量の貴重な標的分子に対する必要性を最小限に抑えるからである。本発明に従う実施形態の標的物質の低消費は、十分でない生物学的サンプル（例えば、膜タンパク質、タンパク質／タンパク質複合体、およびタンパク質／核酸複合体）を結晶化する試み、および目的の標的に対する結合についてのリードライブラリーの低分子薬物スクリーニングにおいて特に有用である。
結晶化混合物に対する標的溶液の比率はまた、結晶化スクリーニングおよび最適化における重要な変数を構成し得る。これらの比率は、全ての考えられ得る値の比率であり得るが、代表的には、１：１００〜１００：１の範囲の標的：結晶化溶液である。代表的な標的：結晶化溶液または結晶化溶液：標的の比率としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２５、１：２０、１：１５、１：１０、１：９、１：８、１：７．５、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２．５、１：２、１：１、２：３、３：４、３：５、４：５、５：６、５：７、５：９、６：７、７：８、８：９、および９：１０。先に記載されたように、本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスは、単一のチップにおいて複数の比率を同時に使用するよう設計され得る。
結晶化化学物質濃度と同様に、標的濃度は、一定範囲の値であり得、そして結晶化スクリーニングにおいて重要な変数である。代表的な濃度範囲は、＜０．５ｍｇ／ｍｌ〜＞１００ｍｇ／ｍｌのいずれかであり得、５〜３０ｍｇ／ｍｌの間の値が最も一般的に使用され得る。本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスは、この範囲の値と容易に適合され得る。
共結晶化は、一般的に、天然または非天然の結合パートナーである二次的因子との標的の結晶化を示す。このような二次的因子は、小さくあり得る（約１０〜１０００Ｄａのオーダー）か、または大きな高分子であり得る。共結晶化分子としては、低分子酵素リガンド（基質、生成物、アロステリックエフェクターなど）、低分子薬物リード物質、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、補体タンパク質（例えば、パートナーまたは標的タンパク質またはサブユニット）、モノクローナル抗体、および融合タンパク質（例えば、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、プロテイン−Ｇ、または発現、溶解度、および標的の挙動を補助し得る他のタグ）が挙げられ得るがこれらに限定されない。これらの化合物の多くは、生物学的化合物または合理的な分子量の化合物のいずれかであるので、共結晶化分子は、ミクロ流体チップにおけるスクリーニングに慣用的に含まれ得る。実際、これらの試薬の多くが高価であり、そして／または限られた量なので、本発明の実施形態に従うミクロ流体チップによりもたらされる低容量さは、これらを共結晶化スクリーニングに理想的に適するようにする。
標的の水和は、重要な問題であり得る。特に、水は、生物学的標的およびサンプルに極めて有力な溶媒であり得る。本明細書中に記載されるミクロ流体デバイスは、比較的疎水性であり、そして水ベースの溶液と適合性である。
結晶化実験の時間の長さは、分または時間から週または月の範囲であり得る。生物学的系におけるほとんどの実験は、代表的に、２４時間〜２週間で結果を示す。このインキュベーション時間のレジームは、本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスにより適応され得る。
結晶化実験の温度は、成功または失敗の割合に大きな影響を有し得る。このことは特に、結晶化実験の温度が０〜４２℃の範囲であり得る生物学的サンプルに当てはまる。最も一般的な結晶化温度のうちのいくつかは、以下の通りである：０、１、２、４、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５、３７、および４２。本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスは、列挙される温度で保存され得るか、または代替的に、小さな温度制御構造（例えば、抵抗加熱器またはＰｅｌｔｉｅｒ冷却構造）との熱接触下に置かれ得る。
さらに、本発明に従う実施形態の小さなフットプリントおよび迅速な準備時間は、所望の標的温度へのより迅速な平衡化および一定範囲の温度のより小さいインキュベーターにおける保存を可能にする。さらに、本発明の実施形態に従うミクロ流体系は、蒸気相との接触下で結晶化実験を行わないので、従来の巨視的な蒸気拡散技術に伴う問題である温度変化に伴う蒸気相から液滴への水の凝縮が回避される。この特徴は、多くの従来の手動またはロボット操作の系（この系は、所望の温度で維持されなければならいか、またはこの実験は、新しい温度に移される前に一定期間室温で維持されなければならないかのいずれかである）を上回る利点を示す。
圧力の変動は、今なお研究中である結晶化パラメーターである。これは、部分的には、従来の拡散蒸着プロトコルおよびマイクロバッチプロトコルが、代表的には大気圧以外のすべて圧力におけるスクリーニングを容易には可能にしないからである。ＰＤＭＳマトリックスの剛性により、チップ上での標的結晶化に対する圧力の効果を探索する実験が可能である。
結晶化「滴下物」が存在する表面は、実験の成功および結晶の品質に影響し得る。拡散蒸着プロトコルおよびマイクロバッチプロトコルにおいて使用される固体支持体接触表面の例としては、ポリスチレンまたはシラン化ガラスのいずれかが挙げられる。両方の型の支持体が、標的に依存して、結晶成長を促進または阻害する異なる性向を示し得る。さらに、その結晶化「滴下物」は、空気または何らかの型のポリ炭素油のいずれかと接触しており、このことは、この実験が、それぞれ、拡散蒸着の設定またはマイクロバッチの設定であるか否かに依存する。空気の接触は、遊離酸素が生物学的標的と容易に反応し、これによりタンパク質変性をもたらし得そして結晶化の成功を阻害または低下し得るという点で、不利を有する。油は、微量炭化水素が結晶化実験中に浸出するのを可能にし、そして同様に、結晶化の成功を阻害または低下し得る。
本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスの設計は、結晶化反応を完全に取り囲む非反応性の生体適合性環境を提供することによって、これらの制限を克服し得る。さらに、ミクロ流体チップにおける結晶化チャンバの組成は、結晶化反応と接触するための新しい表面を提供するように多分変化され得る。このことは、結晶化を促進する異なる表面および表面特性の慣用的スクリーニングを可能にする。
結晶化標的（特に、生物学的起源の標的）は、しばしば、結晶化を可能にするように改変され得る。そのような改変としては、短縮、限定的タンパク質分解性消化物、部位特異的変異体、阻害状態または活性化状態、化学的改変または誘導体化などが挙げられるが、これらに限定されない。標的改変は、時間およびコストがかかり得る。改変標的は、非改変標的が必要とするのと同じ徹底的スクリーニングを必要とする。本発明のミクロ流体デバイスは、もとの標的を用いるのと同じ程度容易に、そのような改変標的を用いて作動し、そして同じ利益を提供する。
結晶化についてのパラメーターとしての重力の効果は、なお研究中である別の結晶化パラメーターである。これは、そのような物理的特性を変化させることが困難であることが原因である。それにもかかわらず、無重力環境における生物学的サンプルの結晶化実験は、重力の影響下にて地球上で得られる結晶よりも優れた品質の結晶の成長を生じた。
重力が無いことは、従来の拡散蒸着設定およびマイクロバッチ設定に関して問題を提示する。なぜなら、すべての流体は、表面張力によって適所に保持されなければならないからである。しばしばそのような実験を手で設定する必要性もまた、困難を引き起こす。この困難は、空間に作業者を維持する費用が原因である。しかし、本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスは、結晶化条件としての微小重力のさらなる調査を可能にする。小型の自動計測および結晶成長系は、以下の１）〜４）を可能にする：１）冷却されているが液体の状態で標的分子を含む衛星工場の打ち上げ、２）標的の分配および結晶の成長、３）生じた結晶の収集および低温凍結、および４）低温貯蔵された結晶を分析のために陸上ステーションに戻すこと。
（８．インサイチュ結晶化スクリーニング）
顕微鏡を用いて結晶の成長を観察する能力は、結晶化試験の成功または失敗を決定する段階である。従来の結晶化プロトコルは、可視化を可能にする透明物質（例えば、ポリスチレンまたはシラン化ガラス）を使用し得る。本発明に従う実験のＰＤＭＳマトリックスの透明性は、結晶化試験が伝統的に得られる以下の２つの主要な方法に特に適する：１）光学顕微鏡により可視光体制での直接観察、および２）偏光の複屈折。
複屈折は、従来の実験において判断するのが困難であり得る。なぜなら、多くのプラスチックは、それ自体が複屈折性であり、サンプルの評価を妨害するからである。しかし、本明細書中に記載されるミクロ流体デバイスは、そのような光学的干渉特性を伴うことなく作製され得、偏光特徴および非偏光特徴の両方を用いて直接の可視化を慣用的に可能にする自動スキャニングシステムの設計を可能にする。
さらに、ロボットを利用する（特に手動で設定する）結晶化実験は、表面上の結晶化滴下物の配置を数１０〜数１００ミクロン変動させ得る。この変動性は、自動スキャニングシステムについての問題を提示する。なぜなら、安定な基準を伴わずにそのような柔軟な位置決めの必要性をプログラムすることは困難であるからである。しかし、本発明の実施形態のミクロ流体チップにおける結晶化チャンバの固定配置は、そのような問題を克服する。なぜなら、どのウェルも、ミクロン未満の精度で特定の位置に位置決めされ得るからである。さらに、そのようなシステムは、異なるサイズおよび位置の結晶化チャンバの設計のために容易に拡張可能である。なぜなら、本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスを設計するために使用されるマスクおよび他のテンプレートは、簡単にデジタル化され得、そして可視化のためのスキャニングソフトウェア中に移植され得るからである。
一旦結晶が視覚的観察により得られると、チップ自体を直接通る回折についてスクリーニングすることが可能であり得る。例えば、チップ内の結晶化チャンバは、ガラス、石英、または弾性材料自体の薄化部分を含む透明な「窓」が、そのチャンバの対向する壁に装備され得る。その後、結晶は、回折キャピラリーについてアッセイするためにチップを通るＸ線に直接曝され得、結晶サンプルを除去することにより結晶サンプルを多分損傷させる必要性が排除される。そのようなアプローチは、追跡調査のための最良の開始条件候補を決定するために最初の結晶化試験から成功をスクリーニングするために使用され得る。同様に、特定の条件の組の下で成長した結晶が、新しい溶液（例えば、低温安定化剤、低分子薬物リード化合物またはリガンドなど）で「再平衡化」され得、そしてそのような環境変化に対するその結晶の安定性が、Ｘ線回折により直接モニターされ得る。
（９．精製／結晶化のためのミクロ流体デバイスの利用）
標的生物学的サンプル（例えば、タンパク質）の結晶化は、実際には、事前の多数の複雑かつ困難な工程の頂点であり、そのような工程としては、タンパク質の発現、精製、誘導体化、および標識が挙げられるが、これらに限定されない。結晶化の前のそのような工程は、１組の溶液特性を備えるチャンバから異なる組の特性を備える別の領域へ液体を往復させる工程を包含する。ミクロ流体技術は、そのような作業を実施するために適切であり、それにより、単一チップの範囲内において必要なすべての工程の組み合わせが可能になる。
プレ結晶化工程の実施を可能にするミクロ流体取扱い構造の例が、上記の第Ｉ節に記載されている。例えば、ミクロ流体チップは、調節されたバイオリアクターとして作用し得、それにより、セルペン（ｃｅｌｌ ｐｅｎ）構造中に含まれる増殖中の細胞中へと栄養素を流すことを可能にすると同時に、老廃物を除去し、そして組換え改変生物が細胞増殖の所望の段階で標的分子（例えば、タンパク質）を生成するのを誘導する。誘導後に、これらの細胞は、セルペン（ｃｅｌｌ ｐｅｎ）からチップの異なる領域へと、酵素的手段または機械的手段による溶解のために押しやられ得る。その後、可溶化した標的分子は、チップ上に直接組み込まれた分子濾過ユニットによって細胞破片から分離され得る。
その後、標的分子と混入する細胞タンパク質および細胞核酸との粗混合物は、種々の化学特性の多孔性マトリックス（例えば、カチオン交換、アニオン交換、アフィニティ、サイズ排除）を通して分離を達成するために流され得る。標的分子が、可溶性を促進する特定の型の融合タンパク質でタグ化された場合、その標的分子はアフィニティ精製され得、同様にタグ化された部位特異的プロテアーゼを用いてその融合産物を分離するように短時間処理され得、その後、清浄化工程としてアフィニティマトリックスに再び通される。
一旦純粋になると、その標的は、異なる安定化剤と混合され得、活性についてアッセイされ得、その後、結晶化実施領域へと輸送される。チップまたはチップホルダー上の種々の点に位置する局所的加熱ユニット（例えば、電極）および冷蔵ユニット（例えば、Ｐｅｌｔｉｅｒ冷却器）は、処理および結晶化全体にわたるすべての段階で差次的な温度調節を可能にする。従って、タンパク質の産生、精製、および結晶化は、本発明に従う単一ミクロ流体デバイスの実施形態にて達成され得る。
（ＩＶ．微小フリー界面拡散）
従来の結晶化へのアプローチは、結晶化剤をゆっくりとした拡散を介して導入することによって、標的溶液王権の次第の変化を生じている。広範な種々の条件のサンプリングの際に特に有用な１つの方法は、巨視的なフリー界面拡散である。この技術は、２つ以上の溶液（代表的に、タンパク質ストック）と沈殿剤との間での十分に規定された流体界面の作製、および引き続く、拡散プロセスを介するこれらの２つの溶液の平衡化を必要とする。これらの溶液が互いに拡散するにつれて、その拡散経路に沿って勾配が確立され、そして条件の連続物が、同時にサンプリングされる。これらの条件における、空間と時間との両方での変動が存在するので、結晶形成の一および時間に関する情報が、さらなる最適化に置いて使用され得る。図２９Ａ〜２９Ｄは、フリー界面に沿って接触した溶液Ａおよび溶液Ｂについての距離に対して、濃度をプロットする、単純化された概略図である。図２９Ａ〜Ｄは、これらの２つの溶液の、経時的な、連続的な、かつ広範な濃度プロフィールが、最終的に作製されることを示す。
巨視的なフリー界面拡散技術の効率にもかかわらず、技術的困難が、この技術を、ハイスループットのスクリーニング用途のために適切ではなくし、そしてこの技術は、いくつかの理由により、結晶学会において広範には使用されない。第一に、流体界面が、代表的に、溶液を狭い容器内（例えば、毛細管または培養プレートの深いウェル）に分配することによって、確立される。図３０Ａ〜Ｂは、巨視的なフリー界面の、毛細管９３００への試みられた形成の、単純化された断面図を示す。第二の溶液９３０２を第一の溶液９３０４内に拡散させる作用は、対流混合を引き起こし、そして乏しく規定された流体界面９３０６を生じる。
さらに、これらの溶液は、この問題を排除するために、毛細管内に連続的に吸引されないかもしれない。図３１Ａ〜Ｂは、第一の溶液９４００と第二の溶液９４０２との間での、毛細管９４０４内での混合を示し、これは、圧力駆動式のＰｏｉｓｅｕｌｌｅ流れの放物線状の速度分布に起因して生じ、乏しく規定された流体界面９４０６を生じる。さらに、巨視的なフリー界面結晶化レジメのための容器は、この容器を、ピペットチップまたは分配ツールに対して接近可能にする寸法を有さなければならず、そして大きい（１０〜１００μｌ）の体積のタンパク質および沈殿剤溶液の使用を必須にする。
所望でない対流混合を回避するために、分配の間と結晶インキュベーションの間との両方において、注意を払わなければならない。この理由により、厄介なプロトコルは、しばしば、巨視的フリー界面を規定するために使用される。例えば、第二の溶液の添加前に、１つの溶液を凍結させる。さらに、２つの溶液が適切な配向で貯蔵されない場合、これらの異なる密度の２つの溶液を、重力によって誘導される対流によって混合して、反応の保存をさらに複雑にする。このことは、図３２Ａ〜Ｃに示されており、これらの図において、経時的に、第二の溶液９５０２の密度より大きい密度を有する第一の溶液９５００は、単に沈降して、静的底部層９５０４を形成し、この層は、毛細管の長さに沿った拡散勾配の形成を導かない。
本発明の実施形態に従って、従来の巨視的フリー界面拡散と類似の結晶化技術（ゲーティングされた微小フリー界面拡散（ゲーティングされたμ−ＦＩＤ））が開発された。ゲーティングされたμ−ＦＩＤは、巨視的なフリー界面拡散技術によって達成される、相間間隔の効率的なサンプリングを保持する。
本発明の実施形態に従うミクロ流体フリー界面（μＦＩ）は、少なくとも１つの静止流体と別の流体との間に局在した界面であり、ここで、これらの流体の間での混合は、対流によってではなく、拡散の方が優勢である。この適用の目的で、用語「流体」とは、特定の極大未満の粘度を有する材料をいう。このような極大粘度の例としては、１０００ＣＰｏｉｓｅ、９００ＣＰｏｉｓｅ、８００ＣＰｏｉｓｅ、７００ＣＰｏｉｓｅ、６００ＣＰｏｉｓｅ、５００ＣＰｏｉｓｅ、４００ＣＰｏｉｓｅ、３００ＣＰｏｉｓｅ、２５０ＣＰｏｉｓｅ、および１００ＣＰｏｉｓｅが挙げられるが、これらに限定されず、従って、排除ゲルまたはポリマー含有材料が、内部に捕捉される。
本発明の実施形態に従うミクロ流体フリー界面において、この界面の少なくとも１つの寸法は、粘性力が他の力より優れるような大きさに制限される。例えば、本発明の実施形態に従うミクロ流体フリー界面において、流体に作用する優勢な力は、浮力よりむしろ粘性であり、従って、このミクロ流体フリー界面は、極度に低いＧｒａｓｈｏｆ数（以下の議論を参照のこと）によって特徴付けられ得る。このミクロ流体フリー界面はまた、流体の全体積に対して局在した性質によって特徴付けられ得、その結果、純粋な流体の間の界面の形成後に最初に存在する、急な移行濃度勾配に曝露される流体の体積が、制限される。
本発明の実施形態に従って作製される、ミクロ流体フリー界面の特性は、図３３Ａおよび３３Ｂに図示されるように、フリーでないミクロ流体界面と対照的であり得る。具体的には、図３３Ａは、本発明の実施形態に従うミクロ流体フリー界面の、単純化された断面図を示す。図３３Ａのミクロ流体フリー界面７５００は、チャネル７５０２内に存在する、第一の流体Ａと第二の流体Ｂとの間に形成される。フリーミクロ流体界面７５００は、実質的に線状であり、その結果、流体ＡとＢとの間に生じる急激な濃度勾配は、このチャネル内に高度に局在化される。
上記のように、チャネル７５０２の寸法は、極度に小さく、その結果、チャネルの壁にすぐ隣接したスリップしない層が、実際に、このチャネルの体積の大部分を占める。その結果、粘性力は、浮力よりずっと大きく、そして流体Ａと流体Ｂとの間での、界面７５００に沿った混合は、対流混合がほとんどまたは全くなしで、ほぼ全体として拡散の結果として起こる。
本発明の実施形態のミクロ流体フリー界面に付随する条件は、以下の式（３）に従って、Ｇｒａｓｈｏｆ数（Ｇｒ）の項で現され得、浮力と粘性力との相対的な大きさの表現は、以下である：
（３） Ｇｒ＝Ｂ／Ｖ＝αΔｃｇＬ３／ｖ２
ここで：
Ｇｒ＝Ｇｒａｓｈｏｆ数；
Ｂ＝浮力；
Ｖ＝粘性力；
α＝溶質の拡大性；
ｃ＝濃度；
ｇ＝重力加速度；
Ｌ＝チャンバの臨界寸法；および
ｖ＝速度論粘度。
式（３）に従って、Ｇｒａｓｈｏｆ数、および従って、所望でない補正流れの存在を減少させるための、多数のアプローチがなされ得る。１つのこのようなアプローチは、ｇを減少させることであり、そしてこれは、空間において実施される微量重量結晶化実験によって採用される戦術である。別のアプローチは、ｖを増加させることであり、そしてこれは、Ｇａｒｃｉａ−Ｒｕｉｚら、「Ａｇａｒｏｓｅ ａｓ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉ：Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｐｒｏｃｃｅｓｓｅｓ」Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｌｏｗｔｈ ２３２，１６５−１７２（２００１）（全ての目的で、本明細書中に参考として援用される）によって記載されるような、ゲル針療法技術を用いて働く調査者によって採用される戦術である。
本発明に従う実施形態は、Ｌを減少させ、そして極端に小さい寸法を有するミクロ流体フローチャネルおよび容器の使用を介することを目的とする。このアプローチの効果は、式（３）における変数（Ｌ）の３乗だけ増幅される。
本発明の実施形態に従うミクロ流体フリー界面は、１以下のＧｒａｓｈｏｆ数を示すと予測される。同じ密度を有する２つの流体において予測されるＧｒａｓｈｏｆ数は、０であり、従って、０に非常に近いＧｒａｓｈｏｆ数は、達成されると予測される。
図３３Ａにおいて上に図示されるミクロ流体フリー界面の実施形態は、図３３Ｂに示される従来の非ミクロ流体フリー界面と対比され得る。具体的には、第一の流体Ａおよび第二の流体Ｂは、界面７５０４によって分離され、この界面は、均一ではないか、またはチャネル７０５２の断面幅によって制限される。この界面に生じる急激な濃度勾配は、局在せず、その代わりに、このチャネルの長さに沿った種々の地点に存在し、それに対応して大きい体積の流体を、この急激な勾配に曝露する。さらに、粘性力は、浮力に必ずしも勝らず、その結果、流体ＡおよびＢの、界面７５０４を横切る混合は、拡散と対流との両方の結果として起こり得る。従来の非ミクロ流体界面によって示されるＧｒａｓｈｏｆ数は、１を超えると予測される。
（１．ミクロ流体フリー界面の生成）
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面は、種々の方法により生成され得る。１つのアプローチは、先に記載のミクロ製作されたエラストマー構造物を利用することである。詳細には、特定の実施形態では、これらミクロ流体構造物が形成されるエラストマー材料は、特定のガスに比較的透過可能である。このガスの透過可能性性質は、良好に規定された再現可能な流体界面を形成するために、加圧化ガスプライミング（ＰＯＰ）の技法を利用して開発され得る。
図３４Ａは、本発明の実施形態によるミクロ流体デバイスのフローチャネル９６００の平面図を示す。フローチャネル９６００は、作動されたバルブ９６０２によって二等分される。材料の導入の前に、フローチャネル９６００はガス９６０４を含む。
図３４Ｂは、圧力下での第１のフローチャネル部分９６００ａへの第１の溶液９６０６の導入、および圧力下での第２のフローチャネル部分９６００ｂへの第２の溶液９６０８の導入を示す。周辺のエラストマー材料９６０７のガス透過可能性のため、ガス９６０４は、入来する溶液９６０８および９６１０によって置換され、そしてエラストマー９６０７を通ってガスが除かれる。
図３４Ｃに示されるように、フローチャネル部分９６００ａおよび９６００ｂの加圧されたガスが出るプライミングは、気泡なしに、これらの行き詰まりのフローチャネル部分の均一な充填を可能にする。図３４Ｄに示されるようなバルブ９６０２の非作動化に際し、ミクロ流体フリー界面９６１２が形成され、流体間の拡散勾配の形成を可能にする。
ゲート型μ−ＦＩＤを利用するタンパク質結晶の形成は、多くの付加された利点とともに、巨視的フリー界面拡散技法によって達成される位相空間の効率的なサンプリングを保持し、これには、サンプル溶液の倹約使用、セットアップの容易さ、ウェルで規定される流体界面の生成、平衡動力学に対する制御、および高スループット平行実験を実施する能力が含まれる。
ゲート型μ−ＦＩＤを利用するタンパク質結晶の形成の別の可能な利点は、図３６Ａおよび３６Ｂと組み合わせて示されるような、高品質結晶の形成である。図３６Ａは、従来の巨視的フリー界面拡散技法を利用して形成されるタンパク質結晶の単純化した略図を示す。詳細には、初期のタンパク質結晶９２００は、浮力の作用の結果として、サンプルの正味の伝達フローを経験している溶液９２０２からのサンプルに曝される。この伝達フローの方向性の結果として、タンパク質結晶９２００の成長もまた方向性がある。しかし、Ｎｅｒａｄら、「溶液からの結晶の成長の間の対流の最小化に関する地上実験」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ ７５、５９１〜６０８（１９８６）に記載のように、タンパク質結晶の非対照的成長が、成長する結晶の格子中に所望されないひずみを生じ得、格子内に不純物の転位および／または取り込みを促進し、そしてその他に結晶の質に悪影響を及ぼす。
対照的に、図３６Ｂは、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散を利用して形成されるタンパク質結晶の単純化した略図を示す。初期のタンパク質結晶９２０４は、結晶化剤内で拡散しているサンプル溶液９２０６に曝される。この拡散は、方向性がなく、そしてタンパク質結晶９２０４の成長もまた対応して方向性がない。従って、この成長する結晶は、図３６Ａに示される成長する結晶により経験される、格子上のひずみおよび不純物の付随する取り込みおよび転位を避ける。従って、図３６Ｂ中の結晶の質は高品質である。
まさに記載された詳細な実施形態は、閉鎖されたバルブによって分離された行き詰まり充填の２つ以上のチャンバまたはチャネルへのバルク材料の透過可能性を開発し、そしてこのバルブの引き続く開放によって静止流体間のミクロ流体フリー界面を生成するけれども、ミクロ流体フリー界面を実現するためのその他の機構が可能である。
例えば、図４６は、本発明によるミクロ流体フリー界面を確立するための１つの可能な代替方法を示す。ミクロ流体チャネル８１００は、矢印によって示される方向の対流を、静止非スリップ層８１０２がフローチャネル８１００の壁に沿って生成されるように経験する流体Ａを運搬する。分岐チャネル８１０４および行き詰まりのチャンバ８１０６は、静止流体Ｂを含む。行き詰まりのチャネルおよびチャンバを取り囲む材料は逆圧を提供するので、流体Ｂは静止したままであり、そしてミクロ流体フリー界面８１１０が、流れる流体Ａと静止流体Ｂとの間の分岐チャネル８１０８の口８１１２で生成される。以下に記載されるように、ミクロ流体フリー界面を横切る流体Ａまたはその成分の拡散が、有用な結果を得るために開発され得る。図４６に示される実施形態は、行き詰まりの分岐チャネルおよびチャンバを含むが、これは、本発明では必要ではなく、そしてこの分岐チャネルは、このチャネルを通る流体の任意の正味の流れを防ぐために十分な逆圧が維持される限り、デバイスの別の部分と連結され得る。
ミクロ流体フリー界面拡散アッセイを確立するための別の可能な代替の方法は、ブレークスルー（ｂｒｅａｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ）バルブおよびチャンバの使用である。ブレークスルーバルブは、真の閉鎖バルブではなく、むしろ流体の進行を停止するための作動流体の表面張力を用いる構造である。これらバルブは、流体の表面張力に依存するので、それらは、バルブにおいて、流体がバルブ構造の両側面および内部を連続的に充填するときではなく、フリー表面が存在する間でのみ作用し得る。
このようなバルブを達成するための方法の非排他的なリストは、制限されないで、疎水性材料のパッチ、特定領域の疎水性処理、チャネルの幾何学的圧縮（高さおよび幅の両方）、幾何学的膨張（チャネルの高さおよび幅の両方）、チャネルの壁の表面粗さの変化、および壁上に付与される電位を含む。
これらの「ブレークスルー」バルブは、それらが「ブレークスルー」され、そして流体をほぼ妨害されないで通過させる前に、固定かつ良好に規定された圧力に耐えるように設計され得る。チャネル中の圧力は制御され得、そしてそれ故、この流体は、所望されるとき進行させられ得る。この圧力を制御する異なる方法は、制限されないで、入力または出力ポートで外から付与される圧力、遠心分離力由来の圧力（すなわち、デバイスをスピンすることによる）、直線状加速由来の圧力（すなわち、チャネルに平行なコンポーネントでデバイスに加速を付与する）、動電学的圧力、泡形成からの内部に生成される圧力（化学反応によるか、または加水分解による）、機械的ポンプ輸送に由来する圧力、または浸透圧を含む。
「ブレークスルー」バルブは、図３５Ａ〜Ｅと組み合わせて示されかつ説明されるように、ミクロ流体フリー界面を生成するために用いられ得る。図３５Ａは、ブレークスルーバルブを利用してミクロ流体フリー界面を生成するためのデバイスの単純化した平面図を示す。第１のチャンバ９１００は、それぞれ、Ｔ形状チャネル９１０４の分岐９１０４ａおよび９１０４ｂを通じて第２のチャンバ９１０２と液体連絡している。
第１のブレークスルーバルブ９１０６は、第１のチャンバ９１００の出口９１０８に位置している。第２のブレークスルーバルブ９１１０は、第２のチャンバ９１０２の入口９１０５の上流の分岐９１０４ｂ中に位置する。第３のブレークスルーバルブ９１１２は、第２のチャンバ９１０２の出口９１１４に位置する。ブレークスルーバルブ９１０６、９１１０、および９１１２は、上記で一般的に説明されるような、疎水性パッチ、フローチャネルの幅の圧縮、または特定のその他の方法から形成され得る。図３５Ａ〜Ｅでは、開放ブレークスルーバルブが、斜線のない丸として描写され、そして閉鎖ブレークスルーバルブが斜線の丸として描写されている。
図３５Ｂ中に示される初期ステージでは、第１のチャンバ９１００は、任意のバルブ９１０６、９１１０、および９１１２のブレークスルー圧力未満の圧力で、Ｔ形状チャネル９１０４およびチャンバ入口９１０７のステム９１０４ｃおよび分岐９１０４ａを通って導入された第１の流体９１１６で充填される。図３５Ｃに示される第２のステージでは、第２のチャンバ９１０２は、バルブ９１０６のブレークスルー圧力未満であるが、バルブ９１１０および９１１２のブレークスルー圧力より大きい圧力で、Ｔ形状チャネル９１０４のステム９１０４ｃおよび入口９１０５を通って導入された緩衝液またはその他の媒介流体９１１８で充填される。
図３５Ｄで示される第３のステージでは、媒介流体９１１８は、第２のチャンバ９１０２中で、バルブ９１０６のブレークスルー圧力未満であるが、バルブ９１１０および９１１２のブレークスルー圧力より大きい圧力で、Ｔ形状チャネル９１０４のステム９１０４ｃおよび入口９１０５を通って導入された第２の流体９１２０で置換される。図３５Ｅに描写される最後のステージでは、第２の流体９１２０は、媒介流体を置換し、第１および第２の流体９１１６および９１２０を、別個ではあるが、Ｔ接合部９１０４を通じて連結されるチャンバ内の残し、ミクロ流体フリー界面９１２２を生成する。
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を生成するためのブレークスルーバルブの使用は、上記で与えられる特定の例に制限されない。例えば、代替の実施形態では、緩衝液または媒介溶液でフラッシュする工程は要求されず、そして第１の溶液は、第２の溶液で直接フラッシュすることにより除去され得、混合の所望されない可能な副産物は、上記チャネルおよびチャンバを通る第２の溶液の初期フローによって除去される。
まさに記載された実施形態は、閉鎖ミクロ流体デバイス中にミクロ流体フリー界面を生成するが、これは、本発明による実施形態では必要ではない。例えば、本発明による代替の実施形態は、流体の２つのリザバを連結するためにキャピラリー力を利用し得る。１つのアプローチでは、マイクロタイタープレートの開放ウェルがガラスキャピラリーのセグメントによって連結され得る。第１の溶液は、１つのウェルに、それがウェルを満たし、そしてガラスキャピラリーと接触するように分与され得る。キャピラリー力は、第１の溶液をキャピラリーの端部に侵入かつ流す。一旦、端部達すると、流体の運動は止まる。次に、第２の溶液が第２のウェルに添加される。この溶液は、キャピラリー入口で第１の溶液と接触し、そしてキャピラリーの端部で２つのウェル間のミクロ流体界面を生成する。
２つのウェル間の連結経路はガラスキャピラリーである必要はなく、そして代替の実施形態では、それに代わって、例えば、ガラスのストリップである親水性ストリップ、または従来のＣＶＤもしくはＰＶＤ技法により堆積されたリシカのラインを備え得る。あるいは、この連結経路は、高度に疎水性材料のパターン化された領域間の疎水性のより少ない材料の経路によって確立され得る。さらに、ウェル、または種々の形態にある複数の相互連結チャンバ間のこのような複数の連結が存在し得る。このような相互連結は、デバイスの使用の前にユーザーによって確立され得、流体状態における迅速かつ効率的な変形を可能にする。
先の例におけるように、２つのリザバがミクロ流体デバイスによって囲われていないが、その代わりにミクロ流体経路を通じて連結されている場合、代替の実施形態は、囲われた、および囲われていない、両方のリザバを有し得る。例えば、サンプルは、ミクロ流体デバイス中に装填され得、そして出口キャピラリーまたはオリフィスの端部に（上記のいずれかの圧力方法により）押される。一旦、出口キャピラリーの端部にあると、このキャピラリーは、試薬のリザバ中に浸漬され得る。このようにして、ミクロ流体フリー界面が、外部リザバとチップ中の試薬のリザバとの間に生成される。この方法は、単一の試薬を、ミクロ流体フリー界面拡散を用いて複数の異なる試薬に対してスクリーニングするために、多くの異なる出力キャピラリーまたはオリフィスを用いてパラレルに用いられ得る。
まさに記載された例では、試薬は、１つまたは多くの入口から、ミクロ流体デバイスを「通って」、１つまたは多くの異なる出口に送達される。あるいは、この試薬は、ミクロ流体界面を生成するために用いられるべき同じオリフィスを通って導入され得る。サンプル含有溶液は、キャピラリー中に吸引され（吸引を付与するか、キャピラリー力によるか、または溶液に圧力を付与することによるかのいずれかで）、そして次に、キャピラリーは、対比試薬中に浸漬され得、キャピラリーの端部とリザバとの間にミクロ流体界面を生成する。これは、多くの異なる試薬のパラレルスクリーニングのためのキャピラリーの大アレイで行われ得る。ごく小容量のサンプルが用いられ得る。なぜなら、これらキャピラリーは、それを超えてサンプルが進行する固定長さを有し得るからである。結晶化適用には（以下を参照のこと）、これらキャピラリーは取外され、そして結晶に触れる必要なくして、回折研究のためにＸ線ビーム中にマウントされ得る。
（２．平衡パラメータに対する再現性あるコントロール）
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散の使用の１つの利点は、広範な状態を再現性よくサンプリングする均一および連続的な濃度勾配を生成する能力である。界面のいずれかの側の流体は互いの中に拡散するので、勾配が拡散経路に沿って確立され、そして状態の連続体が同時にサンプリングされ得る。状態には変動があるので、空間および時間の両方において、陽性の結果（すなわち結晶形成）の位置および時間に関する情報が、さらなる最適化で用いられ得る。
多くの適用において、ｐＨ、濃度、または温度のような状態の勾配を生成することが所望される。このような勾配は、適用をスクリーニングすること、反応状態の最適化、動力学研究、結合親和性の決定、解離定数、酵素−速度プロファイリング、高分子の分離、およびその他の多くの適用のために用いられ得る。主に対流フローの抑制に起因して、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散は、信頼性があり、かつ良好に形成された勾配を確立するために用いられ得る。
次元のＥｉｎｓｔｅｉｎ等式（４）が、ミクロ流体フリー界面を横切る拡散時間の粗い推定を得るために採用され得る。
（４）ｔ＝ｘ２／４Ｄ；ここで：
ｔ＝拡散時間；
ｘ＝最長の拡散長さ；および
Ｄ＝拡散係数である。
一般に、以下の等式（５）に示されるように、拡散係数は、回転運動の半径とは逆に、そしてそれ故、１／分子量の立方根、として変動する。
（５）Ｄ∝１／ｒ∝／１／ｍ１／３；ここで：
Ｄ＝拡散係数；
ｒ＝回転運動の半径；および
ｍ＝分子量である。
等式（５）を再考する際に、回転運動の半径（ｒ）と分子量（ｍ）との間の相関は近似に過ぎないことを認識することが重要である。粘性力が慣性力に対して優位であるため、拡散係数は、実際、分子量とは独立しており、そしてそれに代わってサイズに依存し、そしてそれ故、拡散粒子によって引かれることが経験される。
色素に対する粗い１．５時間の平衡時間と比較して、同じ距離に対する２０ＫＤａのタンパク質の近似平衡時間は、約４５時間であると推定される。同じ距離に対する１００Ｄａの分子量の小さな塩の平衡時間は約４５分である。
流体界面を横切る拡散から生じる相対濃度は、平衡の間に探索された熱力学状態のみならず、平衡が生じる速度によって決定される。従って、平衡の動力学を制御することが、潜在的に価値がある。
従来の巨視的拡散方法では、平衡の動力学に対する粗い制御のみが、初期状態の操作を通じて利用可能であり得る。巨視的フリー界面拡散では、一旦、拡散が始まると、実験者は、引き続く平衡速度に対する制御はもたない。ドロップ実験を行うために、平衡速度は、初期ドロップのサイズ、リザバの合計サイズ、またはインキュベーションの温度を改変することにより変更され得る。微小バッチの実験では、サンプルが濃縮される速度は、ドロップのサイズ、および周辺オイルの同一性および量を操作することにより変更され得る。平衡速度は、錯綜した様式でこれらのパラメータに依存するので、平衡の動力学は、粗い様式でのみ変更され得る。さらに、一旦、実験が開始されると、平衡動力学に対するさらなる制御は利用可能ではない。
対照的に、本発明の実施形態による流体フリー界面実験では、拡散の平衡速度のパラメータもまた、チャンバの寸法を操作すること、およびミクロ流体構造物のチャネルを連結することにより制御され得る。例えば、圧縮チャネルを通じて流体連絡しているリザバを備えるミクロ流体構造物では、物質の高濃度または補充に起因して感知し得る勾配は存在せず、平衡のために必要な時間の良好な近似は、必要な拡散長さと直線的に変化する。平衡速度はまた、連結チャネルの断面積に依存する。平衡に必要な時間は、従って、連結チャネルの長さ、および断面積の両方を変更することにより制御され得る。
例えば、図４０Ａは、本発明によるミクロ流体構造物の簡単な実施形態の平面図を示す。ミクロ流体構造物９７０１は、第１の流体Ａおよび第２の流体Ｂを含むリザバ９７００および９７０２をそれぞれ備える。リザバ９７００および９７０２は、チャネル９７０４によって連結される。バルブ９７０６は、リザバ９７００と９７０２との間の連結チャネル上に配置される。
連結チャネル９７０４は、いずれのリザバよりもかなり小さな断面積を有する。例えば、本発明によるミクロ流体構造物の特定の実施形態では、リザバ／チャネル断面積の比、そしてそれ故、２つの流体を分離する断面積の比の最大比は、５００と２５，０００との間に入り得る。この範囲の最小は、５０×１０μｍチャネルに連結された５０×５０×５０μｍチャンバを記載し、そしてこの範囲の最大は、１０×１μｍチャネルに連結された５００×５００×５００μｍチャンバを記載する。
最初に、リザバ９７００および９７０２は個々の流体で満たされ、そしてバルブ９７０６は閉鎖される。バルブ９７０６の開放に際し、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面が生成され、そして流体ＡおよびＢは、この界面を横切り、チャネルを通って個々のリザバ中に拡散する。さらに、１つのリザバ中に存在する拡散物質の量が大きく、そして有意な濃度変化を受けることなく材料を受ける他方のリザバの容量もまた大きい場合、これらリザバ中の物質の濃度は、経時的に感知し得るほど変化せず、そして拡散の定常状態が確立される。
図４０に示される単純なミクロ流体構造物における流体の拡散は、比較的簡単な等式によって記載され得る。例えば、１つのチャンバから他方への化学種の正味のフラックスは、等式（６）によって単純に記載され得る：
（６）Ｊ＝Ｄ＊Ａ＊ΔＣ／Ｌ；ここで：
Ｊ＝化学種の正味のフラックス
Ｄ＝化学種の拡散定数；
Ａ＝連結チャネルの断面積；
ΔＣ＝２つのチャネル間の濃度差；および
Ｌ＝連結チャネルの長さである。
式（６）の項の積分および広範な操作の後、１つの容量Ｖ１が当初濃度Ｃであり、そして他方の容量Ｖ２が当初濃度０である２つのチャンバの平衡のための特徴時間τは、従って以下の式（７）に示されるように得られ得る：
（７）τ＝（１／（Ｖ１／Ｖ２＋１））＊（１／Ｄ）＊（Ｌ／（Ａ／Ｖ１））；ここで：τ＝平衡時間；
Ｖ１＝初期に化学種を含むチャンバの容量；
Ｖ２＝化学種が拡散して入るチャンバの容量；
Ｄ＝化学種の拡散定数；
Ａ＝連結チャネルの断面積；および
Ｌ＝連結チャネルの長さ、である。
従って、規定された容量のチャンバ中のある化学種の所定の初期濃度について、特徴的平衡時間は、拡散長さＬ、および容積に対する断面積の比（以後、単に「面積」という）に依存し、用語「領域」は、関係あるチャンバの容量によって規準化された面積をいうという理解である。２つのチャンバが図４０Ａの構造物中のような、圧縮チャネルによって連結される場合、１つのチャネルから他方への濃度ドロップは、主にこの連結チャネルに沿って起こり、そしてチャンバ中には感知し得る勾配は存在しない。これは、図４０Ｂに示され、図４０Ａの構造物について、濃度 対 距離の単純化したプロットである。
図４０Ａのミクロ流体構造物のチャンバ間の拡散の挙動は、例えば、Ｎａｔｉｃｋ，ＭａｓｓのＴｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ Ｉｎｃ．によって販売されるＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェアプログラムのＰＤＥツールボックスを利用してモデル化され得る。従って、図４１および４２は、１０００ｕｍの断面積をもつ３００ｕｍ長チャネルを通る、３００ｕｍ×３００ｕｍ×１００ｕｍチャンバから等しい寸法の別のチャンバへの塩化ナトリウムの拡散をシミュレートした結果を示す。これらチャンバの初期濃度は、それぞれ、１Ｍおよび０Ｍである。
図４１は、１つのリサバ中の濃度が最終平衡濃度の０．６に到達するために必要な時間を、チャネル長さに対してプロットする。図４１は、この単純なミクロ流体システムについて、拡散時間とチャネル長さとの間の直線的関係を示す。
図４２は、１つのリサバ中の濃度が最終平衡濃度の０．６に到達するために必要な時間（Ｔ０．６）逆数を、バルブの開放に際し生成される流体界面の面積に対してプロットする。図４２は、これらパラメータ間の直線的関係を示す。平衡時間定数とチャネル長さおよび１／チャネル面積のパラメータととの間の単純な関係は、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散混合の速度を制御するための信頼性があり、かつ直感的方法を可能にする。
この関係は、１つの試薬が、連結チャネル幾何学によって制御され得る拡散速度で、複数の試薬と拡散により混合されることを可能にする。例えば、図３８Ａは、各々ペアが異なる長さΔｘのミクロチャネル９８０６により連結される配合チャンバ９８００、９８０２、および９８０４のペアの３つのセットを示す。図３８Ｂは、平衡時間 対 平衡距離をプロットする。図３８Ｂは、図３８Ａのチャンバの平衡のために必要な時間が、連結チャネルの長さによって変化することを示す。
図３９は、各々が異なる配列の連結ミクロチャネル（単数または複数）９９０８を有する４つの配合チャンバ９９００、９９０２、９９０４、および９９０６を示す。ミクロチャネル９９０８は同じ長さを有するが、断面積および／または連結チャネルの数が異なる。平衡の速度は、従って、例えば、連結チャネルの数またはこれらチャネルの寸法を減少／増加することによって、その断面積を減少／増加することにより増加／減少され得る。
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散研究の別の望ましい局面は、広範な範囲の位相空間を再現性よく探索する能力である。例えば、推測的に、どの熱力学状態が特定の適用（すなわち、タンパク質結晶の核形成／成長）のために好ましいかを決定することは困難であり得、そしてそれ故、スクリーニング方法が可能な限り多くの位相空間（多くの状態）をサンプリングすることが所望される。これは、複数のアッセイを実施すること、そしてまた、各アッセイの展開の間に間に合ってサンプリングされる位相空間により達成され得る。
図４３は、異なる相対容量の２つのリザバをもち、そして１に規準化された初期濃度をもつ、図４０に示されるミクロ流体構造物を利用するリゾチームと塩化ナトリウムの対向拡散をシミュレートする結果を示す。図４３は、流体ＡとＢとの間の位相空間を描写する相のダイアグラム、および、流体が図４０中のバルブの開放により生成されるミクロ流体フリー界面を横切って拡散するときのリザバ中で横切られる位相空間中の経路を提示する。ず４３は、サプリングされた位相空間が、２つのリザバ中に含まれる流体の初期相対容量に依存することを示す。異なるサンプル容量をもつチャンバのアレイを利用すること、そして次にチャネルを横切る拡散が所望の結果（すなわち、結晶形成）を生じた事例を識別することにより、有望なさらなる実験の開始点が決定され得る。
上記のように、２つのリザバを連結するチャネルの長さまたは断面積を変更することは、複数種が混合される速度を変更する。しかし、チャネル容量が、総反応容量と比較したとき小さいままである限り、位相空間を通るチャンバ中の濃度の展開に対する影響はほとんどないか、または全くない。混合の動力学は、従って、反応の位相空間展開から脱共役され、拡散の動力学的および熱力学的挙動に対して影響が独立の制御を可能にする。
例えば、結晶学では、より遅い成長、およびより高い品質の結晶を可能にするように、平衡化を遅延することがしばしば所望される。従来技法では、これは、しばしば、グリセロールのような新たな化学的成分を添加することによるか、または微小バッチを用いることによって試みられている。しかし、成分のこの添加は良好に特徴付けられておらず、常に有効であるとは限らず、そして結晶の形成を阻害し得る。微小バッチ方法もまた、結晶を取り囲む溶液中のタンパク質が枯渇するとき、継続する結晶成長を促進する駆動力を欠く欠点を引き起こし得る。本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散の使用により、結晶形成は、連結チャネルの幅または断面積を単に変更することにより、位相空間展開を改変することなく良好に規定された量によって遅延され得る。
平衡が進行する速度を制御する能力は、熱力学およびミクロ流体フリー界面拡散混合の両方を保存しながら、反応の合計容量を増加することを望む場合、さらなる重要性を有する。１つのこのような事例は、再び、タンパク質結晶学の文脈で生じ、そこでは、初期の小容量結晶化アッセイが、回折研究のためには不十分なサイズの結晶を生じる。このような場合、反応容量を増加すること、そしてそれによって、同時に同じ拡散混合および位相空間を通る経路を維持しながら、結晶成長のために利用可能なより多くのタンパク質を提供することが所望される。チャンバ容量を比例して増加すること、およびチャネルの面積を減少することにより、総アッセイ容量に対する界面の面積が低減され、そしてより大きな容量が、当初の小容量状態中と同じ位相空間を通過し得る。
上記の説明は単一種の拡散に焦点を当ててきたが、互いに相互作用しない２つ以上の種の勾配が同時に生成され得、そして重ね合わされて濃度状態のアレイを生成する。図４７は、このような重ね合わせ勾配を生成するためのミクロ流体構造物の１つの例の平面図を示す。垂直方向に圧縮された平坦な浅いチャンバ８６００が、その周縁で、化学種ＡおよびＢのそれぞれ固定濃度を有するリザバ８６０２および８６０４に連結されている。リザバの形態のシンク８６０６は、種ＡおよびＢが実質的により低い濃度で維持される。初期の一時的な平衡の後、種ＡおよびＢの安定かつ良好に形成された勾配８６０８および８６１０がそれぞれ、二次元で確立される。
図４７の検査から明らかなように、この濃度勾配の正確な形態およびプロフィールは、これもまたその中に含まれていない化学種に対する濃度シンクとして作用し得る（すなわち、リザバ８６０４は化学種Ａに対するシンクとして作用し得る）、相対位置およびチャンバへの入口の数を含むがこれらに制限されないホストの因子に従って変動する。しかし、チャンバ内の各化学種の空間的濃度プロフィールは、二次元の良好に形成され、かつ連続的な空間的勾配を記載するための先に記載のＭＡＴＬＡＢプログラムを用いて容易にモデル化され得る。
図４７に示される特定の実施形態は、物質の連続的拡散の不利益を提供する。それ故、拡散種間の反応の産物の拡散を識別することが求められる場合、これら産物は、連続勾配中でそれら自身が拡散し、それによって分析を複雑にする。
従って、図４８は、二次元の拡散を達成するためのミクロ流体構造物の代替の実施形態の単純化された平面図を示す。直交するチャネル８７０２を横切るグリッド８７００は、空間的濃度勾配を確立する。固定濃度の化学種ＡおよびＢのリザバ８７０４および８７０８は、グリッド８７００の隣接するエッジ上に配置される。グリッド上のこれらリザバに対向して、より低い濃度の化学薬品の２つのシンク８７０３が対向するリザバ中に存在する。
各チャネル連結部８７１０を取り囲んで、グリッドを垂直方向および水平方向に通る拡散を制御する２対のバルブ８７１２および８７１４がそれぞれある。最初、バルブペア８７１４のみが開かれ、水平方向に第１の化学薬品の良好に形成された拡散勾配を生成する。次に、バルブペア８７１４が閉鎖され、そしてバルブペア８７１２が開放されて垂直方向に第２の化学薬品の良好に形成された拡散勾配を生成する。隣接する水平方向バルブにより単離されて、第１の化学種の勾配は、これら連結部の間の領域中に存在して残る。
一旦、第２（垂直）勾配が確立されると、これら２つの勾配は組み合わせられ、そしてすべてのバルブペアを短時間開放することにより、部分的拡散平衡を可能にする。拡散の期間が通過した後、重ね合わせた勾配を含むためにすべてのバルブペアが閉鎖される。あるいは、バルブペア８７１２および８７１４は、別個の単離されたチャンバを生成するためにすべての第２の水平方向バルブを開放し、垂直方向の拡散を停止するために閉鎖され得る。
要約すれば、従来の巨視的ミクロ流体フリー界面技法は、ｍｍのオーダーの寸法を有するキャピラリーチューブまたはその他のコンテナを採用する。対照的に、本発明の実施形態による流体界面は、μｍのオーダーの寸法を有するミクロチャネル中で形成される。このように小さな寸法では、所望されない対流は、粘度の影響に起因して抑制され、そして混合は拡散によって支配される。良好に形成された流体界面は、それ故、有意な所望されない対流混合なくして確立され得る。
（３．溶解度研究（プロテオミクス））
上記の論議は、タンパク質結晶化のためのフリー界面拡散の適用に焦点を当てており、ここでは、タンパク質サンプルを含む溶媒の環境は、ミクロ流体フリー界面を横切る結晶化剤の拡散によって改変され、タンパク質の相および結晶の形成における変化を生じた。しかし、このような結晶化研究への重要な前駆体は、このタンパク質が十分に可溶性かつ単一分散で、結晶化剤への曝露に際し結晶を形成する溶液を識別かつ得ていることである。
従って、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散のための代替の適用は、種々の溶媒中のタンパク質の溶解度を決定することである。詳細には、フリーのミクロ流体界面は、タンパク質サンプルへの溶媒の流れを計測するため、そしてそれ故、タンパク質の溶解度特徴を識別するために利用され得る。詳細には、フリーのミクロ流体界面の存在は、既知容量のチャネルに沿った均一かつ正確な濃度勾配を生成し得、それによって、研究者が、溶液中に入るタンパク質サンプルの既知量の能力を正確に識別することを可能にする。この情報は、次に、結晶を次に形成し易い濃縮されたタンパク質溶液の生成を可能にするために利用され得る。
（４．準透析によるサンプル精製）
上記の論議は、サンプルおよび溶媒の相対量が正確に制御され、溶液中のサンプルの濃度を、そしてそれ故、サンプルが溶液から固体である結晶形態に出現する性向を支配する、タンパク質結晶化およびプロテオミクス溶解度適用に関して焦点を当ててきた。しかし、サンプル濃度以外の多くの因子もまた、サンプル挙動において重要な役割を演じ得る。
１つのこのような因子はサンプル純度である。タンパク質単離および／または精製のための多くの一般的プロセスの１つのアーチファクトは、サンプルとの小塩の濃度である。これらの塩は、溶液中でタンパク質を安定化し得、そしてそうでなければ、結晶の核形成および成長を妨害する。これらの塩を除去するための１つの従来のアプローチは、膜を横切る透析による。しかし、このアプローチは、代表的には、巨視的スケールで起こり、比較的大きなサンプル容量の使用を含み、かつ、塩のバルク量の粗い除去を含む。
従って、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散のなお別の代替の適用は、サンプル溶液からの所望されない成分の除去にある。例えば、小塩の有意な濃度を含む単離および／または精製されたタンパク質を含む溶液が、バルブの１つの側にあるミクロ流体チャネル中に位置決めされ得る。バルブの作動を止めるに際し、タンパク質溶液と希釈剤との間のミクロ流体フリー界面が、より少ない塩が希釈剤中に迅速に拡散し、そしてそれによってサンプル中で枯渇されるように生成され得る。勿論、サンプル中に存在する特定量のタンパク質はまた、ミクロ流体フリー界面を横切って拡散することが予期され、そしてそれによって、このプロセスの間に希釈剤に失われ得る。しかし、小塩と大きなタンパク質分子との間のサイズにおける相違は、相対的拡散を束縛し、サンプル中のタンパク質の損失を制限することが期待され得る。
（５．タンパク質以外の結晶の成長）
本発明による実施形態は、これまでは、タンパク質のような生物学的高分子の結晶の成長に焦点を当ててきた。しかし、その三次元構造が研究され得る他のタイプの分子もまた、結晶を形成し得る。１つのこのような結晶形成のための有望な候補は、単一原子を包括するために利用され得る無機ナノ結晶である。
最近、科学コミュニティは、無機物質からナノ結晶を成長することに興味を示している。このような結晶は、ナノメートルスケールの寸法を有し、そしていくつかの例は、個々の原子を囲み得る。これらの結晶は、量子機械的影響によって支配される光の吸収および発光のような光学的性質を示す。これらの光学的性質は、結晶のサイズおよび質のような因子、およびそれによって囲まれる原子種の同一性に従って制御または変化され得る。
タンパク質結晶でのように、このようなナノ結晶のサイズおよび質は、大きな程度でそれが成長される状態に依存する。従って、相空間展開、およびナノ結晶の成長の間のこの展開の速度の両方を制御することが重要であることが証明され得る。このような制御は、タンパク質結晶化と組み合わせて先に記載されたように、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散を利用して達成され得る。
さらに、特定の場合には、結晶化の１つの要素の濃度を変化する結晶性質に対する影響を決定する重要性が証明され得る。これは、いずれかの端部における大きなリサバとともに（または、単に２つの大きなリザバを連結するチャネルに沿って）、連結チャンバの列による勾配をセットアップすることにより、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散を用いて達成され得る。次いで、結晶が各状態で（または状態の連続体に沿って）成長され、そして次にそれらの吸収／発光性質が尋問される。このようにして、単一の結晶化パラメータ（サンプルの濃度、結晶化剤、沈殿剤、またはいくつかのその他の種）を独立に変化させることが可能である。
チップ上に異なる光学的性質をもつナノ結晶の空間的分布を成長することもまた可能である。
（６．拡散免疫アッセイ）
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面の可能な価値ある別の適用は、標的への分析物の結合の分析である。従来は、分析物の標的への結合は、対流流れにおける分析物または標的単独のいずれかに対する分析物／標的組み合わせの変化した速度が、結合された組み合わせの存在を識別するために採用されるクロマトグラフィーのような技法により決定されている。
本発明による実施形態は、標的への分析物の結合がまた、分析物または標的単独のいずれかに対する分析物／標的組み合わせの変化したサイズ、そしてそれ故拡散の係数を生じるという事実を開拓する。この変化した拡散係数は、結合した組み合わせを識別するために利用され得る。
図６２Ａは、本発明よるミクロ流体フリー界面を横切る拡散を検出し得るデバイスの１つの実施形態の単純化した平面図を示す。流体ＡおよびＢを含むチャンバ８０００および８００２は、それぞれ、少なくとも１つの寸法が制限されている幅を有するチャネル８００４によって連結されている。最初は閉じているバルブ８００６が、チャネル８００４内に位置決めされ、流体ＡおよびＢを分離して維持する。チャンバ８００３は、連結チャネル８００５を通じてチャンバ８００２と流体連絡しており、そしてまた流体Ｂを含む。
第１の流体Ａは、制限されないで、蛍光、屈折率、電導度、光散乱、および比色センサの使用での変化を検出することを含む、分析技法により検出可能な分析物８００８を含む。第２の流体Ｂは、分析物８００８に結合することが知られる標的８０１０を含む。分析物８００８の標的８０１０への結合に際し、分析物／標的組み合わせは、分析物単独のそれに対して実質的に減少した拡散の係数を示す。
最初の時間Ｔ０において、バルブ８００６は開かれ、流体ＡとＢとの間にミクロ流体フリー界面８０１２を生成する。時間Ｔ１で始まり、分析物８００８は、チャネル８００４、チャンバ８００２、およびチャネル８００５を通り、チャンバ８００３中に拡散し始める。分析物８００８と標的８０１０との間に結合反応がないと、分析物は、経時的に、所定の速度で末端チャンバ８００３中に出現し始めることが予期され得る。これは、図６２Ｂに示され、これは、拡散の時間に対する末端チャンバ８００３中で検出されることが予期される信号の強度をプロットする。
しかし、チャネル中で、ある程度の反応が分析物８００８と標的８０１０との間で生じるので、ある％の分析物８００８が標的８０１０に結合し、この％の分析物の拡散の速度を効率的に遅延する。結果として、末端チャンバ中の信号の観察された強度は、経時的に減少し、結合した分析物／標的組み合わせのより遅い拡散の速度を反映する。これはまた図６２Ｂ中に示され、これは、拡散の時間に対する第２のチャンバ中で観察された信号の強度をプロットする。
予期される信号と観察された信号との間の差異は、経時的に分析され、流体システムに関する潜在的に価値ある情報を示す。例えば、個々の溶液中の標的および分析物の濃度が既知である場合、強度信号の経時的な展開の分析は、標的と分析物との間の反応性、すなわち、分析物が標的に結合し、そして結果としてその拡散が遅延される速度を示し得る。あるいは、標的と分析物との間の反応性が既知である場合、強度信号の時間展開の分析は、標的の初期濃度を示し得る。さらに、それに代わって、初期濃度および反応性が既知である場合、強度信号の時間展開は、標的のサイズを示し得、これは分析物単独に対する分析物／標的組み合わせの減少した拡散速度によって表される。
まさに提供された例は、拡散する分析物からの信号の強度の時間展開の分析を利用した。しかし、本発明による実施形態は、この特定のアプローチに制限されない。
例えば、図６３Ａは、拡散アッセイにおける使用のための構造の代替実施形態を示す。構造物８１００は、バルブ８１０４によって二分される一定幅および深さのミクロ流体８１０２を備える。検出可能な分析物８１０６を含む流体Ａは、バルブ８１０４の１つの側に位置決めされる。標的８１０８をも含む流体Ｂは、バルブ８１０４の他方の側に位置決めされる。
開始時間Ｔ０において、バルブ８１０４は開放され、流体ＡとＢとの間にミクロ流体フリー界面８１１０を生成する。時間Ｔ１で始まり、分析物８１０６は、界面８１１０を横切って拡散し始める。分析物８１０６と標的８１０８との間に結合反応がないと、特定の時間の後、チャネルの距離に対する信号の強度のプロフィールは、特徴的な形状を示すことが予期され得る。これは、図６３Ｂに示され、これは、拡散の時間に対する第２のチャンバ中で検出されることが予期される信号の強度をプロットする。
しかし、ある程度の反応が分析物８１０６と標的８１０８との間で生じるので、ある％の分析物が標的に結合し、この％の分析物の拡散の速度を効率的に遅延する。結果として、チャンバ中の後期における信号の観察された強度は変化し得、結合した分析物／標的組み合わせのより遅い拡散の速度を反映する。これはまた図６３Ｂに示され、これは、拡散の距離に対する第２のチャンバ中で観察された信号の強度をプロットする。
図６３Ａ〜Ｂ中に示される実施形態でのように、距離に対する予期される信号と観察された信号との間の差異は、潜在的に価値ある情報を示すために分析され得る。例えば、個々の溶液中の標的および分析物の濃度が既知である場合、強度信号の空間的展開の分析は、標的と分析物との間の反応性、すなわち、分析物が標的に結合し、そして結果としてその拡散が遅延される速度を示し得る。あるいは、標的と分析物との間の反応性が既知である場合、強度信号の空間的展開の分析は、標的の初期濃度を示し得る。さらに、それに代わって、初期濃度および反応性が既知である場合、強度信号の空間的展開は、標的の質量を示し得、これは分析物単独に対する分析物／標的組み合わせの減少した拡散速度によって表される。
（７．粘度測定）
上記の論議は、既知の状態下でミクロ流体フリー界面を横切るサンプルの拡散に基づく濃度または反応性のような化学的サンプルの性質を識別することに焦点を当てた。本発明の代替の実施形態によれば、しかし、流体内で拡散するサンプルよりむしろ、拡散が生じている流体の性質が、フリーミクロ流体界面を横切る拡散の性質を観察することによって決定され得る。
例えば、粘度を測定することへの１つの従来のアプローチは、サンプル流体をも含む閉鎖ベッセル中へのピストンの挿入すること、および次に、このベッセル中でピストンを回転するために必要なトルクを測定することを必要とする。このアプローチは、より大きな流体サンプルの粘度を測定するためには適切であるが、それは、比較的大きな容量のサンプル流体を必要かつ消費するという不利益を提供する。このような容量は、特に、生物学的分析の文脈では、分析のために入手可能ではないかも知れない。
本発明の代替の実施形態によれば、流体内で生成されるミクロ流体フリー界面を横切る既知のサイズおよび拡散係数のマーカー（すなわち、蛍光標識されたビーズまたは高分子）の拡散が、その粘度を決定するために利用され得る。このような技法は、生物学的または生理学的サンプルの粘度の分析に特に適用かのうである。なぜなら、拡散が生じるミクロ流体チャネルの寸法が比較的小容量を占めるからである。
（８．競合結合アッセイ）
上記で論議された拡散免疫アッセイとは異なるタイプのアッセイは、競合結合アッセイである。競合結合アッセイは、タンパク質のような標的分子に結合される現存するリガンドを置換する競合リガンドの性向を決定する。この置換傾向は、元のリガンド／標的分子組み合わせを、競合リガンドと、種々の濃度で混合することにより決定され得る。従来は、このような結合アッセイは、適切な濃度範囲を十分な分解度でカバーするために多数の別個の実験を必要としている。
しかし、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散は、多数のアッセイ状態が一度にサンプリングされ得るように、連続的または別個の勾配を確立することを可能にする。例えば、本発明の１つの実施形態によれば、競合結合アッセイが、チャネルによって連結されるチャンバの列で生成される競合リガンド濃度の個別の勾配を利用して実施され得る。
このアプローチは図６５に示され、これは、狭いチャネル８３０２によって連結され、そしてリザバ８３０４と８３０６との間に位置決めされたチャンバ８３００ａ〜ｃの列を示す。リザバ８３０４は高濃度の競合リガンド８３０８を含み、そしてリザバ８３０６は、競合リガンドを含まない。リザバからまたは互いからのチャンバ８３００ａ〜ｃの各々中への流れは、連結チャネル８３０２中に位置決めされたバルブ８３０５によって独立に制御され得る。チャンバの列のいずれかの末端における濃度は、チャンバに対するリザバの大容量によって、またはリザバへの物質の連続的流れによって固定され得る。
最初は、列中のチャンバは、標的８３１２に結合した元のリガンド８３１０の特定濃度を含む第１の流体で充填される。次に、チャンバ８３００ａ〜ｃが、界面バルブ８３０５を開くことにより、リザバおよび互いとの流体連絡に置かれる。一旦、これらの界面バルブが開放されると、チャンバ間にミクロ流体フリー界面が確立され、そして溶液は拡散により平衡化する。列に沿った各チャンバの位置は、その特定のチャンバ内の競合リガンドの濃度を決定する。
競合リガンドは、代表的には、標的分子よりかなり小さく、そしてそれ故、迅速に平衡化する。競合リガンドによって標的から置換された元のリガンドは遊離し、標的チャンバから別のチャンバに拡散する。リガンド／標的組み合わせに対して元のリガンドの減少したサイズのために、置換された元のリガンドは、より大きな拡散係数を示し、そしてそれ故、より速い速度で拡散することが予期され得る。図６２Ａ〜Ｂおよび６３Ａ〜Ｂと組み合わせて上記で記載されたのと類似の様式で、元のリガンドが蛍光を発すれば、その存在、そしてそれ故、標的からの置換の速度は、予期される時間的または空間的プロフィールからの偏差について蛍光信号を分析することにより示され得る。
まさに記載された実施形態は、蛍光信号の位置における変化を経時的にモニターし、競合的結合を識別するが、本発明の代替の実施形態によれば、蛍光信号の強度における減少がまた、競合結合アッセイを実施するために検出され得る。詳細には、蛍光リガンドが、消光分子の存在下で利用され得る。蛍光分子は、それが別の分子と相互作用し、蛍光発光を抑制するとき消光される。
図６６は、消光物質を利用する競合結合アッセイを実施するためのミクロ流体システムの単純化した実施形態の平面図である。第１のチャンバ８４００は、標的分子８４０２、第１の蛍光リガンド８４０４、および消光分子８４０６を含む。第１のチャンバ８４００は、ミクロ製作チャネル８４０８を経由して、競合リガンド８４１２、および同じ濃度の標的分子８４０２、第１の蛍光リガンド８４０４、および第１のチャンバ８４００中に存在するような消光分子８４０６を含む第２のチャンバ８４１０に連結される。
第１の蛍光リガンド８４０４が標的８４０２に結合されるとき、それは、消光分子と相互作用することができず、そしてそれ故、蛍光発光が観察され得る。しかし、第１の蛍光リガンドが標的に結合しないとき、それは消光されて、そしてそれ故、蛍光発光は観察されない。このようにして、蛍光信号強度における減少は、競合結合挙動を示し得る。
当初はチャンバ８４００および８４１０の内容物を分離するバルブ８４１４は開放され、ミクロ流体フリー界面８４１４を生成し、そして拡散により２つの流体を混合する。これら流体は、第２のチャンバ中の競合リガンドの存在を除いて同一であるので、競合リガンドのみが、チャンバ間の正味の拡散輸送を経験し、そしてチャンバ間に直線状勾配を確立する。チャネルの異なる部分に沿った蛍光強度を観察することにより、第１の蛍光リガンドを置換するために必要な競合リガンドの濃度が決定され得る。あるいは、経時的な末端チャンバ中の蛍光のレベルがモニターされ、標的から第１の蛍光リガンドを置換するために必要な競合リガンドの濃度を決定し得る。いずれかの方法を用い、単一の実験が採用されて、状態の連続体下の競合結合アッセイの結果を決定し得る。
（９．基質／インヒビターアッセイ）
酵素の活性は、異なる濃度のリガンドの存在に応答して測定され得る。例えば、反応を触媒するタンパク質は、タンパク質の活性部位に強く結合する小分子によって損なわれ得る。基質代謝回転アッセイは、酵素活性に対するこのようなリガンドの影響を決定するために用いられ得る。
酵素が蛍光産物を生成する反応を触媒する場合、この酵素の活性は、蛍光をモニターすることにより決定され得る。蛍光を生成する反応の触媒の１つの例は、酵素β−ガラクトシダーゼによるβ−Ｄ−ガラクトピラノシドのレゾルフィンへの加水分解である。レゾルフィンは、経時的にモニターされ得る蛍光産物である。Ｒａｍｓｅｙら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．６９、３４０７〜３４１２（１９９７）。阻害分子の濃度の関数として酵素の活性を決定することにより、反応のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ速度定数が決定され得る。本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散勾配の生成は、単一の実験におけるこの濃度依存性の決定を可能にし得る。
図６７は、このような基質代謝回転アッセイを実施するためのミクロ流体構造物の実施形態の単純化した平面図を示す。ここで再び、リザバ８５００および８５０２は、チャンバの寸法よりかなり小さな幅を有するチャネル８５０４によって連結される。リザバ８５００および８５０２は、基質８５０９を同じ濃度で含み、そしてリザバ８５０２はまた、インヒビター分子８５０８を含む。インヒビター分子濃度の勾配は、チャネルに対するそれらの大容量、または外部供給源からの材料の補充のいずれかに起因して、リザバ８５００および８５０２中の物質の固定された濃度を維持することにより達成される。チャンバは、チャネル８５０４の長さに沿って含めてもよく、または含めなくてもよく、特定の濃度で反応部位のより大きな容量を提供する。
一旦、インヒビター分子の濃度勾配が確立されると、バルブ８５１０が作動されて、チャネルのセクション（またはチャネルによって連結される個々のチャンバ）を隔離し、これらは、次に、酵素８５１４を含む別個のウェル８５１２と混合される。各ウェルの蛍光を経時的にモニターすることにより、各チャンバにおける酵素の活性を決定することが可能である。
本発明の実施形態による活性の検出は、蛍光によることを要求されない。識別されるべき基質に依存して、酵素活性および得られる触媒は、ほんのわずか指名して、比色法、屈折率、表面プラスモン共鳴、または電導度の分析により決定され得る。
（１０．バイオセンサ）
ほんの少数％の既知の微生物が、実験室設定で培養および増殖され得る。この比較的低い成功率は、代表的には、細胞増殖を誘導するために要求される実質的な数の因子に大部分は起因する。細胞増殖を促進するための構造の成功は、増殖する細胞に栄養物を連続的に供給し、そして細胞代謝によって生成される廃棄産物を除去する能力に基本的に依存している。
本発明の実施形態によれば、ミクロ流体フリー界面拡散は、必要な食物を細胞に連続的に供給し、そして廃棄産物を除くために採用され得る。細胞は、食物、増殖因子、緩衝液、および細胞増殖を支持するその他の材料を含む種々のリザバに、細胞が通過するには、小さすぎるチャネルを経由して連結されるチャンバ中に導入され、かつ含まれ得る。フリー界面拡散を次に用いて、食物、増殖因子、または廃棄物のチャンバへのおよびそれからのフラックスを制御する。
例えば、図２７Ａおよび２７Ｂは、本発明によるセルペン構造物の１つの実施形態の平面図および（線４５Ｂ−４５Ｂ’に沿った）断面図をそれぞれ示す。セルペン４５００は、基板４５０５と接触するエラストマーブロック４５０３中のフローチャネル４５０１の拡大部分４５００ａとして形成される。セルペン４５００は、セルペン４５００の端部４５００ｂおよび４５００ｃは内部領域４５００ａを完全に囲わないことを除いて、図２６Ａ〜２６Ｄで上記に記載されたような個々のセルペンに類似している。むしろ、ケージ４５００の端部４５００ａおよび４５００ｂは、複数の退避可能な支柱４５０２によって形成される。支柱４５０２は、図２１Ａ〜２１Ｊと組み合わせて上記で詳細に記載されたような通常は閉鎖されるバルブ構造物のメンブレン構造物の一部分であり得る。
詳細には、制御チャネル４５０４は支柱４５０２の上に横たわる。制御チャネル４５０４中の圧力が減少するとき、エラストマー支柱４５０２は上方に制御チャネル４５０４中に引かれ、それによってセルペン４５００の端部４５００ｂを開き、そして細胞が入ることを許容する。制御チャネル４５０４中の圧力の上昇の際、支柱４５０２は基板４５０５に対して下方に弛緩し、そして細胞がケージ４５００が出るのを防ぐ。
エラストマー支柱４５０２は、ケージ４５００からの細胞の移動を防ぐために十分なサイズおよび数であるが、また、その中に貯蔵された細胞（単数または複数）を維持するためにケージ内部４５００ａ中への栄養物の流れまたは拡散を可能にするギャップ４５０８を含む。対向する端部４５００ｃ上の支柱４５０２は、第２の制御チャネル４５０６の下に同様な形態とされ、所望によりケージの開放および細胞の除去を許容する。
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散は、セルペン内で増殖する細胞への栄養物および増殖因子の定常的供給を提供するため、およびセルペンからの低分子量塩類のような廃棄産物を除去するために利用され得る。１つの実施形態が図６４中に示され、ここでは、セルペン８２００は、ミクロ流体フリー界面８２０６を横切る拡散により栄養分８２０５を供給するフローチャネル８２０４の行き詰まり分岐チャネル８２０２と流体連絡している。セルペン８２００からの廃棄産物８２０７もまた、次いで、ミクロ流体フリー界面８２０６を横切って拡散し、そして除去のためにフローチャネル８２０４中に入る。
セルペンへの、およびそれからの物質の拡散の速度に対する制御は、幅、高さ、および長さ、連結チャネルの数、リザバのサイズ、チャンバのサイズのようなミクロ流体チャネルの寸法、ならびに栄養物供給およびまたは廃棄産物の濃度を変化することにより達成され得る。上記で列挙した因子を変化することにより、とりわけ、細胞増殖および分裂の速度、そしてそれ故、細胞の最大密度を調節することが可能である。そしてミクロ流体寸法では、狭いチャネルによって連結されるより大きな容量のチャンバ内に感知し得る濃度勾配はないので、このようなチャンバ内の全細胞集団は、類似の状態に同時に曝され得る。
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散を利用して、隣接するチャンバ中に位置決めされた、２つ以上の異なる株の細胞を、チャンバ間を移動する栄養分、廃棄物、および細胞増殖のその他の産物の拡散を可能にしながら培養することもまた可能であり得る。このタイプのミクロ流体構造物および方法は、近接する細胞間の、制限されないで、細胞信号伝達、細胞／細胞毒性、および細胞／細胞共生を含む相互作用を研究することで特に価値があり得る。
最後に、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散は、所望の細胞増殖状態をスクリーニングするために栄養分／廃棄物状態の勾配を確立するためにさらに用いられ得る。細胞培養を増殖するための拡散の使用は、これらの小寸法で現実的であり、ここでは、拡散長さが短く、そして容量は、短時間に亘り状態を有意に変化させる拡散輸送を可能にするに十分小さい。
（１１．化学走化性）
本発明による実施形態のなお別の可能な適用は、化学走化性の研究である。化学走化性は、特定の化学薬品の濃度勾配に応答する運動性細胞の移動の方向の変化である。方向のこの変化は、特有の速度で感知された化学薬品に向かうか、またはそれから離れて動く細胞を生じ得る。化学走化性は、免疫応答で鍵となる役割を演じ、ここで、免疫系の成分は、外来因子の存在に起因する化学的環境における感知した変化に応答して外来因子に移動し、かつそれを破壊する。
本発明の実施形態によって生成されたミクロ流体フリー界面は、化学物質濃度勾配を正確に再現するための価値ある方法を提供し得る。これらの濃度勾配への曝露に応答する運動性細胞の活性は、研究者が化学走化性の現象を研究および理解することを可能にする。
（１２．架橋／多孔性勾配をもつポリマーを作成すること）
多くの生物学的適用では、重合ゲルが、代表的には均一組成であるこのゲルを通る分子の拡散する移動度に基づいてこれらを分離するために用いられている。しかし、分子を効率的に分離するゲルの能力は、ゲルの形成の間のｐＨ、密度、または重合架橋のような性質に関して勾配を課すことにより改善され得る。
本発明の実施形態によれば、ミクロ流体フリー界面拡散が、特定の性質の良好に形成された勾配を有する重合化ゲルを製作するために用いられ得る。例えば、１つの例では、濃縮された、重合されていない、光硬化可能なゲル（アガロースなど）が、緩衝溶液を含む第２のミクロ流体チャンバとミクロ流体チャネルを経由して流体連絡しているミクロ流体チャンバ中に導入され得る。個々のチャンバの内容物は、チャネルを通じて互い中に拡散するので、ゲル濃度勾配が確立される。一旦、この勾配が形成されると、ゲルは、ＵＶ照射に曝され得、固形ゲルを生成する架橋を生じる。このゲル濃度勾配は、そしてそれ故、ゲルの多孔性は、この重合の結果としてゲル中に固定される。
まさに記載されたような勾配を示すゲルは、電位を付与すること、および分子を最大の多孔度および最低のゲル濃度の領域から最小の多孔度および最高のゲル濃度の領域までゲルを通じて移動させることにより高分子のサイズを決定するために用いられ得る。一旦、ゲルの平均ポアサイズが、この分子を通過させるには小さ過ぎるようになると、この分子は、ゲル中に捕獲されて残り、そして標準的な蛍光または銀染色方法によって検出可能である。従って、ゲル中の分子の位置は、この分子のサイズの直接的反映である。
本発明によるミクロ流体フリー界面拡散を用いる重ね合わせ勾配でゲルを形成する代替の実施形態では、重合したゲルは、インプリントされたｐＨ勾配で形成され得る。このような代替の実施形態では、第１のチャンバは、１つのｐＨの１つの緩衝液で非重合ゲルで充填され、そして第２のチャンバは、第２のｐＨの第２の緩衝液で同じ濃度の非重合ゲルの組み合わせで充填される。次いで、分子は、チャンバを連結するミクロ流体チャネルを横切って拡散され、ｐＨ勾配を確立する。ゲルは、次に、重合されて均一多孔度の固形ゲルを生成する。拡散する分子が、ゲルマトリックスに永久的に結合され得る場合、均一なｐＨ勾配が、連結チャネルの長さに沿って永久的に確立され得る。このようなｐＨ勾配は、付与された電場との組み合わせで採用され得、ゲルを通って移動する分子をそれらの異なる等電位点に基づいて分離する。
（１３．薬物送達システム）
ミクロ流体チャンバからまたはその中へのフラックスの速度を制御する能力は、時計のような能動的制御戦略なくして、化学薬品または薬物の時限放出を可能にする。例えば、移植されたミクロ流体薬物送達デバイスは、変化する幾何学的形状のミクロ流体チャネルを通じて出口オリフィスに連結された複数のチャネルを含み得る。このようにして、チャネル中の化学薬品の各々の輸送の速度が、別個および組み合わせて制御され得る。このような構造を利用し、いくつかの異なる薬物が、異なりかつ良好に規定された速度で身体中に導入され得る。
例えば、ミクロ流体フリー界面拡散を利用する薬物送達の実施形態では、複数のチャンバが、最初、緩衝溶液で満たされたチャンバに変動する寸法のチャネルを経由して連結され得る。これらの緩衝液で満たされたチャンバは、次いで、順に、種々の寸法のチャネルを経由して出口オリフィスに連結され得る。ミクロ流体チャンバおよび連結チャネルの寸法は、チャンバから身体中への薬物の放出の速度およびタイミングの両方に対する制御を可能にする。幅および長さ、ならびにチャンバ容量および形状のようなチャネル寸法、ならびに薬物濃度の思慮深い選択により、経時的に薬物送達の合計速度に対する非常に正確な制御を達成することが可能である。
（１４．高度に反応性の化学薬品種の混合）
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面にとって可能な適用のなお別の例は、高度に反応性の種の制御された混合にある。例えば、特定の状況下では、２つ以上の化学種間で遅いかまたは段階的なペースで反応を生じさせることが所望され得る。しかし、対流流れを含む従来の状態では、これらの種は、突然および／または激しく反応し得、反応産物の有用性を和らげる。
しかし、本発明の実施形態によれば、これら化学種間の接触および反応は、対流流れはなく、専ら拡散により支配される。従って、これら化学種間の反応を遅延しかつ支配可能なペースで行うことが可能であり得る。本発明による実施形態がかなりの利点を提供し得る１つの分野は、爆発性であるか、またはその他の潜在的に不安定な産物の調製にあり、そこでは、迅速に変化する反応体濃度が、危険またはそうでなければ所望されない状態を生じ得る。本発明による実施形態はまた、最終または中間産物が不安定、高度に反応性、および／または揮発性である組み合わせ合成適用のために潜在的に有用であり得る。
（１５．生物学的アッセイ）
本発明によるミクロ流体フリー界面の実施形態は、種々の適用のために採用され得る。このような適用の例は以下に要約される。可能な適用のより完全な記載は、すべての目的のために参考として本明細書によって援用される、２００１年１１月１６日に出願され、そして「細胞アッセイおよび高スループットスクリーニング」と題するＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／４４８６９中に見出され得る。このような適用を実施するために適切なミクロ流体構造物の例は、本明細書に記載のものを含み、ならびにその他は、すべての目的のために参考として本明細書によって援用される、代理人事件番号第２０１７４Ｃ−００４４３０号として２００２年４月５日に出願された、米国非仮特許出願第 ／ 号、「ミクロ流体デバイスを利用する核酸増幅」中に記載されている。
広範な種々の結合アッセイが本明細書に開示のミクロ流体デバイスを利用して実施され得る。本質的に任意のリガンドおよび抗リガンド間の相互作用が検出され得る。調査され得るリガンド／抗リガンド相互作用の例は、制限されないで、酵素／リガンド相互作用（例えば、基質、コファクター、インヒビター）；レセプター／リガンド；抗原／抗体；タンパク質／タンパク質（同種親和性／異種親和性相互作用）；タンパク質／核酸；ＤＮＡ／ＤＮＡ；およびＤＮＡ／ＲＮＡを含む。従って、これらのアッセイは、例えば、目的のレセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニストを同定するため、レセプターに結合し、かつ細胞内信号カスケードを誘引し得るリガンドを同定するため、および相補的核酸を同定するために用いられ得る。アッセイは、当業者の周知の、リガンドおよび推定の抗リガンドが互いに接触される直接結合フォーマットか、または競合結合フォーマットで実施され得る。
異種結合アッセイは、複合体が、非反応因子から、標識された複合体が非複合体化標識反応体から区別され得るように分離されるステップを含む。しばしば、これは、リガンドまたは抗リガンドのいずれかを支持体に付着することによって達成される。リガンドおよび抗リガンドが接触された後、非複合体化反応体は洗浄され、そして残存する複合体が次いで検出される。
本明細書中に提供されるミクロ流体デバイスで実施される結合アッセイはまた、均一フォーマットで実施され得る。この均一フォーマットでは、リガンドおよび抗リガンドが溶液中で互いと接触され、そして結合複合体は、非複合体化リガンドおよび抗リガンドを除去しなければならないことはなく検出される。均一アッセイを実施するためにしばしば利用される２つのアプローチは、蛍光偏光（ＦＰ）およびＦＲＥＴアッセイである。
ミクロ流体デバイスはまた、競合フォーマットで利用され得、既知の結合パートナー間の相互作用を阻害する薬剤を同定する。このような方法は、一般に、結合パートナーが相互作用し、そして複合体を形成することを可能にするに十分な状態下および時間の間、結合パートナーを含む反応混合物を調製することを含む。阻害活性について化合物を試験するために、この反応混合物は、試験化合物の存在下（試験反応混合物）および非存在下（コントロール反応混合物）で調製される。結合パートナー間の複合体の形成が、次いで、検出され、代表的には、結合パートナーの１つまたは両方による保持される標識を検出することによる。コントロール反応におけるより多くの複合体、次いで、試験反応混合物中の統計学的に有意な差異を構成するレベルの形成は、この試験化合物が結合パートナー間の相互作用を妨害することを示す。
免疫学的アッセイは、本発明の実施形態によるミクロ流体デバイスで実施され得るアッセイの１つの一般的カテゴリーである。特定のアッセイが、目的の特定の抗原に特異的に結合し得る抗体について、抗体の集団をスクリーニングするために実施される。このようなアッセイでは、試験抗体または抗体の集団が抗原と接触される。代表的には、抗原は固体支持体に付着される。免疫学的アッセイの例は、当該分野で公知のような酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および競合アッセイを含む。
本明細書で提供されるミクロ流体デバイスを利用して、種々の酵素アッセイが実施され得る。このような酵素アッセイは、一般に、アッセイを実施するために必要な成分を含むアッセイ混合物を、種々の分岐フローチャネル中に導入することを含む。このアッセイ混合物は、代表的には、例えば、酵素のための基質（単数または複数）、必要なコファクター類（例えば、金属イオン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）、および緩衝液を含む。カップルしたアッセイが実施されるべき場合、アッセイ溶液はまた、一般に、酵素、基質（単数または複数）および酵素カップルのために必要なコファクターを含む。
本発明の実施形態によるミクロ流体デバイスは、産生される酵素産物に選択的に結合する物質を含むために配列され得る。いくつかの事例では、この材料は、この反応産物自体に対して特異的な結合親和性を有する。幾分より複雑なシステムは、転移反応を触媒する酵素のために開発され得る。このタイプの特定のアッセイは、例えば、ドナー基質から、検出部分および親和性標識の両方を保持する産物を産生するために親和性標識を保持するアクセプター基質への検出可能部分の転移を触媒する酵素をインキュベートすることを含む。この産物は、この親和性標識に特異的に結合する相補的試薬を含む物質によって捕獲され得る。この物質は、代表的には、捕獲された産物が容易に検出され得るような検出領域中に位置決めされる。特定のアッセイでは、この物質は、検出セクションの内部チャネル壁にコートされ；あるいは、この物質は、試薬でコートされる検出領域中に位置決めされた支持体であり得る。
本発明のデバイスを利用する特定のアッセイは、細胞よりもむしろベシクルで実施される。このようなアッセイの１つの例は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を利用するＧプロテインカップルレセプターアッセイである。目的のレセプターを過剰発現する細胞から構築された膜ベシクルが、主フローチャネル中に導入される。ベシクルは、これもまた主フローチャネルによって導入される蛍光天然リガンドと混合される前に、インヒビターと予備混合され、そして分岐フローチャネルを経由するか、または主フローチャネルの１つを経由するかのいずれかである。成分は所望の時間の間インキュベートされ、そして蛍光信号が、Ｅｖｏｔｅｃ／Ｚｉｅｓｓ Ｃｏｎｆｏｃｏｒ（シングルまたはダブル光子計数デバイス）のようなＦＣＳリーダーを用いてフローチャンバー中で直接分析され得る。
ＦＲＥＴアッセイはまた、本明細書に開示されるデバイスを用い、多くのリガンド−レセプター相互作用を行うために利用され得る。例えば、ＦＲＥＴペプチドレポーターは、青−および赤−シフトＧＦＰ改変体から構成される蛍光タンパク質をコードするベクター中にリンカー配列（リン酸化部位のようなタンパク質の誘導可能なドメインに対応する）を導入することにより構築され得る。このベクターは細菌発現ベクター（生化学的研究のため）また哺乳動物発現ベクター（インビボ研究のため）であり得る。
核レセプターのアッセイもまた、本発明のミクロ流体デバイスで実施され得る。例えば、コアクチベーター／核レセプター相互作用のためのＦＲＥＴ−ベースのアッセイが実施され得る。詳細な例として、このようなアッセイは：（ａ）ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質、ＧＦＰ誘導体）でタグ化されたレセプターのリガンド結合性ドメイン、および（ｂ）Ｙｅｌｌｏｗ蛍光タンパク質（ＹＦＰ）でタグ化されたレセプター結合性タンパク質（コアクチベーター）間のＦＲＥＴ相互作用を検出するために実施され得る。
蛍光偏光（ＦＰ）は、核レセプター−リガンド置換およびキナーゼ阻害のための高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を開発するために利用され得る。ＦＰは溶液−ベースの均一技法であるので、反応成分の固定化または分離は要求されない。一般に、これらの方法は、レセプターのための蛍光標識されたリガンドと関連する試験化合物との間の競合を用いることを含む。
多くの異なる細胞レポーターアッセイが、提供されたミクロ流体デバイスで実施され得る。実施され得る１つの一般的タイプのレポーターアッセイは、細胞レセプターに結合し、そしてレポーター構築物の転写を活性化する細胞内信号または信号カスケードの活性化を誘引し得る試薬を同定するために設計されたアッセイを含む。このようなアッセイは、目的の遺伝子の発現を活性化し得る化合物を同定するために有用である。以下に論議されるツーハイブリッドアッセイは、本発明のデバイスで実施され得る細胞レポーターアッセイの別の主要なグループである。このツーハイブリッドアッセイは、タンパク質間の結合相互作用を調査するために有用である。
しばしば、細胞レポーターアッセイは、化合物のライブラリーをスクリーニングするために利用される。一般に、このような方法は、細胞を主フローチャネル中に導入することを含み、その結果、細胞は、主フローチャネルと分岐チャネルとの間の交差点に位置決めされるチャンバ中に保持される。異なる試験試薬（例えば、ライブラリーから）が、次いで、異なる分岐チャネル中に導入され得、そこで、それらは、チャンバ中の細胞と混合されるようになる。あるいは、細胞は主フローチャネルを経由して導入され得、そして次に分岐チャネル中に移され、そこで、細胞は、保持領域中に貯蔵される。一方では、異なる試験化合物が、異なる分岐フローチャネル中に導入され、通常は主フローチャネルと分岐フローチャネルとの交差点に位置決めされるチャンバを少なくとも部分的に満たす。保持領域中に保持された細胞は、適切なバルブを開放することにより放出され得、そしてこれら細胞は、異なる試験化合物との相互作用のためのチャンバに移される。一旦、細胞と試験化合物とが混合されると、得られる溶液は、保持スペースに戻されるか、またはレポーター発現の検出のための検出セクションに輸送される。この細胞および試験試薬は、必要に応じてさらに混合され、そして上記で提示された設計の混合器を用いてインキュベートされる。
遺伝子発現を誘引し得るような化合物をスクリーニングすることで利用される細胞は、代表的には目的のレセプターを発現し、そして異種レポーター構築物を宿す。このレセプターは、リガンドのレセプターへの結合に際し、遺伝子の転写を活性化するものである。このレポーター構築物は、通常は、転写制御要素およびそれに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含むベクターである。この転写制御要素は、調査下にあるレセプターへのリガンドの結合に際して生成される細胞内信号（例えば、転写因子）に応答する遺伝子要素である。このレポーター遺伝子は、検出可能な転写または翻訳産物をコードする。しばしば、レポーター（例えば、酵素）は、ミクロ流体デバイスと関連する検出器によって検出され得る光学的信号を生成し得る。
広範な種々のレセプタータイプがスクリーニングされ得る。これらレセプターは、しばしば細胞表面レセプターであるが、細胞内レセプターもまた、スクリーニングされる試験化合物が細胞中に侵入し得ることを前提に調査され得る。調査され得るレセプターの例は、制限されないで、イオンチャネル（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウムチャネル）、電圧−ゲートイオンチャネル、リガンド−ゲートイオンチャネル（例えば、アセチルコリンレセプター、およびＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）レセプター）、成長因子レセプター、ムスカリンレセプター、グルタメートレセプター、アドレナリン作動性レセプター、ドーパミンレセプターを含む。
実施され得る細胞アッセイの別の一般的カテゴリーは、ツーハイブリッドアッセイである。一般に、このツーハイブリッドアッセイは、多くの真核生物転写因子は、２つの異なるハイブリッドまたは融合タンパク質間の相互作用を検出するための別個のＤＮＡ結合ドメインおよび別個の転写活性化ドメインを含むという事実を開拓する。従って、ツーハイブリッドアッセイで利用される細胞は、２つの融合タンパク質をコードする構築物（単数または複数）を含む。これら２つのドメインは、特定条件下で互いと潜在的に相互作用し得る別個の結合性タンパク質に融合される。ツーハイブリッドアッセイを実施することで利用される細胞は、その発現が２つの融合タンパク質間の相互作用、または相互作用の欠如のいずれかに依存するレポーター遺伝子を含む。
まさに記載したアッセイに加えて、細胞膜電位をアッセイするための種々の方法が、本明細書に開示のミクロ流体デバイスで実施され得る。一般に、膜電位およびイオンチャネル活性をモニターするための方法は、２つの代替方法を用いて測定され得る。１つの一般的アプローチは、細胞内側のイオン濃度におけるバルク変化を測定するために蛍光イオンシェルターを用いることである。第２の一般的アプローチは、膜電位に感受性のＦＲＥＴ色素を用いることである。
本明細書に開示のミクロ流体デバイスは、細胞増殖をモニターするための種々の異なるアッセイを実施するために利用され得る。このようなアッセイは、種々の異なる研究で利用され得る。例えば、これら細胞増殖アッセイは、例えば、中毒学分析で利用され得る。細胞増殖アッセイはまた、腫瘍を含む種々の細胞増殖障害の処置のための化合物をスクリーニングすることで価値を有する。
本明細書に開示のミクロ流体デバイスは、毒性状態を同定するため、可能な毒性について試薬をスクリーニングするため、毒性侵襲に対する細胞応答を調査するため、および細胞死をアッセイするために設計された種々の異なるアッセイを実施するために利用され得る。種々の異なるパラメータが、毒性を評価するためにモニターされ得る。このようなパラメータの例は、制限されないで、細胞増殖、遺伝子またはタンパク質発現分析による中毒学応答の細胞経路の活性化をモニターすること、ＤＮＡ断片化；細胞膜の組成における変化、膜透過性、死滅レセプターまたは下流信号伝達経路の成分（例えば、カスパーゼ）の活性化、遺伝子ストレス応答、ＮＦ−κＢ活性化および有糸分裂促進剤に対する応答を含む。関連するアッセイは、アポトーシス（細胞死のプログラムされたプロセス）および壊死をアッセイするために用いられる。
種々の微生物細胞を異なる試験化合物と接触することにより、抗微生物アッセイを実施し、それによって可能な抗細菌化合物を同定するために本明細書で提供されるデバイスをまた利用し得る。本明細書中で用いられる用語「微生物」は、任意の顕微鏡による、および／または単細胞真菌、および任意の細菌または任意の原生動物をいう。いくつかの抗微生物アッセイは、細胞をセルペン中に保持すること、およびそれを少なくとも１つの可能な抗微生物化合物と接触することを含む。この化合物の影響は、細胞の健康および／または代謝における任意の検出可能な変化として検出され得る。このような変化の例は、制限されずに、成長、細胞増殖、細胞分化、遺伝子発現、細胞分裂などにおける改変を含む。
本明細書で提供されるミクロ流体デバイスのあるものは、ミニ配列決定反応またはプライマー伸長反応を実施するために利用され得、標的核酸中の多形部位に存在するヌクレオチドを識別する。一般に、これらの方法では、標的核酸のセグメントに相補的なプライマーは、反応がこの多形部位のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドの存在下で実施される場合に伸長される。しばしば、このような方法は、単一塩基対伸長（ＳＢＰＥ）反応である。このような方法は、代表的には、プライマーを、相補的な標的核酸配列に、プライマーの３’末端が多形部位にすぐ隣接するようにか、または多形部位の２〜３塩基上流にあるようにハイブリダイズすることを含む。伸長反応は、１つ以上の標識された非伸長性ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド）およびポリメラーゼの存在下で実施される。プライマーの３’末端上への非伸長性ヌクレオチドの取り込みは、一旦、非伸長性ヌクレオチドがプライマーの３’末端上に取り込まれると、ポリメラーゼによるプライマーのさらなる伸長を防ぐ。
まさに記載された方法に関連して、本発明のデバイスはまた、当該分野で良好に確立されている増幅技法を用いて複数サンプル中の標的核酸を増幅し、および次に同定するために利用され得る。一般に、このような方法は、標的核酸を潜在的に含むサンプルを、この標的核酸に特異的にハイブリダイズする正プライマーおよび逆プライマーと接触することを含む。反応は、このプライマー配列を伸長するために４つすべてのｄＮＴＰおよびポリメラーゼを含む。
（Ｖ．位相空間の探索）
タンパク質結晶学の問題に緊密に関係するのは、いくつかの化学的変数の関数としてタンパク質の溶解度を決定することである。推測的に、結晶化を誘導する熱力学的状態を決定することは困難であり得るので、スクリーニング方法は、可能な限り多くの位相空間（多くの状態）をサンプリングするべきである。これは、複数のアッセイを実施することにより、そしてまた各アッセイの展開の間に間に合ってサンプリングされる位相空間による達成され得る。
本発明によるミクロ流体デバイスおよび方法の混合および計測機能性は、この課題に適合されており、それによって、タンパク質サンプルは、その化学が系統的に変更される複数の関連溶液と混合され得る。結晶成長を達成する機会を増加する実験を系統的に設計するために沈殿物タンパク質相互作用の一般的な相性質を用いることが可能である。これようにして溶解度「位相空間」が生成され得る。この位相空間の知識は、成功する結晶化状態を予想するか、または同定された状態を洗練するために用いられ得る。
図５５は、高分子および沈殿剤を含む混合物の位相空間を示す単純化した概略図である。この位相空間は、溶解度曲線５５００によって、高分子溶解度によって決定される溶解（Ｓ）および過飽和（ＳＳ）領域に分割される。
Ｇｉｂｂｓの自由エネルギー図は、エネルギー的に好まれない状態からエネルギー的に好ましい状態に移動するために必要な障壁エネルギー（Ｅｂ）によって分割される溶解相および沈殿相の相対エネルギーをグラフにより表す。図５６Ａは、図５５の溶解領域（Ｓ）の自由エネルギー図である。図５６Ｂは、溶解度曲線５５００に沿った自由エネルギー図である。図５６Ｃは、図５５の過飽和領域（ＳＳ）の自由エネルギー図である。図５６Ａ〜Ｃの比較は、この溶解度曲線の沿って等しくバランスされる溶解相および沈殿相のエネルギーを示し、溶解領域では溶解形態がエネルギー的に好まれ、そして過飽和領域では固相がエネルギー的に好まれる。
図５５はまた、過飽和領域（ＳＳ）が、長い範囲のオーダーを欠く無定形沈殿物（すなわち、非結晶）が迅速に形成される沈殿領域（Ｐ）、沈殿曲線５５０２の近傍の不安定領域（Ｌ）、および溶解度曲線５５００の近傍の準安定性領域（Ｍ）にさらに分割され得ることを示す。図５６Ｄ、５６Ｅおよび５６Ｆは、それぞれ、沈殿領域、不安定領域、および準安定領域の自由エネルギー図を示す。
沈殿領域（Ｐ）では、無定形凝集物が結晶固体よりも好まれ、そして活性化エネルギー（Ｅｂ）は低く、その結果、溶解状態と固形状態との間の遷移が迅速に起こる。不安定領域（Ｌ）では、結晶形態が好まれるが、Ｅｂは低く、迅速な核形成および対応する小結晶の形成が生じる。対照的に、準安定領域（Ｍ）では、比較的高い活性化エネルギーが、核形成を抑制するが、現存する結晶の成長を支持する。
臨界的核凝集に必要な三次元核形成は、一般に、引き続く結晶面成長に必要な一次元または二次元核形成の活性化エネルギーより大きな活性化エネルギーを有するので、最適結晶化スキームは、結晶成長のこれらの２つの相に対して独立の制御を提供すべきである。ＢＩＭ計測スキームは、沈殿物とタンパク質溶液との間の「フリー界面拡散」を履行することによりこれの性質を正確に提供する。
図５７は、従来のハンギングドロップおよびミクロバッチ実験の、高分子濃度および沈殿剤濃度を変数として有する二次元位相空間による展開と、本発明の実施形態によるμＦＩＤ実験とを比較する単純化した概略図である。平衡の間のチップによってとられた相−空間軌道は、含まれる種の拡散定数に依存する。チップ界面バルブが開放された後、短時間で、タンパク質側のタンパク質濃度はほとんど変化せず、その一方、代表的には、かなりより大きい拡散定数を有する対向溶媒のそれは、リソグラフィーにより規定された混合比によって決定される３つの最終値の１つまで増加する。次に、約８〜２４時間の時間に亘りタンパク質濃度が平衡化し、溶媒側で増加し、そしてタンパク質側で減少する。最終のタンパク質濃度がもう一度混合比により決定される。従って、チップは、位相空間を通る曲がった経路をとり、これは、原則的に、タンパク質溶液が不安定領域中で効率的な結晶核形成を有し、次いで、準安定領域で高品質成長が続くことを可能にする。
従って、図５７は、３つの異なる混合比を有するμＦＩＤ反応部位の展開を示す。曲線は、各化合物のサンプル側および沈殿剤側の両方の平均状態を良好に示す。最終的状態（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）は、混合比によって決定され、そしてこれらの曲線が、核形成の高い確率をもつ領域から高品質結晶成長を支持する領域まで通過するより大きな機会を有することを観察し得る。これら曲線の区切りは、混合比によって決定される。
対照的に、従来のマイクロバッチおよびハンギングドロップアプローチは、標的分子が沈殿剤と１：１で組み合わされる点ＩＶで開始する。マイクロバッチ実験は、混合不能オイル下でインキュベートされ、引き続く試薬の濃縮を避け、そしてそれ故、位相空間における単一の点のみをサンプリングする。ハンギングドロップ実験では、混合物は、沈殿剤の大きなリザバでの蒸気拡散を通じて平衡化され、試薬を濃縮し、そしてサンプルを過飽和領域中に駆動する。これは望ましくない。なぜなら、得られる位相空間軌道は沈殿領域中に移動するからである。
フリー界面拡散技法の使用は、位相空間をサンプリングする有望な方法を提供するが、任意の所定の高分子のための可能な結晶化剤の真の数および濃度は、より系統的でかつ迅速な位相空間マッピング技法を所望されるようにする。
例えば、結晶成長を調査するための実験または実験のセットを設計する前に、まず、高分子および結晶化剤の特定の組み合わせの曲線の位置を同定することがより効率的である
と証明され得る。一旦、このような溶解度曲線が位相空間でマップされると、調査者は、次いで、軌道がこの溶解度曲線に隣接する位相空間領域を約束する領域を横断すると予期され得るスクリーニング実験のセットを効率的に設計することに進行し得る。
高分子の過飽和のレベルは、一般に、以下の式（８）によって規定される：
（８）ＳＳ＝（ＰＣ−ＭＣ）／ＭＣ・１００、ここで：
ＳＳ＝高分子の過飽和のレベル；
ＰＣ＝高分子濃度；および
ＭＣ＝平衡にある最大可溶性高分子濃度である。
本発明の目的には、これまで中間の過飽和（ＩＳＳ）と称される、高分子の過飽和の代替の測定は、ＭＣがタンパク質の中間最大高分子濃度（ＩＭＣ）によって置換される場合に得られる。本発明の目的には、このＩＭＣは、１分以内に、固相（結晶または無定形のいずれか）を生成することができない高分子の最大濃度として規定される。中間の過飽和（ＩＳＳ）は、以下の式（９）によって規定される：
（９）ＩＳＳ＝（ＰＣ−ＩＭＣ）、ここで：
ＩＳＳ＝中間過飽和；
ＰＣ＝高分子濃度；および
ＩＭＣ＝中間最大高分子濃度である。
高分子の結晶化は、一般に、代表的には、５０％〜５００％の範囲にある高過飽和値を必要とする。さらに、結晶化実験において正のＩＳＳ値で開始することは所望されない。なぜなら、これは、固相の即座の形成をもたらすからである。
所定の位相空間で、ＩＭＣ曲線によって上に境界され、およびＭＣ曲線によって下に境界される領域は、タンパク質結晶成長が支持され得る領域を規定する。従って、このＩＭＣ曲線が、例えば、組み合わせ混合を利用する高スループットスクリーニングの間の迅速固体形成の観察によって既知である場合、結晶化実験は、ＩＭＣの近くで、かつ負のＩＳＳ値で発展するようセットされるべきである。本出願の目的には、約±５０％の間のＩＳＳ値を有する状態は、ＩＭＣ曲線の近傍であると考えられる。
図１７Ａ〜Ｂと組み合わせて先に論議された組み合わせ混合デバイス、およびその改変体は、結晶化剤および高分子の溶解度曲線をマップするための迅速かつ効率的な方法を提供する。詳細には、この結晶化剤サンプルは、緩衝液および試薬を、特異的かつ正確な濃度を達成するために回転ミキサーフローチャネル中に注入することにより調製され得る。次いで、サンプル注入ポートライン、およびポンプが、高分子サンプルを回転ミキサー中に導入するために用いられ得、この回転ミキサーにおける沈殿物の形成の検出が続く。
沈殿物／結晶凝集物の検出は、いくつかの方法でなされ得る。凝集物検出の１つの方法は、カメラ上に混合リングをイメージすることである。単純なイメージ処理が、次いで、沈殿物を有するチャネルから清澄なチャネルを区別するためになされ得る。さらに、いくつかの結晶は、ある程度の複屈折を示すので、偏光レンズを用いて結晶を無定形固体から区別し得る。より小さな長さスケールでタンパク質凝集物を検出するために光散乱のような方法を用いることもまた可能である。
図２４は、塩溶液（３．６Ｍ ＮａＣｌ、およびｐＨ４．６にある１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ））に対し滴定されているタンパク質サンプル（リゾチーム８４ｍｇ／ｍｌ）に対する溶解度「位相空間」を示す。図２４は、１２０ｍＬの合計容量を消費する１００のアッセイの結果を示す。図２４は、溶解度相−空間を含むこのようなグラフの数千のうちの１つだけを表す。
図２４に示されるグラフは、可溶性状態と沈殿状態との間の区別のみを示す。しかし、両方の方向にこの溶解度曲線を通過するために、高分子と結晶化剤との相対濃度における変化の方向をシフトすることによってより多くの情報を得ることが可能であり得る。例えば、タンパク質サンプルに十分な塩が添加される場合、無定形（沈殿物）または結晶（微結晶）のいずれかであり得る固体が形成される。この溶液がゆっくりと希釈される場合、この固体は、最終的に溶液中に溶解して戻る。しかし、その溶解が生じる濃度は、代表的には、凝固が当初生じる同じ濃度ではなく、そして、一般に、この固体が結晶であるか、または無定形であるかに依存する。
詳細には、沈殿は、ほぼ即座に生じるが、結晶は形成するのにより長くかかり、結晶化プロセスのためのより高い活性化エネルギーを示唆している。結晶核形成／形成のためのより高い活性化エネルギーは、実験室時間スケールでの核形成の観察は、実質的な過飽和を必要とすることを意味する。対照的に、結晶形態は、一旦それが出現すると、ゼロより大きいすべての過飽和値について可溶性形態よりも好まれる。従って、固相が溶解度相に戻って再変換される状態と対比して、溶解度相が固体に変換される状態下のヒステリシスの大きさは、沈殿物に対する結晶の存在を、そしてそれ故、結晶化に好適な状態を示し得る。
図２５は、結晶化剤（３．６Ｍ ＮａＣｌ、およびｐＨ４．６にある０．１１Ｍクエン酸ナトリウム）との混合により沈殿されたリゾチーム（８４ｍｇ／ｍｌ）のサンプルの沈殿を示す。矩形（黒四角）と丸（黒丸）シンボルとの間の一致の欠如は、ヒステリシスおよび結晶成長を同定するための位相空間の探索をさらに約束する点を示す。
まさに記載されたような沈殿形成におけるヒステリシスの検出はまた、特定の高分子／結晶化剤の組み合わせが結晶形成の有望性を全く保持するか否かを識別するために非常に価値があることを証明するために供し得る。例えば、図５５の検査は、結晶形成に好適な不安定領域および準安定過飽和領域が溶解度曲線に沿って均一に生じないことを示す。その代わり、このような不安定／準安定領域が、局在化され、そして固体物質の形成が無定形であり、かつ整列された結晶物質の形成が可能ではない隣接する沈殿領域によって取り囲まれ得る。本発明の実施形態によるヒステリシスの検出は、特定タイプの結晶の形成を示し得、そしてそれ故、位相空間の可能な好適な領域をマップするために必要な時間および努力を最小にする予備的スクリーニング機構を提供する。
結晶化サンプル中の凝集した固体のサイズを直接測定するために光散乱技法を利用することがさらに可能であり得る。詳細には、入射電磁放射の形態に対するチップのＰＤＭＳの事実上の透明度は、回転またはその他のタイプの混合デバイスのフローチャネルの光学的尋問を可能にし得る。準−弾性光散乱（ＱＥＬＳ）または動的光散乱（ＤＬＳ）のような技法を利用するサンプルから散乱された放射の検出は、サンプル中に存在する固体のサイズの決定を可能にし得、それによって、結晶核形成が好まれるとき、固体形成の開始のサンプル状態の決定を可能にする。
さらに、「希釈溶液性質からタンパク質結晶化を予測すること」、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．５０：３６１〜３６５（１９９４）において、ＧｅｏｒｇｅおよびＷｉｌｓｏｎは、タンパク質結晶化挙動と、距離に亘る分子内電位の積分を表す基礎的パラメータであるタンパク質浸透圧第２ビリアル係数（Ｂ２２）との間の関係を示した。このＧｅｏｒｇｅおよびＷｉｌｓｏｎの論文は、すべての目的のためにその全体が本明細書中に援用される。
高分子溶液の第２ビリアル係数は、高分子溶液の散乱挙動から検出され得る。さらに、結晶化を起こすタンパク質溶液の第２ビリアル係数の値は、一般に、狭い範囲にあることが見出されている。従って、小容量サンプルとの迅速組み合わせ混合を実施する能力とカップルされた光散乱技法による第２ビリアル係数のオンチップ評価は、可能な結晶可能性について異なる混合物の迅速スクリーニングを可能にし得る。
本発明を、その特定の実施形態を参照して本明細書中に記載してきたが、許容範囲の改変、種々の変更および置換が先行する開示で意図され、そしていくつかの事例では、本発明のいくつかの特徴は、提示されたような本発明の範囲から逸脱することなくその他の特徴の対応する使用なくして採用され得ることが認識される。従って、多くの改変が、本発明の本質的な範囲および思想から逸脱することなく、本発明の教示に対して特定の状況または材料を適合するためになされ得る。本発明は、本発明を実施するために企図されたベストモードとして開示された特定の実施形態に制限されないことが意図され、本発明は、請求項の範囲内に入るすべての実施形態および等価物を含むことが意図される。

Claims (83)

  1. 装置であって、以下：
    第一のエラストマー層に形成されたミクロ流体チャネルネットワークであって、該ミクロ流体チャネルネットワークは、接合部および試薬供給源と流体連絡する第一のセットの入口分枝、該接合部および緩衝剤供給源と流体連絡する第二のセットの入口分枝、ならびに該接合部および出口と流体連絡する混合構造体を備える、ミクロ流体フローチャネルネットワーク；
    該第一のエラストマー層に隣接する第二のエラストマー層に形成された第一の制御チャネルネットワークであって、該第一の制御チャネルネットワークは、該第一の入口分枝セットに隣接して、選択試薬が該接合部に流れるように構成された第一のマルチプレクサ構造体を規定する、第一の制御チャネルネットワーク；ならびに
    該第二のエラストマー層に形成された第二の制御チャネルネットワークであって、該第二の制御チャネルネットワークは、該第二の入口分枝セットに隣接して、選択緩衝剤の流れを該接合部に流すように構成された第二のマルチプレクサ構造体を規定する、第二の制御チャネルネットワーク、
    を備える、装置。
  2. 前記接合部が、ある距離によって分離された第一の地点および第二の地点で第一のフローチャネルと交差する、第二のフローチャネルを備える、請求項１に記載の装置。
  3. 前記第一のフローチャネルが、該距離に沿って分枝している、請求項２に記載の装置。
  4. 前記混合構造体が、前記接合部および前記出口から隔離されるように構成された閉回路を備える、請求項１に記載の装置。
  5. 前記混合構造体が、実質的に円形の形状を有する、請求項１に記載の装置。
  6. 前記フローチャネルネットワークが、前記混合構造体と流体連絡する注入器チャネルをさらに備える、請求項１に記載の装置。
  7. 前記第二のエラストマー層が、少なくとも３つの制御チャネルを規定し、該少なくとも３つの制御チャネルは、前記フローチャネルネットワークの上に重なって、流体を前記第一の入口分枝セット、第二の入口分枝セット、および前記閉回路のうちの１つに通して流すように構成された蠕動ポンピング構造体を規定する、請求項１に記載の装置。
  8. サンプル貯蔵構造体をさらに備え、該サンプル貯蔵構造体は、前記出口と流体連絡しており、そして前記混合構造体からサンプルを保持するように構成されている、請求項１に記載の装置。
  9. 前記サンプル貯蔵構造体が、細長フローチャネルを備える、請求項８に記載の装置。
  10. 前記細長フローチャネルが、行き止まりを有する、請求項９に記載の装置。
  11. 前記細長フローチャネルの、前記入口の反対側の端部が、弁によって開閉される、請求項１０に記載の装置。
  12. 前記細長フローチャネルへの流体アクセスを支配するマルチプレクサ構造体をさらに備える、請求項１１に記載の装置。
  13. 前記貯蔵構造体が、フローチャネルの行および列によって接続される貯蔵容器のアレイを備える、請求項９に記載の装置。
  14. 前記貯蔵容器のアレイが、弁付き接続チャネルを通して流体連絡する、対になった容器を備える、請求項１３に記載の装置。
  15. 結晶化を導く条件を同定する方法であって、以下：
    第一の濃度で溶媒およびサンプルを含有する、第一の溶液を調製する工程；
    該第一の溶液と、結晶化剤を含有する第二の溶液とを混合する工程；
    該混合物において最初に固相が出現する第一の条件を記録する工程；
    さらなる溶媒を該混合物に添加する工程；
    該混合物において固相が消失する第二の条件を記録する工程；ならびに
    該第一の条件と第二の条件との間のヒステリシスを同定する工程、
    を包含する、方法。
  16. 前記第一の条件および第二の条件が、サンプルおよび結晶化剤の濃度を規定する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記結晶化剤が、前記サンプルを含む閉回路ミクロ流体チャネルに導入され；そして
    次いで、前記溶媒が、該閉回路ミクロ流体チャネルに導入される、
    請求項１５に記載の方法。
  18. 前記結晶化剤および前記溶媒のうちの少なくとも一方が、エラストマーマクのポンピング作用によって導入される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記第一の条件および第二の条件が、前記サンプルおよび前記結晶化剤を含有するミクロ流体フローチャネルの光学問い合わせによって決定される、請求項１５に記載の方法。
  20. エラストマーから微細製造される前記ミクロ流体構造体が、光学的に問い合わせられる、請求項１５に記載の方法。
  21. 結晶化を導く条件を同定する方法であって、以下：
    結晶化剤がサンプルを含有する溶液と混合される際の光の散乱を検出する工程；
    該検出された散乱光を、タンパク質結晶含有溶液に特徴的な既知の範囲の第二のビリアル係数で補正する工程、
    を包含する、方法。
  22. 前記結晶化剤が、サンプルを含有する閉回路ミクロ流体チャネルに流入する際に、前記散乱が決定される、請求項４１に記載の方法。
  23. 前記結晶化剤が、エラストマー膜の作用によって、前記閉回路ミクロ流体チャネル内にポンピングされる、請求項２１に記載の方法。
  24. ミクロ流体デバイスを通る流れを制御する方法であって、以下：
    流体をフローチャネルに入れる工程；
    該フローチャネルに隣接し、かつ該フローチャネルから分離されている制御チャネルに、圧力を付与して、介在するエラストマー膜を該フローチャネル内に偏向させる工程；および
    該フローチャネル内の流体のベースライン圧力を、５ｐｓｉｇより大きく維持し、一方で、該制御チャネルに扶養される圧力を緩和して、該エラストマー膜を該フローチャネルの外に付勢する工程、
    を包含する、方法。
  25. 前記圧力が、前記制御チャネルに、ある体積の空気のフラックスの形態で付与され、その結果、前記フローチャネル内に維持される上昇した圧力が、該フローチャネル内の気泡の形成を減少させる、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記エラストマー膜が、５０Ｈｚ以上の周波数で、前記フローチャネルの内外に作動され得る、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記フローチャネルが、閉回路を備え、そして前記エラストマー膜の作用が、約４Ｈｚの周波数で、該閉回路に通して流体を流し得る、請求項２４に記載の方法。
  28. 膜タンパク質の可溶化を導く条件を同定する方法であって、該方法は、以下：
    固体膜タンパク質を、ミクロ流体閉回路混合構造体に導入する工程；
    両親媒性部分を、該ミクロ流体閉回路混合構造体に導入する工程；
    該膜タンパク質および該両親媒性部分の混合物を、検出可能なリガンドに曝露する工程であって、得該検出可能なリガンドは、膜に折り畳まれる場合の該膜タンパク質の形態のみと結合するように構成されている、工程；ならびに
    該リガンドを検出して、溶液中での該膜タンパク質の折り畳まれた形態を同定する工程、
    を包含する、方法。
  29. 前記混合物が、ミクロ流体閉回路混合構造体内で、前記検出可能なリガンドに曝露される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記混合物が、前記ミクロ流体閉回路混合構造体から流れを受け取るミクロ流体フローチャネル内で、前記検出可能なリガンドに曝露される、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記タンパク質が、前記リガンドへの曝露の前にタグ化され；そして
    該可溶性タグか膜タンパク質が、前記ミクロ流体フローチャネル内で、表面に結合する、
    請求項３０に記載の方法。
  32. ２つの流体を混合する方法であって、以下：
    第一の静止流体を配置する工程；
    第二の流体を該第一の静止流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程；
    該第一の流体および第二の流体の対流を抑制し、その結果、該界面を横切る該第一の流体と第二の流体との間の混合が、実質的に拡散のみによって起こる、工程；
    を包含する、方法。
  33. 前記第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程が、前記界面における該第一の流体および第二の流体の一部分を、第一の次元に制限する工程を包含する、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記第一の次元が、ミクロ流体チャネルの幅を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記対流が、前記チャネルの壁に存在する非スリップ層に起因して制限される、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記第二の流体が、前記第一の流体と直接接触して配置される、請求項３２に記載の方法。
  37. 前記第一の流体が、前記フローチャネルの分枝内に配置される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第一の流体が、対向圧力に起因して、前記分枝チャネル内で静止したままである、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記分枝チャネルが、行き止まりを有する、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記第一の流体が、閉鎖具の第一の側と接触して配置され；
    前記第二の流体が、該閉鎖具の反対側と接触して配置され；そして
    該閉鎖具が該チャネルから取り外されて、該流体界面を形成する、
    請求項３２に記載の方法。
  41. 前記第一の流体および第二の流体が、ミクロ流体チャネル内に配置され；
    前記閉鎖具が、該ミクロ流体チャネル内に存在するエラストマー膜を備え；そして
    該エラストマー膜の一部分が、作動力に応答して該チャネルから偏向されることによって取り外される、
    請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ミクロ流体フローチャネルの幅が、該ミクロ流体フローチャネルをエラストマー材料に製造するために使用される鋳型の隆起特徴の幅によって規定される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記隆起特徴の幅が、フォトリソグラフィー技術を利用して規定される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記隆起特徴の幅が、線が配置されるべき領域の上のマスクをパターン付けすること、次いで、該マスクのいずれかの側の材料を除去することによって規定される、請求項４２に記載の方法。
  45. 前記ミクロ流体フローチャネルの幅が、エラストマー膜の層内に閉じ込められた犠牲材料の線の幅によって規定される、請求項４１に記載の方法。
  46. 前記犠牲材料の幅が、該犠牲材料の層を前記エラストマーの上に形成すること、および該犠牲材料を前記線のいずれかの側から除去することによって規定される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記第一の次元が、親水性経路の幅を含む、請求項３３に記載の方法。
  48. 前記親水性経路の幅が、親水性材料の沈着の間に露出される基板表面の領域の幅によって規定される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記親水性経路の幅が、親水性材料の沈着の間にマスクされる基板表面の領域の幅によって規定される、請求項４７に記載の方法。
  50. ２つの流体を混合する方法であって、以下：
    全体積を有する第一の静止流体を提供する工程；
    全体積を有する第二の静止流体を提供する工程；
    該第一の静止流体の一部分を、該第二の静止流体の一部分と接触させて配置して、流体界面を形成する工程であって、その結果、該第一の流体および第二の流体の最小の体積が、該流体界面にすぐ沿って存在する、最も激しい濃度勾配に曝露される、工程、
    を包含する、方法。
  51. 前記界面に沿った、前記第一の流体および第二の流体の部分が、ミクロ流体フローチャネルの寸法によって制限される、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記第一の流体が、第一のチャンバに入れられ、前記第二の流体が、第二のチャンバに入れられ、そして該第一のチャンバの断面積対該ミクロ流体フローチャネルの断面積の比が、５００と２５，０００との間であるように、前記ミクロ流体フローチャネルが、該チャンバを接続している、請求項５１に記載の方法。
  53. 流体系の特性を決定する方法であって、以下：
    標的を含有する第一の静止流体を配置する工程；
    第二の静止流体を該第一の流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程；
    該第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、混合が、該界面を横切って、拡散のみによって起こり、物理的特性を明らかにする、工程、
    を包含する、方法。
  54. 前記第一の流体および第二の流体が同じであり、そして別の流体中の前記標的の拡散係数が既知であり、その結果、該第一の流体および第二の流体の粘度が決定され得る、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記第二の流体が、前記標的に結合することが既知である分析物を含有し、その結果、前記標的の濃度が、該標的の非存在下での該分析物の予測される拡散挙動からの該分析物の観察される拡散挙動の偏差から決定され得る、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記標的に対する前記分析物の親和性が既知であり、そして該標的の濃度が、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、該分析物の一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、請求項７５に記載の方法。
  57. 前記標的に対する前記分析物の親和性が既知であり、そして該標的の大きさが、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、該分析物の一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記分析物および標的の濃度が既知であり、そして該標的に対する該分析物の親和性が、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、該分析物の一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、請求項５５に記載の方法。
  59. 前記第二の流体が、微生物を含有し、その結果、該微生物によって示される該標的に対する化学走性が分析され得る、請求項５３に記載の方法。
  60. 標的材料の特性を分析するための構造体であって、以下：
    標的を含有する、ある体積の第一の静止流体を含むように構成された、第一の微小製造された領域；
    該標的に結合することが既知である分析物を含有する、ある体積の第二の静止流体を含むように構成された、第二の微小製造された領域；
    該体積の第一の流体を、フリーミクロ流体界面を横切って該体積の第二の流体と拡散連絡させて配置させるように作動可能な弁；および
    該第一の微小さ製造された領域における該分析物の存在を検出するように構成された検出器、
    を備える、構造体。
  61. 前記第一の微小製造された領域が、第一のチャンバを備え、該第一のチャンバは、該第一のチャンバの次元に対して少なくとも１つの次元を制限された第一のチャネル部分と流体連絡しており；
    前記第二の微小製造された領域が、第二のチャンバを備え、該第二のチャンバは、該第二のチャンバの次元に対して少なくとも１つの次元を制限された第二のチャネル部分と流体連絡しており；
    前記弁が、該第一のチャネル部分と該第二のチャネル部分との間のチャネル内に偏向可能なエラストマー膜を備え；そして
    前記検出器が、前記第一のチャンバ内の分析物の濃度の増加の速度を、経時的に検出するように構成されている、
    請求項６０に記載の構造体。
  62. 前記第一の微小製造された領域が、少なくとも１つの次元を制限された第一の微小製造されたチャネル部分を備え；
    前記第二の微小製造された領域が、少なくとも１つの次元を制限された第二の微小製造されたチャネル部分を備え；
    前記弁が、該第一のチャネル部分と該第二のチャネル部分との間に微小製造されたチャネル内に偏向可能なエラストマー膜を備え；そして
    前記検出器が、前記弁からの距離にわたって、前記第一のチャンバ内の該分析物の濃度を検出するように構成されている、
    請求項６０に記載の構造体。
  63. 前記検出器が、蛍光、屈折率、非色分析、表面プラスモン共鳴、および伝導率のうちの少なくとも１つを検出するように構成されている、請求項６０に記載の構造体。
  64. タンパク質サンプル中の低分子の濃度を減少させる方法であって、該方法は、以下：
    該タンパク質サンプルを含有する第一の静止流体を、ミクロ流体チャネルに入れる工程；
    低濃度の該低分子を有する第二の静止流体を、該第一の流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程；
    該第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、該第一の静止流体からの該低分子が、拡散のみによって、該界面を横切って拡散し、該第一の静止流体中に存在する低分子の濃度を減少させる、工程、
    を包含する、方法。
  65. リガンドと標的との間の反応を決定する方法であって、以下：
    該リガンドを含有する第一の流体を、第一のチャンバに入れる工程；
    該標的を含有する第二の流体を、第二のチャンバに入れる工程；
    該第一のチャンバと第二のチャンバとを接続しているチャネル内において、該第一の流体と第二の流体との間のミクロ流体フリー界面を確立する工程；
    該第一の流体と第二の流体との間の該ミクロ流体フリー界面を横切る拡散によって混合を起こさせる工程であって；その結果、該リガンドが該標的に結合し、そして該リガンドと該標的との間の反応性が、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、工程、
    を包含する、方法。
  66. 前記拡散プロフィールの偏差が、前記リガンド単独の拡散に対する、リガンド／標的の組み合わせの減少した拡散を反映する、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記標的が、もとのリガンドに結合され；
    前記リガンドが、競合物リガンドを表し；そして
    前記拡散プロフィールの偏差が、該配置された元のリガンドの増強された拡散を反映し、そして該もとのリガンドの検出可能な物理特性によって明らかにされる、
    請求項６５に記載の方法。
  68. 前記拡散プロフィールの偏差が、前記配置された元のリガンドからの蛍光信号の発光によって明らかにされる、請求項６５に記載の方法。
  69. 前記拡散プロフィールの偏差が、前記配置された元のリガンドからの蛍光信号のクエンチによって明らかにされる、請求項６５に記載の方法。
  70. ある範囲の条件下で化学反応をサンプリングする方法であって、以下：
    第一の反応物を含有する第一の流体と、第二の反応物を含有する第二の流体との間に、ミクロ流体フリー界面を形成する工程；
    該第二の流体内への該第一の反応物の拡散を引き起こして、該第一の反応物の濃度勾配を作製する工程；および
    該勾配に沿った種々の濃度での該第一の反応物と、第二の反応物との間の反応を観察する工程、
    を包含する、方法。
  71. 前記第二の反応物が、検出可能な生成物を生成するための反応を触媒する酵素を含有し；そして
    前記第一の反応物が、該酵素のインヒビターを含有する、
    請求項７０に記載の方法。
  72. 前記生成物が、蛍光、屈折率、比色分析、表面プラスモン共鳴、および導電率のうちの少なくとも１つをモニタリングすることによって検出される、請求項７１に記載の方法。
  73. 化学種の濃度勾配を作製する方法であって、以下：
    該化学種を含有する第一の流体を配置する工程；
    第二の静止流体を該第一の静止流体の近くに配置して、ミクロ流体フリー界面を形成する工程；
    該第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、該ミクロ流体フリー界面を横切る該第一の流体と第二の流体との間の混合が、実質的に拡散のみによって起こり、そして該化学酒の濃度勾配が作製される、工程、
    を包含する、方法。
  74. 前記第一の化学種が、前記第二の流体と流体連絡する細胞のための栄養を含有する、請求項７３に記載の方法。
  75. 第二の化学種を含有する第三の流体を、前記第二の流体の近くに配置して、第二のミクロ流体フリー界面を形成する工程；
    該第二の流体および第三の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、該第二のミクロ流体フリー界面を横切る該第二の流体と第三の流体との間の混合が、実質的に拡散のみによって起こり、そして該第二の化学種の第二の濃度勾配が、前記第一の化学種の濃度勾配に重ねられる、工程、
    をさらに包含する、請求項７３に記載の方法。
  76. 前記第一の化学種の濃度勾配の方向が、前記第二の化学種の濃度勾配の方向と平行ではない、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記第一の化学種の濃度勾配の方向が、前記第二の化学物質の濃度勾配に対しておよそ垂直であり、その結果、該第一の化学種の濃度条件および第二の化学種の濃度条件のアレイが作製される、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記第一の化学種および第二の化学種の拡散が、浅いチャンバ内で起こる、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記第一の化学種および第二の化学種の拡散が、直交して配向したミクロ流体フローチャネルのセットにおいて起こる、請求項７７に記載の方法。
  80. 薬物を被験体に導入する方法であって、以下：
    該薬物を含有する第一の静止流体を、ミクロ流体デバイスに入れる工程；
    該第一の静止流体と該被験体との間の該ミクロ流体デバイスに、第二の流体を入れる工程；
    該第一の流体と該第二の流体との間に、ミクロ流体フリー界面を確立する工程であって、その結果、予め決定された量の該薬物が拡散して、予め決定された時間の後のみに該被験体に達する、工程、
    を包含する、方法。
  81. 前記被験体への前記薬物の拡散の時間が、該被験体と前記第一の流体との間に配置された前記ミクロ流体デバイス内のチャネルの寸法によって決定される、請求項８０に記載の方法。
  82. 化学反応の間の反応物の濃度を制御する方法であって、以下：
    第一の反応物を含有する第一の静止流体を、ミクロ流体構造体に入れる工程；
    該第一の静止流体の近くで、第二の流体を該ミクロ流体構造体に入れる工程であって、該第二の静止流体が、第二の反応物を含有する、工程；
    該第一の流体と第二の流体との間に、ミクロ流体フリー界面を確立する工程；
    該ミクロ流体フリー海面を横切る、該第一の流体と第二の流体との間での拡散を可能にして、該第一の反応物と第二の反応物との相対濃度を決定する工程、
    を包含する、方法。
  83. 明細書に記載の発明。
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